WO2010104115A1 - 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 - Google Patents

膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 Download PDF

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WO2010104115A1
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polypeptide
library
gram
protein
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泰 久保
忠史 木村
世吾 小野
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独立行政法人産業技術総合研究所
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    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a polypeptide that specifically recognizes a membrane protein.
  • Natural proteins are responsible for various functions such as the structure and morphogenesis of cells and tissues, as well as biological reactions necessary for life activities. At present, in various fields such as medical, food and manufacturing, we not only use the characteristics inherent in proteins, but also modify them by chemical or protein engineering (for example, heat resistance). Newly created proteins with added properties, pH stability, substrate specificity, etc.). In addition, it is not based on natural proteins in this way, but it is also possible to select a completely random polypeptide library that exhibits the desired properties, and a representative technique is in vitro molecules. There is an evolution method. In the in vitro molecular evolution method, a gene library containing a random base sequence is a starting material.
  • a protein is expressed and a library containing random amino acid sequences is prepared, and a protein having a desired physicochemical property or biochemical function and a gene encoding the same are selectively concentrated. .
  • the selected candidate peptide can be further modified using it as a starting material to proceed to the process of creating more sophisticated ones. Therefore, in recent years, various improvements and new technologies have been introduced regarding this technology, which are mainly the following technical elements.
  • (1) Correlation between genotype and phenotype It is an important point how information associated with a gene is associated with the characteristics of the protein encoded by the gene.
  • the technologies for associating the genotype with the phenotype include mRNA display, cDNA display, ribosome display method, STABLE, and in vitro compartment method.
  • Random sequence library preparation method Another important technical element of in vitro molecular evolution technology is how to create a library that is rich in diversity and independence. Based on random nucleic acid sequences, A method for creating diversity through shuffling and recombination in that area was considered. (3) Spatial presentation method of random sequences A method of efficiently spatially presenting polypeptide chains containing these random sequences is also an important technical element.
  • molecular skeletons such as a-amylase inhibitor, bovine pancreatic trypsin inhibitor, and ankyrin repeat protein.
  • a combinatorial library of proteins was prepared, and a novel protein creation method that replaces antibodies by the in vitro molecular evolution method was developed (Patent Documents 1 and 2).
  • a display-type polypeptide library designed so that the amino acid sequence of the loop region involved in the interaction is random while maintaining the sequence of the region important for the formation of a three-finger-like scaffold of the protein.
  • the polypeptide having high affinity with the target protein has been successfully obtained by high-throughput screening prepared and combined with the emulsion PCR method.
  • this library can be contacted with a soluble interleukin 6 receptor (IL-6R) immobilized on a carrier such as a bead to select a protein with high affinity and bind to IL-6R.
  • IL-6R soluble interleukin 6 receptor
  • This protein has the same affinity for the receptor as IL-6, which is the original ligand for IL-6R. Furthermore, each protein that exhibits inhibitory and promoting effects on IL-6R can be obtained. It was.
  • a carrier such as a bead
  • the target molecule is a membrane protein such as a membrane receptor, it is necessary to stably immobilize it on a carrier such as a bead together with a membrane component.
  • An object of the present invention is to provide an efficient high-throughput screening system for searching for a ligand of a target protein that can also be applied to a membrane protein.
  • the present inventors have conceived of utilizing the periplasmic gap of E. coli, which is a Gram-negative bacterium, so that the membrane protein is expressed in the E. coli inner membrane and the randomized scaffold protein is secreted into the periplasmic gap.
  • We developed a screening technique by expressing it and using the periplasmic gap as a reaction field for polypeptides against membrane proteins. It was also demonstrated that the screening technology can be molecularly evolved into a peptide sequence having a higher affinity with the target membrane protein by combining with the PCR technology. Therefore, this method was named the periplasm endocrine / selection (iPS & S) method (Fig. 4).
  • a gene (polynucleotide) encoding a polypeptide is present in a cell, the polynucleotide is expressed and secreted into the periplasmic space, and the phenotypic polypeptide is expressed in the periplasmic space.
  • E. coli surface display It is a kind of E. coli surface display in that it is presented.
  • the major difference from the prior art is that the target membrane protein molecule cDNA is placed in tandem on a plasmid containing peptide cDNA and the target molecule is expressed on the inner membrane of E. coli. The target molecule is simultaneously expressed and presented (FIG. 12).
  • the genetic information of the polypeptide that specifically binds to the target membrane protein can be obtained by selecting and collecting E. coli spheroplasts.
  • the obtained polynucleotide is amplified, expressed in E. coli along with the target membrane protein as the starting material for the next cycle, and screened for repeated testing of the polypeptide sequence with higher affinity to the target membrane protein.
  • the iPS & S method can target any membrane protein that can be expressed on the inner membrane of Gram-negative bacteria such as E. coli, and searches for and identifies polypeptides that specifically bind to the membrane protein. It can be said that it is a method.
  • a calcium channel blocking type venom peptide derived from a spider venom forms a scaffold structure (ICK scaffold) having three disulfide bonds.
  • a peptide library using the scaffold was prepared.
  • the peptide library was filed on the same date as the present invention, but it was smaller in size than the library using the 3 finger-like (3F) scaffold previously developed by the present inventors, and the number of disulfide bonds was one. Therefore, the advantage that accurate expression and secretion are easy in a narrow periplasmic space can be utilized.
  • the present invention for the “iPS & S method” which is a high-throughput screening method effective for ligand search for membrane proteins, which has been considered difficult in the past, has been completed.
  • a random polypeptide library comprising a group of polypeptides comprising a randomized peptide region consisting of 3 or more amino acids, wherein each polynucleotide constituting the corresponding random polynucleotide library is present in a gram-negative bacterium.
  • the polynucleotide constituting the random polynucleotide library has a secretory signal sequence upstream thereof and is tandemly linked to the polynucleotide encoding the target protein in the same expression vector.
  • the random polypeptide library according to [1] above.
  • a polynucleotide library encoding a polypeptide comprising a randomized peptide region consisting of three or more amino acids, wherein each polynucleotide constituting the polynucleotide library has a secretion signal sequence upstream thereof.
  • a random polynucleotide library wherein the polynucleotide is incorporated under a control region that can be expressed in a Gram-negative bacterium, and a polynucleotide encoding a target membrane protein is linked in tandem.
  • It consists of a group of expression vectors that can be expressed in Gram-negative bacteria, into which each polynucleotide constituting a polynucleotide library that encodes a polypeptide containing a peptide region comprising three or more randomized amino acids is inserted.
  • a random polynucleotide library comprising a group of expression vectors in which a secretory signal sequence is upstream of each of the polynucleotides and a polynucleotide encoding a target protein is linked in tandem.
  • a display-type Gram-negative bacterial library wherein each polypeptide corresponding to the polynucleotide constituting the random polynucleotide library is present in the periplasmic space.
  • a method for screening a polypeptide having a high affinity for a target protein comprising using the display-type gram-negative bacterial library according to [5].
  • a method for screening a polypeptide having affinity for a target membrane protein comprising the following steps (a) to (e): (A) an expression vector that can be expressed in a Gram-negative bacterium, into which each polynucleotide constituting a polynucleotide library that encodes a polypeptide comprising a peptide region comprising three or more randomized amino acids is inserted, Providing a group of expression vectors having a secretory signal sequence upstream of each of the polynucleotides and ligating a polynucleotide encoding the target protein in tandem; (B) Expressing each expression vector constituting the polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium, the target membrane protein on the inner membrane surface, and the polypeptide encoded by each polynucleot
  • a method for screening a polypeptide having affinity for a target membrane protein comprising the following steps (a) to (j): (A) an expression vector that can be expressed in a Gram-negative bacterium, into which each polynucleotide constituting a polynucleotide library that encodes a polypeptide comprising a peptide region comprising three or more randomized amino acids is inserted, Providing a group of expression vectors having a secretory signal sequence upstream of each of the polynucleotides and ligating a polynucleotide encoding the target protein in tandem; (B) Expressing each expression vector constituting the polynucleotide library in a transformed gram-negative bacterium, the target membrane protein on the inner membrane surface, and the polypeptide encoded by each polynucleotide in the periplasmic space, respectively.
  • the iPS & S method of the present invention is used to create lead compounds for designing peptide drug discovery and low molecular weight compounds that target membrane proteins such as G protein-coupled receptors (GPCRs) and ion channels, which are major drug discovery targets. Expected to contribute.
  • GPCRs G protein-coupled receptors
  • Peptide ligands can be created for orphan GPCRs and can be used for deorphaning.
  • a specific peptide for membrane protein can be identified, it can be used as a molecular imaging reagent by binding an affinity carrier for purification or a labeled molecule such as fluorescence or radioisotope, or as a substitute for antibodies The use as is considered.
  • FIG. 1 is a diagram showing a spider venom-derived ICK peptide scaffold; positions of cysteine residues (C1-C6) and randomized regions (dark gray portions).
  • FIG. 2 is a diagram showing an alignment of the ICK peptide family.
  • FIG. 3 is a diagram showing homology modeling based on Hainantoxin-4 of the peptide Peak A4-1.
  • FIG. 4 is a diagram showing a process of the molecular evolution technique “iPS & S method”.
  • FIG. 5A is a diagram showing an outline of the construction of plasmid pGRII-Tx
  • FIG. 5B is a photograph showing confirmation of expression of membrane proteins and peptides.
  • FIG. 6 shows the structure of plasmid pGRII-Tx.
  • FIG. 7 shows the structure of plasmid pGRII-USER.
  • FIG. 8 is a diagram showing a step of removing nonspecifically adsorbed peptides.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of a binding inhibition assay between muscarinic receptor ligand NMS and m2 receptor using peptides A-1 and A-2.
  • FIG. 10A is a diagram showing a structural outline of peptide A-1 and a non-specific binding peptide.
  • FIG. 10B is a diagram showing detection of an Escherichia coli plasmid adsorbed with a peptide.
  • FIG. 10C is a diagram showing detection of peptides expressed in the periplasm.
  • FIG. 11 is a diagram showing an outline of the peptide target specificity evaluation experiment.
  • FIG. 12 is a diagram showing the localization of plasmids, membrane proteins, and polypeptides in the “iPS & S method”.
  • each polypeptide constituting a polypeptide library is a polypeptide encoding each polypeptide in one Gram-negative bacterial host (for example, E. coli).
  • An expression vector (plasmid) containing nucleotides is introduced by transformation, and only one type of polypeptide in the library is expressed for each host bacterium, and the library is made secreted into the periplasmic space.
  • the polypeptide library used in the present invention is a so-called display-type random polypeptide library that includes random peptide regions and is associated with a polynucleotide library composed of polynucleotides encoding each polypeptide.
  • the random polypeptide library of the present invention typically has a structurally stable framework region, and a partial sequence of other regions is randomized, but does not have a framework region.
  • a random oligopeptide library composed only of oligopeptides in which most or all of the amino acid sequences are randomized.
  • the amino acid length of the oligopeptide at that time is usually 5 or more, preferably 5 to 30, more preferably 5 to 10.
  • the amino acid length is short, it is preferable to add a self-associating amino acid sequence such as a ⁇ structure or a leucine zipper to both ends, or to make a fusion protein with an antigen protein for phage display, a soluble enzyme protein, or the like.
  • a library obtained by randomizing a part of the activation region or receptor binding region using a soluble enzyme or various physiologically active proteins themselves as a template is also included in the random polypeptide library of the present invention.
  • the number of amino acids to be randomized is usually 3 or more, preferably 5 to 15, more preferably 5 to 10.
  • the random polypeptide library that can be used in the present invention is a method in which the polypeptide secreted in the periplasmic space does not bind as nonspecifically as possible after each corresponding polynucleotide is expressed in a Gram-negative bacterium such as E. coli. It is necessary to have a size that allows free movement so that specific binding to a target membrane protein is possible, and to take a stable form folded compactly. Therefore, as described above, for example, in the case of an oligopeptide library, an amino acid sequence having a self-associating property such as a ⁇ structure or a leucine zipper is added to both ends, so that a device that takes a stable and constant structure is required. Become.
  • Various conventionally known stable scaffold-forming polypeptide libraries such as 3F scaffold library (Patent Document 1, etc.) Compact 1F scaffold type peptide library (Patent Document 2, etc.) and other antibody fragments And a so-called antibody fragment library obtained by randomizing the hypervariable region of a TCR fragment or a single-chain TCR library (for example, clinical immunity 35: 156-164, 2002).
  • Any polypeptide library capable of displaying peptides can be suitably used.
  • a peptide library using the ICK scaffold such as A4-1 (the above-mentioned application filed on the same date) is a typical preferred example. The sex was verified.
  • a polynucleotide encoding each polypeptide constituting the polypeptide library is present in an expression vector (plasmid) having a secretory signal sequence upstream thereof, and the target protein A random polynucleotide library is constructed in a state where a polynucleotide encoding is inserted in tandem in the same expression vector (see FIG. 5). Therefore, in the present invention, the term “random polynucleotide library” refers to a polynucleotide comprising a group of polynucleotides into which a gene mutation has been introduced at a position corresponding to the randomized region of each polypeptide constituting the “random polypeptide library”.
  • each polynucleotide has a secretion signal upstream thereof, and the polynucleotide encoding the target protein exists as a partial sequence of the expression vector in a state of being tandemly bound.
  • a group of expression vectors into which each polynucleotide is inserted in such a state can also be referred to as a “random polynucleotide library” of the present invention.
  • the group of transformed gram-negative bacteria is also the “random polynucleotide library” of the present invention. It can be said.
  • the “random polypeptide live” of the present invention is used.
  • "Lary” refers to a group of polypeptides in the periplasmic space of each gram-negative bacterium transformed with the corresponding polynucleotide library, and these gram negatives displaying these polypeptides in the periplasmic space.
  • a group of bacteria can also be referred to as a “random polynucleotide library” of the present invention. In the present invention, such a group of transformed gram-negative bacteria is sometimes referred to as a “display-type gram-negative bacteria library”.
  • target protein of the present invention examples include surface antigens such as inflammation, cancer, virus, pathogenic bacteria, etc. in addition to membrane proteins of various signal transduction systems on the surface of mammalian cells involved in neuronal information transmission, cell differentiation, cell proliferation, apoptosis, etc.
  • Any membrane protein, such as a protein, whose base sequence of its gene is known, is a target.
  • membrane receptors involved in signal transduction on the surface of mammalian cell membranes such as humans (eg, GPCRs, cytokine receptors, proliferation / differentiation / growth factor receptors, integrins, etc.), drug transporters, various ion channels, etc.
  • pathogenic bacteria surface antigen protein cancer cell surface antigen protein, virus surface antigen protein and the like.
  • it is preferably used for ligand search of orphan receptors, which are G protein-coupled receptors with unknown ligands.
  • the target protein of the present invention also includes soluble proteins and peptides. In that case, it can be appropriately applied by fusing with, for example, NIpA (Nature Biotechnology 25: 563-565, 2007) so that it can be displayed on the inner membrane of Gram-negative bacteria. Therefore, the target protein of the present invention may be an original biological membrane protein or a soluble protein fused with a membrane protein. In the present invention, these are simply referred to as “target membrane protein”.
  • any Gram-negative bacterium having a periplasmic gap such as Pseudomonas genus Salmonella genus, can be applied. is there.
  • an expression vector used for introducing the polynucleotide library an appropriate known expression vector suitable for a host bacterium, preferably an expression plasmid can be used.
  • a typical method for preparing an expression vector is as follows.
  • a signal sequence for transporting to the periplasmic space of the host bacterium is bound to the 5 ′ side of the randomized polynucleotide, directly or via a spacer as necessary.
  • an outer membrane protein such as OmpA outer membrane protein is bound.
  • secretion into the periplasmic space is increased (according to Protein Expression and Purification 64: 198-204 (2009)).
  • a control sequence including a promoter sequence is added.
  • it is designed so that a stop codon is added to the 3 ′ side.
  • a tag such as a Strep • tagII sequence because the purification of the library becomes easy.
  • the polynucleotides constituting these polynucleotide libraries can be inserted into an expression vector different from the expression vector containing the DNA encoding the target membrane protein, but are inserted into the same expression vector. It is preferable.
  • the insertion position can be determined as appropriate, but it is preferably introduced downstream of the target membrane protein DNA.
  • Use of DNA fused so that the target membrane protein can be expressed as a fusion protein with a maltose binding protein or the like is preferable because it may increase the solubility and expression level (J. Biol. Chem. 267: 8200). -8206 (1992); according to J. Biochem. 127: 151-161 (2000)).
  • the target membrane protein needs to be expressed on the inner membrane of the transformed gram-negative bacterium into which each polynucleotide in the polynucleotide library of the present invention is introduced. Therefore, an expression vector containing a DNA encoding a target membrane protein so as to be expressed in the inner membrane of the transformed gram-negative bacterium is also introduced into the gram-negative bacterium host simultaneously.
  • the polynucleotide library of the present invention may be introduced using a transformed bacterium that has been previously transformed with DNA encoding a target membrane protein and confirmed to express the target membrane protein in the inner membrane. it can.
  • each polynucleotide constituting the polynucleotide library of the present invention is incorporated at a tandem position in an expression vector containing a DNA encoding a target membrane protein.
  • the ratio of the two is determined to an optimum value (for example, 1: 1) of 1 to 10:10 to 1 and not changed during one screening. In order to align the expression time, they can be incorporated under the same control region.
  • Polypeptide library using ICK scaffold has high structural stability and is a conventional 3F scaffold type library. Since it is particularly preferable as the polypeptide library of the present invention in that it is smaller in size, the case where an ICK type polypeptide library is used will be described in detail below.
  • ICK scaffold refers to a polypeptide consisting of 30-70 amino acid residues found in spiders and scorpion venom, and six cysteine residues (Cys-1-Cys- 6) refers to the tertiary structure formed by SS bonding between Cys-1 and Cys-4, Cys-2 and Cys-5, and Cys-3 and Cys-6 (FIG. 1).
  • FIG. 2 shows an amino acid sequence alignment of a representative polypeptide having an ICK scaffold. The number at the right end of the figure is the length of the amino acid. The name of the polypeptide shown in this alignment and the accession number of the protein database are shown in the table below.
  • the polypeptide shown in the first line of FIG. 2 is a novel calcium channel blocker poison “A4-1” (Patent Document 3, Non-Patent Document 8) polypeptide isolated from Grammostola spatulata.
  • A4-1 is an ICK-type toxin containing 34 amino acids and has been found to bind to and inhibit calcium channels.
  • Many peptides containing the ICK motif are already known, and each of them is known to have various biological activities such as Na + channel, Ca 2+ channel, K + channel blocker and enzyme inhibition.
  • the gene of this peptide is characterized by the introduction of base substitution (mutation) that actively undergoes amino acid substitution in the region related to the interaction with the target molecule by accelerated evolution, which creates diversity of the target molecule It is the cause.
  • FIG. 2 shows multiple alignments of primary amino acid sequences such as A4-1 and known channel-inhibiting toxins such as paultoxin (PaurTx3) and hynantoxin (HnTx4). Homologous sequences are indicated by blocks.
  • PaurTx3 paultoxin
  • HnTx4 hynantoxin
  • the tertiary structure of A4-1 was predicted using the 3D modeling software component of BioPackage (MolSoft LLC, California, USA), and the residues involved in the formation of loops and ⁇ -sheets were known hyantoxins (HnTx4 ) (Fig. 3).
  • the ⁇ structure obtained from the secondary structure information is shown as a ribbon-like arrow.
  • three loops are formed by SS bonds between Cys-1 and Cys-4, Cys-2 and Cys-5, and Cys-3 and Cys-6. Regions (regions between Cys-1 and Cys-2, regions between Cys-2 and Cys-3, and regions between Cys-5 and Cys-6) are formed, loop I, loop II, and loop, respectively. It is called III (a ⁇ sheet structure exists mainly between Cys-4 and Cys-5).
  • These three loop regions and the tail region on the C-terminal side from Cys-6 are predicted to be regions that bind to calcium channels.
  • regions (i) to (iv) (i) from the 6th methionine to the 8th lysine in the amino acid sequence of polypeptide A4-1 shown in the first row of FIG. 2, respectively. 3 amino acid residues, (ii) 4 amino acid residues from the 12th aspartic acid to the 15th lysine, (iii) 3 amino acid residues from the 25th arginine to the 27th histidine, and (iv) the 33rd position Amino acid sequences consisting of 2 amino acid residues from valine to 34th phenylalanine.
  • a library composed of a plurality of polypeptide groups containing the amino acid sequence represented by the formula [1] derived from the following “A4-1” amino acid sequence was used as a typical library.
  • the polypeptide shown in FIG. 2 for example, the polypeptide shown in FIG. 2, (i) to (iv) in the same manner as the polypeptide library based on A4-1 with reference to the alignment of FIG. Polypeptide libraries with randomized regions can be produced.
  • Preparation method of library used in “iPS & S method” (1) Preparation of polynucleotide library As a typical example of a polypeptide library containing a random amino acid sequence, a Ca 2+ channel inhibitory peptide A4-1 gene identified from spider venom was used. Prepared as a template. A4-1 consists of 34 amino acids and is thought to form a molecular skeleton called ICK (Inhibitor Cystine Knot) motif from the three-dimensional structure of peptides with sequence homology. A polynucleotide library corresponding to a random peptide library containing a random amino acid sequence in the loop region of A4-1 was prepared.
  • ICK Inhibitor Cystine Knot
  • a well-known method for introducing a mutation into a gene is used.
  • PCR is performed by combining oligonucleotide primers with triplet codon NNS (N is G, C, T, A. S is G or C) at the desired amino acid residue position where random sequences are to be inserted.
  • NNS N is G, C, T, A. S is G or C
  • Similar methods are also used in Patent Documents 1 and 2, etc. See UNIT 3.17 in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, NY 1995).
  • a method of binding short oligonucleotides enzymatically GAE, 164: 49-53, 1995
  • an artificial gene synthesis method connecting short DNAs as blocks (Slonomics) and the like can be used.
  • the DNA encoding the fusion protein of the target membrane protein molecule (muscarinic acetylcholine m2 receptor) and maltose binding protein is designed to be inserted into the same expression plasmid together with the promoter sequence.
  • the cDNA base sequence of the human m2 receptor is obtained from the DNA database Accession No. BC106742.
  • the host microorganism of the present invention is a gram-negative bacterium having a periplasmic space, and any bacterium can be used as long as its expression vector is available, but typically E. coli is used. Conventional genetic recombination techniques can be applied to the transformation technique and culture conditions.
  • the polypeptide When the polypeptide does not bind to the target, it cannot form a complex with spheroplasts, and thus a library of polynucleotides cannot be constructed even by PCR. Therefore, only the polynucleotide library constituting the polypeptide library becomes the second polynucleotide library, and molecular evolution in vitro can be applied very simply, and a polypeptide with higher target affinity can be efficiently obtained.
  • bonded with the membrane protein currently expressed on the inner membrane surface is selected.
  • a method of selecting with Streptactin beads using a tag (Strep-tag, etc.) added to the N-terminal side is typical.
  • Other tags include T7, histidine, FLAG There are tags, etc., and magnetic beads, sepharose beads, agarose beads, porous beads, plates, or membranes may be used.
  • the plasmid DNA inside the spheroplast cell of the selected “polypeptide-membrane protein-spheroplast complex” fixed to the beads is isolated, and the polynucleotide constituting the polynucleotide library in the plasmid DNA is isolated.
  • the nucleotide sequence is amplified by PCR. Based on the amplified polynucleotide sequence, a similar expression plasmid is prepared, and the cycles of transformation, expression, and selection are repeated multiple times, and the polynucleotide with higher affinity for the target membrane protein is concentrated. To do.
  • polypeptide with higher binding affinity can be concentrated by increasing the selection pressure sequentially.
  • the size of the polypeptide-polynucleotide library of the present invention is small (when the amino acid sequence region to be randomized is small)
  • the following known in vitro molecular evolution techniques can be applied.
  • a higher-affinity polypeptide-polynucleotide is obtained by applying the molecular evolution technology to the high-affinity polypeptide-polynucleotide that has been sufficiently selected, concentrated and reduced in size. be able to.
  • a second polypeptide library of the second round can be prepared by applying a molecular evolution technique.
  • Randomization of a part of the sequence means, for example, that one or more mutations are introduced into the amino acid sequence of the randomized region of the selected polypeptide, and the remaining amino acid sequence is designed to be an immobilized amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of a certain region for example, loop I
  • an amino acid sequence in which one or more mutations are introduced into the amino acid sequence of another region for example, loop II
  • a method such as designing a new amino acid sequence in which amino acid residues appearing in the randomized region of the polypeptide are shuffled to hybridize them.
  • a second polypeptide library comprising a group of a plurality of polypeptides having a partial amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the polypeptide selected in the previous round and the remaining amino acids being different. it can.
  • This second polypeptide library can then be used to select polypeptides that bind to the target, and so on, for multiple rounds of selection and further randomization of the library.
  • it is possible to further introduce a mutation into a polypeptide that can bind to a target to promote artificial molecular evolution.
  • a polypeptide having a higher target affinity can be obtained by preferably repeating 2 to 10 rounds, more preferably 3 to 8 rounds.
  • affinity is used.
  • various signal transductions that occur through membrane proteins such as changes in intracellular calcium, cAMP, and arachidonic acid concentrations and potential changes, are measured with each sensitive fluorescent dye, and intracellular and extracellular fluxes due to radioisotopes, etc.
  • SPR surface plasmon resonance
  • QCM quartz oscillation microbalance
  • Polypeptide library A polypeptide library prepared based on the ICK scaffold of A4-1 is composed of a group of polypeptides of the formula [1] consisting of the following amino acid sequences.
  • Formula [1] DCLGF (X) 3 CIP (X) 4 CCRPNLVCS (X) 3 KWCKY (X) 2 (SEQ ID NO: 2) (Wherein X is any amino acid residue)
  • the formula [1] has a structure in which three loop regions including amino acids presumed to be involved in calcium channel binding and a tail region are randomized. As shown in FIG. 2, the region predicted to form a loop and the surrounding amino acid residues were randomized. In addition, tail region amino acid residues were also randomized. The amino acids forming the beta sheet are not changed.
  • the DsbC protein is for promoting stable disulfide bond formation of polypeptides expressed from the A4-1 gene
  • the OmpA sequence is for A4-
  • the Strep • tagII sequence is a sequence for use in purification of the library so that the polypeptide expressed from one gene moves into the periplasmic space. The resulting full-length construct is confirmed by direct sequencing.
  • the muscarinic acetylcholine receptor m2 subtype is expressed in E. coli as a fusion protein with maltose binding protein (MBP) according to the method of Furukawa et al. (H. Furukawa and T. Haga: J. Biochem. (2000) 127, 151-161). Expressed in the intima.
  • MBP maltose binding protein
  • the polypeptide with the ICK motif is a fusion protein with the disulfide isomerase DsbC by placing the signal peptide sequence of the outer membrane protein OmpA of Escherichia coli followed by the purification tag sequence Strep tag II on the amino terminal side.
  • a plasmid was constructed so as to be expressed in the periplasm (FIG. 5A).
  • E. coli was transformed.
  • the expression of ICK peptide (4 kDa) fused with m2 (35 kDa) fused with MBP (43 kDa) and DsbC (25 kDa) was theoretically determined by Western blotting with anti-MBP antibody and anti-Strep-tag antibody, respectively. Bands with value sizes (78 kDa and 29 kDa) were confirmed (FIG. 5B).
  • Both A4-1 derived ICK library and m2 receptor are expressed in the periplasmic space in E. coli. Thereafter, the outer membrane of E. coli is removed to form a spheroplast and incubated with Strep • tactin beads. After washing several times, the polypeptide / receptor / E. Coli complex containing the polypeptide bound to the m2 receptor is eluted. The gene encoding the polypeptide contained in the eluted E. coli is amplified by PCR, and after subtraction, it is introduced into a vector. This vector is transformed into E. coli to co-express ICK and m2 receptor as described above.
  • the selection pressure is sequentially increased to concentrate a polypeptide having a higher binding affinity. be able to.
  • m2 receptor binding peptides were screened by the following procedure.
  • the ICK peptide expressed in each periplasm interacts with the m2 receptor.
  • those having strong binding activity were selected.
  • the outer membrane of Escherichia coli is removed to form spheroplasts, and unbound peptides are removed.
  • Peptides bound to the receptor are selected with Streptactin beads using a Strep-tag added to the N-terminal side. That is, a complex of Streptactin- [Strep-tag-peptide]-[m2 receptor-Escherichia coli (spheroplast)] is selected.
  • sequence information of the peptide that binds to the m2 receptor is contained in the plasmid DNA of Escherichia coli that is caught at the same time, this sequence is amplified by PCR, and the expression and selection cycles after the second round are continued.
  • the sequence gene of interest is concentrated (FIG. 4). As a result of 6 rounds of selection cycles, the following 6 groups and 10 types of peptides were identified.
  • DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VX 1 X 2 KWCKY X 3 X 4 (SEQ ID NO: 3) (Wherein X 1 is V, L or G, X 2 is A or G, X 3 may be A, P, Y or absent, and X 4 may be N, I, L or absent. Good.) Specifically, it is the following four polypeptides.
  • PepA-1 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY (SEQ ID NO: 4)
  • PepA-2 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY AN (SEQ ID NO: 5)
  • PepA-3 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VLG KWCKY PI (SEQ ID NO: 6)
  • PepA-4 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VGA KWCKY YL (SEQ ID NO: 7)
  • B Group B
  • PepB DCLGF RWR CIP GINL CCRPNLVCS NSK KWCKY VM (SEQ ID NO: 8)
  • C Group C PepC: DCLGF SMG CIP NQVR CCRPNLVCS VDL KWCKY SH (SEQ ID NO: 9)
  • D Group D PepD: DCLGF RWS CIP WEAS CCRPNLVCS DWK KWCK
  • PepF-1 DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY AL (SEQ ID NO: 13)
  • PepA-1 SEQ ID NO: 4
  • PepA-2 SEQ ID NO: 5
  • PepC SEQ ID NO: 9
  • the receptor binding peptide was characterized.
  • the muscarinic acetylcholine receptor (mAChR) m1, m2, m3, and m4 subtypes are microinjected into Xenopus oocytes with RNA synthesized from their respective cDNAs to express the receptor on the cell membrane. Prepared as a membrane fraction containing.
  • PepA-1, PepA-2 and PepC were expressed as recombinants in E. coli and purified.
  • Binding competition experiments with peptides were performed using [ 3 H] -N-methylscopolamine ([ 3 H] -NMS) as a receptor binding competitor.
  • PepA-1 was 5 mM at 6.0 mM
  • PepA-2 was 45.4% at 5.4 mM
  • PepC was 37.5% at 365 nM
  • m2 binding to NMS was inhibited.
  • the inhibition rates of PepC against subtypes m1, m3, and m4 other than m2 were 6.0%, 10.4%, and 6.2% at 438 nM, respectively.
  • PepC specifically differentiates the m2 receptor from other mAChR subtypes. It turns out that it inhibits.
  • polypeptides represented by SEQ ID NOs: 3 to 14 are considered to be useful for the treatment of various diseases as inhibitors of binding to the m2 receptor.
  • the iPS & S method of the present invention was proved to be a very effective technique for obtaining a high affinity polypeptide with a target protein.
  • Example 1 Preparation of polypeptide library having molecular backbone of spider venom polypeptide
  • polypeptide of ICK motif A polypeptide library in which the three loop regions and the tail region of Peak A4-1 were randomized was prepared.
  • the cysteine framework of spider venom-like polypeptides is known to be conserved among several short neurotoxins.
  • the amino acid residues in and around the part containing amino acids presumed to be involved in binding to calcium ion channels were randomized.
  • F1 5'-GACTGTTTAGGATTT (NNS) 3 TGCATCCCC (NNS) 4 TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT (NNS) 3 AAATGGTGTAAATAT -3 '(SEQ ID NO: 15)
  • F2 5'-ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA (SNN) 2 ATATTTACACCATTT -3 '(SEQ ID NO: 16)
  • Underlined sequences indicate overlapping sequences for PCR. PCR was performed in buffer supplied by the manufacturer with 2.5 U / ⁇ l PfuTurboCx Hotstart DNA polymerase (STRATAGENE) and 100 pmol fragment. Three cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds were performed.
  • Example 2 Construction of Plasmid Vector Expressing Membrane Protein and Polypeptide Library It was designed so that m2 expressed in E. coli was expressed in the inner membrane and the polypeptide was expressed in the periplasmic space. Moreover, in order to prevent a large difference between their expression levels and individual E. coli, expression was made in a single vector in tandem.
  • telomere The T7terminator sequence was PCR-encoded from rbs of this vector.
  • the PCR product was cloned into the above vector using In-Fusion PCR Cloning System (Clontech) (pGRII-IF).
  • PCR forward 5'-GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3 '(SEQ ID NO: 17)
  • PCR reverse 5'-GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 18)
  • pET40b (+) is a vector comprising a DsbC sequence involved in transferring a polypeptide expressed in E.
  • This DsbC sequence was prepared by PCR using pET40b (+) as a template (PCR forward 1 and reverse 1) and cleaved with SacII (fragment 1). PCR was performed by PCR forward 2 and reverse 2 using A4-1 as a template, and cleaved with SacII (fragment 2). Thereafter, the PCR1 fragment and the PCR2 fragment were ligated, and PCR was performed using PCR forward 3 and PCR reverse 2 as a template (fragment 3). This PCR produced a Strep • tagII-DsbC-A4-1 fragment, which was cleaved with NheI.
  • the XbaI site (380 nt) on pET27b (+) was changed to TGTAGA using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE), and the signal sequence of pelB and the signal sequence of OmpA were exchanged.
  • PCR was performed by PCR forward 4 and PCR reverse 3.
  • a fragment containing OmpA was prepared from the T7 promoter (fragment 4) and cleaved with NheI. Fragments 3 and 4 were ligated, PCR was performed with PCR forward 4 and PCR reverse 2 using this as a template, and then cloned into pCR2.1.
  • PCR forward 1 5'-CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT-3 '(SEQ ID NO: 19)
  • PCR reverse 1 5'-TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • PCR forward 2 5'-GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 21)
  • PCR reverse 2 5'-GAATTCTTAAAATACATA-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • PCR forward 3 5'-CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA-3 '(SEQ ID NO: 23)
  • PCR reverse 3 5'-CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA-3 '(SEQ ID NO: 24
  • the USER cassette sequence of the USER friendly DNA engineering method was synthesized into two fragments by Operon Biotechnology Co., Ltd. PCR was performed with PCR forward 1 and PCR reverse to prepare a USER cassette. Using this as a template, PCR was performed by PCR forward 2 and reverse. The PCR product was cleaved with SacII (SacII-USER). This fragment was ligated with pGRII-Tx cleaved with SacII, PCR was performed with the above PCR forward 4 (SEQ ID NO: 25) and the following PCR reverse (SEQ ID NO: 27), and cloned into pCR2.1.
  • the plasmid obtained was excised with PstI and EcoRI and cloned into the same site of pGRII-Tx (see pGRII-USER, see FIG. 7).
  • the sequence of the obtained vector was confirmed with a DNA sequencer.
  • PCR forward 1 5'-CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • PCR reverse 5'-GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • PCR forward 2 5'-TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • This vector was cut with XbaI and Nt.BbvCI (New England Biolabs) (m2-USER). This vector was used in the following experiments as a cloning vector using the USER friendly DNA engineering method.
  • PCR forward 5'-GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA-3 '(SEQ ID NO: 29)
  • PCR reverse 5'-GGGAAAGUATCTGCAGAATT-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • E. coli was collected at 6000 ⁇ g for 10 minutes and washed with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). The periplasmic fraction and spheroplast fraction were prepared using the cells. The spheroplast fraction was suspended in a buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 25% Sucrose, 0.5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride) and sonicated.
  • a buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 25% Sucrose, 0.5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride
  • the cells were collected by centrifugation at 150000 ⁇ g for 1 hour and suspended in a buffer solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 500 mM NaCl, and 1 mM EDTA). Cells were collected by centrifugation at 150,000 xg for 1 hour, and suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) to obtain a membrane fraction.
  • the periplasmic fraction and membrane fraction were subjected to electrophoresis (SDS-PAGE), and expression was confirmed by Western blot. The periplasm fraction was detected for polypeptide expression using Strep • tagII antibody, and the membrane fraction was detected for m2 using MBP antibody.
  • Example 3 Selection of m2 receptor binding polypeptide from spider venom-like polypeptide library (3-1) Expression of spider venom-like polypeptide and binding to m2 receptor m2 and spider-like expressed in E. coli
  • the polypeptide reacts in the periplasmic space within the cell during culture. By using the periplasmic space as the reaction field, each E. coli can react with the polypeptide and m2.
  • the vector containing the randomized polypeptide was transformed into E. coli, and the cells were collected from the overnight culture plate in a liquid medium of LB-ampicillin and grown until the OD 600 reached 0.6. Cultures were induced with 0.5 mM IPTG for 24 hours at 20 ° C.
  • the collected cells were suspended in a hypertonic solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 20% Sucrose, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride) and incubated on ice for 10 minutes. Cells were harvested by centrifugation at 12000 xg for 10 minutes. This was suspended in a hypotonic solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5)) and incubated on ice for 10 minutes. The fraction collected by centrifugation at 12000 ⁇ g for 10 minutes was used as spheroplast.
  • Strep • tagII added to the spider-like polypeptide was bound with Strep tactin (Magnetic Beads, QIAGEN). This was sufficiently washed with a buffer solution (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% TritonX-100) to remove non-specifically bound substances (FIG. 4). . Polypeptide spheroplast complexes that were specifically bound by elution with a biotin solution were recovered from Strep tactin. 30 cycles of PCR (95 ° C. for 30 seconds, 50 ° C.
  • PCR forward 5 '-[Bio] -GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA-3' (SEQ ID NO: 31)
  • PCR reverse 5'-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • the sequence was commissioned to Bex Corporation to confirm the DNA sequence of the polypeptide contained in the plasmid. Based on randomized sequence similarity, it could be divided into 6 groups. There were no mutations in the non-randomized sequences on the polypeptide sequences of these groups. Ten peptides were identified after 6 rounds of selection cycle. If 2 to 4 amino acid mutations are considered as 1 group, they can be roughly divided into 6 groups.
  • each is referred to as Group A to F, and the polypeptides within the group are referred to as PepA to F. (Note that the region randomized in the original library is underlined)
  • A The group A polypeptide is represented by the following formula [2].
  • DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VX 1 X 2 KWCKY X 3 X 4 (SEQ ID NO: 3) (Wherein X 1 is V, L or G, X 2 is A or G, X 3 may be A, P, Y or absent, and X 4 may be N, I, L or absent. Good.) Specifically, it is the following four polypeptides.
  • PepA-1 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY (SEQ ID NO: 4)
  • PepA-2 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VVA KWCKY AN (SEQ ID NO: 5)
  • PepA-3 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VLG KWCKY PI (SEQ ID NO: 6)
  • PepA-4 DCLGF RRG CIP VGEL CCRPNLVCS VGA KWCKY YL (SEQ ID NO: 7)
  • B Group B
  • PepB DCLGF RWR CIP GINL CCRPNLVCS NSK KWCKY VM (SEQ ID NO: 8)
  • C Group C PepC: DCLGF SMG CIP NQVR CCRPNLVCS VDL KWCKY SH (SEQ ID NO: 9)
  • D Group D PepD: DCLGF RWS CIP WEAS CCRPNLVCS DWK KWCK
  • PepF-1 DCLGF EVV CIP GMLD CCRPNLVCS TVS KWCKY AL (SEQ ID NO: 13)
  • polypeptides were prepared from all clones.
  • the polypeptide was prepared as a thioredoxin fusion protein using a partially modified pBAD / TOPOThio fusion expression kit (Invitrogen).
  • the modified portions are the point where Strep • tagII was inserted into the N-terminal side of thioredoxin of the pBAD / TOPOThio vector and the recognition sequence of PreScission enzyme (GE Healthcare) was inserted into the C-terminal side of the enterokinase recognition sequence.
  • DNA was amplified from a plasmid encoding an m2-binding polypeptide, cloned into a pBAD / TOPOThio modified vector, and transformed into E. coli.
  • the frame was confirmed by sequencing. Positive clones were cultured in LB-ampicillin medium until OD 600 reached 0.5. Cultures were induced with 0.02% arabinose at 25 ° C. for 3 hours. Cells were collected for 20 minutes at 3000 rpm and sonicated. The lysate was centrifuged, separated into a supernatant (soluble fraction) and a pellet (insoluble fraction) and analyzed by SDS-PAGE.
  • the soluble fraction was bound with Strep tactin (IBA GmbH) affinity column for the expressed polypeptide Strep • tagII under non-denaturing conditions, and the fusion protein was cleaved with PreScission enzyme.
  • the polypeptide from which the fusion protein had been removed was recovered, and the protein was quantified by the Lowry method.
  • expression levels of PepA-1, PepA-2 and PepC were sufficiently ensured. Therefore, these 3 polypeptides were subjected to the following binding experiments, and were used with the m2 receptor. Objectively evaluate affinity and specificity.
  • the muscarinic acetylcholine receptor has m1, m3 and m4 subtypes in addition to m2.
  • binding experiments for subtypes were performed. CRNA of each of these receptors was prepared, and binding inhibition to subtypes was measured by the same method as described above.
  • PepC has a concentration of 438 nM, 6.0% inhibition for m1, 10.4% for m3 and 6.2% inhibition for m4, and 37.5% inhibition of binding for m2 at 365 nM. It was. This indicates that PepC selectively inhibits m2 among muscarinic acetylcholine receptor subtypes.
  • Bacterial cells were collected by centrifugation to prepare spheroplasts. This was collected with Strep tactin, and PCR was performed with F1 and F2 for 30 cycles (95 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds) as non-specifically adsorbed DNA. In this PCR, biotin was added to the 5 ′ side of the reverse primer. Nonspecifically adsorbed DNA is bound to avidin-coated magnetic beads (MAGNOTEX-SA, TAKARA BIO INC.), And the DNA that has been bound by alkali treatment is made into a single strand, and one nonspecific adsorption of magnetic beads. Strand DNA (Non-speDI) was prepared (FIG. 8).
  • PepA-1 (SEQ ID NO: 4) was used to evaluate whether m2 was specifically targeted.
  • DNA was amplified from the plasmid of PepA-1 and cloned into a vector not containing m2 (Non-m2-USER).
  • the peptide remained in the selection up to 6 rounds, but a peptide containing a stop codon at the polypeptide randomized sequence (truncated peptide) was cloned and compared (FIG. 10A). Each of these was transformed into E. coli and cultured overnight.
  • Colonies were collected from the cultured plates and induced with 0.5 mM IPTG for 24 hours.
  • Spheroplasts were prepared from the collected cells by centrifugation and collected with Strep / tactin. PCR was performed using the collected spheroplasts to see if bands were detected by electrophoresis. On the other hand, a band appeared in the Truncated peptide, while no band was seen in the sample that expressed PepA-1, so PepA-1 was not adsorbed nonspecifically to the inner membrane of Escherichia coli. It was confirmed that they were specifically bound (see FIGS. 10B and 11). At this time, it was confirmed that both peptides were expressed in the periplasm by analyzing the collected periplasm fraction by electrophoresis and Western blotting (FIG. 10C).
  • PepA-2 DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN 6). PepA-3 DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI 7). PepA-4 DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL 8).
  • PepB (Group B) DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM 9.
  • PepC Group C) DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH 10.
  • PepD (Group D) DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL 11.
  • PepE (Group E) DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI 12
  • PepF-1 DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL 14
  • PepF-2 DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY 15.

Abstract

　本発明は、膜タンパク質にも適用可能な標的タンパク質のリガンド検索のためのディスプレイ型ランダムペプチドライブラリーを用いる効率の良いハイスループットスクリーニング系を構築するものである。　そのために用いるディスプレイ型ランダムペプチドライブラリーは、上流に分泌シグナル配列を有する標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるランダムポリヌクレオチドライブラリーの各ポリヌクレオチドがタンデムに連結された発現ベクターにより形質転換されたグラム陰性細菌の群からなるライブラリーであって、各グラム陰性細菌の内膜表面において前記標的タンパク質が発現しており、かつペリプラズム間隙内には、前記ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドに対応する各ポリペプチドが存在している。標的タンパク質に結合したポリペプチドを、スフェロプラストの選択・回収により獲得し、得られたポリヌクレオチドを増幅し、次のサイクルの出発原料としてスクリーニング、増幅を繰り返すことで、より標的膜タンパク質との親和性の高いポリペプチド配列に試験管内分子進化させることができる。

Description

膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法
　本発明は、膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法に関する。
　天然のタンパク質は、生命活動に必要な生体反応を始めとして細胞・組織の構造や形態形成など様々な機能を担っている。現在我々は、医療・食品・製造など様々の分野において、タンパク質が本来持つ特性を利用するのみならず、化学的あるいはタンパク質工学的にタンパク質を改変することによって、用途に適した特性（例えば、耐熱性、pH安定性、基質特異性など）を付与したタンパク質を新たに創製して利用している。また、このように天然のタンパク質を基にするのではなく、全くランダムなポリペプチドのライブラリーから目的の特性を示すものを選択することも行われており、その代表的な技術として試験管内分子進化法がある。
　試験管内分子進化法では、ランダムな塩基配列を含む遺伝子ライブラリーが出発材料となる。これよりタンパク質を発現してランダムなアミノ酸配列を含むライブラリーを調製し、その中から所望の物理化学的特性や生物化学的機能を持つタンパク質及びそれをコードする遺伝子を選択的に濃縮していく。選択された候補ペプチドは、さらにそれを出発材料として改変を加え、より高機能なものを創り出すプロセスに進むことができる。そのため、近年この技術に関して様々な改良や新技術が導入されており、それは主として次のような技術要素である。
（１）遺伝子型（genotype）と表現型（phenotype）の対応付け
　遺伝子が持つ情報とそれがコードするタンパク質が示す特性とを如何に対応付けるかは重要なポイントである。その遺伝子型（genotype）と表現型（phenotype）を対応付ける技術として、これまでにmRNAディスプレイ、cDNAディスプレイ、リボソームディスプレイ法、STABLE、in vitro compartment法などがある。また、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、バクテリアディスプレイなどのように、ファージや細胞内部に遺伝子型を持ち、細胞表層に表現型を持つ方法などが考案されてきた。
（２）ランダム配列ライブラリーの調製法
　試験管内分子進化技術のもうひとつの重要な技術要素は、多様性・独立性に富んだライブラリーを如何に作るかで、ランダムな核酸配列を基本として、その領域のシャッフリングやリコンビネーションなどにより多様性を生み出す方法が考えられた。
（３）ランダム配列の空間提示方法
　これらのランダム配列を含むポリペプチド鎖を効率よく空間提示する方法も重要な技術要素である。これには、天然あるいは非天然の分子骨格を用いて空間提示する方法があり、a-amylase inhibitor、bovine pancreatic trypsin inhibitor、ankyrin repeat proteinなどの分子骨格（scaffold）を利用した報告がある。
　最近、本発明者らは、ヘビ毒に含まれる神経毒の一種であるa-neurotoxin(α－型神経毒)のファミリーが共通して持つスリーフィンガー（Three-Finger あるいは 3F）型スキャフォールドを利用してタンパク質のコンビナトリアルライブラリーを作製し、試験管内分子進化法により抗体に代わる新規なタンパク質の創製法を開発した（特許文献１，２）。この方法においては、タンパク質のスリーフィンガー様のスキャフォールド形成に重要な領域の配列を維持しながら、相互作用に関与するループ領域のアミノ酸配列がランダムであるように設計したディスプレイ型のポリペプチドライブラリーを作製し、エマルジョンＰＣＲ法と組み合わせたハイスループットスクリーニングにより、標的タンパク質との親和性の高いポリペプチドを得ることに成功している。具体的には、このライブラリーを、ビーズ等の担体に固定化した可溶性のインターロイキン６受容体（IL-6R）と接触させて親和性の高いタンパク質を選択し、IL-6Rに結合しうる新規なタンパク質を同定した。このタンパク質は、IL-6Rの本来のリガンドであるIL-6と同程度に受容体と親和性があり、さらにIL-6Rに対して阻害効果と促進効果を示すそれぞれのタンパク質を得ることができた。
　しかし、標的分子をビーズ等の担体に安定に固定化する際に、標的分子が膜受容体等膜タンパク質である場合には、膜成分とともにビーズ等の担体に安定に固定化する必要があるが、それには技術的な困難性が伴う。
　一方、未だにリガンドが決められないオーファンレセプターと呼ばれるGタンパク質共役型受容体（GPCR）をはじめ、イオンチャンネル、薬物トランスポーターなど、創薬ターゲットの約6割は膜タンパク質が占めると言われている。
　したがって、これらの膜タンパク質を標的とするペプチド創薬および低分子化合物をデザインするためのリード化合物創製のため、膜タンパク質にも適用可能な標的タンパク質のリガンド検索のためのハイスループットスクリーニング系の構築が切望されていた。
特開２００７－３０６８６６号公報 特開２００８－１９３９２２号公報 特開２００８－１１号公報
J. Immunol. Methods., 290: 3-28 (2004) Biochemistry 34: 8076-8081 (1995) J. Biol. Chem. 276: 40306-40312 (2001) J. Gen. Physiol. 123: 455-467 (2004) J. Biol. Chem. 279: 37734-37740 (2004) Toxicon. 49: 202-212 (2007) Toxicon. 39: 43-60 (2001)
　本発明は、膜タンパク質にも適用可能な標的タンパク質のリガンド検索のための効率の良いハイスループットスクリーニング系の構築を提供することを目的とする。
　そこで本発明者らは、グラム陰性菌である大腸菌のペリプラズム間隙を利用することを着想し、膜タンパク質を大腸菌内膜に発現させると共に、ランダム化したスキャフォールドタンパク質をペリプラズム間隙内に分泌するように発現させ、ペリプラズム間隙を膜タンパク質に対するポリペプチドの反応場とすることによるスクリーニング技術を開発した。そして、当該スクリーニング技術を、ＰＣＲ技術と組み合わせることにより、より標的膜タンパク質との親和性の高いペプチド配列に分子進化させることができることも実証できた。そこで、この方法を、ペリプラズム内分泌・選択（intra periplasm secretion & selection, iPS&S）法と命名した（図４）。
　本発明の「iPS&S法」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）が細胞内にあって、当該ポリヌクレオチドが発現してペリプラズム間隙に分泌され、ペリプラズム間隙中で表現型のポリペプチドが提示されているという点で、大腸菌表層ディスプレイの一種といえる。従来技術との大きな違いは、標的膜タンパク質分子のcDNAをペプチドのcDNAを含むプラスミド上にタンデムに並べて搭載し、大腸菌の内膜に標的分子を発現するため、ひとつの大腸菌宿主内でポリペプチドと標的分子を同時に発現・提示するところである（図１２）。これにより、標的膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドの遺伝子情報を大腸菌スフェロプラストの選択・回収により獲得することができる。また、得られたポリヌクレオチドを増幅し、次のサイクルの出発原料として標的膜タンパク質と共に大腸菌で発現させ、スクリーニングする工程を繰り返すことで、より標的膜タンパク質との親和性の高いポリペプチド配列に試験管内分子進化させることができる技術でもある。したがって、iPS&S法は、大腸菌などグラム陰性細菌の内膜に発現することが可能な膜タンパク質であれば標的とすることが可能で、その膜タンパク質と特異的に結合するポリペプチドを探索・同定する方法であるということができる。
　また、本発明者らは、クモ毒由来のカルシウムチャネル遮断タイプの毒ペプチド（特許文献３）がジスルフィド結合を３箇所有するスキャフォールド構造（ICKスキャフォールド）を形成していることを見出し、当該ICKスキャフォールドを利用したペプチドライブラリーを作製した。当該ペプチドライブラリーについては、本発明と同日付で出願したが、本発明者らが以前開発した３フィンガー様（３Ｆ）スキャフォールドを利用したライブラリーよりもサイズが小さく、ジスルフィド結合数も１箇所少ないため、狭いペリプラズム間隙内では正確な発現、分泌が容易であるという利点を生かすことができる。
　以上の知見をもとに、従来困難であるとされていた膜タンパクに対するリガンド検索にも有効なハイスループットスクリーニング法である「iPS&S法」についての本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドの群からなるランダムポリペプチドライブラリーであって、対応するランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、グラム陰性細菌中で発現し、ペリプラズム間隙中に分泌された状態で存在しており、かつ当該グラム陰性細菌の内膜表面に、標的タンパク質が発現していることを特徴とする、ランダムポリペプチドライブラリー。
〔２〕　前記ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドが、その上流に分泌シグナル配列を有しており、かつ同一の発現ベクター中で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとタンデムに連結されている、前記〔１〕に記載のランダムポリペプチドライブラリー。
〔３〕　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーであって、当該ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、その上流に分泌シグナル配列を有し、グラム陰性細菌で発現可能な制御領域下に組み込まれており、かつ標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されていることを特徴とする、ランダムポリヌクレオチドライブラリー。
〔４〕　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターの群からなり、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群から構成されていることを特徴とする、ランダムポリヌクレオチドライブラリー。
〔５〕　前記〔３〕又は〔４〕に記載のランダムポリヌクレオチドライブラリーにより形質転換されたグラム陰性細菌の群からなり、各グラム陰性細菌の内膜表面には標的タンパク質が発現しており、かつペリプラズム間隙内には、前記ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドに対応する各ポリペプチドが存在していることを特徴とする、ディスプレイ型グラム陰性細菌ライブラリー。
〔６〕　前記〔５〕に記載のディスプレイ型グラム陰性細菌ライブラリーを用いることを特徴とする、標的タンパク質に親和性の高いポリペプチドのスクリーニング方法。
〔７〕　標的膜タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドのスクリーニング方法であって、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む方法；
（ａ）ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターであって、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群を用意する工程；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｃ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
（ｄ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
〔８〕　標的の膜タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドのスクリーニング方法であって、下記（ａ）～（ｊ）の工程を含む方法；
（ａ）ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターであって、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群を用意する工程；
（ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｃ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
（ｄ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して発現ベクターに挿入した第２のポリヌクレオチドライブラリーであり、各ポリヌクレオチドは分泌シグナル配列の下流に挿入され、かつ前記標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの群で構成された第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程、；
（ｆ）前記第２のポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
（ｇ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
（ｈ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
（ｉ）必要により工程（ｅ）－（ｈ）を繰り返す工程；そして
（ｊ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程
　本発明のiPS&S法は、主要な創薬ターゲットであるGタンパク質共役型受容体（GPCR）やイオンチャンネルなどの膜タンパク質を標的とするペプチド創薬および低分子化合物をデザインするためのリード化合物創製に寄与することが期待される。オーファンGPCRに対してペプチド性リガンドを創出し、これを利用した脱オーファンにも利用することができる。また、膜タンパク質に対する特異的なペプチドが同定できると、精製のためのアフィニティー担体や、蛍光や放射性同位元素などによる標識分子を結合して分子イメージング試薬としての利用、抗体の代用として検査・診断材料としての利用などが考えられる。
図１は、クモ毒由来ICKペプチドのスキャフォールド；システイン残基（C1-C6）の位置とランダム化した領域（濃いグレー部分）を示す図である。 図２は、ICKペプチドファミリーのアラインメントを示す図である。 図３は、ペプチドPeak A4-1のHainantoxin-4に基づくホモロジーモデリングを示す図である。 図４は、分子進化技術「iPS&S法」の工程を示す図である。 図５Aは、プラスミドpGRII-Txの構成概要を示す図であり、図５Bは、膜タンパク質とペプチドの発現確認を示す写真である。 図６は、プラスミドpGRII-Txの構成を示す図である。 図７は、プラスミドpGRII-USERの構成を示す図である。 図８は、非特異的吸着ペプチドの除去工程を示す図である。 図９は、ペプチドA-1とA-2によるムスカリン受容体リガンドNMSとｍ２受容体との結合阻害アッセイの結果を示す図である。 図１０Aは、ペプチドA-1と非特異的結合ペプチドの構造概要を示す図である。図１０Bは、ペプチドが吸着する大腸菌のプラスミドの検出を示す図である。図１０Cは、ぺリプラズムに発現するペプチドの検出を示す図である。 図１１は、ペプチド標的特異性評価実験の概要を示す図である。 図１２は、「iPS&S法」におけるプラスミド、膜タンパク質、ポリペプチドの局在様態を示す図である。
１．「iPS&S法」に用いるためのライブラリー
　本発明の「iPS&S法」において、ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドは、１個のグラム陰性菌宿主（例えば大腸菌）にそれぞれのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（プラスミド）が形質転換により導入され、１宿主細菌ごとにライブラリー中の１種類のポリペプチドのみが発現し、ペリプラズム間隙内に分泌された状態でライブラリー化されている。
　本発明に用いられるポリペプチドライブラリーは、ランダムペプチド領域を含み、各々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで構成されたポリヌクレオチドライブラリーと対応付けられた、いわゆるディスプレイ型のランダムポリペプチドライブラリーである。
　本発明のランダムポリペプチドライブラリーとしては、典型的には構造的に安定なフレームワーク領域を有し、他の領域の一部配列がランダム化されたものであるが、フレームワーク領域を有さず、かつほとんど又は全てのアミノ酸配列がランダム化されたオリゴペプチドのみで構成された、ランダムオリゴペプチドライブラリーであってもよい。そのときのオリゴペプチドのアミノ酸長は、通常５以上であり、好ましくは５～３０、より好ましくは５～１０である。アミノ酸長が短い場合には、両端にβ構造やロイシンジッパー等の自己会合性を持つアミノ酸配列を付加するか、又はファージディスプレイ用抗原タンパク質、可溶性酵素タンパク質などと融合タンパク質とすることが好ましい。また、可溶性の酵素や各種生理活性タンパク質自身をテンプレートとし、その活性化領域やレセプター結合領域などの一部をランダム化したライブラリーも、本発明のランダムポリペプチドライブラリーに含まれる。これらの場合のランダム化されるアミノ酸数は、通常３以上であり、好ましくは５～１５、より好ましくは５～１０である。
　本発明で用いることができるランダムポリペプチドライブラリーは、対応する各ポリヌクレオチドが大腸菌などのグラム陰性細菌で発現した後、ペリプラズム間隙中に分泌されたポリペプチドができるだけ非特異的な結合をせずに、標的の膜タンパク質との特異的な結合ができるように自由な動きが可能な程度のサイズであると共に、コンパクトに折りたたまれた安定な形態をとることが必要である。したがって、上述のように、例えばオリゴペプチドライブラリーなどの場合は、両端にβ構造やロイシンジッパー等の自己会合性を持つアミノ酸配列を付加して、安定な一定の構造をとらせる工夫が必要となる。
　従来知られている各種の安定なスキャフォールド形成性のポリペプチドライブラリー、例えば３Ｆスキャフォールドライブラリー（特許文献１など）コンパクトな１Ｆのスキャフォールド型ペプチドライブラリー（特許文献２など）の他抗体フラグメントやＴＣＲフラグメントの超可変領域をランダム化した、いわゆる抗体フラグメントライブラリーや、一本鎖ＴＣＲライブラリー（例えば臨床免疫 35: 156-164, 2002）など公知のフレームワーク構造を有し、可溶性のポリペプチドをディスプレイ可能なポリペプチドライブラリーは、いずれも好適に用いることができる。
　大腸菌宿主の場合は、A4-1などＩＣＫスキャフォールドを利用したペプチドライブラリー（上記同日付出願）が、典型的な好ましい例であるので、A4-1由来ライブラリーを用いて本iPS&S法の有効性を検証した。なお、サイズが大きなライブラリーを用いる場合には、大腸菌よりも広い間隙空間を有するグラム陰性細菌を宿主とすることが好ましい。
　そして、本発明のランダムポリペプチドライブラリーは、当該ポリペプチドライブラリーを構成する各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その上流に分泌シグナル配列を有して発現ベクター（プラスミド）中に存在し、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、同一発現ベクター中にタンデムに挿入された状態で、ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成している（図５を参照）。
　したがって、本発明において、「ランダムポリヌクレオチドライブラリー」というとき、「ランダムポリペプチドライブラリー」を構成する各ポリペプチドのランダム化領域と対応した位置に遺伝子変異が導入されたポリヌクレオチドの群からなるポリヌクレオチドライブラリーを指すが、実際は、各ポリヌクレオチドはその上流に分泌シグナルを有し、かつ標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに結合された状態の発現ベクターの部分配列として存在しているので、このような状態で各ポリヌクレオチドが挿入されている発現ベクターの群も本発明の「ランダムポリヌクレオチドライブラリー」ということができる。また、それぞれの発現ベクターが導入された各形質転換グラム陰性細菌も、各ポリヌクレオチドと対応していることから、当該形質転換グラム陰性細菌の群も本発明の「ランダムポリヌクレオチドライブラリー」であるということができる。
　そして、各形質転換グラム陰性細菌内の発現ベクターに組み込まれている各ポリヌクレオチドが、それぞれの細菌のペリプラズム間隙中に、対応するポリペプチドを分泌することになるので、本発明の「ランダムポリペプチドライブラリー」というときは、対応するポリヌクレオチドライブラリーにより形質転換された、各グラム陰性細菌のペリプラズム間隙中のポリペプチドの群を指し、これらポリペプチドをペリプラズム間隙中にディスプレイしている形質転換グラム陰性細菌の群も、本発明の「ランダムポリヌクレオチドライブラリー」ということができる。なお、本発明では、このような形質転換グラム陰性細菌群を、「ディスプレイ型グラム陰性細菌ライブラリー」ということもある。
　本発明の標的タンパク質としては、神経情報伝達、細胞分化、細胞増殖、アポトーシス等にかかわる哺乳類細胞表面の各種シグナル伝達系の膜タンパク質以外にも、炎症や癌やウイルス、病原性細菌などの表面抗原タンパク質等その遺伝子の塩基配列が公知となっている膜タンパク質であればどのようなものでも対象となる。典型的には、ヒトなどの哺乳動物細胞膜表面でシグナル伝達に関わる膜受容体（例えばGPCR、サイトカイン受容体、増殖・分化・成長因子受容体、インテグリン等）、薬物トランスポーター、各種イオンチャネル等、また病原細菌表面抗原タンパク質、癌細胞表面抗原タンパク質、ウイルス表面抗原タンパク質などである。特に、リガンドが未知のGタンパク質共役型受容体であるオーファンレセプターのリガンド検索に好ましく用いられる。
　また、本発明の標的タンパク質としては、可溶性タンパク質やペプチドも対象となる。その場合は、グラム陰性細菌内膜に提示できるように、例えば、NIpA (Nature Biotechnology 25: 563-565, 2007)等と融合することで、適宜適用可能となる。
　したがって、本発明の標的タンパク質は、本来の生体膜タンパク質又は膜タンパク質と融合された可溶性タンパク質の場合があり得るが、本発明ではこれらをあわせて、単に「標的膜タンパク質」という。
　本発明のiPS&S法に用いることができる宿主細菌としては、ペリプラズム間隙を有するどのようなグラム陰性細菌、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）サルモネラ属（Salmonella）細菌なども適用可能であるが、好ましくは大腸菌である。また、ポリヌクレオチドライブラリーを導入するために用いる発現ベクターとしては、宿主細菌に適合する適宜の公知発現ベクター、好ましくは発現プラスミドを用いることができる。
　典型的な発現ベクター（発現用プラスミド）の調製法は以下の通りである。
　ランダム化したポリヌクレオチドの５’側に、直接もしくは必要に応じてスペーサーを介し、宿主細菌のペリプラズム間隙に輸送するためのシグナル配列を結合するが、その際に、ＯｍｐＡ外膜タンパク質など外膜タンパク質をコードする配列を付加しておくと、ペリプラズム間隙への分泌性が高まる（Protein Expression and Purification 64: 198-204 (2009)による。）。また、宿主細菌のペリプラズム間隙内の可溶性タンパク質（例えばジスルフィド異性化酵素DsbCなどの酵素タンパク質）との融合タンパク質として発現させることも、ペリプラズム間隙への分泌性向上に有効である（文献Protein Peptide Letters 9: 419-426 (2002)による。）。さらに、プロモーター配列を含む制御配列を付加する。好ましくは、３’側には停止コドンが付加するように設計する。その際、Strep・tagII配列などのタグを付加すると、ライブラリーの精製が容易になるのでさらに好ましい。これらのポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドは、標的膜タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターとは別の発現ベクター中に挿入することも可能であるが、同一の発現ベクター中に挿入することが好ましい。挿入位置は適宜決定できるが、標的膜タンパク質ＤＮＡの下流に導入することが好ましい。なお、標的となる膜タンパク質をマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現し得るようにフュージョンしたＤＮＡを用いると、可溶性と発現量が上がる可能性があり好ましい（J.Biol. Chem. 267: 8200-8206 (1992); J. Biochem. 127: 151-161 (2000)による。）。
　また、本発明のiPS&S法では、本発明のポリヌクレオチドライブラリー中の各ポリヌクレオチドがそれぞれ導入される形質転換グラム陰性菌の内膜には、標的膜タンパク質が発現される必要がある。そのため、形質転換グラム陰性細菌の内膜で発現するように標的膜タンパクをコードするDNAを含む発現ベクターも同時にもしくはあらかじめグラム陰性細菌宿主中に導入する。例えば、あらかじめ標的膜タンパクをコードするDNAで形質転換し、標的膜タンパクが内膜で発現していることが確認された形質転換細菌を用いて、本発明のポリヌクレオチドライブラリーを導入することもできる。しかし、両者を、同一の発現ベクター中に組み込むことが発現量を一定に調節できるので好ましい。すなわち、好ましい場合とは、標的膜タンパクをコードするDNAを含む発現ベクター中のタンデムな位置に、本発明のポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドを組み込む。その際の、両者の割合は１～１０：１０～１のうちの最適な数値（例えば１：１）に決定し、１回のスクリーニング中には変更しないことが好ましい。なお、発現時期をそろえるために、同一の制御領域下に組み込むこともできる。
２．ＩＣＫスキャフォールドを利用したポリペプチドライブラリーについて
　ＩＣＫスキャフォールドを利用したポリペプチドライブラリー（以下、ＩＣＫ型ポリペプチドライブラリーともいう。）は、構造安定性が高い上に、従来の３Ｆスキャフォールド型のライブラリーよりもサイズが小さい点で本発明のポリペプチドライブラリーとして特に好ましいので、以下，ＩＣＫ型ポリペプチドライブラリーを用いた場合について詳細に述べる。
（１）ＩＣＫスキャフォールドについて
　本発明において「ＩＣＫスキャフォールド」とは、クモやサソリ毒に見いだされる３０－７０アミノ酸残基からなるポリペプチドにおいて、６個のシステイン残基（Cys-1－Cys-6）が、Cys-1とCys-4、Cys-2とCys-5、及びCys-3とCys-6でS-S結合することにより形成する三次構造（図１）をいう。図２に、ＩＣＫスキャフォールドを有する代表的なポリペプチドのアミノ酸配列のアラインメントを示す。図の右端の数字はアミノ酸の長さである。このアラインメントに示されるポリペプチドの名称とプロテインデータベースのアクセッション番号を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図２の１行目に示すポリペプチドは、Grammostola spatulataから単離された新規なカルシウムチャネルブロッカー毒「A4-1」(特許文献３、非特許文献８)ポリペプチドである。
　A4-1は、34アミノ酸を含むICK型の毒素であり、カルシウムチャネルに結合してこれらを阻害することが見いだされている。ICKモチーフを含むペプチドは既に数多く知られており、それぞれがNa+チャネル、Ca2+チャネル、K+チャネルのブロッカーや酵素阻害など様々な生物活性を持つことが知られている。このペプチドの遺伝子は加速進化により、標的分子との相互作用に関係する領域に積極的にアミノ酸置換のおこる塩基置換(変異)を導入しているのが特徴で、これが標的分子の多様性を生み出す原因となっている。本発明者らは、この点に着目してICKモチーフを崩さないループ部分やテール領域にランダム配列を導入してICK型ランダムペプチドライブラリーを設計することを着想した。
　図２に、A4-1と、既知のチャネル阻害毒であるパウルトキシン(PaurTx3) やハイナントキシン(HnTx4) 等の一次アミノ酸配列のマルチプルアラインメントを示す。相同な配列はブロックで示されている。
　他のICK型ポリペプチドについても、図２のアラインメントに示されるICKモチーフをフレームワーク構造として利用することで、A4-1と同様のポリペプチドライブラリーを容易に作製することができる。
　なお、A4-1の三次構造は、BioPackage (MolSoft L.L.C., California, USA)の3Dモデリングソフトウエア部品を用いて予測され、ループおよびβシートの形成に関与する残基は、既知のハイナントキシン(HnTx4) の構造と比較して推定された（図３)。図３において、二次構造情報から得られるβ構造はリボン状矢印として示す。
　図１、図２に示されるように、Cys-1とCys-4、Cys-2とCys-5、Cys-3とCys-6とのそれぞれの間のS-S結合によって、３箇所のループ状の領域（Cys-1とCys-2の間の領域、Cys-2とCys-3の間の領域、Cys-5とCys-6の間の領域）が形成され、それぞれループI、ループII、ループIIIとよぶ（Cys-4とCys-5の間には主にβシート構造が存在する。）。これら３つのループ領域、及びCys-6からC末端側のテール領域が、カルシウムチャネルと結合する領域であると予測される。
（２）ポリペプチドライブラリーについて
　ICKスキャフォールド型のポリペプチドライブラリーにおいては、ICKスキャフォールドのループI，IIおよびIIIの領域とテール領域の一部のアミノ酸配列がランダム化されており、標的タンパク質と親和性の高いポリペプチドをスクリーニングするために用いられる。
　ＩＣＫスキャフォールドのアミノ酸配列中の下記の領域が同時にランダム化されることで、フレームワークを保ったまま、標的との結合特性の異なる種々のポリペプチドからなるライブラリーが得られる。
（ｉ）Cys-1とCys-2の間のループI領域中のCys-1のＣ末側４番目からCys-2のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉ）Cys-2とCys-3の間のループII領域中のCys-2のＣ末側３番目からCys-3のＮ末側１番目までのアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）Cys-5とCys-6の間のループIII領域中のCys-5のＣ末側２番目からCys-6のＮ末側３番目までのアミノ酸配列；および
（ｉｖ）Cys-6からC末端側のテール領域中のCys-6のＣ末側３番目からC末端までのアミノ酸配列。
　上記（ｉ）～（ｉｖ）領域の典型的な例としては、それぞれ図２の第１行に示されるポリペプチドＡ４－１のアミノ酸配列における（ｉ）６番目のメチオニンから８番目のリジンまでの３アミノ酸残基、（ｉｉ）１２番目のアスパラギン酸から１５番目のリジンまでの４アミノ酸残基，（ｉｉｉ）２５番目のアルギニンから２７番目のヒスチジンまでの３アミノ酸残基、及び（ｉｖ）３３番目のバリンから３４番目のフェニルアラニンまでの２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列があげられる。
　本発明では、以下の「A4-1」アミノ酸配列由来の、式〔１〕で示されるアミノ酸配列を含む複数のポリペプチド群からなるライブラリーを典型的なライブラリーとして用いた。
式〔１〕：
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2（配列番号２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
　このライブラリーでは12アミノ酸残基がランダムとなり、ライブラリーが持つ配列のバリエーションは、理論上2012 = 約1016 通りと極めて多様である。
　ＩＣＫスキャフォールドを有するポリペプチド、例えば図２に示されるポリペプチドについても、図２のアラインメントなどを参照することで、A4-1に基づくポリペプチドライブラリーと同様の手法で（ｉ）～（ｉｖ）領域をランダム化したポリペプチドライブラリーを製造することができる。
３．「iPS&S法」に用いるライブラリーの調製方法
（１）ポリヌクレオチドライブラリーの調製
　ランダムなアミノ酸配列を含むポリペプチドライブラリーの典型例として、クモ毒より同定したCa2+チャネル阻害ペプチド A4-1遺伝子を鋳型として調製した。A4-1は３４残基のアミノ酸からなり、配列相同性のあるペプチドの立体構造から、ICK（Inhibitor Cystine Knot）モチーフとよばれる分子骨格を形成すると考えられる。A4-1のループ領域にランダムなアミノ酸配列を含むランダムペプチドライブラリーに対応するポリヌクレオチドライブラリーを調製した。
　ポリヌクレオチドライブラリーを作製する際には、周知の遺伝子への変異導入方法が用いられる。典型的にはランダム配列を入れる所望のアミノ酸残基の位置にトリプレットコドンNNS（NはG、C、T、A。SはGあるいはC）のヌクレオチドを導入したオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせてPCRにより作製する（特許文献１，２などでも同様の手法が用いられている。UNIT 3.17 in “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1995の方法参照。）。その際、テール部にランダム導入するためのプライマーとしては、終止コドンをコードする塩基配列を用いることが好ましい。他に、酵素的に短いオリゴヌクレオチドを結合する方法（GENE, 164:49-53, 1995）や短いDNAをブロックとしてつなぐ人工遺伝子合成法（Slonomics社）などを用いることができる。
（２）コンストラクトの調製
　典型的な大腸菌発現用プラスミドの調製法について以下に述べる。
　ランダム化したポリヌクレオチドの５’側に、大腸菌のペリプラズム間隙に輸送するためのシグナル配列に続いて精製用のタグ配列をアミノ末端側に配し、かつ外膜タンパク質（OmpAなど）及び大腸菌のペリプラズム間隙内酵素（DsbCなど）との融合タンパク質として発現させるように、プロモーター配列を含む制御配列を付加し、３’側には停止コドンが付加するようにプラスミドを設計する。
　標的膜タンパク質分子（ムスカリン性アセチルコリンｍ２受容体）とマルトース結合タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡがプロモーター配列と共に、同一の発現プラスミド内に挿入されるように設計することが好ましい。
　ここで、ヒトｍ2受容体のｃＤＮＡ塩基配列は、DNAデータベースAccession No. BC106742から得られる。
　本発明の宿主微生物としては、ペリプラズム間隙を有するグラム陰性細菌であり、その発現ベクターが入手可能であればどのような細菌であってもよいが、典型的には大腸菌を用いる。
　形質転換手法及び培養条件などは通常の遺伝子組換え手法が適用できる。
４．「iPS&S法」を用いたハイスループットスクリーニング
　iPS&S法においては、ポリヌクレオチドとそれに対応したポリペプチドから構成されるポリペプチドライブラリーは、大腸菌内に導入したベクターとそれにより発現したポリペプチドが標的に結合したときに初めて形成される（図４）。すなわち、標的となる膜タンパク質は大腸菌の内膜に発現させるとともに、ポリペプチドはペリプラズム間隙に発現させる（図１２）。標的にポリペプチドが結合したときには、スフェロプラストとポリペプチドが複合体を形成し、ポリヌクレオチドとポリペプチドが間接的に対応づけられる。標的にポリペプチドが結合しないときには、スフェロプラストと複合体を形成することができないのでＰＣＲしてもポリヌクレオチドのライブラリーを構成することができない。したがって、ポリペプチドライブラリーを構成したポリヌクレオチドライブラリーのみが第２のポリヌクレオチドライブラリーとなり、試験管内分子進化がきわめて簡便に適用でき、より標的親和性の高いポリペプチドを効率的に取得できる。
　具体的には、大腸菌などの外膜を除いてスフェロプラストの状態にした後、洗浄して非結合性のペプチドを除去する。
　次いで、内膜表面に発現している膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する。
　その際の選択方法としては、そのN末端側に付加したタグ（Strep-tagなど）を用いてStreptactinビーズで選択してくる方法が典型的であり、タグとしては、他にT7、ヒスチジン、FLAGタグ等があり、磁気ビーズ、セファロースビーズ、アガロースビーズ、多孔性等のビーズ、プレート又はメンブレンを用いて選択してもよい。
　選択された、ビーズに固定された状態の「ポリペプチド－膜タンパク質－スフェロプラスト複合体」のスフェロプラスト細胞内部のプラスミドＤＮＡを単離し、当該プラスミドＤＮＡ中でポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチド配列をＰＣＲで増幅する。
　当該増幅されたポリヌクレオチド配列をもとに同様の発現プラスミドを作製し、形質転換、発現、選択という２ラウンド以降のサイクルを複数回繰り返して、より標的膜タンパク質に対する親和性の高いポリヌクレオチドを濃縮する。
　第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては、ポリペプチド－膜タンパク質－スフェロプラスト複合体のインキュベーション時間を減少させたり、洗浄の回数を増加させたり、温度を上げることにより、
選択圧を順次高くして、より結合親和性の高いポリペプチドを濃縮することができる。
　また、本発明のポリペプチド－ポリヌクレオチドライブラリーのサイズが小さい場合（ランダム化する対象のアミノ酸配列領域が少ない場合）、は下記の公知の試験管内分子進化技術が適用できる。または、上記した十分に選択、濃縮されてサイズの小さくなった高親和性ポリペプチド－ポリヌクレオチドに対して当該分子進化技術を適用することで、より高親和性のポリペプチド－ポリヌクレオチドを取得することができる。
　具体的には、１ラウンド目のスクリーニング終了後、２ラウンド目の第２のポリペプチドライブラリーを分子進化の手法を適用して作製することができる。すなわち、標的に結合するとして選択されたポリペプチドの配列を決定した後、その配列の一部をさらにランダム化したいわゆる子孫ライブラリーを作製する手法である。配列の一部のランダム化とは、例えば、選択されたポリペプチドのランダム化領域のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入し、残りのアミノ酸配列は固定化したアミノ酸配列を設計する。
　その際には、ある領域(例えばループＩ)のアミノ酸配列は固定して別の領域(例えばループII)のアミノ酸配列に１個あるいは複数の変異を導入したアミノ酸配列を設計する、選択された複数のポリペプチドのランダム化領域に現れたアミノ酸残基をシャッフリングしてこれらを混成させた新たなアミノ酸配列を設計する、などの方法により行うことが好ましい。
　このようにして、一部のアミノ酸配列が前ラウンドで選択されたポリペプチドのアミノ酸配列と同じであり残りのアミノ酸が異なる複数のポリペプチドの群からなる第２のポリペプチドライブラリーを製造することができる。次に、この第２のポリペプチドライブラリーを用いて標的と結合するポリペプチドを選択し、以下同様にして、複数のラウンドの選択およびライブラリーのさらなるランダム化を行うことができる。このようにして、標的に結合しうるポリペプチドにさらに変異を導入して人工的な分子進化を促進することが可能となる。
通常、好ましくは２～１０ラウンド、より好ましくは３～８ラウンド繰り返すことで、より標的親和性の高いポリペプチドを得ることができる。
　確認、評価のための手法としては、標的膜タンパク質遺伝子をあらかじめ卵母細胞や培養細胞に導入して発現させた系を用意し、選択されたポリペプチドと標的膜タンパク質を含む膜画分との親和性を測定する手法が用いられる。他には、膜タンパク質を介して起こる様々なシグナル伝達、例えば細胞内カルシウム、cAMP、アラキドン酸濃度の変化や電位変化をそれぞれの感受性蛍光色素により測定したり、放射性同位元素等による細胞内外のフラックス測定をしたり、標的膜タンパク質を含む人工脂質膜再構成系を基板に固定して、それとポリペプチドとの相互作用を表面プラズモン共鳴（SPR）や水晶発振マイクロバランス（QCM）等の装置で測定する手段がある。あるいは細胞の増殖、生死、分化などの変化を調べる手段がある。
５．本発明の実施態様
　以下に、本発明のiPS&S法に適用できる典型的なICKスキャフォールドを有するA4-1に基づくライブラリーを用いた場合を例として、本発明のiPS&S法における試験管分子進化手法による、標的と親和性の高いポリペプチドのスクリーニング方法を実施態様として説明する。なお、本発明は、当該実施態様には限定されない。
（１）ポリペプチドライブラリー
　A4-1のICKスキャフォールドに基づいて作製されたポリペプチドライブラリーは、下記のアミノ酸配列からなる式〔１〕のポリペプチドの群から構成される。
式〔１〕
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2（配列番号２）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である）
　ここで、式〔１〕は、カルシウムチャネルの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む３つのループ領域およびテール領域がランダム化されている構造を有する。図２に示されるように、ループを形成していると予測される領域およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。さらに、テール領域のアミノ酸残基もランダム化した。ベータシートを形成しているアミノ酸は変更していない。
（２）ICKインビボライブラリー用のコンストラクトの調製
　A4-1遺伝子を含むためには、ループおよびC末端部分のアミノ酸配列をランダム化したA4-1遺伝子の５’側にSD配列およびプロモーター配列、スペーサー、OmpAのシグナル配列、Strep・tagII配列、および大腸菌のDsbCタンパク質を付加し、３’側には停止コドンが付加するように設計した（図６を参照）。さらに、これらの上流には標的となるムスカリン性アセチルコリン受容体がマルトース結合タンパク質とフュージョンする形で付加されている。プロモーター配列およびSD配列は、A4-1遺伝子の大腸菌での転写および翻訳に、 DsbCタンパク質は、A4-1遺伝子から発現されるポリペプチドの安定なジスルフィド結合形成の促進に、OmpA配列は、A4-1遺伝子から発現されるポリペプチドがペリプラズム間隙に移行するように、Strep・tagII配列は、ライブラリーの精製に用いるための配列である。得られた全長コンストラクトを直接配列決定して確認している。
　具体的には、以下の手順で行った。
　ムスカリン性アセチルコリン受容体m2サブタイプは、Furukawaらの方法（H. Furukawa and T. Haga: J. Biochem. (2000) 127, 151-161）に従い、マルトース結合タンパク質（MBP）との融合タンパク質として大腸菌内膜に発現させた。一方、ICKモチーフを持つポリペプチドは、大腸菌の外膜タンパク質OmpAのシグナルペプチド配列に続いて精製用のタグ配列Strep tag IIをアミノ末端側に配して、ジスルフィド異性化酵素DsbCとの融合タンパク質としてペリプラズムに発現させるようにプラスミドの構築を行った（図５A）。このプラスミドDNAを用いて大腸菌のトランスフォーメーションを行った。MBP (43 kDa)と融合したm2（35 kDa）およびDsbC (25 kDa)と融合したICK型ペプチド (4 kDa)の発現は、それぞれ抗MBP抗体および抗Strep-tag抗体によるWesternブロット法により、理論値のサイズ（78 kDaと29 kDa）のバンドが確認できた（図５B）。図５Aに示す受容体とペプチドをタンデムにコードするプラスミドDNAにより大腸菌の形質転換を行うことにより、受容体を内膜に発現し、同時にペプチドをペリプラズム間隙に分泌する発現系を構築することができた。
（３）スクリーニング及び分子進化工程
　A4-1由来ICKライブラリーとｍ２受容体をともに大腸菌内のペリプラズム間隙で発現させる。その後、大腸菌の外膜を除きスフェロプラストの状態にし、Strep・tactinビーズとともにインキュベートする。数回洗浄した後に、ｍ２受容体に結合したポリペプチドを含むポリペプチド・受容体・大腸菌の複合体を溶出する。溶出した大腸菌に含まれるポリペプチドをコードする遺伝子をPCR増幅し、Subtractionをした後にベクターに導入する。このベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし、上述のようにICKとｍ２受容体を共発現させる。このようにして、複数ラウンドの選択およびポリペプチドライブラリー生成を行うことができる。第２ラウンド以降の選択のラウンドにおいては、ICKと標的とのインキュベーション時間を減少させ、洗浄の回数を増加させることにより、選択圧を順次高くして、より結合親和性の高いポリペプチドを濃縮することができる。
　具体的には、以下の手順でm2受容体結合ペプチドをスクリーニングした。
　形質転換した大腸菌においては、それぞれのペリプラズムで発現したICK型ペプチドとm2受容体が相互作用する。この中で強い結合活性のあるものを選択した。それには先ず、大腸菌の外膜を除いてスフェロプラストの状態にして、非結合性のペプチドを除去する。受容体と結合したペプチドは、そのN末端側に付加したStrep-tagを用いてStreptactinビーズで選択してくる。即ち、Streptactin‐[Strep-tag‐ペプチド]‐[m2受容体‐大腸菌（スフェロプラスト）]の複合体が選択されてくる。m2受容体と結合するペプチドの配列情報は、同時に釣られてくる大腸菌が持つプラスミドDNAに含まれるため、この配列をPCRで増幅して、２ラウンド目以降の発現・選択のサイクルを続けて、目的の配列遺伝子を濃縮する（図４）。
　選択のサイクルを６ラウンド行った結果、以下の６グループ１０種類のペプチドを同定した。
（４）本発明のスクリーニングで得られるポリペプチド
　以下の実施例に示されるように、本発明においては、６ラウンドの選択およびライブラリーの生成により、ｍ２受容体と結合しうる１０種類のペプチドを同定した。２～４程度のアミノ酸変異を１グループとすると大きく６グループに分けられる。
以下、それぞれをグループＡ～Ｆといい、グループ内のポリペプチドをPepA～Fという。（なお、基のライブラリーでランダム化した領域を下線で示す）
（Ａ）グループＡ
　グループＡのポリペプチドは、下記の式〔２〕で表される。
式〔２〕：
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX 1 X 2 KWCKYX 3 X 4 （配列番号３）
（式中、X1はV,L又はGであり、X2はA又はGであり、X3はA,P,Y又はなくてもよく、X4はN,I,L又はなくてもよい。）
具体的には、以下の４つのポリペプチドである。
PepA-1: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY　（配列番号４）
PepA-2: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN　（配列番号５）
PepA-3: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI　（配列番号６）
PepA-4: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL　（配列番号７）
（Ｂ）グループＢ
PepB：DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM　（配列番号８）
（Ｃ）グループＣ
PepC：DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH　（配列番号９）
（Ｄ）グループＤ
PepD：DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL　（配列番号１０）
（Ｅ）グループＥ
PepE：DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI　（配列番号１１）
（Ｆ）グループＦ
　グループＦのポリペプチドは、下記の式〔３〕で表される。
式〔３〕：
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX 5 X 6 　（配列番号１２）
（式中、X5はA又はDであり、X6はL又はYである。）
具体的には、以下の２つのポリペプチドである。
PepF-1：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL　（配列番号１３）
PepF-2：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY　（配列番号１４）
　これらのポリペプチドのうち発現量が多かったPepA-1（配列番号４）、PepA-2（配列番号５）及びPepC（配列番号９）の３種類のポリペプチドに対して、以下の手順でm2受容体結合ペプチドの特性解析を行った。
　ムスカリン性アセチルコリン受容体（mAChR）m1, m2, m3, およびm4サブタイプは、それぞれのcDNAから合成したRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微小注入して細胞膜上に受容体を発現させ、受容体を含む膜画分として調製した。PepA-1、PepA-2及びPepCは大腸菌において遺伝子組換え体として発現し、それを精製した。受容体の結合競合物質として[3H]-N-methylscopolamine（[3H]-NMS）を用い、ペプチドとの結合競合実験を行った。
　その結果、PepA-1は6.0 mMで54.6%、PepA-2は5.4 mMで46.0％、PepCは365 nMで 37.5％、m2とNMSとの結合を阻害した。一方PepCのm2以外のサブタイプm1、m3、m4に対する阻害率は、438 nMにおいてそれぞれ6.0％、10.4％、6.2％であり、PepCは他のmAChRサブタイプと区別してm2受容体を特異的に阻害することが分かった。
　これら３種類のポリペプチドを含め、配列番号３～１４で示されるポリペプチドは、いずれもｍ２受容体との結合の阻害剤として、種々の疾患の治療に有用であると考えられる。
　このように、本発明のiPS&S法は、標的タンパク質との高親和性ポリペプチドを取得するためのきわめて有効な手法であることが実証できた。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
　なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
　また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。
（実施例１）クモ毒ポリペプチドの分子骨格をもつポリペプチドライブラリーの作製
　バクテリアディスプレイ法による進化工学を用いて、標的と結合しうるクモ毒様ポリペプチドを取得するために、ICKモチーフのポリペプチドPeak A4-1の３つのループ領域とテール領域をランダム化したポリペプチドライブラリーを作製した。クモ毒様ポリペプチドのシステインのフレームワークは、いくつかの短い神経毒の間で保存されていることが知られている。カルシウムイオンチャネルへの結合に関与すると推定されているアミノ酸を含む部分およびその周辺のアミノ酸残基をランダム化した。
（１－１）　クモ毒様ポリペプチドライブラリー用の全長コンストラクトの調製
　クモ毒様ポリペプチドライブラリー用の全長コンストラクトは、PeakA4-1toxin cDNAを鋳型とし、そのループ部分３ヶ所およびC末端部分のアミノ酸配列をランダムした。即ち、PeakA4-1toxinの塩基配列上、ループIのM6－K8（３アミノ酸）、ループIIのD12－K15（４アミノ酸）、ループIVのR25－H27（３アミノ酸）およびC末端のV33－F34（２アミノ酸）をランダム化した。ポリペプチドコード領域の最後は２つの停止コドン（TGAおよびTAG）を導入し、さらに１９塩基対の3’‐ノンコーディング領域を付加するよう設計した。
　PeakA4-1toxinを鋳型とする上述のヌクレオチド配列を15 bpのオーバーラップを含む2つのオリゴヌクレオチドで合成し、PCRにより全長を合成した。オリゴヌクレオチドは慣用のオペロンバイオテクノロジー株式会社により合成した。２つのフラグメントは共に、ループ配列に対応するランダム化ヌクレオチドを含む。第１のフラグメントは３つのランダム化領域を含む。第２のフラグメントはC末端の１つのランダム化領域、停止コドンおよび3’ノンコーディング領域を含む。これら２つのフラグメントの3’側にオーバーラップ配列を含む。この実験に用いたオリゴヌクレオチドの一覧を以下に示す。NはA、G、CまたはTを表し、SはCまたはGを表す。
 
F1:5’-GACTGTTTAGGATTT(NNS)3TGCATCCCC(NNS)4TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT(NNS)3 AAATGGTGTAAATAT-3’（配列番号１５）
F2:5’-ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA(SNN)2 ATATTTACACCATTT-3’（配列番号１６）
 
　下線を付した配列はPCR用のオーバーラップ配列を示す。
　PCRは、2.5U／μlのPfuTurboCx Hotstart DNAポリメラーゼ（STRATAGENE）および100 pmolのフラグメントを用いて製造元から供給されたバッファ中で行った。94℃を30秒間、55℃を30秒間および72℃を30秒間で3サイクル行った。
（１－２）　配列決定による初期ライブラリーの質の評価
　次に、上述で得られた全長コンストラクトを用いてライブラリーをプラスミドベクターpCR2.1TOPO (Invitrogen)にクローニングして、１０個の単一コロニーを無作為に取り出し、配列決定した。１０個のクローンのすべてにおいて、ランダム化した領域の塩基配列は異なっており、ライブラリーが適切な多様性からなることが確認された。ヌクレオチドの組成についても、SについてはCまたはGのいずれか、Nについては４つのヌクレオチドのいずれかを含むことが確認された。したがって、上述の方法により作製したライブラリーは、多様性および質の点で満足しうるものであった。
（実施例２）膜タンパク質とポリペプチドライブラリーを発現するプラスミドベクターの構築
　大腸菌内で発現させたm2は内膜に、ポリペプチドはペリプラズム間隙に発現するように設計した。また、それらの発現量および個々の大腸菌で大きな差が出ないようにするため、一つのベクターにタンデムに並べて発現できるようにした。
（２－１）　クモ毒様ポリペプチドライブラリーとムスカリン性アセチルコリン受容体ｍ２をコードするプラスミドの作製
　pGRIIMBPM2LDHNDATG＋（H. Furukawa and T. Haga: J. Biochem. (2000) 127, 151-161）は、膜タンパク質であるムスカリン性アセチルコリン受容体（m2）にマルトース結合タンパク質（MBP）をフュージョンタンパク質として大腸菌の内膜に発現するベクターである。このベクターのm2の下流にある制限酵素サイト（HindIII）を切断した。
　pET27b(+)（Invitrogen）は、大腸菌によるタンパク質の発現用のベクターとして用いられている。このベクターのrbsからT7terminatorの配列をPCRした。そのPCR産物をIn-Fusion PCR Cloning System（Clontech）を用いて上記のベクターにクローニングを行った（pGRII-IF）。
 
PCR forward：5’-GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA-3’（配列番号１７）
PCR reverse：5’-GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG-3’（配列番号１８）
 
　pET40b(+)（Invitrogen）は、大腸菌内で発現したポリペプチドをペリプラズム間隙に移行させるのに関与するDsbC配列を468 nt（塩基配列番号）から1115 ntに含むベクターである。このDsbC配列を、pET40b(+)をテンプレートとしてPCRにて調製し（PCR forward 1およびreverse 1）、SacIIにて切断した（フラグメント１）。A4-1をテンプレートにPCR forward 2およびreverse 2でPCRを行い、SacIIで切断した（フラグメント２）。その後、PCR１フラグメントおよびPCR２フラグメントをライゲーションし、これをテンプレートにPCR forward 3およびPCR reverse 2を用いてPCRを行った（フラグメント３）。このPCRにてStrep・tagII－DsbC－A4-1のフラグメントができ、これをNheIで切断した。pET27b(+)上にあるXbaIサイト（380 nt）をQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE）にてTCTAGAをTGTAGAにし、pelBのシグナル配列とOmpAのシグナル配列を交換したものを作製した。これをテンプレートにして、PCR forward 4およびPCR reverse 3にてPCRを行った。これにより、T７プロモータからOmpAを含んだフラグメントを作製し（フラグメント４）、NheIで切断した。フラグメント３および４をライゲーションし、さらにこれをテンプレートにしてPCR forward 4およびPCR reverse 2でPCRを行った後、pCR2.1にクローニングした。クローニングしたプラスミドからPstIおよびEcoRIで切り出しを行いそのフラグメントをpGRII-IFベクターの同じ制限酵素サイトにクローニングした（pGRII-Tx、図6参照）。
 
PCR forward 1 5’-CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT-3’（配列番号１９）
PCR reverse 1：5’-TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT-3’（配列番号２０）
PCR forward 2：5’-GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA-3’（配列番号２１）
PCR reverse 2：5’-GAATTCTTAAAATACATA-3’（配列番号２２）
PCR forward 3：5’-CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA-3’（配列番号２３）
PCR reverse 3：5’-CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA-3’（配列番号２４）
PCR forward-4：5’-CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA-3’（配列番号２５）
 
　USER friendly DNA engineering method（New England Biolabs）のUSER cassette配列をオペロンバイオテクノロジー株式会社にて２つのフラグメントに合成した。PCR forward 1およびPCR reverseでPCR行い、USER cassetteを作製した。これをテンプレートにしてPCR forward 2およびreverseでPCRを行った。PCR産物をSacIIにて切断した(SacII-USER)。このフラグメントとSacIIで切断したpGRII-Txをライゲーションし、上記のPCR forward 4（配列番号２５）と下記PCR reverse（配列番号２７）でPCRを行い、pCR2.1にクローンニングした。得られたプラスミドからPstIおよびEcoRIで切り出しを行い、これをpGRII-Txのおなじサイトにクローニングした（pGRII-USER、図７参照）。得られたベクターの配列はDNAシークエンサーにて確認した。
 
PCR forward 1：5’-CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT-3’（配列番号２６）
PCR reverse：5’-GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT-3’（配列番号２７）
PCR forward 2：5’-TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT-3’（配列番号２８）
 
　このベクターをXbaIおよびNt.BbvCI（New England Biolabs）で切断した（m2-USER）。このベクターをUSER friendly DNA engineering methodを用いたクローニング用のベクターとして以下の実験に用いた。
　ランダム化したポリペプチドを、調製したベクターにクローニングする際には、ランダム化ポリペプチドをコードするヌクレオチドを用いて、PfuTurboCx Hotstart DNAポリメラーゼでPCR（95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間）を25サイクルした。PCR産物、m2-USERおよびUSER enzyme（New England Biolabs）を混合し、室温で15分間反応させた。反応液にLigation High（TOYOBO）を添加し、さらに15分間反応させた。最終的に得られた反応液を大腸菌にトランスフォーメーションし、LB－アンピシリン（75 μg/ml）のプレートにまいて、一晩培養した。PCRに用いたプライマーを以下に示す。ここで、UはUracilを示している。
PCR forward：5’-GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA-3’（配列番号２９）
PCR reverse：5’-GGGAAAGUATCTGCAGAATT-3’（配列番号３０）
（２－２）　大腸菌での発現確認
　大腸菌にベクターをトランスフォーメーションし、発現誘導をかけた後に膜タンパク質およびポリペプチドの発現の確認を行った。大腸菌を6000 x gで10分間で集菌し、20 mMのTris-HCl（pH 7.5）にて洗浄した。その細胞を用いてペリプラズム画分およびスフェロプラスト画分を調製した。スフェロプラスト画分は、緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、1 mM EDTA，25％ Sucrose，0.5 mM phenylmethylsulphonyl fluoride）に懸濁し、超音波処理した。150000 x gで1時間の遠心分離により、細胞を回収し、これを緩衝液（20 mM Tris-HCl (pH 7.4)，500 mM NaClおよび1mM EDTA）で懸濁した。150000 x gで1時間の遠心分離で細胞を回収し、20 mM Tris-HCl (pH 7.4)で懸濁することで膜画分を得た。ペリプラズム画分および膜画分を電気泳動（SDS-PAGE）に供し、ウエスタンブロットにて発現の確認をした。ペリプラズム画分はStrep・tagII抗体を用いてポリペプチドの発現を、膜画分はMBP抗体によりm2の検出をした。その結果、ペリプラズム画分には、約29 kDaにポリペプチドに付加したStrep・tagIIのバンドを、また膜内膜画分では、約78 kDaにm2に付加したMBPのバンドを検出した（図５B）。これらの結果により、ポリペプチド発現はペリプラズム間隙に、m2受容体の発現は内膜にそれぞれ確認できた。
（実験例３）クモ毒様ポリペプチドライブラリーからのｍ２受容体結合ポリペプチドの選択
（３－１）　クモ毒様ポリペプチドの発現とｍ２受容体への結合
　大腸菌中で発現させたm2およびクモ様ポリペプチドは培養中に菌体内のペリプラズム間隙で反応する。ペリプラズム間隙を反応の場とすることでそれぞれの大腸菌でポリペプチドとm2の反応ができる。ランダム化ポリペプチドを配したベクターを大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養したプレートからLB－アンピシリンの液体培地で菌体を回収し、OD600が0.6に達するまで増殖させた。培養物を0.5 mM IPTGで20℃で24時間誘導した。
（３－２）　スフェロプラストの調製
　スフェロプラストは大腸菌にある内膜および外膜の２つのうち、外膜だけを除去した状態である。このようにすることで内膜に発現したm2に結合しているポリペプチドをポリペプチドスフェロプラスト複合体として回収することができる（図４）。大腸菌の培養液から細胞を6000 x gの遠心10分間で回収し、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）にて2回洗浄した。回収した細胞を、高張液（20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，0.5 mM EDTA，20％ Sucrose，1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride）に懸濁し、氷上で10分間インキュベーションした。12000 x gで10分間の遠心分離により、細胞を回収した。これを低張液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)）に懸濁し、氷上で10分間インキュベーションした。12000 x gで10分間の遠心分離により、回収した画分をスフェロプラストとした。
（３－３）　ｍ２受容体結合ポリペプチドの選択
　上述のようにスフェロプラストを調製した後、クモ様ポリペプチドに付加したStrep・tagIIをStrep tactin (Magnetic Beads, QIAGEN)で結合させた。これを緩衝液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，1 M NaCl，0.1% TritonX-100）で十分洗浄し、非特異的に結合している物質を除去した（図４）。ビオチン溶液で溶出することで特異的に結合しているポリペプチドスフェロプラスト複合体をStrep tactinより回収した。この回収した溶液を用いてPCR（95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間）を３０サイクルした。以下にPCRで用いたプライマーの配列を示す。ここで[Bio]はビオチンが付加されていることを示す。
 
PCR forward：5’- [Bio]-GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA-3’（配列番号３１）
PCR reverse：5’-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3’（配列番号３２）
（３－４）　ｍ２受容体結合ポリペプチドの配列の確認
　m2に結合するポリペプチドの配列を明らかにするために、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているプラスミドを回収してそのDNA配列をDNAシークエンサーで確認した。6ラウンド終了後に得られたコロニーを無作為に選び、菌体をLB－アンピシリンの培地中でOD600が0.6に達するまで培養した。菌体を回収後、プラスミドをWizard MagneSil Plasmid Purification System（Promega）により得た。得られたプラスミドの濃度をOD260により測定し、サンプルあたり200 ngになるようにプレートに分注した。シークエンスは株式会社ベックスに依頼し、プラスミドに含まれるポリペプチドのDNA配列を確認した。ランダム化した配列の類似性に基づいて6つのグループに分けることができた。これらグループのポリペプチド配列上の非ランダム化配列に変異は入っていなかった。
　選択のサイクル６ラウンド終了後、１０種類のペプチドを同定した。２～４程度のアミノ酸変異を１グループとすると大きく６グループに分けられる。以下、それぞれをグループＡ～Ｆといい、グループ内のポリペプチドをPepA～Fという。（なお、基のライブラリーでランダム化した領域を下線で示す）
（Ａ）グループＡ
　グループＡのポリペプチドは、下記の式〔２〕で表される。
式〔２〕：
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX 1 X 2 KWCKYX 3 X 4 （配列番号３）
（式中、X1はV,L又はGであり、X2はA又はGであり、X3はA,P,Y又はなくてもよく、X4はN,I,L又はなくてもよい。）
具体的には、以下の４つのポリペプチドである。
PepA-1: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY　（配列番号４）
PepA-2: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN　（配列番号５）
PepA-3: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI　（配列番号６）
PepA-4: DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL　（配列番号７）
（Ｂ）グループＢ
PepB：DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM　（配列番号８）
（Ｃ）グループＣ
PepC：DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH　（配列番号９）
（Ｄ）グループＤ
PepD：DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL　（配列番号１０）
（Ｅ）グループＥ
PepE：DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI　（配列番号１１）
（Ｆ）グループＦ
　グループＦのポリペプチドは、下記の式〔３〕で表される。
式〔３〕：
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX 5 X 6 　（配列番号１２）
（式中、X5はA又はDであり、X6はL又はYである。）
具体的には、以下の２つのポリペプチドである。
PepF-1：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL　（配列番号１３）
PepF-2：DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY　（配列番号１４）
（３－５）　ポリペプチドの調製
　得られたm2結合ポリペプチドについてさらに詳細に調べるために、全てのクローンからポリペプチドを調製した。ポリペプチドは、pBAD/TOPOThio融合発現キット（Invitrogen）を一部改変して用いチオレドキシン融合タンパク質として調製した。改変した部分は、pBAD/TOPOThioベクターのチオレドキシンのN末端側にStrep・tagIIを挿入した点およびエンテロキナーゼ認識配列のC末端側にPreScission酵素（GE Healthcare）の認識配列を挿入した点である。m2結合ポリペプチドをコードするプラスミドからDNAを増幅し、pBAD/TOPOThio改変ベクター中にクローニングし、大腸菌にトランスフォームした。配列決定によりフレームの確認をした。
　ポジティブクローンをLB－アンピシリンの培地中でOD600が0.5に達するまで培養した。培養物を0.02%アラビノースで25℃で3時間誘導した。3000 rpmで20分間で細胞を回収し、超音波処理をした。溶解物を遠心分離し、上清（可溶性画分）およびペレット（不溶性画分）に分離し、SDS-PAGEで解析した。可溶性画分は発現したポリペプチドのStrep・tagIIについてStrep tactin（IBA GmbH）アフィニティーカラムで非変性条件化で結合させ、融合タンパク質をPreScission酵素で切断した。融合タンパク質が除かれたポリペプチドを回収し、Lowry法によりタンパク質の定量をした。
　ここで、得られた１０ポリペプチドのうち、PepA-1、PepA-2及びPepCについては発現量が充分確保できたので、この３ポリペプチドを以下の各結合実験に供し、m2受容体との親和性、特異性を客観的に評価する。
（３－６）　ポリペプチドとｍ２受容体との結合実験
　ポリペプチドの活性および結合様式を評価するために、上記ポリペプチドのうちのPepA-1、PepA-2及びPepCを用いてm2との結合実験を行った。m2は、アフリカツメガエルの卵母細胞にm2タンパク質をコードするcRNAを導入し、細胞膜上に発現した膜画分を用いた。m2の結合競合物質として、トリチウム標識した[3H]-N-methylscopolamine（[3H]-NMS）を用い、これを緩衝液（20 mM Tris-malate (pH 7.5)）に溶解した。精製したポリペプチド、膜画分および[3H]-NMSを混合し、30℃で60分間インキュベートした。反応液をグラスフィルタに通し膜画分をトラップし、20 mM リン酸カリウム緩衝液でよく洗浄して非特異的な結合を除去した。グラスフィルタを乾燥させ、バイアルに移しシンチレーションカクテル中でシンチレーションカウンタを測定した。PepA-1は6.0μMで54.6%、PepA-2は5.4μMで46.0％、PepCは365 nMで37.5%の結合阻害が示され、m2に対するアンタゴニスト作用がみられた（図９）。
（３－７）　ポリペプチドとｍ２以外のムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプとの結合実験
　ムスカリン性アセチルコリン受容体には、m2以外にもm1、m3およびm4のサブタイプがある。ポリペプチドの特異性を明らかにするためにサブタイプに対する結合実験を行った。これら受容体のcRNAをそれぞれ調製し、上述と同様の方法でサブタイプに対する結合阻害を測定した。PepCは438 nMの濃度で、m1に対して6.0%、m3に対して10.4%およびm4に対して6.2％の阻害があり、またｍ2に対しては365 nMで37.5%の結合阻害が見られた。このことは、PepCがムスカリン性アセチルコリン受容体サブタイプの中でm2を選択的に阻害することを示している。
（実験例４）ｍ２結合ポリペプチドの標的特異性評価
（４－１）　非特異的吸着ポリペプチドの除去
　ランダム化したポリペプチドがm2以外の内膜タンパク質等に結合する非特異的吸着が予想されることから、この非特異的結合を除くためにサブトラクションをした。予めm2を除いたベクター（Non-m2-USER）を用意し、これにランダム化ポリペプチドをクローニングした。大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養したプレートからコロニーを回収した。回収した菌培養液のOD600が0.6に達するまで培養し、0.5 mM IPTGで24時間誘導した。遠心分離により菌体を回収し、スフェロプラストを調製した。これをStrep tactinで回収し、F1およびF2でPCR（95℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で30秒間）を30サイクルしたものを非特異的吸着のDNAとした。このPCRでは、リバースプライマーの5’側にビオチンを付したもの使った。非特異的吸着DNAをアビジンコートの磁気ビーズ（MAGNOTEX-SA,TAKARA BIO INC.）に結合させ、アルカリ処理することで結合させたDNAを一本鎖にし、磁気ビーズ結合の非特異的吸着一本鎖DNA（Non-speDI）を準備した（図８）。以下にPCRに使用したF1およびF2の配列を示す。[Bio]はビオチンを付していることを示している。
PCR forward：5’-GAGGAGACATCAGACTGTTTAGGA-3’（配列番号３１）
PCR reverse：5’- [Bio]-TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT-3’（配列番号３２）
　m2を含むベクターで調製して得られたm2結合ポリペプチドをコードするDNAをPCRにて調製した。このPCR産物を熱処理により一本鎖にして、Non-speDIと50℃でアニーリングをした。これにより非特異的なDNAはNon-speDIのDNAと二本鎖を形成する。アニーリング後に二本鎖を形成しなかったDNAを磁気ビーズにより回収し、回収したDNAをテンプレートにPCRしたものを次に進めた（図８）。
（４－２）　選択されたm２結合ポリペプチドの標的特異性の評価
　グループAのPepA-1（配列番号４）を用いてm2を特異的に標的にしているのかを評価した。PepA-1のプラスミドからDNAを増幅し、m2を含まないベクター（Non-m2-USER）にクローニングした。また対照となるペプチドとして、6ラウンドまでセレクションに残ったが、ポリペプチドのランダム化配列の所で停止コドンが入ったもの（truncated peptide）をクローニングして比較した（図１０A）。これらをそれぞれ大腸菌にトランスフォーメーションし、一晩培養した。培養したプレートからコロニーを回収し、0.5 mM IPTGで24時間誘導した。遠心分離により、回収した菌体からスフェロプラストを調製し、Strep・tactinで回収した。回収したスフェロプラストを使ってPCRを行い、電気泳動によりバンドが検出されるかをみた。Truncated peptideではバンドが現れ、一方、PepA-1を発現したサンプルからはバンドは見られなかったことから、PepA-1は大腸菌内膜などに非特異的に吸着していたのではなく、m2と特異的に結合していたことが確認できた（図１０B、図１１参照）。また、この時に両方のペプチドがペリプラズムに発現していることは、回収したペリプラズム画分を電気泳動とウエスタンブロットで解析することにより確認した（図１０C）。
＜ICK scaffold polypeptide library＞
１．Polypeptide A4-1
DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF
２．A4-1-based　polypeptide library
DCLGF(X)3CIP(X)4CCRPNLVCS(X)3KWCKY(X)2
（X＝any amino acid)
３．PepA（Group A）
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVX1X2KWCKYX3X4
（X1＝V,L or G、X2＝A or G、X3＝A,P,Y or not、X4＝N,I,L or not）
４．PepA-1 
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKY
５．PepA-2
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVVAKWCKYAN
６．PepA-3
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVLGKWCKYPI
７．PepA-4
DCLGFRRGCIPVGELCCRPNLVCSVGAKWCKYYL
８．PepB(Group B）
DCLGFRWRCIPGINLCCRPNLVCSNSKKWCKYVM
９．PepC（Group C）
DCLGFSMGCIPNQVRCCRPNLVCSVDLKWCKYSH
１０．PepD（Group D）
DCLGFRWSCIPWEASCCRPNLVCSDWKKWCKYIL
１１．PepE（Group E）
DCLGFLGWCIPREELCCRPNLVCSNNWKWCKYTI
１２．PepF（Group F）
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYX5X6
（X5＝A or D、X6＝L or Y）
１３．PepF-1
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYAL
１４．PepF-2
DCLGFEVVCIPGMLDCCRPNLVCSTVSKWCKYDY
１５．A4-1 random forward primer
GACTGTTTAGGATTT(NNS)3TGCATCCCC(NNS)4TGCTGTCGTCCAAACCTTGTATGCAGT(NNS)3AAATGGTGTAAATAT
(N=A,G,C orT,S=C or G）
１６．A4-1 random reverse primer
ATCTGCAGAATTCGCCCTTCTATCA(SNN)2ATATTTACACCATTT
(N=A,G,C orT,S=C or G)
１７．27rbs forward primer
GTCTGCAGGCAAGCTTCTAGAAATAATTTTGTTTAA
１８．27T7term reverse primer
GGCCAGTGCCAAGCTTTATGCTAGTTATTGCTCAG
１９．Strep40DsbC forward primer
CTCAGTTCGAAAAAGGCGCCGATGACGCGGCAATT
２０．SacIIDsbC reverse primer
TTTTGCCGCGGCTTCTTTACCGCTGGT
２１．SacIIA4-1 forward primer
GAAGCCGCGGCAAAAGACTGTTTAGGA
２２．ERA4-1 reverse primer
GAATTCTTAAAATACATA
２３．NheStrep forward primer
CTAGCTAGCTGGAGCCACCCTCAGTTCGAAAAA
２４．NheOmpSS reverse primer
CTGAGGGTGGCTCCAGCTAGCGGCCTGCGCAA
２５．27T7prom forward primer
CTGCAGTCGATCCCGCGAAATTAA
２６．PstNt USER forward primer
CTGCAGGCTGAGGAGACATCTAGAGGATCCT
２７．Nt USER reverse primer
GCTGAGGGAAAGTCTAGAGGATCCTCT
２８．SacIINt USER forward primer
TCCCCGCGGCTTTTGCTGAGGAGACATCT
２９．TxUser forward primer
GGAGACAUCAGACTGTTTAGGA
３０．TxUser reverse primer
GGGAAAGUATCTGCAGAATT
３１．Tx（biotin）forward primer
GAGGGACATCAGACTGTTTAGGA
３２．Tx（biotin）reverse primer
TTCGCCCTTCGACTGAGGGAAAGT

Claims (8)

  1. 　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドの群からなるランダムポリペプチドライブラリーであって、対応するランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、グラム陰性細菌中で発現し、ペリプラズム間隙中に分泌された状態で存在しており、かつ当該グラム陰性細菌の内膜表面に、標的タンパク質が発現していることを特徴とする、ランダムポリペプチドライブラリー。
  2. 　前記ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドが、その上流に分泌シグナル配列を有しており、かつ同一の発現ベクター中で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとタンデムに連結されている、請求項１に記載のランダムポリペプチドライブラリー。
  3. 　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーであって、当該ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが、その上流に分泌シグナル配列を有し、グラム陰性細菌で発現可能な制御領域下に組み込まれており、かつ標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されていることを特徴とする、ランダムポリヌクレオチドライブラリー。
  4. 　ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターの群からなり、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群から構成されていることを特徴とする、ランダムポリヌクレオチドライブラリー。
  5. 　請求項３又は４に記載のランダムポリヌクレオチドライブラリーにより形質転換されたグラム陰性細菌の群からなり、各グラム陰性細菌の内膜表面には標的タンパク質が発現しており、かつペリプラズム間隙内には、前記ランダムポリヌクレオチドライブラリーを構成するポリヌクレオチドに対応する各ポリペプチドが存在していることを特徴とする、ディスプレイ型グラム陰性細菌ライブラリー。
  6. 　請求項５に記載のディスプレイ型グラム陰性細菌ライブラリーを用いることを特徴とする、標的タンパク質に親和性の高いポリペプチドのスクリーニング方法。
  7. 　標的膜タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドのスクリーニング方法であって、下記（ａ）～（ｅ）の工程を含む方法；
    （ａ）ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターであって、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群を用意する工程；
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
    （ｃ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
    （ｄ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
    （ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
  8. 　標的の膜タンパク質に対して親和性を有するポリペプチドのスクリーニング方法であって、下記（ａ）～（ｊ）の工程を含む方法；
    （ａ）ランダム化された３以上のアミノ酸からなるペプチド領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドライブラリーを構成する各ポリヌクレオチドが挿入された、グラム陰性細菌で発現可能な発現ベクターであって、前記各ポリヌクレオチドの上流に分泌シグナル配列があり、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドがタンデムに連結されている発現ベクターの群を用意する工程；
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを、形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
    （ｃ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
    （ｄ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
    （ｅ）前記選択されたポリペプチドを発現した形質転換細胞中のポリヌクレオチドを増幅して発現ベクターに挿入した第２のポリヌクレオチドライブラリーであり、各ポリヌクレオチドは分泌シグナル配列の下流に挿入され、かつ前記標的膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの群で構成された第２のポリヌクレオチドライブラリーを製造する工程、；
    （ｆ）前記第２のポリヌクレオチドライブラリーを構成する各発現ベクターを形質転換グラム陰性細菌において、前記標的膜タンパク質を内膜表面に、また各ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドをペリプラズム間隙内にそれぞれ発現させる工程；
    （ｇ）前記各ポリペプチドを、前記ペリプラズム間隙内で前記標的膜タンパク質と接触させる工程；
    （ｈ）前記形質転換グラム陰性細菌のスフェロプラストを形成させて、前記標的膜タンパク質と結合したポリペプチドを選択する工程；
    （ｉ）必要により工程（ｅ）－（ｈ）を繰り返す工程；そして
    （ｊ）選択されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程。
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