JPWO2012074130A1 - ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法 - Google Patents
ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2012074130A1 JPWO2012074130A1 JP2012546969A JP2012546969A JPWO2012074130A1 JP WO2012074130 A1 JPWO2012074130 A1 JP WO2012074130A1 JP 2012546969 A JP2012546969 A JP 2012546969A JP 2012546969 A JP2012546969 A JP 2012546969A JP WO2012074130 A1 JPWO2012074130 A1 JP WO2012074130A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- mrna
- trna
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
- B01J2219/0072—Organic compounds
- B01J2219/00725—Peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/08—Liquid phase synthesis, i.e. wherein all library building blocks are in liquid phase or in solution during library creation; Particular methods of cleavage from the liquid support
Abstract
Description
このようにIn vitroディスプレイでは、10の12乗もの多様性を持つペプチドライブラリーをスクリーニングすることが可能であるが、生体の機能を利用してペプチドライブラリーを構築するために、従来はタンパク質性アミノ酸のみから構成されているペプチドライブラリーしか構築されていなかった。この構成要素の低さを乗り越え、阻害能や特異性が十分でない低分子阻害剤をアミノ酸構造中に組み込み、その特殊なアミノ酸を含有するペプチドライブラリーを構築してスクリーニングを行うことができれば、低分子化合物とペプチドそれぞれ単体では達成できないような高い阻害能と選択性を示す阻害剤を獲得することが可能になると期待できる。
遺伝暗号の拡張では、天然の翻訳系でアミノ酸の指定に使われていない終止コドンや人工4塩基コドンを利用し、それらのコドンに特殊アミノ酸を割り当てることで、特殊アミノ酸を含むタンパク質・ペプチドの合成を可能にした。しかし、停止コドンや利用可能な4塩基コドンの数に限りがあるため、同時に利用可能な特殊アミノ酸の数に上限があった(実質3種類以下)。
即ち、本発明は、
〔1〕ランダム配列中の指定された位置に、標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸が配置されたペプチドからなるペプチドライブラリーを翻訳によって製造する方法であって、
(i)ランダムなアミノ酸配列をコードするmRNA配列中に、前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸を指定する改変コドンが配置された塩基配列を含むmRNAのライブラリーを調製する工程と、
(ii)改変コドンに指定されるtRNAに前記特殊アミノ酸が連結されたアミノアシルtRNAを調製する工程と、
(iii)前記アミノアシルtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に所定の特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体からなるライブラリーを得る工程と、を含む方法;
〔2〕前記工程(ii)において、前記アミノアシルtRNAが、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて、所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸をtRNAに転移することにより調製される、上記〔1〕に記載の方法;
〔3〕前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列がNNC及びNNU(NはA、U、G及びCのいずれか一つの塩基を表す。)のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、上記〔1〕又は〔2〕に記載の方法;
〔4〕前記mRNAランダム配列が、さらにNNK(KはU又はGを表す。)を含む、上記〔3〕に記載の方法;
〔5〕さらに、前記各ペプチドを環状化する工程を含む、上記〔1〕から〔4〕のいずれか1項に記載の方法;
〔6〕前記各ペプチドを環状化する工程は、
前記工程(i)において、前記mRNAランダム配列中に、以下の(A)から(C)のいずれかの組の官能基1及び2をそれぞれ有する2つのアミノ酸をコードする第2及び第3の改変コドンを配置し(但し、官能基2を有するアミノ酸がタンパク質性アミノ酸の場合は、第3の改変コドンに代えて当該タンパク性アミノ酸を指定するコドンを配置してもよい。)、
前記工程(ii)において、第2の改変コドンに指定されるtRNAに前記官能基1を有するアミノ酸を連結したアミノアシルtRNAと、第3の改変コドンに指定されるtRNAに前記官能基2を有するアミノ酸を連結したアミノアシルtRNAとを調製し、これらも用いて前記工程(iii)を行い、
前記工程(iii)の後、前記官能基の間の反応によって環状化することを含む、上記〔5〕に記載の方法
〔7〕前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸が低分子化合物含有特殊アミノ酸である、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の方法;
〔8〕前記標的物質は酵素であり、前記標的物質に結合しうる部分は前記酵素の活性部位に結合すると予測される低分子の基である、上記〔1〕から〔6〕のいずれか1項に記載の方法;
〔9〕前記工程(i)において、さらに、得られたmRNAライブラリーの各mRNAの3´末端に直接、又はリンカーを介してピューロマイシンを結合させる工程を含む、上記〔1〕から〔8〕のいずれか1項に記載の方法;
〔10〕上記〔1〕から〔9〕のいずれか1項に記載の方法で製造されたペプチドライブラリーであって、各ペプチドに、そのペプチドをコードするmRNAが連結されている、ペプチドライブラリー;
〔11〕上記〔1〕から〔9〕のいずれか1項に記載の方法で得られたペプチドライブラリー又は上記〔10〕に記載のペプチドライブラリーを用いて、標的物質に結合しうるペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
前記ペプチドライブラリーを標的物質と接触させる工程と、
前記標的物質と結合するペプチドを選択する工程と、
を含む方法:及び
〔12〕上記〔9〕に記載の方法で得られたペプチドライブラリー又は上記〔10〕に記載のペプチドライブラリーを用いて、標的物質に結合しうるペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
前記ライブラリーを標的物質と接触させる工程と、
前記標的物質に結合するmRNAが連結されたペプチドを選択する工程と、
逆転写によって、前記選択されたペプチドに連結されたmRNAからDNAを合成する工程と、
前記DNAをPCRで増幅し、転写によってmRNAライブラリーを得て各mRNAにピューロマイシンを結合する工程と、
無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳してmRNAが連結したペプチドライブラリーを得る工程と、
前記接触させる工程からペプチドライブラリーを得る工程を1回以上繰り返す工程と、
を含む方法、
に関する。
また、かかるライブラリーは、翻訳系により合成されるので、多様性を極めて高くすることができ(例えば10の12乗以上)、また、In vitroディスプレイ法と組み合わせれば、標的に対して親和性の高いペプチド配列の濃縮と同定を効率よく行うことも可能である。
また、本発明によれば、例えば、酵素の阻害剤として機能し得る低分子化合物を組み込んだ特殊アミノ酸が導入されたペプチドの集合からなるライブラリーを構築できる。このライブラリーをスクリーニングすることで、単なるアプタマー(結合活性種)ではなく、高い阻害能と選択性を示す阻害剤を獲得することが可能になる
生体の翻訳では、mRNAの3つの塩基の並び(トリプレット)が一つのコドンとして一つのアミノ酸を指定しており、その並びに対応するペプチドが合成される。このとき、コドンとアミノ酸との対応付けは、以下の2段階で行われる。(i) tRNA の末端にアミノアシルtRNA 合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetase:ARS)が対応するアミノ酸を連結する。 (ii) tRNA のアンチコドンが対応する mRNA のコドンと対合することにより、mRNA の情報に沿って tRNA 上のアミノ酸が重合されペプチドが合成される。
こうしたコドンとアンチコドンとの対応関係は、ほとんど普遍的に決定されており、64種類のコドンそれぞれに、20種類のアミノ酸のいずれか一つが割り当てられている。普遍遺伝暗号表を以下に示す。
再構成型の翻訳系とは、リボソーム、翻訳因子、tRNA、アミノ酸、およびATPやGTP等のエネルギーソースなど、蛋白質やペプチドの翻訳合成に関わる因子をそれぞれ単離・精製し、混ぜ合わせた翻訳系である。例えば、大腸菌のリボソームを用いる系として次の文献に記載された技術が公知である:H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) “DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors” The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894 ; M. C. Gonza, C. Cunningham and R. M. Green (1985) “Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation” Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, No. 6, 1648-1652 ; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996) “Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in vitro system” Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16 ; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) “Cell-free translation reconstituted with purified components”Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755;H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) “Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components” Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。
遺伝暗号のリプログラミングには、翻訳系の構成因子を目的に合わせて自由に取り除き、必要な成分だけを再構成してできる翻訳系を利用する。例えば、特定のアミノ酸を除去した翻訳系を再構成すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。続いて、フレキシザイムあるいは化学的アミノアシル化あるいは変異タンパク質酵素を用いたアミノアシル化を利用して、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに特殊なアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行う。これによって、特殊なアミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに特殊なアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。
ペプチドは環状化すると、(i)プロテアーゼ耐性が向上する、(ii)剛直性が増し膜透過性や標的タンパク質との親和性が向上する、と考えられている。翻訳で生成するペプチドは、2個以上のシステイン残基を含めばジスルフィド結合により環状構造を形成できるが、この結合は生体中で容易に還元されてしまうため、上記のような効果はあまり期待できない。そこで本発明者らは以前に、翻訳された直鎖状のペプチドを非還元性の結合によって環状化させる手法を開発し、報告した(Y. Goto, et al. ACS Chem. Biol. 3 120-129 (2008))。例えば、上記の遺伝暗号のリプログラミング技術により、N末端にクロロアセチル基を有する特殊なペプチドを合成する。このとき、ペプチド中にシステイン残基を配置しておくと、翻訳後に自発的にメルカプト基がクロロアセチル基に求核攻撃し、ペプチドがチオエーテル結合により環状化する。すなわち、クロロアセチル基とメルカプト基という結合形成が可能な一組の官能基をアミノ酸配列に導入することにより、環状化という機能をペプチドに与える。また、このような結合形成が可能な官能基の対は、クロロアセチル基とメルカプト基に限定されない。詳細は後述する。
次に、本発明の実施形態について説明する。
本発明により構築されるペプチドライブラリーは、標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸(以下「本特殊アミノ酸」という。)を所望の位置に有するペプチドの集合体からなることを特徴とする。
ペプチドライブラリーを構成するペプチドの長さは特に限定されないが、例えば、2アミノ酸〜25アミノ酸等とすることができる。
本発明において、特殊アミノ酸は、「本特殊アミノ酸」としても用いられ、また、後述する環状化方法にも用いられうる。
これまで、薬剤標的の特定部位、例えば酵素触媒活性部位、に結合する低分子化合物は、一般的にはランダムスクリーニングを経た研究により偶然発見されてきた。しかし、こういった初期低分子化合物が、標的に対し高い親和性や特異性をもつことは極めて稀で、さらなる古典的なメディシナルケミストリー手法であるトライ&エラーによる合成&探索を繰り返す多大な労力を要した。一方、本願発明のように、既知の低分子化合物をペプチド鎖に組み込み、その化合物の周辺に配置されたペプチド配列をランダム化したライブラリーを構築し探索することができれば、低分子化合物を容易に高機能化できる可能性がある。これまでこのようなアプローチにおいては、ライブラリー構築を化学合成に依存せざるを得ず、それ故探索に適応できる多様性(10の6乗程度)に限界があったが、本発明のライブラリーは翻訳系で合成されることから、極めて高い多様性を実現することが可能である。
本発明のライブラリーは、単なるアプタマーではなく阻害活性を有するペプチドを取得するために、酵素活性部位に結合しうる低分子化合物含有特殊アミノ酸を導入したペプチドライブラリーであってもよい。本明細書では、低分子化合物あるいは低分子化合物含有特殊アミノ酸あるいはそのような特殊アミノ酸を含むペプチドが酵素活性部位に結合する性質を、酵素活性部位指向性と表現することもある。
次に、ランダムなアミノ酸配列中の所望の位置に、本特殊アミノ酸が配置されたペプチド(以下、「本特殊ペプチド」と呼ぶ場合もある。)の製造方法を説明する。
本発明のペプチドライブラリーは、
(i)ランダムなアミノ酸配列をコードするmRNA配列中に前記所望の標的物質に結合しうる部分を有するアミノ酸を指定する改変コドンが配置された塩基配列を含むmRNAのライブラリーを調製する工程と、
(ii)改変コドンに指定されるtRNAに前記特殊アミノ酸が連結されたアミノアシルtRNAを調製する工程と、
(iii)前記特殊アミノ酸を連結したtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に所定の特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体からなるライブラリーを得る工程と、を含む方法によって製造される。
工程(i)と工程(ii)の順序は特に問われず、いずれかを先に行っても並行して行ってもよい。
まず、無細胞翻訳系について説明する。
翻訳系とは、ペプチド翻訳合成のための場であり、一般的には方法及びキット(物)の両方を含む概念である。本発明において、特殊ペプチドライブラリーの調製に使用される無細胞翻訳系は、公知の再構成型の翻訳系を用いてもよいし、これをさらに細分化し、より不純物の少ない系を構築して利用してもよい。従来の系と対比させながら、本発明で利用可能なキット(物)としての翻訳系の具体的な構成成分について説明する。
蛋白質類では、翻訳開始因子(例えば、IF1、IF2、IF3)、翻訳伸長因子(例えばEF-Tu、EF-Ts、EF-G)、翻訳終結因子(例えば、RF1、RF2、RF3、RRF)、エネルギーソース再生のための酵素(例えばcreatine kinase, myokinase, pyrophosphatase, nucleotide-diphosphatase kinase)を使用する。この中で、翻訳終結因子・エネルギーソース再生のための酵素の添加は任意である。鋳型DNAからの転写を行うためにT7 RNA polymeraseを加えることもあるが、あらかじめ転写したmRNAを翻訳系に加える場合、RNA polymeraseの添加は不要である。
本発明では、無細胞翻訳系において、ペプチドをコードする領域にランダム配列を持つ鋳型核酸(mRNAもしくは対応するDNA)から翻訳合成を行うことで、ランダムなアミノ酸配列を持つペプチドライブラリーを合成する。したがって、ペプチドライブラリーを構築することは、各ペプチドをコードする核酸からなるライブラリーを調製して、これを翻訳することを含む。
NNU、NNC、NNKを含むmRNAは、例えば各種のDNA合成装置によって、NNT、NNC、NNKを含むDNAを合成し、これを転写することによって得ることができる。
ペプチドをコードする領域のN末端には、開始コドンが配置される。開始コドンは通常はトリプレット配列AUGである。しかしながら、in vitro転写反応により合成された開始tRNAにおいてアンチコドン配列を任意の配列とすることで、開始コドンのリプログラミングが可能であるので、AUGコドンに加えて、他の塩基配列も開始コドンとして利用できる。
そのため、翻訳合成された直鎖状の特殊ペプチドの分子内反応を利用してペプチドが環状化されるように、RNAもしくはDNAの配列を設計してもよい。
例えば、塩基配列においてペプチドをコードする領域が、mRNA配列の5’から3’の向きに沿って、次の(a)から(d)に対応するような塩基配列を順に含む:
(a)官能基1を持つ特殊アミノ酸を指定する、第一の改変コドン
(b)複数のトリプレットの繰り返しからなるランダム配列
(c)ランダム配列中のいずれかの位置に配置された、本特殊アミノ酸を指定する、第二の改変コドン
(d)官能基2を持つアミノ酸を指定するコドン。
官能基2を持つアミノ酸がタンパク質性アミノ酸である場合は該アミノ酸を指定するコドンは対応する普遍コドンであり、官能基2を持つアミノ酸が特殊アミノ酸である場合は該アミノ酸を指定するコドンは第三の改変コドンであることができる。
本発明において、特殊アミノ酸の割り当てに必要なアミノアシルtRNAは、tRNAを単離し、in vitroでアミノアシル化することにより調製される。単離されたtRNAをin vitroでアミノアシル化するとは、他のtRNAやARSが存在しない条件で、所望のアミノ酸をtRNAの3’末端に結合させることを意味する。このようなアミノアシル化の方法としては、どのようなアミノ酸にも適用できる方法が好ましい。このような方法として、例えば、化学的アミノアシル化法(Heckler T. G., Chang L. H., Zama Y., Naka T., Chorghade M. S., Hecht S. M.: T4 RNA ligase mediated preparation of novel “chemically misacylated” tRNAPhe S. Biochemistry 1984, 23:1468-1473.)、または本発明者らが開発したアミノアシルtRNA 合成リボザイム(ARSリボザイム)を用いる方法が公知である。あるいは、適用できるアミノ酸の種類が限られるが、天然のARSを人工的に改変した酵素を用いる方法も利用可能である。
原型のフレキシザイム Fx
[5´-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUUGGCGUUAGGU-3´, 45nt](配列番号:1)
ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
[5´-GGAUCGAAAGAUUUCCGCAUCCCCGAAAGGGUACAUGGCGUUAGGU-3´,46nt](配列番号:2)
エンハンスドフレキシザイム eFx
[5´-GGAUCGAAAGAUUUCCGCGGCCCCGAAAGGGGAUUAGCGUUAGGU-3´,45nt](配列番号:3)
アミノフレキシザイム aFx
[5´-GGAUCGAAAGAUUUCCGCACCCCCGAAAGGGGUAAGUGGCGUUAGGU-3´,47nt](配列番号:4)
また、本発明では、環状化のための官能基を有するアミノ酸が特殊アミノ酸である場合にも、フレキシザイムを用いてそのような特殊アミノ酸を任意のアンチコドンを持つ直交性(オルソゴナル)tRNAに結合させる。本発明の一態様では、開始アミノ酸残基として官能基1を有するアミノ酸を配置する。その場合、開始tRNAに環状化反応用の官能基を有するアミノ酸を連結することにより、ペプチドN末端に環状化反応用の官能基が導入される。
例えば、後述の実施例では、クロロアセチル基を有するL体もしくはD体のチロシンであるNα-クロロアセチル- L(D)-チロシンを開始tRNAであるtRNAfMetに連結し、ペプチドN末端に導入を行った。ペプチドに導入されたクロロアセチル基は、ペプチド内部のシステイン残基のメルカプト基と自発的なSN2反応を引き起こし、チオエーテル結合によってペプチドが環状化する(Goto et al., ACS Chem. Biol., 2008, 3, 120-129)。この例では、チロシンを母核としているが、他の19種類のタンパク質性アミノ酸のL体及びD体でも問題なくペプチドライブラリーを作製することができる。
天然の翻訳反応において、開始tRNAは翻訳開始のみに用いられ、伸長反応では使用されず、反対に、伸長用tRNAは開始反応には使用されないことは重要である。このような開始tRNAと伸長用tRNAの区別は本願発明においても同様である。
(5’-UCCUCUGs4UAGUUCAGDCGGDAGAACGGCGGACUQUUt6AAYCCGUAUm7GUCACUGGTYCGAGUCCAGUCAGAGGAGCCA-3’(配列番号:7)) がベースになっている(s4U:4-チオウリジン、D:ジヒドロウリジン、Q:キューオシン、t6A:6-スレオニルカルバモイルアデニン、Y:シュードウリジン、m7G:7-メチルグアノシン、T:リボチミジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、かつ変異を導入することで、大腸菌の20種類のアミノアシル化酵素によってアミノアシル化を受けない伸長反応用のtRNAであるtRNAAsn-E2をin vitro転写によって作製した。NNNの箇所がアンチコドンに相当し、コドンに対応するように変化させる。
開始tRNAである人工tRNAの非限定的な一例が、tRNAfMetである。このtRNAの塩基配列は、大腸菌の天然tRNAfMet
(5’-CGCGGGGs4UGGAGCAGCCUGGDAGCUCGUCGGGCmUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGTYCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’ (配列番号:8))がベースになっている。(Cm:2’-O-メチルシチジン)。本発明者らは、この天然tRNAに対して、修飾塩基を無くし、5’末端最初のCをGに変化させた開始反応用のtRNAであるtRNAfMetをin vitro転写によって作製した。CAUの箇所がアンチコドンに相当し、開始AUGコドンに対応する。(本願で使用したtRNAfMet: 5’-GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAACCA-3’、 (配列番号:6)[修飾を無くした箇所、合計6カ所。s4U8U、D20U、Cm32C、T54U、Y55U。][変異の箇所 、合計1カ所。C1G])開始tRNAにおいて重要な箇所は5’末端の最初の塩基(天然tRNAfMetではC、本願のtRNAfMetではG)が、72番目の塩基(天然tRNAfMet及び本願のtRNAfMetではA)と相補鎖を組まないことである。この非相補鎖によって、メチオニルホルミルトランスフェラーゼ(MTF)によりMet-tRNAfMetにホルミル基が転移されたり(但し、この部分にクロロアセチルトリプトファンのような開始用特殊アミノ酸を利用する場合は、意味は無い)、またEF-Tuとの結合が抑制されたりする。
本発明の一態様において、ペプチドライブラリーは環状ペプチドからなるものであってもよい。ペプチドを環状化する方法は、特に限定されないが、例えば、翻訳合成された非環状のペプチドの分子内特異的反応を利用して環状化してもよい。ペプチドの環状化は、以下の工程(i)及び(ii)により実施される。
(i)結合形成反応が可能な一組の官能基である官能基1及び官能基2を分子内に有する非環状ペプチド化合物を翻訳合成によって合成する工程;及び
(ii)前記官能基1及び官能基2の結合形成反応によって前記非環状ペプチド化合物を環状化する工程。
官能基2がタンパク質性アミノ酸の場合には、改変コドンを用いず、当該タンパク質性アミノ酸を連結したアミノアシルtRNAを指定するコドンを用いて、当該タンパク質性アミノ酸をペプチド鎖に導入することができる。
上述のように製造したペプチドライブラリーは、標的物質に結合しうる本特殊ペプチドを選択するためのスクリーニングに有用である。
スクリーニング方法の一態様は、ペプチドライブラリーと標的物質とを接触させる工程と、前記標的物質と結合するペプチドを選択する工程を含む。
標的物質は、例えば、固相担体に固定して、本発明のライブラリーと接触させることができる。本明細書において、「固相担体」は、標的物質を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
標的物質と、ライブラリーは、適宜選択された緩衝液中で接触させ、pH、温度、時間等を調節して反応させる。
本発明において、無細胞翻訳系で構築される特殊ペプチドライブラリーは、mRNAディスプレイを始めとするin vitroディスプレイ技術と完全に適合可能であるため、1012種類以上の高い多様性からなる特殊ペプチドライブラリーから、標的に結合するペプチド分子の創出が可能である。
このように各工程を繰り返すことにより、標的物質に親和性の高いペプチドが濃縮されていく。
(i)酵素活性部位指向性を有するペプチドを含むライブラリーを用意する工程、
(ii)ペプチドライブラリーを標的物質に接触させる工程;及び
(iii)標的物質に結合するペプチド分子を選択する工程。
また、当該方法は、さらに次の工程(二次スクリーニング段階)を行って、ペプチドライブラリーから酵素の阻害活性を有するペプチドを選択してもよい。
(ア)標的酵素に結合するペプチドを選択する一次スクリーニング段階と、(イ)一次スクリーニングで選択されたペプチドの酵素阻害活性を評価し、前記ペプチドが酵素の阻害活性を有するペプチドであることを決定する二次スクリーニング段階を含み、前記一次スクリーニング段階が
(i)酵素活性部位指向性を有するペプチドを含むライブラリーを用意する工程、
(ii)ペプチドライブラリーを標的酵素分子に接触させる工程;
(iii)標的酵素分子に結合するペプチド分子を選択する工程
を含む。
さらに選択されたペプチドを適当な方法で合成することにより、酵素阻害活性を有するペプチドを製造する方法も本発明の範囲内である。また、そのように合成された、酵素の阻害活性を有するペプチドも本発明の範囲内である。
以下では、後述の実施例の項で取り上げるSIRT2を標的とした場合のペプチドライブラリーの構築法とそこからの阻害ペプチド取得法について述べる。(図1)ここで説明される態様はあくまで例示であり、本発明はこの態様に限定されない。
タンパク質翻訳後修飾の一種であるリシン残基のアセチル化は、様々なアセチル化酵素と脱アセチル化酵素の働きによって動的に制御されている。サーチュインは、こうした脱アセチル化酵素の一種で、ヒトにはSIRT1からSIRT7までの7つが存在することが知られている。サーチュインの生体内の働きは完全には解明されていないが、SIRT2については、近年、癌や神経変性疾患との関連が明らかとなり、その阻害剤が注目を集めている1), 2) , 3)。
サーチュイン阻害剤の一種として、サーチュインの基質タンパク質から脱アセチル化される近傍の配列だけを取り出し、アセチルリシン部位をアセチルリシンアナログに変換したペプチド性の阻害剤がある。そうしたアナログの一つであるε-N-トリフルオロアセチルリシン(TfaK)は、サーチュインの活性ポケットに強く結合し、サーチュインに脱トリフルオロアセチル化される速度が脱アセチル化される速度よりもはるかに遅いため、これを含むペプチドはサーチュインの強力な阻害剤となる4)。こうしたペプチド性の阻害剤の開発において、アセチルリシンアナログを囲むペプチド配列はサーチュインの基質タンパク質中の配列が用いられ続けている。
そこで我々は、TfaKを有するランダムペプチドライブラリーを構築し、スクリーニングを行うことで、より強力な阻害効果を示すペプチド配列を獲得することを試みた。
まず、ペプチドライブラリーを翻訳で構築するために、鋳型となるmRNA ライブラリーを調製する。mRNA の翻訳される部分の配列の長さは、任意であるが、今回は16〜20コドンの5種類の長さのものを調製した。このうち、N末端は開始AUGコドン(第一の改変コドン)であり、C末端側にはCysをコードするコドンUGCにリンカーとなるGlySerGlySerGlySerをコードするコドンが続く。開始AUGコドンとUGCの間は、NNKもしくはNNCもしくはNNUのランダムなコドン配列とする。(Nは A, U, G, C のいずれか一つの塩基を、K は U, G のいずれか一つの塩基を、それぞれ表す。)このランダム配列中の特定の1コドンだけを、特殊アミノ酸導入用にAUGコドン(第二の改変コドン)とする。
上述のmRNAライブラリーを改変された遺伝暗号表の下で翻訳する。具体的には、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、(i)tRNAfMet CAUにα-N-クロロアセチル化アミノ酸を連結したもの、(ii)tRNAAsnE2 CAUにTfaKを連結したもの、の2つをフレキシザイムを用いて調製・添加して翻訳を行う。ここで、(i)で使用したtRNAは開始因子に認識されて開始AUGコドンに対合するのに対し、(ii)で使用したtRNAは伸長因子に認識されてAUGコドンと対合する。このために、一つのメチオニンというアミノ酸を除去するだけで2つのアミノ酸を導入することが可能である。翻訳されたペプチドは、N末端のクロロアセチル基とC末側のシステインのメルカプト基との間でチオエーテル結合により環状化し、ランダム配列中にトリフルオロアセチルリシンを有するペプチドライブラリーが合成され、さらにペプチドのC末端がPu(ピューロマイシン)を介してmRNAと連結される。
上述したペプチドライブラリーをmRNA ディスプレイ法やリボソームディスプレイ法などの各種in vitro ディスプレイ法によりスクリーニングし、SIRT2に結合するペプチドを選択する。
標的の活性部位に結合する特殊アミノ酸を含有するペプチドライブラリーを用いているので、結合だけを指標にスクリーニングを行っていても、得られたペプチドは標的の活性部位に結合し、その活性を阻害する可能性が高い。
今回の例で取り上げたSIRT2のような脱アセチル化酵素以外にも、様々な酵素に対して活性ポケットに結合して酵素活性を阻害する阻害剤が既知であれば、SIRT2の場合と同様にそれを特殊アミノ酸として導入したペプチドライブラリーを構築して阻害ペプチドを獲得することができる。例えば、Nε-プロパルギルリシンを含有するペプチドは、ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤になることが知られているので、実施例と同様にこのアミノ酸を含有するペプチドライブラリーをスクリーニングすることで、より強力なヒストン脱メチル化酵素の阻害ペプチドを得ることが可能である5)。
SIRT2は、mRNA ディスプレイ時に担体に固定する必要があるため、N末端に10xHisタグが付与されたコンストラクトとして大腸菌内で発現し、Hisタグを利用して精製した。
まず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。(以下では、Forward 鎖のみを 5´→ 3´ の順で記載する。)
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(ATG)(NNK)1(NNK)2・・・ (NNK)m (ATG)(NNK)1(NNK)2・・・ (NNK)n(TGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(TAG) GACGGGGGGCGGAAA(配列番号:9)
(翻訳領域は一つのコドンを一つの( )で括った。Nは A, T, G, C のいずれか一つを、K は T, G のいずれか一つを、それぞれ表す。(m, n)の組み合わせは、 (m, n)= (3, 4), (4, 4), (4, 5), (5, 5), (5, 6)の5種類である。)
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU(AUG)(NNK)1(NNK)2・・(NNK)m(AUG)(NNK)1(NNK)2・・・(NNK)n(UGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(UAG)GACGGGGGGCGGAAA
(Nは A, U, G, C のいずれか一つを、K は U, G のいずれか一つを、それぞれ表す。)(配列番号:10)
まず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した。(以下では、Forward 鎖のみを 5´ → 3´ の順で記載する。)
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(ATG)(NNC)1(NNC)2・・ (NNC)m (ATG)(NNC)1(NNC)2・・ (NNC)n(TGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(TAG) GACGGGGGGCGGAAA
(翻訳領域は一つのコドンを一つの( )で括った。Nは A, T, G, C のいずれか一つを表す。(m, n)の組み合わせは、 (m, n)= (3, 4), (4, 4), (4, 5), (5, 5), (5, 6)の5種類である。)(配列番号:11)
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU(AUG)(NNC)1(NNC)2・・(NNC)m(AUG)(NNC)1(NNC)2・・・(NNC)n(UGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(UAG)GACGGGGGGCGGAAA
(Nは A, U, G, C のいずれか一つを表す。)(配列番号:12)
以下の「ピューロマイシンリンカーとの連結」から「回収したペプチドの配列情報の増幅」までのサイクルを繰り返すことで、ランダムなペプチドライブラリーからSIRT2に結合するペプチドを選択した。(図1)
下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記の mRNA ライブラリーとアニールさせ、T4 RNA ligase で連結した。(SPC18 はCとOの総数が18であるPEGを表す。)
pdCTCCCGCCCCCCGTCC(SPC18)5CC(Pu)(配列番号:13)
リンカーと連結された mRNA を改変された遺伝暗号表の下で翻訳した(図2)。本実施例の場合には、通常の20種類のアミノ酸からメチオニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、(i)tRNAfMet CAU に α-N-クロロアセチル-L-チロシン(ClAc-LY)またはα-N-クロロアセチル-D-チロシン(ClAc-DY)を連結したもの、(ii)tRNAAsnE2 CAU にTfaKを連結したもの、の2つをフレキシザイムを用いて調製・添加して翻訳を行った。翻訳によって、ランダム配列中にトリフルオロアセチルリシンを含み、チオエーテル結合で環状化したペプチドライブラリーが合成され、ペプチドのC末端に Pu が結合することで、mRNAとペプチドが連結される。
TALONビーズに固定化したSIRT2に、調製した特殊環状ペプチドライブラリーを混合し、4°Cで30分間撹拌した。磁石を利用して上澄みを除去し、残った磁性粒子をバッファーで洗浄した。ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで5分間加熱し、ペプチドをビーズからはがして上澄みを回収した。
SIRT2に結合して回収されてきたペプチド-mRNAを、逆転写・PCRによってDNAとして増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。
上記の一連の操作を繰り返し、ペプチド-mRNAの回収率が飽和したところで、増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたペプチドの配列を同定した。
蛍光を利用した評価系で、選択されたペプチドのSIRT2阻害活性を調べた。具体的にはまず、SIRT2に脱アセチル化されるペプチドの両末端に蛍光基と消光基がついたものをSIRT2と混ぜ、脱アセチル化を行う。続いて、脱アセチル化されたペプチドのみを切断するプロテアーゼと反応させると、SIRT2によって脱アセチル化されたペプチドのみ蛍光基から消光基が解離して蛍光を発する。ここで脱アセチル化反応の際、SIRT2の阻害剤が存在すると、基質ペプチドの脱アセチル化の進行が遅くなり、最終的に得られる蛍光強度が減少する。すなわち、最終的に観測される蛍光の強さによって選択されたペプチドの阻害能が評価できる。
SIRT2の活性ポケットに結合しその活性を阻害するペプチドを獲得するために、配列中に必ず一つ以上のTfaKを含有するペプチドライブラリー(上述のNNK mRNAライブラリーとNNC mRNAライブラリー)を構築し、mRNA ディスプレイ法によって選択を行った。
NNK mRNAライブラリーを翻訳すると、ランダム配列中のいずれかの位置のAUGコドンがTfaKに翻訳され、一つ以上TfaKを含有する環状ペプチドライブラリーが生成する。このペプチドライブラリーを用いてmRNA ディスプレイを行ったところ、ClAc-LY、ClAc-DYのいずれを用いたペプチドライブラリーにおいても、4ラウンド目でmRNAの回収率が飽和した。そこで、3ラウンド後のペプチド配列を同定したところ、全ての配列が2つ以上のTfaKを有していた(表1)。1L-01〜10を順に配列番号:14〜23とし、1D-01〜06を順に配列番号:24〜29とする。
NNC mRNAライブラリーを翻訳すると、ランダム配列中のAUGコドンがTfaKに翻訳され、一配列中に一つだけTfaKを含有する環状ペプチドライブラリーが生成する。このペプチドライブラリーを用いてmRNA ディスプレイを行ったところ、ClAc-LYを用いた場合には5ラウンド目で、ClAc-DYを用いた場合には6ラウンド目でmRNAの回収率が飽和した。そこで、それぞれ4、5ラウンド後のペプチド配列の同定を行ったところ、TfaK近傍の配列に高い相同性が見られた(表2)。2L-01〜21を順に配列番号:30〜50とし、2D-01〜19を順に配列番号:51〜69とする。
さらに、このうち2つのペプチド(2L-08、2D-08)について、その解離定数Kdおよび阻害定数IC50を決定したところ、いずれのペプチドもKd〜3nM、IC50〜4 nMという非常に強力な活性を示すことがわかった。
1) T. F. Outeiro, et al. Science 317 516-519 (2007).
2) R. Luthi-Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107 7927-32 (2010).
3) J. C. Milne and J. M. Denu Curr. Opin. Chem. Biol. 12 11-17 (2008).
4) a) B.C. Simith, and J.M. Denu J. Am. Chem. Soc. 129 5802-5803 (2009). b) B.C. Simith, and J.M. Denu Biochemistry 46 14478-14486 (2009). c) B.C. Simith, and J.M. Denu J. Biol. Chem. 282 37256-37265.
5) Jeffrey C. Culhane, et al. 128 4536-4537 J. Am. Chem. Soc. (2006)
6) Keykavous Parang, et al. 8 37-41 Nat. struct. Biol. (2001)
配列番号2 ジニトロベンジルフレキシザイム dFx
配列番号3 エンハンスドフレキシザイム eFx
配列番号4 アミノフレキシザイム aFx
配列番号5 tRNAAsn-E2
配列番号6 tRNAfMet
配列番号7 大腸菌のtRNAAsn
配列番号8 大腸菌のtRNAfMet
配列番号9 NKK mRNAライブラリーの鋳型DNAの一般配列
配列番号10 NKK mRNAライブラリーの一般配列
配列番号11 NKC mRNAライブラリーの鋳型DNAの一般配列
配列番号12 NKC mRNAライブラリーの一般配列
配列番号13 ピューロマイシンリンカーのDNA部分の塩基配列
配列番号14〜29 NNK mRNAライブラリーのメンバーのアミノ酸配列
配列番号30〜69 NNC mRNAライブラリーのメンバーのアミノ酸配列
Claims (13)
- ランダム配列中の指定された位置に、標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸が配置されたペプチドからなるペプチドライブラリーを製造する方法であって、
(i)ランダムなアミノ酸配列をコードするmRNA配列中に、前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸を指定する改変コドンが配置された塩基配列を含むmRNAのライブラリーを調製する工程と、
(ii)改変コドンに指定されるtRNAに前記特殊アミノ酸が連結したアミノアシルtRNAを調製する工程と、
(iii)前記アミノアシルtRNAを含む無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳して、ランダム配列中に所定の特殊アミノ酸が配置されたペプチドの集合体からなるライブラリーを得る工程と、を含む方法。 - 前記工程(ii)において、前記アミノアシルtRNAが、アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒を用いて、所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸をtRNAに転移することにより調製される、請求項1に記載の方法。
- 前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸を指定する改変コドンがAUGコドンであり、mRNAランダム配列がNNC及びNNU(NはA、U、G及びCのいずれか一つの塩基を表す。)のいずれかのトリプレットの繰り返しからなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記mRNAランダム配列が、さらにNNK(KはU又はGを表す。)を含む、請求項3に記載の方法。
- さらに、前記各ペプチドを環状化する工程を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記各ペプチドを環状化する工程は、
前記工程(i)において、前記mRNAランダム配列中に、以下の(A)から(C)のいずれかの組の官能基1及び2をそれぞれ有する2つのアミノ酸をコードする第2及び第3の改変コドンを配置し(但し、官能基2を有するアミノ酸がタンパク質性アミノ酸の場合は、第3の改変コドンに代えて当該タンパク性アミノ酸を指定するコドンを配置してもよい。)、
前記工程(ii)において、前記第2の改変コドンに指定されるtRNAに前記官能基1を有するアミノ酸を連結したアミノアシルtRNAと、第3の改変コドンに指定されるtRNAに前記官能基2を有するアミノ酸を連結したアミノアシルtRNAとを調製し、これらも用いて前記工程(iii)を行い、
前記工程(iii)の後、前記官能基の間の反応によって環状化することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記所望の標的物質に結合しうる部分を有する特殊アミノ酸が低分子化合物含有特殊アミノ酸である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的物質は酵素であり、前記標的物質に結合しうる部分は前記酵素の活性部位に結合すると予測される低分子の基である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程(i)において、さらに、得られたmRNAライブラリーの各mRNAの3’末端に直接、又はリンカーを介してピューロマイシンを結合させる工程を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法で製造されたペプチドライブラリーであって、各ペプチドに、そのペプチドをコードするmRNAが連結されている、ペプチドライブラリー。
- 請求項1から9のいずれか1項に記載の方法で得られたペプチドライブラリー又は請求項10に記載のペプチドライブラリーを用いて、標的物質に結合しうるペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
前記ペプチドライブラリーを標的物質と接触させる工程と、
前記標的物質と結合するペプチドを選択する工程と、
を含む方法。 - 請求項9に記載の方法で得られたペプチドライブラリー又は請求項10に記載のペプチドライブラリーを用いて、標的物質に結合しうるペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
前記ライブラリーと標的物質と接触させる工程と、
前記標的物質に結合するmRNAが連結されたペプチドを選択する工程と、
逆転写によって、前記選択されたペプチドに連結されたmRNAからDNAを合成する工程と、
前記DNAをPCRで増幅し、転写によってmRNAライブラリーを得て各mRNAにピューロマイシンを結合する工程と、
無細胞翻訳系で前記mRNAを翻訳してmRNAが連結したペプチドライブラリーを得る工程と、
前記接触させる工程からペプチドライブラリーを得る工程を1回以上繰り返す工程と、
を含む方法。 - 配列番号:14〜69で表されるアミノ酸配列で表されるペプチドのいずれかを含むSIRT2活性阻害剤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010270507 | 2010-12-03 | ||
JP2010270507 | 2010-12-03 | ||
PCT/JP2011/078029 WO2012074130A1 (ja) | 2010-12-03 | 2011-12-05 | ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012074130A1 true JPWO2012074130A1 (ja) | 2014-05-19 |
JP6206943B2 JP6206943B2 (ja) | 2017-10-04 |
Family
ID=46172046
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012546969A Active JP6206943B2 (ja) | 2010-12-03 | 2011-12-05 | ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10195578B2 (ja) |
EP (1) | EP2647720B1 (ja) |
JP (1) | JP6206943B2 (ja) |
WO (1) | WO2012074130A1 (ja) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5818237B2 (ja) * | 2010-09-09 | 2015-11-18 | 国立大学法人 東京大学 | N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 |
EP3222720A1 (en) | 2011-09-01 | 2017-09-27 | University of Southern California | Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same |
HUE054006T2 (hu) * | 2011-12-28 | 2021-08-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Eljárás peptid vegyület ciklizálására |
US9815867B2 (en) | 2012-09-03 | 2017-11-14 | The University Of Tokyo | Peptide for inhibiting vascular endothelial growth factor receptor |
JPWO2014119600A1 (ja) * | 2013-01-30 | 2017-01-26 | ペプチドリーム株式会社 | FlexibleDisplay法 |
US9308236B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-04-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions |
JP6754997B2 (ja) * | 2013-08-26 | 2020-09-16 | 国立大学法人 東京大学 | 大環状ペプチド、その製造方法、及び大環状ペプチドライブラリを用いるスクリーニング方法 |
JP6405457B2 (ja) | 2014-09-11 | 2018-10-17 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | Pd−1/pd−l1およびcd80(b7−1)/pd−l1タンパク質/タンパク質相互作用の大環状阻害剤 |
US9732119B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
US9856292B2 (en) | 2014-11-14 | 2018-01-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
US9861680B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
US9944678B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-04-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
US20160222060A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
JP7020910B2 (ja) | 2015-03-13 | 2022-02-16 | 中外製薬株式会社 | 改変アミノアシルtRNA合成酵素およびその用途 |
US9809625B2 (en) | 2015-03-18 | 2017-11-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
JP6618534B2 (ja) | 2015-06-09 | 2019-12-11 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | アミノ酸修飾核酸とその利用 |
US10143746B2 (en) | 2016-03-04 | 2018-12-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
US10358463B2 (en) | 2016-04-05 | 2019-07-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
EP3827849A1 (en) | 2016-05-19 | 2021-06-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Pet-imaging immunomodulators |
KR102526034B1 (ko) | 2016-11-07 | 2023-04-25 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 면역조정제 |
US20190380958A1 (en) | 2016-12-28 | 2019-12-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Self-emulsifying drug formulation for improving membrane permeability of compound |
US11807664B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-11-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing cyclic organic compound |
JP7229158B2 (ja) | 2017-06-09 | 2023-02-27 | 中外製薬株式会社 | N-置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法 |
WO2018237153A1 (en) | 2017-06-23 | 2018-12-27 | Bristol-Myers Squibb Company | IMMUNOMODULATORS ACTING AS PD-1 ANTAGONISTS |
US11492375B2 (en) | 2017-10-03 | 2022-11-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Cyclic peptide immunomodulators |
SG11202003483SA (en) * | 2017-10-16 | 2020-07-29 | Univ Tokyo | MODIFICATION OF D AND T ARMS OF TRNA ENHANCING D-AMINO ACID AND ß-AMINO ACID UPTAKE |
US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
US11814621B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-11-14 | Northwestern University | Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming |
AU2019310039A1 (en) | 2018-07-23 | 2021-02-18 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of treating neurological disorders |
CN113164557A (zh) | 2018-07-23 | 2021-07-23 | 因柯利尔疗法公司 | 治疗神经性病症的方法 |
KR20210098476A (ko) | 2018-11-30 | 2021-08-10 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 펩티드 화합물 또는 아마이드 화합물의 탈보호법 및 고상 반응에 있어서의 탈수지 방법, 및 펩티드 화합물의 제조 방법 |
KR20210108994A (ko) | 2018-12-26 | 2021-09-03 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 코돈 확장을 위한 변이 tRNA |
WO2020210634A1 (en) | 2019-04-11 | 2020-10-15 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of amelioration of cerebrospinal fluid and devices and systems therefor |
KR20220121831A (ko) | 2019-12-26 | 2022-09-01 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 번역용 조성물 및 펩타이드의 제조 방법 |
WO2021146438A1 (en) * | 2020-01-14 | 2021-07-22 | Enclear Therapies, Inc. | System and method of treating neurological disorders |
TW202208623A (zh) | 2020-06-25 | 2022-03-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有經改變之遺傳密碼表的轉譯系統 |
WO2023086767A1 (en) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Leash Labs, Inc. | High-throughput drug discovery methods |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010104115A1 (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3683902B2 (ja) | 1996-10-17 | 2005-08-17 | 三菱化学株式会社 | 遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用 |
WO1998016636A1 (fr) | 1996-10-17 | 1998-04-23 | Mitsubishi Chemical Corporation | Molecule permettant d'homologuer un genotype et un phenotype, et utilisation de celle-ci |
KR100566859B1 (ko) | 1997-01-21 | 2006-04-03 | 제너럴 하스피톨 코포레이션 | Rna-단백질 융합물을 이용한 단백질의 선별 |
US6261804B1 (en) * | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
CA2476425C (en) * | 2002-02-15 | 2012-04-17 | The Research Foundation Of State University Of New York At Buffalo | Ribozymes with broad trna aminoacylation activity |
JP5119444B2 (ja) | 2005-12-06 | 2013-01-16 | 国立大学法人 東京大学 | 多目的アシル化触媒とその用途 |
JP5200241B2 (ja) | 2006-11-17 | 2013-06-05 | 国立大学法人 東京大学 | N末端に非天然骨格をもつポリペプチドの翻訳合成とその応用 |
EP2990411B1 (en) | 2007-03-26 | 2017-05-03 | The University of Tokyo | Process for synthesizing cyclic peptide compound |
JP5818237B2 (ja) * | 2010-09-09 | 2015-11-18 | 国立大学法人 東京大学 | N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 |
-
2011
- 2011-12-05 JP JP2012546969A patent/JP6206943B2/ja active Active
- 2011-12-05 WO PCT/JP2011/078029 patent/WO2012074130A1/ja active Application Filing
- 2011-12-05 EP EP11845623.5A patent/EP2647720B1/en active Active
- 2011-12-05 US US13/990,180 patent/US10195578B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010104115A1 (ja) * | 2009-03-10 | 2010-09-16 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 膜タンパク質を特異的に認識するポリペプチドの調製方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6015044811; 有機合成化学協会誌 Vol.68, No.3, 201003, 217-227 * |
JPN6015044813; 化学フロンティア22 生命現象を理解する分子ツール -イメージングから生体機能解析まで 第1版 第1刷, 20100924, 71-78 * |
JPN7015003095; 生化学 82, 6, 201006, 505-514 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2647720A9 (en) | 2015-04-01 |
WO2012074130A1 (ja) | 2012-06-07 |
EP2647720A4 (en) | 2015-05-20 |
JP6206943B2 (ja) | 2017-10-04 |
EP2647720A1 (en) | 2013-10-09 |
US10195578B2 (en) | 2019-02-05 |
EP2647720B1 (en) | 2019-06-19 |
US20140018257A1 (en) | 2014-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6206943B2 (ja) | ペプチドライブラリーの製造方法、ペプチドライブラリー、及びスクリーニング方法 | |
JP6004399B2 (ja) | 安定化された二次構造を有するペプチド、及びペプチドライブラリー、それらの製造方法 | |
JP5818237B2 (ja) | N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 | |
JP5174971B2 (ja) | ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法 | |
EP2868744B1 (en) | Screening method for peptide binding to target molecule in a ph-dependent manner | |
JP6440055B2 (ja) | ペプチドライブラリの製造方法、ペプチドライブラリ、及びスクリーニング方法 | |
WO2014119600A1 (ja) | Flexible Display法 | |
WO2015115661A1 (ja) | アゾール誘導体骨格を有するペプチドの製造方法 | |
US11970694B2 (en) | Rapid display method in translational synthesis of peptide | |
JP7049569B2 (ja) | pH依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法 | |
Murakami et al. | High-affinity mirror-image monobody targeting MCP-1 generated via TRAP display and chemical protein synthesis | |
KR20240042497A (ko) | 폴리펩타이드의 제작 방법, 태그, 발현 벡터, 폴리펩타이드의 평가 방법, 핵산 디스플레이 라이브러리의 제작 방법 및 스크리닝 방법 | |
上野真吾 et al. | Development of mRNA-protein fusion at N-terminus for evolutionary protein engineering |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141024 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151105 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20151028 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160104 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160524 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161003 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170612 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170831 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6206943 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S201 | Request for registration of exclusive licence |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R314201 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |