JP7229158B2 - N-置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法 - Google Patents
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Description
(1)酸添加時(固相からの切り離し反応時および側鎖脱保護反応時)の加水分解、特にN-置換されたアミノ基に由来する加水分解を抑制するために必要な反応条件を見出すこと、
(2)酸添加時の実用的な後処理が可能となる反応条件を見出すこと、
(3)非天然型ペプチド化合物の特異な溶解性を考慮した溶媒を含む反応条件を見出すこと、
(4)非天然型ペプチド化合物が、ヒドロキシル基などの官能基を含む場合に、脱保護後の副反応(N→Oアシルシフトやヒドロキシル基と反応試薬との副反応(例えばTFAを試薬とした場合のTFAアシル化反応)を抑制すること、
を課題とする。
加えて、アミノ酸側鎖の各官能基に対して、上記4つの条件を満足する保護基を見出すことを課題とする。
さらに、N-置換されたアミノ酸を含むペプチド化合物の工業的な生産をも考慮し、特定の配列に対する最適化にも適用可能な製造方法を見出すことも課題とする。
〔1〕 以下の工程:
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)工程1)で準備されたFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを固相に担持する工程、
3)固相に担持されたFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
4)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程、及び、
5)工程4)で得られたペプチドを、TFAよりも弱酸となる条件下で固相から切り出す工程、
を含む、少なくとも1つのN-置換アミノ酸又はN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法。
〔2〕 前記工程4)で得られたペプチドを構成するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されず、かつ第1の酸で脱保護される保護基で保護されており、前記工程5)の前又は後で、該第1の酸にて該保護基を脱保護する工程をさらに含み、かつ
前記工程5)において、第2の酸を用いてペプチドを切り出す、〔1〕に記載の製造方法であって、
第1の酸および第2の酸がいずれもTFAよりも弱酸であり、かつ第1の酸の酸度が第2の酸の酸度よりも高い、製造方法。
〔3〕 以下の工程:
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)Fmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
3)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程であって、この工程で得られるペプチドを構成するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されずTFAよりも弱酸となる条件下で脱保護される保護基を有する工程、及び、
4)前記側鎖の保護基を、TFAよりも弱酸となる条件下で脱保護する工程、
を含む、少なくとも1つのN-置換アミノ酸又はN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法。
〔4〕 ペプチドの製造が固相法によって行われる、〔3〕に記載の製造方法。
〔5〕 前記工程3)で得られたペプチドを、前記工程4)の前又は後で前記工程4)で用いられる弱酸条件よりも更に弱酸となる条件下で固相から切り出す工程をさらに含む、〔4〕に記載の製造方法。
〔6〕 ペプチドの製造が液相法によって行われる、〔3〕に記載の製造方法。
〔7〕 〔1〕の工程4)又は〔3〕の工程3)が、
新たに添加したFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護してアミノ基を露出する工程、および
更に新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程をさらに含み、
これらの工程を1回または複数回繰り返す、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の製造方法。
〔8〕 製造されたペプチドが、1つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基をC末端側に含み、かつもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体をN末端側に含む、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の製造方法。
〔9〕 前記1つの反応点と前記もう一つの反応点とを結合させ、前記ペプチドを環化させる工程をさらに含む、〔8〕に記載の製造方法。
〔10〕 前記もう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がN末端にあり、かつ前記結合がアミド結合である、〔9〕に記載の製造方法。
〔11〕 前記もう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がN末端にあり、かつ前記結合が炭素-炭素結合である、〔9〕に記載の製造方法。
〔12〕 TFAよりも弱酸となる条件下で行われる工程が、水中でのpKaの値が0~9である弱酸を、イオン化能YOTs値が正の値で水中でのpKaが5~14である溶媒に含む、弱酸溶液を用いて行われる、〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の製造方法。
〔13〕 溶媒がフルオロアルコールである、〔12〕に記載の製造方法。
〔14〕 フルオロアルコールがTFE又はHFIPである、〔13〕に記載の製造方法。
〔15〕 側鎖の保護基が、pH1からpH7の範囲で脱保護される保護基であるか、又は10%以下のTFAにおいて脱保護される保護基である、〔2〕から〔14〕のいずれかに記載の製造方法。
〔16〕 側鎖の保護基が以下のa)~d)から選択される、〔2〕から〔15〕のいずれかに記載の製造方法:
a)側鎖の保護基がSer、Thr、Hyp、及び、それらの誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格基、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、シリル骨格及びBoc骨格から選ばれるいずれかの保護基;
b)側鎖の保護基がTyr及びその誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、シリル骨格、Boc骨格及びtBu骨格から選ばれるいずれかの保護基;
c)前記側鎖の保護基がHis及びその誘導体の側鎖のイミダゾール環の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格及びTrt骨格から選ばれるいずれかの保護基;
d)前記側鎖の保護基がAsp、Glu、及び、それらの誘導体の側鎖のカルボン酸基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、tBu骨格、フェニル-EDOTn骨格及び保護をするカルボン酸基の炭素原子を3つのアルコキシ基が置換した骨格に変換したオルトエステル骨格から選ばれるいずれかの保護基;
<MOM骨格を有する保護基>
R1はHであり、R2はHであり、かつXはメチル、ベンジル、4-メトキシベンジル、2,4-ジメトキシベンジル、3,4-ジメトキシベンジル、または2-トリメチルシリルエチルであるか、
R1はメチルであり、R2はHであり、かつXはエチルであるか、
R1、R2、R3は、いずれもメチルであるか、または
R1とXは、一緒になって-CH2-CH2-CH2-または-CH2-CH2-CH2-CH2-を形成し、かつR2はHであり
ここで、R1、R2、およびXのいずれかがメチルまたはエチルである場合、これらの基はさらにアルキル、ベンジル、またはアリールで置換されていてもよい。)
<Bn骨格を有する保護基>
R1~R5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR6およびR7はアルキルであるか、
R1、R2、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、R3はメトキシであり、かつR6およびR7はHであるか、
R1およびR3がメトキシであり、R2、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR6およびR7はHであるか、または
R1、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR2とR3は一緒になって-O-CH2-O-を形成する。)
<Dpm骨格を有する保護基>
R1~R10は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
R1~R4およびR7~R10は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR5およびR6は一緒になって-O-または-CH2-CH2-を形成する。)
<Trt骨格を有する保護基>
R1~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、
R1、R2、およびR4~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR3は、メチルまたはメトキシであるか、
R1はClであり、かつR2~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
R1~R4、およびR7~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR5とR6は一緒になって-O-を形成する。)
<シリル骨格を有する保護基>
R1~R3は、それぞれ独立してアルキル、またはアリールである。)
<Boc骨格を有する保護基>
R1~R9は、それぞれ独立してH、アルキル、またはアリールである。)
<tBu骨格を有する保護基>
R1~R9は、それぞれ独立してH、アルキル、またはアリールである。)
<フェニル-EDOTn骨格を有する保護基>
R1~R3は、それぞれ独立して、H、またはメトキシである)。
(1)本発明によって見出した、TFAに比べて弱酸である酸とイオン化能を示す溶媒との組み合わせによって、ペプチド鎖の酸加水分解や、β-ヒドロキシ-α-アミノ酸(例えば、Ser、Thr、及び、それらの誘導体)が含まれている配列において起こり得るN→O-アシルシフトやTFAエステル化などを最小限に抑制して脱保護でき、かつ
(2)当該アミノ酸をアミド結合形成反応にて伸長する際に、一般的なペプチド合成に用いられている保護基を有している場合に比べて、反応速度および反応効率を改善できる。
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)工程1)で準備したFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを固相に担持する工程、
3)固相に担持したFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
4)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程、及び、
5)工程4)で得られたペプチドを、TFAよりも弱酸となる条件下で固相から切り出す工程。
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)Fmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
3)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程であって、この工程で得られるペプチドを構成するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されずTFAよりも弱酸となる条件下で脱保護される保護基を有する工程、及び、
4)前記側鎖の保護基を、TFAよりも弱酸となる条件下で脱保護する工程。
上記ペプチドの製造は、固相法によって行われていても、液相法によって行われていてもよい。
本発明におけるペプチドは、直鎖ペプチドでも環状ペプチドでも良く、環状ペプチドであることが好ましい。
このようなN-置換アミノ酸として具体的には、アルキル基、アラルキル基、シクロアルキル基などが好ましく用いられる。
(-C=O-OR)
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基。
非特許文献i)Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition,
非特許文献ii)Chemical Reviews, 2009, 109(6), 2455-2504.
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば酸素原子を介して架橋されたXan基や、炭素原子2つを介して架橋されたジベンゾスベリル基などを用いてもよい。
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば酸素原子を介して架橋されたピキシル(Pixyl)基を用いることもできる。
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば酸素原子を介して架橋されたXan基や、炭素原子2つを介して架橋されたジベンゾスベリル基などを用いてもよい。
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば酸素原子を介して架橋されたピキシル(Pixyl)基を用いることもできる。
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば炭素原子2つを介して架橋されたジベンゾスベリル基などを用いてもよい。
また、R5とR6の間で架橋したもの、例えば酸素原子を介して架橋されたピキシル(Pixyl)基を用いることもできる。
樹脂を構成するポリマーの種類についても特に限定されない。ポリスチレンで構成される樹脂の場合には、100-200meshもしくは200-400meshのいずれを用いても良い。また、架橋率についても特に限定されないが、1%DVB(ジビニルベンゼン)架橋のものが好ましい。
更に新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程をさらに含む。これらの工程は1回または複数回繰り返してもよい。本発明の方法は、Fmoc骨格を有する保護基の脱保護と、次の新しいFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドとの縮合反応を繰り返すことによって目的のペプチド配列を得ることが可能である。
合成されたペプチドの側鎖の保護基を脱保護した後に切り出し工程を行う場合、切り出しに用いられる弱酸は、TFAより弱酸であれば特に限定されない。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
DCM ジクロロメタン
DCE 1,2-ジクロロエタン
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DIC N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DBU 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセ
ン
NMP N-メチル-2-ピロリドン
FA ギ酸
TFA トリフルオロ酢酸
TFE 2,2,2-トリフルオロエタノール
HFIP 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロピル
アルコール
HOAt 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
WSCI・HCl 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド塩酸塩
TBME t-ブチルメチルエーテル
TIPS トリイソプロピルシラン
HATU O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル
)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキ
サフルオロリン酸塩
N-メチルアミノ酸を配列中に含む環状ペプチドの合成は、Fmoc法による固相合成を採用し、以下の5段階の工程による図1に記載の合成ルートで行った。
A)ペプチド合成機を用いFmoc法によって、その側鎖のカルボン酸を2-クロロトリチルレジンに担持させたAspのN末端からペプチドを伸長する工程
B)2-クロロトリチルレジンからペプチドを切り出す工程
C)切り出したペプチドのAspの側鎖のカルボン酸(白丸ユニット)と、ペプチド鎖N末端(三角ユニット)のアミノ基とを縮合し、アミド結合によって環化する工程
D)ペプチド鎖に含まれる側鎖官能基の保護基を脱保護する工程
E)分取HPLCによって化合物を精製する工程。
本実施例に記載するペプチド合成において、ペプチド合成機による合成(前記工程A)には、以下のFmoc-アミノ酸を用いた。
これらは渡辺化学、Chempep社、またはChem-Impex社などから購入した。
これらは、文献記載の方法にて合成した(文献:国際公開番号 WO 2013/100132 A1)。
これらは以下のとおり合成した。なお、これらの合成したFmoc-アミノ酸は、ペプチド合成だけでなく、側鎖官能基の保護基もしくはC末端カルボン酸基の保護基の脱保護検討にも用いた。
(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)プロパン酸(化合物1、Fmoc-Ser(THP)-OH)の合成
得られた残渣をテトラヒドロフラン(THF、12.2 mL)に溶解させ、次いでpH 8.0に調製した1.0 M リン酸緩衝液(12.2 mL)を加えた。この混合物を50度で3時間攪拌した。25度まで冷却した後、酢酸エチル(12.2 mL)を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル(12.2 mL)を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(12.2 mL)で2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、25度で30分乾燥させた。
得られた残渣をジクロロメタン(7 mL)に溶解させ、次いでヘプタン(16.6 mL)を加えた。制御した減圧下(~100 hPa)、ジクロロメタンのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を2度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させ、1.40 gの残渣を得た。
得られた残渣にt-ブチルメチルエーテル(TBME、25 mL)とpH 2.1の0.05 M リン酸水溶液(70 mL)を加えて、25度にて5分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層にt-ブチルメチルエーテル(TBME、25 mL)を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(25 mL)にて2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させることで、(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)プロパン酸(化合物1、Fmoc-Ser(THP)-OH、1.22 g, 30 mol%のt-ブチルメチルエーテル(TBME)が残留)を得た。得られたFmoc-Ser(THP)-OHは-25度の冷凍庫にて保存した。
LCMS(ESI)m/z=410.2(M-H)-
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
(2S,3R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ブタン酸(化合物2、Fmoc-Thr(THP)-OH)の合成
得られた粗生成物のうち、4.65 gをテトラヒドロフラン(THF、30 mL)に溶解させ、次いでpH 8.0に調製した1.0 M リン酸緩衝液(30 mL)を加えた。この混合物を50度で4時間攪拌した。25度まで冷却した後、酢酸エチル(30 mL)を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル(30 mL)を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(30 mL)で2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、25度で30分乾燥させた。
得られた残渣をジエチルエーテル(50 mL)に溶解させ、次いでヘプタン(50 mL)を加えた。制御した減圧下(~100 hPa)、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を2度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させ、Fmoc-Thr(THP)-OHのナトリウム塩(2.80 g, 6.26 mmol)を得た。
得られた全量のFmoc-Thr(THP)-OHのナトリウム塩に酢酸エチル(50 mL)とpH 2.1の0.05 M リン酸水溶液(140 mL)を加えて、25度にて5分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル(50 mL)を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(50 mL)にて2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させた後、得られた固体をt-ブチルメチルエーテル(TBME、50 mL)に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、25度で1時間乾燥させることで、(2S,3R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ブタン酸(化合物2、Fmoc-Thr(THP)-OH、2.70 g, 30mol%のt-ブチルメチルエーテル(TBME)が残留)をTHP保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして得た。得られたFmoc-Thr(THP)-OHは-25度の冷凍庫にて保存した。
LCMS(ESI)m/z=424.2(M-H)-
保持時間:0.84分、0.85分(分析条件SQDFA05)
(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)プロパン酸(化合物6、Fmoc-MeSer(THP)-OH)の合成
得られた残渣のうち、15.0 gをテトラヒドロフラン(175 mL)に溶解させ、次いでpH 8.0に調製した1.0 M リン酸緩衝液(175 mL)を加えた。この混合物を50度で3時間攪拌した。25度まで冷却した後、酢酸エチル(175 mL)を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル(175 mL)を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(175 mL)で2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。
得られた残渣をジクロロメタン(100 mL)に溶解させ、次いでヘプタン(250 mL)を加えた。制御した減圧下(~100 hPa)、ジクロロメタンのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を2度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させた。
得られた残渣にt-ブチルメチルエーテル(TBME、250 mL)とpH 2.1の0.05 M リン酸水溶液(700 mL)を加えて、25度にて5分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層にt-ブチルメチルエーテル(TBME、250 mL)を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液(250 mL)にて2度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、25度で2時間乾燥させることで、(2S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)プロパン酸(化合物6、Fmoc-MeSer(THP)-OH、9.0 g、30mol%のt-ブチルメチルエーテル(TBME)が残留)を得た。得られたFmoc-MeSer(THP)-OHは-25度の冷凍庫にて保存した。
LCMS(ESI)m/z=426.4(M+H)+
保持時間:0.86分(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン酸(化合物7、Fmoc-MeHis(Trt)-OH)の合成
得られた固体に1,4-ジオキサン(1000 mL)、炭酸カリウム(84 g、603.39 mmol)、水(1000 mL)を加えた。さらに炭酸 (2,5-ジオキソピロリジン-1-イル) (9H-フルオレン-9-イル)メチル(Fmoc-OSu、102 g、302.38 mmol)を加えて、0度にて2時間攪拌した。得られた反応溶液をジエチルエーテル(2000 mL)にて洗浄した後、酢酸を用いて溶液のpHを6~7に調整した。得られた固体をろ過することで、(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(1-トリチル-1H-イミダゾール-4-イル)プロパン酸(化合物7、Fmoc-MeHis(Trt)-OH、155 g)を得た。
LCMS(ESI)m/z=634.4(M+H)+
保持時間:1.07分(分析条件SQDAA05)
(2R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸(化合物8、Fmoc-D-Tyr(THP)-OH)の合成
得られた残渣 (300 mg)をテトラヒドロフラン (THF) (2.5 mL)に溶解させ、1.0 Mのリン酸水溶液 (pH 8.0, 2.5 mL)を加えて50度で3時間攪拌した。反応液に酢酸エチル(3 mL)を加え、有機層と水層を分離し、水層を酢酸エチル (3 mL)で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、飽和食塩水 (3 mL)で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで減圧下30分乾燥させた。
得られた残渣をジクロロメタン (DCM) (2 mL)に溶解させ、ヘプタン (5 mL)を加えた。ジクロロメタン (DCM)のみをエバポレーターにより除去し、得られた白色固体をろ過により集めた。得られた白色固体に対して、同様の操作を2回繰り返した。そのようにして得られた白色固体をポンプで減圧下2時間乾燥させた。
上記の白色固体にt-ブチルメチルエーテル (TBME) (4.6 mL)と0.05 Mリン酸水溶液 (pH 2.1, 13 mL)を加え、25度で5分攪拌した。有機層を分離した後、水層をt-ブチルメチルエーテル (TBME) (4.6 mL)で抽出した。得られた有機層を集め、飽和食塩水 (4.6 mL)で2回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を逆相クロマトグラフィー(Wakosil 25C18 10 g, 水/アセトニトリル)により精製することで(2R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-((テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸(化合物8、Fmoc-D-Tyr(THP)-OH, 173 mg)をTHP保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマーとして57%の収率で得た。
LCMS(ESI)m/z=488.4(M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
2,2,2-トリクロロアセトイミド酸 2-フェニルプロパン-2-イル(化合物9)の合成
1H NMR (Varian 400-MR, 400 MHz, CDCl3) δ 1.89 (6H, s), 7.28 (1H, m), 7.36 (2H, m), 7.43 (2H, m), 8.20 (1H, brs)
2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロパン酸 (R)-メチル(化合物10、Fmoc-D-Tyr-OMe)の合成
LCMS(ESI)m/z=418.3(M+H)+
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
(R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸 (化合物11, Fmoc-D-Tyr(Pis)-OH)の合成
上述の得られた混合物をジクロロエタン(DCE) (535 μL)に溶解させ、水酸化トリメチルスズ(IV) (Me3SnOH, 58.1 mg, 0.321 mmol)を加え、60度で7時間攪拌した。反応液に水酸化トリメチルスズ(IV) (Me3SnOH, 29.1 mg, 0.161 mmol)をさらに加え、60度で15時間攪拌した。反応液をエバポレーターにより濃縮し、t-ブチルメチルエーテル (TBME、1 mL)と0.05 Mリン酸水溶液 (pH 2.1, 2 mL)を加え、25度で5分攪拌した。有機層を分離した後、水層をt-ブチルメチルエーテル (TBME、1 mL)で2回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー(purif pack(登録商標) SIZE 20, ジクロロメタン/メタノール)で精製し、(R)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸 (化合物11, Fmoc-D-Tyr(Pis)-OH, 33 mg)を2段階収率39%で得た。
LCMS(ESI)m/z=522.4(M+H)+
保持時間:1.00分(分析条件SQDFA05)
2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-フルオロ-4-ヒドロキシフェニル)プロパン酸 (S)-メチル(化合物12、Fmoc-Tyr(3-F)-OMe)の合成
上記の残渣(1.04 g)をメタノール(10 mL)に溶かし、チオニルクロライド(SOCl2, 539 μL, 7.38 mmol)を滴下しながら0度で加えた。反応液を60度で1時間攪拌した後、室温に冷却し、エバポレーターを用いて溶媒を留去した。得られた残渣に酢酸エチル、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプで乾燥させた。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(purif pack(登録商標) SIZE 200, ヘキサン/酢酸エチル)で精製し、2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-フルオロ-4-ヒドロキシフェニル)プロパン酸 (S)-メチル (化合物12、Fmoc-Tyr(3-F)-OMe, 900mg, 2.07 mmol)を2段階収率84%で得た。
LCMS(ESI)m/z=436.4(M+H)+
保持時間:0.82分(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-(tert-ブトキシ)-3-フルオロフェニル)プロパン酸(化合物13、Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH)の合成
上述の得られた混合物(40 mg)をジクロロエタン(DCE) (810 μL)に溶解させ、水酸化トリメチルスズ(IV) (Me3SnOH, 29.4 mg, 0.163 mmol)を加え、60度で1時間攪拌した。反応液にギ酸 (15.35 μL, 0.407 mmol)を加えた後、逆相クロマトグラフィー(Wakosil 25C18 10 g, 0.1% ギ酸水溶液/0.1% ギ酸アセトニトリル溶液)により精製することで(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-(tert-ブトキシ)-3-フルオロフェニル)プロパン酸(化合物13、Fmoc-Tyr(3-F,tBu)-OH, 27mg, 56.5μmol)を2段階収率93%で得た。
LCMS(ESI)m/z=478.3(M+H)+
保持時間:0.94分(分析条件SQDFA05)
ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(2-フェニルプロパン-2-イル) (S)-1-((9H-フルオレン-9-イル)メチル) (化合物14、Fmoc-Pro-OPis)の合成
続いて、反応液を0度に氷冷し、トリクロロアセトニトリル(11.5 mL, 115 mmol)を5分以上かけて滴下した。混合物を0度にて10分間、その後氷浴から外して室温にてさらに1時間攪拌した。得られた混合物を0度に氷冷し、(S)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)ピロリジン-2-カルボン酸(Fmoc-Pro-OH、42.3 g, 125 mmol)とジクロロメタン(100 mL)との混合物を15分かけて加えた。0度にて30分攪拌した後、ろ過し、ヘキサン-ジクロロメタン(5/1)溶液にて洗浄し、続いて減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン-酢酸エチル)にて精製し、ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(2-フェニルプロパン-2-イル) (S)-1-((9H-フルオレン-9-イル)メチル) (化合物14、Fmoc-Pro-OPis、26.3 g, 57.7 mmol)を得た。
LCMS(ESI)m/z=456.4(M+H)+
保持時間:0.76分(分析条件SQDAA50)
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸(化合物16、Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH)の合成
同様の操作にて調製した別ロットと混合した4-(4-クロロベンジル)-5-オキソオキサゾリジン-3-カルボン酸 (S)-(9H-フルオレン-9-イル)メチル(230 g、530.10 mmol)のジクロロメタン(2.5 L)溶液にトリエチルシラン(881 g、7.58 mol)とトリフルオロ酢酸(TFA、2518 g、22.28 mol)を混合し、30度にて12時間攪拌した。続いて減圧下、溶媒を留去し、得られた残渣をジクロロメタン/ヘキサン(1/10, v/v)にて再結晶することにより、(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸(化合物16、Fmoc-MePhe(4-Cl)-OH、205 g)を得た。
LCMS(ESI)m/z=436.3(M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDAA05)
2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-フルオロ-4-((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸 (S)-メチル(化合物21、Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OMe)の合成
LCMS(ESI)m/z=554.4(M+H)+
保持時間:1.09分(分析条件SQDFA05)
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(3-フルオロ-4-((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)フェニル)プロパン酸(化合物22、Fmoc-Tyr(3-F,Pis)-OH)の合成
LCMS(ESI)m/z=538.2(M-H)-
保持時間:1.00分(分析条件SQDFA05)
ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるレジンとFmoc-アミノ酸との結合体は、以下のとおり合成した。
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-(ピペリジン-1-イル)ブタン酸-2-クロロトリチルレジン(化合物50、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip)の合成
Fmoc-Asp-piptBu(化合物51)の側鎖カルボン酸にてレジンと結合させた化合物(化合物52)の合成
3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(4-(tert-ブチル)ピペリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸 (S)-tert-ブチル(化合物53、Fmoc-Asp(OtBu)-piptBu)の合成(なお、piptBuとは4-(tert-ブチル)ピペリジンを意味し、ここではC末端のカルボン酸基が4-(tert-ブチル)ピペリジンとアミド結合を形成していることを示している。)
LCMS(ESI)m/z=535.4(M+H)+
保持時間:1.17分(分析条件SQDAA05)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(4-(tert-ブチル)ピペリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸(化合物51、Fmoc-Asp-piptBu)の合成
LCMS(ESI)m/z=479.4(M+H)+
保持時間:1.00分(分析条件SQDAA05)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(4-(tert-ブチル)ピペリジン-1-イル)-4-オキソブタン酸-2-クロロトリチルレジン(化合物52、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu)の合成
得られたFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu(化合物52、16.5 mg)を反応容器に入れ、20%ピペリジン/DMF溶液 (1 mL)を加え、25度にて30分間振とうした。反応混合液から30 μLを取りだし、これをDMF (2.97 mL)で希釈し、その吸光度(301.2 nm)を測定し(Shimadzu, UV-1600PC(セル長1.0 cm)を用いて測定)、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu(化合物52)のローディング量を0.356 mmol/gと算出した。
なお、同様に合成したローディング量が異なる別ロットについてもペプチド合成に使用した。
Fmoc-Asp-MeOctyl(化合物54)の側鎖カルボン酸にてレジンと結合させた化合物(化合物55)の合成
3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(メチル(オクチル)アミノ)-4-オキソブタン酸 (S)-tert-ブチル(化合物56、Fmoc-Asp(OtBu)-MeOctyl)の合成(なお、MeOctylとはN-メチルオクタン-1-アミンを意味し、ここではC末端のカルボン酸基がN-メチルオクタン-1-アミンとアミド結合を形成していることを示している。)
LCMS(ESI)m/z=537.5(M+H)+
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA50)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(メチル(オクチル)アミノ)-4-オキソブタン酸(化合物54、Fmoc-Asp-MeOctyl)の合成
LCMS(ESI)m/z=481.4(M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDAA50)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(メチル(オクチル)アミノ)-4-オキソブタン酸-2-クロロトリチルレジン(化合物55、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-MeOctyl)の合成
ローディング量:0.366 mmol/g
なお、同様に合成したローディング量が異なる別ロットについてもペプチド合成に使用した。
Fmoc-Asp-Pro-OPis(化合物57)の側鎖カルボン酸にてレジンと結合させた化合物(化合物58)の合成
1-((S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-(アリルオキシ)-4-オキソブタノイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (S)-2-フェニルプロパン-2-イル(化合物59、Fmoc-Asp(OAll)-Pro-OPis)の合成
LCMS(ESI)m/z=611.4(M+H)+
保持時間:1.03分(分析条件SQDFA05)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-((S)-2-(((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)カルボニル)ピロリジン-1-イル)ブタン酸(化合物57、Fmoc-Asp-Pro-OPis)の合成
LCMS(ESI)m/z=571.3(M+H)+
保持時間:0.88分(分析条件SQDFA05)
(S)-3-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-4-オキソ-4-((S)-2-(((2-フェニルプロパン-2-イル)オキシ)カルボニル)ピロリジン-1-イル)ブタン酸-2-クロロトリチルレジン(化合物58、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis)の合成
得られたFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(化合物58、12.3 mg)を反応容器に入れ、DMF (0.2 mL)およびピペリジン (0.2 mL)を加え、25度にて30分間振とうした。反応容器にDMF (1.6mL)を加えた後、反応混合液から0.4 mLを取りだし、これをDMF (9.6 mL)で希釈し、その吸光度(301.2 nm)を測定した(Shimadzu, UV-1600PC(セル長1.0 cm)を用いて測定)。次の計算式により、Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(化合物58)のローディング量を0.3736 mmol/gと算出した。
(吸光度(301.2 nm) ×1000×50)/(レジン重量(mg)×7800) = (0.717×1000×50)/(12.3×7800) = 0.3736 mmol/g
なお、同様に合成したローディング量が異なる別ロットについてもペプチド合成に使用した。
特別な記載がない限り、上記の基本合成ルートでのペプチド合成は以下の方法にて行った。
ペプチド合成機(Multipep RS; Intavis社製)を用いて、Fmoc法によりペプチド合成を行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
上記の方法によって伸長したペプチドのN末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをDMFにて洗浄した。続いてDCMにてレジンを再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)を加えて室温にて2時間振とうした。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)にて2回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。
切り出し後に減圧下濃縮した残渣をDMF/DCM (1/1, v/v, 8 mL)に溶解した。0.5 M O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU)/DMF溶液(用いたレジン上のモル数(ローディング量(mmol/g)に使用したレジン量(通常は0.10 g)をかけたもの)に対して1.5等量となる容量)と、DIPEA(用いたレジン上のモル数に対して1.8等量)を加え、室温にて2時間振とうした。その後、減圧下溶媒を留去した。目的の環状ペプチドの生成をLCMS測定によって確認した。
ペプチド合成に用いるFmoc-アミノ酸の側鎖官能基の保護基が、TFAよりも弱酸となる条件、すなわち水中でのpKaが0~9である弱酸を、YOTs値が正の値であり、弱酸性であり(水中でのpKaが5~14)、かつ求核性が低い溶媒に溶解した溶液中で脱保護可能かどうかを検討した。
0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP溶液(2% TIPS)は、HFIP (11.66 mL), TIPS (0.24 mL), DCE (0.10 mL)を混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに68.5 mgの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。
0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)は、HFIP (11.66 mL), TIPS (0.24 mL), DCE (0.10 mL)を混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに34.3 mgの硫酸水素テトラブチルアンモニウムを溶解させて調製した。
側鎖に保護基の付いたFmoc-アミノ酸(4.0 umol)とペプチド(既に合成した環状ペプチドPep 1~Pep 6のいずれか(環化後の残渣);最大で3.66 umol)の混合物に対し、0.1 M硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP溶液 (2% TIPS) (0.20 mL)もしくは0.05 M硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP溶液 (2% TIPS) (0.40 mL)を加えて3分間振とうし、その後25度にて静置し、一定時間後にLCMS(FA05)を測定した。脱保護の進行は、脱保護体と被保護体のUVエリア比より算出した。
側鎖に保護基の付いたアミノ酸残基を含むペプチド(既に合成した環状ペプチドPep 1~Pep 6のいずれか(環化後の残渣);最大で3.66 umol)に対し、0.1 M硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP (2% TIPS) (0.20 mL)もしくは0.05 M硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP (2% TIPS) (0.40 mL)を加えて3分間振とうし、その後25度にて静置し、一定時間後にLCMS(FA05)を測定した。脱保護の進行は、脱保護体と被保護体のUVエリア比より算出した。
Fmoc-Tyr(3-F)-OH (run3、run4、run15の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=422.3(M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
Fmoc-MeHis-OH (run5の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=392.3(M+H)+
保持時間:0.47分(分析条件SQDFA05)
Fmoc-MeSer-OH (run8の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=342.3(M+H)+
保持時間:0.67分(分析条件SQDFA05)
Fmoc-Ser-OH (run10の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=328.2(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
Fmoc-Pro-OH (run11の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=338.3(M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDFA05)
Fmoc-D-Tyr-OH (run12~14の脱保護生成物)
LCMS(ESI)m/z=404.3(M+H)+
保持時間:0.72分(分析条件SQDFA05)
H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物101、Pep1)の、0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (化合物50、レジン担持量:0.342 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にてH-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物101)を合成した。環化後、減圧下濃縮を行った残渣をジクロロメタンに溶解して試験管に10等分した後、溶媒を再び減圧下濃縮を行った。
この10等分した1つの試験管に対し、0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに68.5 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.20 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて24時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行ったところ、側鎖の脱保護(D-Tyr(tBu)のtBu基の脱保護)の完結が確認できた。またこのとき、目的の脱保護されたペプチド(化合物131)と、加溶媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマススペクトルを示す化合物)と、加水分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が水分にて加溶媒分解されたもののマススペクトルを示す化合物)の比は72:10:18であった(図2)。なお、本実施例に記載の「TM+H2O」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つが加水分解を受けた化合物を表し、「TM+HFIP」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つがHFIPによって加溶媒分解を受けた化合物を表す。
目的のペプチド(化合物131)
LCMS(ESI)m/z=1424.0(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
加水分解体(TM+H2O)
LCMS(ESI)m/z=1442.0(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
HFIPによる加溶媒分解体(TM+ HFIP)
LCMS(ESI)m/z=1592.0(M+H)+
保持時間:0.69分、0.71分(分析条件SQDFA05)
H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物101、Pep1)の、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
化合物101(Pep1)を合成した後、上記の操作において10等分した別の1つに対し、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに34.3 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて24時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(D-Tyr(tBu)のtBu基の脱保護)は81%進行し、このとき、目的の脱保護されたペプチド(化合物131)と、加溶媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)と、加水分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が水分にて加水分解されたもののマスを示す化合物)の比は93:3:4であった(図3)。なお、「TM+H2O」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つが加水分解を受けた化合物を表す。同様に、「TM+HFIP」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つがHFIPによって加溶媒分解を受けた化合物を表す。
目的のペプチド(化合物131)
LCMS(ESI)m/z=1424.1(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
加水分解体
LCMS(ESI)m/z=1442.0(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
HFIPによる加溶媒分解体
LCMS(ESI)m/z=1592.0(M+H)+
保持時間:0.69分、0.71分(分析条件SQDFA05)
これに対して、同じペプチド配列に対して、5% TFAの替わりに0.1 Mまたは0.05 Mの硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP (2% TIPS)を用いることで、加水分解体(および加溶媒分解体)の生成を大幅に低減することができた。またこの結果は、TFAよりも弱酸となる条件を満たせば、弱酸の濃度を任意に調節できる可能性を示唆する。
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物103、Pep3)の、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (化合物50、ローディング:0.316 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にてH-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物103、Pep3)を合成した。環化後、減圧下濃縮を行った残渣をジクロロメタンに溶解して試験管に10等分した後、溶媒を再び減圧下濃縮を行った。
この10等分した1つの試験管に対し、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに34.3 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて静置し、4時間の段階でLCMS(SQDFA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(MeSer(DMT)のDMT基の脱保護、およびSer(Trt)のTrt基の脱保護)の完結が確認できた。またこのとき、脱保護された目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)と、目的のペプチドのN→O-アシルシフト体(デプシペプチド)のLCでのUVエリア比は、96:4であった。反応開始から22時間、25度で静置した段階でLCMS(SQDFA05)の測定を行った結果は、脱保護された目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)と、目的のペプチドのN→O-アシルシフト体(デプシペプチド)のLCでのUVエリア比は、83:17であった(図4)。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)
LCMS(ESI)m/z=1474.1(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
N→O-アシルシフト体
LCMS(ESI)m/z=1474.1(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
これに対し、同じペプチド配列に対して、5% TFAの替わりに0.05 Mの硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP (2% TIPS)を用いることで、N→O-アシルシフト体の生成を大幅に低減することができた。
H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物101、Pep1)の、0.05 M シュウ酸/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
化合物101(Pep1)を合成した後、上記の操作において10等分した別の1つに対し、0.05 M シュウ酸/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに18.0 mgのシュウ酸を溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(D-Tyr(tBu)のtBu基の脱保護)は完結し、このとき、目的の脱保護されたペプチド(化合物131)と、加溶媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)と、加水分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が水分にて加水分解されたもののマスを示す化合物)の比は79:17:4であった(図5)。なお、「TM+H2O」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つが加水分解を受けた化合物を表す。同様に、「TM+HFIP」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つがHFIPによって加溶媒分解を受けた化合物を表す。
目的のペプチド(化合物131)
LCMS(ESI)m/z=1423.5(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
加水分解体
LCMS(ESI)m/z=1441.5(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
HFIPによる加溶媒分解体
LCMS(ESI)m/z=1591.5(M+H)+
保持時間:0.68分、0.71分(分析条件SQDFA05)
H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物101、Pep1)の、0.05 M マレイン酸/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
化合物101(Pep1)を合成した後、上記の操作において10等分した別の1つに対し、0.05 M マレイン酸/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに23.2 mgのマレイン酸を溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(D-Tyr(tBu)のtBu基の脱保護)は完結し、このとき、目的の脱保護されたペプチド(化合物131)と、加溶媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)と、加水分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が水分にて加水分解されたもののマスを示す化合物)の比は81:12:7であった(図6)。なお、「TM+H2O」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つが加水分解を受けた化合物を表す。同様に、「TM+HFIP」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つがHFIPによって加溶媒分解を受けた化合物を表す。
目的のペプチド(化合物131)
LCMS(ESI)m/z=1423.5(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
加水分解体
LCMS(ESI)m/z=1441.5(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
HFIPによる加溶媒分解体
LCMS(ESI)m/z=1591.4(M+H)+
保持時間:0.68分、0.71分(分析条件SQDFA05)
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物103、Pep3)の、0.05 M シュウ酸/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
化合物103(Pep3)を合成した後、上記の操作において10等分した別の1つに対し、0.05 M シュウ酸/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに18.0 mgのシュウ酸を溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(SQDFA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(MeSer(DMT)のDMT基の脱保護、およびSer(Trt)のTrt基の脱保護)の完結が確認できた。またこのとき、脱保護された目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)と、目的のペプチドのN→O-アシルシフト体(デプシペプチド)のLCでのUVエリア比は、86:14であった(図7)。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.5(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
N→O-アシルシフト体
LCMS(ESI)m/z=1473.5(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物103、Pep3)の、0.05 M マレイン酸/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護
化合物103(Pep3)を合成した後、上記の操作において10等分した別の1つに対し、0.05 M マレイン酸/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに23.2 mgのマレイン酸を溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(SQDFA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(MeSer(DMT)のDMT基の脱保護、およびSer(Trt)のTrt基の脱保護)の完結が確認できた。またこのとき、脱保護された目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)と、目的のペプチドのN→O-アシルシフト体(デプシペプチド)のLCでのUVエリア比は、86:14であった(図8)。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.5(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
N→O-アシルシフト体
LCMS(ESI)m/z=1473.5(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
H-Ala-Phe(4-CF3)-Trp-Trp-MeLeu-MeGly-MeGly-Pro-Hyp(Et)-Ser(Trt)-Asp-pip(tBu)のN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物107、Pep7)の、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP (2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護と、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/TFE (2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護との比較
Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-piptBu (化合物52、ローディング:0.356 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にてH-Ala-Phe(4-CF3)-Trp-Trp-MeLeu-MeGly-MeGly-Pro-Hyp(Et)-Ser(Trt)-Asp-pip(tBu)のN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物107)を合成した。環化後、減圧下濃縮を行った残渣をジクロロメタンに溶解して試験管に10等分した後、溶媒を再び減圧下留去した。
この10等分した1つの試験管に対し、0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/HFIP溶液 (2% TIPS) (HFIP: 23.32 mL, TIPS: 0.48 mL, DCE: 0.20 mLを混合した溶液に205.8 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、25度にて4時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(Ser(Trt)のTrt基の脱保護)は完結し、このとき、脱保護された目的のペプチド(化合物137)と、加溶媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)とのUVエリア比は53:47であった(図9)。なお、「TM+HFIP」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つがHFIPによって加溶媒分解を受けた化合物を表す。
目的のペプチド(化合物137)
LCMS(ESI)m/z=1492.1(M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
HFIPによる加溶媒分解体(いずれかのアミド結合がHFIPによって加溶媒分解を受けたもの)
LCMS(ESI)m/z=1660.1(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
目的のペプチド(化合物137)
LCMS(ESI)m/z=1492.2(M+H)+
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
TFEによる加溶媒分解体(いずれかのアミド結合がTFEによって加溶媒分解を受けたもの)
LCMS(ESI)m/z=1592.0(M+H)+
保持時間:0.75分(分析条件SQDFA05)
0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護、およびその溶液に塩基(DIPEA)を加えての反応停止
Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (化合物50、ローディング:0.342 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にてH-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser(Trt)-Gly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-Pro-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物105、Pep5)を合成した。環化後、減圧下濃縮を行った残渣をジクロロメタンに溶解して試験管に10等分した後、溶媒を再び減圧下濃縮を行った。
この10等分した2つの試験管に対し、それぞれ0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに68.5 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(SQDFA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(Ser(Trt)のTrt基の脱保護)は完結し、このとき、目的の脱保護されたペプチド(化合物135)以外の加媒分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が溶媒であるHFIPにて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)や、加水分解体(ペプチドのいずれかのアミド結合が水分にて加溶媒分解されたもののマスを示す化合物)のマスを示すピークは検出されなかった(図11)。この反応混合物にそれぞれジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、14 μL, 硫酸水素テトラメチルアンモニウムに対して2等量)を加えて1つの試験管は25度にて18時間静置をし、もう1つの試験管は減圧下濃縮を行った。これらのLCMS(SQDFA05)を測定したところ、脱保護された目的のペプチド以外の加溶媒分解体や加水分解体のマスを示すピークは、この時点でも検出されなかった(図11)。
目的のペプチド(化合物135)
LCMS(ESI)m/z=1331.9(M+H)+
保持時間:0.74分(分析条件SQDFA05)
0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を脱保護条件として用いた脱保護、およびその溶液に塩基(DIPEA)を加えての反応停止
Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (化合物50、ローディング:0.316 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にてH-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAspの側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した環状化合物(化合物103、Pep3)を合成した。環化後、減圧下濃縮を行った残渣をジクロロメタンに溶解して試験管に10等分した後、溶媒を再び減圧下濃縮を行った。
この10等分した2つの試験管に対し、それぞれに0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)(HFIP: 11.66 mL, TIPS: 0.24 mL, DCE: 0.10 mLを混合した溶液から4 mLを抜き取り、これに68.5 mgの硫酸水素テトラメチルアンモニウムを溶解させたもの)を0.40 mL加えた。ラバーセプタムにて試験管に栓をし、3分間振とうしたのちに25度にて4時間静置し、LCMS(FA05)にて反応の確認を行った。その結果、側鎖の脱保護(MeSer(DMT)のDMT基の脱保護、およびSer(Trt)のTrt基の脱保護)は完結し、脱保護された目的のペプチド(化合物133)と、目的のペプチドのN→O-アシルシフト体(デプシペプチド)のLCでのUVエリア比は、93:7であった。
この反応混合物にそれぞれジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、14 μL, 硫酸水素テトラメチルアンモニウムに対して2等量)を加えて1つの試験管は25度にて18時間静置をし、もう1つの試験管はDIPEAを加えた直後に減圧下濃縮を行った。これらのLCMS(FA05)を測定したところ、18時間静置したものに関しては目的ペプチドとそのN→O-アシルシフト体のUVエリア比は変化せず、減圧下濃縮を行ったものに関しては、目的ペプチドとそのN→O-アシルシフト体のUVエリア比は98:2となった(図12)。
目的のペプチド(化合物133)
LCMS(ESI)m/z=1474.1(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
N→O-アシルシフト体
LCMS(ESI)m/z=1474.1(M+H)+
保持時間:0.64分(分析条件SQDFA05)
伸長反応時の低反応性が懸念されるThrとMeSerの側鎖ヒドロキシル基の保護基としてTHP基を用いた場合の反応性について以下の実験を行った。
レジン上にて伸長したペプチドで、N末端にN-メチルアミノ基がある化合物(H-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-2-Cl-Trt-resin)-pipに対するFmoc-Thr(Trt)-OHとFmoc-Thr(THP)-OH(化合物2)の伸長反応性の比較評価
伸長反応性の比較評価は、立体障害によってアミノ基の反応性が低いMePhe(3-Cl)をN末端に有する配列にて行った。
Fmoc-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(化合物108)は既に記載の方法で調製したFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (化合物50、ローディング:0.329 mmol/g, 100 mg)をレジンとして用い、既に記載の方法にて合成した。
得られたFmoc-MePhe(3-Cl)-D-Tyr(tBu)-Trp-MePhe-Trp-MePhe-Ile-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(化合物108)にジクロロメタン(600uL)を加え、30分静置してレジンを膨潤させた。液相を除いた後、続いてレジンをDMF(600uL)にて3度洗浄した。得られたレジンに2% DBU/DMF (v/v, 600uL)を加えて20分間振とうさせ、液相を取り除いた。レジンをDMF(600uL)で3度洗浄した。
このレジンに対し、0.60 M Fmoc-Thr(Trt)-OH/0.375 M oxymaのNMP溶液(300 uL)と10%(v/v) DIC/DMF (300uL)とを混合した溶液、もしくは0.60 M Fmoc-Thr(THP)-OH(化合物2)/0.375 M oxymaのNMP溶液(300 uL)と10%(v/v) DIC/DMF (300uL)とを混合した溶液を加えて振とうした。振とう中、1時間、2時間、4時間の段階で反応中のレジンをそれぞれ~10mgずつ取り出し、取りだしたレジンをDMF(600uL)にて3度洗浄し、さらに2% DBU/DMF (v/v, 600uL)を加えて20分間振とうさせ、液相を取り除いた。レジンをDMF(600uL)で3度、さらにジクロロメタン(600uL)で3度洗浄した。
得られたレジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)を加えて10分間振とうし、レジンをろ過で取り除いた後に、液相を減圧下濃縮した。残渣をLCMS(分析条件SQDFA05)にて分析した。結果を表4に示す。
H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr(PG)-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pipを合成機にて合成した際の、Fmoc-Thr(Trt)-OHもしくはFmoc-Thr(THP)-OH(化合物2)の伸長反応性
立体障害によって反応性が低いMePheをN末端に有する配列、およびThrのアミノ基に対して立体的に嵩高いMeLeuをN末端に有する配列に対してThrを伸長することにより、伸長反応性を検討した。
H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr(PG)-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(Thr側鎖のPGは保護基を表し、本実験ではTrt保護もしくはTHP保護を表す)は、既に記載の方法で調製したFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(化合物50、100 mg)をレジンとして用い、既に実施例に記載のFmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った。その際に、Thrの伸長においてはFmoc-Thr(Trt)-OHもしくはFmoc-Thr(THP)-OH(化合物2)を用いた。
ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをDMFおよびDCMにて洗浄した。
レジンをDCMにて再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)を加えて室温にて2時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)にて2回洗浄した。
切り出し後、Fmoc-Thr(Trt)-OHを用いた際には、続いて4N HCl/1,4-ジオキサン(19.5 uL)とTIPS (0.25 mL)とDCM (0.73 mL)を混合した溶液を用いて25度にて5分間振とうしてThr(Trt)のTrt基の脱保護をおこない、続いてDIPEA (24 uL)を加えることで酸の中和をし、LCMSにて伸長反応性を検討した。
目的物(化合物112、H-b-MeAla-Ile-MeLeu-MeAla-MeLeu-Thr-MePhe-MeAla-MeLeu-MePhe-Asp-pip)
LCMS(ESI)m/z=1373.6(M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDAA50)
LCMS(ESI)m/z=1272.6(M+H)+
保持時間:0.69分(分析条件SQDAA50)
目的物(化合物114)
LCMS(ESI)m/z=1458.1(M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
H-MeSer(PG)-MeVal-MeHis(Trt)-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis(Trt)-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPisを合成機にて合成した際の、Fmoc-MeSer(DMT)-OHもしくはFmoc-MeSer(THP)-OH(化合物6)を用いた場合の、MeSerの伸長反応性の確認
H-MeSer(PG)-MeVal-MeHis(Trt)-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis(Trt)-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(MeSer側鎖のPGは保護基を表し、本実験ではDMT保護もしくはTHP保護を表す)は、既に記載の方法で調製したFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-Pro-OPis(化合物58、ローディング量0.3736 mmol/g、100 mg)をレジンとして用い、既に実施例に記載のFmoc法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った。その際に、MeSerの伸長においてはFmoc-MeSer(DMT)-OHもしくはFmoc-MeSer(THP)-OH(化合物6)を用いた。
ペプチドの伸長後、N末端のFmoc基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをDMFおよびDCMにて洗浄した。
得られたレジンを減圧下乾燥させた後、それぞれのレジンを30 mgずつ取り出した。
取りだした各々30 mgのレジンをDCMにて再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)を加えて室温にて2時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)にて2回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。
得られた残渣に、既に記載の方法にて調製した0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を1.3 mL加え、残渣を溶解させた後、室温にて1時間静置し、Tyr(3-F)の側鎖tBu保護以外の側鎖保護基(MeSer側鎖のDMT保護もしくはTHP保護、およびMeHis側鎖のTrt保護)および主鎖C末端のPis保護を脱保護し、LCMSを測定することで、反応の確認をおこなった。
またMS(ネガティブモード)より、MeSerが抜けたペプチド(化合物116、H-MeVal-MeHis-Tyr(3-F,tBu)-Pro-MeHis-Pro-Trp-MePhe(4-Cl)-Asp-Pro-OH)が50%含まれていることが分かった。
目的物(化合物115)
LCMS(ESI)m/z=1559.7(M+H)+
保持時間:0.50分(分析条件SQDFA50)
目的物-MeSer(化合物116)
LCMS(ESI)m/z=1458.8(M+H)+
保持時間:0.50分(分析条件SQDFA50)
目的物(化合物115)
LCMS(ESI)m/z=1559.7(M+H)+
保持時間:0.50分(分析条件SQDFA50)
目的物-MeSer(化合物116)
LCMS(ESI)m/z=1458.7(M+H)+
保持時間:0.50分(分析条件SQDFA50)
H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物101、Pep-1)の側鎖保護基の脱保護(D-Tyr(tBu)のtBu保護の脱保護)(5% TFA/DCE (5% TIPS)を用いた場合)
既に記載の方法にて合成したFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(化合物50、レジン担持量0.373 mmol/g、100 mg)を用いて、合成機上でペプチド伸長を行い、H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pipを得た。
続いてDCMにてレジンを再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)を加えて室温にて2時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)にて2回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。
得られた残渣をDMF/DCM (1/1, v/v, 8 mL)に溶解し、O-(7-アザ-1Hベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU、21 mg)/DMF溶液(0.5 M)と、DIPEA(12 μL)/DMF(88 μL)溶液を加え、室温にて2時間攪拌した。LCMS測定(分析条件SQDFA05)にて反応の確認をし、H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr(tBu)-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物101、Pep-1)の生成を確認した。
LCMS(ESI)m/z=1480.0(M+H)+
保持時間:0.93分(分析条件SQDFA05)
その後、減圧下溶媒を留去し、得られた残渣に5% TFA/DCE (5% TIPS) (8 mL, 含有水分量は<200 ppmであることをカールフィッシャー測定にて確認)を加えて2時間30分攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣のLCMS(FA05)測定を行ったところ、目的物であるH-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物131)と、その加水分解体(いずれかのアミド結合が加水分解されたもの)のMSが確認され、対応するUVエリアの比は13:87であった(図17)。LCの測定結果を図17に示す。なお、本実施例中に記載の「TM+H2O」とは、目的物のいずれかのアミド結合の1つが加水分解を受けた化合物を表す。
目的物(化合物131、H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1424.0(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
加水分解体(H-Ala-Trp-Nle-Trp-D-Tyr-MeGly-MeAla-MePhe(3-Cl)-MeGly-nPrGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物の、いずれかのアミド結合が加水分解されたもの)
LCMS(ESI)m/z=1442.0(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物103、Pep3)の側鎖保護基(MeSer側鎖のDMT保護およびSer側鎖のTrt保護)の脱保護(5% TFA/DCE (5% TIPS)を用いた場合)
既に記載の方法にて合成したFmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip(化合物50、レジン担持量0.316 mmol/g、100 mg)を用いて、合成機上でペプチド伸長を行い、H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pipを得た。
続いてDCMにてレジンを再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)を加えて室温にて2時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 1 mL)にて2回洗浄した。
ペプチドのレジンからの切り出し操作を2度繰り返し、得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮した。
得られた残渣をDMF/DCM (1/1, v/v, 8 mL)に溶解し、O-(7-アザ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N,N-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート(HATU、18 mg)/DMF溶液(0.5 M)と、DIPEA(9.9 μL)/DMF(39.6 μL)溶液を加え、室温にて2時間攪拌した。LCMS測定(SQDFA05)にて反応の確認をしたところ、H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物103、Pep3)からMeSerの側鎖のDMT保護が外れたものが70%(LCMS(ESI) m/z = 1716.2 (M+H)+、保持時間:1.06分)、MeSerの側鎖のDMT保護およびSerの側鎖のTrt保護の両方が外れたものが30%(LCMS(ESI) m/z = 1474.1 (M+H)+、保持時間:0.78分)確認された。割合はLCのUVエリア比によって算出した。その後、減圧下溶媒を留去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、試験管に10等分した。これらを減圧下濃縮し、ジクロロメタンを取り除いた。なお、上述の実施例において使用された「環化後の残渣」とは、この10等分した後に減圧濃縮して得られた残渣のことを指す。
このうちのひとつの試験管に5% TFA/DCE (5% TIPS) (0.8 mL, 含有水分量は32.5 ppm、カールフィッシャーにて測定)を加えて3分間振とうし、その後25度にて2時間静置した。減圧下、溶媒を留去し、残渣のLCMS(FA05)測定を行ったところ、目的物であるH-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物133)と、目的物のN→O-アシルシフト体と、目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化したものと、目的物の2つのヒドロキシル基がTFAエステル化したもののUVエリア比は17:46:32:5であることが確認された。LCの測定結果を図18に示す。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.8(M+H)+
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
目的物のN→O-アシルシフト体(目的物の2つのヒドロキシル基のうち、いずれかもしくは両方でN→O-アシルシフトが進行した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.8(M+H)+
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1569.8(M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
目的物の2つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1665.9(M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDFA05)
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物103、Pep3)の側鎖保護基(MeSer側鎖のDMT保護およびSer側鎖のTrt保護)の脱保護(5% TFA/DCE (5% TIPS)を用いて0度で行った場合)
上記環化後、10等分したうちのひとつの試験管に、5% TFA/DCE (5% TIPS) (0.8 mL, 含有水分量は36.6 ppm、カールフィッシャーにて測定)を0度にて加えて1分間振とうし、その後0度のまま4時間静置した。反応溶液のLCMS(FA05)測定を行ったところ、目的物であるH-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物133)と、目的物のN→O-アシルシフト体と、目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化したものと、目的物のN→O-アシルシフト体の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化したもののUVエリア比は56:12:21:11であることが確認された。LCの測定結果を図19に示す。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.7(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
目的物のN→O-アシルシフト体(目的物の2つのヒドロキシル基のうち、いずれかもしくは両方でN→O-アシルシフトが進行した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.7(M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1569.7(M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
目的物のN→O-アシルシフト体の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1569.7(M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
H-g-EtAbu-MeSer(DMT)-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser(Trt)-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物103、Pep3)の側鎖保護基(MeSer側鎖のDMT保護およびSer側鎖のTrt保護)の脱保護(2% TFA/DCE (5% TIPS)を用いて25度で行った場合)
上記環化後、10等分したうちのひとつの試験管に、2% TFA/DCE (5% TIPS) (0.8 mL, 含有水分量は30.1 ppm、カールフィッシャーにて測定)を25度にて加えて1分間振とうし、その後室温にて4時間静置した。反応溶液のLCMS(FA05)測定を行ったところ、目的物であるH-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物(化合物133)と、目的物のN→O-アシルシフト体と、目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化したものと、目的物の2つのヒドロキシル基がTFAエステル化したものと、目的物のN→O-アシルシフト体の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化したもののUVエリア比は30:34:24:3:9であることが確認された。LCの測定結果を図20に示す。
目的のペプチド(化合物133、H-g-EtAbu-MeSer-Hyp(Et)-Ile-MePhe(3-Cl)-Ser-Trp-Trp-Pro-MeGly-Asp-pipのN末端アミノ基とAsp側鎖カルボン酸とでアミド結合を形成した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.8(M+H)+
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
目的物のN→O-アシルシフト体(目的物の2つのヒドロキシル基のうち、いずれかもしくは両方でN→O-アシルシフトが進行した化合物)
LCMS(ESI)m/z=1473.8(M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
目的物の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1569.8(M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
目的物の2つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1665.7(M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDFA05)
目的物のN→O-アシルシフト体の1つのヒドロキシル基がTFAエステル化した化合物
LCMS(ESI)m/z=1569.8(M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
N末端のアミノ基とアスパラギン酸の側鎖カルボン酸基とでアミド環化したペプチド群の合成
C末端がアミド化(ピペリジン、4-(tert-ブチル)ピペリジン、N-メチルオクタン-1-アミンのいずれかにてアミド化)されているか、もしくはC末端にプロリンが結合しているアスパラギン酸の側鎖のカルボン酸基と、N末端の主鎖アミノ基とがアミド結合により環化したペプチド群を合成した。
配列中にTyr(3-F,tBu)を含む場合には、既に記載の方法にて調製した0.1 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を2 mL加え、残渣を溶解させた後、室温もしくは30度にて24時間静置した。配列中にTyr(3-F)を含まない場合には、既に記載の方法にて調製した0.05 M 硫酸水素テトラメチルアンモニウム/ HFIP溶液(2% TIPS)を4 mL加え、残渣を溶解させた後、室温にて4時間静置した。一定時間静置した後、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、70 μL)を加え、減圧下溶媒を留去した。
液相法での伸長反応を含む合成を以下に示す。
液相でのFmoc-Ala-OSu(化合物152)とH-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(化合物151)とのカップリングを含む、環状ペプチド(化合物154、H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis-MeGly-Pro-Asp-Pro-OHの主鎖N末端のアミノ基とAspの側鎖カルボン酸基との間でアミド結合を形成した環状ペプチド)の合成
液相法での伸長反応を含む図21に記載の合成ルートにて、ペプチドの合成を行った。
H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(化合物151)の合成
続いてDCMにてレジンを再膨潤させた後、レジンにTFE/DCM (1/1, v/v, 4 mL)とジイソプロピルエチルアミン(24 μL)を加えて室温にて2時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。続いてチューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、残ったレジンをさらにTFE/DCM (1/1, v/v, 2 mL)にて2回洗浄した。得られた全ての切り出し溶液を混合し、減圧下濃縮して、標題の化合物(化合物151、H-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis、113.8 mg)を得た。精製は行わずに次の工程に用いた。
LCMS(ESI)m/z=1860.9(M+H)+
保持時間:0.72分(分析条件SQDFA05)
2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸 (S)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル(化合物152、Fmoc-Ala-OSu)の合成
LCMS(ESI)m/z=409.3(M+H)+
保持時間:0.80分(分析条件SQDFA05)
2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)プロパン酸 (S)-2,5-ジオキソピロリジン-1-イル(化合物152、Fmoc-Ala-OSu)とH-Trp-Nle-Trp-Ser(THP)-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis(Trt)-MeGly-Pro-Asp-Pro-OPis(化合物151)とのカップリングと、続く脱Fmoc反応
LCMS(ESI)m/z=1931.8(M+H)+
保持時間:0.73分(分析条件SQDFA05)
H-Ala-Trp-Nle-Trp-Ser-nPrGly-MePhe(3-Cl)-MeHis-MeGly-Pro-Asp-Pro-OHのN末端アミノ基とAsp側鎖のカルボン酸基とがアミド環化した化合物(化合物154)の合成(化合物153の環化反応と、続く脱保護反応)
LCMS(ESI)m/z=1469.7(M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
Claims (14)
- 以下の工程:
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)工程1)で準備されたFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを固相に担持する工程、
3)固相に担持されたFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
4)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程、及び、
5)工程4)で得られたペプチドを、フルオロアルコールを含む、弱酸溶液を用いる条件下で固相から切り出す工程、
を含む、少なくとも1つのN-置換アミノ酸又はN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法であって、
前記工程4)で得られたペプチドを構成するアミノ酸又はアミノ酸類縁体の少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されず、かつ酸で脱保護される保護基で保護されており、前記工程5)の後で、水中でのpKaの値が1~5である弱酸とフルオロアルコールを含む、弱酸溶液を用いる条件下で、該保護基を脱保護する工程をさらに含む、製造方法。 - 以下の工程:
1)以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸(Fmoc保護アミノ酸)、以下のi)及びii)の官能基をそれぞれ少なくとも1つ有するアミノ酸類縁体(Fmoc保護アミノ酸類縁体)、又は、該Fmoc保護アミノ酸及び該Fmoc保護アミノ酸類縁体の両方又はいずれか一方を含むペプチド(Fmoc保護ペプチド)を準備する工程;
i)Fmoc骨格を有する少なくとも1つの保護基により保護されている主鎖のアミノ基、
ii)遊離の又は活性エステル化された少なくとも1つのカルボン酸基、
2)Fmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護し、アミノ基を露出する工程、
3)新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程であって、この工程で得られるペプチドを構成するアミノ酸またはアミノ酸類縁体の少なくとも1つの側鎖が、塩基性条件下では脱保護されず水中でのpKaの値が1~5である弱酸とフルオロアルコールを含む、弱酸溶液を用いる条件下で脱保護される保護基を有する工程、及び、
4)前記側鎖の保護基を、水中でのpKaの値が1~5である弱酸とフルオロアルコールを含む、弱酸溶液を用いる条件下で脱保護する工程、
を含む、少なくとも1つのN-置換アミノ酸又はN-置換アミノ酸類縁体を含むペプチドの製造方法。 - ペプチドの製造が固相法によって行われる、請求項2に記載の製造方法。
- 前記工程3)で得られたペプチドを、前記工程4)の前又は後でフルオロアルコールを含む、弱酸溶液を用いる条件下で固相から切り出す工程をさらに含む、請求項3に記載の製造方法。
- ペプチドの製造が液相法によって行われる、請求項2に記載の製造方法。
- 請求項1の工程4)又は請求項2の工程3)が、
新たに添加したFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドのFmoc骨格を有する保護基を塩基で脱保護してアミノ基を露出する工程、および
更に新たなFmoc保護アミノ酸、Fmoc保護アミノ酸類縁体又はFmoc保護ペプチドを添加して、アミド結合を形成する工程をさらに含み、
これらの工程を1回または複数回繰り返す、請求項1から5のいずれかに記載の製造方法。 - 製造されたペプチドが、1つの反応点を有するアミノ酸残基又はアミノ酸類縁体残基をC末端側に含み、かつもう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体をN末端側に含む、請求項1から6のいずれかに記載の製造方法。
- 前記1つの反応点と前記もう一つの反応点とを結合させ、前記ペプチドを環化させる工程をさらに含む、請求項7に記載の製造方法。
- 前記もう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がN末端にあり、かつ前記結合がアミド結合である、請求項8に記載の製造方法。
- 前記もう1つの反応点を有するアミノ酸残基、アミノ酸類縁体残基又はカルボン酸類縁体がN末端にあり、かつ前記結合が炭素-炭素結合である、請求項8に記載の製造方法。
- フルオロアルコールがTFE又はHFIPである、請求項1から10のいずれかに記載の製造方法。
- 側鎖の保護基が、pH1からpH7の範囲で脱保護される保護基であるか、又は10%以下のTFAにおいて脱保護される保護基である、請求項1から11のいずれかに記載の製造方法。
- 側鎖の保護基が以下のa)~d)から選択される、請求項1から12のいずれかに記載の製造方法:
a)側鎖の保護基がSer、Thr、Hyp、及び、それらの誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格基、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、シリル骨格及びBoc骨格から選ばれるいずれかの保護基;
b)側鎖の保護基がTyr及びその誘導体の側鎖のヒドロキシル基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、シリル骨格、Boc骨格及びtBu骨格から選ばれるいずれかの保護基;
c)前記側鎖の保護基がHis及びその誘導体の側鎖のイミダゾール環の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格及びTrt骨格から選ばれるいずれかの保護基;
d)前記側鎖の保護基がAsp、Glu、及び、それらの誘導体の側鎖のカルボン酸基の保護基である場合、以下の一般式で表わされるMOM骨格、Bn骨格、Dpm骨格、Trt骨格、tBu骨格、フェニル-EDOTn骨格及び保護をするカルボン酸基の炭素原子を3つのアルコキシ基が置換した骨格に変換したオルトエステル骨格から選ばれるいずれかの保護基;
<MOM骨格を有する保護基>
(式中、
R1はHであり、R2はHであり、かつXはメチル、ベンジル、4-メトキシベンジル、2,4-ジメトキシベンジル、3,4-ジメトキシベンジル、または2-トリメチルシリルエチルであるか、
R1はメチルであり、R2はHであり、かつXはエチルであるか、
R1、R2、R3は、いずれもメチルであるか、または
R1とXは、一緒になって-CH2-CH2-CH2-または-CH2-CH2-CH2-CH2-を形成し、かつR2はHであり
ここで、R1、R2、およびXのいずれかがメチルまたはエチルである場合、これらの基はさらにアルキル、ベンジル、またはアリールで置換されていてもよい。)
<Bn骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR6およびR7はアルキルであるか、
R1、R2、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、R3はメトキシであり、かつR6およびR7はHであるか、
R1およびR3がメトキシであり、R2、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR6およびR7はHであるか、または
R1、R4、およびR5は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、またはハロゲンであり、かつR2とR3は一緒になって-O-CH2-O-を形成する。)
<Dpm骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R10は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
R1~R4およびR7~R10は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR5およびR6は一緒になって-O-または-CH2-CH2-を形成する。)
<Trt骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、
R1、R2、およびR4~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR3は、メチルまたはメトキシであるか、
R1はClであり、かつR2~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであるか、または
R1~R4、およびR7~R15は、それぞれ独立してH、アルキル、アリール、アルコキシ、またはハロゲンであり、かつR5とR6は一緒になって-O-を形成する。)
<シリル骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R3は、それぞれ独立してアルキル、またはアリールである。)
<Boc骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R9は、それぞれ独立してH、アルキル、またはアリールである。)
<tBu骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R9は、それぞれ独立してH、アルキル、またはアリールである。)
<フェニル-EDOTn骨格を有する保護基>
(式中、
R1~R3は、それぞれ独立して、H、またはメトキシである)。 - 固相が、トリチルクロリド樹脂(Trt樹脂)、2-クロロトリチルクロリド樹脂(Clt樹脂)、4-メチルトリチルクロリド樹脂(Mtt樹脂)、4-メトキシトリチルクロリド樹脂(Mmt樹脂)からなる群より選択される樹脂を含有する、請求項1から13のいずれかに記載の製造方法。
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