WO2023214577A1 - ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法 - Google Patents

ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023214577A1
WO2023214577A1 PCT/JP2023/017114 JP2023017114W WO2023214577A1 WO 2023214577 A1 WO2023214577 A1 WO 2023214577A1 JP 2023017114 W JP2023017114 W JP 2023017114W WO 2023214577 A1 WO2023214577 A1 WO 2023214577A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
solvent
compound
fmoc
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/017114
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
未来 陰
実 田宮
純一朗 金澤
研一 野村
Original Assignee
中外製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中外製薬株式会社 filed Critical 中外製薬株式会社
Publication of WO2023214577A1 publication Critical patent/WO2023214577A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for synthesizing peptides that can be synthesized with high purity and high efficiency.
  • the Fmoc method is widely applied in peptide synthesis due to its reliability and mild deprotection conditions (de-Fmoc conditions). Furthermore, in recent years, the application of peptides containing a large amount of N-alkylamino acids such as N-methylamino acids to pharmaceuticals has been actively researched, but the acid instability of such molecular species is known (non-patent literature 1, Patent Document 1). Therefore, in these documents, instead of the Boc method, which requires acidic conditions for N-terminal deprotection, the Fmoc method, which allows deprotection under basic conditions, is adopted.
  • Diketopiperazine (DKP) formation in peptide synthesis is a long-recognized problem. Diketopiperazine formation can occur when the N-terminal protecting group of a dipeptide supported on a solid phase via an ester bond is removed, exposing a free amino group.
  • Diketopiperazine formation can occur when the N-terminal protecting group of a dipeptide supported on a solid phase via an ester bond is removed, exposing a free amino group.
  • Non-Patent Document 2 a method of suppressing diketopiperazine formation by using an Alloc group, which undergoes a deprotection reaction under neutral conditions, without using a base, as a protecting group at a site where diketopiperazine formation is likely to occur.
  • Non-patent Document 3 a method is employed in which a dipeptide containing such a sequence is synthesized in advance and the peptide chain is extended using it. is known (Non-patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 A method of suppressing ketopiperazine formation is known (Non-Patent Document 4).
  • dipeptides supported on a solid phase through ester bonds are known to form diketopiperazines when the ester bonds are cleaved, while N-substituted amino acids in the peptide sequence , the amide bond, which is stronger than the ester bond, is cleaved to form a diketopiperazine, and the dipeptide containing the N-substituted amino acid may be eliminated from the peptide sequence. It has been found that this shedding can occur anywhere in the peptide sequence where an N-substituted amino acid is present, and is therefore not limited to dipeptides supported on a solid phase.
  • the present inventors found that when an N-substituted amino acid is included in the peptide sequence, in addition to the problem of diketopiperazine formation, the desired elongation reaction does not proceed and the N-terminus is substituted with 6 It was revealed that there is a problem in that an impurity having a membered cyclic amidine skeleton (6-membered cyclic amidine skeleton structure) is formed. No methods to solve these problems have been reported so far.
  • Non-Patent Document 2 requires Alloc amino acids, which are less common than Fmoc amino acids in terms of availability. Furthermore, in the method for elongating a peptide chain using a dipeptide described in Non-Patent Document 3, there is a concern that racemization of amino acids at the C-terminal side of the dipeptide may progress. Therefore, the method described in this document should be applied except in cases where the C-terminal amino acid of the dipeptide fragment is achiral (e.g., glycine) or where racemization is difficult to proceed (e.g., proline). That's difficult.
  • achiral e.g., glycine
  • Non-Patent Document 4 is characterized in that the time required for the Fmoc removal process is very short, and the Fmoc removal process and solid phase washing are performed within 1 minute, for example, 10 to 20 seconds. Requires operation. It is impossible to apply such extremely short-term operations to scale-up synthesis including industrialization.
  • the present invention provides a peptide synthesis method capable of suppressing the formation of diketopiperazine, comprising: (i) Fmoc as an N-terminal protecting group; It is an object of the present invention to provide a method that uses a protecting group containing a skeleton, (ii) has no sequence restrictions from the viewpoint of racemization, and (iii) allows scale-up synthesis such as industrialization.
  • an object of the present invention is to provide a peptide synthesis method capable of suppressing the formation of a 6-membered cyclic amidine skeleton structure. Furthermore, in one aspect, an object of the present invention is to provide a peptide synthesis method capable of suppressing the formation of dimeric urea bodies.
  • the present inventors treated a peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton with a base whose pKa of the conjugate acid in acetonitrile is 23 or higher in a specific solvent, and then By reacting with the peptide an elongating active species such as active ester generated using chloride or a condensing agent, diketopiperazine and 6-membered cyclic amidine skeleton structures can be produced, from removal of the protecting group to elongation of the peptide chain. , and/or that the formation of dimeric urea bodies can be suppressed, leading to the completion of the present invention.
  • an elongating active species such as active ester generated using chloride or a condensing agent
  • a method for producing a peptide comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton; (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent. a step of treating with; and (3) After the step (2), the first peptide and the carboxylic acid or carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the manufacturing method includes the step of obtaining.
  • a method for reducing the amount of diketopiperazine impurities and/or 6-membered cyclic amidine skeleton structure impurities produced in the production of peptides comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton; and (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent.
  • a method for reducing the amount of at least one impurity selected from the group consisting of diketopiperazine impurities, 6-membered cyclic amidine skeleton impurities, and dimeric urea impurities in the production of peptides hand, (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton; and (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent.
  • a method for producing a peptide by a solid phase method comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase; (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent.
  • the manufacturing method includes the step of obtaining.
  • a method for reducing the amount of diketopiperazine impurities and/or 6-membered cyclic amidine skeleton structure impurities produced in the production of peptides by solid phase method comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase; and (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent.
  • the first peptide and the carboxylic acid or carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the step (2) is a step of removing the protecting group containing the Fmoc skeleton in the first peptide, and/or the protecting group containing the Fmoc skeleton in the first peptide is removed in the form of a carbamate.
  • the solvent in step (2) has a solid-phase resin swelling capacity of 1.5 mL/g or more, 2.0 mL/g or more, 2.5 mL/g or more, 3.0 mL/g or more, 3.5 mL/g or more, or the method described in any one of [0-1] to [7], where the solvent is 4.0 mL/g or more.
  • the carbamate is a salt of the conjugate acid with a base whose pKa in acetonitrile is 23 or more.
  • step (2) The method according to [9] or [10], wherein the carbamate is a salt with at least one base selected from the group consisting of amidines, guanidines, and phosphazenes.
  • step (2) The carbamate according to any one of [9] to [11], wherein the carbamate is a DBU salt, a TMG salt, a HP1 (dma) salt, an MTBD salt, a P1-tBu salt, or a P2-Et salt.
  • the molar ratio of the carbamate to the amine formed by further decarboxylation is 0.6 or more, 0.8 or more, 1.
  • the molar ratio of the carbamate to the amine formed by further decarboxylation (carbamate/amine) determined from the proton integral ratio of 1 H-NMR is 0.6 or more, 0.8 or more, 1.0 or more, 2.0 or more, 3.0 or more, 4.0 or more, 4.6 or more, 5.0 or more, 6.0 or more, 8.0 or 10.0 or more, the method according to any one of [9] to [12].
  • the solvent in step (2) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, a phosphate ester solvent, an amide solvent, The method according to any one of [0-1] to [16], further comprising one or more selected from urea-based solvents and sulfone-based solvents. [18] Any one of [0-1] to [16], wherein the solvent in step (2) further contains one or more selected from amide solvents, urea solvents, and sulfone solvents. The method described in. [19] The method according to any one of [0-1] to [13], wherein the solvent in the step (2) comprises a sulfoxide solvent.
  • sulfoxide solvent is one or more selected from the group consisting of DMSO, diethyl sulfoxide, methyl ethyl sulfoxide, and methyl phenyl sulfoxide. Method described. [21] The method according to any one of [0-1] to [19], wherein the sulfoxide solvent is DMSO. [22] The method according to any one of [0-1] to [21], wherein the base in step (2) is at least one selected from the group consisting of amidines, guanidines, and phosphazenes. .
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is an amino acid having a protecting group, a second peptide having a protecting group, a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an amino acid with a protecting group, a second peptide with a protecting group, an active ester of a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an amino acid with a protecting group, a protecting group a second peptide having a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or an acid halide of a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, wherein the C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid and the C 6 -C 10 aryl carboxylic acid is independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, aryl,
  • the protecting group is a carbamate-based protecting group, a sulfonyl-based protecting group, or an acyl-based protecting group.
  • the carbamate-based protecting group is a protecting group containing an Fmoc skeleton, Alloc, Teoc, Boc, or Cbz
  • the sulfonyl-based protecting group is Ns
  • the acyl-based protecting group is Tfa
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof, and the C 1 - C 8 alkyl carboxylic acids and C 6 -C 10 aryl carboxylic acids may be substituted with one or more substituents independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, and halogen. Good, the method described in [37].
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog may be substituted with one or more substituents independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, and halogen .
  • the method according to [37], wherein the carboxylic acid or carboxylic acid analog is a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is an amino acid or a second peptide that has a protecting group, or an active ester of an amino acid or a second peptide that has a protecting group, or has a protecting group.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is an amino acid or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton, or an active ester of an amino acid or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton.
  • the condensing agent in step (3) is in the form of a salt, the counter anion of which is PF 6 - or BF 4 - , or a carbodiimide condensing agent, [0-1], [ The method described in any of 0-4] to [0-6] and [3] to [50].
  • the condensing agent in step (3) is in the form of a salt, and its counter anion is PF 6 - or BF 4 - , [0-1], [0-4] to [0-6] and the method described in any one of [3] to [51].
  • the condensing agent in step (3) is at least one selected from the group consisting of PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, and TOTU.
  • the condensing agent in step (3) is PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, or TOTU, [52] or [53] The method described in.
  • step (3) The method according to any one of [0-1], [0-4] to [0-6], and [3] to [54], wherein the step (3) is carried out in the presence of a base.
  • the step (3) is carried out in the presence of a base whose pKa of the conjugate acid in water is 5 to 12, [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] ] to [55].
  • the base in step (3) is DIPEA.
  • condensing agent in step (3) is a carbodiimide condensing agent. the method of.
  • the carbodiimide condensing agent is diisopropylcarbodiimide (DIC), di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide (tBEC), di-tert-butylcarbodiimide (DtBC), and The method according to [58], which is at least one selected from the group consisting of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC).
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • DsBC di-sec-butylcarbodiimide
  • tBEC 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide
  • DtBC di-tert-butylcarbodiimide
  • EDC 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide
  • the protecting group containing the Fmoc skeleton is Fmoc group, Fmoc(2,7tb) group, Fmoc(1Me) group, Fmoc(2F) group, Fmoc(2,7Br) group, mio-Fmoc group, dio-Fmoc group group, tdf-Fmoc group, Fmoc(2TMS) group, Fmoc(2so3h) group, sm-Fmoc group, or rm-Fmoc group, the method according to [64]. [66] The method according to [65], wherein the protecting group containing an Fmoc skeleton is an Fmoc group.
  • [67] [0-1], [0-3] to [0] further comprising a step (treatment step) of treating the mixture in step (2) between the step (2) and the step (3). -6] and the method described in any of [3] to [66].
  • [67-1] The method according to [67], wherein the treatment step is a step of contacting the mixture with an acid or a salt.
  • [67-2] The method according to [67], wherein the treatment step is a step of adding a solution of a sulfoxide solvent containing an acid or a salt to the mixture.
  • [67-3] The method according to [67], wherein the treatment step is a step of adding a DMSO solution containing an acid or a salt to the mixture.
  • a DMSO solution containing at least one base selected from the group consisting of DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, and 2,4,6-trimethylpyridine, [ 68-4] and [68-5].
  • one or more washings include a step of washing with a solution of a sulfoxide solvent containing an acid or a salt, according to any one of [68] to [68-7]. the method of.
  • one or more washings include a step of washing with a solution of a sulfoxide solvent containing an acid and a base, according to any one of [68] to [68-7]. the method of. [68-10] The method according to any one of [68] to [68-7], which includes a step of washing with a DMSO solution containing an acid and a base in one or more washings in the washing step. [68-11] The method according to any one of [68-8] to [68-11], wherein the one or more times of washing in the washing step is one time of washing.
  • the salt is an acid selected from the group consisting of HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, and hydrochloric acid, and DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine , and pyridine, the method according to any one of [67-1] to [68-3] and [68-8] to [68-11].
  • [69-3] The method according to any one of [67-1] to [68-3] and [68-8] to [68-11], wherein the salt is pyridine hydrochloride.
  • the base is at least one selected from the group consisting of DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine, and pyridine, [68-9] or [68-9] 68-10].
  • the washing step comprises: i) washing the resin for solid phase synthesis using a solvent that has been contacted with CO 2 in advance; and/or ii) a step of washing the resin for solid phase synthesis using a solvent that has not been brought into contact with CO 2 in advance;
  • the washing step comprises: i) washing the solid phase synthesis resin with a solvent in which CO 2 has been bubbled in advance; and/or ii) a step of washing the resin for solid phase synthesis using a solvent in which CO 2 is not bubbled in advance;
  • the solvent in step (3) is the same as the solvent in step (2), [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [71
  • the solvent in the step (3) is a solvent in which the condensing agent can be dissolved, [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [72] Any method described.
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent. [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [73] containing at least one selected from the group consisting of solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents The method described in any of the above.
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent. [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] containing 50v/v% or more of at least one selected from the group consisting of solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents ] to [73].
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent. [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] containing 70v/v% or more of at least one selected from the group consisting of solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents ] to [73].
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent. [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] containing 90v/v% or more of at least one selected from the group consisting of solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents ] to [73].
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent. [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [77], consisting of at least one selected from the group consisting of solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents The method described in any of the above.
  • the solvent in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent.
  • the aromatic hydrocarbon solvent is one or more selected from the group consisting of benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, and cumene.
  • the halogenated solvent is one or more selected from the group consisting of dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, and carbon tetrachloride
  • the ether solvent may be diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, cyclopentylmethyl ether, 4-methyltetrahydropyran, 1,3-dioxolane, 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane, diisopropyl ether, t- one or more selected from the group consisting of butyl methyl ether, diglyme, triglyme, and tetraglyme
  • the amide solvent is one or more selected from the group consisting of DMF, NMP, DMA, NEP, NBP, and formamide
  • the sulfoxide solvent is one or more selected from the group consisting of DMSO and methylphenylsulfoxide
  • the sulfone solvent
  • the ketone solvent is one or more selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, diethyl ketone, and cyclopentanone
  • the carbonate solvent is one or more selected from the group consisting of dimethyl carbonate, diethyl carbonate, and dibutyl carbonate
  • the carboxylic acid used in the step (3) is an amino acid or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton, and the protecting group containing an Fmoc skeleton possessed by the amino acid or the second peptide is [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [ 80].
  • the carboxylic acid analog used in step (3) is an amino acid having a protecting group, a second peptide having a protecting group, a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid a carboxyl group of an amino acid having a protecting group containing the Fmoc skeleton, a carboxyl group at the C-terminus of a second peptide having a protecting group containing the Fmoc skeleton, and the C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid. or the carboxyl group of a C 6 -C 10 arylcarboxylic acid is converted to an acid halide group, [0-1], [0-4] to [0-6] and [3] to [ 81].
  • [1] to [82] are methods for producing peptides using a solid phase method, but these methods can also be applied to methods for producing peptides using a liquid phase method. That is, one aspect of the present invention provides the following [83] to [84-1]. [83] to [84-1] may include features of [3] to [82] other than those unique to the solid-phase production method.
  • a method for producing a peptide by a liquid phase method comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton; (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent. a step of treating with; and (3) After the step (2), the first peptide and the carboxylic acid or carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the manufacturing method includes the step of obtaining.
  • a method for reducing the amount of diketopiperazine impurities and/or 6-membered cyclic amidine skeleton structure impurities produced in the production of peptides by a liquid phase method comprising: (1) providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase; and (2) After the step (1), the first peptide is mixed with one or more bases including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile in a solvent containing a sulfoxide solvent.
  • [84-1] Reducing the production amount of at least one impurity selected from the group consisting of diketopiperazine impurities, 6-membered cyclic amidine skeleton structure impurities, and dimeric urea impurities in the production of peptides by liquid phase method
  • peptide synthesis when peptide synthesis includes an amino acid sequence in which the desired elongation reaction does not proceed sufficiently under conventional conditions due to the formation of diketopiperazine and/or the formation of a 6-membered cyclic amidine skeleton structure, Since the formation of such impurities can be significantly reduced even when the peptide chain is present, it is possible to efficiently elongate the peptide chain and obtain a peptide having the desired amino acid sequence.
  • the method of the present invention does not require the use of special protecting groups such as Alloc, which is less common, and there are no restrictions on reaction operations such as extremely short reaction times, so it is highly versatile and can be scaled up. This can be a practical synthesis method.
  • Figure 1 shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene in Fmoc-Phe-NMe 2 (compound 1-4-1) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • the 1 H-NMR spectrum between 3.6 and 6.8 ppm is shown before and after the action of (DBU), and the compounds 1-4-1, 1-4-2, and 1-4-2 observed in this range are shown.
  • 1-4-3a a diagram showing the characteristic 1 H signal of dibenzofulvene.
  • a) shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU ) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a solution obtained by the action of
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • 1, b) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a solution of compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • Figure 2 shows the reaction of compound 1-4-1 with 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • the 1 H-NMR spectrum near 5.4-3.5 ppm shows that compound 1-4-2 and compound 1-4-3a produced by It is a diagram.
  • a)-1 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • a)-2 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU is a diagram showing a 1D-ROESY spectrum obtained by selectively exciting a 4.82 ppm 1 H signal of a solution obtained by the action of (DBU).
  • a)-3 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • (DBU) is a diagram showing a 1D-ROESY spectrum obtained by selectively exciting the 1 H signal at 3.95 ppm of a solution obtained by the action of (DBU).
  • b) shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU ) is a 1 H-NMR spectrum showing the integral ratio of the 4.85 ppm 1 H signal and the 3.95 ppm 1 H signal of the solution obtained.
  • Figure 3 shows the reaction of compound 1-4-1 with 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DMF-d7 N,N-dimethylformamide-d7
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum around 5.2-3.5 ppm, indicating that Compound 1-4-2 was produced.
  • a)-1 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a sample of compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • a)-2 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU DBU
  • a)-3 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU and further adding 3 ⁇ L of a standard compound of compound 1-4-2 to obtain a solution obtained by selectively exciting the 1 H signal at 4.84 ppm.
  • a)-5 is 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • b) shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) for compound 1-4-1 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • FIG. 2 is a diagram showing 1 H-NMR and 1D-NOESY spectra around 5.1-3.7 ppm, indicating that Compound 1-4-3a was produced by the action of 7-undecene (DBU).
  • DBU 7-undecene
  • a) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a standard sample of compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • b) is the 1 H-NMR spectrum of the solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute into the N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-4-2.
  • FIG. 4 c) shows 4.77 ppm of the solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute into the N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-4-2.
  • FIG. 2 is a diagram showing a 1D-NOESY spectrum obtained by selectively exciting the H signal.
  • FIG. 4 shows 3.96 ppm of 1 H of the solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute into the N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-4-2.
  • FIG. 2 is a diagram showing a 1D-NOESY spectrum obtained by selectively exciting signals.
  • e) shows that after bubbling 13 CO 2 into the N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-4-2 for 1 minute, 1,8-diazabicyclo[5.4 0]-7-undecene (DBU).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4 0]-7-undecene
  • FIG. 4 is a diagram of a 1 H-NMR spectrum showing the integral ratio of a 1 H signal at 3.96 ppm.
  • e) shows that after bubbling 13 CO 2 into the N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-4-2 for 1 minute, 1,8-diazabicyclo[5.4 0]-7-Undecene (DBU) is an enlarged view of the 1 H signal at 4.83 ppm in the 1 H-NMR spectrum of the solution obtained.
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4 0]-7-Undecene
  • FIG. 2 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum around 164-124 ppm, showing that Compound 1-4-3a was produced by the action of 7-undecene (DBU).
  • DBU 7-undecene
  • a) shows a 13 C-NMR spectrum of a solution obtained by bubbling 13 CO 2 to compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a diagram.
  • FIG. 1 shows that after bubbling 13 CO 2 to compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-
  • FIG. 2 is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum around 164-124 ppm, showing that Compound 1-4-3a was produced by the action of 7-undecene (DBU).
  • DBU 7-undecene
  • FIG. 5 shows that 1,8 - diazabicyclo [5. 4.0]-7-Undecene ( DBU ).
  • Figure 6 shows the reaction of compound 1-4-1 with 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum around 6.9-3.6 ppm, indicating the presence of compound 1-4-3a in the solution obtained by the above steps (solution B, SolB).
  • solution B solution B, SolB
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • solution B solution obtained by the action of 1 H-NMR.
  • FIG. 6, b) shows the relationship between compound 1-4-1 and 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • DMF-d7 N,N-dimethylformamide-d7
  • DMF-d7 N,N-dimethylformamide-d7
  • DMF-d7 N,N-dimethylformamide-d7
  • DBU 1,8 -Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • solution A a solution obtained by mixing the solution obtained.
  • c) shows that 1,8 - diazabicyclo [5.4 0]-7-undecene (DBU) ( solution A).
  • Figure 7 shows the reaction of compound 1-4-1 with 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • FIG. 7 a) shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU ) and a solution of compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). After bubbling 13 CO 2 for 1 minute, 1,8 -Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) is added to the solution obtained by mixing the solution (solution A).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • 1,8 -Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene is added to the solution obtained by mixing the solution (solution A).
  • c) shows 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU ) and a solution of compound 1-4-2 in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8 -Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • DBU 1,8 -Diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • Figure 8 shows the reaction of compound 1-4-1 with 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). After bubbling 13 CO 2 for 1 minute to the solution (solution B) obtained by .4.0] 1 H, 13 C, 15 of the carbamate moiety of compound 1-4-3a present in the solution obtained by mixing the solution obtained by reacting with -7-undecene (DBU) (solution A) It is a figure showing that all N signals were identified.
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • halogen atom examples include F, Cl, Br, or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and has a heteroatom (atom other than carbon and hydrogen atoms) in the skeleton. ) or a group having a subset of a hydrocarbyl or hydrocarbon group structure that does not contain unsaturated carbon-carbon bonds and contains hydrogen and carbon atoms.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched ones.
  • the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1 -C 20 , hereinafter "C p -C q " means the number of carbon atoms is p to q), Preferably C 1 -C 10 alkyl, more preferably C 1 -C 6 alkyl.
  • alkyl examples include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, s-pentyl (1- methylbutyl), t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP 2 carbon atoms). Depending on the configuration of the double bond and substituents (if present), the geometry of the double bond can be Entadel (E) or Caribbean (Z), cis or trans configuration.
  • Alkenyl includes not only straight chain but also branched alkenyl.
  • alkenyl includes C 2 -C 10 alkenyl, more preferably C 2 -C 6 alkenyl, and specifically, for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl. (including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl, and the like.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms). Alkynyl includes not only straight chain but also branched chain. Alkynyl is preferably C 2 -C 10 alkynyl, more preferably C 2 -C 6 alkynyl, and specifically, for example, ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • Cycloalkyl preferably includes C 3 -C 8 cycloalkyl, specifically, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo[2.2.1]heptyl, spiro[ 3.3] heptyl and the like.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, and preferably includes C 6 -C 10 aryl. Specific examples of aryl include phenyl, naphthyl (eg, 1-naphthyl, 2-naphthyl), and the like.
  • heterocyclyl means a non-aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to carbon atoms. Heterocyclyl may have double and/or triple bonds in the ring, carbon atoms in the ring may be oxidized to form carbonyl, and may be a single ring or a fused ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 4 to 10 (4 to 10 membered heterocyclyl), more preferably 4 to 7 (4 to 7 membered heterocyclyl).
  • heterocyclyl examples include azetidinyl, oxiranyl, oxetanyl, azetidinyl, dihydrofuryl, tetrahydrofuryl, dihydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridyl, tetrahydropyrimidyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, Pyrazolidinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, oxazolidinyl, isoxazolidinyl, thiazolidinyl, isothiazolidinyl, 1,2-thiazinane, thiadiazolidinyl, azetidinyl, oxazolidone, benzodioxanyl, benzoxazolyl, dioxolanyl, dioxanyl, Tetrahydro
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to carbon atoms.
  • the ring may be a monocyclic ring, a fused ring with another ring, or a partially saturated ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10 membered heteroaryl), more preferably 5 to 7 (5 to 7 membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridazinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl.
  • benzothiadiazolyl benzothiazolyl
  • benzoxazolyl benzoxadiazolyl
  • benzimidazolyl indolyl, isoindolyl, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodioxolyl, indolizinyl, imidazopyridyl, and the like.
  • alkoxy means an oxy group to which "alkyl” as defined above is bonded, and preferably C 1 -C 6 alkoxy is mentioned. Specific examples of alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, and 3-methylbutoxy.
  • alkenyloxy means an oxy group to which "alkenyl” as defined above is bonded, and preferably includes C 2 -C 6 alkenyloxy.
  • alkenyloxy include vinyloxy, allyloxy, 1-propenyloxy, 2-propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy (including cis and trans), 3-butenyloxy, pentenyloxy, and hexenyloxy.
  • cycloalkoxy means an oxy group to which "cycloalkyl” as defined above is bonded, and preferably C 3 -C 8 cycloalkoxy is mentioned. Specific examples of cycloalkoxy include cyclopropoxy, cyclobutoxy, and cyclopentyloxy.
  • aryloxy means an oxy group to which "aryl” as defined above is bonded, and preferably includes C 6 -C 10 aryloxy. Specific examples of aryloxy include phenoxy, 1-naphthyloxy, and 2-naphthyloxy.
  • heteroaryloxy means an oxy group to which "heteroaryl” as defined above is bonded, and preferably includes 5- to 10-membered heteroaryloxy.
  • amino means -NH2 in a narrow sense and -NRR' in a broad sense, where R and R' are independently hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R' together with the nitrogen atom to which they are attached form a ring.
  • R and R' are independently hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R' together with the nitrogen atom to which they are attached form a ring.
  • Preferred examples of amino include -NH 2 , mono-C 1 -C 6 alkylamino, di-C 1 -C 6 alkylamino, and 4- to 8-membered cyclic amino.
  • monoalkylamino means a group in which R is hydrogen and R' is “alkyl” as defined above in “amino” defined above, and preferably mono-C 1 -C 6 alkylamino.
  • monoalkylamino include methylamino, ethylamino, n-propylamino, i-propylamino, n-butylamino, s-butylamino, and t-butylamino.
  • dialkylamino as used herein means a group in which R and R' are independently “alkyl” as defined above in “amino” defined above, preferably di-C 1 -C 6 Alkylamino is mentioned. Specific examples of dialkylamino include dimethylamino and diethylamino.
  • cyclic amino refers to a group in which R and R' form a ring together with the nitrogen atom to which they are bonded, preferably in the "amino" defined above.
  • examples include 4- to 8-membered cyclic aminos.
  • Specific examples of the cyclic amino include 1-azetidyl, 1-pyrrolidyl, 1-piperidyl, 1-piperazyl, 4-morpholinyl, 3-oxazolidyl, 1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl, 3 -oxa-8-azabicyclo[3.2.1]octan-8-yl and the like.
  • Haloalkyl as used herein means a group in which one or more hydrogen atoms of "alkyl” defined above are substituted with halogen, preferably C 1 -C 8 haloalkyl, and C 1 -C 6 haloalkyl. is more preferable.
  • Haloalkyl as used herein means a group in which one or more hydrogen atoms of "alkyl” defined above are substituted with fluorine atoms, and C 1 -C 8 fluoroalkyl is preferred.
  • Specific examples of haloalkyl include monofluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2,2-difluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 3,3-difluoropropyl, 4,4-difluorobutyl , 5,5-difluoropentyl, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl, and the like.
  • aralkyl (arylalkyl) means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” as defined above is substituted with “aryl” as defined above, and C 7 -C 14 aralkyl is preferable. , C 7 -C 10 aralkyl are more preferred. Specific examples of aralkyl include benzyl, phenethyl, and 3-phenylpropyl.
  • aralkyloxy means an oxy group to which "aralkyl” as defined above is bonded, preferably C 7 -C 14 aralkyloxy, more preferably C 7 -C 10 aralkyloxy.
  • Specific examples of aralkyloxy include benzyloxy, phenethyloxy, and 3-phenylpropoxy.
  • peptide chain refers to a peptide chain in which one or more natural amino acids and/or unnatural amino acids are linked via an amide bond and/or an ester bond.
  • the peptide chain is preferably a peptide chain containing 1 to 15 amino acid residues, more preferably 5 to 12 amino acid residues.
  • the "peptide compound” in the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide compound in which natural amino acids and/or unnatural amino acids are linked by an amide bond or an ester bond, but preferably 5 to 30 residues, more preferably 8 to 30 residues. A peptide compound having 15 residues, more preferably 9 to 13 residues.
  • the peptide compound synthesized in the present invention preferably contains at least three N-substituted amino acids in one peptide, and more preferably contains at least five or more N-substituted amino acids. These N-substituted amino acids may be present continuously or discontinuously in the peptide compound.
  • the peptide compound in the present invention may be linear or cyclic, and cyclic peptide compounds are preferred. In this specification, a "peptide compound" may also be referred to as a "peptide.”
  • the "cyclic peptide compound” in the present invention is a cyclic peptide compound that can be obtained by cyclizing the N-terminal group and the C-terminal group of a linear peptide compound. Cyclization includes cyclization through carbon-nitrogen bonds such as amide bonds, cyclization through carbon-oxygen bonds such as ester bonds and ether bonds, cyclization through carbon-sulfur bonds such as thioether bonds, and carbon-carbon bonds. Any form may be used, such as cyclization by , or cyclization by constructing a heterocyclic ring.
  • cyclization via a covalent bond such as an amide bond or a carbon-carbon bond is preferable, and cyclization via an amide bond between a carboxylic acid group in a side chain and an amino group in the main chain at the N-terminus is more preferable.
  • the position of the carboxylic acid group, amino group, etc. used for cyclization may be on the main chain or on the side chain, and is not particularly limited as long as it is at a position where cyclization is possible.
  • one or more means a number of one or more.
  • substituents of a group the term means one up to the maximum number of substituents allowed by the group.
  • one or more includes, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or a larger number.
  • the "resin for solid phase synthesis” is not particularly limited as long as it can be used for the synthesis of peptide compounds by solid phase method.
  • resins for solid phase synthesis include CTC resin, Wang resin, SASRIN resin, trityl chloride resin (Trt resin), 4-methyltrityl chloride resin (Mtt resin), and 4-methoxytrityl chloride.
  • resins (Mmt) that can be removed under acidic conditions. The resin can be appropriately selected depending on the functional group on the amino acid side used.
  • a carboxylic acid main chain carboxylic acid or side chain carboxylic acid typified by Asp or Glu
  • a hydroxyl group phenol group typified by Tyr
  • Trt resin trityl chloride resin
  • CTC resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • Mtt resin 4-methyltrityl chloride resin
  • resin may be described as resin.
  • cellulose may be used as the solid phase.
  • solid phase may be used synonymously with "resin for solid phase synthesis.”
  • the type of polymer constituting the resin is also not particularly limited. In the case of a resin made of polystyrene, either 100-200 mesh or 200-400 mesh may be used.
  • the crosslinking rate is also not particularly limited, but 1% DVB (divinylbenzene) crosslinking is preferred.
  • examples of the types of polymers constituting the resin include Tentagel and Chemmatrix.
  • examples of the substituent include alkyl, alkoxy, fluoroalkyl, fluoroalkoxy, oxo, aminocarbonyl, alkylsulfonyl, alkyl
  • substituents include sulfonylamino, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, halogen, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, cyano, carboxyl, alkoxycarbonyl, formyl, and the like.
  • a substituent may be added to each of these, and these substituents are not limited, for example, any substituent containing a halogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • substituents are not limited, for example, any substituent containing a halogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • One or more may be independently selected from among the groups. That is, examples include optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, and cycloalkyl.
  • the compounds described herein can be salts thereof or solvates thereof.
  • Salts described herein include, for example, hydrochloride; hydrobromide; hydroiodide; phosphate; phosphonate; sulfate; methanesulfonate, p-toluenesulfonate, etc. sulfonates; carboxylates such as acetates, citrates, malates, tartrates, succinates, salicylates; or alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; magnesium salts, calcium salts, etc.
  • alkaline earth metal salts such as ammonium salts, alkylammonium salts, dialkylammonium salts, trialkylammonium salts, and tetraalkylammonium salts; These salts are produced, for example, by contacting the compound with an acid or a base.
  • the solvate of the compound described herein refers to a compound in which the compound forms one molecular group together with a solvent, and is not particularly limited as long as it is a solvate formed by the solvent. Examples include hydrates, alcoholates (ethanolates, methanolates, 1-propanolates, 2-propanolates, etc.), and solvates with a single solvent such as dimethyl sulfoxide.
  • a solvate is formed with a plurality of solvents for one molecule of the compound, or one in which a solvate is formed with a plurality of types of solvents in one molecule of the compound.
  • the solvent is water, it is called a hydrate.
  • hydrates are preferable, and specific examples of such hydrates include 1 to 10 hydrates, preferably 1 to 5 hydrates, and more preferably 1 to 3 hydrates. Examples include hydrates.
  • amino acid as used herein includes natural amino acids and unnatural amino acids.
  • Natural amino acids include Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, He, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro. refers to Examples of unnatural amino acids include, but are not limited to, ⁇ -amino acids, D-type amino acids, N-substituted amino acids, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, amino acids whose side chains differ from those of natural amino acids, and hydroxycarboxylic acids. Any steric configuration is acceptable for the amino acids herein.
  • side chains of amino acids there are no particular restrictions on the selection of side chains of amino acids, but in addition to hydrogen atoms, examples include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, aryl groups, heteroaryl groups, aralkyl groups, heteroaralkyl groups, cycloalkyl groups, and spiro bonds.
  • cycloalkyl groups Each may be provided with a substituent, and these substituents are not limited, for example, any substituent containing a halogen atom, an O atom, an S atom, a N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • One or more may be independently selected from the following.
  • examples thereof include optionally substituted alkyl groups, alkoxy groups, alkenyl groups, alkynyl groups, aryl groups, heteroaryl groups, aralkyl groups, cycloalkyl groups, oxo, aminocarbonyl, and halogen atoms.
  • the amino acid herein may be a compound having a carboxy group and an amino group in the same molecule (even in this case, imino acids such as proline and hydroxyproline are also included in the amino acid). included).
  • Examples of the substituent containing a halogen atom in this specification include an alkyl group, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, etc. having a halogen as a substituent, and more specifically, Examples include fluoroalkyl, difluoroalkyl, trifluoroalkyl and the like.
  • oxy examples include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy, and the like.
  • alkoxy C 1 -C 4 alkoxy and C 1 -C 2 alkoxy are preferable, and methoxy or ethoxy is particularly preferable.
  • Examples of oxycarbonyl include alkyloxycarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl, alkenyloxycarbonyl, alkynyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, heteroaryloxycarbonyl, aralkyloxycarbonyl, etc. .
  • carbonyloxy examples include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy, etc. Can be mentioned.
  • thiocarbonyl examples include alkylthiocarbonyl, cycloalkylthiocarbonyl, alkenylthiocarbonyl, alkynylthiocarbonyl, arylthiocarbonyl, heteroarylthiocarbonyl, aralkylthiocarbonyl, and the like.
  • Examples of carbonylthio include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio, etc. Can be mentioned.
  • aminocarbonyl examples include alkylaminocarbonyl (for example, C 1 -C 6 or C 1 -C 4 alkylaminocarbonyl, especially ethylaminocarbonyl, methylaminocarbonyl, etc.). ), cycloalkylaminocarbonyl, alkenylaminocarbonyl, alkynylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, heteroarylaminocarbonyl, aralkylaminocarbonyl, and the like.
  • alkylaminocarbonyl for example, C 1 -C 6 or C 1 -C 4 alkylaminocarbonyl, especially ethylaminocarbonyl, methylaminocarbonyl, etc.
  • cycloalkylaminocarbonyl alkenylaminocarbonyl, alkynylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, heteroarylaminocarbonyl, aralkylaminocarbonyl, and
  • Examples of sulfonylamino include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino, and the like.
  • examples include groups in which the H atom bonded to the N atom in -NH-SO 2 -R is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, or aralkyl.
  • aminosulfonyl examples include alkylaminosulfonyl, cycloalkylaminosulfonyl, alkenylaminosulfonyl, alkynylaminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroarylaminosulfonyl, aralkylaminosulfonyl, and the like.
  • examples include groups in which the H atom bonded to the N atom in -SO 2 -NHR is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, or aralkyl.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenylsulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, heterosulfamoylamino, Examples include arylsulfamoylamino and aralkylsulfamoylamino.
  • the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2 -NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • thio are selected from alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio, and the like.
  • sulfonyl examples include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl, and the like.
  • substituents containing an N atom include azide (-N 3 , also referred to as "azido group”), cyano (-CN), primary amino (-NH 2 ), and secondary amino (-NH-R; also referred to as monosubstituted amino).
  • tertiary amino also referred to as disubstituted amino
  • aminocarbonylamino -NR-CO-NR 'R''
  • pyridyl piperidino, morpholino, azetidinyl, and the like.
  • secondary amino examples include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino, and the like.
  • tertiary amino examples include alkyl (aralkyl) amino, each independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc.
  • alkyl (aralkyl) amino examples include an amino group having two arbitrary substituents selected from the above, and these two arbitrary substituents may form a ring.
  • Specific examples include dialkylamino, particularly C 1 -C 6 dialkylamino, C 1 -C 4 dialkylamino, dimethylamino, and diethylamino.
  • C p -C q dialkylamino group refers to a group in which an amino group is substituted with two C p -C q alkyl groups, and both C p -C q alkyl groups are the same. may also be different.
  • substituted amidinos include those in which the three substituents R, R', and R'' on the N atom are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , heteroaryl, and aralkyl, such as alkyl(aralkyl)(aryl)amidino.
  • aminocarbonylamino examples include hydrogen atoms, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl; Examples include groups independently selected from among these groups, or groups in which these groups form a ring.
  • amino acid residues constituting a peptide compound are sometimes simply referred to as "amino acids.”
  • N-substituted amino acid in the present invention means an amino acid in which the main chain amino group is N-substituted among the amino acids defined above.
  • the main chain amino group of the amino acid is an NHR group
  • R is any group other than hydrogen, such as an optionally substituted alkyl group, alkenyl group, or alkynyl group.
  • an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, or a cycloalkyl group and a cyclic amino acid such as proline in which a carbon atom bonded to an N atom and a carbon atom from the ⁇ -position form a ring.
  • Examples include prolines that form a 5-membered ring, azetidines that form a 4-membered ring, and piperidines that form a 6-membered ring.
  • the substituent of each group that may be substituted is not particularly limited, and examples thereof include a halogen group, an ether group, and a hydroxyl group.
  • N-alkylamino acid in the present invention refers to an amino acid whose main chain amino group is substituted with an alkyl group among the N-substituted amino acids defined above.
  • N-alkylamino acids include N-C 1 -C 10 alkyl amino acids and N-C 1 -C 6 alkyl amino acids.
  • specific examples of the N-alkyl amino acid include N-methyl amino acid, N-ethyl amino acid, N-(n-propyl) amino acid, N-(i-propyl) amino acid, and the like.
  • amino acid as used herein includes all its corresponding isotopes.
  • An isotope of an “amino acid” is one in which at least one atom is replaced with an atom with the same atomic number (number of protons) but a different mass number (sum of the number of protons and neutrons).
  • isotopes included in "amino acid” in this specification include hydrogen atom, carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom, phosphorus atom, sulfur atom, fluorine atom, chlorine atom, etc., and 2 H, 3 Included are H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, and the like.
  • prolines refers to a group of compounds in which, in addition to proline, one or more arbitrary substituents are bonded to any carbon atom forming the five-membered ring of proline. , when a plurality of substituents are present on the five-membered ring, these substituents may be taken together to form a ring, and the ring may be any aromatic ring.
  • the "prolines” include proline, trans-4-hydroxy-L-proline, cis-4-hydroxy-L-proline, trans-4-fluoro-L-proline, cis-4-fluoro-L- Examples include proline, 2-methyl-L-proline, and the like.
  • prolines When prolines have a hydroxy group, the hydroxy group may be protected by any protecting group, or any substituent and the oxygen atom of the hydroxy group may form an ether bond or an ester bond. Good too. Furthermore, any one of the carbon atoms forming the five-membered ring may be replaced with an oxygen atom or a sulfur atom. A specific example of such a compound is L-thioproline. Furthermore, prolines may have an unsaturated bond within the five-membered ring they form. A specific example of such a compound is 3,4-dehydro-L-proline. Note that they are not limited to the L-form, but may be the D-form.
  • azetidines are basically compounds in which one nitrogen atom and three carbon atoms form a four-membered ring, and a carboxyl group is bonded to the carbon atom next to the nitrogen atom. means a cyclic amino acid.
  • One or more arbitrary substituents may be bonded to any carbon atom forming the four-membered ring. When a plurality of substituents are present on the four-membered ring, these substituents may be taken together to form a ring.
  • Specific examples of “azetidines” include (S)-azetidine-2-carboxylic acid and (R)-azetidine-2-carboxylic acid.
  • azetidines Compounds in which a carboxyl group is bonded to the second carbon atom counting from the nitrogen atom forming a four-membered ring are also included in "azetidines"; such compounds include, for example, azetidine-3. -Carboxylic acids, etc.
  • piperidines basically refers to compounds in which one nitrogen atom and five carbon atoms form a six-membered ring, and a carboxyl group is bonded to the carbon atom next to the nitrogen atom. means a cyclic amino acid.
  • One or more arbitrary substituents may be bonded to any carbon atom forming the 6-membered ring. When a plurality of substituents are present on the six-membered ring, these substituents may be taken together to form a ring, and the ring may be any aromatic ring.
  • piperidines include (R)-piperidine-2-carboxylic acid, (S)-piperidine-2-carboxylic acid, and (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid. acid, (S)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid, and the like.
  • examples of the aromatic hydrocarbon solvent include benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene, and the like.
  • examples of the halogen-based solvent include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride, and the like.
  • examples of ether solvents include diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane, diisopropyl ether, cyclopentyl methyl ether, t -butyl methyl ether, 4-methyltetrahydropyran, diglyme, triglyme, tetraglyme and the like.
  • examples of the amide solvent include N,N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N,N-dimethylacetamide (DMA), N-ethylpyrrolidone (NEP), -butylpyrrolidone (NBP), formamide, etc.
  • examples of the sulfoxide solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), diethyl sulfoxide, methyl ethyl sulfoxide, methyl phenyl sulfoxide, and the like.
  • examples of the sulfone solvent include diphenylsulfone, dimethylsulfone, diethylsulfone, sulfolane, 3-methylsulfolane, ethylmethylsulfone, ethylisopropylsulfone, and the like.
  • examples of urea-based solvents include 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU), etc.
  • ester solvent examples include methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, ⁇ -valerolactone, and the like.
  • examples of the ketone solvent include acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethyl ketone, and the like.
  • carbonate-based solvents examples include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate, and the like.
  • examples of the phosphate ester solvent include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, and tributyl phosphate.
  • amidines means a base represented by the following formula B1: [In the formula, RB 1 and RB 4 are each independently C 1 -C 4 alkyl, or RB 1 and RB 4 together with the nitrogen atom to which RB 1 is attached and the carbon atom to which RB 4 is attached to form a 5- to 8-membered ring, RB 2 and RB 3 are each independently C 1 -C 4 alkyl, or RB 2 and RB 3 are the nitrogen atom to which RB 2 is bonded, the nitrogen atom to which RB 3 is bonded, and Together with the carbon atom to which the nitrogen atom is bonded, it forms a 5- to 8-membered ring. ]
  • RB 1 to RB 4 are C 1 -C 4 alkyl
  • preferred examples of the C 1 -C 4 alkyl include methyl and ethyl.
  • preferred examples of the 5- to 8-membered ring include a pyrrolidine ring, a piperidine ring, and an azepane ring.
  • preferred examples of the 5- to 8-membered ring include a 1,4,5,6-tetrahydropyrimidine ring.
  • amidines include DBU: 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene and DBN: 1,5-diazabicyclo[4.3.0]-5-nonene. .
  • guanidines means a base represented by the following formula B2: [In the formula, RB 6 is hydrogen or C 1 -C 4 alkyl; RB 5 and RB 7 are each independently C 1 -C 4 alkyl, or together with each nitrogen atom to which they are bonded and the carbon atom to which each nitrogen atom is bonded, 5 to 8 forming a member ring, RB 8 is C 1 -C 4 alkyl and RB 9 is hydrogen, C 1 -C 4 alkyl or phenyl, or RB 8 and RB 9 are each nitrogen atom to which they are attached and each The nitrogen atom forms a 5- to 8-membered ring together with the carbon atom to which it is bonded, When RB 9 is phenyl here, the two formulas B2 may be such that the two benzene rings of the phenyl group are fused to form naphthalene. ]
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl
  • the C 1 -C Preferred 4- alkyl is t-butyl.
  • preferred examples of the 5- to 8-membered ring include an imidazolidine ring, a hexahydropyrimidine ring, and a 1,3-diazepane ring.
  • preferred examples of the 5- to 8-membered ring include a 1,4,5,6-tetrahydropyrimidine ring.
  • the guanidines include TMG: 1,1,3,3-tetramethylguanidine, TBD: 1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene, MTBD: 7- Examples include methyl-1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene.
  • phosphazenes means a base represented by the following formula B3 or the following formula B4:
  • RB 10 is C 1 -C 4 alkyl, or RB 10 and RB 11 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5-8 membered ring
  • RB 11 is C 1 -C 4 alkyl, except when RB 10 and RB 11 form a 5-8 membered ring, or RB 11 and RB 12 are each nitrogen atom and Each nitrogen atom forms a 5- to 8-membered ring together with the phosphorus atom to which it is bonded
  • RB 12 is C 1 -C 4 alkyl, unless RB 11 and RB 12 form a 5-8 membered ring, or RB 12 and RB 13 together with the nitrogen atom to which they are attached to form a 5- to 8-membered ring
  • RB 13 is C 1 -C 4 alkyl, except when RB 12 and RB 13 form a 5-8 membered ring, or RB 13 and RB 14 are each nitrogen atom and Each nitrogen atom forms a 5- to 8-member
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • -C 8 alkyl is preferably t-butyl or t-octyl.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably a pyrrolidine ring, a piperidine ring, an azepane ring, etc. can be mentioned.
  • the 5- to 8-membered ring has RB 11 , RB 12 , RB 13 , and RB 14 bonded to each other. It is preferably a 5- to 8-membered saturated ring containing no heteroatoms other than each nitrogen atom and the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded.
  • RB 17 is independently C 1 -C 4 alkyl, or RB 17 and RB 18 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5-8 membered ring
  • RB 18 is C 1 -C 4 alkyl, except when RB 17 and RB 18 form a 5- to 8-membered ring, or RB 18 and RB 19 are each nitrogen atom and Each nitrogen atom forms a 5- to 8-membered ring together with the phosphorus atom to which it is bonded
  • RB 19 is C 1 -C 4 alkyl, unless RB 18 and RB 19 form a 5-8 membered ring, or RB 19 and RB 20 together with the nitrogen atom to which they are attached to form a 5- to 8-membered ring
  • RB 20 is C 1 -C 4 alkyl, except when RB 19 and RB 20 form a 5-8 membered ring
  • RB 21 is C 1 -C 4 alkyl, or RB 21 and RB 22 together
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • -C 4 alkyl is preferably ethyl or t-butyl.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably Examples include a pyrrolidine ring, a piperidine ring, and an azepane ring.
  • RB 17 and RB 18 are both C 1 -C 4 alkyl
  • RB 19 and RB 20 are both C 1 -C 4 alkyl
  • RB 17 and RB 18 form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 19 and RB 20 also preferably form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 21 and RB 22 are both C 1 -C 4 alkyl, preferably RB 23 and RB 24 and RB 25 and RB 26 are also both C 1 -C 4 alkyl, and RB 21 and RB 22 are Preferably, RB 23 and RB 24 and RB 25 and RB 26 , which form an 8-membered ring, also form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 18 and RB 19 and/or RB 22 and RB 23 form a 5- to 8-membered ring
  • RB 11 , RB 12 , RB 13 , and RB 14 are bonded to the 5- to 8-membered ring. It is preferably a 5- to 8-membered saturated ring containing no heteroatoms other than each nitrogen atom and the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded.
  • the phosphazenes include P2tBu: 1-tert-butyl-2,2,4,4,4-pentakis(dimethylamino)-2 ⁇ 5 ,4 ⁇ 5 -catenadi(phosphazene), P2Et: tetramethyl(tris( dimethylamino)phosphoranylidene) phosphate triamide-ethylimine, HP1(dma): imino-tris(dimethylamino)phosphorane, BTPP: tert-butylimino-tri(pyrrolidino)phosphorane, P1tBu: tert-butylimino-tris(dimethylamino)phosphorane, BEMP: 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diazaphosphorine and the like.
  • A, B, and/or C includes the following seven variations; (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A and B, (v) A and C, (vi) B and C, (vii) A, B, and C.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide by a solid phase method, which includes the following steps (1) to (3).
  • the "first peptide" in step (2) means a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton.
  • Step (1) of the present invention is a step of providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase.
  • the first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase is usually synthesized by solid phase synthesis through a functional group (e.g., a carboxyl group) in an amino acid residue at its C-terminus. However, it may be supported on a solid phase through a functional group (for example, a carboxyl group) of an amino acid residue other than the C-terminus.
  • a functional group for example, a carboxyl group
  • the amino group of the amino acid residue at its N-terminus is protected by a protecting group containing an Fmoc skeleton.
  • the solid phase on which the first peptide is supported can be any known in the art and generally includes a predetermined amino acid residue (e.g., a C-terminal amino acid residue) of the first peptide. ) and are linked by an ester bond.
  • the resin has a resin bond that is determined to be "H ( ⁇ 5% TFA in DCM)" for acid sensitivity as described in the Solid Phase Synthesis Handbook (published by Merck & Co., Ltd., May 1, 2002). It is preferable to have a group, and it can be selected as appropriate depending on the functional group on the amino acid side used.
  • a carboxylic acid main chain carboxylic acid or side chain carboxylic acid typified by Asp or Glu
  • a hydroxyl group phenol group typified by Tyr
  • Trt resin trityl chloride resin
  • Clt resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • Mtt resin 4-methyltrityl chloride resin
  • protecting group containing an Fmoc skeleton means a group in which an arbitrary substituent is introduced into an arbitrary position of an Fmoc group or a constituent skeleton of an Fmoc group.
  • a specific example of a protecting group containing such an Fmoc skeleton is a protecting group represented by the following formula (1).
  • R 1 -R 8 are independently selected from the group consisting of hydrogen, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 fluoroalkyl, halogen, sulfo, and trimethylsilyl; R 9 -R 10 are independently hydrogen or methyl).
  • the protecting group containing an Fmoc skeleton includes, for example, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, a 2,7-di-tert-butyl-Fmoc (Fmoc(2,7tb)) group, a 1 -Methyl-Fmoc (Fmoc (1Me)) group, 2-fluoro-Fmoc (Fmoc (2F)) group, 2,7-dibromo-Fmoc (Fmoc (2,7Br)) group, 2-monoisooctyl-Fmoc ( mio-Fmoc) group, 2,7-diisooctyl-Fmoc (dio-Fmoc) group, 2,7-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8 -tridecafluorooctyl)-Fmoc (tdf-Fmoc) group, 2,2,7
  • the type and number of amino acid residues constituting the first peptide are not limited, and two or more amino acid residues, for example, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 15, 14, Peptides with any amino acid sequence containing 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 amino acid residues can be used as the first peptide.
  • Natural amino acids and/or unnatural amino acids can be used as the amino acids.
  • the first peptide includes one or more N-substituted amino acids.
  • the first peptide having a protecting group comprising an Fmoc backbone (e.g., the first peptide having a protecting group comprising an Fmoc backbone supported on a solid phase) provided in step (1) is obtained from a commercial supplier. Alternatively, it can be manufactured by applying methods known in the art, such as those shown in WO2013/100132 and WO2018/225864.
  • the first peptide is a dipeptide.
  • the C-terminal amino acid residue of the dipeptide is supported on the solid phase by, for example, an ester bond, and as shown in the scheme below, the free radical generated as a result of removing the protecting group of the N-terminal amino acid residue is The amino group of may react with the carbonyl group in the ester linkage to produce undesirable DKP.
  • R 1 to R 4 mean any atom or group, and * means the bonding site with the resin for solid phase synthesis.
  • the first peptide is a peptide in which the second amino acid residue from the N-terminus is an "N-substituted amino acid.”
  • the free amino group generated as a result of removing the protecting group of the N-terminal amino acid residue is located between the second and third amino acid residues from the N-terminus. It may react with the carbonyl group in the peptide bond, and undesirable DKP, DKP-eliminated products, and impurities having an amidine skeleton (six-membered cyclic amidine skeleton structure) may be formed.
  • R 4 means any atom or group other than hydrogen
  • R 1 to R 3 and R 5 to R 8 mean any atom or group
  • * is an adjacent amino acid residue or a solid phase
  • R 6 when R 6 is hydrogen, it can take either route A or route B in the above scheme, and when R 6 is other than hydrogen, (You can only go through route A in the above scheme.)
  • N-substituted amino acid in the present invention include N-alkylated N-alkylamino acids such as N-methylated amino acids, and cyclic amino acids such as prolines and azetidines.
  • Step (2) of the present invention comprises introducing the first peptide provided in step (1) into a solvent containing a sulfoxide-based solvent, and at least one type of base containing a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile. Alternatively, it is a step of treating with multiple types of bases.
  • the first peptide obtained by step (2) is in the form of a carbamate.
  • dibenzofulvene is generated without decarboxylation proceeding in at least a portion of the first peptide upon removal of the protecting group containing the Fmoc skeleton.
  • R is hydrogen or any substituent of the amino group.
  • carbamate can suppress the intramolecular nucleophilic reaction of the terminal amino group, and even under basic deprotection conditions, the formation of a 6-membered ring intermediate is suppressed, leading to DKP elimination. It is estimated that by-products of bodies and six-membered cyclic amidine skeleton structures are reduced.
  • the first peptide obtained by step (2) is in the form of a carbamate.
  • the isocyanate produced by the reaction of the condensing agent and the carbamate anion has an adjacent N-terminal amino group. It is thought that the dimeric urea compound is produced by nucleophilic attack of the urea molecules and an intermolecular reaction (referred to as intermolecular here even if they are supported on the same solid phase).
  • step (3) by decomposing the carbamate and converting it into the amine form, the dimer urea form in step (3) It is estimated that it is possible to reduce the generation of
  • the amount of the base that can significantly reduce the formation of the DKP elimination product and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure is
  • the first peptide may be present as a carbamate.
  • the molar ratio between the carbamate and the amine formed by further decarboxylation (carbamate/amine) is 0.6 or more, 0.8 or more, or 1.0 or more. , 2.0 or more, 3.0 or more, 4.0 or more, 4.6 or more, 5.0 or more, 6.0 or more, 8.0 or more, or 10.0 or more. It is possible.
  • Such a molar ratio is, for example, determined by 1 H-NMR of a solution treated with the base using an amide form (for example, dimethylamide form) of the N-terminal amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton in the first peptide. It can be determined from the proton integral ratio at .
  • the carbamate may be a salt of the conjugate acid with any base having a pKa of 23 or higher in acetonitrile.
  • Preferred examples of such salts include, for example, DBU salt, TMG salt, HP1 (dma) salt, MTBD salt, P1-tBu salt, and P2-Et salt.
  • the solvent used in step (2) only needs to contain a sulfoxide solvent, and may be a single solvent or a mixed solvent.
  • a mixed solvent it is preferable that the sulfoxide solvent is contained in an amount of 50 v/v % or more, 70 v/v % or more, or 90 v/v % or more.
  • sulfoxide solvent used in step (2) include dimethyl sulfoxide (DMSO), diethyl sulfoxide, methyl ethyl sulfoxide, and methyl phenyl sulfoxide, with DMSO being preferred.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the mixed solvent includes, in addition to the sulfoxide solvent, an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, and a carbonate solvent.
  • solvents selected from solvents, phosphate ester solvents, amide solvents, urea solvents, and sulfone solvents may be included.
  • the mixed solvent when the solvent used in step (2) is a mixed solvent, includes one or more selected from amide solvents, urea solvents, and sulfone solvents in addition to sulfoxide solvents. Seed solvents may also be included.
  • step (2) specific examples of the solvent include benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene, etc. Among them, toluene and cumene are preferred.
  • halogenated solvent examples include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride, etc., with dichloromethane being preferred.
  • ether solvent When an ether solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane ( DME), diisopropyl ether, cyclopentyl methyl ether (CPME), t-butyl methyl ether, 4-methyltetrahydropyran, diglyme, triglyme, tetraglyme, etc., preferably tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,2- These are dimethoxyethane and 1,3-dioxolane.
  • DME diethyl ether
  • tetrahydrofuran 2-methyltetrahydrofuran
  • 1,4-dioxane 1,3-dioxolane
  • 1,2-dimethoxyethane DME
  • an ester solvent when used in step (2), specific examples of the solvent include methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, and ⁇ -valerolactone. Among them, butyl acetate and methyl propionate are preferred.
  • a ketone solvent When a ketone solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include acetone, methyl ethyl ketone (MEK), methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethyl ketone (3-pentanone), Preferred are methyl ethyl ketone and diethyl ketone.
  • MEK methyl ethyl ketone
  • methyl isobutyl ketone methyl isobutyl ketone
  • cyclohexanone cyclopentanone
  • diethyl ketone diethyl ketone
  • a carbonate solvent When a carbonate solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate, etc., with dimethyl carbonate being preferred.
  • a phosphate ester solvent When a phosphate ester solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, tributyl phosphate, and the like, with tributyl phosphate being preferred.
  • amide solvent examples include N,N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N,N-dimethylacetamide (DMA), N -Ethylpyrrolidone (NEP), N-butylpyrrolidone (NBP), formamide, and the like.
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • DMA N,N-dimethylacetamide
  • NEP N -Ethylpyrrolidone
  • NBP N-butylpyrrolidone
  • formamide and the like.
  • a urea-based solvent When a urea-based solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), 1,3-dimethyl-3,4,5,6- Examples include tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU).
  • DMI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • DMPU tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone
  • a sulfonic solvent When a sulfonic solvent is used in step (2), specific examples of the solvent include diphenylsulfone, dimethylsulfone, diethylsulfone, sulfolane, 3-methylsulfolane, ethylmethylsulfone, ethylisopropylsulfone, and the like.
  • the solvent used in step (2) has a swelling capacity of the solid phase resin of 1.5 mL/g or more, 2.0 mL/g or more, 2.5 mL/g or more, 3.0 mL/g or more, 3.5 mL/g or more , or 4.0 mL/g or more.
  • a swelling capacity of the solid phase resin of 1.5 mL/g or more, 2.0 mL/g or more, 2.5 mL/g or more, 3.0 mL/g or more, 3.5 mL/g or more , or 4.0 mL/g or more.
  • the swelling capacity (mL/g) of the solid phase resin is DMI: 8.5, DMPU: 8.0, NMP: 6.4, THF: 6.0, DMA: 5.8, CHCl 3 : 5.6, CPME: 5.6, CH 2 Cl 2 : 5.4, 2-methyltetrahydrofuran: 5.4, DMF: 5.2, Butyl acetate: 5.2, DME: 4.8, MEK: 4 .4, toluene: 4.0, AcOEt: 4.2, xylene: 3.0, Et 2 O: 2.8, dimethyl carbonate: 2.8, MTBE: 2.4, CH 3 CN: 2.0, Tributyl phosphate: 1.6, MeOH: 1.6, H 2 O: 1.6.
  • the table described in “Green Chem., 2017, 19, 952-962" or the determination in table 2 of "Green Chem., 2020, 22, 996-1018", etc. can also be adopted.
  • one or more bases are used, including at least a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile.
  • the base is a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile.
  • at least one of them is a base whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile, and the other bases are bases whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile. or less than 23 bases.
  • the base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugate acid used in step (2) may be a base having a pKa of 34 or less, preferably 30 or less, more preferably 28 or less.
  • pKa is an index representing the degree of basicity, and the larger the pKa, the higher the basicity.
  • the pKa (CH 3 CN) of the conjugate acid of the organic base in acetonitrile is expressed as "New J.Chem.2009,33,588” 1) or "Sigma-Aldrich, Phosphazene Bases: https://www The values shown in ⁇ .sigmaaldrich.com/chemistry/chemical-synthesis/technology-spotlights/phosphazenes.html'' 2) or ⁇ Eur. J. Org. Chem. 2019, 6735-6748'' may be adopted.
  • bases whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile include amidines, guanidines, or phosphazenes.
  • the pKa of the bases listed below are all 23 or more.
  • a plurality of bases whose conjugate acid has a pKa of 23 or more in acetonitrile for example, a plurality of bases selected from the above-mentioned amidines, guanidines, or phosphazenes, for example, two bases.
  • a plurality of bases selected from the above-mentioned amidines, guanidines, or phosphazenes for example, two bases.
  • Preferred examples of specific combinations of such bases include DBU and MTBD, DBU and HP1 (dma), DBU and P1tBu, and DBU and P2Et.
  • the base whose conjugate acid has a pKa in acetonitrile of 23 or more is, for example, the above-mentioned amidine. , guanidines, or phosphazenes.
  • the base having a pKa of the conjugate acid in acetonitrile of less than 23 is preferably selected from piperidine, piperazine, and morpholine. Preferred examples of such combinations of bases include DBU and piperidine.
  • step (2) can also be repeated multiple times before step (3).
  • the same solvent and/or the same base or different solvents and/or different bases may be used each time in step (2).
  • the same solvent means that the type of solvent and the mixing ratio of the solvent are the same, and the term different solvent means that either or both of the type of solvent and the mixing ratio of the solvent are different.
  • the same base means that the type of base and the concentration of the base in the solvent are the same, and the term different bases means that the type of base and the concentration of the base in the solvent are the same. Or both mean different things.
  • the method of the present invention may include the step of draining the solution between each time of step (2). Thereby, the solvent and/or base used in the previous step (2) can be replaced with the solvent and/or base used in the next step (2).
  • step (2) is a step of removing a protecting group containing an Fmoc skeleton, and/or a step of converting a protecting group containing an Fmoc skeleton in the first peptide into a carbamate form.
  • the step of removing the protecting group containing the Fmoc skeleton in the first peptide is performed substantially only in step (2).
  • the method of the invention does not include, prior to step (2), treating the first peptide with a single base, such as piperidine, where the pKa of the conjugate acid in acetonitrile is less than 23. .
  • the first peptide provided in step (1) for example, in any solvent (e.g., DMF), as the sole base, a base whose conjugate acid has a pKa of less than 23 in acetonitrile (e.g., , piperidine) to treat the first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton, and then perform step (2) of the present invention (for example, treating DBU or a combination of DBU and piperidine in a solvent containing DMSO).
  • Embodiments such as (processed with) may be excluded from the present invention.
  • the base used in step (2) can be contained in the solvent at any concentration that allows the reaction of this step to proceed.
  • concentration ranges include, for example, 0.25 to 20 v/v%, 0.5 to 20 v/v%, 1 to 20 v/v%, 1 to 15 v/v%, and 1 to 10 v/v%.
  • step (2) can further include contacting the solvent with CO 2 .
  • the solvent used in step (2) can be a solvent that has been contacted with CO 2 prior to the step.
  • the contact between the solvent and CO 2 can be performed, for example, by bubbling CO 2 into the solvent.
  • CO 2 can be included in the reaction system.
  • the amine in the reaction system can be more easily converted into a carbamate by including CO 2 in the reaction system.
  • the reaction in step (2) can be carried out at a temperature of -100°C to around the boiling point of the solvent, preferably 0 to 50°C. Further, the reaction in step (2) is performed for 1 minute to 1 week, preferably 1 minute to 3 hours, 3 minutes to 3 hours, 5 minutes to 3 hours, more preferably 1 minute to 20 minutes, 3 minutes to The reaction time can be 20 minutes or 5 to 20 minutes.
  • step (3) of the present invention after step (2), the first peptide and a carboxylic acid or a carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent. This is the step of obtaining the third peptide.
  • the third peptide is synthesized by condensing the N-terminal amino group of the first peptide with the carboxyl group of the carboxylic acid.
  • the carboxylic acid used in step (3) is an amino acid with a protecting group, a second peptide with a protecting group, a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid. be able to.
  • the carboxylic acid analog used in step (3) can be an active ester of carboxylic acid or an acid halide of carboxylic acid.
  • the process ( 3) condensation reaction can be carried out.
  • the active ester includes a carbonyl group in these compounds, especially in the case of the second peptide, a carbonyl group contained in the C-terminal amino acid residue, such as a group that can promote the reaction with an amine.
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group that may have a substituent, an aryl group that may have a substituent, an aralkyl group that may have a substituent, a substituted Indicates a cycloalkyl group that may have a group, a heteroaryl group that may have a substituent, an alkenyl group that may have a substituent, and an alkylene group that may have a substituent. ) etc. are combined.
  • the process can be carried out without a condensing agent.
  • the condensation reaction (3) can be carried out.
  • the carboxyl group in these compounds especially in the case of the second peptide, the carboxyl group contained in the C-terminal amino acid residue is a chlorocarbonyl group, a fluorocarbonyl group, a bromocarbonyl group, etc. Examples include those converted to groups, iodocarbonyl groups, etc.
  • the protecting group is a carbamate-based protecting group, a sulfonyl-based protecting group, or an acyl-based protecting group. can be.
  • the carbamate-based protecting group means a protecting group constituting a carbamate structure, and includes, for example, a protecting group having an Fmoc skeleton, Alloc, Teoc, Boc, Cbz, and 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group. (Troc) etc. are included in this.
  • the sulfonyl-based protecting group means a protecting group containing a sulfonyl structure, such as a methanesulfonyl (Ms) group, a p-toluenesulfonyl (Ts) group, a 2-nitrobenzenesulfonyl (Ns) group, and a trifluoromethanesulfonyl (Tf) group. and (2-trimethylsilyl)-ethanesulfonyl (SES) groups.
  • Ms methanesulfonyl
  • Ts p-toluenesulfonyl
  • Ns 2-nitrobenzenesulfonyl
  • SES (2-trimethylsilyl)-ethanesulfonyl
  • the acyl protecting group means a protecting group containing an acyl structure, and includes, for example, an acetyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group, a trifluoroacetyl (Tfa) group, and the like.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step (3) is an amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton
  • the amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton has a protective group containing an Fmoc skeleton. Any natural or unnatural amino acid protected with a group can be used.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step (3) is a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton
  • the second peptide having a protecting group containing the Fmoc skeleton As long as the N-terminal amino acid is protected with a protecting group containing an Fmoc skeleton, the type and number of amino acid residues constituting the peptide are not limited, and may include two or more natural and/or non-natural amino acid residues. , peptides with any amino acid sequence can be utilized.
  • the second peptide comprises one or more N-substituted amino acids.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step (3) is a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof, These are independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, halogen, nitro, dialkylamino, cyano, alkoxycarbonyl, and dialkylaminocarbonyl. may be substituted with one or more substituents.
  • C 1 -C 8 alkyl carboxylic acids, active esters or acid halides thereof are preferably C 1 -C 4 alkyl carboxylic acids, active esters or acid halides thereof, specifically, for example, acetic acid, Examples thereof include propanoic acid, butanoic acid, pentanoic acid, or active esters or acid halides thereof.
  • Specific examples of the C 6 -C 10 arylcarboxylic acid, or its active ester or acid halide include benzoic acid, naphthoic acid, or its active ester or acid halide.
  • step (3) 1 to 20 equivalents, preferably 2 to 10 equivalents of an amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton are added to the first peptide.
  • 1 to 20 equivalents, preferably 2 to 10 equivalents of an amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton are added to the first peptide.
  • 1 to 20 equivalents, preferably 2 to 10 equivalents of an amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton are added to the first peptide.
  • the first peptide and/or the second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton preferably contains at least one N-substituted amino acid.
  • the amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton is preferably an N-substituted amino acid.
  • the Fmoc skeleton-containing protecting group of the amino acid or second peptide used in step (3) is the same as the Fmoc skeleton-containing protecting group of the first peptide used in step (1). However, they can also be different.
  • the solvent used in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, or a ketone solvent.
  • the solvent may contain at least one type of solvent, carbonate solvent, or phosphate ester solvent, and may be a single solvent or a mixed solvent.
  • the solvents used in step (3) include aromatic hydrocarbon solvents, halogen solvents, ether solvents, amide solvents, sulfoxide solvents, sulfone solvents, urea solvents, ester solvents, It is preferable that at least one of a ketone solvent, a carbonate solvent, or a phosphate ester solvent is contained in an amount of 25 v/v % or more, 50 v/v % or more, or 75 v/v % or more.
  • step (3) specific examples of the solvent include benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene, etc. Among them, toluene and cumene are preferred.
  • halogenated solvent examples include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride, etc., with dichloromethane being preferred.
  • ether solvent examples include diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane
  • examples include diisopropyl ether, cyclopentyl methyl ether, t-butyl methyl ether, 4-methyltetrahydropyran, diglyme, triglyme, tetraglyme, etc., and preferably tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, 1,3 -It is dioxolane.
  • amide solvent When an amide solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include N,N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N,N-dimethylacetamide (DMA), N -ethylpyrrolidone (NEP), N-butylpyrrolidone (NBP), formamide, etc., and preferred are DMF and NMP.
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • DMA N,N-dimethylacetamide
  • NEP N ethylpyrrolidone
  • NBP N-butylpyrrolidone
  • formamide etc.
  • preferred are DMF and NMP.
  • a sulfoxide solvent When a sulfoxide solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), diethyl sulfoxide, methyl ethyl sulfoxide, methyl phenyl sulfoxide, and the like, with DMSO being preferred.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • diethyl sulfoxide diethyl sulfoxide
  • methyl ethyl sulfoxide methyl ethyl sulfoxide
  • methyl phenyl sulfoxide methyl sulfoxide
  • a sulfonic solvent When a sulfonic solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include diphenylsulfone, dimethylsulfone, diethylsulfone, sulfolane, 3-methylsulfolane, ethylmethylsulfone, ethylisopropylsulfone, and the like.
  • a urea solvent When a urea solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), 1,3-dimethyl-3,4,5,6- Examples include tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DMPU), and DMI is preferred.
  • DMI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • DMPU tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone
  • DMI is preferred.
  • an ester solvent When an ester solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, and ⁇ -valerolactone. Among them, ethyl acetate, butyl acetate, and methyl propionate are preferred.
  • a ketone solvent When a ketone solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethyl ketone, etc., and preferably methyl ethyl ketone and diethyl ketone. be.
  • a carbonate solvent When a carbonate solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate, etc., with dimethyl carbonate being preferred.
  • a phosphate ester solvent When a phosphate ester solvent is used in step (3), specific examples of the solvent include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, tributyl phosphate, etc., and tributyl phosphate is preferable.
  • the mixed solvent includes an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, and an ester.
  • the solvent may be composed of two or more solvents selected from ketone solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents, and may also contain any other solvents.
  • the solvent used in step (3) is a sole solvent
  • examples of the solvent include toluene, cumene, 1,2-dichlorobenzene, benzene, anisole, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, tetrahydrofuran, 2-methyl.
  • the solvent used in step (3) can be the same as the solvent used in step (2).
  • the solvent used in step (3) is preferably one in which the condensing agent can be dissolved.
  • the base used in step (2) may remain, but this residual base may produce by-products in which amino acids or peptides are excessively elongated.
  • a solvent in which the condensing agent can be dissolved is used in step (3), the formation of such overextended bodies can be suppressed.
  • the condensing agent used in step (3) is in the form of a salt, the counter-anion of which is PF 6 - or BF 4 - .
  • condensing agents include PyOxim ([ethylcyano(hydroxyimino)acetato-O 2 ]tri-1-pyrrolidinylphosphonium hexafluorophosphate), PyAOP ((7-azabenzotriazole-1 -yloxy)trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), PyBOP (benzotriazol-1-yloxy)trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate), COMU((1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylideneaminooxy) ) dimethylaminomorpholinocarbenium hexafluorophosphate), HATU(O-(7-aza-1H-benzotriazol-1-yl)-N
  • the condensing agent used in step (3) is at least one selected from the group consisting of PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, and TOTU. It is preferable to include seeds, and it is more preferable to use any one of these.
  • the condensation reaction in step (3) can be performed in the presence of a base.
  • the type of base is not limited as long as it contributes to the progress of the condensation reaction, but a base with a pKa of the conjugate acid in water of 5 to 12 is preferable, and examples of such bases include, for example, DIPEA, Examples include triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine, and pyridine.
  • 1 to 20 equivalents, preferably 2 to 10 equivalents of base can be used relative to the first peptide.
  • the pKa of the conjugate acid of the base in water for example, the value calculated by Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V11.02 ((c)1994-2020 ACD/Labs) can be used. .
  • the condensing agent used in step (3) is a carbodiimide condensing agent.
  • condensing agents include diisopropylcarbodiimide (DIC), di-sec-butylcarbodiimide (DsBC), 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide (tBEC), and di-tert-butylcarbodiimide (DtBC).
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • DsBC di-sec-butylcarbodiimide
  • tBEC 1-tert-butyl-3-ethylcarbodiimide
  • DtBC di-tert-butylcarbodiimide
  • EDC 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • DsBC di-sec-butylcarbodiimide
  • the condensation reaction in step (3) can be carried out in the presence of an additive.
  • the type of additive is not limited as long as it contributes to the progress of the condensation reaction, but specific examples of such additives include HOAt, HOBt, HOOBt, Oxyma, and Oxyma-B. , preferably HOAt, Oxyma.
  • the condensing agent can be used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 2 to 10 equivalents, relative to the first peptide.
  • the present invention may further include a step (treatment step) of treating the mixture in step (2) between step (2) and step (3).
  • the treating step is contacting the mixture with an acid or salt.
  • the acid or base may be added directly to the mixture, or a solution containing the acid or base may be added to the mixture.
  • Any solvent can be used for the solution; for example, it is preferable to use the solvent used in step (2), it is more preferable to use a sulfoxide solvent, and it is even more preferable to use DMSO.
  • the treatment step may be a step of decomposing the carbamate produced in step (2).
  • acids used in the treatment step include HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, and hydrochloric acid. Among these, HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, and HOOBt are preferred.
  • the salt used in the treatment step includes at least one acid selected from the group consisting of HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, and hydrochloric acid, and DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,6 Examples include salts consisting of a base selected from the group consisting of -trimethylpyridine and pyridine, with pyridine hydrochloride being a preferred example.
  • the step of treating the mixture in step (2) may be a step of washing the resin for solid phase synthesis.
  • Any solvent can be used to wash the resin, and for example, it is preferable to use the solvent used in step (2), it is more preferable to use a sulfoxide solvent, and it is even more preferable to use DMSO.
  • the solvent used in the step of washing the resin for solid phase synthesis may be a solution containing a base. Examples of such bases include DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, and 2,4,6-trimethylpyridine. Washing the resin can be performed multiple times (eg, 2, 3, 4, 5, or 6 times) with the same solvent or different solvents.
  • the step of washing the resin for solid phase synthesis is a step of washing with a solution of a sulfoxide solvent containing an acid or a salt.
  • acids used for washing the resin include HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, and hydrochloric acid. Among these, HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, and HOOBt are preferred.
  • the salt used for cleaning the resin includes at least one acid selected from the group consisting of HOAt, Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, hydrochloric acid, and DIPEA, triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,
  • a salt consisting of a base selected from the group consisting of 6-trimethylpyridine and pyridine is exemplified, and pyridine hydrochloride is preferably exemplified.
  • a solvent that has been contacted with CO 2 may be used prior to the step, and CO 2 is A non-contacted solvent may be used, or a combination of a CO 2 -contacted solvent and a non-contacted solvent may be used.
  • the resin is washed one or more times with a solvent that has been contacted with CO 2 in advance, and then the resin is washed one or more times with a solvent that has not been contacted with CO 2 in advance. Washing is preferred.
  • the reaction in step (3) can be carried out at a temperature of -100°C to around the boiling point of the solvent, preferably 0 to 60°C. Further, the reaction in step (3) can be carried out for a reaction time of 1 minute to 1 week, preferably 30 minutes to 20 hours.
  • the peptide produced by the method of the present invention includes a third peptide produced through the steps (1) to (3).
  • the peptide produced by the method of the present invention can further contain any number of amino acids in addition to the third peptide.
  • the peptide produced by the method of the present invention can also be a third peptide produced through the steps (1) to (3).
  • the peptide produced by the method of the present invention can contain at least one, two or more, three or more, four or more, or five or more N-substituted amino acids.
  • the N-substituted amino acid may be an N-alkyl amino acid, preferably an N-methyl amino acid.
  • the method of the present invention may include a step of cutting out the peptide from the solid phase synthesis resin after the step of elongating the peptide chain.
  • a method known in the technical field or a method described in this example can be used.
  • the present invention provides a method for reducing diketopiperazine impurities and/or a six-membered cyclic amidine skeleton in the production of a peptide (for example, production of a peptide by a solid phase method), which includes the step (1) and the step (2).
  • the present invention also relates to a method of reducing the amount of structural impurities produced.
  • the method includes, after the step (2), condensing the first peptide with a carboxylic acid or a carboxylic acid analog in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the method may further include a step (3) of obtaining.
  • the present invention provides a method for reducing diketopiperazine impurities and six-membered cyclic amidine skeleton structures in the production of peptides (e.g., production of peptides by a solid phase method), including the step (1) and the step (2).
  • the present invention also relates to a method of reducing the amount of at least one impurity selected from the group consisting of impurities and dimeric urea impurities.
  • the method includes, after the step (2), condensing the first peptide with a carboxylic acid or a carboxylic acid analog in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the method may further include a step (3) of obtaining.
  • Example 1 Preparation of amino acids, resin-supported peptides, etc. used in this example
  • Example 1-1 Fmoc-amino acids used in peptide synthesis using a peptide synthesizer
  • Fmoc-amino acids listed in Tables 2 to 4 were used for synthesis using a peptide synthesizer.
  • the Fmoc-amino acids listed in Table 2 were synthesized according to the methods described in WO2018/225864 and WO2021/090856.
  • Fmoc-amino acids listed in Table 3 were purchased from commercial suppliers.
  • the Fmoc-amino acids listed in Table 4 were synthesized according to the scheme shown below.
  • the obtained crude product was suspended in DCM (50 mL), 3 mol/L aqueous sodium dihydrogen phosphate solution (45 mL, containing 1.5 mol/L salt) was added, stirred, and the aqueous layer was removed. The organic layer was washed twice with a 3 mol/L aqueous sodium dihydrogen phosphate solution (45 mL, containing 1.5 mol/L salt).
  • a 5N aqueous sodium hydroxide solution (26 mL) was added to a THF/methanol solution (1/1, 52 mL) of the obtained crude product aa3-3-b (3.63 g) while cooling in an ice bath, and the mixture was heated at 0°C for 5 minutes. After stirring, the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the resulting residue was dissolved in 4N hydrochloric acid (30 mL), and the solvent was distilled off. After the mixture was extracted twice with ethyl acetate, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solution was concentrated under reduced pressure.
  • Example 1-2 Preparation of amino acids, peptides, etc. supported on resin used in this example
  • the polymer or resin portion when a compound is bonded to a polymer or resin, the polymer or resin portion may be indicated by a circle.
  • the chemical structure of the reaction site may be indicated by connecting it to ⁇ .
  • the 2-chlorotrityl group of the resin is an ester with the side chain carboxylic acid of Asp. Connected via a bond.
  • pyrro means pyrrolidine, and in the above structure, the C-terminal carboxylic acid group forms an amide bond with pyrrolidine.
  • the reaction of supporting Fmoc amino acid on the resin was performed according to the method described in WO2013/100132 or WO2018/225864.
  • 2-chlorotrityl chloride resin (1.60 mmol/g, 100-200 mesh, 1% DVB, 48.7 g) and dehydrated dichloromethane (500 mL) were placed in a reaction vessel equipped with a filter, and the mixture was shaken at room temperature for 20 minutes. After applying nitrogen pressure to remove dichloromethane, add dehydrated methanol (12.63 mL) and diisopropylethylamine (DIPEA) (32.6 mL) to compound 1-2-1-b (15.91 g) and dehydrated dichloromethane (350 mL).
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the added mixture was added to the reaction vessel and shaken for 60 minutes. After applying nitrogen pressure to remove the reaction solution, a mixture of dehydrated dichloromethane (350 mL), dehydrated methanol (97.3 mL), and diisopropylethylamine (DIPEA) (32.6 mL) was added to the reaction vessel, and the mixture was incubated for 1 hour. It was shaken for 30 minutes. After applying nitrogen pressure to remove the reaction liquid, dichloromethane (350 mL) was added, and after shaking for 5 minutes, nitrogen pressure was applied to remove the reaction liquid.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the obtained compound 1-2-1 (12.6 mg) was placed in a reaction vessel, DMF (2 mL) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour. Thereafter, DBU (40 ⁇ L) was added and shaken at 30° C. for 30 minutes. Then, DMF (8 mL) was added to the reaction mixture, and 1 mL of the solution was diluted with DMF (11.5 mL). The absorbance (294 nm) of the obtained diluted solution was measured (measured using Shimadzu, UV-1600PC (cell length 1.0 cm)), and the supported amount of compound 1-2-1 was calculated to be 0.464 mmol/g. . In addition, different lots synthesized in the same manner but with different supported amounts were also used for peptide synthesis and investigation.
  • Example 1-2-2 (S)-3-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-4-oxo-4-(piperidin-1-yl)butanoic acid-2 -Synthesis of chlorotrityl resin (Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip, compound 1-2-2)
  • Example 1-2-3 (3R)-2-chlorotrityl-3-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)butanoate resin (Fmoc-D-3-Abu-O-Trt(2-Cl )-resin, synthesis of compound 1-2-3)
  • Example 1-2-4 Preparation of solid-phase supported peptide compounds (Compounds 1-2-4 to 1-2-12) used in this example Compound 1 used in this example Compound 1-2-12 was prepared from -2-4 by the Fmoc method using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis). For detailed operating procedures, the manual included with the synthesizer was followed.
  • a peptide synthesizer Multipep RS; manufactured by Intavis
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-protected amino acids (0.6 mol/L) constituting the target peptide and HOAt, Oxyma, or HOOBt (0.375 mol/L) as a carboxylic acid activator in NMP. When the Fmoc-protected amino acid or HOOBt was poorly soluble, solution 1 was prepared by adding DMSO to a concentration of 20%. Solution 2 was prepared by mixing N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) (10v/v%) and N,N-dimethylformamide (DMF).
  • DIC N,N'-diisopropylcarbodiimide
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • Solution 1 and Solution 2 were set in a peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • the solution was drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMF (0.7 mL per column).
  • Fmoc deprotection step Add a DMF solution of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) (2v/v%, 0.7mL per column) to deprotect the Fmoc group at room temperature. I did it. The reaction was performed for 4.5 minutes for deprotection of the first residue, and for 10 minutes for deprotection of the second and subsequent residues, and then the solution was discharged from the frit. Next, twice with DMF (0.7 mL per column) and once with a solution of DIPEA (0.14 mol/L) and HOAt (0.14 mol/L) dissolved in DMF (0.7 mL per column). Washed twice with DMF (0.7 mL per column).
  • DIPEA 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • Extension process solution 1 (0.3 mL per column) and solution 2 (0.36 mL per column) are mixed in the mixing vial of the synthesizer, added to the resin, and the solid phase reaction vessel is heated from 40°C to the difficult-to-extend array.
  • the solution was heated to 60°C and reacted for 2.5 hours to 14 hours in the case of a difficult-to-extend sequence to perform a condensation reaction between the amino group on the resin and the Fmoc-protected amino acid, and then the solution was discharged from the frit. .
  • this condensation reaction of Fmoc-protected amino acids was repeated one or two more times.
  • the resin was then washed three times with DMF (0.7 mL per column).
  • Fmoc-Ile-MeAla-Aze(2)-MeCha-MeGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pyrro (compound 1-2-4) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pyrro (compound 1-2-1, 0.552 mmol/g).
  • Fmoc-Ile-MeGly-Aze(2)-MeCha-MeGly-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-5) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-Thr(tBu)-MeAla-Cys(StBu)-Phe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-6) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-Nle-MeAla(3-Pyr)-Ser(iPen)-Asp-(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-7) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-Nle-MePhe(3-Cl)-Ser(iPen)-Asp-(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-8) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-Ser(nPr)-MeAla-Phe-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-9) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-1-ACPrC-MeAla-Tyr(tBu)-Asp-(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-10) Prepared from Fmoc-Asp(O-Trt(2-Cl)-resin)-pip (compound 1-2-2, 0.452 mmol/g).
  • Fmoc-Aib-Pro-D-3-Abu-O-Trt(2-Cl)-resin (compound 1-2-11) Prepared from Fmoc-D-3-Abu-O-Trt(2-Cl)-resin (compound 1-2-3, 0.558 mmol/g).
  • Fmoc-cLeu-MeVal-D-3-Abu-O-Trt(2-Cl)-resin (compound 1-2-12) Prepared from Fmoc-D-3-Abu-O-Trt(2-Cl)-resin (compound 1-2-3, 0.558 mmol/g).
  • Example 1-3 Preparation of linear peptide used in this example
  • Example 1-3-1 Synthesis of Fmoc-Ile-MeGly-Aze(2)-MeCha-MeGly-Asp(OMe)-pip, compound 1-3-1
  • Solid-phase resin supporting the peptide already prepared in Example 1-2-4 (0.452 mmol/g of Compound 1-2 prepared in Example 1-2-4 from Compound 1-2-2) -5)
  • the resin was swollen by putting 100 mg into a solid-phase reaction vessel, adding DCM (1.0 mL), and allowing it to stand for 10 minutes.
  • the solution was then drained from the frit followed by the addition of TFE/DCM solution (1/1 (v/v), 2.0 mL) and shaking at room temperature for 2 hours. Thereafter, the solution was drained from the frit into an eggplant flask, and the resin was then washed twice with TFE/DCM solution (1/1 (v/v), 1.0 mL), and the drained solution was collected into the eggplant flask.
  • Example 1-3-3 Synthesis of Fmoc-Thr(tBu)-MeAla-Cys(StBu)-Phe-Asp(OMe)-pip, compound 1-3-2
  • Solid-phase resin supporting the peptide already prepared in Example 1-2-4 (0.452 mmol/g of Compound 1-2 prepared in Example 1-2-4 from Compound 1-2-2) -6) 100 mg was placed in a solid phase reaction vessel, DCM (1.0 mL) was added, and the resin was allowed to stand for 10 minutes to swell the resin. The solution was then drained from the frit followed by the addition of TFE/DCM solution (1/1 (v/v), 2.0 mL) and shaking at room temperature for 2 hours. Thereafter, the solution was drained from the frit into an eggplant flask, and the resin was subsequently washed twice with TFE/DCM solution (1/1 (v/v), 1.0 mL), and the drained solution was collected into the eggplant flask.
  • Example 2 Experiment in which the effects of reagents and solvents were confirmed for the Fmoc removal step, resin washing step, and elongation step in solid phase synthesis of peptides. Performs amino acid elongation.
  • compound 1-2-4 was used as a peptide sequence supported on a solid phase, and the reagents and solvents in each step were changed to avoid impurities generated during peptide synthesis (diketopiperazine elimination product, 6-membered cyclic amidine).
  • impurities generated during peptide synthesis diiketopiperazine elimination product, 6-membered cyclic amidine
  • the Fmoc-free solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 5 in the Fmoc-free solvent at the volume percent concentrations (v/v%) listed in Table 5. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with wash solvent (0.7 mL per column).
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with DMSO (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • the excised solution was analyzed by LCMS (SQDAA05long) and the target peptide compound (TM) (2-1*), diketopiperazine (DKP) eliminated product (compound 2-2*), and 6-membered cyclic amidine skeleton structure were identified. (Compound 2-3*) and MeLeu overextended product (Compound 2-4*) were confirmed to be produced.
  • LCMS (ESI) m/z 833.58(M+H)+ Retention time: 2.72 minutes (Analysis conditions SQDAA05long)
  • the Fmoc-free solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 5 in the Fmoc-free solvent at the volume percent concentrations (v/v%) listed in Table 5. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with wash solvent (0.7 mL per column).
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with DMSO (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.25 mL) of phosphoric acid (PyOxim) (0.221 mmol, 4 equivalents) and DIPEA (0.057 mL, 0.331 mmol, 6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added. and shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • DMSO solution (2% v/v, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to form an Fmoc group. was deprotected. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with DMSO (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a diketopiperazine elimination product is a generally widely known synthetic defect in peptide synthesis.
  • the production of a six-membered cyclic amidine skeleton structure is unprecedented and a new problem in peptide synthesis discovered by the present inventors.
  • the formation of the diketopiperazine elimination product is such that the amino group at the N-terminus forms a 6-membered ring with respect to the carbonyl group forming the second amide bond from the N-terminus. After nucleophilic attack on , the amino group forming the original amide bond is eliminated.
  • the production of the six-membered cyclic amidine skeleton structure is thought to progress by similarly forming a six-membered ring and then eliminating the hydroxyl group derived from the carbonyl group generated by nucleophilic attack.
  • the formation of a diketopiperazine eliminated product and a six-membered cyclic amidine skeleton structure are both problems in peptide synthesis due to the formation of a six-membered ring.
  • Run1 and run2 are the Fmoc removal step, resin washing step, and extension step that are carried out in general peptide synthesis (comparative experiment).
  • DBU is used as the base used in the Fmoc removal process
  • DMF is used as the solvent used in the Fmoc removal process, resin washing process, and extension process.
  • DKP diketopiperazine
  • the formation of the diketopiperazine eliminated product and the formation of the 6-membered cyclic amidine skeleton structure were as follows. Approximately 2% of each was confirmed. On the other hand, as shown in runs 4 to 7, when a stronger base with a conjugate acid pKa of 23 or more was used, it was confirmed that the formation of the diketopiperazine elimination product and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure could be suppressed.
  • acid chloride may be used in the elongation step.
  • DMSO is used in the Fmoc removal step and resin washing step
  • acid chloride prepared separately during the extension reaction is reacted in NMP in the presence of 2,4,6-trimethylpyridine. It was also confirmed that the formation of the diketopiperazine eliminated product and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure can be suppressed.
  • two or more types of bases may coexist at the same time in the Fmoc removal step.
  • two types of bases coexist, as in run25, as long as one is used with an optimal base (here, DBU), it is possible to give an adduct to dibenzofulvene generated in the Fmoc removal process.
  • DBU optimal base
  • piperidine which is widely known, is present, the formation of diketopiperazine eliminated products and six-membered cyclic amidine skeleton structures can be suppressed.
  • Example 2 As described above, from the results of Example 2, an outline of the range of each process (Fmoc removal process, resin washing process, elongation process) that can suppress the production of diketopiperazine elimination products and 6-membered cyclic amidine skeleton structures was identified. Ta. In addition, the combination of reaction conditions shown in Example 2 is not limited to suppressing the formation of the diketopiperazine eliminated product and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure.
  • Example 3 Experiment to confirm the generality of peptide sequences for the effect of reducing diketopiperazine elimination during peptide synthesis under the conditions found.
  • various peptide sequences prepared in Example 1-2-4 Table 6
  • the method described in Core 1 was obtained using the general conventional method (Condition-1) and the method of the present invention (Condition-2).
  • Amino acids were elongated and the amount of diketopiperazine eliminated was compared.
  • Condition-1 100 mg of the peptide-supported solid-phase resin (compounds 1-2-5 to 1-2-9 (corresponding to runs 1 to 5 in Table 6)) prepared in Example 1-2-4 was solidified.
  • the resin was swelled by placing it in a phase reaction vessel, adding DCM (1.0 mL), and allowing it to stand for 10 minutes. The solution was then drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMF (0.7 mL per column). A DMF solution of piperidine (20 v/v%, 0.7 mL per column) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to deprotect the Fmoc group. After draining the solution from the frit, the resin was washed eight times with DMF (0.7 mL per column).
  • a DMF solution (0.3 mL) of Fmoc-protected amino acid (0.6 mol/L) and HOAt (0.375 mol/L) and a DMF solution (0.3 mL) of DIC (10 v/v%) were added to the resin obtained above.
  • a mixed solution of 36 mL) was added thereto, and the mixture was shaken at 40°C for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • Condition-2 100 mg of the peptide-supported solid-phase resin (compounds 1-2-5 to 1-2-9 (corresponding to runs 1 to 5 in Table 6)) prepared in Example 1-2-4 was solidified.
  • the resin was swelled by placing it in a phase reaction vessel, adding DCM (1.0 mL), and allowing it to stand for 10 minutes. The solution was then drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMSO (0.7 mL per column). A DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with DMSO (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.25 mL) of Fmoc-protected amino acid (4 equivalents) and [ethylcyano(hydroxyimino)acetato-O2]tri-1-pyrrolidinylphosphonium hexafluorophosphate (PyOxim) were added to the resin obtained above.
  • a DMSO solution (0.25 mL) of 4 equivalents) and DIPEA (6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added, and the mixture was shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • Table 6 shows the amount of diketopiperazine (DKP) eliminated for each sequence and each condition.
  • the amount of the diketopiperazine (DKP) eliminated product shown in Table 6 is calculated when the UV area percentage of the target peptide (TM) and the diketopiperazine (DKP) eliminated product in LCMS is taken as 100%. , is the UV area percent of the diketopiperazine (DKP) elimination product.
  • LCMS (ESI) m/z 1055.68(M+H)+ Retention time: 3.10 minutes (Analysis conditions SQDFA05long)
  • Target peptide compound (TM), Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-MeAla-Cys(StBu)-Phe-Asp-pip(run2) (Compound 3-1-2*)
  • Target peptide compound (TM), Fmoc-Nle-Nle-MeAla(3-Pyr)-Ser(iPen)-Asp-pip(run3) (compound 3-1-3*)
  • Target peptide compound (TM), Fmoc-Nle-Nle-MePhe(3-Cl)-Ser(iPen)-Asp-pip(run4) (compound 3-1-4*)
  • LCMS (ESI) m/z 881.47(M+H)+ Retention time: 2.60 minutes (Analysis conditions SQDFA05long)
  • Example 4 In addition to the problem of diketopiperazine elimination, experimental compound 1-2-10 was confirmed for the effect of neutralization process and washing with acid in the arrangement in which a dimeric urea body is produced under the conditions of WO2022/097540. If the method of WO2022/097540 is applied to a sequence in which diketopiperazine elimination easily progresses, diketopiperazine elimination can be significantly suppressed, but on the other hand, a dimeric urea derivative derived from carbamate is generated as a new by-product. is confirmed to be generated.
  • the Fmoc-free solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 7 in the Fmoc-free solvent at the volume percent concentrations (v/v%) listed in Table 7. After draining the solution from the frit, the resin was washed 8 times with DMF in run 1 and 6 times with DMSO in run 4, each using 0.7 mL per column.
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with DMSO (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.3 mL) of Fmoc-MeAla-OH (0.6 mol/L) and Oxyma (0.375 mol/L) and a DMSO solution (10 v/v%) of DIC (10 v/v%) were added to the resin obtained above.
  • a mixed solution of 0.36 mL) was added thereto, and the mixture was shaken at 40°C for 2.5 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • the Fmoc-free solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 7 in the Fmoc-free solvent at the volume percent concentrations (v/v%) listed in Table 7. After draining the solution from the frit, the resin was washed with the washing solvents listed in Table 7 (0.7 mL per column). Multiple washing operations were performed using the same or different solvents, or in combination with acid washing, and the order and number of washings are shown in Table 7.
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed twice with DIPEA (2 equivalents) in DMSO (0.7 mL per column). Subsequently, it washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) containing HOAt (2 equivalents) and DIPEA (2 equivalents), and then washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) of DIPEA (2 equivalents). Washed 3 times.
  • DIPEA 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.25 mL) of phosphoric acid (PyOxim) (0.181 mmol, 4 equivalents) and DIPEA (0.047 mL, 0.271 mmol, 6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added. and shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • the Fmoc-free solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 7 in the Fmoc-free solvent at the volume percent concentrations (v/v%) listed in Table 7. Subsequently, as a neutralization step, 0.4 mL of a DMSO solution of HOAt (0.25 mol/L) (corresponding to approximately 2 equivalents to the peptide supported on the solid phase) was added, and the mixture was allowed to stand for an additional 5 minutes. After draining the solution from the frit, the resin was washed six times with the washing solvents listed in Table 7 (0.7 mL per column).
  • a DMSO solution (0.3 mL) of phosphoric acid (PyOxim) (0.181 mmol, 4 equivalents) and DIPEA (0.047 mL, 0.271 mmol, 6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added. and shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • a DMSO solution (0.3 mL) of phosphoric acid (PyOxim) (0.181 mmol, 4 equivalents) and DIPEA (0.047 mL, 0.271 mmol, 6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added. and shaken at room temperature for 4 hours.
  • the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried. To check the progress of the reaction, a portion of the obtained resin was taken out, swollen with DCM, and the solution was drained from the frit, followed by a TFE/DCM solution (1/1 (1/1) containing DIPEA (0.045 mol/L)). The peptide was excised using v/v)). The cut out solution was analyzed by LCMS (SQDFA05long).
  • Run 1 is the Fmoc removal step, resin washing step, and extension step that are carried out in general peptide synthesis (comparative experiment).
  • Piperidine (pip) is used as the base used in the Fmoc removal process
  • DMF is used as the solvent used in the Fmoc removal process, resin washing process, and extension process.
  • DKP diketopiperazine
  • the condensing agent was fixed in PyOxim, and the conditions of the resin washing step after the Fmoc removal step were investigated.
  • the acids and bases used in the washing with a DMSO solution containing an acid and a base, and the remaining five washes with a DMSO solution containing a base include Oxyma, 4-nitrophenol, HOOBt, triethylamine, It was confirmed that the formation of both the diketopiperazine eliminated product and the dimeric urea product could be suppressed even when 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine, and pyridine hydrochloride were used.
  • Example 4 As described above, from the results of Example 4, diketopiperazine elimination forms and The range of each process (Fmoc removal process, resin washing process, extension process) that can suppress the production of dimeric urea bodies was identified. Note that this example is a part of the present invention in suppressing the formation of diketopiperazine eliminated products and dimeric urea products, and is not limited to the combination of reaction conditions shown in Example 4.
  • Example 5 Experiment to confirm the generality of the peptide sequence for the effect of reducing diketopiperazine elimination during peptide synthesis under the conditions found in Example 4.
  • various peptides prepared in Example 1-2-4 were tested.
  • a general conventional method The amino acid described in Core 1 was extended using the method of the present invention described in Condition-1), the method of the present invention described in Example 3 (Condition-2), and the method discovered in Example 4 of the present invention (Condition-3), and diketopiperazine removal was performed.
  • the amounts of by-products derived from the dispersion and carbamate were compared.
  • run1 the amino acid described in Core1 was extended by the method described in Example 2, Table 5, and run1 as a general conventional method.
  • Example 3 Solid-phase resins supporting the peptides already prepared in Example 1-2-4 (compounds 1-2-4 to 1-2-9 and compounds 1-2-11 to 1-2-12 ( Each corresponding to run 1 to run 8 in Table 6)) 100 mg was placed in a solid phase reaction vessel, DCM (1.0 mL) was added in a nitrogen-purged glove box, and the resin was allowed to stand for 10 minutes to swell the resin. . The solution was then drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMSO (0.7 mL per column).
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed twice with DIPEA (2 equivalents) in DMSO (0.7 mL per column). Subsequently, it washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) containing HOAt (2 equivalents) and DIPEA (2 equivalents), and then washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) of DIPEA (2 equivalents). Washed 3 times.
  • DIPEA 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.25 mL) of Fmoc-protected amino acid (4 equivalents) and [ethylcyano(hydroxyimino)acetato-O2]tri-1-pyrrolidinylphosphonium hexafluorophosphate (PyOxim) were added to the resin obtained above.
  • a DMSO solution (0.25 mL) of 4 equivalents) and DIPEA (6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes, then a solution was added, and the mixture was shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • Table 8 shows the amount of diketopiperazine (DKP) eliminated for each sequence and each condition.
  • the production amount of the diketopiperazine (DKP) eliminated product shown in Table 8 is calculated by calculating the UV area percentage of the target peptide (TM), the diketopiperazine (DKP) eliminated product, and the carbamate-derived byproduct by LCMS. It is the UV area percentage of the diketopiperazine (DKP) eliminated product when the total is 100%.
  • the amount of diketopiperazine (DKP) eliminated product produced in run 1 shown in Table 8 includes the amount of the six-membered cyclic amidine skeleton structure produced.
  • Example 4 of the present invention condition-3 was more effective in elongating various peptides than the general conventional method, not only for the sequences described in Example 4. It was confirmed that there is an effect of suppressing diketopiperazine elimination products when
  • Example 5 show that the method discovered in Example 4 of the present invention has more generality when elongating not only a specific peptide sequence but also various peptides, compared to the general conventional method. It was confirmed that the formation of both diketopiperazine eliminated products and carbamate-derived byproducts could be suppressed by this method.
  • Example 6 Experiment to confirm the generality of the carboxylic acid substrate that extends the effect of reducing diketopiperazine elimination during peptide synthesis under the conditions found in Example 4.
  • the preparation was performed in Example 1-2-4.
  • the obtained peptide sequence (compound 1-2-10) was extended with various carboxylic acids described in Core 1 using the method discovered in Example 4 of the present invention (conditions-4), and diketopiperazine elimination product and dimer urea were obtained. I checked the amount my body produced.
  • Condition-4 Solid-phase resin supporting the peptide already prepared in Example 1-2-2 (0.452 mmol/g of Compound 1-2 prepared in Example 1-2-4 from Compound 1-2-2) -10) 100 mg was placed in a solid phase reaction vessel, DCM (1.0 mL) was added in a glove box purged with nitrogen, and the resin was allowed to stand for 10 minutes to swell the resin. The solution was then drained from the frit and the resin was subsequently washed twice with DMSO (0.7 mL per column).
  • DMSO solution (2 v/v%, 0.7 mL per column) of 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to remove the Fmoc group. Deprotection was performed. After draining the solution from the frit, the resin was washed twice with DIPEA (2 equivalents) in DMSO (0.7 mL per column). Subsequently, it washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) containing HOAt (2 equivalents) and DIPEA (2 equivalents), and then washed once with a DMSO solution (0.7 mL per column) of DIPEA (2 equivalents). Washed 3 times.
  • DIPEA 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • a DMSO solution (0.25 mL) of the elongating carboxylic acid (0.181 mmol, 4 equivalents) listed in Table 9 and [ethylcyano(hydroxyimino)acetato-O2]tri-1-pyrrolidium were added to the resin obtained above.
  • a DMSO solution (0.25 mL) of phosphonium hexafluorophosphate (PyOxim) (0.181 mmol, 4 equivalents) and DIPEA (0.047 mL, 0.271 mmol, 6 equivalents) were mixed and left to stand for about 1 to 2 minutes. The solution was added and shaken at room temperature for 4 hours. After draining the solution from the frit, the resin was washed four times with DMF (0.7 mL per column) and four times with DCM (0.7 mL per column) and dried.
  • Table 9 shows the amount of diketopiperazine elimination product (TM-DKP) and dimeric urea product produced for each sequence.
  • the production amounts of diketopiperazine (DKP) eliminated products and dimeric urea products shown in Table 9 are determined by the UV area percentage of the target peptide (TM) and diketopiperazine (DKP) eliminated products and dimeric urea products in LCMS. This is the UV area percentage of the diketopiperazine (DKP) eliminated product and the dimeric urea product when the sum of 100% is taken as 100%.
  • LCMS (ESI) m/z 947.60(M+H)+ Retention time: 2.99 minutes (Analysis conditions SQDFA05long)
  • Target peptide compound (TM), Boc-MeAla-1-ACPrC-MeAla-Tyr (tBu)-Asp-pip (run2) (compound 6-1-2*)
  • Target peptide compound (TM), Cbz-Pro-1-ACPrC-MeAla-Tyr (tBu)-Asp-pip (run3) (compound 6-1-3*)
  • Target peptide compound (TM), Ac-1-ACPrC-MeAla-Tyr(tBu)-Asp-pip (run4) (compound 6-1-4*)
  • Target peptide compound (TM), Ns-Aib-1-ACPrC-MeAla-Tyr (tBu)-Asp-pip (run6) (compound 6-1-6*)
  • Example 7 Confirmation of the presence of carbamate in the Fmoc removal process and confirmation of its influence on diketopiperazine elimination The compounds described in the examples are shown in the table below.
  • NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
  • ROESY Rotating Coordinate System Overhauser Effect
  • NOESY Nuclear Overhauser Effect
  • HSQC Heterogeneous Nuclear Single Quantum Correlation
  • HMBC Heterogeneous Nuclear Multiple Bond Correlation cpd.: Compound
  • NMR measurements were performed at 298K using AVANCE III 600 Cryo-TCI or AVANCE III HD 600 BBFO manufactured by Bruker.
  • a base with any of the nitrogen atoms protonated can serve as a cation source.
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • the following three may be the cation source, but in this specification, any of the cations corresponds to Even if a salt is formed with an anion, the salts will be referred to as DBU salts without distinction ( Figure 1).
  • TMG 1,1,3,3-tetramethylguanidine
  • HP1(dma) iminotris(dimethylamino)phosphoorane
  • TMG salt HP1(dma) salt
  • MTBD salt MTBD salt
  • Example 7-1 Confirmation of the presence of DBU ⁇ HOCO-Phe-NMe 2 when compound 1-4-1 was treated with DBU
  • Example 7-1-1 Compound 1-4-1 (12.9 mg) produced when compound 1-4-1 was treated with DBU in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution , 0.031 mmol) in N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) ( 0.5 mL) (Fig. 1-b)). After adding -diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) (5.11 ⁇ L, 0.034 mmol) and stirring vigorously, 1 H-NMR (Fig. 1-a)), 1D-ROESY ((Fig.
  • Example 7-1-2 Identification of compound 1-4-3a produced when DBU is applied to compound 1-4-2 by spraying 13 CO 2
  • the following in Example 7-1-2 All experimental operations were performed in a glove box (under nitrogen atmosphere, under dehydration conditions).
  • N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) which was dried for 12 hours or more with MS4A activated by heating to a high temperature in a microwave and then cooling under vacuum (x2), was used as a solvent.
  • NMR was measured using a sample that was sampled in a highly airtight NMR tube with a valve inside a glove box and completely blocked from contact with the outside air.
  • DBU 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene
  • Example 7-1-3 Structural proof of compound 1-4-3a present in solution A + solution B (SolA + SolB)
  • the following experimental operations described in Example 7-1-3 were all conducted in a glove box ( The test was carried out under nitrogen atmosphere under dehydration conditions).
  • N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) which was dried for 12 hours or more with MS4A activated by heating to a high temperature in a microwave and then cooling under vacuum (x2), was used as a solvent.
  • NMR was measured using a sample that was sampled in a highly airtight NMR tube with a valve inside a glove box and completely blocked from contact with the outside air.
  • the peak on the low-field side (the circled peak in Figure 6-b), where the coupling of the 1 H signal with 13 C (2.7 Hz) at 83 ppm can be recognized, is the result of mixing solution B and solution A. It was confirmed that the peaks shifted from each other and were converted into intermediate broad-shaped peaks (the peaks circled in ( Figure 6-b)). From these results, the 1 H signal confirmed the presence of compound 1-4-3a in (SolB).
  • Example 7-2 Confirmation of the presence of carbamate when compound 1-4-1 is treated with DBU or piperidine in various solvents
  • Basic operations Compound 1-4-1 (about 25 mg) in a heavy solvent solution (1.25 mL, tetrahydrofuran-d8 (THF-d8) [Entry 1], toluene-d8 [Entry 2], dichloromethane-d2 (DCM-d2) [Entry 3] ], N,N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) [Entry 4], dimethyl sulfoxide-d6 (DMSO-d6) [Entry 5], and then divide 1.0 mL of the solution into two (0.5 mL).
  • Table 12 shows that when run 1 (2% DBU) and run 2 (20% piperidine) are compared, the diketopiperazine eliminated product and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure when treated with DBU.
  • run 1 20% DBU
  • run 2 20% piperidine
  • Example 7-3 Confirmation of the presence of compound 1-4-3a when compound 1-4-1 was treated with various bases in DMSO Basic operation After preparing five solutions (0.5 mL) of compound 1-4-1 (about 10 mg, 0.24 mmol) in dimethyl sulfoxide-d6 (DMSO-d6), piperidine (67.5 ⁇ L, Entry 1), 1,1 , 3,3-tetramethylguanidine (TMG) (13.5 ⁇ L, Entry 2), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU) (6.8 ⁇ L, Entry 3), 7-methyl- 1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene (MTBD) (13.5 ⁇ L, Entry 4), iminotris(dimethylamino)phosphoolane (HP1 (dma)) (13.5 ⁇ L, Entry 5) ), each of the five bases was acted on, the NMR of each was measured, and the ratio of compound 1-4-3a and compound 1-4-2 was
  • Example 8 Experiment to confirm the effect of reducing diketopiperazine elimination during peptide synthesis using the liquid phase method under the conditions found.
  • the Fmoc-protected amino acids listed in Table 14 were extended using the method of the present invention (conditions-X), and the amounts of diketopiperazine elimination products and dimeric urea products produced in the liquid phase method were confirmed.
  • Condition-X DBU (0.0091 mL, 0 .061 mmol, 1 equivalent) was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes.
  • Table 14 shows the amount of diketopiperazine eliminated product (TM-DKP) produced for each peptide sequence.
  • the production amount of the diketopiperazine eliminated product (TM-DKP) shown in Table 14 is calculated by adding up the UV area percentage of the target peptide (TM) and the diketopiperazine eliminated product (TM-DKP) by LCMS to 100. UV area percentage of diketopiperazine elimination product (TM-DKP) as a percentage.
  • LCMS (ESI) m/z 1069.97(M+H)+ Retention time: 3.35 minutes (Analysis conditions SQDFA05long)
  • Target peptide compound (TM), Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-MeAla-Cys(StBu)-Phe-Asp(OMe)-pip(run2) (Compound 8-1-2)
  • Example 8 From the results of Example 8, it was confirmed that the method of the present invention can suppress the formation of diketopiperazine elimination products and synthesize the target peptide even in liquid phase peptide synthesis.
  • the present invention it has been found that in the production of peptides, the formation of by-products such as diketopiperazine and 6-membered cyclic amidine skeleton structures can be suppressed, and peptide chains can be efficiently extended.
  • the present invention is useful in the field of peptide synthesis.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

ペプチドの合成においては、Ｎ末端の保護基を除去する際に形成されるジケトピペラジン、および６員環状アミジン骨格構造体に起因して、所望の伸長反応が進行しないという課題がある。本発明者らは、ペプチドの製造において、特定の溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いてＦｍｏｃ骨格を有する保護基にてＮ末端のアミノ基が保護されたペプチドを処理し、次いで、ペプチド鎖の伸長を行うことで、上記の課題を解決できることを見出した。

Description

ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
　本発明は、ペプチドの合成において、高純度かつ高効率にて合成することが可能なペプチドの新規な合成方法に関する。
　ペプチド合成においてＦｍｏｃ法は、その信頼性と温和な脱保護条件（脱Ｆｍｏｃ条件）から、広く適用されている方法である。また、近年、Ｎ－メチルアミノ酸などのＮ－アルキルアミノ酸を多く含むペプチドの医薬品への応用がさかんに研究されているが、このような分子種の酸不安定性が知られている（非特許文献１、特許文献１）。そのため、これらの文献では、Ｎ末端の脱保護として酸性条件が必要となるＢｏｃ法ではなく、塩基性条件での脱保護が可能なＦｍｏｃ法が採用されている。
　ペプチド合成におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）形成は、古くから認知されている問題である。ジケトピペラジン形成は、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドのＮ末端の保護基が除去されて、遊離のアミノ基が露出した場合に起こりうる。Ｆｍｏｃ法を利用したペプチド合成において、このジケトピペラジン形成の問題の改善に向けたいくつかのアプローチが報告されてきた。
　具体的には、ジケトピペラジン形成を起こしやすい箇所の保護基として、塩基を用いずに、中性条件下で脱保護反応が進行するＡｌｌｏｃ基を用いることで、ジケトピペラジン形成を抑制する方法が知られている（非特許文献２）。
　また、ジケトピペラジン形成が進行しやすい箇所にてＮ末端が遊離のアミノ基となる機会を回避すべく、そのような配列を含むジペプチドをあらかじめ合成し、それを用いてペプチド鎖を伸長する方法が知られている（非特許文献３）。
　さらには、Ｆｍｏｃの脱保護の際に一般的に広く用いられているピペリジンの替わりに、より強い塩基であるＤＢＵやＴＢＡＦを用いて、脱保護にかかる時間を極めて短時間とすることで、ジケトピペラジン形成を抑制する方法が知られている（非特許文献４）。
　これらの方法はいずれも、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドのジケトピペラジン形成に対する対応策である。
国際公開番号 WO 2018/225851 A1
J. Peptide Res., 2005, 65, 153-166. Org. Lett., 2012, 14, 612-615. Bachem社公開 Solid Phase Peptide Synthesis（https://www.bachem.com/fileadmin/user_upload/pdf/Catalogs_Brochures/Solid_Phase_Peptide_Synthesis.pdf） Org. Lett., 2008, 10, 3857-3860.
　上述のとおり、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドは、そのエステル結合が切断されることでジケトピペラジンが形成されることが知られていた一方で、ペプチド配列中にＮ－置換アミノ酸を含む場合には、エステル結合より強固なアミド結合が切断される形でジケトピペラジンが形成されて、ペプチド配列からＮ－置換アミノ酸を含むジペプチドが脱落することがある。この脱落は、ペプチド配列中のＮ－置換アミノ酸が存在する任意の場所で発生し得るため、固相上に担持されたジペプチドに限らず発生し得ることが分かってきた。
　さらに本発明者らは、ペプチド配列中にＮ－置換アミノ酸が含まれる場合には、ジケトピペラジン形成の問題に加え、所望の伸長反応が進行せずに、目的物に代えてＮ末端に６員環状のアミジン骨格を有する不純物（６員環状アミジン骨格構造体）が形成されるという問題があることを明らかにした。これらの課題を解決する方法についてはこれまで報告されていない。
　固相に担持されたジペプチドのエステル結合において進行するジケトピペラジン脱離だけでなく、アミド結合において進行するジケトピペラジン脱離と、上記６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制するために、上述の従来技術を適用することが考えられる。しかしながら、その適用範囲には制限があり、これらは十分な解決策を提供できるものであるとはいえない。
　例えば、非特許文献２に記載の方法では、入手性の観点でＦｍｏｃアミノ酸と比較して一般性の劣るＡｌｌｏｃアミノ酸を必要とする。
　また、非特許文献３に記載のジペプチドを用いたペプチド鎖の伸長方法では、ジペプチドのＣ末端側のアミノ酸のラセミ化が進行する懸念がある。そのため、ジペプチドフラグメントのＣ末端側のアミノ酸がアキラルな場合（例えば、グリシン）か、ラセミ化が進行しにくい場合（例えば、プロリン）のような場合を除いて、この文献に記載の方法を適用することは難しい。
　さらに、非特許文献４に記載の方法は、脱Ｆｍｏｃ工程に要する時間を非常に短時間にすることを特徴とし、１分以内、例えば、１０秒～２０秒での脱Ｆｍｏｃ工程と固相洗浄操作を必要とする。工業化をはじめとしたスケールアップ合成にこのような極端な短時間での操作を適用することは不可能である。
　さらに本発明者らは、ジケトピペラジン形成および／または６員環状アミジン骨格構造体形成の問題に加え、ダイマーウレア体の不純物が形成されるという問題があることを明らかにした。このダイマーウレア体の形成という課題を解決する方法についてはこれまで報告されていない。
　以上のとおり、いまだかつて実用的なジケトピペラジン抑制の方法論は提示されていない。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、一局面において、本発明は、ジケトピペラジンの形成を抑制可能なペプチド合成方法であって、（i）Ｎ末端の保護基としてＦｍｏｃ骨格を含む保護基を用い、（ii）ラセミ化の観点からの配列上の適用制限がなく、（iii）工業化等のスケールアップ合成が可能な方法を提供することを課題とする。また、一局面において、本発明は、６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制可能なペプチド合成方法を提供することを課題とする。さらに、一局面において、本発明は、ダイマーウレア体の形成を抑制可能なペプチド合成方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、ペプチドの製造において、特定の溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いてＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するペプチドを処理し、続いて、酸クロリドや縮合剤を用いて発生させた活性エステルといった伸長活性種を該ペプチドと反応させることで、該保護基の除去からペプチド鎖の伸長に至るまで、ジケトピペラジン、６員環状アミジン骨格構造体、および／またはダイマーウレア体の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を含む。
〔０－１〕ペプチドの製造方法であって、
(1) Fmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
〔０－２〕ペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) Fmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
〔０－３〕ペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物、６員環状アミジン骨格構造体不純物、およびダイマーウレア体不純物からなる群より選択される少なくとも１種の不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) Fmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
〔０－４〕(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程をさらに含む、〔0-2〕または〔0-3〕に記載の方法。
〔０－５〕固相法により行われる、〔0-1〕～〔0-4〕のいずれかに記載の方法。
〔０－６〕前記第一のペプチドが、固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドである、〔0-1〕～〔0-4〕のいずれかに記載の方法。
〔０－７〕液相法により行われる、〔0-1〕～〔0-4〕のいずれかに記載の方法。
〔１〕固相法によるペプチドの製造方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
〔２〕固相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
〔２－１〕固相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物、６員環状アミジン骨格構造体不純物、およびダイマーウレア体不純物からなる群より選択される少なくとも１種の不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
〔３〕(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程をさらに含む、〔2〕に記載の方法。
〔４〕前記工程(2)が、前記第一のペプチドにおけるFmoc骨格を含む保護基を除去する工程である、および／または前記第一のペプチドにおけるFmoc骨格を含む保護基をカルバミン酸塩の形態に変換する工程である、〔0-1〕～〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記第一のペプチドにおけるFmoc骨格を含む保護基を除去する工程が、実質的に前記工程(2)のみで行われる、〔0-1〕～〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記工程(2)に先立って、前記第一のペプチドを単一の塩基としてのピペリジンで処理する工程を含まない、〔0-1〕～〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記工程(2)に先立って、前記第一のペプチドを共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23未満である単一の塩基で処理する工程を含まない、〔0-1〕～〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記工程(2)における前記溶媒が、固相樹脂の膨潤能が1.5mL/g以上、2.0mL/g以上、2.5mL/g以上、3.0mL/g以上、3.5mL/g以上、または4.0mL/g以上の溶媒である、〔0-1〕～〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記工程(2)により得られる第一のペプチドの少なくとも一部が、カルバミン酸塩の形態にある、〔0-1〕～〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記カルバミン酸塩が、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基との塩である、〔9〕に記載の方法。
〔１１〕前記カルバミン酸塩が、アミジン類、グアニジン類およびホスファゼン類からなる群より選択される少なくとも１種の塩基との塩である、〔9〕または〔10〕に記載の方法。
〔１２〕前記カルバミン酸塩が、ＤＢＵ塩、ＴＭＧ塩、ＨＰ１（ｄｍａ）塩、ＭＴＢＤ塩、Ｐ１－ｔＢｕ塩、またはＰ２－Ｅｔ塩である、〔9〕～〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記工程(2)において、カルバミン酸塩と、さらに脱炭酸が進行して生じるアミン体のモル比（カルバミン酸塩／アミン体）が、０．６以上、０．８以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、４．６以上、５．０以上、６．０以上、８．０以上、または１０．０以上である、〔9〕～〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１３－１〕前記工程(2)において、１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた、カルバミン酸塩と、さらに脱炭酸が進行して生じるアミン体のモル比（カルバミン酸塩／アミン体）が、０．６以上、０．８以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、４．６以上、５．０以上、６．０以上、８．０以上、または１０．０以上である、〔9〕～〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記工程(2)における前記溶媒が、スルホキシド系溶媒を50v/v%以上含む、〔0-1〕～〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記工程(2)における前記溶媒が、スルホキシド系溶媒を70v/v%以上含む、〔0-1〕～〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記工程(2)における前記溶媒が、スルホキシド系溶媒を90v/v%以上含む、〔0-1〕～〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕前記工程(2)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、リン酸エステル系溶媒、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、およびスルホン系溶媒より選択される１種または複数種をさらに含む、〔0-1〕～〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記工程(2)における前記溶媒が、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、およびスルホン系溶媒より選択される１種または複数種をさらに含む、〔0-1〕～〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記工程(2)における前記溶媒が、スルホキシド系溶媒からなる、〔0-1〕～〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記スルホキシド系溶媒が、ＤＭＳＯ、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、およびメチルフェニルスルホキシドからなる群より選択される１種または複数種である、〔0-1〕～〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記スルホキシド系溶媒が、ＤＭＳＯである、〔0-1〕～〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕前記工程(2)における前記塩基が、アミジン類、グアニジン類およびホスファゼン類からなる群より選択される少なくとも１種である、〔0-1〕～〔21〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕前記工程(2)における前記塩基が、DBU、MTBD、TMG、P1tBu、P2EtおよびHP1(dma)からなる群より選択される少なくとも１種である、〔0-1〕～〔22〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕前記工程(2)における前記塩基が、DBU、MTBD、TMG、P1tBu、P2EtまたはHP1(dma)である、〔0-1〕～〔23〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕前記工程(2)における前記塩基が、(i) DBUとピペリジンとの組み合わせ、または(ii) DBUとMTBD、HP1(dma)、P1tBu、もしくはP2Etとの組み合わせである、〔0-1〕～〔23〕のいずれかに記載の方法。
〔２５－１〕前記工程(2)における前記溶媒がＤＭＳＯであり、前記塩基がDBUである、〔0-1〕～〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔２５－２〕前記工程(2)における前記溶媒がＤＭＳＯであり、前記塩基がTMGである、〔0-1〕～〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔２５－３〕前記工程(2)における前記溶媒がＤＭＳＯであり、前記塩基がDBUとピペリジンとの組み合わせである、〔0-1〕～〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕前記工程(2)における前記塩基が、前記溶媒中に1～8v/v%の濃度で含まれる、〔0-1〕～〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔２７〕前記工程(2)が、前記溶媒にＣＯ２を接触させる工程をさらに含む、〔0-1〕～〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔２８〕前記工程(2)が、前記溶媒にＣＯ２をバブリングさせる工程をさらに含む、〔1〕～〔27〕のいずれかに記載の方法。
〔２９〕前記工程(2)における前記溶媒が、事前にＣＯ２を接触させた溶媒である、〔0-1〕～〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔３０〕前記工程(2)における前記溶媒が、事前にＣＯ２をバブリングさせた溶媒である、〔0-1〕～〔26〕のいずれかに記載の方法
〔３１〕前記工程(2)を複数回繰り返す、〔0-1〕～〔30〕のいずれかに記載の方法。
〔３２〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において同じ溶媒が用いられる、〔31〕に記載の方法。
〔３３〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において異なる溶媒が用いられる、〔31〕に記載の方法。
〔３４〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において同じ塩基が用いられる、〔31〕～〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔３５〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において異なる塩基が用いられる、〔31〕～〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔３６〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回の間に溶液を排出する工程をさらに含む、〔31〕～〔35〕のいずれかに記載の方法。
〔３７〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸であるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の酸ハロゲン化物であり、該C1-C8アルキルカルボン酸およびC6-C10アリールカルボン酸は、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、ジアルキルアミノ、シアノ、アルコキシカルボニル、およびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔36〕のいずれかに記載の方法。
〔３８〕前記保護基が、カルバメート系保護基、スルホニル系保護基、またはアシル系保護基である、〔37〕に記載の方法。
〔３９〕前記カルバメート系保護基が、Fmoc骨格を含む保護基、Alloc、Teoc、Boc、またはCbzであり、前記スルホニル系保護基がNsであり、アシル系保護基がTfaである、〔38〕に記載の方法。
〔４０〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸であるか、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物であり、該C1-C8アルキルカルボン酸およびC6-C10アリールカルボン酸は、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、およびハロゲンからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、〔37〕に記載の方法。
〔４１〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、およびハロゲンからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されてもよいC1-C8アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である、〔37〕に記載の方法。
〔４２〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、C1-C8アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である、〔37〕に記載の方法。
〔４３〕前記第一のペプチドが２～３０個、２～２０個、２～１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸残基を含む、〔0-1〕～〔42〕のいずれかに記載の方法。
〔４４〕前記第一のペプチドがジペプチドである、〔0-1〕～〔43〕のいずれかに記載の方法。
〔４５〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および／または前記保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のN-置換アミノ酸を含む、および／または前記保護基を有するアミノ酸がN-置換アミノ酸である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔44〕のいずれかに記載の方法。
〔４６〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、またはFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、またはFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および／または前記Fmoc骨格を含む保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のN-置換アミノ酸を含む、および／または前記Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸がN-置換アミノ酸である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔45〕のいずれかに記載の方法。
〔４７〕前記第一のペプチドのN末端から２残基目のアミノ酸が、N-置換アミノ酸である、〔0-1〕～〔46〕のいずれかに記載の方法。
〔４８〕前記N-置換アミノ酸がN-アルキルアミノ酸である、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔４９〕前記N-置換アミノ酸がN-C1-C6アルキルアミノ酸である、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔５０〕前記N-置換アミノ酸がN-メチルアミノ酸である、〔46〕または〔47〕に記載の方法。
〔５１〕前記工程(3)における前記縮合剤が、塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがPF6 -またはBF4 -であるか、またはカルボジイミド系縮合剤である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔50〕のいずれかに記載の方法。
〔５２〕前記工程(3)における前記縮合剤が塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがPF6 -またはBF4 -である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔51〕のいずれかに記載の方法。
〔５３〕前記工程(3)における前記縮合剤が、PyOxim、PyAOP、PyBOP、COMU、HATU、HBTU、HCTU、TDBTU、HOTU、TATU、TBTU、TCTU、およびTOTUからなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔52〕に記載の方法。
〔５４〕前記工程(3)における前記縮合剤が、PyOxim、PyAOP、PyBOP、COMU、HATU、HBTU、HCTU、TDBTU、HOTU、TATU、TBTU、TCTU、またはTOTUである、〔52〕または〔53〕に記載の方法。
〔５５〕前記工程(3)が塩基の存在下で行われる、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔54〕のいずれかに記載の方法。
〔５６〕前記工程(3)が、共役酸の水中でのpKaが5～12の塩基の存在下で行われる、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔55〕のいずれかに記載の方法。
〔５７〕前記工程(3)における前記塩基がDIPEAである、〔55〕または〔56〕に記載の方法。
〔５８〕前記工程(3)における前記縮合剤がカルボジイミド系縮合剤である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔51〕のいずれかに記載の方法。
〔５９〕前記カルボジイミド系縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド（ｔＢＥＣ）、ジｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド（ＤｔＢＣ）、および１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群より選択される少なくとも１種である、〔58〕に記載の方法。
〔６０〕前記カルボジイミド系縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）である、〔58〕または〔59〕に記載の方法。
〔６１〕前記工程(3)が添加剤の存在下で行われる、〔1〕、〔51〕および〔58〕～〔60〕のいずれかに記載の方法。
〔６２〕前記添加剤が、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、およびＯｘｙｍａ－Ｂからなる群より選択される少なくとも１種である、〔61〕に記載の方法。
〔６３〕前記添加剤が、ＨＯＡｔまたはＯｘｙｍａである、〔62〕に記載の方法。
〔６４〕前記Fmoc骨格を含む保護基が、下記式(1)で表される、〔0-1〕～〔63〕のいずれかに記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、
　R1～R8は、独立して、水素、C1-C8アルキル、C1-C8フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、
　R9～R10は、独立して、水素またはメチルである）。
〔６５〕前記Fmoc骨格を含む保護基がFmoc基、Fmoc(2,7tb)基、Fmoc(1Me)基、Fmoc(2F)基、Fmoc(2,7Br)基、mio-Fmoc基、dio-Fmoc基、tdf-Fmoc基、Fmoc(2TMS)基、Fmoc(2so3h)基、sm-Fmoc基、またはrm-Fmoc基である、〔64〕に記載の方法。
〔６６〕前記Fmoc骨格を含む保護基がFmoc基である、〔65〕に記載の方法。
〔６７〕前記工程(2)と前記工程(3)の間に前記工程(2)における混合物を処理する工程（処理工程）をさらに含む、〔0-1〕、〔0-3〕～〔0-6〕および〔3〕～〔66〕のいずれかに記載の方法。
〔６７－１〕前記処理工程が、前記混合物に酸または塩を接触させる工程である、〔67〕に記載の方法。
〔６７－２〕前記処理工程が、前記混合物に酸または塩を含むスルホキシド系溶媒の溶液を添加する工程である、〔67〕に記載の方法。
〔６７－３〕前記処理工程が、前記混合物に酸または塩を含むＤＭＳＯ溶液を添加する工程である、〔67〕に記載の方法。
〔６８〕前記処理工程が、固相合成用樹脂を洗浄する工程である、〔67〕に記載の方法。
〔６８－１〕前記洗浄する工程が、スルホキシド系溶媒を含む溶媒で洗浄する工程を含む、〔68〕に記載の方法。
〔６８－２〕前記洗浄する工程が、ＤＭＳＯを含む溶媒で洗浄する工程を含む、〔68〕に記載の方法。
〔６８－３〕前記洗浄する工程が、ＤＭＳＯで洗浄する工程を含む、〔68〕に記載の方法。
〔６８－４〕前記洗浄する工程が、塩基を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程を含む、〔68〕に記載の方法。
〔６８－５〕前記洗浄する工程が、塩基を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する工程を含む、〔68〕に記載の方法。
〔６８－６〕ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、および２，４，６－トリメチルピリジンからなる群より選択される少なくとも１種である前記塩基を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する工程を含む、〔68－4〕および〔68－5〕のいずれかに記載の方法。
〔６８－７〕前記洗浄する工程が、２回、３回、４回、５回、または６回行われる、〔68－1〕～〔68－6〕のいずれかに記載の方法。
〔６８－８〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、酸または塩を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程を含む、〔68〕～〔68－7〕のいずれかに記載の方法。
〔６８－８－１〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、酸を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程を含む、〔68－8〕に記載の方法。
〔６８－８－２〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、酸を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する工程を含む、〔68－8〕に記載の方法。
〔６８－８－３〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、塩を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程を含む、〔68－8〕に記載の方法。
〔６８－８－４〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、塩を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する工程を含む、〔68－8〕に記載の方法。
〔６８－９〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、酸および塩基を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程を含む、〔68〕～〔68－7〕のいずれかに記載の方法。
〔６８－１０〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄において、酸および塩基を含むＤＭＳＯ溶液で洗浄する工程を含む、〔68〕～〔68－7〕のいずれかに記載の方法。
〔６８－１１〕前記洗浄する工程における、１または複数回の洗浄が、１回の洗浄である、〔68－8〕～〔68－11〕のいずれかに記載の方法。
〔６９〕前記酸が、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、および塩酸からなる群より選択される少なくとも１種である、〔67－1〕～〔68－3〕および〔68－8〕～〔68－11〕のいずれかに記載の方法。
〔６９－１〕前記酸が、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、およびＨＯＯＢｔからなる群より選択される少なくとも１種である、〔67－1〕～〔68－3〕および〔68－8〕～〔68－11〕のいずれかに記載の方法。
〔６９－２〕前記塩が、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、および塩酸からなる群より選択される酸と、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、およびピリジンからなる群より選択される塩基からなる塩である、〔67－1〕～〔68－3〕および〔68－8〕～〔68－11〕のいずれかに記載の方法。
〔６９－３〕前記塩が、ピリジン塩酸塩である、〔67－1〕～〔68－3〕および〔68－8〕～〔68－11〕のいずれかに記載の方法。
〔６９－４〕前記塩基が、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、およびピリジンからなる群より選択される少なくとも１種である、〔68－9〕または〔68－10〕に記載の方法。
〔７０〕前記洗浄する工程が、
i) 事前にＣＯ２を接触させた溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、および／または
ii) 事前にＣＯ２を接触させていない溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、
を含む、〔68〕に記載の方法。
〔７１〕前記洗浄する工程が、
i) 事前にＣＯ２をバブリングさせた溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、および/または
ii) 事前にＣＯ２をバブリングさせていない溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、
を含む、〔68〕に記載の方法。
〔７２〕前記工程(3)における前記溶媒が、前記工程(2)における前記溶媒と同じである、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔71〕のいずれかに記載の方法。
〔７３〕前記工程(3)における前記溶媒が、前記縮合剤が溶解可能な溶媒である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔72〕のいずれかに記載の方法。
〔７４〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔73〕のいずれかに記載の方法。
〔７５〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を50v/v%以上含む、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔73〕いずれかに記載の方法。
〔７６〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を70v/v%以上含む、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔73〕のいずれかに記載の方法。
〔７７〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を90v/v%以上含む、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔73〕のいずれかに記載の方法。
〔７８〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種からなる、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔77〕のいずれかに記載の方法。
〔７９〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒である、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔78〕のいずれかに記載の方法。
〔８０〕前記芳香族炭化水素系溶媒が、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼンアニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、およびクメンからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記ハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および四塩化炭素からなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記エーテル系溶媒が、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、１，３－ジオキソラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジグリム、トリグリム、およびテトラグリムからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記アミド系溶媒が、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＮＥＰ、ＮＢＰ、およびホルムアミドからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記スルホキシド系溶媒が、ＤＭＳＯ、およびメチルフェニルスルホキシドからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記スルホン系溶媒が、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、およびエチルイソプロピルスルホンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ウレア系溶媒が、ＤＭＩ、およびＤＭＰＵからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記エステル系溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、酢酸ブチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、およびγ－バレロラクトンからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記ケトン系溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、ジエチルケトン、およびシクロペンタノンからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記カーボネート系溶媒が、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、およびジブチルカーボネートからなる群より選択される１種または複数種であり、
　前記リン酸エステル系溶媒が、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、およびリン酸トリブチルからなる群より選択される１種または複数種である、〔74〕～〔79〕のいずれかに記載の方法。
〔８１〕前記工程(3)に用いられるカルボン酸がFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸または第二のペプチドであり、該アミノ酸または第二のペプチドが有するFmoc骨格を含む保護基が、前記工程(1)で用いられる第一のペプチドが有するFmoc骨格を含む保護基と同一であるか、または異なる、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔80〕のいずれかに記載の方法。
〔８２〕前記工程(3)に用いられるカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、またはC6-C10アリールカルボン酸の酸ハロゲン化物であり、該Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸のカルボキシル基、該Fmoc骨格を含む保護基を有する第二のペプチドのC末端のカルボキシル基、該C1-C8アルキルカルボン酸のカルボキシル基、またはC6-C10アリールカルボン酸のカルボキシル基が酸ハロゲン化物基に変換されている、〔0-1〕、〔0-4〕～〔0-6〕および〔3〕～〔81〕のいずれかに記載の方法。
　〔１〕～〔８２〕は、固相法によるペプチドの製造方法であるが、これらの方法は、液相法によるペプチドの製造方法にも適用することができる。すなわち、本発明の一局面は、以下の〔８３〕～〔８４－１〕を提供する。〔８３〕～〔８４－１〕は、〔３〕～〔８２〕のうち固相法による製造方法に固有の特徴以外の特徴を含むものであってもよい。
〔８３〕液相法によるペプチドの製造方法であって、
(1) Fmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
〔８４〕液相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
〔８４－１〕液相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物、６員環状アミジン骨格構造体不純物、およびダイマーウレア体不純物からなる群より選択される少なくとも１種の不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
　かかる方法によれば、高効率で、目的のペプチドを得ることができる。
　本発明によれば、ペプチド合成において、従来の条件では、ジケトピペラジン形成および／または６員環状アミジン骨格構造体の形成に起因して、所望の伸長反応が十分に進行しないアミノ酸配列を含む場合にあっても、このような不純物の形成を著しく低減できることから、効率的にペプチド鎖を伸長させて、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。本発明の方法は、一般性の低いＡｌｌｏｃ等の特別な保護基を用いる必要がなく、極端に短い反応時間に対応するといった反応操作上の制限もないため、汎用性が高く、スケールアップも可能な実用的な合成方法となり得る。
図１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中でＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２（化合物１－４－１）に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させた前後での３．６－６．８ｐｐｍの間の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示し、この範囲に観測される化合物１－４－１および、化合物１－４－２、化合物１－４－３ａ、ジベンゾフルベンの特徴的な１Ｈシグナルを示す図である。図１中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図１中、ｂ）は、化合物１－４－１のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて生じた化合物１－４－２と化合物１－４－３ａが化学交換を起こしており、その比率が８２：１８であることを示す５．４－３．５ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの図である。図２中、ａ）－１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２中、ａ）－２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の４．８２ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＲＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図２中、ａ）－３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＲＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図２中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルと３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比を示した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 図３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－４－２が生じたことを示す５．２－３．５ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）－１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中での化合物１－４－２の標品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）－２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）－３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－４－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）－４は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－４－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図３中、ａ）－５は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－４－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図３中、ｂ）はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－４－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．８４ｐｐｍのプロトンシグナルと３．９５ｐｐｍのシグナルの積分値を図り、その積分値をもとに溶液中の化合物１－４－３と化合物１－４－２の存在比を算出した図である。 図４は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－４－３ａが生じたことを示す５．１－３．７ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲおよび１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中での化合物１－４－２の標品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｂ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｃ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の４．７７ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ｄ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせ得られる溶液の３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ｅ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｆ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせ後の４．７７ｐｐｍの１Ｈシグナルと３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比を示した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの図である。図４中、ｅ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルを拡大した図である。なお分解能向上のため、この図だけウィンドウ関数としてSin-bellを用いて変換した。 図５は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－４－３ａが生じたことを示す１６４－１２４ｐｐｍ付近の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図５中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図５中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図６は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ、ＳｏｌＢ）に化合物１－４－３ａが存在することを示す６．９－３．６ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ｃ）は、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図７は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液に、化合物１－４－３ａが存在すること示すＮＨ－ＨＳＱＣ（１５Ｎ［Ｆ１］：９７－８５ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：５．７－４．７ｐｐｍ付近），ＮＨ－ＨＭＢＣ（１５Ｎ［Ｆ１］：１０１－８３ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：３．０４－２．６４ｐｐｍ付近），ＣＨ－ＨＭＢＣ（１３Ｃ［Ｆ１］：１６５－１５８ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：５．７－４．５ｐｐｍ付近）スペクトルを示す図である。図７中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＮＨ－ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。図７中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＮＨ－ＨＭＢＣスペクトルを示す図である。図７中、ｃ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＣＨ－ＨＭＢＣスペクトルを示す図である。 図８は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－４－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液に存在する化合物１－４－３ａのカルバマート部位の１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎシグナルすべてを同定したことを示す図である。
（用語の定義）
　本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する基である。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ１－Ｃ２０、以下「Ｃｐ－Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ１－Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１－Ｃ６アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルケニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルキニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロシクリル」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の環状の１価の基を意味する。ヘテロシクリルは、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは４～１０であり（４～１０員ヘテロシクリル）、より好ましくは４～７である（４～７員ヘテロシクリル）。ヘテロシクリルとしては具体的には、たとえば、アゼチジニル、オキシラニル、オキセタニル、アゼチジニル、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピリミジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、１，２－チアジナン、チアジアゾリジニル、アゼチジニル、オキサゾリドン、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリル、ジオキソラニル、ジオキサニル、テトラヒドロピロロ[１,２－ｃ]イミダゾール、チエタニル、３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、３－オキサ－８－アザビシクロ[３．２．１]オクタニル、スルタム、２－オキサスピロ[３．３]ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ１－Ｃ６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルケニルオキシ」とは、前記定義の「アルケニル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルオキシが挙げられる。アルケニルオキシとして具体的には、たとえば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－プロペニルオキシ、１－ブテニルオキシ、２－ブテニルオキシ（シス、トランスを含む）、３－ブテニルオキシ、ペンテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールオキシ」とは、前記定義の「アリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールオキシが挙げられる。アリールオキシとして具体的には、たとえば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリールオキシ」とは、前記定義の「ヘテロアリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくは５～１０員ヘテロアリールオキシが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「環状アミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する基を意味し、好ましくは、４～８員環状アミノが挙げられる。環状アミノとして具体的には、たとえば、１－アゼチジル、１－ピロリジル、１－ピペリジル、１－ピペラジル、４－モルホリニル、３－オキサゾリジル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル－４－イル、３－オキサ－８－アザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イルなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素原子がハロゲンで置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ８ハロアルキルが好ましく、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキルがより好ましい。
　本明細書における「フルオロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素原子がフッ素原子で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキルが好ましい。ハロアルキルとして具体的には、たとえば、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、３，３－ジフルオロプロピル、４，４－ジフルオロブチル、５，５－ジフルオロペンチル、３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキルオキシ」とは、前記定義の「アラルキル」が結合したオキシ基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルオキシが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルオキシがより好ましい。アラルキルオキシとして具体的には、たとえば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、３－フェニルプロポキシなどが挙げられる。
　本明細書において、「ペプチド鎖」とは、１つまたはそれ以上の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合および／またはエステル結合により連結されているペプチド鎖をいう。ペプチド鎖として好ましくは、１～１５のアミノ酸残基を含むペプチド鎖であり、より好ましくは５～１２のアミノ酸残基からなるペプチド鎖である。
　本発明における「ペプチド化合物」は、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合によって連結されるペプチド化合物であれば特に限定されないが、好ましくは５～３０残基、より好ましくは８～１５残基、さらに好ましくは９～１３残基のペプチド化合物である。本発明において合成されるペプチド化合物は、１つのペプチド中に少なくとも３つのＮ置換アミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも５つ以上のＮ置換アミノ酸を含むことがより好ましい。これらのＮ置換アミノ酸は、ペプチド化合物中に連続して存在していても、不連続に存在していてもよい。本発明におけるペプチド化合物は、直鎖状でも環状でもよく、環状ペプチド化合物が好ましい。本明細書において、「ペプチド化合物」を「ペプチド」ということもある。
　本発明における「環状ペプチド化合物」は、直鎖ペプチド化合物のＮ末端側の基とＣ末端側の基とを環化することにより得ることができる環状のペプチド化合物である。環化は、アミド結合のような炭素－窒素結合による環化、エステル結合やエーテル結合のような炭素－酸素結合による環化、チオエーテル結合のような炭素－硫黄結合による環化、炭素－炭素結合による環化、あるいは複素環構築による環化など、どのような形態であってもよい。これらのうちでは、アミド結合あるいは炭素－炭素結合などの共有結合を介した環化が好ましく、側鎖のカルボン酸基とＮ末端の主鎖のアミノ基によるアミド結合を介した環化がより好ましい。環化に用いられるカルボン酸基やアミノ基等の位置は、主鎖上のものでも、側鎖上のものでもよく、環化可能な位置にあれば、特に制限されない。
　本明細書において「１つまたは複数の」とは、１つまたは２つ以上の数を意味する。「１つまたは複数の」が、ある基の置換基に関連する文脈で用いられる場合、この用語は、１つからその基が許容する置換基の最大数までの数を意味する。「１つまたは複数の」として具体的には、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい数が挙げられる。
　本明細書において「固相合成用樹脂」は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このような固相合成用樹脂として、具体的には、例えば、ＣＴＣ樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、ＳＡＳＲＩＮ樹脂、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）、４－メトキシトリチルクロリド樹脂（Ｍｍｔ）などの酸性条件で除去可能なものが挙げられる。樹脂は、用いられるアミノ酸側の官能基に合わせて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸側の官能基としてカルボン酸（主鎖カルボン酸、もしくは、ＡｓｐやＧｌｕに代表される側鎖カルボン酸）、又は、芳香環上のヒドロキシ基（Ｔｙｒに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）もしくは２－クロロトリチルクロリド樹脂（ＣＴＣ樹脂）を用いることが好ましい。アミノ酸側の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（ＳｅｒやＴｈｒに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、２－クロロトリチルクロリド樹脂（ＣＴＣ樹脂）もしくは４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）を用いることが好ましい。なお、本明細書中にて、樹脂をレジンと記載する場合もある。また、固相としてセルロースを用いることもある。また、本明細書においては、「固相」との用語を「固相合成用樹脂」と同義で用いることもある。
　樹脂を構成するポリマーの種類についても特に限定されない。ポリスチレンで構成される樹脂の場合には、１００－２００ｍｅｓｈもしくは２００－４００ｍｅｓｈのいずれを用いても良い。また、架橋率についても特に限定されないが、１％ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）架橋のものが好ましい。また、樹脂を構成するポリマーの種類として、Tentagel、またはChemmatrixが挙げられる。
　本明細書に記載の化合物の製造において、定義した基が実施方法の条件下で望まない化学的変換を受けてしまう場合、例えば、官能基の保護、脱保護等の手段を用いることにより、該化合物を製造することができる。ここで保護基の選択および脱着操作は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　本明細書において、「置換されていてもよい」という修飾語句が付与されている場合、その置換基としては、例えば、アルキル、アルコキシ、フルオロアルキル、フルオロアルコキシ、オキソ、アミノカルボニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミルなどが例示される。
　さらにこれらそれぞれに置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、ホウ素原子、ケイ素原子、又はリン原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどが例示される。
　本明細書に記載の化合物は、その塩またはそれらの溶媒和物であることができる。本明細書に記載の塩には、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが含まれる。これらの塩は、例えば、当該化合物と、酸または塩基とを接触させることにより製造される。本明細書に記載の化合物の溶媒和物とは、化合物が溶媒とともに、一つの分子集団を形成したものをさし、溶媒により形成された溶媒和物であれば特に限定されない。その例としては、水和物、アルコール和物（エタノール和物、メタノール和物、１－プロパノール和物、２－プロノール和物など）、ジメチルスルホキシドなどの単独の溶媒との溶媒和物だけでなく、化合物１分子に対して複数個の溶媒と溶媒和物を形成したもの、または化合物１分子に対して複数種類の溶媒と溶媒和物を形成したものなどが挙げられる。溶媒が水であれば水和物と言う。本発明の化合物の溶媒和物としては、水和物が好ましく、そのような水和物として具体的には１～１０水和物、好ましくは１～５水和物、さらに好ましくは１～３水和物が挙げられる。
　本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸が含まれる。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。非天然アミノ酸は特に限定されないが、β－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ－置換アミノ酸、α，α－ジ置換アミノ酸、側鎖が天然アミノ酸と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、スピロ結合したシクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、又はＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基など、または、オキソ、アミノカルボニル、ハロゲン原子などが例示される。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
　本明細書におけるハロゲン原子を含む置換基としては、ハロゲンを置換基に有するアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。
　Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシ（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、カルボキシ（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）などの基が挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。アルコキシとしては、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、Ｃ１－Ｃ２アルコキシが好ましく、なかでもメトキシ、又はエトキシが好ましい。
　カルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル（例えば、Ｃ１－Ｃ６又はＣ１－Ｃ４アルキルアミノカルボニル、なかでもエチルアミノカルボニル、メチルアミノカルボニルなどが例示される。）、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
　Ｓ原子を含む置換基としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ）、スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）などの基が挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
　スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子を含む置換基として、アジド（－Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノともいう。）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノともいう。）、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ’’）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ’’）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ’’）、ピリジル、ピペリジノ、モルホリノ、アゼチジニルなどの基が挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノ）の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。具体的には、ジアルキルアミノ、なかでもＣ１－Ｃ６ジアルキルアミノ、Ｃ１－Ｃ４ジアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが例示される。本明細書において「Ｃｐ－Ｃｑジアルキルアミノ基」とは、アミノ基にＣｐ－Ｃｑアルキル基が２個置換された基をいい、両Ｃｐ－Ｃｑアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ’’）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ’’が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ’’）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ’’、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ’’）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ’’が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　本明細書においてペプチド化合物を構成する「アミノ酸残基」を単に「アミノ酸」ということがある。
　本発明における「Ｎ－置換アミノ酸」とは、先に定義のアミノ酸のうち、主鎖アミノ基が、Ｎ－置換されているアミノ酸を意味する。Ｎ－置換アミノ酸として具体的には、アミノ酸の主鎖アミノ基が、ＮＨＲ基であって、Ｒが、水素以外の任意の基、例えば、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であるものや、プロリンのようにＮ原子に結合した炭素原子とα位からの炭素原子が環を形成する環状アミノ酸などが挙げられる。例えば、５員環を形成するプロリン類、４員環を形成するアゼチジン類、６員環を形成するピペリジン類が挙げられる。置換されていてもよい各基の置換基は、特に制限されず、たとえばハロゲン基、エーテル基、ヒドロキシル基などが挙げられる。
　本発明における「Ｎ－アルキルアミノ酸」とは、先に定義のＮ－置換アミノ酸のうち、主鎖アミノ基がアルキル基で置換されているアミノ酸を意味する。Ｎ－アルキルアミノ酸として具体的には、Ｎ－Ｃ１－Ｃ１０アルキルアミノ酸、Ｎ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ酸が挙げられる。また、Ｎ－アルキルアミノ酸として、具体的には、Ｎ－メチルアミノ酸、Ｎ－エチルアミノ酸、Ｎ－（ｎ－プロピル）アミノ酸、Ｎ－（ｉ－プロピル）アミノ酸等が挙げられる。
　本明細書における「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本明細書の「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
　本明細書において「プロリン類」とは、プロリンに加え、プロリンの５員環を形成する任意の炭素原子上に任意の置換基が１つまたは複数結合した化合物群を意味する。、５員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよく、その環は任意の芳香環であってもよい。「プロリン類」として具体的には、プロリン、trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン、cis-4-ヒドロキシ-L-プロリン、trans-4-フルオロ-L-プロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン、２－メチル－Ｌ－プロリンなどが挙げられる。プロリン類がヒドロキシ基を有する場合、該ヒドロキシ基は任意の保護基によって保護されていてもよく、もしくは、任意の置換基と該ヒドロキシ基の酸素原子とがエーテル結合もしくはエステル結合を形成していてもよい。さらに５員環を形成する炭素原子のうち任意のひとつが酸素原子もしくは硫黄原子に置き換わっていてもよい。このような化合物として具体的には、例えば、L-チオプロリンが挙げられる。さらにプロリン類は、形成する５員環内に不飽和結合を有していてもよい。このような化合物として具体的には、例えば、3,4-デヒドロ-L-プロリンが挙げられる。なお、それらはＬ体に限らず、Ｄ体であってもよい。
　本明細書において「アゼチジン類」とは、１つの窒素原子と３つの炭素原子が４員環を形成しており、窒素原子の隣の炭素原子にカルボキシル基が結合している化合物を基本とする環状アミノ酸を意味する。４員環を形成する任意の炭素原子上には、任意の置換基が１つまたは複数結合していてもよい。４員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよい。「アゼチジン類」として具体的には、(S)-アゼチジン-2-カルボン酸、(R)-アゼチジン-2-カルボン酸などが挙げられる。また、４員環を形成している窒素原子から数えて２つめの炭素原子にカルボキシル基が結合している化合物も「アゼチジン類」に含まれ、このような化合物としては、例えば、アゼチジン-3-カルボン酸などが挙げられる。
　本明細書において「ピペリジン類」とは、１つの窒素原子と５つの炭素原子が６員環を形成しており、窒素原子の隣の炭素原子にはカルボキシル基が結合している化合物を基本とする環状アミノ酸を意味する。６員環を形成する任意の炭素原子上には、任意の置換基が１つまたは複数結合していてもよい。６員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよく、その環は任意の芳香環であってもよい。「ピペリジン類」として具体的には、(R)-ピペリジン-2-カルボン酸、(S)-ピペリジン-2-カルボン酸、(R)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、(S)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸などが挙げられる。
　本明細書において、芳香族炭化水素系溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられる。
　本明細書において、ハロゲン系溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられる。
　本明細書において、エーテル系溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられる。
　本明細書において、アミド系溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられる。
　本明細書において、スルホキシド系溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、メチルフェニルスルホキシドなどが挙げられる。
　本明細書において、スルホン系溶媒としては、例えば、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　本明細書において、ウレア系溶媒としては、例えば、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられる。
　本明細書において、エステル系溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ―バレロラクトンなどが挙げられる。
　本明細書において、ケトン系溶媒としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトンなどが挙げられる。
　本明細書において、カーボネート系溶媒としては、例えば、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられる。
　本明細書において、リン酸エステル系溶媒としては、例えば、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アミジン類」とは、下記式Ｂ１で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、
　ＲＢ１とＲＢ４は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１とＲＢ４は、ＲＢ１が結合している窒素原子およびＲＢ４が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２とＲＢ３は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２とＲＢ３は、ＲＢ２が結合している窒素原子およびＲＢ３が結合している窒素原子ならびに該窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成する。］
　ＲＢ１～ＲＢ４が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルが挙げられる。
　ＲＢ１とＲＢ４が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ２とＲＢ３が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、１，４，５，６－テトラヒドロピリミジン環などが挙げられる。
　アミジン類として具体的には、ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンや、ＤＢＮ：１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］－５－ノネンなどが挙げられる。
　本明細書において「グアニジン類」とは、下記式Ｂ２で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、
　ＲＢ６は、水素またはＣ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ５とＲＢ７は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ８は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、かつＲＢ９は水素、Ｃ１－Ｃ４アルキルまたはフェニルであるか、ＲＢ８とＲＢ９は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ここでＲＢ９がフェニルである場合、２つの式Ｂ２は、該フェニル基の２つのベンゼン環が縮合してナフタレンを形成してもよい。］
　ＲＢ５～ＲＢ８が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチルであり、ＲＢ９が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはｔ－ブチルである。
　ＲＢ５とＲＢ７が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、イミダゾリジン環、ヘキサヒドロピリミジン環、１，３－ジアゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ８とＲＢ９が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、１，４，５，６－テトラヒドロピリミジン環などが挙げられる。
　グアニジン類として具体的には、ＴＭＧ：１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、ＴＢＤ：１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン、ＭＴＢＤ：７－メチル－１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エンなどが挙げられる。
　本明細書において「ホスファゼン類」とは、下記式Ｂ３または下記式Ｂ４で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、
　ＲＢ１０は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１０およびＲＢ１１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１１は、ＲＢ１０およびＲＢ１１が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１１およびＲＢ１２は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１２は、ＲＢ１１およびＲＢ１２が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１２およびＲＢ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１３は、ＲＢ１２およびＲＢ１３が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１３およびＲＢ１４は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１４は、ＲＢ１３およびＲＢ１４が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１４およびＲＢ１５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１５は、ＲＢ１４およびＲＢ１５が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、またはＣ６－Ｃ１０アリールである。］
　ＲＢ１０～ＲＢ１５が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルであり、ＲＢ１６が、Ｃ１－Ｃ８アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ８アルキルとして好ましくはｔ－ブチル、ｔ－オクチルである。
　ＲＢ１０とＲＢ１１、ＲＢ１２とＲＢ１３、および／またはＲＢ１４とＲＢ１５が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ１１とＲＢ１２、および／またはＲＢ１３とＲＢ１４が５～８員環を形成する場合、該５～８員環は、ＲＢ１１、ＲＢ１２、ＲＢ１３、およびＲＢ１４が結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子以外にヘテロ原子を含まない、５～８員の飽和環であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、
　ＲＢ１７は、独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１７およびＲＢ１８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１８は、ＲＢ１７およびＲＢ１８が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１８およびＲＢ１９は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１９は、ＲＢ１８およびＲＢ１９が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１９およびＲＢ２０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２０は、ＲＢ１９およびＲＢ２０が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ２１は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２１およびＲＢ２２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２２は、ＲＢ２１およびＲＢ２２が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２２およびＲＢ２３は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２３は、ＲＢ２２およびＲＢ２３が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２３およびＲＢ２４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２４は、ＲＢ２３およびＲＢ２４が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２４およびＲＢ２５は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２５は、ＲＢ２４およびＲＢ２５が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２５およびＲＢ２６は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２６は、ＲＢ２５およびＲＢ２６が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ２７は、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ６－Ｃ１０アリールである。］
　ＲＢ１７～ＲＢ２６が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルであり、ＲＢ２７が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはエチル、ｔ－ブチルである。
　ＲＢ１７とＲＢ１８、ＲＢ１９とＲＢ２０、ＲＢ２１とＲＢ２２、ＲＢ２３とＲＢ２４、ＲＢ２５とＲＢ２６が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ１７とＲＢ１８が共にＣ１－Ｃ４アルキルである場合、ＲＢ１９とＲＢ２０も共にＣ１－Ｃ４アルキルであることが好ましく、ＲＢ１７とＲＢ１８が５～８員環を形成する、ＲＢ１９とＲＢ２０も５～８員環を形成することが好ましい。
　ＲＢ２１とＲＢ２２が共にＣ１－Ｃ４アルキルである場合、ＲＢ２３とＲＢ２４およびＲＢ２５とＲＢ２６も共にＣ１－Ｃ４アルキルであることが好ましく、ＲＢ２１とＲＢ２２が５～８員環を形成する、ＲＢ２３とＲＢ２４およびＲＢ２５とＲＢ２６も５～８員環を形成することが好ましい。
　ＲＢ１８とＲＢ１９、および／またはＲＢ２２とＲＢ２３が５～８員環を形成する場合、該５～８員環は、ＲＢ１１、ＲＢ１２、ＲＢ１３、およびＲＢ１４が結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子以外にヘテロ原子を含まない、５～８員の飽和環であることが好ましい。
　ホスファゼン類として具体的には、Ｐ２ｔＢｕ：１－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２，４，４，４－ペンタキス（ジメチルアミノ）－２λ５，４λ５－カテナジ（ホスファゼン）、Ｐ２Ｅｔ：テトラメチル（トリス（ジメチルアミノ）ホスホラニリデン）リン酸トリアミド－エチルイミン、ＨＰ１（ｄｍａ）：イミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、ＢＴＰＰ：ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－トリ（ピロリジノ）ホスホラン、Ｐ１ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、ＢＥＭＰ：２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチルペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン等が挙げられる。
　本明細書において、「および／または」との用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「A、B、および／またはC」には、以下の７通りのバリエーションが含まれる；
(i) A、(ii) B、(iii) C、(iv) AおよびB、(v) AおよびC、(vi) BおよびC、(vii) A、B、およびC。
（製造方法）
　ある態様において、本発明は、以下の工程（１）～（３）を含む、固相法によるペプチドの製造方法に関する。
（１）固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
（２）前記工程（１）の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
（３）前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程。
　なお、前記工程（２）における「前記第一のペプチド」は、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを意味する。
工程（１）
　本発明の工程（１）は、固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程である。
　工程（１）における「固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド」は、通常、そのＣ末端のアミノ酸残基中の官能基（例えば、カルボキシル基）を通じて固相合成用樹脂に担持されているが、Ｃ末端以外のアミノ酸残基の官能基（例えば、カルボキシル基）を通じて固相に担持されていてもよい。「固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド」は、そのＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基がＦｍｏｃ骨格を含む保護基によって保護されている。
　第一のペプチドが担持されている固相は、本技術分野で既知の任意のものを使用することができ、概して、第一のペプチドの所定のアミノ酸残基（例えば、Ｃ末端のアミノ酸残基）とエステル結合によって連結される。樹脂は、特に、固相合成ハンドブック（メルク株式会社発行、平成１４年５月１日発行）に記載されている酸感受性として「Ｈ（＜５％ＴＦＡ ｉｎ ＤＣＭ）」と判定されている樹脂結合基を有することが好ましく、用いられるアミノ酸側の官能基に合わせて適宜選択することができる。
　例えば、アミノ酸側の官能基としてカルボン酸（主鎖カルボン酸、もしくは、ＡｓｐやＧｌｕに代表される側鎖カルボン酸）、又は、芳香環上のヒドロキシ基（Ｔｙｒに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）もしくは２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｌｔ樹脂）を用いることが好ましい。アミノ酸側の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（ＳｅｒやＴｈｒに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｌｔ樹脂）もしくは４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）を用いることが好ましい。
　本発明において「Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基」とは、Ｆｍｏｃ基またはＦｍｏｃ基の構成骨格の任意の位置に任意の置換基が導入された基を意味する。このようなＦｍｏｃ骨格を含む保護基として、具体的には下記式（１）で表される保護基が挙げられる
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
　Ｒ１～Ｒ８は、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、
　Ｒ９～Ｒ１０は、独立して、水素またはメチルである）。
　Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基としてより具体的には、例えば、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、２，７－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２，７ｔｂ））基、１－メチル－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（１Ｍｅ））基、２－フルオロ－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２Ｆ））基、２，７－ジブロモ－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２，７Ｂｒ））基、２－モノイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－ジイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクチル）－Ｆｍｏｃ（ｔｄｆ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－ビス（トリメチルシリル）－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２ＴＭＳ））基、（２－スルホ－９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ（２ｓｏ３ｈ））、［（１Ｓ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）エトキシ］カルボニル基（ｓｍ－Ｆｍｏｃ）、［（１Ｒ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）エトキシ］カルボニル基（ｒｍ－Ｆｍｏｃ）などが挙げられる。これらＦｍｏｃ骨格を含む保護基として好ましくはＦｍｏｃ基である。これらＦｍｏｃ骨格を含む保護基は、市販の試薬などを用い既知の方法により導入することができる。
　本発明において、第一のペプチドを構成するアミノ酸残基の種類および数は限定されず、２以上のアミノ酸残基、例えば、２～３０個、２～２０個、２～１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸残基を含む、任意のアミノ酸配列を備えるペプチドを第一のペプチドとして利用することができる。前記アミノ酸には天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸を使用することができる。第一のペプチドには、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸が含まれていることが好ましい。
　工程（１）において提供される、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド（例えば、固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド）は、商業的供給業者から入手するか、あるいは本技術分野で既知の方法、例えば、ＷＯ２０１３／１００１３２やＷＯ２０１８／２２５８６４に示されるような方法を適用することによって製造することができる。
　ある態様において、第一のペプチドはジペプチドである。この場合、該ジペプチドのＣ末端のアミノ酸残基は、例えば、エステル結合により固相に担持されており、以下のスキームに示すように、Ｎ末端のアミノ酸残基の保護基を除去した結果生じる遊離のアミノ基が、該エステル結合中のカルボニル基と反応して、望ましくないＤＫＰが生じることがある。本発明の方法を用いることにより、ＤＫＰ脱離による目的ペプチドの収量低下を抑制することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１～Ｒ４は任意の原子または基を意味し、＊は固相合成用樹脂との結合箇所を意味する。）
　ある態様において、第一のペプチドは、そのＮ末端から２残基目のアミノ酸が、「Ｎ－置換アミノ酸」であるペプチドである。この場合には、以下のスキームに示すように、Ｎ末端のアミノ酸残基の保護基を除去した結果生じる遊離のアミノ基が、Ｎ末端から２残基目と３残基目のアミノ酸の間のペプチド結合中のカルボニル基と反応することがあり、望ましくないＤＫＰやＤＫＰ脱離体、アミジン骨格を有する不純物（６員環状アミジン骨格構造体）が形成され得る。本発明の方法を用いることにより、このようなＤＫＰ、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制し、目的ペプチドの収率低下を防ぐことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （式中、Ｒ４は水素以外の任意の原子または基を意味し、Ｒ１～Ｒ３およびＲ５～Ｒ８は任意の原子または基を意味し、＊は隣接するアミノ酸残基または固相との結合箇所を意味する。ここで、Ｒ６が水素である場合には、上記スキームの経路Ａおよび経路Ｂのいずれかの経路を経ることができ、Ｒ６が水素以外である場合には上記スキームの経路Ａのみを経ることができる。）
　本発明における「Ｎ－置換アミノ酸」としては、Ｎ－メチル化などのＮ－アルキル化されているＮ－アルキルアミノ酸や、プロリン類やアゼチジン類などの環状アミノ酸が好ましく例示される。
工程（２）
　本発明の工程（２）は、工程（１）で提供された第一のペプチドを、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程である。
　ある態様において、工程（２）により得られる第一のペプチドの少なくとも一部は、カルバミン酸塩の形態にある。特定の理論に拘束されるものではないが、工程（２）では、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基の除去にあたり、第一のペプチドの少なくとも一部において、脱炭酸が進行することなくジベンゾフルベンが生成することにより、Ｎ末端のアミノ基が該保護基由来のＣ（＝Ｏ）Ｏ－と一緒にカルバミン酸イオン（－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｏ－、ここでＲは水素またはアミノ基の任意の置換基である）を形成し、これが系中のプロトン化された塩基との間でカルバミン酸塩を形成している（以下は、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基としてＦｍｏｃを、塩基としてＤＢＵを用いた場合のカルバミン酸塩の形成を示すスキームである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　カルバミン酸塩が形成されると末端アミノ基の分子内求核反応を抑制することができ、塩基性の脱保護条件下であっても、６員環中間体の形成が抑制され、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の副生が軽減されると推定される。
　ある態様において、工程（２）により得られる第一のペプチドの少なくとも一部は、カルバミン酸塩の形態にある。特定の理論に拘束されるものではないが、工程（３）の時点までカルバミン酸塩が安定に存在する場合、縮合剤とカルバミン酸アニオンが反応して生じるイソシアネートに、隣接するＮ末端のアミノ基が求核攻撃して分子間（同一の固相上に担持している場合であってもここでは分子間と記載する）で反応することでダイマーウレア体が生成していると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　そのため、工程（２）における混合物を処理する工程（例えば、固相合成用樹脂を洗浄する工程）において、カルバミン酸塩を分解してアミン体に変換することにより、工程（３）におけるダイマーウレア体の生成を低減することができると推定される。
　工程（２）において共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いる本発明の方法では、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成を有意に低減できる程度の量の第一のペプチドがカルバミン酸塩として存在し得る。例えば、本発明の方法では、カルバミン酸塩とさらに脱炭酸が進行して生じるアミン体とのモル比（カルバミン酸塩／アミン体）が、０．６以上、０．８以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、４．６以上、５．０以上、６．０以上、８．０以上、または１０．０以上となる量でカルバミン酸塩が形成し得る。斯かるモル比は、例えば、当該第一のペプチドにおける、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するＮ末端のアミノ酸のアミド体（例えばジメチルアミド体）を用い、当該塩基で処理した溶液の１Ｈ－ＮＭＲにおけるプロトン積分比から求めることができる。
　カルバミン酸塩は共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である任意の塩基との塩であり得る。このような塩として、具体的には、例えば、ＤＢＵ塩、ＴＭＧ塩、ＨＰ１（ｄｍａ）塩、ＭＴＢＤ塩、Ｐ１－ｔＢｕ塩、またはＰ２－Ｅｔ塩などが好ましく例示される。
　ある態様において、工程（２）に用いられる溶媒は、スルホキシド系溶媒を含んでいればよく、単独溶媒でも、混合溶媒でもよい。混合溶媒の場合、スルホキシド系溶媒を５０ｖ／ｖ％以上、７０ｖ／ｖ％以上、または９０ｖ／ｖ％以上含むことが好ましい。
　工程（２）において用いられるスルホキシド系溶媒として具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、メチルフェニルスルホキシドなどが挙げられ、好ましくは、ＤＭＳＯである。
　工程（２）に用いられる溶媒が混合溶媒である場合、混合溶媒は、スルホキシド系溶媒に加えて、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、リン酸エステル系溶媒、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、およびスルホン系溶媒より選択される１種または複数種の溶媒が含まれていてもよい。
　ある態様において、工程（２）に用いられる溶媒が混合溶媒である場合、混合溶媒は、スルホキシド系溶媒に加えて、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、およびスルホン系溶媒より選択される１種または複数種の溶媒が含まれていてもよい。
　工程（２）に芳香族炭化水素系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられ、好ましくは、トルエン、クメンである。
　工程（２）にハロゲン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタンである。
　工程（２）にエーテル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられ、好ましくは、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソランである。
　工程（２）にエステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ－バレロラクトンなどが挙げられ、好ましくは、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルである。
　工程（２）にケトン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトン（３－ペンタノン）などが挙げられ、好ましくは、メチルエチルケトン、ジエチルケトンである。
　工程（２）にカーボネート系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられ、好ましくは、ジメチルカーボネートである。
　工程（２）にリン酸エステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられ、好ましくはリン酸トリブチルである。
　工程（２）にアミド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられる。
　工程（２）にウレア系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられる。
　工程（２）にスルホン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　ある態様において、工程（２）で用いられる溶媒は、固相樹脂の膨潤能が1.5mL/g以上、2.0mL/g以上、2.5mL/g以上、3.0mL/g以上、3.5mL/g以上、または4.0mL/g以上であることが好ましい。各溶媒の固相樹脂の膨潤能の指標として、「Tetrahedron Lett., 1998, 39, 8951-8954」、「Org. Process Res Dev. 2018, 22, 494-503」、「RSC Adv., 2020, 10, 42457-42492」に記載の値を採用することができる。固相樹脂の膨潤能（ｍＬ／ｇ）として具体的には、ＤＭＩ：８．５、ＤＭＰＵ：８．０、ＮＭＰ：６．４、ＴＨＦ：６．０、ＤＭＡ：５．８、ＣＨＣｌ３：５．６、ＣＰＭＥ：５．６、ＣＨ２Ｃｌ２：５．４、２－メチルテトラヒドロフラン：５．４、ＤＭＦ：５．２、酢酸ブチル：５．２、ＤＭＥ：４．８、ＭＥＫ：４．４、トルエン：４．０、ＡｃＯＥｔ：４．２、キシレン：３．０、Ｅｔ２Ｏ：２．８、ジメチルカーボネート：２．８、ＭＴＢＥ：２．４、ＣＨ３ＣＮ：２．０、リン酸トリブチル：１．６、ＭｅＯＨ：１．６、Ｈ２Ｏ：１．６である。その他、「Green Chem., 2017, 19, 952-962」に記載の表、または「Green Chem., 2020, 22, 996-1018」のtable 2の判定等を採用することもできる。
　工程（２）では、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基を少なくとも含む、１種または複数種の塩基が用いられる。塩基を１種類のみ使用する場合、その塩基は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基である。一方、複数種類の塩基を使用する場合、そのうちの少なくとも１種は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基であり、その他の塩基は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基であっても、２３未満の塩基であってもよい。
　工程（２）に用いられる、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基としては、ｐＫａが３４以下、好ましくは３０以下、より好ましくは２８以下の塩基であってもよい。
　ｐＫａは、塩基性の程度を表す指標であり、ｐＫａが大きいほど、塩基性が高い。なお、本発明において、有機塩基の共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａ（ＣＨ３ＣＮ）として、「New J.Chem.2009,33,588」１)または「Sigma-Aldrich, Phosphazene Bases： https://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemical-synthesis/technology-spotlights/phosphazenes.html」２)または「Eur. J. Org. Chem. 2019, 6735-6748」に示された値等を採用してもよい。
　共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基としては、アミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類などが挙げられ、例えば、以下に列挙した塩基のｐＫａはいずれも２３以上である。
ＤＢＵ：ｐＫａ１）＝２４．３
ＤＢＮ：ｐＫａ１）＝２３．８
ＴＭＧ：ｐＫａ１）＝２３．３
ＴＢＤ：ｐＫａ１）＝２６．０
ＭＴＢＤ：ｐＫａ１）＝２５．５
Ｐ２ｔＢｕ：ｐＫａ１）＝３３．５
Ｐ２Ｅｔ：ｐＫａ１）＝３２．９
ＨＰ１（ｄｍａ）：ｐＫａ１）＝２５．９
ＢＴＰＰ：ｐＫａ２）＝２８．４
Ｐ１ｔＢｕ：ｐＫａ１）＝２７．０
ＢＥＭＰ：ｐＫａ２）＝２７．６
　本工程において、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基が複数種使用される場合、例えば、前述のアミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類から選択される複数種、例えば２種類の塩基を組み合わせて用いることができる。このような塩基の具体的な組み合わせとして、ＤＢＵとＭＴＢＤ、ＤＢＵとＨＰ１（ｄｍａ）、ＤＢＵとＰ１ｔＢｕ、ＤＢＵとＰ２Ｅｔなどが好ましく例示される。
　本工程において、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基と２３未満の塩基が組み合わせて用いられる場合、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基は、例えば、前述のアミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類から選択されることができる。また、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満の塩基は、ピペリジン、ピペラジン、モルホリンより選択されることが好ましい。このような塩基の具体的な組み合わせとして、ＤＢＵとピペリジンなどが好ましく例示される。
　ある態様において、工程（２）は、工程（３）の前に複数回繰り返すこともできる。この場合、工程（２）の各回において、同じ溶媒および／または同じ塩基を用いても、異なる溶媒および／または異なる塩基を用いてもよい。本発明において、同じ溶媒とは、溶媒の種類および溶媒の混合割合が同一であることを意味し、異なる溶媒とは、溶媒の種類および溶媒の混合割合のいずれかまたは両方が異なることを意味する。また、本発明において、同じ塩基とは、塩基の種類および溶媒中での塩基の濃度が同一であることを意味し、異なる塩基とは、塩基の種類および溶媒中での塩基の濃度のいずれかまたは両方が異なることを意味する。
　ある態様において、工程（２）が複数回含まれる場合、本発明の方法は、工程（２）の各回の間に溶液を排出する工程を含んでいてもよい。これにより、１回前の工程（２）で用いられた溶媒および／または塩基を次の回の工程（２）で用いられる溶媒および／または塩基に置き換えることができる。
　ある態様において、工程（２）はＦｍｏｃ骨格を含む保護基を除去する工程である、および／または前記第一のペプチドにおけるFmoc骨格を含む保護基をカルバミン酸塩の形態に変換する工程である。
　ある態様において、第一のペプチドにおけるＦｍｏｃ骨格を含む保護基を除去する工程は、実質的に工程（２）のみで行われる。
　ある態様において、本発明の方法は、工程（２）に先立って、第一のペプチドを共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満である単一の塩基、例えばピペリジンで処理する工程を含まない。具体的には、工程（１）において提供された第一のペプチドを例えば、任意の溶媒（例えば、ＤＭＦ中）、単独の塩基として共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満である塩基（例えば、ピペリジン）を用いて、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを処理し、その後に本発明の工程（２）を行う（例えば、ＤＭＳＯを含む溶媒中でＤＢＵやＤＢＵとピペリジンの組み合わせで処理する）といった態様は、本発明から除外され得る。
　ある態様において、工程（２）で用いられる塩基は、本工程の反応が進行し得る任意の濃度で溶媒中に含まれ得る。このような濃度の範囲として具体的には、例えば、０．２５～２０ｖ／ｖ％、０．５～２０ｖ／ｖ％、１～２０ｖ／ｖ％、１～１５ｖ／ｖ％、１～１０ｖ／ｖ％、１～９ｖ／ｖ％、１～８ｖ／ｖ％、１～７ｖ／ｖ％、１～６ｖ／ｖ％、１～５ｖ／ｖ％、１～４ｖ／ｖ％、１～３ｖ／ｖ％、１～２ｖ／ｖ％などが挙げられ、１～８ｖ／ｖ％が好ましい。
　ある態様において、工程（２）は、溶媒にＣＯ２を接触させる工程をさらに含むことができる。また、ある態様において、工程（２）に用いられる溶媒は、該工程に先立ってＣＯ２を接触させた溶媒であることができる。溶媒とＣＯ２との接触は、例えば、溶媒にＣＯ２をバブリングすることにより行うことができる。工程（２）中にあるいは工程（２）の前に溶媒とＣＯ２とを接触させることで、反応系にＣＯ２を含ませることができる。特定の理論に拘束されるものではないが、工程（２）では、第一のペプチドの少なくとも一部において、Ｎ末端のアミノ基が該保護基由来のＣ（＝Ｏ）Ｏ－とプロトン化された塩基と一緒にカルバミン酸塩を形成しているところ、反応系にＣＯ２を含ませることにより、反応系中のアミン体をより容易にカルバミン酸塩に変換させることができる。したがって、反応系にＣＯ２を含ませることにより、反応中のアミン体をさらに低減し、末端アミノ基の分子内求核反応をさらに抑制することができ、塩基性の脱保護条件下であっても、６員環中間体の形成がさらに抑制され、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の副生がさらに軽減されると推定される。
　ある態様において、工程（２）の反応は、－１００℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０～５０℃で行うことができる。また、工程（２）の反応は、１分～１週間、好ましくは、１分～３時間、３分～３時間、５分～３時間、さらに好ましくは、１分～２０分、３分～２０分、５分～２０分の反応時間で行うことができる。
工程（３）
　本発明の工程（３）は、工程（２）の後に、第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程である。本工程では、第一のペプチドのＮ末端のアミノ基と、カルボン酸のカルボキシル基とが縮合することで、第三のペプチドが合成される。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸は、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸であることができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸類縁体は、カルボン酸の活性エステルであるか、またはカルボン酸の酸ハロゲン化物であることができる。
　保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸のそれぞれの活性エステルを使用することで、縮合剤なしに工程（３）の縮合反応を行うことができる。活性エステルとして具体的には、これら化合物中のカルボニル基、とりわけ第二のペプチドの場合には、そのＣ末端のアミノ酸残基に含まれるカルボニル基に、アミンとの反応を促進し得る基、たとえばＯ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）基（ＯＢｔ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）基（ＯＡｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＯＳｕ）、ペンタフルオロフェノキシ基（ＯＰｆｐ）、またはＳ－Ｒ１１（Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキレン基を示す。）などが結合したものが挙げられる。
　保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸のそれぞれの酸ハロゲン化物を使用することで、縮合剤なしに工程（３）の縮合反応を行うことができる。酸ハロゲン化物として具体的には、これら化合物中のカルボキシル基、とりわけ第二のペプチドの場合には、そのＣ末端のアミノ酸残基に含まれるカルボキシル基が、クロロカルボニル基、フルオロカルボニル基、ブロモカルボニル基、ヨードカルボニル基などに変換されたものが挙げられる。
　工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体、例えば、アミノ酸や第二のペプチドが保護基を有する場合、該保護基は、カルバメート系保護基、スルホニル系保護基、またはアシル系保護基であることができる。
　本明細書において、カルバメート系保護基とは、カルバメート構造を構成する保護基を意味し、例えば、Ｆｍｏｃ骨格を有する保護基、Ａｌｌｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）などがこれに含まれる。スルホニル系保護基とは、スルホニル構造を含む保護基を意味し、例えば、メタンスルホニル（Ｍｓ）基、ｐ－トルエンスルホニル（Ｔｓ）基、２－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）基、トリフルオロメタンスルホニル（Ｔｆ）基、（２－トリメチルシリル）－エタンスルホニル（ＳＥＳ）基などがこれに含まれる。アシル系保護基とは、アシル構造を含む保護基を意味し、例えば、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）基などがこれに含まれる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体がＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸である場合、該Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸には、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基で保護されている任意の天然または非天然アミノ酸を用いることができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体がＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドである場合、該Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドは、そのＮ末端のアミノ酸がＦｍｏｃ骨格を含む保護基で保護されていれば、該ペプチドを構成するアミノ酸残基の種類および数は限定されず、２以上の天然および／または非天然アミノ酸残基を含む、任意のアミノ酸配列を備えるペプチドを利用することができる。第二のペプチドは、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸を含むことが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体が、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、Ｃ６－Ｃ１０アリールカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である場合、これらは、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、ジアルキルアミノ、シアノ、アルコキシカルボニル、およびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい。Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物として好ましくは、Ｃ１－Ｃ４アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物であり、具体的には、例えば、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、もしくはペンタン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物などが挙げられる。Ｃ６－Ｃ１０アリールカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物として、具体的には、例えば、安息香酸、もしくはナフトエ酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物などが挙げられる。
　工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量のＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸またはＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドを用いることができる。
　ある態様において、第一のペプチド、および／またはＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドは、Ｎ－置換アミノ酸を少なくとも１つ含むことが好ましい。また、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸は、Ｎ－置換アミノ酸であることが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられるアミノ酸または第二のペプチドが有するＦｍｏｃ骨格を含む保護基は、工程（１）で用いられる第一のペプチドが有するＦｍｏｃ骨格を含む保護基と同一であっても、異なっていてもよい。
　ある態様において、工程（３）に用いられる溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒の少なくとも１種を含んでいればよく、単独溶媒でも、混合溶媒でもよい。混合溶媒の場合、工程（３）において用いられる溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒の少なくとも１種を２５ｖ／ｖ％以上、５０ｖ／ｖ％以上、または７５ｖ／ｖ％以上含むことが好ましい。
　工程（３）に芳香族炭化水素系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられ、好ましくは、トルエン、クメンである。
　工程（３）にハロゲン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタンである。
　工程（３）にエーテル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられ、好ましくは、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソランである。
　工程（３）にアミド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられ、好ましくは、ＤＭＦ、ＮＭＰである。
　工程（３）にスルホキシド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、メチルフェニルスルホキシドなどが挙げられ、好ましくは、ＤＭＳＯである。
　工程（３）にスルホン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　工程（３）にウレア系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられ、好ましくは、ＤＭＩである。
　工程（３）にエステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ―バレロラクトンなどが挙げられ、好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルである。
　工程（３）にケトン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトンなどが挙げられ、好ましくは、メチルエチルケトン、ジエチルケトンである。
　工程（３）にカーボネート系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられ、好ましくは、ジメチルカーボネートである。
　工程（３）にリン酸エステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられ、好ましくはリン酸トリブチルである。
　工程（３）に用いられる溶媒が混合溶媒の場合、混合溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒から選択される２種またはそれ以上の溶媒からなっていてもよく、これら以外の任意の溶媒が含まれていてもよい。
　工程（３）で用いられる溶媒が、単独溶媒である場合、該溶媒として、トルエン、クメン、１，２－ジクロロベンゼン、ベンゼン、アニソール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＳＭＯ、ＤＭＩ、ＤＭＰＵ、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、リン酸トリメチル、リン酸トリブチル、スルホラン、または３－メチルスルホランが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられる溶媒は、工程（２）に用いられる溶媒と同一であることもできる。
　工程（３）に用いられる溶媒としては、縮合剤が溶解可能なものが好ましく用いられる。本発明では、工程（２）に用いた塩基が残存していることがあるが、この残存塩基に起因して、アミノ酸あるいはペプチドが過剰に伸長した副生成物が生じる場合がある。縮合剤が溶解可能な溶媒を工程（３）に用いた場合には、かかる過剰伸長体の形成を抑制することができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられる縮合剤は、塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがＰＦ６ －またはＢＦ４ －である。このような縮合剤として、具体的には、ＰｙＯｘｉｍ（［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＡＯＰ（（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸）、ＣＯＭＵ（（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＡＴＵ（Ｏ－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＢＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＣＴＵ（Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＤＢＴＵ（Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）、ＨＯＴＵ（Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩）、ＴＢＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩）、ＴＣＴＵ（Ｏ－（６－クロロ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）、およびＴＯＴＵ（Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）などが挙げられる。
　ある態様において、工程（３）に用いられる縮合剤は、ＰｙＯｘｉｍ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＣＯＭＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＤＢＴＵ、ＨＯＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＣＴＵ、およびＴＯＴＵからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、これらのいずれか１種を用いることがより好ましい。
　ある態様において、工程（３）の縮合反応は、塩基の存在下で行うことができる。縮合反応の進行に寄与するものであれば、塩基の種類は限定されないが、共役酸の水中でのｐＫａが５～１２の塩基が好ましく、このような塩基として具体的には、例えば、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、ピリジンなどが挙げられる。工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量の塩基を用いることができる。なお、塩基の共役酸の水中でのｐＫａは、例えばAdvanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V11.02 ((c)1994-2020 ACD/Labs)にて計算される値等を使用することができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられる縮合剤はカルボジイミド系縮合剤である。このような縮合剤として、具体的には、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）、１－ｔｅｒｔ－ブチル－３－エチルカルボジイミド（ｔＢＥＣ）、ジｔｅｒｔ－ブチルカルボジイミド（ＤｔＢＣ）、および１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）などが挙げられ、好ましくはジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、またはジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド（ＤｓＢＣ）である。
　工程（３）で用いられる縮合剤がカルボジイミド系縮合剤である場合、工程（３）の縮合反応は添加剤の存在下で行うことができる。縮合反応の進行に寄与するものであれば、添加剤の種類は限定されないが、このような添加剤として具体的には、例えば、ＨＯＡｔ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、Ｏｘｙｍａ、およびＯｘｙｍａ－Ｂなどが挙げられ、好ましくはＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａである。
　工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量の縮合剤を用いることができる。
　ある態様において、本発明は、工程（２）と工程（３）の間に、工程（２）における混合物を処理する工程（処理工程）をさらに含んでいてもよい。ある態様において、処理工程は前記混合物に酸または塩を接触させる工程である。混合物に酸または塩基を接触させる工程においては、混合物に酸または塩基を直接添加してもよいし、混合物に酸または塩基を含む溶液を添加してもよい。当該溶液には、任意の溶媒を用いることができ、例えば、工程（２）に用いた溶媒を用いることが好ましく、スルホキシド系溶媒を用いることがより好ましく、ＤＭＳＯを用いることがさらに好ましい。なお、処理工程は、工程（２）において生成したカルバミン酸塩を分解する工程であってもよい。
　処理工程で用いられる酸としては、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、塩酸が例示される。これらの中でも、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔが好ましい。処理工程で用いられる塩としては、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、塩酸からなる群より選択される少なくとも１種の酸、およびＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、およびピリジンからなる群より選択される塩基からなる塩が例示され、ピリジン塩酸塩が好ましく例示される。
　ある態様において、工程（２）における混合物を処理する工程は、固相合成用樹脂を洗浄する工程であってもよい。樹脂の洗浄には、任意の溶媒を用いることができ、例えば、工程（２）に用いた溶媒を用いることが好ましく、スルホキシド系溶媒を用いることがより好ましく、ＤＭＳＯを用いることがさらに好ましい。また、ある態様において、固相合成用樹脂を洗浄する工程に用いられる溶媒は塩基を含む溶液であってもよい。このような塩基としては、例えば、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジンが例示される。樹脂の洗浄は、同じ溶媒あるいは異なる溶媒で複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、または６回）行うことができる。
　ある態様において、固相合成用樹脂を洗浄する工程は、酸または塩を含むスルホキシド系溶媒の溶液で洗浄する工程である。樹脂の洗浄で用いられる酸としては、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、塩酸が例示される。これらの中でも、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔが好ましい。樹脂の洗浄で用いられる塩としては、ＨＯＡｔ、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、塩酸からなる群より選択される少なくとも１種の酸、およびＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、およびピリジンからなる群より選択される塩基からなる塩が例示され、ピリジン塩酸塩が好ましく例示される。
　ある態様において、固相合成用樹脂を洗浄する工程では、該工程に先立ってＣＯ２を接触させた溶媒（例えば、ＣＯ２ガスを用いてバブリングした溶媒）を使用してもよく、ＣＯ２を接触させていない溶媒を使用してもよく、ＣＯ２を接触させた溶媒と接触させていない溶媒とを組み合わせて使用してもよい。洗浄を複数回行う場合には、事前にＣＯ２を接触させた溶媒で１回もしくは複数回、樹脂を洗浄し、次いで事前にＣＯ２を接触させていない溶媒で１回もしくは複数回、樹脂を洗浄することが好ましい。
　ある態様において、工程（３）の反応は、－１００℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０～６０℃で行うことができる。また、工程（３）の反応は、１分～１週間、好ましくは、３０分～２０時間の反応時間で行うことができる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、前記工程（１）～工程（３）を経て製造される第三のペプチドを含むものである。この場合、本発明の方法によって製造されるペプチドは、第三のペプチドに加えて、任意のアミノ酸を任意の数でさらに含むことができる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、前記工程（１）～工程（３）を経て製造される第三のペプチドであることもできる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、Ｎ－置換アミノ酸を少なくとも１つ、または、２つ以上、３つ以上、４つ以上もしくは５つ以上含むことができる。前記Ｎ－置換アミノ酸としては、Ｎ－アルキルアミノ酸、好ましくはＮ－メチルアミノ酸であることができる。
　ある態様において、本発明の方法は、ペプチド鎖の伸長工程の後に、固相合成用樹脂からのペプチドの切り出し工程を含んでもよい。切り出し工程には、本技術分野に既知の方法や、本実施例に記載の方法を用いることができる。
　ある態様において、本発明は、前記工程（１）および前記工程（２）を含む、ペプチドの製造（例えば、固相法によるペプチドの製造）における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法にも関する。当該方法は、前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程（３）をさらに含んでもよい。
　ある態様において、本発明は、前記工程（１）および前記工程（２）を含む、ペプチドの製造（例えば、固相法によるペプチドの製造）における、ジケトピペラジン不純物、６員環状アミジン骨格構造体不純物、およびダイマーウレア体不純物からなる群より選択される少なくとも１種の不純物の生成量を低減させる方法にも関する。当該方法は、前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程（３）をさらに含んでもよい。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明の内容を以下の実施例、比較例及び参照例でさらに説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。全ての出発物質および試薬は商業的供給業者から入手、もしくは公知の方法を用いて合成した。
　実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ：酢酸アンモニウム
Ａｃ：アセチル基
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル基
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル基
ＣＯＭＵ：（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＣＥ：１，２－ジクロロエタン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＫＰ：ジケトピペラジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤｓＢＣ：Ｎ，Ｎ’－ジ－ｓｅｃ－ブチルカルボジイミド
ＥＤＣＩ・ＨＣｌ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＦＡ：ギ酸
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
ＨＯＡｔ：１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＯＢｔ：３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン
ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＢＴＵ：Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＣＴＵ：Ｏ－（１Ｈ－６－クロロ－１－イル）－１、１、３、３ －テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＯＴＵ：Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＰ１（ｄｍａ）：イミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン
ＭＴＢＤ：７－メチル－１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン
ＮＭＰ：Ｎ－メチル－２－ピロリドン
Ｎｓ：２－ニトロベンゼンスルホニル基
Ｏｘｙｍａ：シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル
ｐｉｐ：ピペリジン
Ｐ１ｔＢｕ：ｔ－ブチルイミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン
Ｐ２Ｅｔ：テトラメチル（トリス（ジメチルアミノ）ホスホラニリデン）リン酸トリアミド－エチルイミン
ＰｙＡＯＰ：（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＰｙＯｘｉｍ：［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
Ｔｅｏｃ：２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基
ＴＥＳ：トリエチルシラン
Ｔｆａ：トリフルオロアセチル基
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ：２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＧ：１，１，３，３－テトラメチルグアニジン
ＴＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩
ＴＢＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩
ＴＣＴＵ：Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＤＢＴＵ：Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１,２,３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＯＴＵ：Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
　ＬＣＭＳの分析条件は表１に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例１：　本実施例中で使用するアミノ酸やレジンに担持されたペプチド等の調製
実施例１－１：ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるＦｍｏｃ－アミノ酸
　本明細書内に記載するペプチド合成において、ペプチド合成機による合成には表２～表４に記載するＦｍｏｃ－アミノ酸を用いた。
　表２記載のＦｍｏｃ－アミノ酸はＷＯ２０１８／２２５８６４およびＷＯ２０２１／０９０８５６に記載の方法に従って合成した。
　表３記載のＦｍｏｃ－アミノ酸は商業的供給業者から購入した。
　表４記載のＦｍｏｃ－アミノ酸は以下に示すスキームのとおり合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
化合物ａａ３－１、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　窒素雰囲気下、市販の（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ，化合物ａａ３－１－ａ）（３ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０．５ｍＬ）にパラホルムアルデヒド（６９６ｍｇ、２３．１７ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（５．３６ｍＬ、６９．５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮することで粗生成物である化合物ａａ３－１－ｂ（２．９５ｇ、９５％）を得た。これ以上の精製を行わずに次の反応に用いた。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　窒素雰囲気下、上記の粗生成物である化合物ａａ３－１－ｂ（２．９５ｇ）の１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）（１５．５ｍＬ）溶液にトリエチルシラン（ＴＥＳ）（１０．５９ｍＬ、６６．３ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１５．３２ｍＬ、１９９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、７０℃にて５時間攪拌した。反応液を室温に冷却し、減圧下溶媒を留去することで得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解し、ｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘキサン＝９／１（４０ｍＬ）を加え、攪拌した。この混合物を冷蔵庫で３０分冷却した後、生じた固体をろ過し、ｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘキサン＝９／１（３０ｍＬ）で３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。得られた粗生成物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に懸濁させ、３ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液（４５ｍＬ，１．５ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む）を加えて撹拌し、水層を除いた後に有機層を３ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液（４５ｍＬ，１．５ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む）で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、化合物ａａ３－１、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ）を得た（２．６７ｇ，９０％）。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ３－２、（２Ｓ）－３－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－２－（２－トリメチルシリルエトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｈ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ，化合物ａａ３－２－ａ）(２．００ｇ、８．５８ｍｍｏｌ)を水（１２．０ｍＬ）に溶解させた後、トリエチルアミン（２．３８ｍＬ、１７．１５ｍｍｏｌ）と１，４－ジオキサン（１０．０ｍＬ）の混合溶液を加え、室温にて１０分攪拌した。その後、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２－（トリメチルシリル）エチル）カーボネート（２．４５ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液に２－メチルテトラヒドロフラン（５ｍＬ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で２回洗浄した。得られた有機層を飽和硫酸水素カリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した後、１０％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮することで、化合物ａａ３－２、２Ｓ）－３－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－２－（２－トリメチルシリルエトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ）を得た。（２．８８ｇ，８９％）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３７６（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ３－３、２－メチル－２－［（２－ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロパン酸（Ｎｓ－Ａｉｂ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　市販の２－アミノ－２－メチルプロパン酸メチルエステル塩酸塩（４．０ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０．９２ｍＬ、６２．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２２．１ｍＬ）に２－ニトロベンゼンスルホニルクロリド（６．９３ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０．０ｍＬ）を氷浴で冷却しながら加え、０℃で５分間攪拌した後、室温で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、粗生成物ａａ３－３－ｂを得た。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３０１（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　得られた粗生成物ａａ３－３－ｂ（３．６３ｇ）のＴＨＦ／メタノール溶液（１／１、５２ｍＬ）に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２６ｍＬ）を氷浴で冷やしながら加え、０℃で５分間攪拌した後、室温で５時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後、得られた残渣を４Ｎ塩酸（３０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を留去した。混合物を酢酸エチルで２回抽出した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後にろ過を行い、溶液を減圧下濃縮した。得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％－ギ酸入りアセトニトリル／０．１％－ギ酸入り蒸留水）にて２回精製することで、化合物ａａ３－３、２－メチル－２－［（２－ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロパン酸（Ｎｓ－Ａｉｂ－ＯＨ）（２．４６ｇ、７１％）を得た。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２８７（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例１－２：本実施例中で使用するレジンに担持されたアミノ酸およびペプチド等の調製
実施例１－２－１：（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ、化合物１－２－１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　本明細書では、ポリマーやレジンと化合物が結合した場合、ポリマーやレジン部位を〇にて表記する場合がある。また、レジン部位の反応点を明確にさせる目的で、〇に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。例えば、上記の構造（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－１））では、レジンの２－クロロトリチル基がＡｓｐの側鎖カルボン酸とエステル結合を介して結合している。なお、ｐｙｒｒｏとはピロリジンを意味し、上記の構造ではＣ末端のカルボン酸基がピロリジンとアミド結合を形成している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　窒素雰囲気下、０℃にてＤＭＦ（６００ｍＬ）にＥＤＣＩ・ＨＣｌ（６７．１ｇ，３５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４３．３ｇ，３２１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（１２０ｇ，２９２９ｍｍｏｌ）を順に加え、０℃で１時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（１０ｖ）と０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水（２ｖ）を０℃で加え、有機層を分離した。得られた有機層を０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１（ｖ／ｖ））、飽和食塩水／水（１／１（ｖ／ｖ））で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して化合物１－２－１－ａを粗生成物として得た。（１３７．１ｇ，ｑｕａｎｔ．）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４６５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
　氷冷下にて、化合物１－２－１－ａ（１３７ｇ，３９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１３７ｍＬ）溶液にＴＦＡ（２７１ｍＬ）を内温が１０℃を超えないようにゆっくり加えた。室温で１時間撹拌後、ジイソプロピルエーテル（３．４Ｌ）を４回に分けて加え、析出した固体をろ取し、乾燥して化合物１－２－１－ｂ（（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ）を得た。（１０８．４ｇ，９０％）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
　Ｆｍｏｃアミノ酸のレジンへの担持反応は、ＷＯ２０１３／１００１３２もしくはＷＯ２０１８／２２５８６４に記載の方法に従って行った。フィルター付きの反応容器に２－クロロトリチルクロライドレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、４８．７ｇ）と脱水ジクロロメタン（５００ｍＬ）を入れ、室温にて２０分間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、化合物１－２－１－ｂ（１５．９１ｇ） と脱水ジクロロメタン（３５０ｍＬ）に脱水メタノール（１２．６３ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３２．６ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、６０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（３５０ｍＬ）に脱水メタノール（９７．３ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３２．６ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間３０分振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）を入れ５分間振とうした後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このジクロロメタンでのレジンの洗浄を５回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ、化合物１－２－１、５９．７９ｇ）を得た。
　担持率の確認のため、得られた化合物１－２－１（１２．６ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えて、室温にて１時間振とうした。その後、ＤＢＵ（４０μＬ）を加えて３０℃で３０分間振とうした。その後、反応混合液にＤＭＦ（８ｍＬ）を加え、その溶液１ｍＬをＤＭＦ（１１．５ｍＬ）で希釈した。得られた希釈溶液の吸光度（２９４ｎｍ）を測定し（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶ－１６００ＰＣ（セル長１．０ｃｍ）を用いて測定）、化合物１－２－１の担持量を０．４６４ｍｍｏｌ／ｇと算出した。
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットについてもペプチド合成や検討等に使用した。
実施例１－２－２：（Ｓ）－３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－オキソ－４－（ピペリジン－１－イル）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ、化合物１－２－２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（Ｓ）－３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－オキソ－４－（ピペリジン－１－イル）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（化合物１－２－２、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ）は、文献記載の方法にて合成した（文献：国際公開番号ＷＯ２０１３／１００１３２　Ａ１）。なお、ｐｉｐとはピペリジンを意味し、上記の構造ではＣ末端のカルボン酸基がピペリジンとアミド結合を形成している。
実施例１－２－３：（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ、化合物１－２－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　商業的供給業者より購入した（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ）（７．１ｇ，２１．８２ｍｍｏｌ）と２－クロロトリチルクロライドレジン（１．６ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、２７．２５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ）を用い、化合物１－２－１の合成と同様の手法にて、化合物１－２－３、（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）を得た。（３３．４４ｇ，担持量０．５９８ｍｍｏｌ／ｇ）
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットにおいても本実施例におけるペプチド合成に使用した。
実施例１－２－４：本実施例中にて使用する固相担持されたペプチド化合物（化合物１－２－４～化合物１－２－１２）の調製
　本実施例中にて使用する化合物１－２－４から化合物１－２－１２の調製は、ペプチド合成機（Multipep RS；　Intavis社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸もしくはＨＯＯＢｔが難溶の場合、２０％となるようＤＭＳＯを添加して溶液１を調製した。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１０ｖ／ｖ％）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合し、溶液２を調製した。
　実施例１－２－１、１－２－２、または１－２－３にて調製した、Ｎ末端がＦｍｏｃ基で保護されたアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位、もしくはＮ末端がＦｍｏｃで保護されたβアミノ酸の主鎖カルボン酸部位が結合した２－クロロトリチルレジン（化合物１－２－１、化合物１－２－２、または化合物１－２－３）（１カラムあたり１００ｍｇ）を固相反応容器に加え、ペプチド合成機にセットした。このレジン（１００ｍｇ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）（１．０ｍＬ）を加えて３０分程度静置することでレジンの膨潤を行った。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）にて２回洗浄した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。１残基目の脱保護においては４．５分間反応させ、２残基目以降の脱保護においては１０分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。続いてＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回、ＤＩＰＥＡ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶かした溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で１回、ＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。
伸長工程
　溶液１（１カラムあたり０．３ｍＬ）と溶液２（１カラムあたり０．３６ｍＬ）を合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合した後に、レジンに添加し、固相反応容器を４０℃から難伸長配列の場合は６０℃まで加温し、２．５時間から難伸長配列の場合は１４時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。伸長効率が低い場合、このＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を更に１回もしくは２回繰り返して行った。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
　このＦｍｏｃ基の脱保護反応に次ぐＦｍｏｃアミノ酸の縮合反応を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。最後のアミノ酸の伸長後は脱Ｆｍｏｃ工程を行わずに、さらにＤＣＭ（１カラムあたり１．０ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた後、以後の検討に用いた。本手法を標準条件として用いて、以下の固相担持されたペプチド化合物（化合物１－２－４～化合物１－２－１２）を調製した。
　なお、前述の通り、１カラムあたり１００ｍｇの化合物１－２－１、化合物１－２－２、または化合物１－２－３を用いて調製したが、１配列あたり複数本のカラムを並べて同様に調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－１、０．５５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－３、０．５５８ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－１２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－３、０．５５８ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　なお、一例として化合物１－２－４が得られたことを確認する目的で、得られたレジンの一部に対し、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳにて分析したところ、目的ペプチド（化合物１－２－４＊）の生成が確認された。化合物１－２－５から化合物１－２－１２においても、化合物１－２－４と同様の方法にて目的ペプチド（化合物１－２－５＊から化合物１－２－１２＊）の生成を確認した。なお、本実施例において、化合物番号に＊を付した場合には、反応の確認のためにレジンからペプチドを切り出して確認した化合物を示す。化合物１－２－４＊は、化合物１－２－４に含まれるペプチドのカルボン酸と、レジンの２－クロロトリチル基との結合を切断したペプチド化合物を示す。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９２８．６９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９２８．８０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１００３．８０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－７＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８５５．７３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－８＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８８．６７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－９＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７８４．６６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物１－２－１０＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８１０．４４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（化合物１－２－１１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５０８．４７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（化合物１－２－１２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３２６．４１（Ｍ－Ｈ）－
　Ｆｍｏｃ保護が外れたフラグメントのＭＳ（（Ｍ－Ｈ－Ｆｍｏｃ）－）として検出
　保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例１－３：本実施例中で使用する直鎖ペプチドの調製
実施例１－３－１：Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ、化合物１－３－１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２―２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ）、２．０ｍＬ）を加えて室温にて２時間振盪した。その後、溶液をフリットからナスフラスコへ排出し、続いてレジンをＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ）、１．０ｍＬ）で２回洗浄し、排出した溶液をナスフラスコへ回収した。同じ操作を固相反応容器７本分に対して行い、排出した溶液をまとめて減圧下溶媒留去した。得られた残渣をＤＣＥ（５ｍＬ）に溶かした後、減圧下で溶媒を留去する作業を２回繰り返すことで、粗生成物である化合物１－２－５＊（２０９．２ｍｇ、７１％）を得た。これ以上の精製を行わずに次の反応に用いた。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９２８．７８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　窒素雰囲気下、上記の粗生成物である化合物１－２－５＊（２０９．２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をトルエン（０．７５ｍＬ）とメタノール（１．５０ｍＬ）に溶かした溶液にトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液（０．６Ｍ、０．７５ｍＬ、０．４５ｍｍｏｌ）を室温にて滴下した。室温で５分攪拌した後、酢酸（０．０１３ｍＬ、０．２３ｍｍｏｌ）を加え、減圧下溶媒を留去して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール）にて精製することで、化合物１－３－１、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐを得た（１７５．９ｍｇ、８３％）。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝９４２．６３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．９４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例１－３－３：Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ、化合物１－３－２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２―２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－６）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ）、２．０ｍＬ）を加えて室温にて２時間振盪した。その後、溶液をフリットからナスフラスコへ排出し、続いてレジンをＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ）、１．０ｍＬ）で２回洗浄し、排出した溶液をナスフラスコへ回収した。同じ操作を固相反応容器７本分に対して行い、排出した溶液をまとめて減圧下溶媒留去した。得られた残渣をＤＣＥ（５ｍＬ）に溶かした後、減圧下で溶媒を留去する作業を２回繰り返すことで、粗生成物である化合物１－２－６＊（２０２．８ｍｇ、６４％）を得た。これ以上の精製を行わずに次の反応に用いた。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１００３．７０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　窒素雰囲気下、上記の粗生成物である化合物１－２－６＊（２０２．８ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をトルエン（０．６７ｍＬ）とメタノール（１．３５ｍＬ）に溶かした溶液にトリメチルシリルジアゾメタンのヘキサン溶液（０．６Ｍ、０．６７ｍＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を室温にて滴下した。室温で５分攪拌した後、酢酸（０．０１２ｍＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を加え、減圧下溶媒を留去して得られた残渣を順相カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）にて精製することで、化合物１－３－２、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐを得た（１６８．１ｍｇ、８２％）。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝１０１７．６１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．１２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例２：ペプチドの固相合成において、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程について、試薬および溶媒の効果について確認をした実験
　ペプチドの固相合成においては、脱Ｆｍｏｃ、樹脂洗浄を経て、続くアミノ酸の伸長を行う。本実施例では、固相担持されたペプチド配列として化合物１－２－４を用い、それぞれの工程の試薬や溶媒を変更し、ペプチド合成によって生じる不純物（ジケトピペラジン脱離体、６員環状アミジン骨格構造体、および過剰伸長体）の低減の程度を比較し、適切な条件の範囲を特定した。
基本操作Ａ（表５、ｒｕｎ１～７、１４～１５、２９～３０）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－４）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表５中に記載の塩基を表５中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンを洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａあるいはＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）あるいはＤｓＢＣ（１２ｖ／ｖ％）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表５のｒｕｎ５においては、基本操作Ａに基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－４）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＳＯ溶液（０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド化合物（ＴＭ）（２－１＊）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体（化合物２－２＊）と６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）とＭｅＬｅｕ過剰伸長体（化合物２－４＊）の生成を確認した。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（化合物２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８３３．５８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．７２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（化合物２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６３５．４５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．２４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６８８．４７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．５２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ＭｅＬｅｕ過剰伸長体、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（化合物２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９６０．６６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．１９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
基本操作Ｂ（表５、ｒｕｎ８～１３、１６～２３、２５～２８）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－４）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表５中に記載の塩基を表５中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンを洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とウロニウム系もしくはホスホニウム系の縮合剤（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表５のｒｕｎ８においては、基本操作Ｂに基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－４）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３３１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
基本操作Ｃ（表５、ｒｕｎ２４）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－４）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２％ｖ／ｖ、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｃｌ（後述）（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＮＭＰ溶液（０．７ｍＬ）と２，４，６－トリメチルピリジン（０．５５ｍｍｏｌ、１０当量）の混合液を添加し、４０℃で１．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。なお、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｃｌの調製については以下のように実施した。（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル(メチル)アミノ］－４－メチルペンタン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ）（０．０８１ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４４ｍＬ）に溶解させ、その溶液を氷浴で冷やしながらＤＭＦ（０．０１７ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を滴下し、次に塩化チオニル（０．０２４ｍＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で３０分攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣にトルエン（０．８１ｍＬ、１０ｖ／ｗ）を添加し、減圧下濃縮する操作を２回行った。得られた粗生成物をＮＭＰ（０．７ｍＬ）に溶解させ、上述の反応に用いた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
　なお、ジケトピペラジン脱離体の生成はペプチド合成において、一般的に広く知られている合成上の不具合である。６員環状アミジン骨格構造体の生成は、前例がなく本願発明者らが見出したペプチド合成上の新たな課題である。特定の理論に限定するものではないが、ジケトピペラジン脱離体の生成は、Ｎ末端のアミノ基が、Ｎ末端から２番目のアミド結合を形成するカルボニル基に対し６員環を形成するように求核攻撃した後、元のアミド結合を形成するアミノ基が脱離することによって進行する。一方で、６員環状アミジン骨格構造体の生成は、同様に６員環を形成した後、求核攻撃によって発生したカルボニル基由来のヒドロキシ基が脱離することによって進行していると考えられる。つまり、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の形成は、いずれも６員環を形成することに起因するペプチド合成上の課題であることが共通している。
　得られた結果（それぞれの条件での、化合物２－１＊、化合物２－２＊、化合物２－３＊、化合物２－４＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　ｒｕｎ１およびｒｕｎ２は一般的なペプチド合成において実施されている脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程である（比較実験）。例えばｒｕｎ２の条件では脱Ｆｍｏｃ工程に用いる塩基にＤＢＵ、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に用いる溶媒にＤＭＦが使用されている。この条件においては、２残基欠損したジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成が２％程度、６員環状アミジン骨格構造体の生成が５％程度確認された。それに対し、ｒｕｎ５の通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に使用する溶媒にＤＭＳＯを用いると、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成に加え、ＭｅＬｅｕ過剰伸長体の生成を抑制できることが確認できた。また、ｒｕｎ３に示す結果の通り、最も一般的に脱Ｆｍｏｃの塩基として使用されているピペリジン（ｐｉｐ）（ｐＫａ　１９．３５（アセトニトリル中）、参考文献　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　２０１９，　６７３５－６７４８）を用いて、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に使用する溶媒にＤＭＳＯを用いた条件においては、ジケトピペラジン脱離体の生成、および６員環状アミジン骨格構造体の生成が、それぞれ２％程度ずつ確認された。それに対しｒｕｎ４から７の通り、共役酸のｐＫａが２３以上のより強い塩基を用いた場合には、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できることが確認できた。
　また、ｒｕｎ８、ｒｕｎ１０からｒｕｎ１３およびｒｕｎ１６からｒｕｎ２３に示す結果の通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に使用する溶媒にＤＭＳＯを用いた条件にて、伸長反応に種々ホスホニウム系・ウロニウム系の縮合剤を使用した場合にも、ジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できることが確認できた。
　なお、ｒｕｎ９に示す結果の通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程にＤＭＳＯ溶媒を使用し、伸長工程においては縮合剤にＰｙＯｘｉｍ、溶媒にＤＭＳＯ以外を用いて実施した場合にもジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成が抑制できることを確認した。
　脱Ｆｍｏｃ工程にＤＭＳＯ溶媒を用い、樹脂洗浄工程または伸長工程のうちどちらか１工程にＤＭＳＯ溶媒、残り１工程にＤＭＦ溶媒を用いた結果をｒｕｎ１４およびｒｕｎ１５に示す。３工程すべてにＤＭＳＯ溶媒を用いたｒｕｎ５と比較すると、伸長工程のみＤＭＦ溶媒を用いた場合には縮合剤にＤＩＣ／Ｏｘｙｍａを用いると６員環状アミジン骨格構造体の生成がわずかに増加する結果となった。一方で樹脂洗浄工程のみＤＭＦ溶媒を用いた場合には、３工程すべてにＤＭＳＯ溶媒を用いた場合と同等にジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成が抑制できることを確認した。
　本発明においては、伸長工程に酸クロリドを用いてもよい。例えば、ｒｕｎ２４のように、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程にＤＭＳＯを用いた条件にて、伸長反応時に別途調製した酸クロリドを２，４，６－トリメチルピリジン存在下、ＮＭＰ中で作用させた場合にも、ジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能であることが確認できた。
　本発明においては、脱Ｆｍｏｃ工程にて、一度に２種類以上の塩基を共存させてもよい。例えば、２種類の塩基を共存させるケースとして、ｒｕｎ２５のように一方を至適な塩基（ここではＤＢＵ）を用いてさえすれば、脱Ｆｍｏｃ工程にて発生するジベンゾフルベンに対する付加体を与えることが広く知られているピペリジンを共存させても、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できる。
　また、ＤＢＵよりもさらに強い塩基であるＨＰ１（ｄｍａ）、Ｐ１ｔＢｕ、Ｐ２Ｅｔを共存させた場合においてもジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能であることが確認できた（ｒｕｎ２６から２８）。
　ｒｕｎ２９およびｒｕｎ３０に示す結果の通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に使用する溶媒にＤＭＳＯを用いた条件にて、伸長反応にＤｓＢＣやＨＯＡｔを使用した場合にも、ジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できることが確認できた。
　以上、実施例２の結果より、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能な各工程（脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程）の範囲の概要が特定された。なお、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成抑制においては、実施例２に示す反応条件の組み合わせに限定されない。
実施例３：　見出した条件によるペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果のペプチド配列一般性確認実験
　本実施例では、実施例１－２－４にて調製した種々のペプチド配列（表６のＣｏｒｅ２まで伸長したペプチド配列、化合物１－２－５～化合物１－２－９）に対して、一般的な従来法（条件－１）と本発明の方法（条件－２）でＣｏｒｅ１に記載のアミノ酸を伸長し、ジケトピペラジン脱離体の生成量を比較した。
条件－１（従来法）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－５～化合物１－２－９（それぞれ表６のｒｕｎ１から５に対応））１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。ピペリジンのＤＭＦ溶液（２０ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で８回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＦ溶液（０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
条件－２（本発明の方法）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－５～化合物１－２－９（それぞれ表６のｒｕｎ１から５に対応））１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物３－１－１＊～化合物３－１－５＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物３－２－１＊～化合物３－２－５＊）の生成を確認した。
　各配列、各条件におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量を表６に示す。なお表６に示すジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとした時の、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体のＵＶ面積パーセントである。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物３－１－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１０５５．６８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．１０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物３－２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８７１．６１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．９７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物３－１－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１１６０．６１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物３－２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９１８．４４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ３）（化合物３－１－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９６８．５９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ３）（化合物３－２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９３．７２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ４）（化合物３－１－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１００１．５４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ４）（化合物３－２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９３．４２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ５）（化合物３－１－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８１．４７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ５）（化合物３－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６６７．３８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
　以上、実施例３の結果より、特定のペプチド配列に限らず種々のペプチド合成において、一般的な従来法に比べ、本発明の方法で伸長を行う場合にはジケトピペラジン脱離体の抑制効果があることを確認した。
実施例４：ジケトピペラジン脱離の問題に加えて、ＷＯ２０２２／０９７５４０の条件にてダイマーウレア体が生じる配列において中和工程および酸による洗浄の効果について確認をした実験
　化合物１－２－１０はジケトピペラジン脱離が進行しやすい配列で、ＷＯ２０２２／０９７５４０の方法を適用するとジケトピペラジン脱離は大幅に抑制可能であるが、一方で新たな副生成物としてカルバミン酸塩由来のダイマーウレア体が生成することが確認されている。特定の理論に拘束されないが、カルバミン酸塩が安定に存在する場合、縮合剤とカルバミン酸アニオンが反応して生じるイソシアネートに、隣接するＮ末端のアミノ基が求核攻撃して分子間で反応することでダイマーウレア体が生成していると考えられる。本実施例では、固相担持されたペプチド配列として化合物１－２－１０を用い、中和工程の追加およびレジン洗浄工程への酸・塩基の添加を行うことで、ペプチド合成において生じる不純物（ジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体）の低減の程度を比較し、両方の問題を共に低減可能な適切な条件の範囲を特定した。
基本操作Ｄ（表７、ｒｕｎ１、４）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表７中に記載の塩基を表７中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンをｒｕｎ１ではＤＭＦで８回、ｒｕｎ４ではＤＭＳＯで６回、いずれも１カラムあたり０．７ｍＬを用いて洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔあるいはＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表７のｒｕｎ４においては、基本操作Ｄに基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＳＯ溶液（０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、溶液をフリットから排出した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド化合物（ＴＭ）（４－１＊）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体（化合物４－２＊）とダイマーウレア体（化合物４－３＊）の生成を確認した。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物４－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８９５．６１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．６６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（化合物４－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７２７．５２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ダイマーウレア体（化合物４－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１２０１．７７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
基本操作Ｅ（表７、ｒｕｎ２、３、６～２５）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表７中に記載の塩基を表７中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンを表７に記載の洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）を用いて洗浄した。複数回の洗浄操作において、同一もしくは異なる溶媒、または酸洗浄との組み合わせで実施しており、それらの順序および洗浄回数を表７に示した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とホスホニウム系の縮合剤（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表７のｒｕｎ１７においては、基本操作Ｅに基づき、以下のように実施した。実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。続いてＨＯＡｔ（２当量）とＤＩＰＥＡ（２当量）を溶かしたＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で１回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（０．１８１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．１８１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、溶液をフリットから排出した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
基本操作Ｆ（表７、ｒｕｎ５）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを表７に記載の脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒(１カラムあたり０．７ｍＬ)で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間静置し、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表７に記載の塩基を表７に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。続いて、中和工程として、ＨＯＡｔ（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＳＯ溶液０．４ｍＬ（固相に担持されたペプチドに対して、およそ２当量相当）を加えてさらに５分間静置した。溶液をフリットから排出した後、レジンを表７に記載の洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（０．１８１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．１８１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表７のｒｕｎ５においては、基本操作Ｆに基づき、以下のように実施した。実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を加えて室温で１０分間静置し、脱Ｆｍｏｃを行った。続いて、中和工程として、ＨＯＡｔ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＳＯ溶液０．４ｍＬ（固相に担持されたペプチドに対して、およそ４当量相当）を加えてさらに５分間静置した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（０．１８１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．１８１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、溶液をフリットから排出した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
　得られた結果（それぞれの条件での、化合物４－１＊、化合物４－２＊、化合物４－３＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　ｒｕｎ１は一般的なペプチド合成において実施されている脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程である（比較実験）。脱Ｆｍｏｃ工程に用いる塩基にピペリジン（ｐｉｐ）、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に用いる溶媒にＤＭＦが使用されている。この条件においては、２残基欠損したジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成が７５％程度確認され、目的物は２５％程度であった。それに対し、ｒｕｎ２に示す結果の通り、ＷＯ２０２２／０９７５４０の方法を用いるとジケトピペラジン脱離体の生成は４％程度まで抑制することができるが、新たな副生成物としてダイマーウレア体が３０％程度確認され、目的物は６８％程度となった。
　これに対し、ｒｕｎ３に示す通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程に用いる溶媒にいずれもＤＭＳＯを用いたところ、ジケトピペラジン脱離体の生成が１０％程度、ダイマーウレア体の生成が７％程度に低減され、目的物は８３％程度まで向上した。
　ジケトピペラジン脱離体とダイマーウレア体の生成をともに抑制するべく、縮合剤をＰｙＯｘｉｍに固定し、脱Ｆｍｏｃ工程後のレジン洗浄工程の条件検討を行った。
　まず、ｒｕｎ５に示す通り、脱Ｆｍｏｃ工程の後に2当量のＨＯＡｔを加える中和工程をはさんだところ、ジケトピペラジン脱離体の生成を８％程度、ダイマーウレア体の生成を４％程度に抑制することができた。特定の理論に拘束されないが、ダイマーウレア体を低減することができた本結果は、中和工程によってカルバミン酸塩の分解が進行したためであると考えられる。また、ｒｕｎ６に示す通り、中和工程と同じ目的で、レジン洗浄工程６回中の６回目のみに２当量のＨＯＡｔを含むＤＭＳＯ溶液での洗浄を行うと、中和工程を用いた場合に比べてさらにジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成を抑制することができた。
　一方で、ｒｕｎ６からｒｕｎ８に示す通り、２当量のＨＯＡｔを含むＤＭＳＯ溶液にさらされる時間が長いほどジケトピペラジン脱離体の生成が増加するものの、一般的な方法であるｒｕｎ１と比較して、依然として優位な効果を示すことがわかった。
　ｒｕｎ９からｒｕｎ１２に示す通り、酸を含む洗浄溶媒にＤＩＰＥＡを加えると、洗浄溶媒にさらされる時間が長い場合にも、短時間の場合と同様にジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成をともに抑制することができた。これは、洗浄時間等、各工程にかかる時間が延長するスケールアップ時にも適用可能であることを示す。
　ｒｕｎ１３およびｒｕｎ１４に示す通りレジン洗浄工程６回のうち１回目にＨＯＡｔとＤＩＰＥＡを含むＤＭＳＯ溶液で洗浄した場合には、６回目に行う場合に比べてダイマーウレア体の生成がわずかに増加するのに対し、３回目に行う場合はｒｕｎ１５およびｒｕｎ１６に示す通り、６回目に行う場合と同等にジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成を抑制できることが確認できた。
　さらに、ｒｕｎ１７およびｒｕｎ１８に示す通り、レジン洗浄工程６回のうち、ＨＯＡｔとＤＩＰＥＡを含むＤＭＳＯ溶液での洗浄以外の残り５回を２当量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＳＯ溶液で洗浄したところ、残り５回をＤＭＳＯのみで洗浄した場合に比べてジケトピペラジン脱離体の生成をさらに抑制できることが確認できた。
　なお、ｒｕｎ１９からｒｕｎ２５に示す通り、酸と塩基を含むＤＭＳＯ溶液での洗浄、および残り５回の塩基を含むＤＭＳＯ溶液での洗浄における酸や塩基として、Ｏｘｙｍａ、４－ニトロフェノール、ＨＯＯＢｔ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、ピリジン塩酸塩を用いた場合にも、ジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成をともに抑制できることを確認した。
　以上、実施例４の結果より、ジケトピペラジン脱離体が問題となり、ＷＯ２０２２／０９７５４０の条件にてダイマーウレア体の生成が新たな問題になるペプチド配列に対して、ジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成をともに抑制可能な各工程（脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程）の範囲が特定された。なお、ジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成抑制において、本実施例は本発明の一部分であり、実施例４に示す反応条件の組み合わせに限定されない。
実施例５：実施例４にて見出した条件によるペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果のペプチド配列一般性確認実験
　本実施例では、実施例１－２－４にて調製した種々のペプチド配列（表８のＣｏｒｅ２まで伸長したペプチド配列、化合物１－２－４～化合物１－２－９および化合物１－２－１１～化合物１－２－１２）に対して、一般的な従来法（条件－１）と実施例３に記載の本発明の方法（条件－２）と本発明実施例４にて見出した方法（条件－３）でＣｏｒｅ１に記載のアミノ酸を伸長し、ジケトピペラジン脱離体およびカルバミン酸塩由来の副生成物の生成量を比較した。
　なお、ｒｕｎ１においては、一般的な従来法として実施例２、表５、ｒｕｎ１に記載の方法でＣｏｒｅ１に記載のアミノ酸を伸長した。
条件－３（本発明実施例４にて見出した方法）
　実施例１－２－４にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－４～化合物１－２－９および化合物１－２－１１～化合物１－２－１２（それぞれ表６のｒｕｎ１から８に対応））１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。続いてＨＯＡｔ（２当量）とＤＩＰＥＡ（２当量）を溶かしたＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で１回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物３－１－１＊～化合物３－１－５＊および化合物５－１－１＊～化合物５－１－２＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物３－２－１＊～化合物３－２－５＊および化合物５－２－１＊～化合物５－２－２＊）の生成を確認した。
　なお、ｒｕｎ１においては、反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物２－１＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物２－２＊）と６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）の生成を確認した。
　各配列、各条件におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量を表８に示す。表８に示すジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体、およびカルバミン酸塩由来副生成物のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとした時の、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体のＵＶ面積パーセントである。なお、表８に示すｒｕｎ１におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量は６員環状アミジン骨格構造体の生成量も含んだ値を示している。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ７）（化合物５－１－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６３３．４２（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．４１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ７）（化合物５－２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４５３．５５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　カルバミン酸塩由来副生成物（ｒｕｎ７）（化合物５－３－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４１２．２３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ８）（化合物５－１－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６４５．４１（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．３９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ８）（化合物５－２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４２３．５３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　カルバミン酸塩由来副生成物（ｒｕｎ８）（化合物５－３－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４５２．２４（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：１．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
　ｒｕｎ１～６の結果より、実施例４に記載の配列に限らず、種々のペプチド合成において、一般的な従来法に比べて本発明実施例４にて見出した方法（条件－３）で伸長を行う場合にジケトピペラジン脱離体の抑制効果があることを確認した。
　ｒｕｎ７およびｒｕｎ８において、これらの配列では本発明実施例３の方法（条件－２）を適用すると、従来法に比べジケトピペラジン脱離体の生成を抑制できる一方で、カルバミン酸塩由来の副生成物（化合物５－３－１＊および化合物５－３－２＊）が生成することが確認された。特定の理論に拘束されないが、カルバミン酸塩が安定に存在する場合、縮合剤とカルバミン酸アニオンが反応して生じるイソシアネートに、切り出し時に使用するＴＦＥが求核攻撃することで生成していると考えられる。
　これらの配列に対し、本発明実施例４にて見出した方法（条件－３）で伸長を行うと、カルバミン酸塩由来の副生成物およびジケトピペラジン脱離体の両方の生成を抑制できることが確認された（ｒｕｎ７およびｒｕｎ８）。特定の理論に拘束されないが、カルバミン酸塩由来の副生成物を低減することができた本結果は、酸による洗浄によってカルバミン酸塩の分解が進行したためであると考えられる。
　以上、実施例５の結果より、特定のペプチド配列に限らず、種々のペプチド合成において、一般的な従来法に比べ、本発明実施例４で見出した方法にて伸長を行う場合には一般性をもってジケトピペラジン脱離体およびカルバミン酸塩由来の副生成物の生成をともに抑制できることを確認した。
実施例６：実施例４にて見出した条件によるペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果の伸長するカルボン酸の基質一般性確認実験
　本実施例では、実施例１－２－４にて調製したペプチド配列（化合物１－２－１０）に対して、本発明実施例４で見出した方法（条件－４）でＣｏｒｅ１に記載の種々カルボン酸を伸長し、ジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成量を確認した。
条件－４（本発明実施例４にて見出した方法）
　実施例１－２－２にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－２から実施例１－２－４にて調製した化合物１－２－１０）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＳＯ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＳＯ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。続いてＨＯＡｔ（２当量）とＤＩＰＥＡ（２当量）を溶かしたＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で１回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（２当量）のＤＭＳＯ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、表９に記載の伸長するカルボン酸（０．１８１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．１８１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇまたはＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物６－１－１＊～化合物３－１－６＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物６－２－１＊～化合物６－２－６＊）およびダイマーウレア体（化合物４－３＊）の生成を確認した。
　各配列におけるジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）およびダイマーウレア体の生成量を表９に示す。なお、表９に示すジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体およびダイマーウレア体の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体およびダイマーウレア体のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとした時の、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体およびダイマーウレア体のＵＶ面積パーセントである。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物６－１－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９４７．６０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物６－２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７７９．５３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．１１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｂｏｃ－ＭｅＡｌａ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物６－１－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７７３．６２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｂｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物６－２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６０３．５８（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．２９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｃｂｚ－Ｐｒｏ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ３）（化合物６－１－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８１９．５８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｃｂｚ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ３）（化合物６－２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６４９．６１（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．２７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ａｃ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ４）（化合物６－１－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６３０．５０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．２１分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ａｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ４）（化合物６－２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４６２．４２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｔｆａ－Ａｉｂ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ５）（化合物６－１－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７６９．５６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｔｆａ－Ａｉｂ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ５）（化合物６－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６０１．５４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．９８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｎｓ－Ａｉｂ－１－ＡＣＰｒＣ－ＭｅＡｌａ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ６）（化合物６－１－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８５８．５４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．０９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｎｓ－Ａｉｂ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ６）（化合物６－２－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９０．４１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
　以上、実施例６の結果より、特定のＦｍｏｃアミノ酸に限らず種々のカルボン酸の伸長において、本発明の方法で伸長を行うことでジケトピペラジン脱離体やダイマーウレア体の生成を抑制して、目的ペプチドを合成できることを確認した。
実施例７：脱Ｆｍｏｃ工程におけるカルバミン酸塩の存在確認と、ジケトピペラジン脱離に及ぼす影響の確認
　実施例中に記載する化合物を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
　実施例中では以下の略号を使用した。
ＮＭＲ：核磁気共鳴分光法
ＲＯＥＳＹ：回転座標系Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果分光法
ＮＯＥＳＹ：核Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果分光法
ＨＳＱＣ：異種核一量子相関
ＨＭＢＣ：異種核多結合相関
ｃｐｄ.：化合物
　ＮＭＲ測定はＢｒｕｋｅｒ社製のＡＶＡＮＣＥ　ＩＩＩ　６００　Ｃｒｙｏ－ＴＣＩまたはＡＶＡＮＣＥ　ＩＩＩ　ＨＤ　６００　ＢＢＦＯを用いて２９８Ｋにて行った。
　複数の窒素原子を含む塩基がプロトン化されカチオンとなり系中のアニオンと塩を組む場合には、いずれかの窒素原子がプロトン化されたものがカチオン源となり得る。例えば、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）の場合には、下の三つがカチオン源となる可能性が考えられるが、本明細書ではいずれのカチオンが対応するアニオンと塩を形成したとしてもそれぞれを区別することなくＤＢＵ塩と呼ぶこととする（図１）。他の塩基、例えば、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）やイミノトリス（ジメチルアミノ）ホスフォオラン（ＨＰ１（ｄｍａ））についても同様にＴＭＧ塩もしくはＨＰ１（ｄｍａ）塩、ＭＴＢＤ塩と呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
化合物１－４－１、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－１－ベンジル－２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－エチル］カルバマート（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）の合成
　市販のＮ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ，ＣＡＳ：３５６６１－４０－６，化合物ａａ２－１２）（２．０ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１４ｍＬ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（４ｍＬ）の混合溶液に対し室温で１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（１．１９ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)（０．７６７ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）を加えた後、氷冷下ジメチルアミンのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２．０Ｍ、２．８４ｍＬ、５．６８ｍｍｏｌ）をさらに加え１５分撹拌した。溶液に酢酸イソプロピル（２０ｍL）を加え、有機相を１Ｍの塩酸（２０ｍＬ）で二回、水（５０ｍＬ）で一回、半飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で二回、半飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍL）で二回洗浄した。得られた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過し得られた母液の溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をトルエンで二回共沸させた後、５℃で放冷した結果、化合物１－４－１の白色結晶（１．８８ｇ、８８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｔｏｌｕｅｎｅ－ｄ８，２９８Ｋ）δ７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．２１－７．１６（ｍ，２Ｈ），７．１４－７．０７（ｍ，２Ｈ），７．０５－７．００（ｍ，４Ｈ），７．００－６．９５（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＮＨ），４．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，８．４，６．０Ｈｚ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５，７．４Ｈｚ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５，７．４Ｈｚ），４．０３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０，８．４Ｈｚ），２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０，６．０Ｈｚ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ）．
　１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ｔｏｌｕｅｎｅ－ｄ８，２９８Ｋ）δ１７１．１，１５５．９，１４４．６，１４１．８，１２９．９，１２８．５，１２７．８（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｐｅａｋ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＣＨ－ＨＳＱＣ ），１２７．３，１２７．０，１２５．６，１２５．４，１２０．２，６７．２，５２．３，４７．７，４０．２，３６．０，３５．０．
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４１５．４４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例７－１：化合物１－４－１をＤＢＵにて処理した際のＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ の存在確認
実施例７－１－１：化合物１－４－１をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液中でＤＢＵにて処理した際の生成物
　化合物１－４－１（１２．９ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液（０．５ｍＬ）の１Ｈ－ＮＭＲを測定した（図１－ｂ））後、当該溶液に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（５．１１μＬ、０．０３４ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌後、１Ｈ－ＮＭＲ（図１－ａ））、１Ｄ－ＲＯＥＳＹ（（図２－ａ）－２）、（図２－ａ）－３））を測定した。その結果、主に３つの化合物が生成していることをＮＭＲスペクトルから確認した。すなわち、ジベンゾフルベン、および、化合物１－４－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）、Ｎ－［（１Ｓ）－１－ベンジル－２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ－エチル]カルバマートＤＢＵ塩（化合物１－４－３ａ，ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）の３つが当該溶液中に存在しており化合物１－４－２と化合物１－４－３ａが化学交換を起こしていることを確認した。なお、当該溶液中の化合物１－４－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）の同定に関しては本実施例（実施例７－１－１）に、化合物１－４－３ａの同定に関しては実施例７－１－３で詳しく説明した。
ＤＭＦ－ｄ７中、化合物１－４－１に対してＤＢＵを作用させ生じる化合物１－４－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）と化合物１－４－３ａが化学交換を起こしていることとそれらの比率の確認
　当該溶液の１Ｄ－ＲＯＥＳＹを測定した結果（４．８４ｐｐｍおよび３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起、図２－ａ）－２、図２－ａ）－３）、化合物１－４－３ａの４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－４－２のαメチンのプロトンに相当する３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルが系中で化学交換を起こしていることを確認した（（図２－ａ）－２）、（図２－ａ）－３））。すなわち、４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図２－ａ）－２）、３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図２－ａ）－３）、選択励起したシグナルと同位相のＲＯＥＳＹが観測されたことから、それぞれのシグナルは化学交換していることを確認した（図２－ａ））。さらに、１Ｈ－ＮＭＲの１Ｈシグナルの積分比から化合物１－４－３ａと化合物１－４－２の存在比が８２：１８であることを確認した（図２－ｂ））。
当該溶液中の化合物１－４－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）の存在確認
　別途用意した化合物１－４－２の標品３μＬを当該溶液に混合し１Ｈ－ＮＭＲ（図３－ａ）－３、図３－ｂ））および１Ｄ－ＮＯＳＥＹ（図３－ａ）－４、図３－ａ）－５）を測定した。
　１）化合物１－４－２の標品３μＬを当該溶液に加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、当該溶液の１Ｈ－ＮＭＲで観測された３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナル（図３－ａ）－２）と化合物１－４－２の標品で観測される３．９４ｐｐｍの１Ｈシグナル（図３－ａ）－１）が分離することなく３．９５ｐｐｍにトリプレットの１Ｈシグナルとして完全に一致した状態で観測された（図３－ａ）－３）。
　２）化合物１－４－２の標品３μＬと当該溶液に加えて得られる溶液の１Ｄ－ＮＯＥＳＹを測定した結果（４．８４ｐｐｍおよび３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起）、４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図３－ａ）－４）、３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図３－ａ）－５）、選択励起したシグナルと同位相かつ元のシグナルと同形のＮＯＥＳＹ（４．８５ｐｐｍ：ダブルトリプレット、３．９５ｐｐｍ：トリプレット）が観測された。
　３）化合物１－４－２の標品３μＬを当該溶液に加えると、化合物１－４－３ａの４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－４－２の３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比が８２：１８（化合物１－４－２を加える前の積分比[図２－ｂ）]）から６１：３９に変化した（図３－ｂ））。
　以上の１）～３）の３点から当該溶液中に化合物１－４－２が存在することを確認した。
実施例７－１－２：化合物１－４－２に対して １３ ＣＯ ２ を吹き付けてＤＢＵを作用させたときに生じる化合物１－４－３ａの同定
　実施例７－１－２中の下記の実験操作はすべてグローブボックス内（窒素雰囲気下、脱水条件）で実施した。なお、マイクロウェーブで高温に加熱後、真空下で放冷すること（ｘ２）で活性化させたＭＳ４Ａで１２時間以上乾燥させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）を溶媒として用い、グローブボックス内でバルブ付き高気密ＮＭＲチューブにサンプリングし外気との接触を完全に遮断したサンプルでＮＭＲを測定した。
溶液Ａ（ＳｏｌＡ）の調整
　化合物１－４－２(４．６４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ)のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた後、１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ｂ））、１３Ｃ－ＮＭＲ（図５－ａ）），１Ｄ－ＮＯＥＳＹ（４．７７ｐｐｍおよび３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起、（図４－ｃ）、図４－ｄ））を測定した。その後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（３．９７μＬ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加え化合物１－４－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）を含む溶液Ａを調整し１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ｅ））、１３Ｃ－ＮＭＲ（図５－ｂ））を測定した。
溶液Ａ中の化合物１－４－３ａの同定
　化合物１－４－３ａの構造は、１Ｈ－ＮＭＲ，１３Ｃ－ＮＭＲ，１Ｄ－ＮＯＥＳＹの測定結果から矛盾なく説明できる。
　４）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、原料の化合物１－４－２の１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ａ））では観測されなかった４．７６ｐｐｍの新たな１Ｈシグナルを確認した（図４－ｂ））（カルバマートアニオンもしくはカルバミン酸の生成、図５－a）参照）。
　５）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた溶液の１Ｈ－ＮＭＲで観測された４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－４－２のαメチレンに相当する３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分値を測定したところ、５２：４８の比率であることを確認した（図４－ｆ）。
　６）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた溶液の１Ｄ－ＮＯＥＳＹを測定した結果、４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９６ｐｐｍ１Ｈシグナルから（図４－ｃ））、また、３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルから同位相のＮＯＥＳＹが観測された（図４－ｄ））ことから両者が化学交換を起こしていることを確認した。
　７）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた後にさらにＤＢＵを加えた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、ＤＢＵを加える前に観測された４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルが、ＤＢＵを加えると、高磁場シフトし４．８３ｐｐｍに変化することを確認した（図４－ｅ））（化合物１－４－３ａの生成確認）。
　８）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせた後にさらにＤＢＵを加えた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、αメチンの４．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルと１３Ｃラベルされた１６１．５ｐｐｍのカルボニルの１３Ｃシグナル（図５－ｂ））との間で２．７Ｈｚの３ＪＣＨのカップリングを確認した（図４－ｇ））。
　９）化合物１－４－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を１分間バブリングさせて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲを測定し（図５－ａ））、その後さらにＤＢＵを加えて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲを測定し（図５－ｂ））比較した結果、１３Ｃラベルされたカルボニルに相当する１３ＣシグナルがＤＢＵを加えることで１５７．１ｐｐｍから１６１．５ｐｐｍへ高磁場シフトしたことを確認した（化合物１－４－３ａの生成確認）。
　４）～９）の６点から溶液Ａ（ＳｏｌＡ）の調整で、化合物１－４－２の１級アミンと１３ＣＯ２が反応し、カルバマートもしくはカルバミン酸が形成され、そこに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させることにより化合物１－４－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）が生成したことを確認した。上記実験により化合物１－４－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）が生成したとして矛盾はない。本構造については実施例７－１－３でより詳細に同定を行った。
実施例７－１－３：溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中に存在する化合物１－４－３ａの構造証明
　実施例７－１－３に記載されている下記の実験操作はすべてグローブボックス内（窒素雰囲気下、脱水条件）で実施した。なお、マイクロウェーブで高温に加熱後、真空下で放冷すること（ｘ２）で活性化させたＭＳ４Ａで１２時間以上乾燥させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）を溶媒として用い、グローブボックス内でバルブ付き高気密ＮＭＲチューブにサンプリングし外気との接触を完全に遮断したサンプルでＮＭＲを測定した。
溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の調整
　化合物１－４－１（１１．５ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液（０．５ｍＬ）に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（４．５６μＬ、０．０３１ｍｍｏｌ）を加え溶液Ｂを調整し１Ｈ－ＮＭＲを測定した（ＳｏｌＢ、図６－ａ））。
溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）の調整
　上記の溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）（０．１５ｍＬ、図６－ａ）、０．００８４ｍｍｏｌ）と溶液Ａ（ＳｏｌＡ）（０．３５ｍＬ、ＳｏｌＡ、図６－ｃ）、０．０１６８ｍｍｏｌ）を混合させ１Ｈ－ＮＭＲ（図６－ｂ）），１３Ｃ－ＮＭＲ，ＣＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｃ）），ＣＨ－ＨＳＱＣ，ＮＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｂ）），ＮＨ－ＨＳＱＣ（図７－ａ））を測定した。
溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）中の化合物１－４－３ａの存在確認
　溶液Ａの１Ｈ－ＮＭＲで観測された化合物１－４－３ａのαメチンに相当する４．８３ ｐｐｍの１Ｈシグナル（図６－ｃ））と溶液Ｂの１Ｈ－ＮＭＲで観測された４．８５ ｐｐｍの１Ｈシグナル（図６－ａ））がそれぞれ４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルにシフトしながら完全に一致したことを確認した（図６－ｂ））。すなわち、溶液Ｂで観測された４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルの中でカップリングのない低磁場側のピーク（図６－ａ）の点線で囲ったピーク）と、溶液Ａで観測された４．８３ｐｐｍの中で１Ｈシグナルの１３Ｃとのカップリング（２．７Ｈｚ）が認識できる低磁場側のピーク（図６－ｂ）の丸で囲ったピーク）は、溶液Ｂと溶液Ａを混合させるとお互いにシフトし中間のブロード形状のピーク（（図６－ｂ）の丸で囲ったピーク）に変換されることを確認した。これらの結果から、１Ｈシグナルが（ＳｏｌＢ）に化合物１－４－３ａが存在することを確認した。
溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中の化合物１－４－３ａの構造証明
　溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中の化合物１－４－３ａの構造は、１Ｈ－ＮＭＲ（図６－ｂ）），１３Ｃ－ＮＭＲ，ＣＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｃ）），ＣＨ－ＨＳＱＣ，ＮＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｂ）），ＮＨ－ＨＳＱＣ（図７－ａ））を用いることで、カルバミン酸ＤＢＵ塩であることを矛盾なく説明できる。
　１０）溶液Ａ（ＳｏｌＡ）＋溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の混合溶液のＣＨ－ＨＭＢＣを測定した結果、αメチンの４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルと溶媒の１３Ｃシグナルより高い１３Ｃラベルされた１６１．５ｐｐｍの１３Ｃシグナルとの間にＣＨ－ＨＭＢＣ相関があることを確認した（図７－ｃ））。すなわち、ＣＨ－ＨＭＢＣ相関および１３Ｃシグナルの値、実験的に１３Ｃの由来がバブリングした１３ＣＯ２であるため、１６１．５ｐｐｍの１３Ｃシグナルはカルバマートのカルボニルと同定して矛盾がない。
　１１）溶液Ａ（ＳｏｌＡ）＋溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の混合溶液のＮＨ－ＨＳＱＣを測定した結果、ＮＨの１Ｈシグナルと同定された５．３０ｐｐｍと９１．４ｐｐｍの１５ＮシグナルにＮＨ－ＨＳＱＣ相関がみられたことから９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルはカルバマートの窒素原子と同定した（図７－ａ））。なお、ベンジルメチレンの２．９１／２．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルとカルバマートの窒素原子に相当する９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルとの間にはＮＨ－ＨＭＢＣ相関も確認しており（図７－ｂ））、１５Ｎシグナルの値としても９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルがカルバマートの窒素原子であることを矛盾なく説明できる。
　１０）、１１）の２点から溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）を調整した際、化合物１－４－３ａが系中に存在することを確認した。また下記の通り、化合物１－４－３ａのカルバマート部位のＮＭＲシグナルをすべて帰属することができ（図８）、すべてのＮＭＲシグナルの値が化合物１－４－３ａの構造を矛盾なく説明できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ）δ７．２９－７．２３（ｍ，４Ｈ），７．２２－７．１１（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．９０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，６．２Ｈｚ，３ＪＣＨ＝　２．７Ｈｚ），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．３，６．８Ｈｚ），２．８７（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．３，６．２Ｈｚ），２．７８（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ）δ１７３．６（ｑＣ），１６１．５（ｑＣ），１３９．４（ｑＣ），１２９．７（ＣＨ　ｘ２），１２８．３（ＣＨ　ｘ２），１２６．３（ＣＨ），５３．０（ＣＨ），４０．０（ＣＨ２），３６．４（ＣＨ３），３４．８（ＣＨ３）．
　１５Ｎ－ＮＭＲ（６１ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ，ａｓｓｉｇｎｅｄ ｂｙ ＮＨ－ＨＳＱＣ ａｎｄ ＮＨ－ＨＭＢＣ）δ９６，９１．
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基をＤＢＵにて処理した際、ジベンゾフルベンの脱離に続いて脱炭酸まで進行して完全にアミノ基が露出するのではなく、大部分はＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２として存在していることが確認された。また、その存在と存在比率は１Ｈ－ＮＭＲにて確認できることが示された。
実施例７－２：化合物１－４－１を各種溶媒中、ＤＢＵまたはピペリジンにて処理した際のカルバミン酸塩の存在確認
基本操作
　化合物１－４－１（約２５ｍｇ）の重溶媒溶液（１．２５ｍＬ，テトラヒドロフラン－ｄ８（ＴＨＦ－ｄ８）［Ｅｎｔｒｙ１］，トルエン－ｄ８［Ｅｎｔｒｙ２］，ジクロロメタン－ｄ２（ＤＣＭ－ｄ２）［Ｅｎｔｒｙ３］，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）［Ｅｎｔｒｙ４］，ジメチルスルホキシド－ｄ６（ＤＭＳＯ－ｄ６）[Ｅｎｔｒｙ５]を調整後、当該溶液１．０ｍＬを二つにわけ（０．５ｍＬ）、片方には１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）(６．８μＬ)を、もう片方にはピペリジン（６７．５μＬ）を作用させ、それぞれのＮＭＲを測定し、化合物１－４－３ａと化合物１－４－２の比率を１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた（表１１）。本実験において、化合物１－４－１はｅｎｔｒｙ１では２５．１ｍｇ、ｅｎｔｒｙ２では２４．８ｍｇ、ｅｎｔｒｙ３では２５．０ｍｇ、ｅｎｔｒｙ４では２５．３ｍｇ、ｅｎｔｒｙ５では２５．２ｍｇ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基をＤＢＵを用いて処理した場合には、いずれの溶媒中においてもカルバミン酸塩が過半数以上の比率で存在することが確認できた。一方、ピペリジンを用いて処理した場合には、いずれの溶媒中においてもカルバミン酸塩は検出されず、脱炭酸まで進行し完全にアミノ基が露出していることが確認できた。
　本知見を基に固相での実験結果を考察した場合、特定の理論に拘束されるものではないが、以下の式の通り、カルバミン酸塩の存在によって、ジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことが低減効果につながっていると説明できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　例えば、ＮＭＲにてカルバミン酸塩の形成が確認されたＤＢＵでの脱保護と確認されなかったピペリジンでの脱保護を固相実験にて比較し、どのような影響を及ぼすか確認した。実施例２に記載の基本操作Ｂと同様の手法にて、表１２、ｒｕｎ１～２に記載の試薬や溶媒を用いて反応を行い、得られた結果（それぞれの条件での、化合物２－１＊、化合物２－２＊、化合物２－３＊、化合物２－４＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
　特定の理論に拘束されないが、表１２、ｒｕｎ１（２％ＤＢＵ）とｒｕｎ２（２０％ピペリジン）を比較した際、ＤＢＵにて処理した場合にジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成が大きく抑制できるのは、カルバミン酸塩の存在によってジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことによると、矛盾なく説明できる。
実施例７－３：化合物１－４－１をＤＭＳＯ中、各種塩基にて処理した際の化合物１－４－３ａの存在確認
基本操作
　化合物１－４－１（約１０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド－ｄ６（ＤＭＳＯ－ｄ６）溶液（０．５ｍＬ）を五つ調整後、ピペリジン（６７．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ１）、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）（１３．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ２）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（６．８μＬ，Ｅｎｔｒｙ３）、７－メチル－１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン（ＭＴＢＤ）（１３．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ４）、イミノトリス（ジメチルアミノ）ホスフォオラン（ＨＰ１（ｄｍａ））（１３．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ５）、の五つの塩基それぞれを作用させ、それぞれのＮＭＲを測定し、化合物１－４－３ａおよび化合物１－４－２の比率を１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた（表１３）。本実験において、化合物１－４－１はｅｎｔｒｙ１では１０．１ｍｇ、ｅｎｔｒｙ２では１０．０ｍｇ、ｅｎｔｒｙ３では１０．１ｍｇ、ｅｎｔｒｙ４では１０．１ｍｇ、ｅｎｔｒｙ５では１０．１ｍｇ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基を共役酸のｐＫａが２３以上の範囲の塩基を用いて処理した場合にカルバミン酸塩が９割の比率で存在することが確認できた。
　本知見を基に固相での実験結果を考察した場合、特定の理論に限定されるものではないが、実施例２においてｒｕｎ３に対し、ｒｕｎ４～７の条件でジケトピペラジン脱離等を低減できたのは、上述の通り、カルバミン酸塩の存在によってジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことが寄与している。
　以上、特定の理論に限定されるものではないが、Ｆｍｏｃ保護を塩基で処理した際、Ｎ末端のアミノ基がカルバミン酸塩として存在することによってジケトピペラジン脱離等を軽減できる。また、実施例７－３の結果から、カルバミン酸塩として存在可能な塩基の範囲が特定された。
実施例８：見出した条件による液相法でのペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果の確認をした実験
　本実施例では、実施例１－３にて調製した直鎖ペプチドに対して、本発明の方法（条件－Ｘ）にて表１４に記載のＦｍｏｃ保護アミノ酸を伸長し、液相法におけるジケトピペラジン脱離体およびダイマーウレア体の生成量を確認した。
条件－Ｘ
　実施例１－３にて既に調製済みの直鎖ペプチド（化合物１－３－１～化合物１－３－２）（０．０６１ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（０．２０ｍＬ）溶液にＤＢＵ（０．００９１ｍＬ、０．０６１ｍｍｏｌ、１当量）を加え、室温で５分攪拌した。反応液にＨＯＡｔ（１６．５２ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ、２当量）とＤＩＰＥＡ（０．０２１ｍＬ、０．１２１ｍｍｏｌ、２当量）のＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）溶液を加え、室温で３分攪拌したものを溶液Ａとした。
　別の反応容器にて、表１４に記載のＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．０７３ｍｍｏｌ、１．２当量）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（３８．４ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ、１．２当量）のＤＭＳＯ（０．２０ｍＬ）溶液にＤＩＰＥＡ（０．０１９ｍＬ、０．１０９ｍｍｏｌ、１．８当量）を加え、室温で３分攪拌した後、別途調製した溶液Ａを滴下して加えた。室温にて１時間攪拌した後、反応溶液の一部をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物８－１－１～８－１－２）およびジケトピペラジン脱離体（化合物８－２－１～８－２－２）の生成を確認した。
　各ペプチド配列におけるジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）の生成量を表１４に示す。なお、表１４に示すジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとしたときの、ジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）のＵＶ面積パーセントである。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物８－１－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１０６９．９７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．３５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ（ｒｕｎ１）（化合物８－２－１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８５．７８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．２６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物８－１－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１０７４．９０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：４．０５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ｐｉｐ（ｒｕｎ２）（化合物８－２－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９３２．６９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　以上、実施例８の結果より、本発明の方法は液相法でのペプチド合成においてもジケトピペラジン脱離体の生成を抑制して、目的ペプチドを合成できることを確認した。
　本発明により、ペプチドの製造において、ジケトピペラジンや６員環状アミジン骨格構造体などの副生成物の形成を抑制して、効率的にペプチド鎖を伸長できることが見出された。本発明は、ペプチド合成の分野において有用である。

Claims (19)

  1. 　ペプチドの製造方法であって、
    （１）固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
    （２）前記工程（１）の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
    （３）前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
  2. 　ペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
    （１）固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
    （２）前記工程（１）の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
    を含む、前記方法。
  3. 　ペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物、６員環状アミジン骨格構造体不純物、およびダイマーウレア体不純物からなる群より選択される少なくとも１種の不純物の生成量を低減させる方法であって、
    （１）固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
    （２）前記工程（１）の後に、スルホキシド系溶媒を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
    を含む、前記方法。
  4. 　（３）前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程をさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　固相法により行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記第一のペプチドが、固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　液相法により行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記工程（２）が、前記第一のペプチドにおけるＦｍｏｃ骨格を含む保護基を除去する工程である、および／または前記第一のペプチドにおけるＦｍｏｃ骨格を含む保護基をカルバミン酸塩の形態に変換する工程である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記工程（２）に先立って、前記第一のペプチドを単一の塩基としてのピペリジンで処理する工程を含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記工程（２）に先立って、前記第一のペプチドを共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満である単一の塩基で処理する工程を含まない、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記工程（２）により得られる第一のペプチドの少なくとも一部が、カルバミン酸塩の形態にある、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記工程（２）における前記溶媒が、スルホキシド系溶媒を５０ｖ／ｖ％以上含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記スルホキシド系溶媒が、ＤＭＳＯ、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、およびメチルフェニルスルホキシドからなる群より選択される１種または複数種である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記工程（２）における前記塩基が、アミジン類、グアニジン類およびホスファゼン類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記工程（２）における前記塩基が、ＤＢＵ、ＭＴＢＤ、ＴＭＧ、Ｐ１ｔＢｕ、Ｐ２ＥｔおよびＨＰ１（ｄｍａ）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記第一のペプチドが２～３０個、２～２０個、２～１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸残基を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および／または前記保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸を含む、および／または前記保護基を有するアミノ酸がＮ－置換アミノ酸である、請求項１および４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記第一のペプチドのＮ末端から２残基目のアミノ酸が、Ｎ－置換アミノ酸である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記工程（３）における前記縮合剤が、塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがＰＦ６ －またはＢＦ４ －であるか、またはカルボジイミド系縮合剤である、請求項１および４～１８のいずれか一項に記載の方法。
PCT/JP2023/017114 2022-05-02 2023-05-02 ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法 WO2023214577A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022075743 2022-05-02
JP2022-075743 2022-05-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023214577A1 true WO2023214577A1 (ja) 2023-11-09

Family

ID=88646535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/017114 WO2023214577A1 (ja) 2022-05-02 2023-05-02 ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023214577A1 (ja)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012165546A1 (ja) * 2011-05-31 2012-12-06 味の素株式会社 ペプチドの製造方法
WO2018021233A1 (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 積水メディカル株式会社 新規キサンテン保護剤
WO2019123994A1 (ja) * 2017-12-19 2019-06-27 積水メディカル株式会社 新規アルキルジフェニルメタン保護剤
JP7063408B1 (ja) * 2021-07-02 2022-05-09 ペプチスター株式会社 液相ペプチド製造方法
JP7063409B1 (ja) * 2021-07-02 2022-05-09 ペプチスター株式会社 Ｆｍоｃ基を除去する方法
WO2022097540A1 (ja) * 2020-11-05 2022-05-12 中外製薬株式会社 ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012165546A1 (ja) * 2011-05-31 2012-12-06 味の素株式会社 ペプチドの製造方法
WO2018021233A1 (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 積水メディカル株式会社 新規キサンテン保護剤
WO2019123994A1 (ja) * 2017-12-19 2019-06-27 積水メディカル株式会社 新規アルキルジフェニルメタン保護剤
WO2022097540A1 (ja) * 2020-11-05 2022-05-12 中外製薬株式会社 ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
JP7063408B1 (ja) * 2021-07-02 2022-05-09 ペプチスター株式会社 液相ペプチド製造方法
JP7063409B1 (ja) * 2021-07-02 2022-05-09 ペプチスター株式会社 Ｆｍоｃ基を除去する方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COIN IRENE, BEERBAUM MONIKA, SCHMIEDER PETER, BIENERT MICHAEL, BEYERMANN MICHAEL: "Solid-Phase Synthesis of a Cyclodepsipeptide: Cotransin", ORGANIC LETTERS, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 10, no. 17, 1 September 2008 (2008-09-01), US , pages 3857 - 3860, XP055928807, ISSN: 1523-7060, DOI: 10.1021/ol800855p *
KOVACS LUCIANA; DAVIS RYAN A.; GANGULY TANUSHREE; CHAMMAS ROGER; SUTCLIFFE JULIE L.: "Repurposing an atherosclerosis targeting peptide for tumor imaging", BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY, ELSEVIER, FR, vol. 145, 1 December 2021 (2021-12-01), FR , XP086898190, ISSN: 0753-3322, DOI: 10.1016/j.biopha.2021.112469 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7229158B2 (ja) Ｎ－置換アミノ酸を含むペプチドの合成方法
RU2515555C2 (ru) Способ получения дегареликса
US20070249526A1 (en) Process for the preparation of cyclic peptides
JP7411414B2 (ja) ペプチドの製造方法、及び塩基の処理方法
EP4056580A1 (en) Method for producing peptide compound comprising highly sterically hindered amino acid
KR20210098476A (ko) 펩티드 화합물 또는 아마이드 화합물의 탈보호법 및 고상 반응에 있어서의 탈수지 방법, 및 펩티드 화합물의 제조 방법
EP4269422A1 (en) Method for producing peptide compound containing n-substituted-amino acid residue
WO2022097540A1 (ja) ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
TW202138382A (zh) 胜肽化合物的合成法
WO2023214577A1 (ja) ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
WO2023033017A1 (ja) ガニレリクス又はその塩の製造法
US20230135100A1 (en) Process of preparing a peptide epoxyketone immunoproteasome inhibitor, and precursors thereof
TW202409059A (zh) 抑制由二酮哌嗪形成之缺陷的胜肽合成方法
JPH049800B2 (ja)
CN116615411A (zh) 包含n-取代氨基酸残基的肽化合物的制造方法
JP2020529472A (ja) ペプチド化合物の環化放出関連する出願の相互参照
CN117279928A (zh) 包含n-取代氨基酸残基的环状化合物的制备方法
WO2024080333A1 (ja) Ｎ－置換アミノ酸残基を含む環状ペプチド化合物の製造方法
Burov et al. Derivatives of N-amidinoproline and their use in conventional and solid phase peptide synthesis
Vasanthakumar et al. Synthesis of alkyl and aryl esters of N-protected β-homoamino acids from N-protected α-aminodiazoketones

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23799506

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1