JP7063409B1 - Fmоc基を除去する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、Fmoc基の脱保護工程においてはジベンゾフルベン(DBF)が副生する。当該ジベンゾフルベンを残存させたまま次の工程に進むと、9-フルオレニルメチル化などの副反応を引き起こすため、この脱保護工程においてジベンゾフルベンを除去しておく必要があった。
従って、本発明の課題は、Fmоc基脱保護工程で生じるジベンゾフルベンを容易に除去でき、次の縮合工程に影響を及ぼさないFmоc基の除去方法を提供することにある。
[1]Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸誘導体に塩基を反応させてFmоc基を除去する方法であって、当該反応によって生じるジベンゾフルベンを一般式(1)又は(2)
で表される化合物により捕捉させることを特徴とする方法。
[2]L1及びL2が、炭素数1~10の2価の有機基である[1]記載の方法。
[3]Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸誘導体が、Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドである[1]又は[2]記載の方法。
[4]次の工程a~dを含むことを特徴とする液相ペプチド製造方法。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、Fmoc基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
b.縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
c.反応液中の前記Fmoc基でアミノ基が保護された化合物のFmoc基を[1]~[3]のいずれかに記載の方法で除去する工程、
d.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記Fmoc基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。
[5]前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、アミノ基含有化合物である[4]記載の液相ペプチド製造方法。
[6]前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、2価以上の水溶性アミン、アルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミン、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ基含有化合物である[4]又は[5]記載の液相ペプチド製造方法。
[7]前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接またはリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である[4]~[6]のいずれかに記載の液相ペプチド製造方法。
で表される化合物に捕捉させることを特徴とする。
なお、Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後の任意の時点で、必要に応じて保護基を除去することができる。
水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
使用するアミン化合物の当量は、系に存在するFmoc基の量に対して、1~30当量、好ましくは4~20当量、より好ましくは4~10当量である。本明細書において、Fmoc基の脱保護のために用いる塩基を、アミン化合物ということがあるが、本発明の限定を意図するものではない。
一般式(1)又は(2)中L1及びL2は、それぞれ2価の有機基を示す。当該2価の有機基としては、炭素数1~10の2価の有機基が好ましく、より好ましくは、メルカプト基を有していてもよい炭素数1~10の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数6~10のアリーレン基、メルカプト基を有していてもよい炭素数4~9のヘテロアリーレン基が挙げられる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、メルカプトトリメチレン基、メルカプトプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、ペンタメチレン基、フェニレン基、ナフチレン基、インドール基、ベンズイミダゾール基、キノリル基、イソキノリン基などが挙げられる。
Mは水素原子又はアルカリ金属を示す。具体的には、水素原子、ナトリウム、カリウムが挙げられる。
具体的には、メルカプトメタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸、1,3-ジメルカプトプロパンスルホン酸、2-メルカプトベンズイミダゾール-5-スルホン酸ナトリウム、メルカプトメタンホスホン酸ナトリウム、メルカプトエタンホスホン酸、3-メルカプトプロパンホスホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンホスホン酸ナトリウムなどが挙げられる。3-メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム以外の化合物がより好ましい。
前記塩基と式(1)又は(2)の化合物は、同時に添加してもよく、式(1)又は(2)の化合物、次いで塩基の順に添加してもよく、塩基を加えFmoc基の脱離を行ったのちに式(1)又は(2)の化合物を加えてもよく、塩基を加えFmoc基を脱離させたのちに式(1)又は(2)の化合物を加えてもよい。これらのうち、前記塩基と式(1)又は(2)の化合物を同時に添加、又はメルカプト化合物、次いで塩基の順に添加するのが好ましく、式(1)又は(2)の化合物、次いで塩基の順に添加するのがより好ましい。
前記式(1)又は(2)の化合物はジベンゾフルベンと反応し、ジベンゾフルベンとの間で付加体(以下、DBF-メルカプト化合物付加体ということがある)を生成する。当該DBF-メルカプト化合物付加体は、水溶性であるため、分液を行えば水溶液層に移行し、有機層から除去される。本明細書では、塩基、ジベンゾフルベン及び式(1)又は(2)の化合物の3者の共存状態を経て、前記DBF-メルカプト化合物付加体が形成されることを捕捉という。
捕捉によるFmoc基除去工程は、―20~40℃の温度で、5分~5時間行えばよい。
ここで、用いられる水溶液としては、水、又は中性付近のpHを有する水溶液が挙げられる。具体的には、水、塩化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸三ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸三カリウム水溶液等が挙げられる。
また、得られた有機溶媒層は、さらに任意のアミノ酸との縮合反応に利用できる。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、Fmoc基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
b.縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
c.反応液中の前記Fmoc基でアミノ基が保護された化合物のFmoc基を前記の方法で除去する工程、
d.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記Fmoc基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。
このような液相ペプチド合成用担体としては、例えば前記特許文献1-14に記載の化合物が挙げられる。好ましい液相ペプチド合成用担体としては、下記式(I)で表される化合物が挙げられる。
環Aはヘテロ原子を含んでいてもよく、多環性でもよいC4~18の芳香環を示し;
R11は、水素原子であるか、又は環Aがベンゼン環でRbが下記式(a)で表される基である場合には、R14と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか、又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
p個のXは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR17-(R17は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
p個のR12は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示し;
環Aは、p個のXR12に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく;
Raは、水素原子、又はハロゲン原子により置換されていてもよい芳香族環を示し;
Rbは、水素原子、又は式(a):
r、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが4以下を示し;
r個のZは、それぞれ独立して-O-、-S-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-又は-NR18-(R18は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)を示し;
r個のR15は、独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示し;
R14は、水素原子を示すか、R11と一緒になって単結合を示して、環A及び環Bと共にフルオレン環を形成するか,又は酸素原子を介して環A及び環Bと共にキサンテン環を形成してもよく;
環Bは、r個のZR15に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基、及びハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。)で表される基を示し;
Yは、ヒドロキシ基、NHR19(R19は水素原子、アルキル基又はアラルキル基を示す。)又はハロゲン原子を示す。]
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の芳香族複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の芳香族複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
ここで、R17としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などの直鎖又は分岐鎖のC1~10のアルキル基が挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
q個のR13は、それぞれ独立して水素原子であるか、又は酸素原子を介してシリル基若しくは脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
p、qは、それぞれ0~3の整数かつp+qが1以上4以下を示す。
当該有機基中に存在する脂肪族炭化水素基とは、直鎖、分岐状若しくは環状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であり、有機溶媒溶解性の点から、C5以上の脂肪族炭化水素基が好ましく、C5~30の脂肪族炭化水素基がより好ましく、C8~30の脂肪族炭化水素基がさらに好ましい。当該脂肪族炭化水素基の具体例としては、アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられるが、特にアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基が好ましく、アルキル基がより好ましい。さらに、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルケニル基が好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、C3~8のシクロアルキル基がより好ましく、C5~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がさらに好ましく、C8~30の直鎖又は分岐鎖のアルキル基がよりさらに好ましい。
アルケニル基としては、ビニル基、1-プロぺニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、オレイル基などの一価の基、それらから誘導される二価の基が挙げられる。
アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基、1-プロピニル基などが挙げられる。
脂肪族炭化水素基に酸素原子を介して置換し得るシリル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基及び置換基を有していてもよいアリール基から選ばれる3個が置換したシリル基が好ましい。従って、前記脂肪族炭化水素基には、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基及び置換基を有していてもよいアリール基から選ばれる3個が置換したシリルオキシ基が置換していてもよい。ここで、置換基を有していてもよいアリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
好ましい酸素原子を介して置換するシリル基としては、炭素数1~6の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基であり、より好ましくは炭素数1~4の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が3個置換したシリルオキシ基である。シリルオキシ基に置換する3個のアルキル基又はアリール基は、同一でも異なっていてもよい。なお、当該シリルオキシ基は、前記脂肪族炭化水素基に1~3個置換しているのが好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ここで、芳香族環としては、C6~18の芳香族炭化水素環、及びC4~10の芳香族複素環が挙げられる。
具体的なC6~18の芳香族炭化水素環としては、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナントレン環、トリフェニレン環、テトラセン環、インダン環、インデン環、フルオレン環、ビフェニル環などが挙げられる。このうち、ベンゼン環、ナフタレン環、フェナントレン環、フルオレン環がより好ましい。
C4~10の芳香族複素環としては、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~10員環の複素環が好ましく、具体的には、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環、イミダゾール環、ピリジン環、キノリン環、イソキノリン環などが挙げられる。このうち、ヘテロ原子として窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる1~3個を含む5員環~8員環の複素環が好ましく、ピロール環、フラン環、チオフェン環、インドール環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、カルバゾール環、ピラゾール環、インダゾール環がより好ましい。
Raの芳香族環には、1~3個のハロゲン原子が置換していてもよい。
式(a)中のr、sは、それぞれ0~3の整数かつr+sが0~4を示す。
rは、0~4が好ましく、1~3がより好ましく、1~2がさらに好ましい。
ここで、R18としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
s個のR16は、それぞれ独立して酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基を示す。
R15及びR16で表される酸素原子を介してシリル基又は脂肪族炭化水素基で置換されていてもよい脂肪族炭化水素基を有する有機基は、前記のR12及びR13と同じものが挙げられ、前記のR12及びR13と同じものが好ましい。
ハロゲン原子としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。ハロゲン原子で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、sec-ブチルオキシ基、tert-ブチルオキシ基、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基などが挙げられる。
ここで、R19としては、水素原子、C1~10のアルキル基又はC7~20のアラルキル基が好ましい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
アラルキル基としては、C7~16アラルキル基、例えば、ベンジル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、ナフチルメチル基、1-ナフチルエチル基などが挙げられる。
なお、液相ペプチド合成用担体に結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後に、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。その場合の水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
ここでいうリンカーとは、リンカーの一方がカルボキシル基と結合し、他方が液体ペプチド合成用担体と結合する2つの反応基をもつ有機基である。好ましいリンカーは、分子量が約2000以下(好ましくは約1500以下、より好ましくは約1000以下)の有機基であって、反応基として、同じでも異なってもよく、アミノ基、カルボキシル基、及びハロメチル基からなる群より選ばれる少なくとも2つの基を分子内にもつ化合物である。例えば、以下の化合物を挙げることができる。
なお、Fmоc基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドが、水酸基、アミノ基、グアニジル基、カルボキシル基、チオール基、インドール基、イミダゾール基等の反応性に富む官能基を有する場合、これらの官能基にペプチド合成で用いられる一般的な保護基が導入されていてもよく、反応終了後の任意の時点で、必要に応じて保護基を除去することで目的化合物を得ることができる。
水酸基の保護基としてはtBu基、Trt基、Bz基、アセチル基、シリル基等が挙げられ、アミノ基の保護基としては、Boc基、Fmoc基、Cbz基、Trt基、Mmt基、ivDde基等が挙げられ、グアニジル基の保護基としては、Pbf基、Pmc基、ニトロ基等が挙げられ、カルボキシル基の保護基としてはtBu基、メチル基、エチル基、Bz基等が挙げられ、チオール基の保護基としては、Trt基、Acm基、tBu基、S-tBu基等が挙げられ、インドール基の保護基としては、Boc基等が挙げられ、イミダゾール基の保護基としては、Boc基、Bom基、Bum基、Trt基等を挙げることができる。
そのような有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルホルムアミド(DMF)、シクロヘキサン、シクロペンチルメチルエーテル(CPME)、メチル-tert-ブチルエーテル(MTBE)、2-メチルTHF、4-メチルテトラヒドロピラン(4-メチルTHP)、酢酸イソプロピル、クロロホルム、ジクロロメタン、N-メチルピロリドンを挙げることができ、好ましくは、THF、DMF、シクロヘキサン、CPME,MTBE、2-メチルTHF、4-メチルTHP、酢酸イソプロピル、N-メチルピロリドンである。さらに、上記溶媒の2種以上の混合溶媒でもよい。
反応温度は、ペプチド合成において一般的に用いられる温度が、例えば、-20~40℃が好ましく、より好ましくは0~30℃である。反応時間(1サイクルの時間)は、通常0.5~30時間である。
アミノ酸活性エステルスカベンジャーとしては、有機溶媒中で反応を継続する観点から、アミノ基含有化合物が好ましく、特に2価以上の水溶性アミン、アルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミン、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ基含有化合物が好ましい。
アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類としては、下記の一般式で挙げられるものが好ましい。
すなわち、次の一般式(3)で表されるアミノスルホン酸類及びアミノ硫酸類;
一般式(4)で表されるアミノホスホン酸類及びアミノリン酸類;
一般式(5)で表されるアミノアルコール類が好ましい。
一般式(3)において、X1が単結合の場合はアミノスルホン酸類であり、X2が酸素原子の場合はアミノ硫酸類である。
一般式(4)において、X2が単結合の場合はアミノホスホン酸類であり、X2が酸素原子の場合はアミノリン酸類である。
工程cにおいて添加するアミン化合物の当量は、系に存在するFmoc基の量に対して、1~30当量、好ましくは4~20当量、より好ましくは4~10当量である。
で表される化合物が好ましい。
Mは水素原子又はアルカリ金属を示す。具体的には、水素原子、ナトリウム、カリウムが挙げられる。
具体的には、メルカプトメタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、2-メルカプトエタンスルホン酸、1,3-ジメルカプトプロパンスルホン酸、2-メルカプトベンズイミダゾール-5-スルホン酸ナトリウム、メルカプトメタンホスホン酸ナトリウム、メルカプトエタンホスホン酸、3-メルカプトプロパンホスホン酸ナトリウム、1,3-ジメルカプトプロパンホスホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本明細書において一般式(1)で表されるチオスルホン酸類及び一般式(2)で表されるチオホスホン酸類を総称する場合、「メルカプト化合物」ということがあり、これらはトラッピング剤である。
前記アミン化合物とメルカプト化合物は、同時に添加してもよく、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加してもよく、アミン化合物を加えFmoc基を脱離させたのちにメルカプト化合物を加えてもよい。これらのうち、前記アミン化合物とメルカプト化合物は、同時に添加してもよく、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加するのが好適であり、メルカプト化合物、次いでアミン化合物の順に添加するのがより好適である。当該メルカプト化合物はDBFと反応し、DBF-メルカプト化合物付加体を生成する。当該DBF-メルカプト化合物付加体は、水溶性であるため、分液を行えば水溶液層に移行し、有機層から除去される。
Fmoc脱離工程は、-20~40℃の温度で、5分~5時間行えばよい。
具体的には、反応液に水溶液を添加した後、水層と有機溶媒層を分液する。
水層には、Fmoc基が脱離した活性エステルスカベンジャーと、ジベンゾフルベン-式(1)又は(2)の化合物付加体が含まれる。すなわち、Fmoc基の脱離工程で副生するジベンゾフルベンは、水溶液の添加だけで、容易に水層に抽出される。
一方、有機溶媒層には、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、Fmoc基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体が含まれる。
ここで、用いられる水溶液としては、水、又は中性付近のpHを有する水溶液が挙げられる。具体的には、水、塩化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、リン酸水素二ナトリウム水溶液、リン酸三ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、リン酸水素二カリウム水溶液、リン酸三カリウム水溶液等が挙げられる。
また、得られた有機溶媒層は、さらに任意のアミノ酸との縮合反応に利用できる。
なお、液相ペプチド合成用担体として、以下に示す化合物を使用した。
・TIPS2-OH(C11)型ベンジル化合物(積水メディカル社製)(以下、B-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
・TIPS2-OH(C11)型キサンテン化合物(積水メディカル社製)(以下、X-STagと記すことがある)。但し、TIPSは、トリイソプロピルシリル基を示す。
また、以下の実施例では、B-STagがFmoc保護tBu保護グルタミン酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)と結合した化合物を、Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)と表記し、下記の構造を示すものとする。Fmoc-Glu(OtBu)-OHに限らず、他のアミノ酸と結合した場合も、これに準ずる表記とする。
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 2.40g(3.0mmol)をCPME6mL、THF9mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3.21g(7.5mmol)、WSCI・HCl 1.44g(7.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン36.8mg(0.3mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.94g(7.5mmol)、DMSO 38mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.42g(8.6mmol)を添加し、DBU5.1mL(34mmol)を加え、20分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液75mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水17mL、5%炭酸ナトリウム水溶液6mL、DMF 1.2mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したジベンゾフルベン(DBF)が2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME27mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 2.38g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、20分撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 2.43g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で2時間撹拌した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)を添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを滴下し、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Ala-OH一水和物 1.33g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間半撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME2mL、DMF7mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1.67g(4.1mmol)、COMU 1.67g(3.9mmol)、DIEPA 2.1mLを加え、室温で1時間撹拌した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム1.19g(3.9mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.7mL(18mmol)を加え、40分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下した後、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 4.58gを得た。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.29mL、トリイソプロピルシラン0.29mL、ジチオトレイトール865mg、アニソール0.58mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、ジイソプロピルエーテル72mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をジイソプロピルエーテル10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの純度は90.5%であった。
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)の合成
Fmoc-NH-(D-STag) 1.09g(1.0mmol)をCPME9mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.32mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、Fmoc-NH-(D-STag)が生成物のNH2-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液10mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液し、NH2-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.55g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。NH2-(D-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エタノール(AEEE)62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、70分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水25mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.8mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.7mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、50分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.58g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で70分撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.82g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、AEEE62μL(0.5mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 3.0mLを添加し、DMF 0.4mL、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、65分撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 24mL、IPA18mL、CPME6mL、水12mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag) 1.84gを得た。
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(D-STag)1.14g(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸9.5mL、水0.25mL、トリイソプロピルシラン0.25mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE70mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 227mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の純度は77.2%であった。
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 0.79g(1.0mmol)をCPME2mL、THF3mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 1.06g(2.5mmol)、WSCI・HCl 0.48g(2.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン12.2mg(0.1mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール150μL(2.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.74g(4.5mmol)、DMSO 4.5mLを添加し、DBU1.7mL(11.3mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液6mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液19mLを加えた後、室温まで昇温し分液した。得られた有機層に20%食塩水20mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、有機層を濃縮したのち、残渣にCPME9mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF2mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 0.79g(1.4mmol)、COMU 0.57g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で1時間撹拌した。H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で1時間半撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(1.3mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、25分撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 0.81g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mLを加え、室温で55分撹拌した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で25分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Ala-OH・一水和物 0.47g(1.5mmol)、COMU 0.64g(1.5mmol)、DIEPA 0.78mL(4.5mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール89μL(1.5mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.5mmol)、DMSO 2.5mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 0.56g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール81μL(1.4mmol)を加え、室温で70分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、75分撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、水 3.2mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液13mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、5%炭酸ナトリウム水溶液4mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 40mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 1.56gを得た。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)962mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸7.5mL、水0.21mL、トリイソプロピルシラン0.21mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.42mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 275mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの純度は78.4%であった。
H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の合成
1)H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)の合成
Fmoc-NH-(X-STag) 1.11g(1.0mmol)をCPME8mL、DMF2mLに溶解し、0℃に冷却した後、DIEPA 0.33mL(1.9mmol)、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.30g(1.8mmol)を添加し、DBU0.67mL(4.5mmol)を滴下した。0℃で1時間撹拌し、Fmoc-NH-(X-STag)が生成物のNH2-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液2.4mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液9mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水23mL、5%炭酸ナトリウム水溶液8mL、DMF 1.6mLを加え、分液し、NH2-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
このNH2-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Thr(tBu)-OH 0.54g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で110分撹拌した。NH2-(X-STag)が生成物のFmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。Fmoc-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液20mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水15mL、DMF 1.6mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.6mL、DMF2mL、Fmoc-Arg(Pbf)-OH 0.88g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.47mL(2.7mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、2-アミノエタノール(AE)81μL(1.4mmol)を加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)、DMSO 2.4mLを添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、90分撹拌した。Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液13mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 0.57g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。H-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、アミノメタンホスホン酸0.15g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で105分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、85分撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを滴下した後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液に、CPME0.5mL、DMF2mL、Fmoc-Trp(Boc)-OH 0.71g(1.4mmol)、COMU 0.56g(1.3mmol)、DIEPA 0.71mL(4.1mmol)を加え、室温で75分撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、3-アミノプロパンスルホン酸0.19g(1.4mmol)、DMSO 2.4mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、2-メルカプト-1-エタンスルホン酸ナトリウム0.40g(2.4mmol)を添加し、DBU 0.91mL(6.1mmol)を加え、100分撹拌した。Fmoc-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液16mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水13mL、DMF 0.9mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが2-メルカプト-1-エタンスルホン酸と反応した化合物[2-(9-フルオレニルメチルチオ)エタンスルホン酸]がないことを確認し、H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を濃縮して得た残渣2,36gのうち0.47g(0.2mmol相当)をはかり取り、2-メチルテトラヒドロフラン1.8mL、DMF0.4mL、Fmoc-Gln(Trt)-OH 0.17g(0.3mmol)、COMU 0.11g(0.3mmol)、DIEPA 0.14mL(0.8mmol)を加え、室温で75分撹拌した。H-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のFmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、硫酸水素2-アミノエチル38mg(0.3mmol)、DMSO 0.6mLを加え、室温で30分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸(合成例1にて合成)76mg(0.5mmol)を添加し、DBU 0.18mL(1.2mmol)を加え、2時間撹拌した。Fmoc-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)が生成物のH-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)に対し5%以下になったことを確認後、5%炭酸水素カリウム水溶液5mL、CPME1mL、THF1mLを加えた後、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水3mL、DMF 0.2mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロパンスルホン酸]がないことを確認し、H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 4mL、IPA1mLを加え、析出した固体をろ取し、得られた固体を減圧乾燥した。H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag) 0.31gを得た。
H-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-NH-(X-STag)0.25g(0.11mmol)にトリフルオロ酢酸3.2mL、水0.09mL、トリイソプロピルシラン0.09mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.18mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE30mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE5mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2 78mgを得た。得られたH-Gln-Trp-Glu-Arg-Thr-NH2の純度は82.0%であった。
3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸の合成
3-ブロモ-1-プロパンホスホン酸ジエチル777mg(3mmol)をアセトニトリル6mLに溶解し、トリフェニルメタンチオール1.66g(6mmol)、トリエチルアミン0.54mL(3.9mmol)を加え、50℃で18時間撹拌した。MTBE20mL、水20mLを加え分液し、有機層を20%塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を濃縮し、濃縮残渣2.39gを得た。残渣をヘプタン/酢酸エチル(2/1)に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gを定量的収率で得た。
上記で得た3-(トリフェニルメチルチオ)-1-プロパンホスホン酸ジエチル1.36gをアセトニトリル10mLに溶解し、トリメチルシリルブロミド1,95mL(15mmol)を加え、室温で18時間撹拌した。メタノール4mLを加え、過剰なトリメチルシリルブロミドと反応させたのち、減圧濃縮した。濃縮残渣にアセトニトリル15mLを加え、溶解していない固体を濾別した。ろ液を濃縮し、濃縮残渣2.32gを得た。得られた残渣にトリフルオロ酢酸22.8mL、水0.6mL、トリイソプロピルシラン0.6mLを加え、室温で2時間撹拌した。反応液にMTBE24mLを加え、析出した固体を濾別したのち、ろ液を濃縮し、濃縮残渣3.30gを得た。残渣にMTBE35mL、ヘプタン12mL、水10mLを加え、分液した。有機層から水5mLで2回再抽出したのち、水層を合わせ減圧濃縮した。濃縮残渣0.72gを得た。残渣を水に溶解し、HPLCカラムクロマトグラフィ(カラム:YMC社製ODS-AQ-HG;10mm×250mm)で精製し、目的とする3-メルカプト-1-プロパンホスホン酸0.30gを得た。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)σ=1.60(2H,m)、1.71(2H,m)、2.32(1H,br)、2.53(2H,m)
LC-MS m/z 157.00[M+H+]
H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの合成
1)H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)の合成
B-STag 2.39g(3.0mmol)をCPME6mL、THF9mLに溶解し、Fmoc-Glu(OtBu)-OH 3.19g(7.5mmol)、WSCI・HCl 1.44g(7.5mmol)、4-ジメチルアミノピリジン37mg(0.3mmol)を加え、室温で2時間半撹拌した。B-STagが生成物のFmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.60g(4.8mmol)、DMSO 16mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプトプロピオン酸 1.18mL(13.5mmol)を添加し、DBU5.1mL(33.8mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液16.9mLを滴下し、5%炭酸ナトリウム水溶液68mLを加えた後、室温まで昇温し分液した。得られた有機層にCPME 4mL、DMF 0.6mL、5%炭酸ナトリウム水溶液3mL、20%食塩水9mLを加え、分液した。得られた有機層にはFmoc基から生成したDBFが3-メルカプトプロピオン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロピオン酸]が生成物のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し6.5%残存した。得られた有機層を濃縮したのち、残渣にCPME26.7mL加え、H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にDMF6.7mL、Fmoc-Cys(Trt)-OH 2.37g(4.1mmol)、COMU 1.68g(3.9mmol)、DIEPA 2.12mLを加え、室温で2時間撹拌した。H-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 15.6mLを加え、室温で1時間撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプトプロピオン酸 634uL(7.3mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU 2.7mL(18.2mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが3-メルカプトプロピオン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロピオン酸]が生成物のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し0.1%残存した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME1.8mL、DMF6.7mL、Fmoc-Asn(Trt)-OH 2.44g(4.1mmol)、COMU 1.68g(3.9mmol)、DIEPA 2.12mLを加え、室温で1時間半撹拌した。H-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.56g(3.9mmol)、DMSO 15.6mLを加え、室温で1時間撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプトプロピオン酸 0.63mL(7.3mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.73mL(18.2mmol)を加え、55分撹拌した。Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが3-メルカプトプロピオン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロピオン酸]が生成物のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し1.3%残存した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME1.8mL、DMF6.7mL、Fmoc-Ala-OH・一水和物 1.34g(4.1mmol)、COMU 1.68g(3.9mmol)、DIEPA 2.12mL(12.2mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。H-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.55g(3.9mmol)、DMSO 15.6mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプトプロピオン酸 0.63mL(7.3mmol)、DMF 1.3mLを添加し、DBU2.73mL(18.2mmol)を加え、1時間撹拌した。Fmoc-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが3-メルカプトプロピオン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロピオン酸]が生成物のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し0.7%残存した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
上記のH-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液にCPME1.8mL、DMF6.7mL、Fmoc-Asp(OtBu)-OH 1.68g(4.1mmol)、COMU 1.68g(3.9mmol)、DIEPA 2.12mL(12.2mmol)を加え、室温で1時間半撹拌した。H-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のFmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、タウリン0.56g(3.9mmol)、DMSO 15.6mLを加え、室温で40分撹拌した。0℃に冷却し、3-メルカプトプロピオン酸 0.63mL(7.3mmol)を添加し、DBU2.73mL(18.2mmol)を加え、1時間半撹拌した。Fmoc-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)が生成物のH-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)に対し5%以下になったことを確認後、1M硫酸水溶液9.6mLを滴下したのち、5%炭酸ナトリウム水溶液60mLを加え、室温まで昇温し、分液した。得られた有機層に20%食塩水38mL、5%炭酸ナトリウム水溶液13mL、DMF 2.7mLを加え、分液した。得られた有機層にFmoc基から生成したDBFが3-メルカプトプロピオン酸と反応した化合物[3-(9-フルオレニルメチルチオ)プロピオン酸]が2.6%残存した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)を含むCPME溶液を得た。
得られたCPME溶液を減圧下で濃縮し、残渣にMeCN 30mLを加え析出した固体をろ取し、得られた固体を30℃で減圧乾燥した。H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag) 4.41gを得た。
H-Asp(OtBu)-Ala-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-O-(B-STag)961mg(0.50mmol)にトリフルオロ酢酸7.5mL、水0.21mL、トリイソプロピルシラン0.21mL、3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール0.42mLを添加し、室温で2時間撹拌した。反応溶液を0℃に冷却し、MTBE60mLをゆっくりと滴下し、沈澱物を濾取した。ろ取した沈殿物をMTBE10mLで3回洗浄行った後、沈澱物を減圧下で乾燥し、H-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OH 274mgを得た。得られたH-Asp-Ala―Asn-Cys-Glu-OHの純度は2.4%であった。なお、純度が低かった理由として、各伸長反応工程で副生したDBFと従来のトラッピング剤である3-メルカプトプロピオン酸が反応した化合物(DBF-チオカルボン酸付加体)の存在の影響が考えられた。
Claims (6)
- Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸誘導体が、Fmоcでアミノ基が保護されたアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドである請求項1記載の方法。
- 次の工程a~dを含むことを特徴とする液相ペプチド製造方法。
a.有機溶媒を含む溶媒中で、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、Fmoc基でアミノ基が保護されたアミノ酸又はペプチドとを縮合させる工程、
b.縮合反応後の反応液に、アミノ酸活性エステルスカベンジャーを添加する工程、
c.反応液中の前記Fmoc基でアミノ基が保護された化合物のFmoc基を請求項1又は2記載の方法で除去する工程、
d.反応液に水溶液を添加した後、分液して、液相ペプチド合成用担体と結合したアミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドと、前記Fmoc基が脱離したアミノ酸又はペプチドとの縮合体を含有する有機溶媒層を得る工程。 - 前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、アミノ基含有化合物である請求項3記載の液相ペプチド製造方法。
- 前記アミノ酸活性エステルスカベンジャーが、2価以上の水溶性アミン、アルキルアミン、芳香族アミン、ヒドロキシルアミン、アミノスルホン酸類、アミノ硫酸類、アミノホスホン酸類、アミノリン酸類及びアミノアルコール類から選ばれるアミノ基含有化合物である請求項3又は4記載の液相ペプチド製造方法。
- 前記液相ペプチド合成用担体が、アミノ酸、ペプチド又はアミノ酸アミドに直接またはリンカーを介して結合して、それらを有機溶媒に溶解性で水に不溶性にする化合物である請求項3~5のいずれか1項に記載の液相ペプチド製造方法。
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