TW202233574A

TW202233574A - 肽之製造方法、保護基形成用試藥及縮合多環化合物

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Publication number: TW202233574A
Application number: TW110147858A
Authority: TW
Inventors: 津山博昭
Original assignee: 日商富士軟片股份有限公司
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-09-01
Also published as: WO2022138605A1; CN116724022A; US20230357311A1; JPWO2022138605A1; EP4269423A1

Abstract

本發明的課題為提供一種高純度且高效的肽之製造方法、脫保護性優異之保護基形成用試藥及新穎的縮合多環化合物。依據本發明，提供一種包括使用式(1)所表示之多環化合物之步驟之肽之製造方法、包含上述多環化合物之保護基形成用試藥及上述多環化合物。R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個具有R ^A，上述R ^A表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個上述脂肪族烴基的碳數為3以上。

Description

肽之製造方法、保護基形成用試藥及縮合多環化合物

本發明有關一種肽之製造方法、保護基形成用試藥及縮合多環化合物。

作為肽之製造方法，有固相法、液相法等。液相法反應性良好，並且能夠在縮合反應之後，藉由抽取清洗及單離等來進行中間物肽的純化。然而，藉由合成對象的肽，在現有的側鏈保護基中有時性能不夠充分。作為以往的保護基形成用試藥，已知有專利文獻1中所記載之𠮿

化合物及專利文獻2中所記載之二苯基甲烷化合物。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2018/021233號 [專利文獻2]國際公開第2010/113939號

[發明欲解決之課題]

在專利文獻1中，只記載有一種𠮿

化合物，該𠮿

化合物在有機溶劑中難以析出，並且藉由液-液相分離的操作而容易分離純化。本發明的一實施形態所要解決之課題為提供一種高純度且高效的肽之製造方法。又，本發明的另一實施形態所要解決之課題為提供一種脫保護性優異之保護基形成用試藥。又，本發明的又一實施形態所要解決之課題為提供一種新穎的縮合多環化合物。

用於解決上述課題的方法包含以下態樣。＜1＞一種肽之製造方法，其係包括使用下述式(1)所表示之多環化合物之步驟。

式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-NHCOR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、烷基、芳烷基、雜芳烷基或者具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基或烷氧基，R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A， R ^A分別獨立地表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3以上。

＜2＞如＜1＞所述之肽之製造方法，其中，使用式(1)所表示之化合物之步驟為藉由式(1)所表示之化合物來保護被保護或未被保護的天冬醯胺酸或麩醯胺酸的側鏈胺基之側鏈保護步驟。＜3＞如＜1＞所述之肽之製造方法，其係進一步包括：肽鏈延長步驟，式(1)所表示之化合物為N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽，並且使上述化合物與C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽縮合；及沉澱步驟，使在肽鏈延長步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱。＜4＞如＜3＞所述之肽之製造方法，其係在沉澱步驟之後，依序進一步包括1次以上的如下步驟：對所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端進行脫保護之步驟；使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至所獲得之C末端被保護的肽的N末端中之步驟；及使所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之步驟。

＜5＞如＜3＞或＜4＞所述之肽之製造方法，其係進一步包括對C末端保護基進行脫保護之C末端脫保護步驟，且脫保護係使用10體積%以下的三氟乙酸溶液來進行。＜6＞如＜3＞至＜5＞之任一項所述之肽之製造方法，其中，C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽的C末端保護基具有碳數12以上的脂肪族烴基。＜7＞如＜1＞至＜6＞之任一項所述之肽之製造方法，其中，式(1)中的R ¹～R ⁸中的僅1個為R ^A。＜8＞如＜1＞至＜7＞之任一項所述之肽之製造方法，其中，式(1)中的R ³或R ⁶為R ^A。＜9＞如＜1＞至＜8＞之任一項所述之肽之製造方法，其中，式(1)中的R ^A分別獨立地為碳數3～10的烷基、碳數3～10的烷氧基或碳數3～10的烷氧基烷基。＜10＞如＜1＞至＜7＞之任一項所述之肽之製造方法，其中，式(1)中的Y ²為-O-。

＜11＞一種精胺酸或麩醯胺酸的側鏈胺基保護基形成用試藥，其係包含下述式(1)所表示之多環化合物。

式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、烷基、芳烷基或雜芳烷基， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基或烷氧基，R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A， R ^A表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3～10。

＜12＞一種多環化合物，其係由下述式(1)表示。

式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-NHCOR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、碳數10以下的烷基、芳烷基、雜芳烷基或者具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、碳數1～4的烷基或碳數1～4的烷氧基， R ²～R ⁷及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A， R ^A表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3～10。＜13＞如＜12＞所述之多環化合物，其係由下述式(2)表示。

式(2)中，R ³或R ⁶分別獨立地表示氫原子、碳數3～10的烷氧基，R ³及R ⁶中的至少1個為碳數2～10的烷氧基， Rc表示氫原子或第三丁氧基羰基或9-茀基甲氧基羰基，Rd表示氫原子或鹽結構的陽離子，m表示1或2。 [發明之效果]

依據本發明的一實施形態，能夠提供一種高純度且高效的肽之製造方法。又，依據本發明的另一實施形態，能夠提供一種脫保護性優異之保護基形成用試藥。又，依據本發明的又一實施形態，能夠提供一種新穎的縮合多環化合物。

[用以實施發明的形態]

以下，對本發明的內容進行詳細地說明。以下所記載之構成要件的說明有時基於本發明的代表性實施態樣來進行，但是本發明並不限定於該等實施態樣。在本說明書中，除非另有特別說明，則各術語具有如下含義。使用“～”所表示之數值範圍表示將“～”前後所記載之數值作為下限值及上限值而包含之範圍。在本說明書中階段性記載之數值範圍中，一個數值範圍內所記載之上限值或下限值可以替換成其他階段性記載的數值範圍的上限值或下限值。又，在本說明書中所記載之數值範圍中，其數值範圍的上限值或下限值可以替換成實施例中所示之值。 “步驟”這一術語不僅為獨立之步驟，而且即使在無法與其他步驟明確區分之情況下，只要實現步驟的所期望的目的，則亦包含在本術語中。在基團(原子團)的標記中，未標有經取代及未經取代之標記包含不具有取代基者，並且還包含具有取代基者。例如，“烷基”不僅包含不具有取代基之烷基(未經取代烷基)，還包含具有取代基之烷基(取代烷基)。化學結構式亦有時記載為省略了氫原子之簡化結構式。 “質量%”與“重量%”的含義相同，並且“質量份”與“重量份”的含義相同。 2個以上的較佳態樣的組合為更佳態樣。

“烷基”可以為鏈狀，亦可以為支鏈狀，並且亦可以經鹵素原子等取代。 “烷基”為碳數(亦稱為“碳原子數”。)1～10的烷基為較佳。烷基的碳數為1～6為更佳，1～4為更佳，1或2為更佳。作為具體例，可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、第三丁基等。 “烯基”為碳數2～6的烯基為較佳。作為具體例，可以舉出1-丙烯基。作為“芳基”，碳數6～14的芳基為較佳，可以舉出苯基、1-萘基、2-萘基、聯苯基、2-蒽基等。其中，碳數6～10的芳基為更佳，苯基為特佳。作為“甲矽烷基”，可以舉出三甲基矽烷基、三乙基矽烷基、二甲基苯基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二乙基矽烷基等。作為“鹵素原子”，可以舉出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。作為“烷氧基”，碳數1～10的烷氧基為較佳。烷基的碳數為1～6為更佳，1～4為更佳，1或2為更佳。作為具體例，可以舉出甲氧基、乙氧基、丙氧基。作為“芳烷基”，碳數7～20的芳烷基為較佳。碳數為7～12為較佳。作為具體例，可以舉出苄基。作為“雜芳烷基”，碳數6～20的雜芳烷基為較佳。碳數為6～12為較佳。作為“醯基”，碳數1～6的醯基為較佳。作為具體例，可以舉出乙醯基、丙醯基。作為“芳烷基羰基”，碳數7～10的芳烷基羰基為較佳。作為具體例，可以舉出苄基羰基。作為“烷氧基羰基”，碳數1～6的烷氧基羰基為較佳。作為具體例，可以舉出甲氧基羰基、乙氧基羰基、Boc基。Boc基表示第三丁氧基羰基。作為“芳烷氧基羰基”，碳數7～20的芳烷氧基羰基為較佳。碳數為8～20為較佳，8～14為更佳。作為具體例，可以舉出芐氧基羰基(以下，亦稱為Cbz基或Z基。)、Fmoc基。Fmoc基表示9-茀基甲氧基羰基。

在本發明之胺基酸及肽具有羥基、胺基、羧基、羰基、醯胺基、胍基、巰基等之情況下，該等基團可以被保護，並且在反應後依據需要去除保護基，從而能夠獲得目標化合物。作為羥基的保護基，例如可以舉出烷基、芳基、三苯甲基、碳數7～10的芳烷基、甲醯基、碳數1～6的醯基、苯甲醯基、碳數7～10的芳烷基羰基、2-四氫吡喃基、2-四氫呋喃基、甲矽烷基、碳數2～6的烯基等。該等基團可以經選自包括鹵素原子、碳數1～6的烷基、碳數1～6的烷氧基及硝基之群組中的1個～3個取代基取代。

作為胺基的保護基，例如可以舉出甲醯基、碳數1～6的醯基、碳數1～6的烷氧基羰基、苯甲醯基、碳數7～10的芳烷基羰基、碳數7～14的芳烷氧基羰基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)-3-methylbutyl基(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環己烯-1-亞基)-3-甲基丁基)、鄰苯二甲醯基、N,N-二甲胺基亞甲基、甲矽烷基、碳數2～6的烯基等。該等基團可以經選自包括鹵素原子、碳數1～6的烷氧基及硝基之群組中的1個～3個取代基取代。作為羧基的保護基，例如可以舉出上述羥基的保護基、三苯甲基等。作為醯胺基的保護基，例如可以舉出三苯甲基等。作為羰基的保護基，例如可以舉出環狀縮醛(例如，1,3-二㗁烷)、非環狀縮醛(例如，二(碳數1～6的烷基)縮醛)等。作為胍基的保護基，例如可以舉出2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基、2,3,4,5,6-五甲基苯磺醯基、甲苯磺醯基、硝基等。作為巰基(硫醇基)的保護基，例如可以舉出三苯甲基、4-甲基苄基、乙醯胺基甲基、第三丁基、第三丁硫基等。

關於上述保護基的去除方法，只要基於公知的方法、例如，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons刊(1980)中所記載的方法等進行即可。可以利用使用酸、鹼、紫外光、肼、苯基肼、N-甲基二硫胺甲酸鈉、四丁基氟化銨、乙酸鈀、三烷基矽烷基鹵化物之方法、還元法。

“胺基酸”為α、β或γ胺基酸，並不限定於天然型胺基酸，亦可以為非天然型胺基酸。又，亦可以為羥基羧酸等胺基酸類似物。

(式(1)所表示之多環化合物) 本發明之多環化合物由下述式(1)表示，下述式(2)所表示者為較佳。該化合物為本發明的多環化合物及保護基形成用試藥，並且用於本發明的肽之製造方法中。

式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-NHCOR ¹⁸、 -SH或鹵素原子，上述R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，上述R ¹⁸表示氫原子、烷基或芳烷基、雜芳烷基或者具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構。作為鹵素原子，從反應產率及保管穩定性的觀點考慮，溴原子、氯原子為較佳。作為R ¹⁷中之活性酯型羰基，可以舉出羰基氧基丁二酸醯亞胺、烷氧基羰基、芳氧基羰基、芳烷氧基羰基，從脫保護性的觀點考慮，羰基氧基丁二酸醯亞胺為較佳。作為R ¹⁷中之活性酯型磺醯基，可以舉出烷基磺醯基、芳基磺醯基，從脫保護性的觀點考慮，碳數1～6的烷基磺醯基、對甲苯磺醯基為較佳。作為R ¹⁷，氫原子或活性酯型保護基為較佳，氫原子為更佳。作為R ¹⁸中之芳烷基，碳數7～20的芳烷基為較佳，碳數7～16的芳烷基為更佳。作為R ¹⁸中之雜芳烷基，碳數5～30的雜芳烷基為較佳，碳數5～20的雜芳烷基為更佳。作為R ¹⁸中之具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構，下述式(2a)所表示之化學結構為較佳。

式(2a)中，Rc表示氫原子或第三丁氧基羰基或9-茀基甲氧基羰基，Rd表示氫原子或鹽結構的陽離子，m表示1或2，*表示鍵結部位。

Y ²表示-N(R ¹¹⁰)-、-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、 -CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-或-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-，上述R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子，上述R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基。 R ¹¹⁰為R ^A為較佳。作為R ^A，與後述R ^A的含義相同，較佳態樣亦相同。作為R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷中之烷基，碳數1～6的烷基為較佳，碳數1～3的烷基為更佳。作為-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-中之R ¹⁰⁰及R ¹⁰¹，分別為同一基團為較佳，碳數1～6的烷基或氫原子為更佳。作為具體例，可以舉出-CH=CH-、-C(CH ₃)=C(CH ₃)-。作為-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-中之R ¹⁰²～R ¹⁰⁵，R ¹⁰²及R ¹⁰⁴和R ¹⁰³及R ¹⁰⁵分別為同一基團為較佳。作為R ¹⁰²及R ¹⁰⁴，碳數1～6的烷基或氫原子為較佳。作為R ¹⁰³及R ¹⁰⁵，碳數1～6的烷基或氫原子為較佳。作為具體例，可以舉出-CH ₂-CH ₂-。作為-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-中之R ¹⁰⁶及R ¹⁰⁷，分別為同一基團為較佳，碳數1～6的烷基為較佳。作為具體例，可以舉出-CH ₂-、-C(CH ₃) ₂-、-C(C ₂H ₅) ₂-。作為Y ²，氧原子(-O-)或硫原子(-S-)為較佳，氧原子(-O-)為更佳。

R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基(較佳為碳數1～10的烷基)或烷氧基(較佳為碳數1～10的烷氧基)，R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A。在將式(1)所表示之多環化合物用於肽之製造方法中之情況下，R ^A表示“脂肪族烴基”或“具有脂肪族烴基之有機基團”，在僅存在1個R ^A之情況下，R ^A的脂肪族烴基的碳數為3以上，在存在複數個R ^A之情況下，R ^A中的至少1個上述脂肪族烴基的碳數為3以上。其中，R ^A不具有包含甲矽烷基及矽烷氧基結構之烴基。在本發明之精胺酸或麩醯胺酸的側鏈胺基保護基形成用試藥及本發明之化合物中，R ^A中的至少1個脂肪族烴基的碳數為3～10。 R ¹～R ⁸中的僅1個為R ^A為較佳，僅R ³或R ⁶為R ^A為更佳。在此情況下，除了R ^A以外的取代基為氫原子或鹵素原子為較佳，氫原子為更佳。

R ^A中之“脂肪族烴基”為直鏈、支鏈狀或環狀的飽和或不飽和的脂肪族烴基。脂肪族烴基的碳數為3～10為更佳，3～8為更佳，4～8為更佳。作為脂肪族烴基，可以舉出烷基、環烷基、烯基、炔基，烷基為較佳。 R ^A中之“具有脂肪族烴基之有機基團”為在其分子結構中具有脂肪族烴基之一價(具有1個與縮合多環鍵結之鍵結鍵)的有機基團。 “具有脂肪族烴基之有機基團”中之“脂肪族烴基”的部位並無特別限定，可以存在於末端(一價基團)，亦可以存在於除此以外的部位(例如，二價基團)。 “具有脂肪族烴基之有機基團”中的除了“脂肪族烴基”以外的部位能夠任意地設定。例如可以具有-O-、-S-、-COO-、-OCONH-、-CONH-及除了“脂肪族烴基”以外的烴基(一價的基團或二價的基團)等部位。 “具有脂肪族烴基之有機基團”與縮合多環的鍵結可以為經由“脂肪族烴基”或“烴基”者亦即直接以碳-碳鍵結的方式鍵結者，亦可以為經由除了“脂肪族烴基”以外的部位者。從合成容易度的觀點考慮，“具有脂肪族烴基之有機基團”的Y ²中之與N的鍵結(取代)為經由存在於上述R ^A中之“烴基”者亦即直接以碳-氮鍵結的方式鍵結者為較佳。

作為R ^A，碳數3～10的烷基、碳數3～10的烷氧基或碳數3～10的烷氧基烷基為較佳，碳數3～10的烷氧基為更佳。該等取代基的碳數為3～8為更佳，4～8為更佳，5～8為更佳，6為特佳。

依據本發明的一實施形態，藉由使用脫保護性優異之保護基，能夠提供高純度且高合成效率的肽之製造方法。其中，脫保護性優異表示在弱酸下的脫保護速度快。弱酸表示三氟乙酸為20體積%以下的酸性溶液，三氟乙酸濃度為10體積%以下為較佳，5體積%以下為更佳，2體積%以下為更佳，1體積%以下為更佳。下限為0.01體積%為較佳，0.1體積%為更佳。

進而，即使為如非天然肽的不易合成的肽，亦能夠抑制副反應且以高純度合成，其中，該非天然肽包含容易產生副反應之非天然胺基酸。在本發明之製造方法中，即使在弱酸條件下亦能夠進行側鏈保護基的脫保護，並且能夠抑制所獲得之肽的副反應，從而有利於含有天冬醯胺酸和/或麩醯胺酸之肽合成。

從脫保護性的觀點考慮，上述式(1)所表示之多環化合物為下述式(10)所表示之化合物為較佳。

式(10)中，Y ¹、Y ²及R ^A分別與式(1)中之Y ¹、Y ²及R ^A的含義相同，較佳態樣亦相同。n10及n11分別獨立地表示0～4的整數，並且n10及n11這兩者不會成為0。 n10及n11分別獨立地為0～2的整數為較佳，n10及n11中的任一者為0而另一者為1為更佳。 R ^A與縮合多環的2位、3位、4位、5位、6位及7位中的任一個鍵結為較佳，與縮合多環的2位、3位、6位及7位中的任一個鍵結為更佳，與縮合多環的3位或6位鍵結為進一步較佳。

式(10)所表示之化合物為式(100)或式(200)所表示之化合物為較佳，式(100)所表示之化合物為更佳。

在式(100)或式(200)中，Y ¹及R ^A分別與式(1)中之Y ¹及R ^A的含義相同，較佳態樣亦相同。n100及n200分別獨立地表示1～4的整數，1～3的整數為較佳，1或2為更佳，1為更佳。 R ^A與縮合多環的2位、3位及4位中的任一個鍵結為較佳，與縮合多環的2位或3位鍵結為更佳，與縮合多環的3位鍵結為進一步較佳。式(1)所表示之多環化合物的分子量並無特別限制，但是從脫保護速度、結晶性、溶劑溶解性及產率的觀點考慮，340～3,000為較佳，400～2,000為更佳，500～1,300為特佳。

＜式(1)所表示之多環化合物之製造方法＞作為本發明之式(1)所表示之多環化合物之製造方法，並無特別限定，但是能夠參照公知的方法來製造。關於用於製造式(1)所表示之多環化合物之原料化合物，除非另有特別說明，則可以使用市售者，亦能夠按照公知的方法或基於該等之方法來製造。又，依據需要，可以藉由公知的純化方法來純化所製造之式(1)所表示之多環化合物。例如，能夠進行藉由再結晶、管柱層析法等來進行單離及純化之方法及藉由改變溶液溫度之方法或改變溶液組成之方法等來進行再沉澱純化之方法等。

本發明之式(1)所表示之多環化合物的合成方法並無特別限定，但是例如能夠按照以下方案並使用3-羥基黃酮等作為起始原料來進行合成。又，能夠參照國際公開第2018/021233號中所記載的合成方法來進行合成。

R ^1r～R ^8r分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基或烷氧基，R ^1r～R ^8r及R ¹¹⁰中的至少1個表示R ^A。X ¹⁰⁰表示Cl、Br、I。R ¹⁸⁰表示氫原子、烷基或Fmoc基。

(肽之製造方法) 在本發明之肽之製造方法中，使用上述式(1)所表示之多環化合物之步驟為藉由上述式(1)所表示之多環化合物來保護胺基酸或肽的側鏈之側鏈保護步驟為較佳。在本發明之肽之製造方法中，式(1)所表示之多環化合物不僅用於保護基的形成，而且亦能夠用於肽的改質、在水或有機溶劑等中的溶解度的調整、結晶化性的改良及多聚體化等。其中，式(1)所表示之多環化合物用於保護基的形成為較佳，用作作為天冬醯胺酸及麩醯胺酸的側鏈之醯胺基的保護基為更佳。從肽的合成容易性及產率的觀點考慮，本發明之肽之製造方法除了上述側鏈保護步驟以外，進一步包括對在上述側鏈保護步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端進行脫保護之N末端脫保護步驟、及使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至在上述N末端脫保護步驟中所獲得之C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽的N末端中之肽鏈延長步驟為更佳，進一步包括使在上述肽鏈延長步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之沉澱步驟為更佳，在上述沉澱步驟之後，依序進一步包括1次以上的如下步驟為更佳，亦即，對所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端進行脫保護之步驟、使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至所獲得之C末端被保護的肽的N末端中之步驟及使所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之步驟。再者，N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽為僅N末端被保護之胺基酸或肽，N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或肽為N末端及C末端被保護之胺基酸或肽。各步驟中之胺基與羧基的肽鍵的形成反應(縮合反應)、保護基的脫保護能夠藉由公知的方法來進行。例如，參照並援用國際公開第2020/175473號及國際公開第2020/175473號，並被編入本申請說明書中。以下，對上述各步驟進行詳細地說明。

＜溶解步驟＞本發明之肽之製造方法在上述側鏈保護步驟或肽鏈延長步驟之前，包括將上述式(1)所表示之多環化合物溶解於溶劑中之溶解步驟為較佳。作為溶劑，能夠將通常的有機溶劑用於反應中，但是上述溶劑中之溶解度越高，能夠期待越優異之反應性，因此選擇式(1)所表示之多環化合物的溶解度高之溶劑。具體而言，可以舉出氯仿、二氯甲烷等鹵化烴類；1,4-二㗁烷、四氫呋喃(THF)、環戊基甲醚等非極性有機溶劑等。該等溶劑可以混合使用2種以上。又，在上述鹵化烴類或非極性有機溶劑中，只要式(1)所表示之多環化合物能夠溶解，則可以混合使用苯、甲苯、二甲苯等芳香族烴類；乙腈、丙腈等腈類；丙酮、2-丁酮等酮類；N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮等醯胺類；二甲基亞碸等亞碸類。作為溶劑，非極性有機溶劑為較佳，THF為更佳。即使在使用了非極性有機溶劑之情況下，本發明亦能夠維持高反應性，從而能夠提高製造產率。又，可以使用Organic Process Research & Development、2017、21、3、365-369中所記載的溶劑。

＜側鏈保護步驟＞本發明之肽之製造方法包括藉由上述式(1)所表示之多環化合物來保護胺基酸或肽的側鏈胺基之側鏈保護步驟為較佳。被保護之胺基酸為天冬醯胺酸或麩醯胺酸為較佳，該等可以保護其他胺基或羧基。又，在肽的側鏈被保護之情況下，來自於天冬醯胺酸或麩醯胺酸之部位的側鏈被保護為較佳。天冬醯胺酸或麩醯胺酸的反應率降低或者脫保護率降低，從而製造效率降低，但是藉由使用本發明的化合物，這些問題點得到改善。在此情況下，在式(1)所表示之多環化合物中，Y ¹為-OR ¹⁷為較佳。在使用式(1)中之Y ¹為-OH之上述式(1)所表示之多環化合物之情況下，在不影響反應之溶劑中，在酸觸媒中進行反應為較佳。作為酸觸媒，參照並援用國際公開第2020/175473號及國際公開第2020/175473號，並被編入本申請說明書中。

作為所使用之酸觸媒，能夠不受限制地使用在肽合成中通常使用之酸觸媒，例如可以舉出甲磺酸、三氟甲磺酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、乙酸等。其中，三氟乙酸、乙酸為較佳。酸觸媒的使用量相對於上述式(1)所表示之多環化合物的1莫耳當量為超過0莫耳當量且20莫耳當量以下為較佳，0.5莫耳當量～15莫耳當量為更佳，1莫耳當量～10莫耳當量為進一步較佳。

＜C末端保護步驟＞本發明之肽之製造方法包括由C末端保護基保護胺基酸或肽的羧基或醯胺基之C末端保護步驟為較佳。作為C末端保護基，具有碳數12以上的脂肪族烴基之化合物為較佳，較佳為碳數為15以上，更佳為20～30。在C末端保護基具有複數個脂肪族烴基之情況下，該等的碳數的合計為30～80為較佳，36～80為更佳。作為C末端保護基，具有環結構為較佳，具有縮合多環、芳香族雜環或萘環為較佳。作為C末端保護基，國際公開第2020/175473號的式(1)所表示之芳香族雜環化合物為較佳。作為該化合物，參照國際公開第2020/175473號，並被編入本申請說明書中。作為C末端保護基，國際公開第2020/175472號的式(1)所表示之縮合多環芳香族烴化合物亦較佳。作為該化合物，參照國際公開第2020/175472號，並被編入本申請說明書中。作為C末端保護基，可以為國際公開第2020/262259號(日本專利申請2019-122492及將其作為基礎之專利申請)中所揭示的化合物，參照國際公開第2020/262259號(日本專利申請2019-122492及將其作為基礎之專利申請)，並被編入本申請說明書中。作為在上述C末端保護步驟中所使用之胺基酸或肽，並無特別限制，但是N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽為較佳，Fmoc保護胺基酸或Fmoc保護肽為更佳。又，除了在上述C末端保護步驟中所使用之胺基酸或肽中之C末端部分以外的羥基、胺基、羰基、羧基、醯胺基、咪唑基、吲哚基、胍基、巰基等藉由保護基進行保護為較佳。

在C末端保護基的鍵結部位為-OH或-SH之情況下，在不影響反應之溶劑中，在縮合添加劑(縮合活化劑)的存在下，添加縮合劑或者在酸觸媒中進行反應為較佳。

在C末端保護基的鍵結部位為-NHR ¹⁸(R ¹⁸為氫原子、烷基、芳烷基或雜芳烷基)之情況下，在縮合添加劑的存在下，添加縮合劑或者使縮合劑與鹼進行反應為較佳。作為縮合活化劑、縮合劑、酸觸媒，參照並援用國際公開第2020/175473號及國際公開第2020/175473號，並被編入本申請說明書中。

作為縮合劑，在肽合成中通常使用之縮合劑在本發明中亦能夠不受限制地使用，並不限定於此，但是例如可以舉出4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基嗎啉氯化物(DMT-MM)、O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HATU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HBTU(6-Cl))、O-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TCTU)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代基亞乙基胺氧基)二甲基胺基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(COMU)、二環己碳二醯亞胺(DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺(EDC)、其鹽酸鹽(EDC·HCl)及六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻(PyBop)等。其中，DIC、EDC、EDC·HCl、DMT-MM、HBTU、HATU或COMU為較佳。縮合劑的使用量相對於基質1莫耳當量為1莫耳當量～10莫耳當量為較佳，1莫耳當量～5莫耳當量為更佳。

作為用於縮合反應之酸觸媒，能夠不受限制地使用在肽合成中通常使用之酸觸媒，例如可以舉出甲磺酸、三氟甲磺酸及對甲苯磺酸等。其中，甲磺酸、對甲苯磺酸為較佳。酸觸媒的使用量相對於基質1莫耳當量為1莫耳當量～10莫耳當量為較佳，0.01莫耳當量～5莫耳當量為更佳。

在上述C末端保護步驟中，為了促進反應且抑制消旋反應(racemization)等副反應，添加縮合活化劑為較佳。縮合活化劑為藉由與縮合劑共存而將胺基酸引導至相對應之活性酯、對稱酸酐等中以使其容易形成肽鍵(醯胺鍵)之試藥。作為縮合活化劑，能夠不受限制地使用在肽合成中通常使用之活化劑，例如可以舉出4-二甲基胺基吡啶、N-甲基咪唑、硼酸衍生物、1-羥基苯并三唑(HOBt)、乙基1-羥基三唑-4-羧酸酯(HOCt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、3-羥基-1,2,3-苯并三𠯤-4(3H)-酮(HOOBt)、N-羥基丁二醯亞胺(HOSu)、N-羥基鄰苯二甲醯亞胺(HOPht)、N-羥基-5-降莰烯-2,3-二羧基醯亞胺(HONb)、五氟苯酚及乙基(羥亞胺基)氰基乙酸酯(Oxyma)等。其中，4-二甲基胺基吡啶、HOBt、HOCt、HOAt、HOOBt、HOSu、HONb或Oxyma為較佳。活化劑的使用量相對於基質1莫耳當量為超過0莫耳當量且4.0莫耳當量為較佳，0.1莫耳當量～1.5莫耳當量為更佳。

作為溶劑，能夠較佳地使用在上述溶解步驟中所述之溶劑。反應溫度並無特別限制，但是-10℃～80℃為較佳，0℃～40℃為更佳。反應時間並無特別限制，但是1小時～30小時為較佳。

又，藉由上述C末端保護步驟所獲得之N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽可以進行純化。例如，使所獲得之N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽溶解於溶劑(反應溶劑、例如THF)中，並在進行所期望的有機合成反應之後，對所獲得之產物進行單離。然後，改變溶解有N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽之溶劑(例如，溶劑組成的變更、溶劑種類的變更)，並使其再沉澱。具體而言，在如N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽溶解的條件下進行反應。在反應後，在蒸餾去除溶劑之後進行溶劑取代，或者不蒸餾去除溶劑而向反應系統添加極性溶劑，從而沉澱凝集物並去除雜質。作為取代溶劑或極性溶劑，單獨或混合使用甲醇、乙腈、水等極性有機溶劑。亦即，在如N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽溶解的條件下進行反應，在反應後，作為溶劑取代，例如對於溶解使用鹵化溶劑、THF等而對於沉澱化使用甲醇、乙腈或水等極性有機溶劑。

＜N末端脫保護步驟＞本發明之肽之製造方法包括對在上述C末端保護步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端保護基進行脫保護之N末端脫保護步驟為較佳。作為N末端的保護基，能夠使用肽化學等技術領域中通常使用之後述胺基的保護基。在本發明中，Boc基、Cbz基或Fmoc基為較佳。

關於脫保護條件，藉由該臨時保護基的種類而適當選擇。例如，在為Fmoc基的情況下，藉由鹼處理來進行，並且在為Boc基的情況下，藉由酸處理來進行。該反應在不影響反應之溶劑中進行。

作為鹼，可以舉出二甲胺、二乙胺等二級胺或1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一碳烯(DBU)、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)、1,5-二氮雜雙環[4.3.0]-5-壬烯(DBN)等沒有親核性之有機鹼等。作為溶劑，能夠較佳地使用在上述溶解步驟中所述之溶劑。

＜肽鏈延長步驟＞本發明之肽之製造方法包括使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至在上述N末端脫保護步驟中所獲得之C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽的N末端中之肽鏈延長步驟為較佳。作為N末端被保護的胺基酸，例如，Y ¹為-NHCOR ¹⁸且R ¹⁸為具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構之、式(1)所表示之多環化合物為較佳。在上述肽鏈延長步驟中，使用上述縮合劑、縮合添加劑等，並且在肽化學領域中通常使用之肽合成條件下較佳地進行。作為N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽，並無特別限制，Fmoc保護胺基酸或Fmoc保護肽為較佳。

＜沉澱步驟＞本發明之肽之製造方法包括使在上述肽鏈延長步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之沉澱步驟為較佳。沉澱步驟能夠以與上述C末端保護步驟的純化(再沉澱)相同的方式進行。具體而言，在前段反應後，不蒸餾去除反應溶劑而向反應系統添加極性溶劑。在此情況下，反應溶劑使用THF作為非極性有機溶劑，並且極性溶劑使用乙腈。非極性有機溶劑與極性溶劑的使用比例(體積基準)為1:1～1:100為較佳，1:3～1:50為更佳，1:5～1:20為進一步較佳。在該使用比例的情況下，能夠使N末端被保護且C末端被保護的胺基酸或N末端被保護且C末端被保護的肽有效地沉澱，從而能夠有效地純化目標物。

＜鏈延長＞本發明之肽之製造方法在上述沉澱步驟之後，依序進一步包括1次以上的如下步驟為較佳，亦即，對所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端進行脫保護之步驟、使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至所獲得之C末端被保護的肽的N末端中之步驟及使所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之步驟。藉由反覆進行上述3個步驟，能夠容易進行所獲得之肽的鏈延長。上述3個步驟中之各步驟能夠以與上述相對應之各步驟相同的方式進行。

＜C末端脫保護步驟＞本發明之肽之製造方法進一步包括對C末端保護基進行脫保護之C末端脫保護步驟為較佳。在上述C末端脫保護步驟中，藉由去除具有所期望的胺基酸殘基數之C末端被保護的肽中之上述C末端保護基，能夠獲得作為最終目標物之肽。作為C末端保護基的去除方法，可以較佳地舉出使用了酸性化合物之脫保護方法。例如，可以舉出添加酸觸媒之方法或使用金屬觸媒並添加氫之方法。作為酸觸媒，可以舉出三氟乙酸(TFA)、鹽酸、三氟乙醇(TFE)、六氟異丙醇(HFIP)、乙酸等。對於不被強酸分解之肽，TFA為較佳，對於被強酸分解之肽，TFE、HFIP或乙酸為較佳。關於酸的濃度，能夠依據延長之胺基酸的側鏈保護基及脫保護條件而適當選擇。例如，TFA的濃度相對於所使用之溶劑的總體積為50體積%以下為較佳，30體積%以下為更佳，10體積%以下為更佳，5體積%以下為更佳，1體積%以下為特佳。下限值為0.01體積%為較佳，0.1體積%為更佳，0.5體積%為更佳。脫保護時間為5小時以下為較佳，3小時以下為更佳，1小時以下為更佳。

在本發明中，即使在弱酸條件下亦能夠進行C末端保護基及側鏈保護基的脫保護，能夠抑制所獲得之肽的副反應。作為在弱酸條件下的C末端保護基的脫保護較佳的肽(亦即，對酸弱之肽)，例如可以舉出具有N-烷基醯胺結構之肽。從抑制所獲得之肽的副反應且經時穩定性的觀點考慮，本發明之肽之製造方法適用於對酸弱之肽之製造方法中為較佳，適用於具有N-烷基醯胺結構之肽之製造方法中為更佳。

關於藉由本發明之肽之製造方法所獲得之作為最終目標物之肽，能夠按照肽化學中常用之方法來進行單離純化。例如，藉由對反應混合物進行抽取清洗、結晶、層析等，能夠對作為最終目標物之肽進行單離純化。藉由本發明之肽之製造方法所製造之肽的種類並無特別限定，但是肽的胺基酸殘基數例如為數十以下左右為較佳。與現有的或未知的合成肽或天然肽同樣地，藉由本發明之肽之製造方法所獲得之肽能夠利用於各種各樣的領域中，例如能夠利用於藥劑、食品、化妝品、電子材料、生物感測器等領域中，但是並不限定於此。本發明之肽之製造方法亦能夠在不影響下一步驟的反應之範圍內適當省略上述沉澱步驟。 [實施例]

以下，舉出實施例對本發明的實施形態進行進一步具體的說明。關於以下實施例所示之材料、使用量、比例、處理內容及處理順序等，只要不脫離本發明的實施形態的宗旨，則能夠進行適當地變更。因此，本發明的實施形態的範圍並不限定於以下所示之具體例。再者，除非另有特別說明，則“份”、“%”為質量基準。又，室溫表示25℃。

除非另有特別說明，則基於管柱層析法之純化可以使用自動純化裝置ISOLERA(Biotage公司製)或中壓液相層析法YFLC-Wprep2XY.N(YAMAZEN CORPORATION製)。除非另有特別說明，則二氧化矽管柱層析法中之載體可以使用SNAPKP-Sil Cartridge(Biotage公司製)、HI-FLASH COLUMNS W001、W002、W003、W004或W005(YAMAZEN CORPORATION.製)。管柱層析法中所使用之洗提液中之混合比為體積比。例如，“己烷:乙酸乙酯的梯度洗提=50:50～0:100”表示使50%己烷/50%乙酸乙酯的洗提液最終變成0%己烷/100%乙酸乙酯的洗提液。又，例如，“己烷:乙酸乙酯的梯度洗提=50:50～0:100、甲醇:乙酸乙酯的梯度洗提=0:100～20:80”表示使50%己烷/50%乙酸乙酯的洗提液變成0%己烷/100%乙酸乙酯的洗提液之後，最終變成20%甲醇/80%乙酸乙酯的洗提液。

關於MS光譜，使用ACQUITY SQD LC/MS System(Waters Corporation.製、離子化法：ESI (ElectroSpray Ionization、電噴灑離子化)法)進行了測定。關於NMR光譜，使用四甲矽烷作為內部基準，並且使用Bruker AV300(Bruker公司製、300MHz)或Bruker AV400(Bruker公司製、400MHz)進行測定，並將所有δ值均以ppm表示。關於HPLC純度，使用ACQUITY UPLC(Waters Corporation.製、管柱：CSH C18 1.7μm)進行了測定。

＜保護基形成用試藥(中間物2的合成和實施化合物1)的合成＞

＜中間物1的合成＞向3-羥基黃酮(20.0g，94.3mmol)中加入碳酸鉀(26.1g，188.5mmol)、N,N-二甲基乙醯胺400ml並滴加1-溴己烷(20.2g，122.5mmol)之後，加熱至內溫80℃，並攪拌了2小時。冷卻反應液，添加水800ml並攪拌30分鐘之後進行了濾過。向所獲得之粗產物中添加甲醇1200ml，進行加熱回流以使其溶解之後進行冷卻，添加水2400ml並進行過濾，用水400ml進行清洗，從而獲得了27.4g的白色固體的中間物1。 ¹H-NMR(DMSOd ⁶，400MHz)δ=0.88(3H，t)，1.27-1.48(6H，m)，1.73-1.81(2H，m)，4.15(2H，t)，7.05(1H，dd)，7.15(1H，d)，7.47(1H，dt)，7.63(1H，d)，7.85(1H，dt)，8.10(1H，d)，8.17(1H，dd)

＜中間物2的合成＞添加中間物1(2.00g，6.75mmol)、氫氧化鈉(2.16g，53.99mmol)、鋅粉(0.88g，13.50mmol)、乙醇12ml，一邊進行加熱回流一邊攪拌了2小時。冷卻之後，添加乙醇28ml並進行過濾，用乙醇20ml進行清洗之後，用蒸餾器減壓濃縮了濾液。向所獲得之油狀物中添加飽和食鹽水20ml、氯化銨(4.33g，80.98mmol)、水20ml，進一步用乙酸乙酯20ml抽取，用飽和食鹽水進行清洗之後，用硫酸鎂進行乾燥並進行過濾而濃縮，從而獲得了中間物2。中間物2作為保護基形成用試藥而發揮作用。

＜實施化合物1的合成法＞添加中間物2(2.02g，6.77mmol)、Fmoc-L-天冬醯胺酸(1.43g，4.02mmol)、二甲基甲醯胺24ml之後，滴加三氟乙酸(4.37ml，40.22mmol)並攪拌了2小時。向水72ml中添加反應液，攪拌30分鐘之後進行濾過，用甲醇將所獲得之粗產物再漿料化，從而獲得了1.93g(2個步驟、43.5%)的目標物。 ¹H-NMR(DMSOd ⁶，400MHz)δ=0.87(3H，m)，1.23-1.38(6H，m)，1.63-1.69(2H，m)，2.55(1H，dd)，2.68(1H，dd)，3.89-3.96(2H，m)，4.20-4.29(3H，m)，4.49(1H，q)，6.22(1H，d)，6.61-6.68(2H，m)，7.05-7.13(2H，m)，7.22-7.44(7H，m)，7.66-7.74(3H，m)，7.91(2H，d)，8.83(1H，d)，12.8(1H，br)

＜實施化合物2的合成法＞將1-溴己烷變更為2-溴丙烷，除此以外，以與實施化合物1相同的方式獲得了實施化合物2。 ¹H-NMR(DMSOd ⁶，400MHz)δ=1.23(6H，m)，2.56(1H，dd)，2.69(1H，dd)，4.20-4.30(3H，m)，4.46-4.63(2H，m)，6.22(1H，d)，6.58-6.68(2H，m)，7.04-7.13(2H，m)，7.23-7.44(7H，m)，7.67-7.75(3H，m)，7.91(2H，d)，8.83(1H，d)，12.8(1H，br)

＜實施化合物3的合成法＞將1-溴己烷變更為2-乙基己基溴，除此以外，以與實施化合物1相同的方式獲得了實施化合物3。

＜實施化合物4的合成法＞將Fmoc-L-天冬醯胺酸變更為Fmoc-L-麩醯胺酸，除此以外，以與實施化合物1相同的方式獲得了實施化合物4。

＜比較化合物1及比較化合物3＞

比較化合物1及比較化合物3使用了WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES,LTD.製的市售品。

＜比較化合物2的合成法＞與實施化合物1同樣地，將1-溴己烷變為對甲苯磺酸甲酯，除此以外，以與實施化合物1相同的方式合成了比較化合物2。

(評價1) ＜脫保護速度＞關於在上述中所合成之被保護的胺基酸，如下求出了所保護之側鏈部位的脫保護率。在混合使用了實施例的化合物之側鏈被保護的胺基酸或使用了比較例的化合物之側鏈被保護的胺基酸50mg和與側鏈被保護的胺基酸等莫耳量的Fmoc-Gly-OH(內部標準)之後，添加二氯甲烷/三氟乙醇/三氟乙酸(100/10/1：vol比)以使基質濃度以側鏈被保護的胺基酸基準成為0.025M，並在30℃下攪拌了60分鐘。將反應溶液5μL溶解於MeOH(甲醇)：400μL中，並使用Ultra Performance LC(超高效液相層析法、Waters Corporation.製、型號：ACQUITY)，定量對側鏈被保護的胺基酸進行脫保護而生成之Fmoc-胺基酸與Fmoc-Gly-OH的比率，從而求出脫保護率(%)，並依據下述基準進行了評價。

關於超高效液相層析法中所使用之管柱及測定條件，如下所示。管柱：Waters Corporation.製、型號：BEH C18 1.7μm、2.1mm×30mm 流量：0.5mL/min 溶劑：A液：0.1%甲酸-水、B液：0.1%甲酸-乙腈梯度循環：0.00min(A液/B液=95/5)、2.00min(A液/B液=5/95)、3.00min(A液/B液=95/5) 檢測波長：254nm

關於脫保護速度的評價，將“B”以上的情況設為合格。將結果示於表1中。再者，脫保護率越高，脫保護速度越快，可以說較佳。 -評價基準- “A”：脫保護率為90%以上。 “B”：脫保護率為50%以上且未達90%。 “C”：脫保護率為10%以上且未達50%。 “D”：脫保護率未達10%。

＜縮合中之反應速度＞向苄胺(20mg、0.187mmol)、N-甲基嗎福林(0.082ml、0.747mmol)中添加四氫呋喃1.87ml，進一步向苄胺中添加1.25莫耳當量的在上述中所獲得之側鏈被保護的胺基酸，添加(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代基亞乙基胺氧基)二甲基胺基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(COMU、1.25莫耳當量)並攪拌1小時，並依據下述基準進行了評價。將其結果示於表1中。

關於縮合的反應速度的評價，以苄胺的殘餘率為指標，將“B”以上的情況設為合格。再者，苄胺的殘餘率越低，側鏈被保護的胺基酸的縮合中之反應性越高，可以說較佳。 -評價基準- “A”：殘餘率未達5%。 “B”：殘餘率為5%以上且未達20%。 “C”：殘餘率為20%以上且未達50%。 “D”：殘餘率為50%以上。

[表1]

	化合物	脫保護速度	縮合反應速度
實施例1	實施化合物1	A	A
實施例2	實施化合物2	A	B
實施例3	實施化合物3	A	A
實施例4	實施化合物4	A	A
比較例1	比較化合物1	D	D
比較例2	比較化合物2	C	C
比較例3	比較化合物3	C	A

依據表1，與比較例1～比較例3的化合物相比，實施例1～實施例4中所使用之化合物的脫保護速度與縮合中之反應速度均優異。

＜保護肽(4殘基肽：Fmoc-Phe-Gln(X)-Asn(X)-Arg-Cys(Trt)-OH)的合成＞再者，將除了上述以外的各縮寫的詳細內容示於以下。 Phe：苯基丙胺酸殘基 Gln(X)：具有本發明的保護基之麩醯胺酸殘基 Asn(X)：具有本發明的保護基之天冬醯胺酸殘基 Cys(Trt)：Trt保護半胱胺酸殘基 Trt：三苯甲基

(實施例5：Fmoc-Cys(Trt)-O-NaphTAG的合成) 在室溫下，混合按照國際公開第2020/175472號的實施例所合成之原料1(914mg、1.00mmol)、Fmoc-Cys(Trt)-OH(879mg、1.50mmol)、四氫呋喃(10mL)，並添加了4-二甲基胺基吡啶(24.4mg、0.20mmol)、二異丙基碳二醯亞胺(232μL、1.50mmol)。在氮氣下將反應溶液攪拌1小時之後，將藉由添加甲醇(50mL)而析出之固體進行濾過並使其減壓乾燥，從而獲得了Fmoc-Cys(Trt)-O-NaphTAG(1.452g、98.0%)。

(實施例6：Fmoc-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG的合成) 使Fmoc-Cys(Trt)-O-NaphTAG(1.442g、0.974mmol)溶解於四氫呋喃(9.7mL)中，並且加入二氮雜雙環十一碳烯(DBU、2.0莫耳當量)並進行了攪拌。在脫保護反應結束後，依序加入N-甲基嗎福林(2.05莫耳當量)和甲磺酸(2.0莫耳當量)之後，添加實施化合物1(標記為Asn(X ₁))(1.25莫耳當量)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代基亞乙基胺氧基)二甲基胺基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(COMU、1.25莫耳當量)並進行了攪拌。在縮合反應結束後，加入乙腈(48.7mL)並進行攪拌，將沉澱物進行過濾，並藉由乙腈進行清洗之後使其減壓乾燥，從而獲得了Fmoc-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(1.775g、產率97.2%)。

(實施例7：Fmoc-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG的合成) 使Fmoc-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(1.765g、0.941mmol)溶解於四氫呋喃(9.4mL)中，並且加入二氮雜雙環十一碳烯(DBU、2.0莫耳當量)並進行了攪拌。在脫保護反應結束後，依序加入N-甲基嗎福林(2.05莫耳當量)及甲磺酸(2.0莫耳當量)之後，添加實施化合物4(標記為Gln(Y))(1.25莫耳當量)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代基亞乙基胺氧基)二甲基胺基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(COMU、1.25莫耳當量)並進行了攪拌。在縮合反應結束後，加入乙腈(47mL)並進行攪拌，將沉澱物進行過濾，並藉由乙腈進行清洗之後使其減壓乾燥，從而獲得了Fmoc-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(2.100g、產率97.7%)。 ESI-MS(+)=1985.1

(實施例8：Fmoc-Phe-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG的合成) 使Fmoc-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(2.09g、0.915mmol)溶解於四氫呋喃(9.2mL)中，並且加入二氮雜雙環十一碳烯(DBU、2.0莫耳當量)並進行了攪拌。在脫保護反應結束後，依序加入N-甲基嗎福林(2.05莫耳當量)及甲磺酸(2.0莫耳當量)之後，添加Fmoc-Phe-OH(1.25莫耳當量)、(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代基亞乙基胺氧基)二甲基胺基嗎啉代碳鎓六氟磷酸鹽(COMU、1.25莫耳當量)並進行了攪拌。在縮合反應結束後，加入乙腈(46mL)並進行攪拌，將沉澱物進行過濾，並藉由乙腈進行清洗之後使其減壓乾燥，從而獲得了Fmoc-Phe-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(2.167g、產率97.4%)。

(實施例9：肽的脫保護) 在室溫下，向Fmoc-Phe-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-NaphTAG(2.157g、0.887mmol)中加入三氟乙酸/六氟異丙醇/二氯甲烷(1/10/100：vol%、88.7mL)、三異丙基矽烷(10.0莫耳當量)及3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇(10.0莫耳當量)，並攪拌了1小時。向反應液中加入第三丁基甲基醚及正己烷的1/1混合液(1L)以使其結晶，從而獲得了Fmoc-Phe-Gln-Asn-Cys-OH(586mg、90.2%)。 HPLC純度(220nm)：88.5% MS(ESI，m/Z)：733.8(M+H)

(實施例10-13) 將天冬醯胺酸化合物變為實施化合物1至實施化合物2(標記為Asn(X ₂))，除此以外，以與實施例6至實施例9相同的方式合成了肽。 (實施例13) HPLC純度(220nm)：86.0%

[表2]

	排列	產率[%]
實施例5	Fmoc-Cys(Trt)-O-NaphTAG	98.0
實施例6	Fmoc-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-TAG	97.2
實施例7	Fmoc-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-TAG	97.7
實施例8	Fmoc-Phe-Gln(Y)-Asn(X ₁)-Cys(Trt)-O-TAG	97.4
實施例9	Fmoc-Phe-Gln-Asn-Cys-OH	90.2
實施例10	Fmoc-Asn(X ₂)-Cys(Trt)-O-TAG	96.8
實施例11	Fmoc-Gln(Y)-Asn(X ₂)-Cys(Trt)-O-TAG	97.0
實施例12	Fmoc-Phe-Gln(Y)-Asn(X ₂)-Cys(Trt)-O-TAG	96.5
實施例13	Fmoc-Phe-Gln-Asn-Cys-OH	91.5

如實施例所示，藉由本發明之肽之製造方法，能夠以高產率合成肽，並且即使在弱酸條件下亦能夠對側鏈的保護基進行脫保護，純度高。

無。

無。

Claims

一種肽之製造方法，其係包括使用下述式(1)所表示之多環化合物之步驟，
式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-NHCOR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、烷基、芳烷基、雜芳烷基或者具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基或烷氧基，R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A，前述R ^A分別獨立地表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3以上。
如請求項1之肽之製造方法，其中使用前述式(1)所表示之化合物之步驟為藉由前述式(1)所表示之化合物來保護被保護或未被保護的天冬醯胺酸或麩醯胺酸的側鏈胺基之側鏈保護步驟。
如請求項1之肽之製造方法，其係進一步包括：肽鏈延長步驟，前述式(1)所表示之化合物為N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽，並且使前述化合物與C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽縮合；及沉澱步驟，使在前述肽鏈延長步驟中所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱。
如請求項3之肽之製造方法，其係在前述沉澱步驟之後，依序進一步包括1次以上的如下步驟：對所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽的N末端進行脫保護之步驟；使N末端被保護的胺基酸或N末端被保護的肽縮合至所獲得之C末端被保護的肽的N末端中之步驟；及使所獲得之N末端被保護且C末端被保護的肽沉澱之步驟。
如請求項3或4之肽之製造方法，其係進一步包括對C末端保護基進行脫保護之C末端脫保護步驟，且脫保護係使用10體積%以下的三氟乙酸溶液來進行。
如請求項3或4之肽之製造方法，其中前述C末端被保護的胺基酸或C末端被保護的肽的C末端保護基具有碳數12以上的脂肪族烴基。
如請求項1至4中任一項之肽之製造方法，其中前述式(1)中的R ¹～R ⁸中的僅1個為R ^A。
如請求項1至4中任一項之肽之製造方法，其中前述式(1)中的R ³或R ⁶為R ^A。
如請求項1至4中任一項之肽之製造方法，其中前述式(1)中的R ^A分別獨立地為碳數3～10的烷基、碳數3～10的烷氧基或碳數3～10的烷氧基烷基。
如請求項1至4中任一項之肽之製造方法，其中前述式(1)中的Y ²為-O-。
一種精胺酸或麩醯胺酸的側鏈胺基保護基形成用試藥，其係包含下述式(1)所表示之多環化合物，
式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、烷基、芳烷基或雜芳烷基， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、烷基或烷氧基，R ¹～R ⁸及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A， R ^A表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3～10。
一種多環化合物，其係由下述式(1)表示，
式(1)中，Y ¹表示-OR ¹⁷、-NHR ¹⁸、-NHCOR ¹⁸、-SH或鹵素原子，R ¹⁷表示氫原子、活性酯型羰基或活性酯型磺醯基，R ¹⁸表示氫原子、碳數10以下的烷基、芳烷基、雜芳烷基或者具有被保護或未被保護的胺基及羧基之化學結構， Y ²表示-O-、-S-、-CR ¹⁰⁰=CR ¹⁰¹-、-CR ¹⁰²R ¹⁰³-CR ¹⁰⁴R ¹⁰⁵-、-CR ¹⁰⁶R ¹⁰⁷-或-N(R ¹¹⁰)-，R ¹⁰⁰～R ¹⁰⁷分別獨立地表示氫原子或烷基，R ¹¹⁰表示R ^A或氫原子， R ¹～R ⁸分別獨立地表示R ^A、氫原子、鹵素原子、碳數1～4的烷基或碳數1～4的烷氧基， R ²～R ⁷及R ¹¹⁰中的至少1個為R ^A， R ^A表示脂肪族烴基或具有脂肪族烴基之有機基團，至少1個脂肪族烴基的碳數為3～10。
如請求項12之多環化合物，其係由下述式(2)表示，
式(2)中，R ³或R ⁶分別獨立地表示氫原子、碳數3～10的烷氧基，R ³及R ⁶中的至少1個為碳數2～10的烷氧基， Rc表示氫原子或第三丁氧基羰基或9-茀基甲氧基羰基，Rd表示氫原子或鹽結構的陽離子，m表示1或2。