WO2022097540A1 - ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法 - Google Patents

ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法 Download PDF

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fmoc
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研一 野村
未来 陰
実 田宮
純一朗 金澤
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中外製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for synthesizing a peptide that can be synthesized with high purity and high efficiency in peptide synthesis by the solid phase method.
  • Diketopiperazine (DKP) formation in peptide synthesis is a long-recognized problem. Diketopiperazine formation can occur when the N-terminal protecting group of the dipeptide carried on the solid phase by an ester bond is removed and the free amino group is exposed.
  • Non-Patent Document 2 a method for suppressing diketopiperazine formation by using an Allloc group in which a deprotection reaction proceeds under neutral conditions without using a base as a protecting group at a site where diketopiperazine formation is likely to occur.
  • Non-Patent Document 3 In order to avoid the opportunity for the N-terminal to become a free amino group at a site where diketopiperazine formation is likely to proceed, a method of pre-synthesizing a dipeptide containing such a sequence and using it to extend a peptide chain. Is known (Non-Patent Document 3).
  • Non-Patent Document 4 A method of suppressing the formation of diketopiperazine is known (Non-Patent Document 4).
  • a dipeptide carried on a solid phase by an ester bond forms diketopiperazine by cleaving the ester bond, while an N-substituted amino acid is formed in the peptide sequence.
  • diketopiperazine may be formed in such a form that an amide bond stronger than the ester bond is cleaved, and the dipeptide containing the N-substituted amino acid may be shed from the peptide sequence. Since this shedding can occur anywhere in the peptide sequence where the N-substituted amino acid is present, it has been found that it can occur not only in the dipeptide supported on the solid phase.
  • Non-Patent Document 2 requires an Alloc amino acid, which is inferior in generality to the Fmoc amino acid in terms of availability.
  • the method for extending a peptide chain using a dipeptide described in Non-Patent Document 3 there is a concern that racemization of amino acids on the C-terminal side of the dipeptide may proceed. Therefore, the method described in this document is applied except when the amino acid on the C-terminal side of the dipeptide fragment is achiral (for example, glycine) or when racemization is difficult to proceed (for example, proline). That is difficult.
  • Non-Patent Document 4 is characterized in that the time required for the de-Fmoc step is very short, and the de-Fmoc step and solid phase washing are performed within 1 minute, for example, 10 to 20 seconds. Requires operation. It is impossible to apply such an operation in an extremely short time to scale-up synthesis such as industrialization.
  • the present invention is a peptide synthesis method capable of suppressing the formation of diketopiperazine, and (i) Fmoc as an N-terminal protecting group. It is an object of the present invention to provide a method using a protecting group containing a skeleton, (ii) having no restrictions on the sequence from the viewpoint of racemicization, and (iii) capable of scale-up synthesis such as industrialization. Further, in one aspect, it is an object of the present invention to provide a peptide synthesis method capable of suppressing the formation of a 6-membered cyclic amidine skeletal structure.
  • the present inventors treat a peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton with a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of a conjugated acid in a specific solvent. Subsequently, by reacting an extended active species such as an acid chloride or an active ester generated with a condensing agent with the peptide, diketopiperazine and a 6-membered ring are formed from the removal of the protecting group to the extension of the peptide chain.
  • an extended active species such as an acid chloride or an active ester generated with a condensing agent
  • the present invention includes the following.
  • [1] A method for producing a peptide by the solid phase method.
  • (1) A step of providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a resin for solid phase synthesis, (2) After the step (1), the group is selected from the group consisting of aromatic hydrocarbon solvents, halogen solvents, ether solvents, ester solvents, ketone solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents.
  • the first peptide is treated with one or more bases containing at least a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugated acid; (3) After the step (2), the first peptide and a carboxylic acid or a carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent to form a third peptide.
  • the manufacturing method comprising the step of obtaining. [2] The method according to [1], which does not include a step of treating the first peptide with piperidine as a single base prior to the step (2).
  • the solvent in the step (2) has a swelling ability of the solid phase resin of 1.5 mL / g or more, 2.0 mL / g or more, 2.5 mL / g or more, 3.0 mL / g or more, 3.5 mL / g or more, Alternatively, the method according to any one of [1] to [4], which is a solvent of 4.0 mL / g or more. [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein at least a part of the first peptide obtained by the step (2) is in the form of carbamate.
  • the carbamic acid salt is a salt of a conjugated acid with a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile.
  • the carbamic acid salt is a DBU salt, a TMG salt, an HP1 (dma) salt, an MTBD salt, a P1-tBu salt, or a P2-Et salt.
  • the molar ratio (carbamic acid salt / amine body) of the carbamate and the amine substance produced by further decarboxylation determined from the proton integral ratio of 1 H-NMR is determined.
  • the solvent in the step (2) is a group consisting of an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphoric acid ester solvent.
  • the solvent in the step (2) is composed of an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphate ester solvent.
  • the method according to any one of [1] to [11] which comprises 75v / v% or more of at least one selected.
  • the solvent in the step (2) further contains one or more selected from an amide-based solvent, a urea-based solvent, or a sulfone-based solvent.
  • the solvent in the step (2) is composed of an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphate ester solvent.
  • the aromatic hydrocarbon solvent may be one or more selected from the group consisting of toluene, benzene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, and cumene.
  • the halogen-based solvent is one or more selected from the group consisting of dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, and carbon tetrachloride.
  • the ether solvent is tetrahydrofuran, diethyl ether, 2-methyltetratetra, 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane, 1,3-dioxolane, diisopropyl ether, cyclopentylmethyl ether, t-butylmethyl ether, 4-methyl.
  • the ester solvent is one or more selected from the group consisting of methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, and ⁇ -valerolactone.
  • the ketone solvent is one or more selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, and diethyl ketone.
  • the carbonate solvent is one or more selected from the group consisting of dimethyl carbonate, diethyl carbonate, and dibutyl carbonate
  • the phosphate ester solvent is from trimethyl phosphate, triethyl phosphate, and tributyl phosphate.
  • the aromatic hydrocarbon solvent, halogen solvent, ether solvent, ester solvent, ketone solvent, carbonate solvent, or phosphate ester solvent in the step (2) is 26 or less.
  • the solvent in the step (2) is 25 or less, 24 or less, 23 or less, 22 or less, 21 or less, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13. It has a donor number value of 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1 or less, [1] to [ 16] The method described in any one of.
  • the amount of the aromatic hydrocarbon solvent, halogen solvent, ether solvent, ester solvent, ketone solvent, carbonate solvent, or phosphate ester solvent in the step (2) is 25 or less. 24 or less, 23 or less, 22 or less, 21 or less, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less , 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1 or less, according to any one of [1] to [17].
  • the base in the step (2) is at least one selected from the group consisting of DBU, MTBD, TMG, P1tBu, P2Et and HP1 (dma).
  • the method described in. [27] The method according to any one of [1] to [26], wherein the base in the step (2) is DBU, MTBD, TMG, P1tBu, P2Et or HP1 (dma).
  • the base in the step (2) is (i) a combination of DBU and piperidine, or (ii) a combination of DBU and MTBD, HP1 (dma), P1tBu, or P2Et, [1] to The method according to any one of [26].
  • an amino acid with a protective group a second peptide with a protective group, an active ester of a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an amino acid with a protective group, a protective group.
  • the protecting group is a carbamate-based protecting group, a sulfonyl-based protecting group, or an acyl-based protecting group.
  • the carbamate-based protecting group is a protective group containing an Fmoc skeleton, Alloc, Teoc, Boc, or Cbz, the sulfonyl-based protecting group is Ns, and the acyl-based protecting group is Tfa.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid or a C 6 -C 10 aryl carboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof, and the C 1- Even if the C 8 alkyl carboxylic acid and the C 6 -C 10 aryl carboxylic acid are substituted with one or more substituents independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, and halogen. Good, the method described in [40].
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog may be substituted with one or more substituents independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, and halogen.
  • the method according to [40], wherein the carboxylic acid or carboxylic acid analog is a C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof.
  • the first peptide is 2 to 30, 2 to 20, 2 to 15, 14, 13, 12, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, or 6.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is an amino acid having a protective group or a second peptide, or an amino acid having a protective group or an active ester of the second peptide, or having a protective group.
  • An amino acid or an acid halide of a second peptide, wherein the first peptide and / or a second peptide having the protective group comprises one or more N-substituted amino acids and / or the protection.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog is an amino acid or a second peptide having a protective group containing an Fmoc skeleton, or an active ester of an amino acid or a second peptide having a protective group containing an Fmoc skeleton.
  • One is an amino acid or an acid halide of a second peptide having a protective group containing an Fmoc skeleton, the first peptide and / or a second peptide having a protective group containing the Fmoc skeleton.
  • the condensing agent in the step (3) is at least one selected from the group consisting of PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, and TOTU.
  • the condensing agent in the step (3) is PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, or TOTU, [1] to [52].
  • the protecting groups containing the Fmoc skeleton are Fmoc group, Fmoc (2,7tb) group, Fmoc (1Me) group, Fmoc (2F) group, Fmoc (2,7Br) group, mio-Fmoc group, dio-Fmoc.
  • the method according to [57] which is a group, a tdf-Fmoc group, an Fmoc (2TMS) group, an Fmoc (2so3h) group, a sm-Fmoc group, or an rm-Fmoc group.
  • the method according to [57] wherein the protecting group containing the Fmoc skeleton is an Fmoc group.
  • the cleaning step is i) The step of cleaning the solid-phase synthesis resin with a solvent that has been contacted with CO 2 in advance, and / or ii) The step of cleaning the solid-phase synthesis resin with a solvent that has not been contacted with CO 2 in advance.
  • the cleaning step is i) The step of cleaning the solid-phase synthesis resin with a solvent bubbling CO 2 in advance, and / or ii) The process of cleaning the solid-phase synthesis resin with a solvent that has not been bubbled with CO 2 in advance.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the solvent in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone solvent.
  • the aromatic hydrocarbon solvent may be one or more selected from the group consisting of benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzeneanisole, ethylbenzene, nitrobenzene, and cumene.
  • the halogen-based solvent is one or more selected from the group consisting of dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, and carbon tetrachloride.
  • the ether solvent is diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrachloride, cyclopentylmethyl ether, 4-methyltetrahydropyran, 1,3-dioxolane, 1,4-dioxane, 1,2-dimethoxyethane, diisopropyl ether, t-.
  • the amide-based solvent is one or more selected from the group consisting of DMF, NMP, DMA, NEP, NBP, and formamide.
  • the sulfoxide solvent is one or more selected from the group consisting of DMSO and methylphenyl sulfoxide.
  • the sulfone-based solvent is one or more selected from the group consisting of diphenyl sulfone, dimethyl sulfone, diethyl sulfone, sulfolane, 3-methyl sulfolane, ethyl methyl sulfone, and ethyl isopropyl sulfone.
  • the urea solvent is one or more selected from the group consisting of DMI and DMPU.
  • the ester solvent is one or more selected from the group consisting of methyl acetate, ethyl acetate, methyl propionate, butyl acetate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, and ⁇ -valerolactone.
  • the ketone solvent is one or more selected from the group consisting of acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, diethyl ketone, and cyclopentanone.
  • the carbonate solvent is one or more selected from the group consisting of dimethyl carbonate, diethyl carbonate, and dibutyl carbonate.
  • the carboxylic acid used in the step (3) is an amino acid or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton, and the protecting group containing the Fmoc skeleton of the amino acid or the second peptide is the step.
  • the method according to any one of [1] to [71] which is the same as or different from the protecting group containing the Fmoc skeleton of the first peptide used in (1).
  • the carboxylic acid analog used in the step (3) is an amino acid having a protective group, a second peptide having a protective group, C 1 -C 8 alkyl carboxylic acid, or C 6 -C 10 aryl carboxylic acid.
  • a method for reducing the amount of diketopiperazine impurities and / or 6-membered cyclic amidine skeletal structure impurities produced in the production of peptides by the solid phase method (1) A step of providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a solid phase; and (2) After the step (1), the group is selected from the group consisting of aromatic hydrocarbon solvents, halogen solvents, ether solvents, ester solvents, ketone solvents, carbonate solvents, and phosphate ester solvents.
  • the method comprising treating the first peptide with at least one or more bases comprising a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of a conjugated acid in a solvent comprising at least one of the above.
  • the desired elongation reaction sufficiently proceeds under conventional conditions due to the formation of diketopiperazine and / or the formation of a 6-membered cyclic amidin skeletal structure. Since the formation of such impurities can be significantly reduced even when the amino acid sequence is not included, the peptide chain can be efficiently extended to obtain a peptide having a desired amino acid sequence.
  • the method of the present invention is highly versatile and can be scaled up because it does not require the use of a special protecting group such as Allloc, which is less common, and there are no restrictions on reaction operations such as dealing with extremely short reaction times. It can be a practical synthesis method.
  • FIG. 1 shows 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene in Fmoc-Phe-NMe 2 (Compound 1-3-1) in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • 1 H-NMR spectrum between 3.6-6.8 ppm before and after the action of (DBU) is shown, and compound 1-3-1 and compound 1-3-2 observed in this range, compound. It is a figure which shows the characteristic 1H signal of 1-3-3a, dibenzofulvene.
  • DBU N-dimethylformamide-d7
  • 1, a) is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows the 1 H-NMR spectrum of the solution obtained by acting
  • FIG. 1 b) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a solution of compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • FIG. 2 It is a figure which shows the 1D-ROESY spectrum which selectively excited 1H signal of 4.82ppm of the solution obtained by acting (DBU).
  • a) -3 is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DMF-d7 N, N-dimethylformamide-d7
  • b) is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) with respect to compound 1-3-1. It is a 1 H-NMR spectrum showing the integral ratio of the 1 H signal of 4.85 ppm and the 1 H signal of 3.95 ppm of the solution obtained by the action of).
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • a) -1 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a sample of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • a) -2 is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DBU 1 H-NMR spectrum of the solution obtained by acting
  • a) -3 is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • FIG. 3 It is a figure which shows the 1H - NMR spectrum of the solution obtained by allowing (DBU) to act, and further adding 3 ⁇ L of the standard of compound 1-3-2.
  • a) -4 is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • DMF-d7 N, N-dimethylformamide-d7
  • a) -5 is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows the 1D-NOESY spectrum which performed (DBU), and was selected and excited
  • b) is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) with respect to compound 1-3-1 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • FIG. 4 shows 1,8-diazabicyclo [5.4.0]-after bubbling 13 CO 2 to compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows 1 H-NMR and 1D-NOESY spectrum around 5.1-3.7 ppm which shows that the compound 1-3-3a was generated by the action of 7-undecene (DBU).
  • DBU 7-undecene
  • a) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a standard of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • b) is a 1 H-NMR spectrum of a solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute with a solution of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows.
  • c) is 1 of 4.77 ppm of the solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute with the N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-3-2. It is a figure which shows the 1D-NOESY spectrum which H signal was selectively excited.
  • FIG. 4 a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of a standard of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • b) is a 1 H-NMR spectrum of a solution obtained by bubbling 13 CO 2 for
  • d) is 3.96 ppm of 1 H of the solution obtained by bubbling 13 CO 2 for 1 minute with respect to the N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of Compound 1-3-2. It is a figure which shows the 1D-NOESY spectrum which selectively excited a signal.
  • e) shows 1,8-diazabicyclo [5.4] after bubbling 13 CO 2 for 1 minute with a solution of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows the 1H - NMR spectrum of the solution obtained by the action of -7-undecene (DBU).
  • DBU -7-undecene
  • f) is a 1.77 ppm 1H signal after bubbling 13 CO 2 for 1 minute with a solution of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure of the 1H - NMR spectrum which showed the integral ratio of the 1H signal of 3.96ppm .
  • e) shows 1,8-diazabicyclo [5.4] after bubbling 13 CO 2 for 1 minute with a solution of compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is an enlarged view of the 1H signal of 4.83ppm of the 1H - NMR spectrum of the solution obtained by the action of -7-undecene (DBU).
  • FIG. 5 shows 1,8-diazabicyclo [5.4.0]-after bubbling 13 CO 2 to compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure which shows the 13 C-NMR spectrum around 164-124 ppm which shows that the compound 1-3-3a was generated by the action of 7-undecene (DBU).
  • a) shows a 13 C-NMR spectrum of a solution obtained by bubbling 13 CO 2 with respect to compound 1-3-2 in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7). It is a figure.
  • DBU 7-undecene
  • a) is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) with respect to compound 1-3-1. It is a figure which shows the 1 H-NMR spectrum of the solution (solution B) obtained by acting
  • b) is 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU) in N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) with respect to compound 1-3-1.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) solution of compound 1-3-2, 1,8-diazabicyclo [5] .4.0] -7-Undecene (DBU) is allowed to act on the solution (solution A) obtained by mixing the solution (solution A), which is present in the solution obtained by mixing 1H, 13C , 15 of the carbamate moiety of compound 1-3-3a . It is a figure which shows that all N signals were identified.
  • halogen atom examples of the "halogen atom" in the present specification are F, Cl, Br or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and refers to a hetero atom (an atom other than carbon and hydrogen atom) in the skeleton. ) Or a group having a subset of a hydrocarbyl or hydrocarbon group structure that does not contain an unsaturated carbon-carbon bond and contains hydrogen and a carbon atom.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Specifically, the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1 -C 20 , hereinafter, "C p -C q " means that the number of carbon atoms is p to q).
  • C1-C 10 alkyl Preferred are C1-C 10 alkyl, more preferably C 1 - C 6 alkyl.
  • Specific examples of the alkyl include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, and s-pentyl (1-pentyl).
  • Methylbutyl t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP 2 carbon atoms). Depending on the double bond and the placement of the substitutions (if any), the geometry of the double bond can be an entomen (E) or tuzanmen (Z), cis or trans arrangement.
  • Alkenyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Examples of the alkenyl include C2 - C 10 alkenyl, more preferably C2 - C 6 alkenyl, and specific examples thereof include vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl and 2-butenyl. (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms).
  • Alkinyl includes not only linear ones but also branched chain ones.
  • the alkynyl is preferably C2 - C10 alkynyl, more preferably C2 - C6 alkynyl, and specifically, for example, ethynyl, 1 -propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • Preferred examples of the cycloalkyl include C3 - C8 cycloalkyl, and specific examples thereof include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, and spiro [. 3.3] Heptyl and the like can be mentioned.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C 6 -C 10 aryl. Specific examples of the aryl include phenyl and naphthyl (for example, 1-naphthyl and 2-naphthyl).
  • heterocyclyl means a non-aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the heterocyclyl may have double and / or triple bonds in the ring, and the carbon atom in the ring may be oxidized to form a carbonyl, which may be a monocyclic or fused ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 4 to 10 (4 to 10-membered heterocyclyl), more preferably 4 to 7 (4 to 7-membered heterocyclyl).
  • heterocyclyl examples include azetidinyl, oxylanyl, oxetanyl, azetidinyl, dihydrofuryl, tetrahydrofuryl, dihydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridyl, tetrahydropyrimidyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, and the like.
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the ring may be a single ring, a fused ring with another ring, or may be partially saturated.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10-membered heteroaryl), and more preferably 5 to 7 (5 to 7-membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include frill, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridadinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl.
  • Benzodiazepine benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzoxaziazolyl, benzoimidazolyl, indolyl, isoindrill, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodioxolyl, indridinyl, imidazolypyridyl and the like.
  • alkoxy means an oxy group to which the "alkyl” of the above definition is bonded, and C1 - C6 alkoxy is preferable. Specific examples of the alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, 3-methylbutoxy and the like.
  • alkenyloxy means an oxy group to which the "alkenyl” as defined above is bound, and preferably C2 - C6 alkenyloxy .
  • Specific examples of the alkenyloxy include vinyloxy, allyloxy, 1-propenyloxy, 2-propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy (including cis and trans), 3-butenyloxy, pentenyloxy, and hexenyloxy. Can be mentioned.
  • cycloalkoxy means an oxy group to which the "cycloalkyl” as defined above is bonded, and preferably C3 - C8 cycloalkoxy is mentioned. Specific examples of cycloalkoxy include cyclopropoxy, cyclobutoxy, cyclopentyloxy and the like.
  • aryloxy means an oxy group to which the above - defined “aryl” is attached, preferably C6 - C10 aryloxy. Specific examples of the aryloxy include phenoxy, 1-naphthyloxy, 2-naphthyloxy and the like.
  • heteroaryloxy means an oxy group to which the "heteroaryl” defined above is bound, and preferably 5 to 10-membered heteroaryloxy.
  • amino means -NH 2 in a narrow sense and -NRR'in a broad sense, where R and R'are independent of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo. Selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R'form a ring together with the nitrogen atom to which they are attached.
  • Preferred amino acids include -NH 2 , mono-C 1 -C 6 alkyl amino, di C 1 -C 6 alkyl amino, 4- to 8-membered cyclic amino and the like.
  • the term "monoalkylamino” means a group of the above-defined “amino” in which R is hydrogen and R'is “alkyl” as defined above, preferably mono - C1. -C 6 alkylamino can be mentioned. Specific examples of the monoalkylamino include methylamino, ethylamino, n-propylamino, i-propylamino, n-butylamino, s-butylamino, t-butylamino and the like.
  • dialkylamino means a group of "amino” in the above definition in which R and R'are independently “alkyl” in the above definition, preferably diC1 - C6. Alkylamino can be mentioned. Specific examples of the dialkylamino include dimethylamino and diethylamino.
  • cyclic amino means, of the "amino” defined above, R and R'mean groups that together form a ring with the nitrogen atom to which they are attached, preferably.
  • examples include 4- to 8-membered cyclic amino acids.
  • the cyclic amino for example, 1-azetidyl, 1-pyrrolidyl, 1-piperidyl, 1-piperazil, 4-morpholinyl, 3-oxazolidyl, 1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl, 3 -Oxa-8-azabicyclo [3.2.1] octane-8-yl and the like can be mentioned.
  • haloalkyl means a group in which one or more hydrogen atoms of "alkyl” as defined above are substituted with a halogen, preferably C1 - C8 haloalkyl, preferably C1 - C6 haloalkyl . Is more preferable.
  • fluoroalkyl means a group in which one or more hydrogen atoms of "alkyl” as defined above are substituted with a fluorine atom, and C1 - C8 fluoroalkyl is preferable.
  • haloalkyl for example, monofluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2,2-difluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 3,3-difluoropropyl, 4,4-difluorobutyl , 5,5-Difluoropentyl, 3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl and the like.
  • aralkyl (arylalkyl) means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” as defined above is substituted with "aryl” as defined above, preferably C7 - C14 aralkyl. , C 7 -C 10 aralkyl are more preferred. Specific examples of the aralkyl include benzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl and the like.
  • aralkyloxy means an oxy group to which the "aralkyl” defined above is bound, preferably C7 - C14 aralkyloxy, more preferably C7 - C10 aralkyloxy .
  • Specific examples of the aralkyloxy include benzyloxy, phenethyloxy, 3-phenylpropoxy and the like.
  • peptide chain refers to a peptide chain in which one or more natural and / or unnatural amino acids are linked by an amide bond and / or an ester bond.
  • the peptide chain is preferably a peptide chain containing 1 to 15 amino acid residues, and more preferably a peptide chain consisting of 5 to 12 amino acid residues.
  • the "peptide compound” in the present invention is not particularly limited as long as it is a peptide compound in which a natural amino acid and / or an unnatural amino acid is linked by an amide bond or an ester bond, but is preferably 5 to 30 residues, more preferably 8 to 8 to 30 residues. It is a peptide compound having 15 residues, more preferably 9 to 13 residues.
  • the peptide compound synthesized in the present invention preferably contains at least 3 N-substituted amino acids in one peptide, and more preferably contains at least 5 or more N-substituted amino acids. These N-substituted amino acids may be present continuously or discontinuously in the peptide compound.
  • the peptide compound in the present invention may be linear or cyclic, and a cyclic peptide compound is preferable. In the present specification, the "peptide compound” may be referred to as "peptide".
  • the "cyclic peptide compound” in the present invention is a cyclic peptide compound that can be obtained by cyclizing the N-terminal side group and the C-terminal side group of the linear peptide compound.
  • Cyclization includes carbon-nitrogen bond cyclization such as amide bonds, carbon-oxygen bond cyclization such as ester bonds and ether bonds, carbon-sulfur cyclization such as thioether bonds, and carbon-carbon bonds. It may be in any form, such as cyclization by cyclization by, or cyclization by construction of a heterocycle.
  • cyclization via a covalent bond such as an amide bond or a carbon-carbon bond is preferable, and cyclization via an amide bond between a carboxylic acid group in the side chain and an amino group in the N-terminal main chain is more preferable.
  • the positions of the carboxylic acid group, amino group and the like used for cyclization may be those on the main chain or those on the side chains, and are not particularly limited as long as they are in cyclizable positions.
  • one or more means one or two or more numbers.
  • the term means the number from one to the maximum number of substituents the group allows. Specific examples of the "one or more” include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or a larger number.
  • the "resin for solid phase synthesis” is not particularly limited as long as it can be used for the synthesis of peptide compounds by the solid phase method.
  • Specific examples of such a resin for solid phase synthesis include CTC resin, Wang resin, SASRIN resin, trityl chloride resin (Trt resin), 4-methyltrityl chloride resin (Mtt resin), and 4-methoxytrityl chloride. Examples thereof include those that can be removed under acidic conditions such as resin (Mmt).
  • the resin can be appropriately selected according to the functional group on the amino acid side used.
  • a carboxylic acid main chain carboxylic acid or a side chain carboxylic acid typified by Asp or Glu
  • a hydroxy group on the aromatic ring phenol group typified by Tyr
  • Trt resin trityl chloride resin
  • CTC resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • the resin is trityl chloride resin (Trt resin) or 2-chlorotrityl chloride resin (CTC resin).
  • Mtt resin 4-methyltritylchloride resin
  • a resin may be described as a resin.
  • the type of polymer constituting the resin is also not particularly limited. In the case of a resin composed of polystyrene, either 100-200 mesh or 200-400 mesh may be used.
  • the cross-linking rate is also not particularly limited, but 1% DVB (divinylbenzene) cross-linking is preferable.
  • examples of the type of polymer constituting the resin include Tentagel and Chemmatrix.
  • the substituent includes, for example, alkyl, alkoxy, fluoroalkyl, fluoroalkoxy, oxo, aminocarbonyl, alkylsulfonyl, alkyl.
  • substituents include sulfonylamino, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, halogen, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, cyano, carboxyl, alkoxycarbonyl, formyl and the like.
  • substituents may be added to each of these, and these substituents are also not limited, and any substitution including, for example, a halogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • a halogen atom an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • One or two or more may be freely selected independently from the group. That is, examples thereof include alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, etc., which may be substituted.
  • the compounds described herein can be salts thereof or solvates thereof.
  • the salts described herein include, for example, hydrochloride; hydrobromide; hydroiodide; phosphate; phosphonate; sulfate; methanesulfonate, p-toluenesulfonate and the like. Sulfates; carboxylates such as acetates, citrates, malates, tartrates, succinates, salicylates; or alkali metal salts such as sodium and potassium salts; magnesium salts, calcium salts, etc.
  • Alkaline earth metal salts include ammonium salts such as ammonium salts, alkylammonium salts, dialkylammonium salts, trialkylammonium salts, tetraalkylammonium salts and the like. These salts are produced, for example, by contacting the compound with an acid or a base.
  • the solvate of the compound described in the present specification refers to a phenomenon in which a solute molecule strongly attracts a solvent molecule in a solution to form one molecular group, and if the solvent is water, it is called a hydrate.
  • the compounds described herein are solvents with an organic solvent such as alcohol (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, etc.), dimethylformamide, or diglyme, or a single solvent selected from water and the like. It may be a Japanese product or a solvent product with a plurality of solvents.
  • amino acid in the present specification includes natural amino acids and unnatural amino acids (sometimes referred to as amino acid derivatives).
  • natural amino acid refers to Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro. Point to.
  • the unnatural amino acid (amino acid derivative) is not particularly limited, and examples thereof include ⁇ -amino acids, D-type amino acids, N-substituted amino acids, ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acids, amino acids having different side chains from natural amino acids, and hydroxycarboxylic acids. ..
  • any configuration is allowed.
  • the selection of the side chain of the amino acid is not particularly limited, but in addition to the hydrogen atom, for example, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, a heteroaralkyl group, a cycloalkyl group, or a spiro bond. It is freely selected from the cycloalkyl groups.
  • Substituents may be added to each, and these substituents are not limited, and any substituent including, for example, a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • substituents include, for example, a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • substituents include an alkyl group, an alkoxy group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, a cycloalkyl group and the like, which may be substituted, or an oxo, aminocarbonyl, halogen atom and the like.
  • the amino acid herein may be a compound having a carboxy group and an amino group in the same molecule (even in this case, imino
  • Examples of the substituent containing a halogen atom in the present specification include an alkyl group having a halogen as a substituent, a cycloalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group and the like, and more specifically. Is exemplified by fluoroalkyl, difluoroalkyl, trifluoroalkyl and the like.
  • Examples of oxy (-OR) include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • alkoxy C1 - C4 alkoxy and C1 - C2 alkoxy are preferable, and methoxy or ethoxy is preferable.
  • Examples of carbonyloxy include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like. ..
  • carbonylthio examples include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like. ..
  • alkylaminocarbonyls eg, C1 - C6 or C -1 - C4 alkylaminocarbonyls, among which ethylaminocarbonyl, methylaminocarbonyl and the like.
  • Cycloalkylaminocarbonyl alkenylaminocarbonyl, alkynylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, heteroarylamino
  • Examples of carbonylamino include alkylcarbonylamino, cycloalkylcarbonylamino, alkenylcarbonylamino, alkynylcarbonylamino, arylcarbonylamino, heteroarylcarbonylamino, aralkylcarbonylamino and the like. ..
  • Examples of oxycarbonylamino include alkoxycarbonylamino, cycloalkoxycarbonylamino, alkenyloxycarbonylamino, alkynyloxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, heteroaryloxycarbonylamino, aralkyloxy. Examples include carbonylamino.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • groups in which the H atom bonded to the N atom in -NH-SO2 - R is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl can be mentioned.
  • aminosulfonyl examples include alkylaminosulfonyl, cycloalkylaminosulfonyl, alkenylaminosulfonyl, alkynylaminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroarylaminosulfonyl, aralkylaminosulfonyl and the like.
  • groups in which the H atom bonded to the N atom in -SO2 -NHR is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl can be mentioned.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenyl sulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero.
  • Aryl sulfamoyl amino, aralkyl sulfamoyl amino and the like can be mentioned.
  • the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2 -NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • thio As an example of thio (-SR), it is selected from among alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio and the like.
  • sulfonyl examples include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl and the like.
  • Substituents containing N atoms include azide (-N 3 , also referred to as "azido group”), cyano (-CN), primary amino (-NH 2 ), secondary amino (-NH-R; mono-substituted amino).
  • secondary amino examples include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • tertiary aminos examples include, for example, alkyl (aralkyl) amino, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc., respectively.
  • Amino groups having any two substituents selected above may be mentioned, and these any two substituents may form a ring.
  • Specific examples thereof include dialkylaminos, among which C1 - C6 dialkylaminos, C1 - C4 dialkylaminos, dimethylaminos and diethylaminos.
  • C p -C q dialkylamino group refers to a group in which two C p -C q alkyl groups are substituted for an amino group, and both C p -C q alkyl groups are the same. May be different.
  • the three substituents R, R', and R" on the N atom are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, hetero.
  • substituted guanidinos include R, R', R", and R''' as alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , Heteroaryl, groups independently selected from aralkyl, or groups formed by these groups.
  • R, R', and R" are among hydrogen atoms, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. Examples thereof include groups selected independently of each, or groups forming a ring.
  • amino acid residue constituting the peptide compound may be simply referred to as "amino acid”.
  • N-substituted amino acid in the present invention means an amino acid in which the main chain amino group is N-substituted among the amino acids defined above.
  • the main chain amino group of the amino acid is an NHR group
  • R is an arbitrary group other than hydrogen, for example, an alkyl group, an alkenyl group, or an alkynyl group which may be substituted.
  • An aryl group, a heteroaryl group, an alkyl group, or a cycloalkyl group, and a cyclic amino acid such as proline in which a carbon atom bonded to an N atom and a carbon atom from the ⁇ -position form a ring.
  • prolines forming a 5-membered ring azetidines forming a 4-membered ring, and piperidines forming a 6-membered ring can be mentioned.
  • the substituent of each group which may be substituted is not particularly limited, and examples thereof include a halogen group, an ether group, and a hydroxyl group.
  • amino acid includes all isotopes corresponding to each.
  • An isotope of an “amino acid” is one in which at least one atom is replaced with an atom having the same atomic number (number of protons) but different mass number (sum of numbers of protons and neutrons).
  • isotopes included in the "amino acids" of the present specification include hydrogen atom, carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom, phosphorus atom, sulfur atom, fluorine atom, chlorine atom and the like, respectively, 2H and 3 H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl and the like are included.
  • prolines means a group of compounds in which one or more arbitrary substituents are bonded to any carbon atom forming a 5-membered ring of proline in addition to proline. When a plurality of substituents are present on the 5-membered ring, the substituents may be combined to form a ring, and the ring may be any aromatic ring.
  • prolines proline, trans-4-hydroxy-L-proline, cis-4-hydroxy-L-proline, trans-4-fluoro-L-proline, cis-4-fluoro-L- Examples thereof include proline and 2-methyl-L-proline.
  • the hydroxy group may be protected by an arbitrary protecting group, or an arbitrary substituent and an oxygen atom of the hydroxy group form an ether bond or an ester bond. May be good.
  • any one of the carbon atoms forming the 5-membered ring may be replaced with an oxygen atom or a sulfur atom.
  • Specific examples of such a compound include L-thioproline.
  • prolines may have unsaturated bonds in the formed 5-membered ring.
  • Specific examples of such a compound include 3,4-dehydro-L-proline. It should be noted that they are not limited to the L-form and may be the D-form.
  • azetidines are basically compounds in which one nitrogen atom and three carbon atoms form a four-membered ring, and a carboxyl group is bonded to the carbon atom next to the nitrogen atom. It means a cyclic amino acid. Any one or more substituents may be bonded to any carbon atom forming a 4-membered ring. When a plurality of substituents are present on the 4-membered ring, the substituents may be combined to form a ring.
  • Specific examples of the "azetidines” include (S) -azetidine-2-carboxylic acid and (R) -azetidine-2-carboxylic acid.
  • azetidines compounds in which a carboxyl group is bonded to the second carbon atom counting from the nitrogen atom forming a 4-membered ring are also included in "azetidines", and such compounds include, for example, azetidine-3. -Carboxylic acid and the like.
  • piperidins are basically compounds in which one nitrogen atom and five carbon atoms form a 6-membered ring, and a carboxyl group is bonded to the carbon atom next to the nitrogen atom. Means a cyclic amino acid. Any one or more substituents may be bonded to any carbon atom forming a 6-membered ring. When a plurality of substituents are present on the 6-membered ring, the substituents may be combined to form a ring, and the ring may be any aromatic ring.
  • examples of the aromatic hydrocarbon solvent include benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene and the like.
  • examples of the halogen-based solvent include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride and the like.
  • ether solvent for example, diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyl tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane, diisopropyl ether, cyclopentyl methyl ether, t. -Butyl methyl ether, 4-methyltetrahydropyran, diglyme, triglycrim, tetraglyme and the like can be mentioned.
  • examples of the amide solvent include N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMA), N-ethylpyrrolidone (NEP), and N. -Butylpyrrolidone (NBP), formamide and the like can be mentioned.
  • examples of the sulfoxide-based solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO) and methylphenyl sulfoxide.
  • examples of the sulfone solvent include diphenyl sulfone, dimethyl sulfone, diethyl sulfone, sulfolane, 3-methyl sulfolane, ethyl methyl sulfone, ethyl isopropyl sulfone and the like.
  • examples of the urea solvent include 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI) and 1,3-dimethyl-3,4,5,6-tetrahydro-2 (1H) -pyrimidinone. (DMPU) and the like.
  • ester solvent examples include methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, ⁇ -valerolactone and the like.
  • examples of the ketone solvent include acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethyl ketone and the like.
  • examples of the carbonate solvent include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate and the like.
  • examples of the phosphoric acid ester solvent include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, tributyl phosphate and the like.
  • amidines means a base represented by the following formula B1:
  • RB 1 and RB 4 are independently C1- C4 alkyl, respectively , or RB 1 and RB 4 are associated with the nitrogen atom to which RB 1 is attached and the carbon atom to which RB 4 is attached.
  • RB 2 and RB 3 are independently C1 - C4 alkyl, respectively, or RB 2 and RB 3 are the nitrogen atom to which RB 2 is attached and the nitrogen atom to which RB 3 is attached and the like. Together with the carbon atom to which the nitrogen atom is bonded, it forms a 5- to 8-membered ring.
  • the C1 - C4 alkyl is preferably methyl or ethyl.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably a pyrrolidine ring, a piperidine ring, an azepane ring or the like.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably a 1,4,5,6-tetrahydropyrimidine ring.
  • amidines include DBU: 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene and DBN: 1,5-diazabicyclo [4.3.0] -5-nonene. ..
  • guanidines means a base represented by the following formula B2:
  • RB 6 is hydrogen or C1 - C4 alkyl and is RB 5 and RB 7 are C1 - C4 alkyl independently, or 5-8 together with each nitrogen atom to which they are bonded and the carbon atom to which each nitrogen atom is bonded.
  • RB 8 is C 1 -C 4 alkyl and RB 9 is hydrogen, C 1 -C 4 alkyl or phenyl, or RB 8 and RB 9 are each nitrogen atom to which they are attached and their respective. Together with the carbon atom to which the nitrogen atom is bonded, it forms a 5- to 8-membered ring.
  • the two formulas B2 may condense the two benzene rings of the phenyl group to form naphthalene.
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl
  • RB 9 is C 1 -C 4 alkyl
  • the 4 -alkyl is preferably t-butyl.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably an imidazolidine ring, a hexahydropyrimidine ring, a 1,3-diazepan ring or the like.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably a 1,4,5,6-tetrahydropyrimidine ring.
  • TMG 1,1,3,3-tetramethylguanidine
  • TBD 1,5,7-triazabicyclo [4.4.0] deca-5-ene
  • MTBD 7- Methyl-1,5,7-triazabicyclo [4.4.0] deca-5-ene and the like can be mentioned.
  • phosphazene means a base represented by the following formula B3 or the following formula B4:
  • RB 10 is a C1- C4 alkyl, or RB 10 and RB 11 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5-8 membered ring.
  • RB 11 is C1 - C4 alkyl, except when RB 10 and RB 11 form a 5-8 membered ring, or RB 11 and RB 12 are each nitrogen atom to which they are attached and Together with the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded, a 5- to 8-membered ring is formed.
  • RB 12 is C1 - C4 alkyl, except when RB 11 and RB 12 form a 5-8 membered ring, or RB 12 and RB 13 are associated with the nitrogen atom to which they are attached.
  • RB 13 is C1 - C4 alkyl, except when RB 12 and RB 13 form a 5- to 8-membered ring, or RB 13 and RB 14 are each nitrogen atom to which they are attached and Together with the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded, a 5- to 8-membered ring is formed.
  • RB 14 is C1 - C4 alkyl, except when RB 13 and RB 14 form a 5-8 membered ring, or RB 14 and RB 15 are associated with the nitrogen atom to which they are attached.
  • RB 15 is C1 - C4 alkyl, except when RB 14 and RB 15 form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 16 is hydrogen, C1 - C8 alkyl, or C6-C 10 aryl .
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • the C 1 The —C8 alkyl is preferably t-butyl or t-octyl.
  • the 5- to 8-membered ring is preferably a pyrrolidine ring, a piperidine ring, an azepane ring, or the like. Can be mentioned.
  • the 5-8 membered ring is bound to RB 11 , RB 12 , RB 13 and RB 14 . It is preferably a 5- to 8-membered saturated ring containing no heteroatom other than each nitrogen atom and the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded.
  • RB 17 is independently C1 - C4 alkyl, or RB 17 and RB 18 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 18 is C1 - C4 alkyl, except when RB 17 and RB 18 form a 5- to 8-membered ring, or RB 18 and RB 19 are each nitrogen atom to which they are attached and Together with the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded, a 5- to 8-membered ring is formed.
  • RB 19 is C1 - C4 alkyl, except when RB 18 and RB 19 form a 5- to 8-membered ring, or RB 19 and RB 20 are associated with the nitrogen atom to which they are attached.
  • RB 20 is C1 - C4 alkyl, except where RB 19 and RB 20 form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 21 is a C1- C4 alkyl, or RB 21 and RB 22 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 22 is C1 - C4 alkyl, except when RB 21 and RB 22 form a 5- to 8-membered ring, or RB 22 and RB 23 are each nitrogen atom to which they are attached and Together with the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded, a 5- to 8-membered ring is formed.
  • RB 23 is C1 - C4 alkyl, except when RB 22 and RB 23 form a 5- to 8-membered ring, or RB 23 and RB 24 are associated with the nitrogen atom to which they are attached.
  • RB 24 is C1 - C4 alkyl, except when RB 23 and RB 24 form a 5-8 membered ring, or RB 24 and RB 25 are each nitrogen atom to which they are attached and Together with the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded, a 5- to 8-membered ring is formed.
  • RB 25 is C1 - C4 alkyl, except when RB 24 and RB 25 form a 5- to 8-membered ring, or RB 25 and RB 26 are associated with the nitrogen atom to which they are attached.
  • RB 26 is C1 - C4 alkyl, except where RB 25 and RB 26 form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 27 is a C1 - C4 alkyl or a C6 - C 10 aryl.
  • the C 1 -C 4 alkyl is preferably methyl or ethyl
  • the C 1 The —C4 alkyl is preferably ethyl or t-butyl.
  • RB 17 and RB 18, RB 19 and RB 20 , RB 21 and RB 22, RB 23 and RB 24, RB 25 and RB 26 form a 5- to 8-membered ring
  • the 5- to 8-membered ring is preferable. Examples thereof include a pyrrolidine ring, a piperidine ring, and an azepane ring.
  • both RB 19 and RB 20 are preferably C 1 - C 4 -alkyl, with RB 17 and RB 18 forming a 5- to 8-membered ring.
  • RB 19 and RB 20 also preferably form a 5- to 8-membered ring.
  • RB 21 and RB 22 are both C1 - C 4 alkyl, it is preferable that RB 23 and RB 24 and RB 25 and RB 26 are both C 1 -C 4 alkyl, and RB 21 and RB 22 are 5 to RB 22.
  • RB 23 and RB 24 and RB 25 and RB 26 which form an 8-membered ring, also preferably form a 5- to 8-membered ring.
  • the 5-8 membered ring is bound to RB 11 , RB 12 , RB 13 and RB 14 . It is preferably a 5- to 8-membered saturated ring containing no heteroatom other than each nitrogen atom and the phosphorus atom to which each nitrogen atom is bonded.
  • P2tBu 1-tert-butyl-2,2,4,4,4-pentakis (dimethylamino) -2 ⁇ 5,4 ⁇ 5 - catenadi (phosphazene)
  • P2Et tetramethyl (tris (tris) Dimethylamino) phosphoranilidene) phosphate triamide-ethylimine
  • HP1 (dma) imino-tris (dimethylamino) phosphorane
  • BTPP tert-butylimino-tri (pyrrolidino) phosphorane
  • P1tBu tert-butylimino-tris (dimethylamino) phosphorane
  • BEMP 2-tert-butylimino-2-diethylamino-1,3-dimethylperhydro-1,3,2-diazaphosphorin and the like can be mentioned.
  • the meaning of the terms “and / or” includes any combination of “and” and “or” as appropriate. Specifically, for example, “A, B, and / or C” includes the following seven variations; (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A and B, (v) A and C, (vi) B and C, (vii) A, B, and C.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide by a solid phase method, which comprises the following steps (1) to (3).
  • the first peptide is treated with one or more bases containing at least a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugated acid; and (3) the above.
  • the step (1) of the present invention is a step of providing a first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton supported on a resin for solid phase synthesis.
  • the "first peptide having a protective group containing an Fmoc skeleton carried on a solid-phase synthesis resin" in step (1) is usually passed through a functional group (for example, a carboxyl group) in the amino acid residue at the C-terminal thereof. Although it is supported on the solid-phase synthesis resin, it may be supported on the solid-phase synthesis resin through a functional group (for example, a carboxyl group) of an amino acid residue other than the C-terminal.
  • the "first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton carried on a solid-phase synthesis resin” has an amino group of an amino acid residue at the N-terminal protected by a protecting group containing an Fmoc skeleton.
  • any resin known in the art can be used, and generally, a predetermined amino acid residue of the first peptide (for example, C-terminal) can be used. It is linked to the amino acid residue) by an ester bond.
  • the resin is particularly a resin bond that is determined to be "H ( ⁇ 5% TFA in DCM)" as an acid sensitivity described in the Solid Phase Synthesis Handbook (issued by Merck Group, May 1, 2002). It is preferable to have a group, and it can be appropriately selected according to the functional group on the amino acid side to be used.
  • a carboxylic acid main chain carboxylic acid or a side chain carboxylic acid typified by Asp or Glu
  • a hydroxy group on the aromatic ring phenol group typified by Tyr
  • Trt resin trityl chloride resin
  • Clt resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • the resin is trityl chloride resin (Trt resin) or 2-chlorotrityl chloride resin (Clt resin).
  • the "protecting group containing an Fmoc skeleton” means a Fmoc group or a group in which an arbitrary substituent is introduced at an arbitrary position in the constituent skeleton of the Fmoc group.
  • Specific examples of the protecting group containing such an Fmoc skeleton include a protecting group represented by the following formula (1).
  • R 1 to R 8 are independently selected from the group consisting of hydrogen, C1-C 8 alkyl, C 1 - C 8 fluoroalkyl, halogen, sulfo, and trimethylsilyl.
  • R 9 to R 10 are independently hydrogen or methyl).
  • a protective group containing an Fmoc skeleton for example, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, a 2,7-di-tert-butyl-Fmoc (Fmoc (2,7tb)) group, 1 -Methyl-Fmoc (Fmoc (1Me)) group, 2-fluoro-Fmoc (Fmoc (2F)) group, 2,7-dibromo-Fmoc (Fmoc (2,7Br)) group, 2-monoisooctyl-Fmoc ( mio-Fmoc) group, 2,7-diisooctyl-Fmoc (dio-Fmoc) group, 2,7- (3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8) -Tridecafluorooctyl) -Fmoc (tdf-Fmoc) group, 2,
  • the type and number of amino acid residues constituting the first peptide are not limited, and two or more amino acid residues, for example, 2 to 30, 2 to 20, 2 to 15, 14; Peptides with arbitrary amino acid sequences, including 13, 12, 11, 10, 9, 8, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2 amino acid residues. Can be used as the first peptide. Natural amino acids and / or unnatural amino acids can be used as the amino acids.
  • the first peptide preferably contains one or more N-substituted amino acids.
  • the first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton carried on a solid-phase synthetic resin provided in step (1) can be obtained from a commercial supplier or a method known in the art. For example, it can be manufactured by applying a method as shown in WO2013 / 100132 or WO2018 / 225864.
  • the first peptide is a dipeptide.
  • the C-terminal amino acid residue of the dipeptide is usually supported on the resin for solid phase synthesis by an ester bond, and the protecting group of the N-terminal amino acid residue is removed as shown in the following scheme.
  • the resulting free amino group may react with the carbonyl group in the ester bond to produce the undesired DKP.
  • R 1 to R 4 mean an arbitrary atom or group, and * means a bond with a solid-phase synthesis resin.
  • the first peptide is a peptide in which the amino acid at the second residue from the N-terminal is an "N-substituted amino acid".
  • the free amino group resulting from the removal of the protective group of the N-terminal amino acid residue is between the amino acids at the 2nd and 3rd residues from the N-terminal. It may react with a carbonyl group in the peptide bond, and an undesired DKP, DKP desorbed product, or an impurity having an amidine skeleton (6-membered cyclic amidine skeleton structure) may be formed.
  • R 4 means any atom or group other than hydrogen
  • R 1 to R 3 and R 5 to R 8 mean any atom or group
  • * means an adjacent amino acid residue or solid phase. It means a bonding site with a synthetic resin.
  • R 6 when R 6 is hydrogen, it can go through any of the routes A and B of the above scheme, and R 6 is other than hydrogen. In some cases, only route A of the above scheme can be taken.
  • N-substituted amino acid in the present invention, N-alkylated N-alkyl amino acids such as N-methylation and cyclic amino acids such as prolines and azetidines are preferably exemplified.
  • the first peptide provided in the step (1) is used as an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and the like. And in a solvent containing at least one selected from the group consisting of phosphate ester solvents, in the step of treating with one or more bases containing at least a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugated acid. be.
  • the step (2) of the present invention is a step related to the removal of the protecting group of the amino acid residue at the N-terminal.
  • the formation of DKP desorbents and 6-membered cyclic amidine skeletal structures is via the 6-membered ring intermediate as described above.
  • the energy was calculated from the 6-membered ring intermediate to the desorption of DKP, the higher the hydrogen acceptability of the solvent, the greater the stabilization by coordination, and the donor, which is an index of the donation of unshared electron pairs of the solvent.
  • the number (DN) value is presumed to be an important parameter.
  • the solvent used in the step (2) preferably has a donor number (DN) value of 26 or less.
  • the DN values are 26 or less, 25 or less, 24 or less, 23 or less, or 22 or less, 21 or less, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less.
  • the DN value can be measured by the method described in "Journal of the American Chemical Society 1972, 94 (5), 1431-1434” and “Chemistry A European Journal 2012, 18 (35), 10969-10982". Further, the DN value of the mixed solvent can be measured by the method described in "Chemistry select 2021, 6 (4), 600-608". Specifically, the DN values are toluene: 0.1, DCM: 1, cumene: 6, methyl propionate: 11, sulfolane: 14.8, diethyl ketone: 15, butyl acetate: 15, propyl acetate: 16, diethyl.
  • step (2) at least a portion of the first peptide obtained by step (2) is in the form of carbamate.
  • dibenzofluben is produced in at least a part of the first peptide in the removal of the protecting group containing the Fmoc skeleton without the progress of decarbonization.
  • This forms a carbamate with a protonated base in the system (hereinafter, the formation of a carbamate when Fmoc is used as a protecting group containing an Fmoc skeleton and DBU is used as a base. It is a scheme showing).
  • carbamate is formed, the intramolecular nucleophilic reaction of the terminal amino group can be suppressed, and even under basic deprotection conditions, the formation of a 6-membered ring intermediate is suppressed, and DKP elimination. It is presumed that by-products of the body and 6-membered cyclic amidin skeletal structure are reduced.
  • the amount of the DKP desorbed substance and the formation of the 6-membered cyclic amidine skeletal structure can be significantly reduced.
  • the first peptide may be present as carbamate.
  • the molar ratio (carbamic acid salt / amine compound) between the carbamate salt and the amine substance produced by further decarbonation is 0.6 or more, 0.8 or more, 1.0 or more.
  • Carbamic acid is formed in an amount of 2.0 or more, 3.0 or more, 4.0 or more, 4.6 or more, 5.0 or more, 6.0 or more, 8.0 or more, or 10.0 or more. Can be. Such a molar ratio can be obtained, for example, from the proton integral ratio of 1 H-NMR.
  • the carbamate can be a salt of the conjugate acid in acetonitrile with any base having a pKa of 23 or greater.
  • Specific examples of such salts include, for example, DBU salt, TMG salt, HP1 (dma) salt, MTBD salt, P1-tBu salt, P2-Et salt and the like.
  • the solvent used in step (2) is at least one of an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphate ester solvent. It may contain a seed and may be a single solvent or a mixed solvent. In the case of a mixed solvent, the total amount of the aromatic hydrocarbon solvent, halogen solvent, ether solvent, ester solvent, ketone solvent, carbonate solvent, and phosphate ester solvent is 25 v / v% or more of the total solvent.
  • It preferably contains 50 v / v% or more, or 75 v / v% or more, and preferably contains an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphoric acid ester solvent. It is more preferable to contain at least one selected from the group consisting of 25 v / v% or more, 50 v / v% or more, or 75 v / v% or more.
  • an aromatic hydrocarbon solvent specifically, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene, etc. are used as the solvent. , And preferred are toluene and cumene.
  • halogen-based solvent examples thereof include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride and the like, and dichloromethane is preferable.
  • an ether solvent specifically, diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetraoxide, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane (1,2-dimethoxyethane) as the solvent.
  • DME diisopropyl ether
  • CPME cyclopentylmethyl ether
  • t-butylmethyl ether 4-methyltetrahydropyran, digrim, triglym, tetraglym and the like, preferably tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrogen, 1,2- Dimethoxyethane, 1,3-dioxolane.
  • the solvent is specifically methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, ⁇ -valerolactone. And the like, preferably butyl acetate and methyl propionate.
  • a ketone solvent When a ketone solvent is used in the step (2), specific examples thereof include acetone, methyl ethyl ketone (MEK), methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethylentanone (3-pentanone) and the like. Preferred are methyl ethyl ketone and diethyl ketone.
  • a carbonate-based solvent when used in the step (2), specific examples thereof include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate and the like, and dimethyl carbonate is preferable.
  • a phosphoric acid ester-based solvent when used in the step (2), specific examples thereof include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, tributyl phosphate and the like, and tributyl phosphate is preferable.
  • the mixed solvent is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, a carbonate solvent, and a phosphoric acid ester. It may consist of at least one selected from the solvent, or two or more solvents, and may consist of an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an ester solvent, a ketone solvent, and a carbonate.
  • one or more kinds of solvents selected from the amide system solvent, the urea system solvent, and the sulfone system solvent may be contained.
  • N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMA), N -Ethylpyrrolidone (NEP), N-butylpyrrolidone (NBP), formamide and the like can be mentioned.
  • a urea solvent specifically, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), 1,3-dimethyl-3,4,5,6- Examples thereof include tetrahydro-2 (1H) -pyrimidinone (DMPU).
  • DMI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • DMPU tetrahydro-2 (1H) -pyrimidinone
  • a sulfone-based solvent when used in the step (2), specific examples thereof include diphenyl sulfone, dimethyl sulfone, diethyl sulfone, sulfolane, 3-methyl sulfolane, ethyl methyl sulfone, ethyl isopropyl sulfone and the like.
  • the solvent used in the step (2) is a single solvent
  • the solvent may be toluene, cumene, 1,2-dichlorobenzene, benzene, anisole, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, tetrahydrofuran, 2-methyl.
  • the solvent used in step (2) has a solid phase resin swelling capacity of 1.5 mL / g or more, 2.0 mL / g or more, 2.5 mL / g or more, 3.0 mL / g or more, 3.5 mL / g or more. , Or 4.0 mL / g or more is preferable.
  • As an index of the swelling ability of the solid phase resin of each solvent "Tetrahedron Lett., 1998, 39, 8951-8954", “Org. Process Res Dev. 2018, 22, 494-503", “RSC Adv., 2020," 10, 42457-42492 "can be adopted.
  • the swelling ability (mL / g) of the solid phase resin is DMI: 8.5, DMPU: 8.0, NMP: 6.4, THF: 6.0, DMA: 5.8, CHCl 3 : 5.6, CPME: 5.6, CH 2 Cl 2 : 5.4, 2-Methyltetrahydrofuran: 5.4, DMF: 5.2, Butyl acetate: 5.2, DME: 4.8, MEK: 4 .4, toluene: 4.0, AcOEt: 4.2, xylene: 3.0, Et 2 O: 2.8, dimethyl carbonate: 2.8, MTBE: 2.4, CH 3 CN: 2.0, Tributyl phosphate: 1.6, MeOH: 1.6, H 2 O: 1.6.
  • the table described in “Green Chem., 2017, 19, 952-962" or the judgment of table 2 in “Green Chem., 2020, 22, 996-1018" can be adopted.
  • step (2) one or more bases containing at least a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile as a conjugate acid is used.
  • the base is a base having a pKa of 23 or more in acetonitrile as a conjugate acid.
  • a plurality of types of bases at least one of them has a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugate acid, and the other base has a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugate acid. It may be a base of or less than 23 bases.
  • the base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugate acid used in the step (2) may be a base having a pKa of 34 or less, preferably 30 or less, and more preferably 28 or less.
  • pKa is an index showing the degree of basicity, and the larger the pKa, the higher the basicity.
  • pKa CH 3 CN
  • Examples of the base having a pKa of 23 or more in acetonitrile of the conjugate acid include amidines, guanidines, phosphazenes and the like.
  • the pKa of the bases listed below is 23 or more.
  • a plurality of bases having a pKa of 23 or more in acetonitrile of a conjugate acid for example, a plurality of bases selected from the above-mentioned amidines, guanidines, or phosphazenes, for example, two bases.
  • a plurality of bases selected from the above-mentioned amidines, guanidines, or phosphazenes for example, two bases.
  • two bases can be used in combination.
  • DBU and MTBD, DBU and HP1 (dma), DBU and P1tBu, DBU and P2Et and the like are preferably exemplified.
  • the base having a pKa of 23 or more in acetonitrile is, for example, the above-mentioned amidines. , Guanidins, or phosphazenes.
  • the base having a pKa of less than 23 in acetonitrile of the conjugate acid is preferably selected from piperidine, piperazine and morpholine. As a specific combination of such bases, DBU and piperidine are preferably exemplified.
  • step (2) can also be repeated multiple times prior to step (3).
  • the same solvent and / or the same base may be used, or different solvents and / or different bases may be used in each step (2).
  • the same solvent means that the type of solvent and the mixing ratio of the solvent are the same, and different solvents mean that either or both of the type of solvent and the mixing ratio of the solvent are different.
  • the same base means that the type of base and the concentration of the base in the solvent are the same, and the different base means either the type of base or the concentration of the base in the solvent. Or both mean different.
  • the method of the invention may include a step of draining the solution between each step (2). Thereby, the solvent and / or base used in the previous step (2) can be replaced with the solvent and / or base used in the next step (2).
  • the method of the invention does not include treating the first peptide with a single base, eg piperidine, having a pKa of less than 23 in acetonitrile as a conjugate acid prior to step (2). ..
  • the first peptide provided in step (1) can be used, for example, in any solvent (eg, in DMF), a base having a pKa of less than 23 in acetonitrile of the conjugated acid as a single base (eg, in DMF).
  • Piperidine is used to treat the first peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton, followed by step (2) of the present invention (eg, a combination of DBU or DBU and piperidine in a solvent containing toluene). Aspects such as) can be excluded from the present invention.
  • the base used in step (2) can be contained in the solvent at any concentration at which the reaction of this step can proceed.
  • the range of such a concentration is, for example, 0.25 to 20 v / v%, 0.5 to 20 v / v% 1 to 20 v / v%, 1 to 15 v / v%, and 1 to 10 v / v.
  • % 1-9v / v%, 1-8v / v%, 1-7v / v%, 1-6v / v%, 1-5v / v%, 1-4v / v%, 1-3v / v% 1 to 2 v / v% and the like are mentioned, and 1 to 8 v / v% is preferable.
  • step (2) can further include contacting the solvent with CO 2 .
  • the solvent used in the step (2) can be a solvent to which CO 2 is contacted prior to the step. Contact between the solvent and CO 2 can be performed, for example, by bubbling the solvent with CO 2 .
  • the reaction system can contain CO 2 .
  • step (2) in at least a portion of the first peptide, the N-terminal amino group is combined with the COO - derived from the protecting group and the protonated base.
  • the amine compound in the reaction system can be more easily converted to the carbamate by including CO 2 in the reaction system.
  • the amine substance in the reaction can be further reduced, the intramolecular nucleophilic reaction of the terminal amino group can be further suppressed, and the basic deprotection conditions are satisfied. It is also presumed that the formation of the 6-membered ring intermediate is further suppressed and the by-products of the DKP desorbed body and the 6-membered cyclic amidine skeletal structure are further reduced.
  • the reaction of step (2) can be carried out at a temperature from ⁇ 100 ° C. to near the boiling point of the solvent, preferably 0 to 50 ° C.
  • the reaction of step (2) is 1 minute to 1 week, preferably 1 minute to 3 hours, 3 minutes to 3 hours, 5 minutes to 3 hours, and more preferably 1 minute to 20 minutes, 3 minutes to.
  • the reaction time can be 20 minutes, 5 minutes to 20 minutes.
  • step (3) of the present invention after step (2), the first peptide and a carboxylic acid or a carboxylic acid analog are condensed in a solvent in the presence or absence of a condensing agent, and the first step is performed. This is the step of obtaining the third peptide. In this step, the N-terminal amino group of the first peptide and the carboxyl group of the carboxylic acid are condensed to synthesize the third peptide.
  • the carboxylic acid used in step (3) is an amino acid with a protecting group, a second peptide with a protecting group, a C1 - C - 8 alkylcarboxylic acid, or a C6 - C10 arylcarboxylic acid. be able to.
  • the carboxylic acid analog used in step (3) can be an active ester of carboxylic acid or an acid halide of carboxylic acid.
  • the condensation reaction of 3) can be carried out.
  • a carbonyl group in these compounds, particularly in the case of a second peptide, a carbonyl group contained in the amino acid residue at the C-terminal thereof is a group capable of promoting a reaction with an amine, for example.
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group which may have a substituent, an aryl group which may have a substituent or an aralkyl group which may have a substituent, and a substituent. Indicates a cycloalkyl group which may have a group, a heteroaryl group which may have a substituent, an alkenyl group which may have a substituent, and an alkylene group which may have a substituent. .) Etc. are combined.
  • the condensation reaction of (3) can be carried out.
  • the carboxyl group in these compounds particularly in the case of the second peptide, the carboxyl group contained in the amino acid residue at the C terminal thereof is a chlorocarbonyl group, a fluorocarbonyl group, or a bromocarbonyl. Examples thereof include those converted into a group, an iodocarbonyl group, or the like.
  • the protecting group is a carbamate-based protecting group, a sulfonyl-based protecting group, or an acyl-based protecting group.
  • the protecting group is a carbamate-based protecting group, a sulfonyl-based protecting group, or an acyl-based protecting group.
  • the carbamate-based protecting group means a protecting group constituting a carbamate structure, for example, a protecting group having an Fmoc skeleton, Alloc, Teoc, Boc, Cbz, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group. (Troc) and the like are included in this.
  • the sulfonyl-based protecting group means a protecting group containing a sulfonyl structure, for example, a methanesulfonyl (Ms) group, a p-toluenesulfonyl (Ts) group, a 2-nitrobenzenesulfonyl (Ns) group, and a trifluoromethanesulfonyl (Tf).
  • Ms methanesulfonyl
  • Ts p-toluenesulfonyl
  • Ns 2-nitrobenzenesulfonyl
  • Tf trifluoromethanesulfonyl
  • the acyl-based protecting group means a protecting group containing an acyl structure, and includes, for example, an acetyl group, a pivaloyl group, a benzoyl group, a trifluoroacetyl (Tfa) group and the like.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step (3) is an amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton
  • the amino acid having a protecting group containing the Fmoc skeleton includes protection containing an Fmoc skeleton. Any natural or unnatural amino acid protected by the group can be used.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step (3) is a second peptide having a protective group containing an Fmoc skeleton
  • the second peptide having a protective group containing the Fmoc skeleton will be:
  • the type and number of amino acid residues constituting the peptide are not limited, and include two or more natural and / or unnatural amino acid residues.
  • Peptides having any amino acid sequence can be utilized.
  • the second peptide preferably contains one or more N-substituted amino acids.
  • the carboxylic acid or carboxylic acid analog used in step ( 3 ) is a C1 - C8 alkylcarboxylic acid, a C6 - C10 arylcarboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof.
  • These are independently selected from the group consisting of alkenyl, alkynyl, alkoxy, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, halogen, nitro, dialkylamino, cyano, alkoxycarbonyl, and dialkylaminocarbonyl. It may be substituted with one or more substituents.
  • the C1-C - 8 alkylcarboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof is preferably C1 - C4 alkylcarboxylic acid, or an active ester or acid halide thereof, and specifically, for example, acetic acid.
  • Examples thereof include propanoic acid, butanoic acid, or pentanoic acid, or an active ester thereof or an acid halide.
  • Specific examples of the C 6 -C 10 arylcarboxylic acid or an active ester or acid halide thereof include benzoic acid or naphthoic acid, or an active ester or acid halide thereof.
  • step (3) an amino acid having a protecting group containing 1 equivalent to 20 equivalents, preferably 2 equivalents to 10 equivalents of the Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton is added to the first peptide.
  • an amino acid having a protecting group containing 1 equivalent to 20 equivalents, preferably 2 equivalents to 10 equivalents of the Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton is added to the first peptide.
  • an amino acid having a protecting group containing 1 equivalent to 20 equivalents preferably 2 equivalents to 10 equivalents of the Fmoc skeleton or a second peptide having a protecting group containing an Fmoc skeleton.
  • the first peptide and / or the second peptide having a protecting group comprising an Fmoc skeleton preferably comprises at least one N-substituted amino acid.
  • the amino acid having a protecting group containing an Fmoc skeleton is preferably an N-substituted amino acid.
  • the protecting group containing the Fmoc skeleton of the amino acid or second peptide used in step (3) is identical to the protecting group containing the Fmoc skeleton of the first peptide used in step (1). However, they may be different.
  • the solvent used in step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and a ketone. It may contain at least one of a system solvent, a carbonate system solvent, and a phosphate ester system solvent, and may be a single solvent or a mixed solvent.
  • the solvent used in the step (3) is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, an ester solvent, and the like.
  • a ketone solvent a carbonate solvent, and a phosphate ester solvent at 25 v / v% or more, 50 v / v% or more, or 75 v / v% or more.
  • an aromatic hydrocarbon solvent specifically, benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, 1,2-dichlorobenzene, bromobenzene, anisole, ethylbenzene, nitrobenzene, cumene, etc. are used as the solvent. Benzene and cumene are preferable.
  • halogen-based solvent examples thereof include dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, carbon tetrachloride and the like, and dichloromethane is preferable.
  • an ether solvent specifically, diethyl ether, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,4-dioxane, 1,3-dioxolane, 1,2-dimethoxyethane, etc.
  • examples thereof include diisopropyl ether, cyclopentylmethyl ether, t-butyl methyl ether, 4-methyltetrahydropyran, diglym, triglym, tetraglym and the like, preferably tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, 1,3. -Dioxorane.
  • N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), N, N-dimethylacetamide (DMA), N -Ethylpyrrolidone (NEP), N-butylpyrrolidone (NBP), formamide and the like can be mentioned, with preference given to DMF and NMP.
  • a sulfoxide-based solvent when used in the step (3), specific examples thereof include dimethyl sulfoxide (DMSO) and methylphenyl sulfoxide, and DMSO is preferable.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • a sulfone-based solvent when used in the step (3), specific examples thereof include diphenyl sulfone, dimethyl sulfone, diethyl sulfone, sulfolane, 3-methyl sulfolane, ethyl methyl sulfone, ethyl isopropyl sulfone and the like.
  • a urea solvent specifically 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), 1,3-dimethyl-3,4,5,6- Examples thereof include tetrahydro-2 (1H) -pyrimidinone (DMPU), and DMI is preferable.
  • DMI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • DMPU tetrahydro-2 (1H) -pyrimidinone
  • DMI is preferable.
  • the solvent is specifically methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, propyl acetate, isopropyl acetate, isobutyl acetate, pentyl acetate, ⁇ -valerolactone. And the like, preferably ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate.
  • a ketone solvent when used in the step (3), specific examples thereof include acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone, cyclohexanone, cyclopentanone, diethyl ketone and the like, preferably methyl ethyl ketone and diethyl ketone. be.
  • a carbonate-based solvent when used in the step (3), specific examples thereof include dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dibutyl carbonate and the like, and dimethyl carbonate is preferable.
  • a phosphoric acid ester-based solvent when used in the step (3), specific examples thereof include trimethyl phosphate, triethyl phosphate, tributyl phosphate and the like, and tributyl phosphate is preferable.
  • the mixed solvent is an aromatic hydrocarbon solvent, a halogen solvent, an ether solvent, an amide solvent, a sulfoxide solvent, a sulfone solvent, a urea solvent, and an ester.
  • System solvent It may consist of two or more solvents selected from a ketone system solvent, a carbonate system solvent, or a phosphate ester system solvent, and may contain any solvent other than these.
  • the solvent used in the step (3) is a single solvent
  • the solvent may be toluene, cumene, 1,2-dichlorobenzene, benzene, anisole, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, tetrahydrofuran, 2-methyl.
  • the solvent used in step (3) can be the same as the solvent used in step (2).
  • a solvent in which the condensing agent can be dissolved is preferably used.
  • the base used in the step (2) may remain, but due to this residual base, a by-product in which an amino acid or a peptide is excessively extended may be generated.
  • a solvent in which the condensing agent can be dissolved is used in the step (3), the formation of such an excessively elongated body can be suppressed.
  • the condensing agent used in step (3) is in the form of a salt, the counter anion thereof being PF 6 - or BF 4- .
  • a condensing agent include PyOxim ([ethylcyano (hydroxyimino) acetate-O 2 ] tri-1-pyrrolidinyl phosphonium hexafluorophosphate) and PyAOP ((7-azabenzotriazole-1).
  • the condensing agent used in the step (3) includes at least one selected from the group consisting of PyOxim, PyAOP, PyBOP, COMU, HATU, HBTU, HCTU, TDBTU, HOTU, TATU, TBTU, TCTU, and TOTU. Is preferable, and it is more preferable to use any one of these.
  • step (3) 1 equivalent to 20 equivalents, preferably 2 equivalents to 10 equivalents of a condensing agent can be used with respect to the first peptide.
  • the condensation reaction of step (3) can be carried out in the presence of a base.
  • the type of base is not limited as long as it contributes to the progress of the condensation reaction, but a base having a pKa of 5 to 12 in water of the conjugated acid is preferable, and specific examples of such a base include DIPEA. Examples thereof include triethylamine, 2,6-lutidine, 2,4,6-trimethylpyridine and pyridine.
  • 1 equivalent to 20 equivalents, preferably 2 equivalents to 10 equivalents of base can be used with respect to the first peptide.
  • the value calculated by Advanced Chemistry Development (ACD / Labs) Software V11.02 ((c) 1994-2020 ACD / Labs) can be used. ..
  • the present invention does not include a step of adding an acid to neutralize the remaining base between steps (2) and step (3).
  • the residual base used in the deprotection step prior to the extension step is not desirable. Therefore, the residual base is acidified between the deprotection step and the extension step. May be neutralized with.
  • the neutralization step does not contribute to the efficient progress of the reaction.
  • the present invention may further include a step of cleaning the solid phase synthesis resin between the steps (2) and (3).
  • Any solvent can be used for cleaning the resin, and for example, it is preferable to use the solvent used in the step (2).
  • the resin can be washed multiple times with the same solvent or different solvents.
  • a solvent contacted with CO 2 may be used prior to the step, and CO 2 may be used.
  • a solvent that is not in contact with the solvent may be used, or a solvent that is in contact with CO 2 and a solvent that is not in contact with the CO 2 may be used in combination.
  • the reaction of step (3) can be carried out at a temperature from ⁇ 100 ° C. to near the boiling point of the solvent, preferably 0 to 60 ° C.
  • the reaction in step (3) can be carried out in a reaction time of 1 minute to 1 week, preferably 30 minutes to 20 hours.
  • the peptide produced by the method of the present invention comprises a third peptide produced through the steps (1) to (3).
  • the peptide produced by the method of the present invention may further contain any amino acid in any number in addition to the third peptide.
  • the peptide produced by the method of the present invention can also be a third peptide produced through the steps (1) to (3).
  • the peptide produced by the method of the invention can contain at least one, or two or more, three or more, four or more or five or more N-substituted amino acids.
  • the N-substituted amino acid can be an N-alkyl amino acid, preferably an N-methyl amino acid.
  • the method of the present invention may include a step of cutting out the peptide from the resin for solid phase synthesis after the step of extending the peptide chain.
  • a method known in the present art or a method described in the present embodiment can be used.
  • the present invention determines the amount of diketopiperazine impurities and / or 6-membered cyclic amidine skeletal structure impurities produced in the production of peptides by the solid phase method, which comprises the steps (1) and (2). It also concerns how to reduce it.
  • Example 1 Preparation of amino acids used in this example, peptides supported on a resin, and the like.
  • Example 1-1 Fmoc-amino acid used for peptide synthesis by a peptide synthesizer In the peptide synthesis described in the present specification, the Fmoc-amino acid shown in Tables 2 to 4 was used for the synthesis by the peptide synthesizer.
  • the Fmoc-amino acids listed in Table 2 were synthesized according to the methods described in WO2018 / 225864 and WO2021 / 090856.
  • the Fmoc-amino acids listed in Table 3 were purchased from commercial suppliers.
  • the Fmoc-amino acids shown in Table 4 were synthesized according to the scheme shown below.
  • Triethylsilane (10.59 mL, 66.)
  • DCE 1,2-dichloroethane
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the obtained crude product was suspended in DCM (50 mL), a 3 mol / L sodium dihydrogen phosphate aqueous solution (45 mL, containing 1.5 mol / L salt) was added, and the mixture was stirred to remove the aqueous layer.
  • the organic layer was washed twice with a 3 mol / L aqueous sodium dihydrogen phosphate solution (45 mL, containing 1.5 mol / L salt).
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • the obtained residue was purified by reverse phase column chromatography (water / acetonitrile) to purify the compounds aa3-1, (2S) -2-.
  • 2,5-dioxopyrrolidine-1-yl (2- (trimethylsilyl) ethyl) carbonate (2.45 g, 9.43 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • 2-Methyltetrahydrofuran (5 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was washed twice with a 10% aqueous sodium carbonate solution (10 mL).
  • the obtained organic layer was washed with saturated aqueous potassium hydrogen sulfate solution (10 mL), washed with 10% aqueous sodium chloride solution, dried over anhydrous magnesium sulfate, and then filtered.
  • the aqueous layer was further washed with dichloromethane (5 mL, 5 v / w), the obtained organic layer was washed with semi-saturated saline (15 mL, 15 v / w), dried over anhydrous sodium sulfate, and filtered to prepare a solution. Concentrated under reduced pressure.
  • the obtained crude product was purified by reverse phase column chromatography (0.1% -acetalis containing formic acid / 0.1% -distilled water containing formic acid), and the collected fractions were subjected to reverse phase column chromatography (additive-free-).
  • a 5N sodium hydroxide aqueous solution (26 mL) was added to a THF / methanol solution (1/1, 52 mL) of the obtained crude product aa3-4-b (3.63 g) while cooling in an ice bath, and the mixture was added at 0 ° C. for 5 minutes. After stirring, the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the obtained residue was dissolved in 4N hydrochloric acid (30 mL), and the solvent was distilled off. The mixture was extracted twice with ethyl acetate, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solution was concentrated under reduced pressure.
  • Example 1-2 Preparation of amino acids, peptides and the like carried on the resin used in this example.
  • the polymer or resin moiety when a compound is bonded to a polymer or resin, the polymer or resin moiety may be indicated by ⁇ .
  • the reaction point of the resin site it may be connected to ⁇ to indicate the chemical structure of the reaction site.
  • the 2-chlorotrityl group of the resin is an ester with the side chain carboxylic acid of Asp. It is connected via a bond.
  • pyrro means pyrrolidine, and in the above structure, the C-terminal carboxylic acid group forms an amide bond with pyrrolidine.
  • the carrier reaction of Fmoc amino acid to the resin was carried out according to the method described in WO2013 / 100132 or WO2018 / 225864.
  • 2-Chlorotrityl chloride resin (1.60 mmol / g, 100-200 mesh, 1% DVB, 48.7 g) and dehydrated dichloromethane (500 mL) were placed in a reaction vessel with a filter and shaken at room temperature for 20 minutes. After removing dichloromethane by applying nitrogen pressure, dehydrated methanol (12.63 mL) and diisopropylethylamine (DIPEA) (32.6 mL) were added to compound 1-2-1-b (15.91 g) and dehydrated dichloromethane (350 mL).
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the added mixture was added to the reaction vessel and shaken for 60 minutes. After removing the reaction solution by applying nitrogen pressure, a mixed solution of dehydrated methanol (97.3 mL) and diisopropylethylamine (DIPEA) (32.6 mL) added to dehydrated dichloromethane (350 mL) was added to the reaction vessel for 1 hour. Shake for 30 minutes. After applying nitrogen pressure to remove the reaction solution, dichloromethane (350 mL) was added and shaken for 5 minutes, and then nitrogen pressure was applied to remove the reaction solution.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • the obtained compound 1-2-1 (12.6 mg) was placed in a reaction vessel, DMF (2 mL) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour. Then, DBU (40 ⁇ L) was added and shaken at 30 ° C. for 30 minutes. Then, DMF (8 mL) was added to the reaction mixture, and 1 mL of the solution was diluted with DMF (11.5 mL). The absorbance (294 nm) of the obtained diluted solution was measured (measured using Shimadzu, UV-1600PC (cell length 1.0 cm)), and the loading amount of compound 1-2-1 was calculated to be 0.464 mmol / g. .. In addition, another lot synthesized in the same manner and having a different loading amount was also used for peptide synthesis and examination.
  • Example 1-2-2 (S) -3-((((9H-fluorene-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -4-oxo-4- (piperidine-1-yl) butanoic acid-2 -Synthesis of chlorotrityl resin (Fmoc-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip, compound 1-2-2) (S) -3-((((9H-Fluorene-9-yl) methoxy) carbonyl) amino) -4-oxo-4- (piperidine-1-yl) butanoic acid-2-chlorotrityl resin (Compound 1-) 2-2, Fmoc-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip) was synthesized by the method described in the literature (Reference: International Publication No. WO 2013/100132 A1). Note that pip means piperidine, and in the
  • Examples 1-2-3 (3R) -3- (9H-fluorene-9-ylmethoxycarbonylamino) butanoic acid-2-chlorotrityl resin (Fmoc-D-3-Abu-O-Trt (2-Cl) ) -Resin, synthesis of compound 1-2-3) (3R) -3- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) butanoic acid (Fmoc-D-3-Abu-OH) (7.1 g, 21.82 mmol) and 2- Using chlorotrityl chloride resin (1.6 mmol / g, 100-200 meth, 1% DVB, 27.25 g, 43.6 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 1-2-1, compound 1-2-2.
  • chlorotrityl chloride resin 1.6 mmol / g, 100-200 meth, 1% DVB, 27.25 g, 43.6 mmol
  • Examples 1-2-4 (2S) -2- [9H-fluorene-9-ylmethoxycarbonyl (methyl) amino] propanoic acid-2-chlorotrityl resin (Fmoc-MeAla-O-Trt (2-Cl)) -Resin, synthesis of compound 1-2-4) (2S) -2- [9H-fluorene-9-ylmethoxycarbonyl (methyl) amino] propanoic acid (Fmoc-MeAla-OH) (1.0 g, 3.07 mmol) and 2-chloro purchased from a commercial supplier.
  • Example 1-2-5 Preparation of a solid-phase-supported peptide compound (Compound 1-2-5 to Compound 1-2-12) used in this Example Compound 1 used in this example. Preparation of compound 1-2-12 from -2-5 was carried out by the Fmoc method using a peptide synthesizer (Multipep RS; manufactured by Intavis). For the detailed operation procedure, follow the manual attached to the synthesizer.
  • Solution 1 was prepared by dissolving Fmoc-protected amino acid (0.6 mol / L) constituting the target peptide and HOAt or Oxyma or HOOBt (0.375 mol / L) as an activator of the carboxylic acid in NMP.
  • Fmoc-protected amino acid or HOOBt was poorly dissolved, DMSO was added so as to have a concentration of 20% to prepare Solution 1.
  • N, N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) (10 v / v%) and N, N-dimethylformamide (DMF) were mixed to prepare Solution 2.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-Undecene
  • the Fmoc amino acid condensation reaction following the Fmoc group deprotection reaction was set as one cycle, and the peptide was extended on the resin surface by repeating this cycle. After the extension of the last amino acid, the de-Fmoc step was not performed, and the cells were further washed 4 times with DCM (1.0 mL per column), dried, and then used for the subsequent studies.
  • DCM 1.0 mL per column
  • the following peptide compounds (Compound 1-2-5 to Compound 1-2-12) supported on a solid phase were prepared. As described above, 100 mg of compound 1-2-1 to compound 1-2-3 was prepared per column, but a plurality of columns per sequence were arranged in the same manner.
  • Fmoc-Thr (tBu) -MeAla-Cys (StBu) -Phe-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (SEQ ID NO: 3) (Compound 1-2-7) It was prepared from Fmoc-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (Compound 1-2-2, 0.452 mmol / g).
  • Fmoc-Nle-MeAla (3-Pyr) -Ser (iPen) -Asp- (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (SEQ ID NO: 4)
  • Fmoc-Asp O-Trt (2-Cl) -resin
  • Fmoc-Nle-MePhe (3-Cl) -Ser (iPen) -Asp- (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (SEQ ID NO: 5) (Compound 1-2-9) It was prepared from Fmoc-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (Compound 1-2-2, 0.452 mmol / g).
  • Fmoc-Ser (nPr) -MeAla-Phe-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (SEQ ID NO: 6) (Compound 1-2-10) It was prepared from Fmoc-Asp (O-Trt (2-Cl) -resin) -pip (Compound 1-2-2, 0.452 mmol / g).
  • Fmoc-Aib-Pro-D-3-Abu-O-Trt (2-Cl) -resin (Compound 1-2-11) It was prepared from Fmoc-D-3-Abu-O-Trt (2-Cl) -resin (Compound 1-2-3, 0.519 mmol / g).
  • Fmoc-cLeu-MeVal-D-3-Abu-O-Trt (2-Cl) -resin (Compound 1-2-12) It was prepared from Fmoc-D-3-Abu-O-Trt (2-Cl) -resin (Compound 1-2-3, 0.519 mmol / g).
  • Fmoc-Ala-MeAla-O-Trt (2-Cl) -resin (Compound 1-2-13)
  • 1 g of Fmoc-MeAla-O-Trt (2-Cl) -resin (2-Cl) -resin ( Compound 1-2-4 (0.514 mmol / g) was added to carry out a solid phase reaction, and the resin was washed with DMF (7 mL) four times during the de-Fmoc step.
  • Fmoc-Ala-MeAla-O-Trt (2-Cl) -resin, 0.408 mmol / g) was prepared.
  • Example 2 In the solid-phase synthesis of the peptide, the de-Fmoc step, the resin washing step, and the extension step were confirmed. In the solid-phase synthesis of the experimental peptide, the effects of the reagent and the solvent were confirmed. Elongate amino acids.
  • compound 1-2-5 is used as the peptide sequence carried on a solid phase, the reagents and solvents in each step are changed, and impurities (diketopiperazine desorbed product, 6-membered cyclic amidine) produced by peptide synthesis are used. The degree of reduction of skeletal structures and excess stretches) was compared and the range of appropriate conditions was identified.
  • the de-Fmoc solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 5 in the de-Fmoc solvent at the volume percent concentration (v / v%) shown in Table 5. After draining the solution from the frit, the resin was washed 6 times with a wash solvent (0.7 mL per column).
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • Target Peptide Compound (TM), H-MeLeu-Ile-MeAla-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pyrro (SEQ ID NO: 15) (Compound 2-1 *) LCMS (ESI) m / z 833.79 (M + H) + Retention time: 2.64 minutes (analytical condition SQDAA05long)
  • the de-Fmoc solution was prepared by dissolving the bases listed in Table 5 in the de-Fmoc solvent at the volume percent concentration (v / v%) shown in Table 5. After draining the solution from the frit, the resin was washed 6 times with a wash solvent (0.7 mL per column).
  • diketopiperazine desorbed is a generally widely known synthetic defect in peptide synthesis.
  • the production of a 6-membered cyclic amidine skeletal structure is an unprecedented new challenge in peptide synthesis found by the inventors of the present application.
  • the formation of diketopiperazine desorbates is such that the N-terminal amino group forms a 6-membered ring with respect to the carbonyl group forming the second amide bond from the N-terminal. After a nucleophilic attack, the amino group forming the original amide bond is eliminated to proceed.
  • the formation of the 6-membered cyclic amidine skeletal structure proceeds by similarly forming a 6-membered ring and then desorbing the hydroxy group derived from the carbonyl group generated by the nucleophilic attack. That is, it is common that the formation of the diketopiperazine desorbed body and the 6-membered cyclic amidine skeletal structure is a problem in peptide synthesis caused by the formation of the 6-membered ring.
  • Run1 is a de-Fmoc step, a resin washing step, and an extension step widely carried out in general peptide synthesis (comparative experiment).
  • Piperidine pKa 19.35 (in acetonitrile), reference Eur. J. Org. Chem. 2019, 6735-6748
  • DKP 2-residue-deficient diketopiperazine
  • the base of the de-Fmoc step was fixed as DBU, and the solvent of the de-Fmoc step, the resin cleaning step, and the extension step was examined.
  • the solvents used are from DMF to halogen-based solvent (DCM), aromatic hydrocarbon-based solvent (toluene, cumene), and ether-based solvent (THF, DME, 1, 3-Dioxolan, 2-methyltetrachloride), phosphate ester solvent (tributyl phosphate), ester solvent (methyl propionate, butyl acetate), ketone solvent (diethyl ketone, methyl ethyl ketone), carbonate solvent (dimethyl carbonate) It was confirmed that the formation of the diketopiperazine desorbed body and the 6-membered cyclic amidin skeletal structure can be suppressed by changing to.
  • DN donor number
  • two or more kinds of bases may coexist at one time in the Fmoc removal step.
  • DBU optimum base
  • the coexistence of the widely known piperidine can also suppress the production of diketopiperazine desorbents and 6-membered cyclic amidine skeletal structures.
  • an acid chloride may be used in the stretching step.
  • an acid chloride prepared separately is acted on in NMP in the presence of 2,4,6-trimethylpyridine after undergoing a resin washing step using a solvent at the time of de-Fmoc found by the inventors of the present application, such as run55. It was confirmed that the formation of the diketopiperazine desorbed body and the 6-membered cyclic amidine skeletal structure can be suppressed even in the case of the above.
  • Example 2 As described above, from the results of Example 2, the outline of the range of each step (de-Fmoc step, resin washing step, extension step) capable of suppressing the formation of the diketopiperazine desorbed body and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure is specified. rice field.
  • the combination of reaction conditions shown in Example 2 is not limited to the suppression of the production of the diketopiperazine desorbed product and the 6-membered cyclic amidine skeletal structure.
  • Example 3 In the experimental literature of peptide synthesis in which the base neutralization step is added in the de-Fmoc step in the solid-phase synthesis of the peptide, the base used for the de-Fmoc reaction in the de-Fmoc step or the subsequent resin washing step is described. There are examples of neutralization.
  • peptide synthesis in the solid phase there is known an example in which a rapid de-Fmoc reaction is carried out with DBU / DMF for the purpose of suppressing diketopiperazine desorption, and then neutralization is carried out by adding HOBt. (Org. Lett., 2008, 10, 3857-3860.).
  • the de-Fmoc solution was prepared by dissolving the base shown in Table 6 in the de-Fmoc solvent at the volume percent concentration (v / v%) shown in Table 6. Subsequently, as a neutralization step, 0.4 mL of a DMF solution of HOAt (0.25 mol / L or 0.5 mol / L) (approximately 2 equivalents or 4 equivalents with respect to the peptide carried on the solid phase) was added. Then, it was allowed to stand for another 5 minutes. As a comparison experiment, after performing the de-Fmoc step for 10 minutes without performing the neutralization step, DMF (0.4 mL) was added, and an experiment in which the mixture was allowed to stand for another 5 minutes was also carried out side by side. After draining the solution from the frit, the resin was washed 6 times with the washing solvent shown in Table 6 (0.7 mL per column).
  • Example 4 Peptide sequence generality confirmation experiment of diketopiperazine desorption reducing effect during peptide synthesis under the found conditions
  • various peptide sequences prepared in Example 1-2-5 (Table 7).
  • the peptide sequence extended to Core2, compound 1-2-6 to compound 1-2-12), is described in Core1 by a general conventional method (condition-1) and the method of the present invention (condition-2).
  • Amino acids were extended and the amount of diketopiperazine desorbed product produced was compared.
  • Condition-1 100 mg of the solid phase resin (Compound 1-2-6 to Compound 1-2-12 (corresponding to run1 to 7 in Table 7, respectively)) carrying the peptide already prepared in Example 1-2-5 was solidified.
  • the resin was swollen by placing it in a phase reaction vessel, adding DCM (1.0 mL), and allowing it to stand for 10 minutes. The solution was then drained from the frit, followed by washing the resin twice with DMF (0.7 mL per column). A DMF solution of piperidine (20 v / v%, 0.7 mL per column) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to deprotect the Fmoc group. After draining the solution from the frit, the resin was washed 8 times with DMF (0.7 mL per column).
  • Condition-2 100 mg of the solid phase resin (Compound 1-2-6 to Compound 1-2-12 (corresponding to run1 to 7 in Table 7, respectively)) carrying the peptide already prepared in Example 1-2-5 was solidified.
  • the resin was swollen by placing it in a phase reaction vessel, adding DCM (1.0 mL), and allowing it to stand for 10 minutes. The solution was then drained from the frit, followed by washing the resin twice with toluene (0.7 mL per column).
  • Table 7 shows the amount of diketopiperazine (DKP) desorbed product produced under each sequence and each condition.
  • the amount of diketopiperazine (DKP) desorbed product shown in Table 7 was 100% when the UV area percentages of the target peptide (TM) and diketopiperazine (DKP) desorbed product in LCMS were combined. , UV area percent of diketopiperazine (DKP) desorbed.
  • Target Peptide Compound (TM), Fmoc-MeLeu-Ile-MeGly-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pip (SEQ ID NO: 18) (run1) (Compound 4-1-1 *) LCMS (ESI) m / z 1056.10 (M + H) + Retention time: 3.11 minutes (analysis condition SQDFA05long)
  • Target Peptide Compound (TM), Fmoc-Nle-Nle-MePhe (3-Cl) -Ser (iPen) -Asp-pip (SEQ ID NO: 23) (run4) (Compound 4-1-4 *) LCMS (ESI) m / z 1001.86 (M + H) + Retention time: 3.55 minutes (analysis condition SQDFA05long)
  • Example 5 Experiment to confirm the generality of the substrate of a carboxylic acid that extends the effect of reducing diketopiperazine desorption during peptide synthesis under the found conditions.
  • the peptide sequence (compound) prepared in Example 1-2-5 With respect to 1-2-5), various carboxylic acids described in Core 1 were extended by the method of the present invention (Condition-3), and the amounts of diketopiperazine desorbed and 6-membered cyclic amidine skeletal structure were confirmed. bottom.
  • Table 8 shows the amounts of diketopiperazine desorbed (TM-DKP) and 6-membered cyclic amidine skeletal structures produced in each sequence.
  • the amounts of diketopiperazine desorbed (TM-DKP) and 6-membered cyclic amidine skeletal structure shown in Table 8 were the target peptide (TM), diketopiperazine desorbed (TM-DKP), and 6-membered.
  • TM target peptide
  • TM-DKP diketopiperazine desorbed
  • 6-membered It is the UV area percentage of the diketopiperazine desorbed product (TM-DKP) and the 6-membered cyclic amidine skeleton structure when the UV area percentage of the cyclic amidine skeleton structure in LCMS is 100% in total.
  • Target Peptide Compound (TM), Teoc-Phe (4-CF3) -Ile-MeAla-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pyrro (SEQ ID NO: 34) (run1) (Compound 5-1-1 *) LCMS (ESI) m / z 1065.7 (M + H) + Retention time: 2.90 minutes (analytical condition SQDFA05long)
  • Target Peptide Compound (TM), Boc-MeAla-Ile-MeAla-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pyrro (SEQ ID NO: 36) (run2) (Compound 5-1-2 *) LCMS (ESI) m / z 891.7 (M + H) + Retention time: 3.07 minutes (analysis condition SQDAA05long)
  • Target Peptide Compound (TM), Alloc-Phe-Ile-MeAla-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pyrro (SEQ ID NO: 38) (run3) (Compound 5-1-3 *) LCMS (ESI) m / z 937.6 (M + H) + Retention time: 3.02 minutes (analysis condition SQDAA05long)
  • the notation of Ac means an acetyl group obtained by extending acetic acid.
  • LCMS (ESI) m / z 748.6 (M + H) + Retention time: 1.53 minutes (analysis condition SQDFA05long)
  • Target Peptide Compound (TM), Ns-Aib-Ile-MeAla-Aze (2) -MeCha-MeGly-Asp-pyrro (SEQ ID NO: 44) (run6) (Compound 5-1-6 *) LCMS (ESI) m / z 976.6 (M + H) + Retention time: 2.08 minutes (analysis condition SQDFA05long)
  • Example 6 Confirmation of the effect of the dipeptide carried on the solid phase by the ester bond on the formation of diketopiperazine under the found conditions
  • the problem of desorption of diketopiperazine is that it is carried on the solid phase. This is the case where diketopiperazine is formed by breaking the ester bond of the dipeptide.
  • the general conventional method (Condition-4) and the method of the present invention (Condition-) are applied to the dipeptide carried on the solid phase prepared in Example 1-2-4 via an ester bond.
  • Fmoc-MeLeu-OH was extended, and a confirmation experiment was conducted to see how the method of the present invention had an effect on the formation of diketopiperazine.
  • Condition-4 (conventional method) (run1) 100 mg of the solid phase resin (Compound 1-2-13) carrying the dipeptide already prepared in Example 1-2-5 is placed in a solid phase reaction vessel, DCM (1.0 mL) is added, and the mixture is allowed to stand for 10 minutes. By doing so, the resin was swollen. The solution was then drained from the frit, followed by washing the resin twice with DMF (0.7 mL per column). A DMF solution of piperidine (20 v / v%, 0.7 mL per column) was added and reacted at room temperature for 10 minutes to deprotect the Fmoc group. After draining the solution from the frit, the resin was washed 6 times with DMF (0.7 mL per column).
  • Condition-5 (method of the present invention) (run2 and run3) 100 mg of the solid phase resin (Compound 1-2-13) carrying the peptide already prepared in Example 1-2-5 was placed in a solid phase reaction vessel, and DCM (1) was placed in a nitrogen-substituted glove box. The resin was swollen by adding (0.0 mL) and allowing it to stand for 10 minutes. The solution was then drained from the frit, followed by washing the resin twice with toluene (0.7 mL per column).
  • the obtained resin (run1, 10.64 mg) was placed in a reaction vessel, DMF (4.0 mL) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 30 minutes. Then, DBU (40 ⁇ L) was added and shaken at 30 ° C. for 15 minutes. Then, DMF was added so that the reaction mixture became 10.0 mL, and 80 ⁇ L of the solution was diluted with DMF (920 ⁇ L).
  • the obtained diluted solution was analyzed by LCMS (injection volume: 5 ⁇ L), and the supported amount of the obtained resin was 0.021 mmol / g from the UVarea value of dibenzofulvene (294 nm: 88.61, 304 nm: 72.01).
  • the obtained diluted solution was analyzed by LCMS (injection volume: 5 ⁇ L), and the supported amount of the obtained resin was 0.021 mmol / g from the UVarea value of dibenzofulvene (294 nm: 88.61, 304 nm: 72.01).
  • LCMS injection volume: 5 ⁇ L
  • the supported amount of the obtained resin was 0.021 mmol / g from the UVarea value of dibenzofulvene (294 nm: 88.61, 304 nm: 72.01).
  • the average value of the carrying amount calculated at each wavelength was taken as the carrying amount of the resin.
  • the supported amount of run2 was 0.321 mmol / g when calculated by the same Fmoc quantification method. (UVarea value at 294 nm: 1432.15, UVarea value at 304 nm: 1217.70)
  • the supported amount was calculated by the same Fmoc quantification method and found to be 0.306 mmol / g. (UVarea value at 294 nm: 1364.67, UVarea value at 304 nm: 1162.58)
  • the weight (g) of the peptide component on the raw material resin is calculated as follows.
  • Weight of peptide component on raw material resin (g) Weight of raw material resin (g) x carrying amount of raw material resin (mmol / g) x molecular weight of peptide component on raw material resin (g / mol) x 0.001 (mol) / Mmol) (Equation 4)
  • the weight (g) of the peptide component on the resin when the target product is 100% produced is calculated as follows.
  • the amount of resin carried (mmol / g) the amount of raw resin carried (mmol / g) ⁇ (1-The amount of raw resin carried (mmol / g) x peptide component on the raw resin Molecular weight (g / mol) x 0.001 (mol / mmol) + carrying amount of raw material resin (mmol / g) x molecular weight of the peptide component of the target product (g / mol)
  • the recovery rate is calculated by the following equation.
  • Recovery rate amount of reaction product-bearing resin carried (mmol / g) x (1 ⁇ amount of raw material resin carried (mmol / g) -molecular weight of peptide component on raw material resin (g / mol) x 0.001 (mol) / Mmol) + molecular weight of the peptide component of the target product (g / mol) x 0.001 (mol / mmol))
  • the dipeptide carried on the solid phase via an ester bond is elongated by the method of the present invention to suppress the formation of diketopiperazine and synthesize the target peptide in good yield. I confirmed that I could do it.
  • Example 7 Confirmation of the presence of carbamate in the de-Fmoc step and confirmation of the effect on diketopiperazine desorption
  • the compounds described in Examples are shown in the table below.
  • NMR measurements were performed at 298K using Bruker's AVANCE III 600 Cryo-TCI or AVANCE III HD 600 BBFO.
  • the protonated one of the nitrogen atoms can be a cation source.
  • a cation source for example, in the case of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (DBU), the following three may be the cation sources, but in the present specification, any of the cations corresponds to it. Even if a salt is formed from the anion to be formed, it is referred to as a DBU salt without distinguishing between them (Fig. 1).
  • TMG 1,1,3,3-tetramethylguanidine
  • HP1 (dma) iminotris (dimethylamino) phosolane
  • the obtained organic phase was dried over sodium sulfate, and then the solvent of the obtained mother liquor was distilled off under reduced pressure.
  • the obtained crude product was azeotroped twice with toluene and then allowed to cool at 5 ° C. to obtain white crystals (1.88 g, 88%) of compound 1-3-1.
  • Example 7-1 Confirmation of the presence of DBU / HOCO-Phe-NMe 2 when compound 1-3-1 is treated with DBU.
  • Example 7-1-1 Product compound 1-3-1 (12.9) when compound 1-3-1 was treated with DBU in a solution of N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7).
  • 1 H-NMR of a solution of N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) (0.5 mL) of mg, 0.031 mmol) was measured (Fig. 1-b)), and then 1 with respect to the solution.
  • Example 7-1-2 Identification of compound 1-3-3a generated when DBU is allowed to act by spraying 13 CO 2 on compound 1-3-2 The following in Example 7-1-2 All experimental operations were performed in the glove box (under nitrogen atmosphere, dehydration conditions). N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7), which was heated to a high temperature by microwave and then dried under MS4A activated by allowing it to cool under vacuum (x2) for 12 hours or more, was used as a solvent. In the glove box, a sample was sampled in a highly airtight NMR tube with a valve, and NMR was measured with a sample that completely blocked contact with the outside air.
  • DMF-d7 N-dimethylformamide-d7
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene
  • Example 7-1-3 Structural verification of compound 1-3-3a present in solution A + solution B (SolA + SolB) All of the following experimental operations described in Example 7-1-3 are performed in the glove box ( It was carried out under a nitrogen atmosphere and dehydration conditions). N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7), which was heated to a high temperature by microwave and then dried under MS4A activated by allowing it to cool under vacuum (x2) for 12 hours or more, was used as a solvent. In the glove box, a sample was sampled in a highly airtight NMR tube with a valve, and NMR was measured with a sample that completely blocked contact with the outside air.
  • DMF-d7 N-dimethylformamide-d7
  • Example 7-2 Confirmation of the presence of carbamate when compound 1-3-1 is treated with DBU or piperidine in various solvents.
  • Basic operation Compound 1-3-1 (about 25 mg) deuterated solution (1.25 mL, tetrahydrofuran-d8 (THF-d8) [Entry1], toluene-d8 [Entry2], dichloromethane-d2 (DCM-d2) [Entry3] ], N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) [Entry4], divide 1.0 mL of the solution into two (0.5 mL), and 1,8-diazabicyclo [5.4] on one side.
  • Table 12 when comparing run1 (2% DBU) and run2 (20% piperidine), diketopiperazine desorbed and 6-membered cyclic amidine skeletal structures when treated with DBU.
  • the fact that the formation of diketopiperazine can be greatly suppressed can be explained consistently by the fact that the presence of carbamate does not form a 6-membered ring that causes desorption of diketopiperazine and the like.
  • Example 7-3 Confirmation of the presence of compound 1-3-3 when compound 1-3-1 is treated with various bases in THF.
  • Basic operation After preparing four solutions (0.5 mL) of tetrahydrofuran-d8 (THF-d8) of compound 1-3-1 (about 10 mg, 0.24 mmol), piperidine (67.5 ⁇ L, Entry1), 1 , 1,3,3-Tetramethylguanidine (TMG) (13.5 ⁇ L, Entry2), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-Undecene (DBU) (6.8 ⁇ L, Entry3), Imminotris Each of the four bases of (dimethylamino) phosphoolane (HP1 (dma)) (13.5 ⁇ L, Entry4) was allowed to act, and after 30 minutes, the NMR of each was measured, and compounds 1-3-3 and 1-3-3 were measured. The ratio of 2 was determined from the proton integral ratio of 1 H-NMR (Table 13). In this experiment, compound 1-3-1 was used at
  • Example 7-4 Confirmation of behavior when compound 1-3-1 is treated with DBU and then acid (HOAt) is added.
  • Deuterated solution (1.25 mL, tetrahydrofuran) of compound 1-3-1 (about 25 mg).
  • -D8 (THF-d8) [Entry1], toluene-d8 [Entry2], dichloromethane-d2 (DCM-d2) [Entry3], N, N-dimethylformamide-d7 (DMF-d7) [Entry4]
  • DBU 8-diazabicyclo
  • Triazole (HOAt) (3.3 mg, with HOAt) was added, and nothing was added to the other (without HOAt), and the NMR of each was measured to measure compound 1-3-3a and compound 1-3-2.
  • the ratio was determined from the proton integral ratio of 1 H-NMR (Table 14). In this experiment, compound 1-3-1 was used at 24.9 mg for entry1, 25.3 mg for entry2, 25.2 mg for entry3, and 24.9 mg for entry4.
  • Example 7-5 In the solid phase synthesis of the peptide, the experiment of peptide synthesis using the solvent subjected to CO 2 bubbling in the de-Fmoc step. It was explained that not forming a 6-membered ring that causes desorption of ketopiperazine leads to suppression of diketopiperazine formation. Therefore, in order to stabilize the carbamate salt during the de-Fmoc reaction, we conducted a confirmation experiment to see how the production of diketopiperazine desorbed product would be affected by using a solvent with CO 2 bubbling as a carbonic acid source. rice field.
  • DBU 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene

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Abstract

ペプチドの固相合成においては、Ｎ末端の保護基を除去する際に形成されるジケトピペラジン、および６員環状アミジン骨格構造体に起因して、所望の伸長反応が進行しないという課題がある。本発明者らは、固相法によるペプチドの製造において、特定の溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いてＦｍｏｃ骨格を有する保護基にてＮ末端のアミノ基が保護されたペプチドを処理し、次いで、ペプチド鎖の伸長を行うことで、上記の課題を解決できることを見出した。

Description

ジケトピペラジン形成による欠損を抑制するペプチド合成方法
　本発明は、固相法によるペプチド合成において、高純度かつ高効率にて合成することが可能なペプチドの新規な合成方法に関する。
　ペプチド合成においてＦｍｏｃ法は、その信頼性と温和な脱保護条件（脱Ｆｍｏｃ条件）から、広く適用されている方法である。また、近年、Ｎ－メチルアミノ酸などのＮ－アルキルアミノ酸を多く含むペプチドの医薬品への応用がさかんに研究されているが、このような分子種の酸不安定性が知られている（非特許文献１、特許文献１）。そのため、これらの文献では、Ｎ末端の脱保護として酸性条件が必要となるＢｏｃ法ではなく、塩基性条件での脱保護が可能なＦｍｏｃ法が採用されている。
　ペプチド合成におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）形成は、古くから認知されている問題である。ジケトピペラジン形成は、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドのＮ末端の保護基が除去されて、遊離のアミノ基が露出した場合に起こりうる。Ｆｍｏｃ法を利用したペプチド合成において、このジケトピペラジン形成の問題の改善に向けたいくつかのアプローチが報告されてきた。
　具体的には、ジケトピペラジン形成を起こしやすい箇所の保護基として、塩基を用いずに、中性条件下で脱保護反応が進行するＡｌｌｏｃ基を用いることで、ジケトピペラジン形成を抑制する方法が知られている（非特許文献２）。
　また、ジケトピペラジン形成が進行しやすい箇所にてＮ末端が遊離のアミノ基となる機会を回避すべく、そのような配列を含むジペプチドをあらかじめ合成し、それを用いてペプチド鎖を伸長する方法が知られている（非特許文献３）。
　さらには、Ｆｍｏｃの脱保護の際に一般的に広く用いられているピぺリジンの替わりに、より強い塩基であるＤＢＵやＴＢＡＦを用いて、脱保護にかかる時間を極めて短時間とすることで、ジケトピペラジン形成を抑制する方法が知られている（非特許文献４）。
　これらの方法はいずれも、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドのジケトピペラジン形成に対する対応策である。
国際公開番号 WO 2018/225851 A1
J. Peptide Res., 2005, 65, 153-166. Org. Lett., 2012, 14, 612-615. Bachem社公開 Solid Phase Peptide Synthesis（https://www.bachem.com/fileadmin/user_upload/pdf/Catalogs_Brochures/Solid_Phase_Peptide_Synthesis.pdf） Org. Lett., 2008, 10, 3857-3860.
　上述のとおり、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドは、そのエステル結合が切断されることでジケトピペラジンが形成されることが知られていた一方で、ペプチド配列中にＮ－置換アミノ酸を含む場合には、エステル結合より強固なアミド結合が切断される形でジケトピペラジンが形成されて、ペプチド配列からＮ－置換アミノ酸を含むジペプチドが脱落することがある。この脱落は、ペプチド配列中のＮ－置換アミノ酸が存在する任意の場所で発生し得るため、固相上に担持されたジペプチドに限らず発生し得ることが分かってきた。
　さらに本発明者らは、ペプチド配列中にＮ－置換アミノ酸が含まれる場合には、ジケトピペラジン形成の問題に加え、所望の伸長反応が進行せずに、目的物に代えてＮ末端に６員環状のアミジン骨格を有する不純物（６員環状アミジン骨格構造体）が形成されるという問題があることを明らかにした。これらの課題を解決する方法についてはこれまで報告されていない。
　固相に担持されたジペプチドのエステル結合において進行するジケトピペラジン脱離だけでなく、アミド結合において進行するジケトピペラジン脱離と、上記６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制するために、上述の従来技術を適用することが考えられる。しかしながら、その適用範囲には制限があり、これらは十分な解決策を提供できるものであるとはいえない。
　例えば、非特許文献２に記載の方法では、入手性の観点でＦｍｏｃアミノ酸と比較して一般性の劣るＡｌｌｏｃアミノ酸を必要とする。
　また、非特許文献３に記載のジペプチドを用いたペプチド鎖の伸長方法では、ジペプチドのＣ末端側のアミノ酸のラセミ化が進行する懸念がある。そのため、ジペプチドフラグメントのＣ末端側のアミノ酸がアキラルな場合（例えば、グリシン）か、ラセミ化が進行しにくい場合（例えば、プロリン）のような場合を除いて、この文献に記載の方法を適用することは難しい。
　さらに、非特許文献４に記載の方法は、脱Ｆｍｏｃ工程に要する時間を非常に短時間にすることを特徴とし、１分以内、例えば、１０秒～２０秒での脱Ｆｍｏｃ工程と固相洗浄操作を必要とする。工業化をはじめとしたスケールアップ合成にこのような極端な短時間での操作を適用することは不可能である。
　以上のとおり、いまだかつて実用的なジケトピペラジン抑制の方法論は提示されていない。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、一局面において、本発明は、ジケトピペラジンの形成を抑制可能なペプチド合成方法であって、（i）Ｎ末端の保護基としてＦｍｏｃ骨格を含む保護基を用い、（ii）ラセミ化の観点からの配列上の適用制限がなく、（iii）工業化等のスケールアップ合成が可能な方法を提供することを課題とする。また、一局面において、本発明は、６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制可能なペプチド合成方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、固相法によるペプチドの製造において、特定の溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いてＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するペプチドを処理し、続いて、酸クロリドや縮合剤を用いて発生させた活性エステルといった伸長活性種を該ペプチドと反応させることで、該保護基の除去からペプチド鎖の伸長に至るまで、ジケトピペラジンおよび６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を含む。
〔１〕固相法によるペプチドの製造方法であって、
(1) 固相合成用樹脂に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
(2) 前記工程(1)の後に、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む1種または複数種の塩基で処理する工程；および
(3) 前記工程(2)の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
〔２〕前記工程(2)に先立って、前記第一のペプチドを単一の塩基としてのピペリジンで処理する工程を含まない、〔1〕に記載の方法。
〔３〕前記工程(2)に先立って、前記第一のペプチドを共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23未満である単一の塩基で処理する工程を含まない、〔1〕に記載の方法。
〔４〕前記工程(2)と前記工程(3)の間に、酸を加えて残存する塩基を中和する工程を含まない、〔1〕～〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記工程(2)における前記溶媒が、固相樹脂の膨潤能が1.5mL/g以上、2.0mL/g以上、2.5mL/g以上、3.0mL/g以上、3.5mL/g以上、または4.0mL/g以上の溶媒である、〔1〕～〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記工程(2)により得られる第一のペプチドの少なくとも一部が、カルバミン酸塩の形態にある、〔1〕～〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記カルバミン酸塩が、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基との塩である、〔6〕に記載の方法。
〔８〕前記カルバミン酸塩が、ＤＢＵ塩、ＴＭＧ塩、ＨＰ１（ｄｍａ）塩、ＭＴＢＤ塩、Ｐ１－ｔＢｕ塩、またはＰ２－Ｅｔ塩である、〔6〕または〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記工程(2)において、１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた、カルバミン酸塩と、さらに脱炭酸が進行して生じるアミン体のモル比（カルバミン酸塩／アミン体）が、０．６以上、０．８以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、４．６以上、５．０以上、６．０以上、８．０以上、または１０．０以上である、〔6〕～〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記工程(2)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を25v/v%以上含む、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕前記工程(2)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を50v/v%以上含む、〔1〕～〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕前記工程(2)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を75v/v%以上含む、〔1〕～〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記工程(2)における前記溶媒が、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、またはスルホン系溶媒より選択される1種または複数種をさらに含む、〔1〕～〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記工程(2)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種からなる、〔1〕～〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記芳香族炭化水素系溶媒がトルエン、ベンゼン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、およびクメンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ハロゲン系溶媒がジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および四塩化炭素からなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記エーテル系溶媒がテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、およびテトラグリムからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記エステル系溶媒が酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、およびγ―バレロラクトンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ケトン系溶媒がアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、およびジエチルケトンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記カーボネート系溶媒がジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、およびジブチルカーボネートからなる群より選択される1種または複数種であり、および
　前記リン酸エステル系溶媒がリン酸トリメチル、リン酸トリエチル、およびリン酸トリブチルからなる群より選択される1種または複数種である、〔1〕～〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕前記工程(2)における前記溶媒が、２６以下のドナーナンバー値を有する、〔1〕～〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔１６．１〕前記工程(2)における前記芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒が、２６以下のドナーナンバー値を有する、〔1〕～〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕前記工程(2)における前記溶媒が、２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下のドナーナンバー値を有する、〔1〕～〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１７．１〕前記工程(2)における前記芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒が、２５以下、２４以下、２３以下、２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下のドナーナンバー値を有する、〔1〕～〔17〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記工程(2)における前記溶媒が、トルエンまたはクメンである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記工程(2)における前記溶媒が、ジクロロメタンである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記工程(2)における前記溶媒が、テトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、または２－メチルテトラヒドロフランである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記工程(2)における前記溶媒が、プロピオン酸メチルまたは酢酸ブチルである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕前記工程(2)における前記溶媒が、メチルエチルケトンまたはジエチルケトンである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕前記工程(2)における前記溶媒が、ジメチルカーボネートである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕前記工程(2)における前記溶媒が、リン酸トリブチルである、〔1〕～〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕前記工程(2)における前記塩基が、アミジン類、グアニジン類およびホスファゼン類からなる群より選択される少なくとも1種である、〔1〕～〔24〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕前記工程(2)における前記塩基が、DBU、MTBD、TMG、P1tBu、P2EtおよびHP1(dma)からなる群より選択される少なくとも1種である、〔1〕～〔25〕のいずれかに記載の方法。
〔２７〕前記工程(2)における前記塩基が、DBU、MTBD、TMG、P1tBu、P2EtまたはHP1(dma)である、〔1〕～〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔２８〕前記工程(2)における前記塩基が、(i) DBUとピペリジンとの組み合わせ、または(ii) DBUとMTBD、HP1(dma)、P1tBu、もしくはP2Etとの組み合わせである、〔1〕～〔26〕のいずれかに記載の方法。
〔２９〕前記工程(2)における前記塩基が、前記溶媒中に1～8v/v%の濃度で含まれる、〔1〕～〔28〕のいずれかに記載の方法。
〔３０〕前記工程(2)が、前記溶媒にＣＯ２を接触させる工程をさらに含む、〔1〕～〔29〕のいずれかに記載の方法。
〔３１〕前記工程(2)が、前記溶媒にＣＯ２をバブリングさせる工程をさらに含む、〔1〕～〔30〕のいずれかに記載の方法。
〔３２〕前記工程(2)における前記溶媒が、事前にＣＯ２を接触させた溶媒である、〔1〕～〔29〕のいずれかに記載の方法。
〔３３〕前記工程(2)における前記溶媒が、事前にＣＯ２をバブリングさせた溶媒である、〔1〕～〔29〕のいずれかに記載の方法。
〔３４〕前記工程(2)を複数回繰り返す、〔1〕～〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔３５〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において同じ溶媒が用いられる、〔34〕に記載の方法。
〔３６〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において異なる溶媒が用いられる、〔34〕に記載の方法。
〔３７〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において同じ塩基が用いられる、〔34〕～〔36〕のいずれかに記載の方法。
〔３８〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回において異なる塩基が用いられる、〔34〕～〔36〕のいずれかに記載の方法。
〔３９〕前記工程(2)を複数回繰り返す場合に、工程(2)の各回の間に溶液を排出する工程をさらに含む、〔34〕～〔38〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸であるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の酸ハロゲン化物であり、該C1-C8アルキルカルボン酸およびC6-C10アリールカルボン酸は、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、ジアルキルアミノ、シアノ、アルコキシカルボニル、およびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される1つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、〔1〕～〔39〕のいずれかに記載の方法。
〔４１〕前記保護基が、カルバメート系保護基、スルホニル系保護基、またはアシル系保護基である、〔40〕に記載の方法。
〔４２〕前記カルバメート系保護基が、Fmoc骨格を含む保護基、Alloc、Teoc、Boc、またはCbzであり、前記スルホニル系保護基がNsであり、アシル系保護基がTfaである、〔41〕に記載の方法。
〔４３〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸であるか、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物であり、該C1-C8アルキルカルボン酸およびC6-C10アリールカルボン酸は、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、およびハロゲンからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、〔40〕に記載の方法。
〔４４〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、およびハロゲンからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されてもよいC1-C8アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である、〔40〕に記載の方法。
〔４５〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、C1-C8アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である、〔40〕に記載の方法。
〔４６〕前記第一のペプチドが２～３０個、２～２０個、２～１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸残基を含む、〔1〕～〔45〕のいずれかに記載の方法。
〔４７〕前記第一のペプチドがジペプチドである、〔1〕～〔46〕のいずれかに記載の方法。
〔４８〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および/または前記保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のN-置換アミノ酸を含む、および/または前記保護基を有するアミノ酸がN-置換アミノ酸である、〔1〕～〔47〕のいずれかに記載の方法。
〔４９〕前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、またはFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、またはFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および/または前記Fmoc骨格を含む保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のN-置換アミノ酸を含む、および/または前記Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸がN-置換アミノ酸である、〔1〕～〔48〕のいずれかに記載の方法。
〔５０〕前記第一のペプチドのN末端から2残基目のアミノ酸が、N-置換アミノ酸である、〔1〕～〔49〕のいずれかに記載の方法。
〔５１〕前記工程(3)における前記縮合剤が塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがPF6 -またはBF4 -である、〔1〕～〔50〕のいずれかに記載の方法。
〔５２〕前記工程(3)における前記縮合剤が、PyOxim、PyAOP、PyBOP、COMU、HATU、HBTU、HCTU、TDBTU、HOTU、TATU、TBTU、TCTU、およびTOTU からなる群より選択される少なくとも1種を含む、〔1〕～〔51〕のいずれかに記載の方法。
〔５３〕前記工程(3)における前記縮合剤が、PyOxim、PyAOP、PyBOP、COMU、HATU、HBTU、HCTU、TDBTU、HOTU、TATU、TBTU、TCTU、またはTOTUである、〔1〕～〔52〕のいずれかに記載の方法。
〔５４〕前記工程(3)が塩基の存在下で行われる、〔1〕～〔53〕のいずれかに記載の方法。
〔５５〕前記工程(3)が、共役酸の水中でのpKaが5～12の塩基の存在下で行われる、〔1〕～〔54〕のいずれかに記載の方法。
〔５６〕前記工程(3)における前記塩基がDIPEAである、〔54〕または〔55〕に記載の方法。
〔５７〕前記Fmoc骨格を含む保護基が、下記式(1)で表される、〔1〕～〔56〕のいずれかに記載の方法；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
(式中、
　R1～R8は、独立して、水素、C1-C8アルキル、C1-C8フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、
　R9～R10は、独立して、水素またはメチルである)。
〔５８〕前記Fmoc骨格を含む保護基がFmoc基、Fmoc(2,7tb)基、Fmoc(1Me)基、Fmoc(2F)基、Fmoc(2,7Br)基、mio-Fmoc基、dio-Fmoc基、tdf-Fmoc基、Fmoc(2TMS)基、Fmoc(2so3h)基、sm-Fmoc基、またはrm-Fmoc基である、〔57〕に記載の方法。
〔５９〕前記Fmoc骨格を含む保護基がFmoc基である、〔57〕に記載の方法。
〔６０〕前記工程(2)と前記工程(3)の間に固相合成用樹脂を洗浄する工程をさらに含む、〔1〕～〔59〕のいずれかに記載の方法。
〔６１〕前記洗浄する工程が、
i) 事前にＣＯ２を接触させた溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、および/または
ii) 事前にＣＯ２を接触させていない溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、
を含む、〔60〕に記載の方法。
〔６２〕前記洗浄する工程が、
i) 事前にＣＯ２をバブリングさせた溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、および/または
ii) 事前にＣＯ２をバブリングさせていない溶媒を用いて固相合成用樹脂を洗浄する工程、
を含む、〔60〕に記載の方法。
〔６３〕前記工程(3)における前記溶媒が、前記工程(2)における前記溶媒と同じである、〔1〕～〔62〕のいずれかに記載の方法。
〔６４〕前記工程(3)における前記溶媒が、前記縮合剤が溶解可能な溶媒である、〔1〕～〔63〕のいずれかに記載の方法。
〔６５〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を含む、〔1〕～〔64〕のいずれかに記載の方法。
〔６６〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を25v/v%以上含む、〔1〕～〔64〕いずれかに記載の方法。
〔６７〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を50v/v%以上含む、〔1〕～〔64〕のいずれかに記載の方法。
〔６８〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を75v/v%以上含む、〔1〕～〔64〕のいずれかに記載の方法。
〔６９〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種からなる、〔1〕～〔68〕のいずれかに記載の方法。
〔７０〕前記工程(3)における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒である、〔1〕～〔69〕のいずれかに記載の方法。
〔７１〕前記芳香族炭化水素系溶媒が、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼンアニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、およびクメンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および四塩化炭素からなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記エーテル系溶媒が、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、１，３－ジオキソラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジグリム、トリグリム、およびテトラグリムからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記アミド系溶媒が、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＡ、ＮＥＰ、ＮＢＰ、およびホルムアミドからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記スルホキシド系溶媒が、ＤＭＳＯ、およびメチルフェニルスルホキシドからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記スルホン系溶媒が、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、およびエチルイソプロピルスルホンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ウレア系溶媒が、ＤＭＩ、およびＤＭＰＵからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記エステル系溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、酢酸ブチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、およびγ―バレロラクトンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記ケトン系溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、ジエチルケトン、およびシクロペンタノンからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記カーボネート系溶媒が、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、およびジブチルカーボネートからなる群より選択される1種または複数種であり、
　前記リン酸エステル系溶媒が、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルからなる群より選択される1種または複数種である、〔65〕～〔70〕のいずれかに記載の方法。
〔７２〕前記工程(3)に用いられるカルボン酸がFmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸または第二のペプチドであり、該アミノ酸または第二のペプチドが有するFmoc骨格を含む保護基が、前記工程(1)で用いられる第一のペプチドが有するFmoc骨格を含む保護基と同一であるか、または異なる、〔1〕～〔71〕のいずれかに記載の方法。
〔７３〕前記工程(3)に用いられるカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、またはC6-C10アリールカルボン酸の酸ハロゲン化物であり、該Fmoc骨格を含む保護基を有するアミノ酸のカルボキシル基、該Fmoc骨格を含む保護基を有する第二のペプチドのC末端のカルボキシル基、該C1-C8アルキルカルボン酸のカルボキシル基、またはC6-C10アリールカルボン酸のカルボキシル基が酸ハロゲン化物基に変換されている、〔1〕～〔72〕のいずれかに記載の方法。
〔７４〕固相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
(1) 固相に担持されたFmoc骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
(2) 前記工程(1)の後に、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも1種を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのpKaが23以上である塩基を少なくとも含む1種または複数種の塩基で処理する工程
を含む、前記方法。
　本発明によれば、固相法を用いたペプチド合成において、従来の条件では、ジケトピペラジン形成および／または６員環状アミジン骨格構造体の形成に起因して、所望の伸長反応が十分に進行しないアミノ酸配列を含む場合にあっても、このような不純物の形成を著しく低減できることから、効率的にペプチド鎖を伸長させて、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。本発明の方法は、一般性の低いＡｌｌｏｃ等の特別な保護基を用いる必要がなく、極端に短い反応時間に対応するといった反応操作上の制限もないため、汎用性が高く、スケールアップも可能な実用的な合成方法となり得る。
図１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中でＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２ （化合物１－３－１）に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させた前後での３．６－６．８ｐｐｍの間の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示し、この範囲に観測される化合物１－３－１および、化合物１－３－２、化合物１－３－３ａ、ジベンゾフルベンの特徴的な１Ｈシグナルを示す図である。図１中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図１中、ｂ）は、化合物１－３－１のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて生じた化合物１－３－２と化合物１－３－３ａが化学交換を起こしており、その比率が８２：１８であることを示す５．４－３．５ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの図である。図２中、ａ）－１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図２中、ａ）－２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の４．８２ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＲＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図２中、ａ）－３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＲＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図２中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルと３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比を示した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。 図３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－３－２が生じたことを示す５．２－３．５ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）-１は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中での化合物１－３－２の標品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）-２は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）-３は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－３－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図３中、ａ）-４は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－３－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図３中、ａ）-５は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－３－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図３中、ｂ）はＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させ、さらに化合物１－３－２の標品を３μＬ加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．８４ｐｐｍのプロトンシグナルと３．９５ｐｐｍのシグナルの積分値を図り、その積分値をもとに溶液中の化合物１－３－３と化合物１－３－２の存在比を算出した図である。 図４は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－３－３ａが生じたことを示す５．１－３．７ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲおよび１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中での化合物１－３－２の標品の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｂ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｃ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の４．７７ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ｄ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせ得られる溶液の３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した１Ｄ－ＮＯＥＳＹスペクトルを示す図である。図４中、ｅ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図４中、ｆ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリングさせ後の４．７７ｐｐｍの１Ｈシグナルと３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比を示した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの図である。図４中、ｅ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルを拡大した図である。なお分解能向上のため、この図だけウィンドウ関数としてSin-bellを用いて変換した。 図５は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて化合物１－３－３ａが生じたことを示す１６４－１２４ｐｐｍ付近の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図５中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図５中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－２に対して１３ＣＯ２をバブリングさせた後、、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図６は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ、ＳｏｌＢ）に化合物１－３－３ａが存在することを示す６．９－３．６ｐｐｍ付近の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。図６中、ｃ）は、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す図である。 図７は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液に、化合物１－３－３ａが存在すること示すＮＨ－ＨＳＱＣ（１５Ｎ［Ｆ１］：９７－８５ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：５．７－４．７ｐｐｍ付近），ＮＨ－ＨＭＢＣ（１５Ｎ［Ｆ１］：１０１－８３ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：３．０４－２．６４ｐｐｍ付近），ＣＨ－ＨＭＢＣ（１３Ｃ［Ｆ１］：１６５－１５８ｐｐｍ付近、１Ｈ［Ｆ２］：５．７－４．５ｐｐｍ付近）スペクトルを示す図である。図７中、ａ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＮＨ－ＨＳＱＣスペクトルを示す図である。図７中、ｂ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＮＨ－ＨＭＢＣスペクトルを示す図である。図７中、ｃ）は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液のＣＨ－ＨＭＢＣスペクトルを示す図である。 図８は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）中、化合物１－３－１に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ｂ）と、化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液に対して１分間１３ＣＯ２をバブリング後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させて得られる溶液（溶液Ａ）を混合して得られる溶液に存在する化合物１－３－３ａのカルバマート部位の１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎシグナルすべてを同定したことを示す図である。
（用語の定義）
　本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する基である。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ１－Ｃ２０、以下「Ｃｐ－Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ１－Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１－Ｃ６アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルケニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルキニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロシクリル」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の環状の１価の基を意味する。ヘテロシクリルは、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは４～１０であり（４～１０員ヘテロシクリル）、より好ましくは４～７である（４～７員ヘテロシクリル）。ヘテロシクリルとしては具体的には、たとえば、アゼチジニル、オキシラニル、オキセタニル、アゼチジニル、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピリミジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、１，２－チアジナン、チアジアゾリジニル、アゼチジニル、オキサゾリドン、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリル、ジオキソラニル、ジオキサニル、テトラヒドロピロロ[１,２－ｃ]イミダゾール、チエタニル、３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、３－オキサ－８－アザビシクロ[３．２．１]オクタニル、スルタム、２－オキサスピロ[３．３]ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ１－Ｃ６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルケニルオキシ」とは、前記定義の「アルケニル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルオキシが挙げられる。アルケニルオキシとして具体的には、たとえば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－プロペニルオキシ、１－ブテニルオキシ、２－ブテニルオキシ（シス、トランスを含む）、３－ブテニルオキシ、ペンテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールオキシ」とは、前記定義の「アリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールオキシが挙げられる。アリールオキシとして具体的には、たとえば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリールオキシ」とは、前記定義の「ヘテロアリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくは５～１０員ヘテロアリールオキシが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「環状アミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する基を意味し、好ましくは、４～８員環状アミノが挙げられる。環状アミノとして具体的には、たとえば、１－アゼチジル、１－ピロリジル、１－ピペリジル、１－ピペラジル、４－モルホリニル、３－オキサゾリジル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル－４－イル、３－オキサ－８－アザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イルなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素原子がハロゲンで置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ８ハロアルキルが好ましく、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキルがより好ましい。
　本明細書における「フルオロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素原子がフッ素原子で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキルが好ましい。ハロアルキルとして具体的には、たとえば、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、３，３－ジフルオロプロピル、４，４－ジフルオロブチル、５，５－ジフルオロペンチル、３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキルオキシ」とは、前記定義の「アラルキル」が結合したオキシ基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルオキシが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルオキシがより好ましい。アラルキルオキシとして具体的には、たとえば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、３－フェニルプロポキシなどが挙げられる。
　本明細書において、「ペプチド鎖」とは、１つまたはそれ以上の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合および／またはエステル結合により連結されているペプチド鎖をいう。ペプチド鎖として好ましくは、１～１５のアミノ酸残基を含むペプチド鎖であり、より好ましくは５～１２のアミノ酸残基からなるペプチド鎖である。
　本発明における「ペプチド化合物」は、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合によって連結されるペプチド化合物であれば特に限定されないが、好ましくは５～３０残基、より好ましくは８～１５残基、さらに好ましくは９～１３残基のペプチド化合物である。本発明において合成されるペプチド化合物は、１つのペプチド中に少なくとも３つのＮ置換アミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも５つ以上のＮ置換アミノ酸を含むことがより好ましい。これらのＮ置換アミノ酸は、ペプチド化合物中に連続して存在していても、不連続に存在していてもよい。本発明におけるペプチド化合物は、直鎖状でも環状でもよく、環状ペプチド化合物が好ましい。本明細書において、「ペプチド化合物」を「ペプチド」ということもある。
　本発明における「環状ペプチド化合物」は、直鎖ペプチド化合物のＮ末端側の基とＣ末端側の基とを環化することにより得ることができる環状のペプチド化合物である。環化は、アミド結合のような炭素－窒素結合による環化、エステル結合やエーテル結合のような炭素－酸素結合による環化、チオエーテル結合のような炭素－硫黄結合による環化、炭素－炭素結合による環化、あるいは複素環構築による環化など、どのような形態であってもよい。これらのうちでは、アミド結合あるいは炭素－炭素結合などの共有結合を介した環化が好ましく、側鎖のカルボン酸基とＮ末端の主鎖のアミノ基によるアミド結合を介した環化がより好ましい。環化に用いられるカルボン酸基やアミノ基等の位置は、主鎖上のものでも、側鎖上のものでもよく、環化可能な位置にあれば、特に制限されない。
　本明細書において「１つまたは複数の」とは、１つまたは２つ以上の数を意味する。「１つまたは複数の」が、ある基の置換基に関連する文脈で用いられる場合、この用語は、１つからその基が許容する置換基の最大数までの数を意味する。「１つまたは複数の」として具体的には、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより大きい数が挙げられる。
　本明細書において「固相合成用樹脂」は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このような固相合成用樹脂として、具体的には、例えば、ＣＴＣ樹脂、Ｗａｎｇ樹脂、ＳＡＳＲＩＮ樹脂、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）、４－メトキシトリチルクロリド樹脂（Ｍｍｔ）などの酸性条件で除去可能なものが挙げられる。樹脂は、用いられるアミノ酸側の官能基に合わせて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸側の官能基としてカルボン酸（主鎖カルボン酸、もしくは、ＡｓｐやＧｌｕに代表される側鎖カルボン酸）、又は、芳香環上のヒドロキシ基（Ｔｙｒに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）もしくは２－クロロトリチルクロリド樹脂（ＣＴＣ樹脂）を用いることが好ましい。アミノ酸側の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（ＳｅｒやＴｈｒに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、２－クロロトリチルクロリド樹脂（ＣＴＣ樹脂）もしくは４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）を用いることが好ましい。なお、本明細書中にて、樹脂をレジンと記載する場合もある。
　樹脂を構成するポリマーの種類についても特に限定されない。ポリスチレンで構成される樹脂の場合には、１００－２００ｍｅｓｈもしくは２００－４００ｍｅｓｈのいずれを用いても良い。また、架橋率についても特に限定されないが、１％ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）架橋のものが好ましい。また、樹脂を構成するポリマーの種類として、Tentagel、またはChemmatrixが挙げられる。
　本明細書に記載の化合物の製造において、定義した基が実施方法の条件下で望まない化学的変換を受けてしまう場合、例えば、官能基の保護、脱保護等の手段を用いることにより、該化合物を製造することができる。ここで保護基の選択および脱着操作は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　本明細書において、「置換されていてもよい」という修飾語句が付与されている場合、その置換基としては、例えば、アルキル、アルコキシ、フルオロアルキル、フルオロアルコキシ、オキソ、アミノカルボニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミルなどが例示される。
　さらにこれらそれぞれに置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、ホウ素原子、ケイ素原子、又はリン原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどが例示される。
　本明細書に記載の化合物は、その塩またはそれらの溶媒和物であることができる。本明細書に記載の塩には、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが含まれる。これらの塩は、例えば、当該化合物と、酸または塩基とを接触させることにより製造される。本明細書に記載の化合物の溶媒和物とは、溶液中で溶質分子が溶媒分子を強く引き付け、一つの分子集団をつくる現象をいい、溶媒が水であれば水和物と言う。本明細書に記載の化合物は、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノールなど）、ジメチルホルムアミド、またはジグリムなどの有機溶媒、または水などから選択される単独の溶媒との溶媒和物でも、複数の溶媒との溶媒和物でもよい。
　本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体ということがある）が含まれる。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体）は特に限定されないが、β－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α－ジ置換アミノ酸、側鎖が天然アミノ酸と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、スピロ結合したシクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、又はＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基など、または、オキソ、アミノカルボニル、ハロゲン原子などが例示される。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
　本明細書におけるハロゲン原子を含む置換基としては、ハロゲンを置換基に有するアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基などが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。
　Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシ（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシ（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＣＯ２Ｈ）などの基が挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。アルコキシとしては、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、Ｃ１－Ｃ２アルコキシが好ましく、なかでもメトキシ、又はエトキシが好ましい。
　カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル（例えば、Ｃ１－Ｃ６又はＣ１－Ｃ４アルキルアミノカルボニル、なかでもエチルアミノカルボニル、メチルアミノカルボニルなどが例示される。）、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
　Ｓ原子を含む置換基としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）などの基が挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
　スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子を含む置換基として、アジド（－Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノともいう。）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノともいう。）、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）、ピリジル、ピペリジノ、モルホリノ、アゼチジニルなどの基が挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノ）の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。具体的には、ジアルキルアミノ、なかでもＣ１－Ｃ６ジアルキルアミノ、Ｃ１－Ｃ４ジアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが例示される。本明細書において「Ｃｐ－Ｃｑジアルキルアミノ基」とは、アミノ基にＣｐ－Ｃｑアルキル基が２個置換された基をいい、両Ｃｐ－Ｃｑアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　本明細書においてペプチド化合物を構成する「アミノ酸残基」を単に「アミノ酸」ということがある。
　本発明における「Ｎ－置換アミノ酸」とは、先に定義のアミノ酸のうち、主鎖アミノ基が、Ｎ－置換されているアミノ酸を意味する。Ｎ－置換アミノ酸として具体的には、アミノ酸の主鎖アミノ基が、ＮＨＲ基であって、Ｒが、水素以外の任意の基、例えば、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であるものや、プロリンのようにＮ原子に結合した炭素原子とα位からの炭素原子が環を形成する環状アミノ酸などが挙げられる。例えば、５員環を形成するプロリン類、４員環を形成するアゼチジン類、６員環を形成するピペリジン類が挙げられる。置換されていてもよい各基の置換基は、特に制限されず、たとえばハロゲン基、エーテル基、ヒドロキシル基などが挙げられる。
　本明細書における「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本明細書の「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
　本明細書において「プロリン類」とは、プロリンに加え、プロリンの５員環を形成する任意の炭素原子上に任意の置換基が１つまたは複数結合した化合物群を意味する。、５員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよく、その環は任意の芳香環であってもよい。「プロリン類」として具体的には、プロリン、trans-4-ヒドロキシ-L-プロリン、cis-4-ヒドロキシ-L-プロリン、trans-4-フルオロ-L-プロリン、cis-4-フルオロ-L-プロリン、２－メチルーＬ－プロリンなどが挙げられる。プロリン類がヒドロキシ基を有する場合、該ヒドロキシ基は任意の保護基によって保護されていてもよく、もしくは、任意の置換基と該ヒドロキシ基の酸素原子とがエーテル結合もしくはエステル結合を形成していてもよい。さらに５員環を形成する炭素原子のうち任意のひとつが酸素原子もしくは硫黄原子に置き換わっていてもよい。このような化合物として具体的には、例えば、L-チオプロリンが挙げられる。さらにプロリン類は、形成する５員環内に不飽和結合を有していてもよい。このような化合物として具体的には、例えば、3,4-デヒドロ-L-プロリンが挙げられる。なお、それらはＬ体に限らず、Ｄ体であってもよい。
　本明細書において「アゼチジン類」とは、１つの窒素原子と３つの炭素原子が４員環を形成しており、窒素原子の隣の炭素原子にカルボキシル基が結合している化合物を基本とする環状アミノ酸を意味する。４員環を形成する任意の炭素原子上には、任意の置換基が１つまたは複数結合していてもよい。４員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよい。「アゼチジン類」として具体的には、(S)-アゼチジン-2-カルボン酸、(R)-アゼチジン-2-カルボン酸などが挙げられる。また、４員環を形成している窒素原子から数えて２つめの炭素原子にカルボキシル基が結合している化合物も「アゼチジン類」に含まれ、このような化合物としては、例えば、アゼチジン-3-カルボン酸などが挙げられる。
　本明細書において「ピペリジン類」とは、１つの窒素原子と５つの炭素原子が６員環を形成しており、窒素原子の隣の炭素原子にはカルボキシル基が結合している化合物を基本とする環状アミノ酸を意味する。６員環を形成する任意の炭素原子上には、任意の置換基が１つまたは複数結合していてもよい。６員環上に複数の置換基が存在している場合、それらの置換基は一緒になって環を形成していてもよく、その環は任意の芳香環であってもよい。「ピペリジン類」として具体的には、(R)-ピペリジン-2-カルボン酸、(S)-ピペリジン-2-カルボン酸、(R)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、(S)-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸などが挙げられる。
　本明細書において、芳香族炭化水素系溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられる。
　本明細書において、ハロゲン系溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられる。
　本明細書において、エーテル系溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられる。
　本明細書において、アミド系溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられる。
　本明細書において、スルホキシド系溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルフェニルスルホキシドなどが挙げられる。
　本明細書において、スルホン系溶媒としては、例えば、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　本明細書において、ウレア系溶媒としては、例えば、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられる。
　本明細書において、エステル系溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ―バレロラクトンなどが挙げられる。
　本明細書において、ケトン系溶媒としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトンなどが挙げられる。
　本明細書において、カーボネート系溶媒としては、例えば、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられる。
　本明細書において、リン酸エステル系溶媒としては、例えば、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アミジン類」とは、下記式Ｂ１で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
［式中、
　ＲＢ１とＲＢ４は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１とＲＢ４は、ＲＢ１が結合している窒素原子およびＲＢ４が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２とＲＢ３は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２とＲＢ３は、ＲＢ２が結合している窒素原子およびＲＢ３が結合している窒素原子ならびに該窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成する。］
　ＲＢ１～ＲＢ４が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルが挙げられる。
　ＲＢ１とＲＢ４が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ２とＲＢ３が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、１，４，５，６－テトラヒドロピリミジン環などが挙げられる。
　アミジン類として具体的には、ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンや、ＤＢＮ：１，５－ジアザビシクロ［４．３．０］－５－ノネンなどが挙げられる。
　本明細書において「グアニジン類」とは、下記式Ｂ２で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
［式中、
　ＲＢ６は、水素またはＣ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ５とＲＢ７は、それぞれ独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ８は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、かつＲＢ９は水素、Ｃ１－Ｃ４アルキルまたはフェニルであるか、ＲＢ８とＲＢ９は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合している炭素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ここでＲＢ９がフェニルである場合、２つの式Ｂ２は、該フェニル基の２つのベンゼン環が縮合してナフタレンを形成してもよい。］
　ＲＢ５～ＲＢ８が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチルであり、ＲＢ９が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはｔ－ブチルである。
　ＲＢ５とＲＢ７が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、イミダゾリジン環、ヘキサヒドロピリミジン環、１，３－ジアゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ８とＲＢ９が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、１，４，５，６－テトラヒドロピリミジン環などが挙げられる。
　グアニジン類として具体的には、ＴＭＧ：１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、ＴＢＤ：１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン、ＭＴＢＤ：７－メチル－１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エンなどが挙げられる。
　本明細書において「ホスファゼン類」とは、下記式Ｂ３または下記式Ｂ４で表される塩基を意味する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
［式中、
　ＲＢ１０は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１０およびＲＢ１１は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１１は、ＲＢ１０およびＲＢ１１が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１１およびＲＢ１２は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１２は、ＲＢ１１およびＲＢ１２が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１２およびＲＢ１３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１３は、ＲＢ１２およびＲＢ１３が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１３およびＲＢ１４は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１４は、ＲＢ１３およびＲＢ１４が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１４およびＲＢ１５は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１５は、ＲＢ１４およびＲＢ１５が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、またはＣ６－Ｃ１０アリールである。］
　ＲＢ１０～ＲＢ１５が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルであり、ＲＢ１６が、Ｃ１－Ｃ８アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ８アルキルとして好ましくはｔ－ブチル、ｔ－オクチルである。
　ＲＢ１０とＲＢ１１、ＲＢ１２とＲＢ１３、および／またはＲＢ１４とＲＢ１５が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ１１とＲＢ１２、および／またはＲＢ１３とＲＢ１４が５～８員環を形成する場合、該５～８員環は、ＲＢ１１、ＲＢ１２、ＲＢ１３、およびＲＢ１４が結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子以外にヘテロ原子を含まない、５～８員の飽和環であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
［式中、
　ＲＢ１７は、独立してＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１７およびＲＢ１８は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１８は、ＲＢ１７およびＲＢ１８が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１８およびＲＢ１９は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ１９は、ＲＢ１８およびＲＢ１９が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ１９およびＲＢ２０は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２０は、ＲＢ１９およびＲＢ２０が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ２１は、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２１およびＲＢ２２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２２は、ＲＢ２１およびＲＢ２２が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２２およびＲＢ２３は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２３は、ＲＢ２２およびＲＢ２３が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２３およびＲＢ２４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２４は、ＲＢ２３およびＲＢ２４が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２４およびＲＢ２５は、それらが結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２５は、ＲＢ２４およびＲＢ２５が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲＢ２５およびＲＢ２６は、それらが結合している窒素原子と一緒になって５～８員環を形成し、
　ＲＢ２６は、ＲＢ２５およびＲＢ２６が５～８員環を形成する場合を除き、Ｃ１－Ｃ４アルキルであり、
　ＲＢ２７は、Ｃ１－Ｃ４アルキル、またはＣ６－Ｃ１０アリールである。］
　ＲＢ１７～ＲＢ２６が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはメチル、エチルであり、ＲＢ２７が、Ｃ１－Ｃ４アルキルである場合、該Ｃ１－Ｃ４アルキルとして好ましくはエチル、ｔ－ブチルである。
　ＲＢ１７とＲＢ１８、ＲＢ１９とＲＢ２０、ＲＢ２１とＲＢ２２、ＲＢ２３とＲＢ２４、ＲＢ２５とＲＢ２６が５～８員環を形成する場合、該５～８員環として好ましくは、ピロリジン環、ピペリジン環、アゼパン環などが挙げられる。
　ＲＢ１７とＲＢ１８が共にＣ１－Ｃ４アルキルである場合、ＲＢ１９とＲＢ２０も共にＣ１－Ｃ４アルキルであることが好ましく、ＲＢ１７とＲＢ１８が５～８員環を形成する、ＲＢ１９とＲＢ２０も５～８員環を形成することが好ましい。
　ＲＢ２１とＲＢ２２が共にＣ１－Ｃ４アルキルである場合、ＲＢ２３とＲＢ２４およびＲＢ２５とＲＢ２６も共にＣ１－Ｃ４アルキルであることが好ましく、ＲＢ２１とＲＢ２２が５～８員環を形成する、ＲＢ２３とＲＢ２４およびＲＢ２５とＲＢ２６も５～８員環を形成することが好ましい。
　ＲＢ１８とＲＢ１９、および／またはＲＢ２２とＲＢ２３が５～８員環を形成する場合、該５～８員環は、ＲＢ１１、ＲＢ１２、ＲＢ１３、およびＲＢ１４が結合している各窒素原子および該各窒素原子が結合しているリン原子以外にヘテロ原子を含まない、５～８員の飽和環であることが好ましい。
　ホスファゼン類として具体的には、Ｐ２ｔＢｕ：１－ｔｅｒｔ－ブチル－２，２，４，４，４－ペンタキス（ジメチルアミノ）－２λ５，４λ５－カテナジ（ホスファゼン）、Ｐ２Ｅｔ：テトラメチル（トリス（ジメチルアミノ）ホスホラニリデン）リン酸トリアミド－エチルイミン、ＨＰ１（ｄｍａ）：イミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、ＢＴＰＰ：ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－トリ（ピロリジノ）ホスホラン、Ｐ１ｔＢｕ：ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン、ＢＥＭＰ：２－ｔｅｒｔ－ブチルイミノ－２－ジエチルアミノ－１，３－ジメチルペルヒドロ－１，３，２－ジアザホスホリン等が挙げられる。
　本明細書において、「および/または」との用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「A、B、および/またはC」には、以下の７通りのバリエーションが含まれる；
(i) A、(ii) B、(iii) C、(iv) AおよびB、(v) AおよびC、(vi) BおよびC、(vii) A、B、およびC。
（製造方法）
　ある態様において、本発明は、以下の工程（１）～（３）を含む、固相法によるペプチドの製造方法に関する。
（１）固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
（２）前記工程（１）の後に、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
（３）前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程。
工程（１）
　本発明の工程（１）は、固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程である。
　工程（１）における「固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド」は、通常、そのＣ末端のアミノ酸残基中の官能基（例えば、カルボキシル基）を通じて固相合成用樹脂に担持されているが、Ｃ末端以外のアミノ酸残基の官能基（例えば、カルボキシル基）を通じて固相合成用樹脂に担持されていてもよい。「固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチド」は、そのＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基がＦｍｏｃ骨格を含む保護基によって保護されている。
　第一のペプチドが担持されている固相合成用樹脂は、本技術分野で既知の任意のものを使用することができ、概して、第一のペプチドの所定のアミノ酸残基（例えば、Ｃ末端のアミノ酸残基）とエステル結合によって連結される。樹脂は、特に、固相合成ハンドブック（メルク株式会社発行、平成１４年５月１日発行）に記載されている酸感受性として「Ｈ（＜５％ＴＦＡ ｉｎ ＤＣＭ）」と判定されている樹脂結合基を有することが好ましく、用いられるアミノ酸側の官能基に合わせて適宜選択することができる。
　例えば、アミノ酸側の官能基としてカルボン酸（主鎖カルボン酸、もしくは、ＡｓｐやＧｌｕに代表される側鎖カルボン酸）、又は、芳香環上のヒドロキシ基（Ｔｙｒに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）もしくは２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｌｔ樹脂）を用いることが好ましい。アミノ酸側の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（ＳｅｒやＴｈｒに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリド樹脂（Ｔｒｔ樹脂）、２－クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｌｔ樹脂）もしくは４－メチルトリチルクロリド樹脂（Ｍｔｔ樹脂）を用いることが好ましい。
　本発明において「Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基」とは、Ｆｍｏｃ基またはＦｍｏｃ基の構成骨格の任意の位置に任意の置換基が導入された基を意味する。このようなＦｍｏｃ骨格を含む保護基として、具体的には下記式（１）で表される保護基が挙げられる
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
（式中、
　Ｒ１～Ｒ８は、独立して、水素、Ｃ１－Ｃ８アルキル、Ｃ１－Ｃ８フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、
　Ｒ９～Ｒ１０は、独立して、水素またはメチルである）。
　Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基としてより具体的には、例えば、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、２，７－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２，７ｔｂ））基、１－メチル－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（１Ｍｅ））基、２－フルオロ－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２Ｆ））基、２，７－ジブロモ－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２，７Ｂｒ））基、２－モノイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｍｉｏ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－ジイソオクチル－Ｆｍｏｃ（ｄｉｏ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－（３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロオクチル）－Ｆｍｏｃ（ｔｄｆ－Ｆｍｏｃ）基、２，７－ビス（トリメチルシリル）－Ｆｍｏｃ（Ｆｍｏｃ（２ＴＭＳ））基、（２－スルホ－９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ（２ｓｏ３ｈ））、［（１Ｓ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）エトキシ］カルボニル基（ｓｍ－Ｆｍｏｃ）、［（１Ｒ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）エトキシ］カルボニル基（ｒｍ－Ｆｍｏｃ）などが挙げられる。これらＦｍｏｃ骨格を含む保護基として好ましくはＦｍｏｃ基である。これらＦｍｏｃ骨格を含む保護基は、市販の試薬などを用い既知の方法により導入することができる。
　本発明において、第一のペプチドを構成するアミノ酸残基の種類および数は限定されず、２以上のアミノ酸残基、例えば、２～３０個、２～２０個、２～１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個のアミノ酸残基を含む、任意のアミノ酸配列を備えるペプチドを第一のペプチドとして利用することができる。前記アミノ酸には天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸を使用することができる。第一のペプチドには、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸が含まれていることが好ましい。
　工程（１）において提供される、固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドは、商業的供給業者から入手するか、あるいは本技術分野で既知の方法、例えば、ＷＯ２０１３／１００１３２やＷＯ２０１８／２２５８６４に示されるような方法を適用することによって製造することができる。
　ある態様において、第一のペプチドはジペプチドである。この場合、該ジペプチドのＣ末端のアミノ酸残基は、通常、エステル結合により固相合成用樹脂に担持されており、以下のスキームに示すように、Ｎ末端のアミノ酸残基の保護基を除去した結果生じる遊離のアミノ基が、該エステル結合中のカルボニル基と反応して、望ましくないＤＫＰが生じることがある。本発明の方法を用いることにより、ＤＫＰ脱離による目的ペプチドの収量低下を抑制することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（式中、Ｒ１～Ｒ４は任意の原子または基を意味し、＊は固相合成用樹脂との結合箇所を意味する。）
　ある態様において、第一のペプチドは、そのＮ末端から２残基目のアミノ酸が、「Ｎ－置換アミノ酸」であるペプチドである。この場合には、以下のスキームに示すように、Ｎ末端のアミノ酸残基の保護基を除去した結果生じる遊離のアミノ基が、Ｎ末端から２残基目と３残基目のアミノ酸の間のペプチド結合中のカルボニル基と反応することがあり、望ましくないＤＫＰやＤＫＰ脱離体、アミジン骨格を有する不純物（６員環状アミジン骨格構造体）が形成され得る。本発明の方法を用いることにより、このようなＤＫＰ、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成を抑制し、目的ペプチドの収率低下を防ぐことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（式中、Ｒ４は水素以外の任意の原子または基を意味し、Ｒ１～Ｒ３およびＲ５～Ｒ８は任意の原子または基を意味し、＊は隣接するアミノ酸残基または固相合成用樹脂との結合箇所を意味する。ここで、Ｒ６が水素である場合には、上記スキームの経路Ａおよび経路Ｂのいずれかの経路を経ることができ、Ｒ６が水素以外である場合には上記スキームの経路Ａのみを経ることができる。）
　本発明における「Ｎ－置換アミノ酸」としては、Ｎ－メチル化などのＮ－アルキル化されているＮ－アルキルアミノ酸や、プロリン類やアゼチジン類などの環状アミノ酸が好ましく例示される。
工程（２）
　本発明の工程（２）は、工程（１）で提供された第一のペプチドを、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶媒中、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程である。
　本発明の工程（２）は、Ｎ末端のアミノ酸残基の保護基の除去に関わる工程である。特定の理論に拘束されるものではないが、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成は、上記のように６員環中間体を経由していると推定される。６員環中間体を経てＤＫＰ脱離するまでのエネルギー計算を実施したところ、溶媒の水素受容能が高いほど配位による安定化が大きく、溶媒の非共有電子対の供与性の指標であるドナーナンバー（ＤＮ）値が重要なパラメータと推定される。ＤＮ値が２６以下の溶媒であるか、または該溶媒を含む場合、上記の６員環中間体を経由する反応が抑制され、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成が軽減される傾向にあると推定される。したがって、工程（２）で用いられる溶媒は、ドナーナンバー（ＤＮ）値が２６以下であるものが好ましい。ある態様において、ＤＮ値は、２６以下、２５以下、２４以下、２３以下、または２２以下、２１以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下であることができる。各溶媒のＤＮ値の指標として、「Eur.Chem.Bull., 2015, 4(2), 92-97」に記載の値を採用することができる。その他、「特開2010-50089」に記載の表、または「化学大辞典 1989,1584-1585」に記載の表、などの値を採用することもできる。また「Journal of the American Chemical Society 1972, 94(5), 1431-1434」、「Chemistry A European Journal 2012, 18(35), 10969-10982」に記載の方法によりＤＮ値を測定することができる。さらに「Chemistryselect 2021, 6(4), 600-608」に記載の方法により混合溶媒のＤＮ値を測定することができる。ＤＮ値として具体的には、トルエン：０．１、ＤＣＭ：１、クメン：６、プロピオン酸メチル：１１、スルホラン：１４．８、ジエチルケトン：１５、酢酸ブチル：１５、酢酸プロピル：１６、ジエチルカーボネート：１６、アセトン：１７、ジメチルカーボネート：１７．２、メチルエチルケトン：１７．４、２－メチルテトラヒドロフラン：１８、ジエチルエーテル：１９．２、テトラヒドロフラン：２０、１，２－ジメトキシエタン：２０、１，３－ジオキソラン：２１．２、リン酸トリメチル：２３、リン酸トリブチル：２３．７、ＤＭＦ：２６．６、ＮＭＰ：２７．３、ＤＭＡ：２７．８、ＤＭＩ：２７．８である。
　ある態様において、工程（２）により得られる第一のペプチドの少なくとも一部は、カルバミン酸塩の形態にある。特定の理論に拘束されるものではないが、工程（２）では、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基の除去にあたり、第一のペプチドの少なくとも一部において、脱炭酸が進行することなくジベンゾフルベンが生成することにより、Ｎ末端のアミノ基が該保護基由来のＣＯＯ－と一緒にカルバミン酸イオン（－ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｏ－、ここでＲは水素またはアミノ基の任意の置換基である）を形成し、これが系中のプロトン化された塩基との間でカルバミン酸塩を形成している（以下は、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基としてＦｍｏｃを、塩基としてＤＢＵを用いた場合のカルバミン酸塩の形成を示すスキームである）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　カルバミン酸塩が形成されると末端アミノ基の分子内求核反応を抑制することができ、塩基性の脱保護条件下であっても、６員環中間体の形成が抑制され、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の副生が軽減されると推定される。
　工程（２）において共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を用いる本発明の方法では、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の形成を有意に低減できる程度の量の第一のペプチドがカルバミン酸塩として存在し得る。例えば、本発明の方法では、カルバミン酸塩とさらに脱炭酸が進行して生じるアミン体とのモル比（カルバミン酸塩／アミン体）が、０．６以上、０．８以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、４．６以上、５．０以上、６．０以上、８．０以上、または１０．０以上となる量でカルバミン酸塩が形成し得る。斯かるモル比は、例えば、１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めることができる。
　カルバミン酸塩は共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である任意の塩基との塩であり得る。このような塩として、具体的には、例えば、ＤＢＵ塩、ＴＭＧ塩、ＨＰ１（ｄｍａ）塩、ＭＴＢＤ塩、Ｐ１－ｔＢｕ塩、またはＰ２－Ｅｔ塩などが好ましく例示される。
　ある態様において、工程（２）に用いられる溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒の少なくとも１種を含んでいればよく、単独溶媒でも、混合溶媒でもよい。混合溶媒の場合、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒の総量として溶媒全体の２５ｖ／ｖ％以上、５０ｖ／ｖ％以上、または７５ｖ／ｖ％以上含むことが好ましく、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を２５ｖ／ｖ％以上、５０ｖ／ｖ％以上、または７５ｖ／ｖ％以上含むことがより好ましい。
　工程（２）に芳香族炭化水素系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられ、好ましくは、トルエン、クメンである。
　工程（２）にハロゲン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタンである。
　工程（２）にエーテル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル（ＣＰＭＥ）、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられ、好ましくは、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソランである。
　工程（２）にエステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ―バレロラクトンなどが挙げられ、好ましくは、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルである。
　工程（２）にケトン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、アセトン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトン（３－ペンタノン）などが挙げられ、好ましくは、メチルエチルケトン、ジエチルケトンである。
　工程（２）にカーボネート系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられ、好ましくは、ジメチルカーボネートである。
　工程（２）にリン酸エステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられ、好ましくはリン酸トリブチルである。
　工程（２）に用いられる溶媒が混合溶媒である場合、混合溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒から選択される少なくとも１種、または、２種もしくはそれ以上の溶媒からなっていてもよく、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒に加えて、アミド系溶媒、ウレア系溶媒、またはスルホン系溶媒より選択される1種または複数種の溶媒が含まれていてもよい。
　工程（２）にアミド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられる。
　工程（２）にウレア系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられる。
　工程（２）にスルホン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　工程（２）で用いられる溶媒が、単独溶媒である場合、該溶媒として、トルエン、クメン、１，２－ジクロロベンゼン、ベンゼン、アニソール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、リン酸トリメチル、またはリン酸トリブチルが好ましい。
　ある態様において、工程（２）で用いられる溶媒は、固相樹脂の膨潤能が1.5mL/g以上、2.0mL/g以上、2.5mL/g以上、3.0mL/g以上、3.5mL/g以上、または4.0mL/g以上であることが好ましい。各溶媒の固相樹脂の膨潤能の指標として、「Tetrahedron Lett., 1998, 39, 8951-8954」、「Org. Process Res Dev. 2018, 22, 494-503」、「RSC Adv., 2020, 10, 42457-42492」に記載の値を採用することができる。固相樹脂の膨潤能（ｍＬ／ｇ）として具体的には、ＤＭＩ：８．５、ＤＭＰＵ： ８．０、ＮＭＰ：６．４、ＴＨＦ：６．０、ＤＭＡ：５．８、ＣＨＣｌ３：５．６、ＣＰＭＥ：５．６ 、ＣＨ２Ｃｌ２：５．４、２－メチルテトラヒドロフラン： ５．４、ＤＭＦ：５．２、酢酸ブチル： ５．２、ＤＭＥ：４．８、ＭＥＫ：４．４、トルエン：４．０、ＡｃＯＥｔ：４．２、キシレン：３．０、Ｅｔ２Ｏ：２．８、ジメチルカーボネート：２，８、ＭＴＢＥ：２．４、ＣＨ３ＣＮ：２．０、リン酸トリブチル：１．６、ＭｅＯＨ：１．６、Ｈ２Ｏ：１．６である。その他、「Green Chem., 2017, 19, 952-962」に記載の表、または「Green Chem., 2020, 22, 996-1018」のtable 2の判定等を採用することもできる。
　工程（２）では、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基を少なくとも含む、１種または複数種の塩基が用いられる。塩基を１種類のみ使用する場合、その塩基は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基である。一方、複数種類の塩基を使用する場合、そのうちの少なくとも１種は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基であり、その他の塩基は、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基であっても、２３未満の塩基であってもよい。
　工程（２）に用いられる、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基としては、ｐＫａが３４以下、好ましくは３０以下、より好ましくは２８以下の塩基であってもよい。
　ｐＫａは、塩基性の程度を表す指標であり、ｐＫａが大きいほど、塩基性が高い。なお、本発明において、有機塩基の共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａ（ＣＨ３ＣＮ）として、「New J.Chem.2009,33,588」１)または「Sigma-Aldrich, Phosphazene Bases： https://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemical-synthesis/technology-spotlights/phosphazenes.html」２)または「Eur. J. Org. Chem. 2019, 6735-6748」に示された値等を採用してもよい。
　共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基としては、アミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類などが挙げられ、例えば、以下に列挙した塩基のｐＫａはいずれも２３以上である。
ＤＢＵ：ｐＫａ１）＝２４．３
ＤＢＮ：ｐＫａ１）＝２３．８
ＴＭＧ：ｐＫａ１）＝２３．３
ＴＢＤ：ｐＫａ１）＝２６．０
ＭＴＢＤ：ｐＫａ１）＝２５．５
Ｐ２ｔＢｕ：ｐＫａ１）＝３３．５
Ｐ２Ｅｔ：ｐＫａ１）＝３２．９
ＨＰ１（ｄｍａ）：ｐＫａ１）＝２５．９
ＢＴＰＰ：ｐＫａ２）＝２８．４
Ｐ１ｔＢｕ：ｐＫａ１）＝２７．０
ＢＥＭＰ：ｐＫａ２）＝２７．６
　本工程において、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基が複数種使用される場合、例えば、前述のアミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類から選択される複数種、例えば２種類の塩基を組み合わせて用いることができる。このような塩基の具体的な組み合わせとして、ＤＢＵとＭＴＢＤ、ＤＢＵとＨＰ１（ｄｍａ）、ＤＢＵとＰ１ｔＢｕ、ＤＢＵとＰ２Ｅｔなどが好ましく例示される。
　本工程において、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基と２３未満の塩基が組み合わせて用いられる場合、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上の塩基は、例えば、前述のアミジン類、グアニジン類、またはホスファゼン類から選択されることができる。また、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満の塩基は、ピペリジン、ピペラジン、モルホリンより選択されることが好ましい。このような塩基の具体的な組み合わせとして、ＤＢＵとピペリジンなどが好ましく例示される。
　ある態様において、工程（２）は、工程（３）の前に複数回繰り返すこともできる。この場合、工程（２）の各回において、同じ溶媒および／または同じ塩基を用いても、異なる溶媒および／または異なる塩基を用いてもよい。本発明において、同じ溶媒とは、溶媒の種類および溶媒の混合割合が同一であることを意味し、異なる溶媒とは、溶媒の種類および溶媒の混合割合のいずれかまたは両方が異なることを意味する。また、本発明において、同じ塩基とは、塩基の種類および溶媒中での塩基の濃度が同一であることを意味し、異なる塩基とは、塩基の種類および溶媒中での塩基の濃度のいずれかまたは両方が異なることを意味する。
　ある態様において、工程（２）が複数回含まれる場合、本発明の方法は、工程（２）の各回の間に溶液を排出する工程を含んでいてもよい。これにより、１回前の工程（２）で用いられた溶媒および／または塩基を次の回の工程（２）で用いられる溶媒および／または塩基に置き換えることができる。
　ある態様において、本発明の方法は、工程（２）に先立って、第一のペプチドを共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満である単一の塩基、例えばピペリジンで処理する工程を含まない。具体的には、工程（１）において提供された第一のペプチドを例えば、任意の溶媒（例えば、ＤＭＦ中）、単独の塩基として共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３未満である塩基（例えば、ピペリジン）を用いて、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを処理し、その後に本発明の工程（２）を行う（例えば、トルエンを含む溶媒中でＤＢＵやＤＢＵとピペリジンの組み合わせで処理する）といった態様は、本発明から除外され得る。
　ある態様において、工程（２）で用いられる塩基は、本工程の反応が進行し得る任意の濃度で溶媒中に含まれ得る。このような濃度の範囲として具体的には、例えば、０．２５～２０ｖ／ｖ％、０．５～２０ｖ／ｖ％１～２０ｖ／ｖ％、１～１５ｖ／ｖ％、１～１０ｖ／ｖ％、１～９ｖ／ｖ％、１～８ｖ／ｖ％、１～７ｖ／ｖ％、１～６ｖ／ｖ％、１～５ｖ／ｖ％、１～４ｖ／ｖ％、１～３ｖ／ｖ％、１～２ｖ／ｖ％などが挙げられ、１～８ｖ／ｖ％が好ましい。
　ある態様において、工程（２）は、溶媒にＣＯ２を接触させる工程をさらに含むことができる。また、ある態様において、工程（２）に用いられる溶媒は、該工程に先立ってＣＯ２を接触させた溶媒であることができる。溶媒とＣＯ２との接触は、例えば、溶媒にＣＯ２をバブリングすることにより行うことができる。工程（２）中にあるいは工程（２）の前に溶媒とＣＯ２とを接触させることで、反応系にＣＯ２を含ませることができる。特定の理論に拘束されるものではないが、工程（２）では、第一のペプチドの少なくとも一部において、Ｎ末端のアミノ基が該保護基由来のＣＯＯ－とプロトン化された塩基と一緒にカルバミン酸塩を形成しているところ、反応系にＣＯ２を含ませることにより、反応系中のアミン体をより容易にカルバミン酸塩に変換させることができる。したがって、反応系にＣＯ２を含ませることにより、反応中のアミン体をさらに低減し、末端アミノ基の分子内求核反応をさらに抑制することができ、塩基性の脱保護条件下であっても、６員環中間体の形成がさらに抑制され、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の副生がさらに軽減されると推定される。
　ある態様において、工程（２）の反応は、－１００℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０～５０℃で行うことができる。また、工程（２）の反応は、１分～１週間、好ましくは、１分～３時間、３分～３時間、５分～３時間、さらに好ましくは、１分～２０分、３分～２０分、５分～２０分の反応時間で行うことができる。
工程（３）
　本発明の工程（３）は、工程（２）の後に、第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程である。本工程では、第一のペプチドのＮ末端のアミノ基と、カルボン酸のカルボキシル基とが縮合することで、第三のペプチドが合成される。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸は、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸であることができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸類縁体は、カルボン酸の活性エステルであるか、またはカルボン酸の酸ハロゲン化物であることができる。
　保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸のそれぞれの活性エステルを使用することで、縮合剤なしに工程（３）の縮合反応を行うことができる。活性エステルとして具体的には、これら化合物中のカルボニル基、とりわけ第二のペプチドの場合には、そのＣ末端のアミノ酸残基に含まれるカルボニル基に、アミンとの反応を促進し得る基、たとえばＯ－（ベンゾトリアゾールー１－イル）基（ＯＢｔ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾールー１－イル）基（ＯＡｔ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＯＳｕ）、ペンタフルオロフェノキシ基（ＯＰｆｐ）、またはＳ－Ｒ１１（Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいアルキレン基を示す。)などが結合したものが挙げられる。
　保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸のそれぞれの酸ハロゲン化物を使用することで、縮合剤なしに工程（３）の縮合反応を行うことができる。酸ハロゲン化物として具体的には、これら化合物中のカルボキシル基、とりわけ第二のペプチドの場合には、そのＣ末端のアミノ酸残基に含まれるカルボキシル基が、クロロカルボニル基、フルオロカルボニル基、ブロモカルボニル基、ヨードカルボニル基などに変換されたものが挙げられる。
　工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体、例えば、アミノ酸や第二のペプチドが保護基を有する場合、該保護基は、カルバメート系保護基、スルホニル系保護基、またはアシル系保護基であることができる。
　本明細書において、カルバメート系保護基とは、カルバメート構造を構成する保護基を意味し、例えば、Ｆｍｏｃ骨格を有する保護基、Ａｌｌｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）などがこれに含まれる。スルホニル系保護基とは、スルホニル構造を含む保護基を意味し、例えば、メタンスルホニル（Ｍｓ）基、ｐ－トルエンスルホニル（Ｔｓ）基、２－ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）基、トリフルオロメタンスルホニル（Ｔｆ）基、（２－トリメチルシリル）－エタンスルホニル（ＳＥＳ）基などがこれに含まれる。アシル系保護基とは、アシル構造を含む保護基を意味し、例えば、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）基などがこれに含まれる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体がＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸である場合、該Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸には、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基で保護されている任意の天然または非天然アミノ酸を用いることができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体がＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドである場合、該Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドは、そのＮ末端のアミノ酸がＦｍｏｃ骨格を含む保護基で保護されていれば、該ペプチドを構成するアミノ酸残基の種類および数は限定されず、２以上の天然および／または非天然アミノ酸残基を含む、任意のアミノ酸配列を備えるペプチドを利用することができる。第二のペプチドは、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸を含むことが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられるカルボン酸またはカルボン酸類縁体が、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、Ｃ６－Ｃ１０アリールカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物である場合、これらは、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、ジアルキルアミノ、シアノ、アルコキシカルボニル、およびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい。Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物として好ましくは、Ｃ１－Ｃ４アルキルカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物であり、具体的には、例えば、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、もしくはペンタン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物などが挙げられる。Ｃ６－Ｃ１０アリールカルボン酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物として、具体的には、例えば、安息香酸、もしくはナフトエ酸、またはその活性エステルもしくは酸ハロゲン化物などが挙げられる。
　工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量のＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸またはＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドを用いることができる。
　ある態様において、第一のペプチド、および／またはＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドは、Ｎ－置換アミノ酸を少なくとも１つ含むことが好ましい。また、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸は、Ｎ－置換アミノ酸であることが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられるアミノ酸または第二のペプチドが有するＦｍｏｃ骨格を含む保護基は、工程（１）で用いられる第一のペプチドが有するＦｍｏｃ骨格を含む保護基と同一であっても、異なっていてもよい。
　ある態様において、工程（３）に用いられる溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒の少なくとも１種を含んでいればよく、単独溶媒でも、混合溶媒でもよい。混合溶媒の場合、工程（３）において用いられる溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒の少なくとも１種を２５ｖ／ｖ％以上、５０ｖ／ｖ％以上、または７５ｖ／ｖ％以上含むことが好ましい。
　工程（３）に芳香族炭化水素系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、クメンなどが挙げられ好ましくは、トルエン、クメンである。
　工程（３）にハロゲン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、四塩化炭素などが挙げられ、好ましくは、ジクロロメタンである。
　工程（３）にエーテル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，３－ジオキソラン、１，２－ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、テトラグリムなどが挙げられ、好ましくは、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソランである。
　工程（３）にアミド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、Ｎ－ブチルピロリドン（ＮＢＰ）、ホルムアミドなどが挙げられ、好ましくは、ＤＭＦ、ＮＭＰである。
　工程（３）にスルホキシド系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルフェニルスルホキシドなどが挙げられ、好ましくは、ＤＭＳＯである。
　工程（３）にスルホン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジフェニルスルホン、ジメチルスルホン、ジエチルスルホン、スルホラン、３－メチルスルホラン、エチルメチルスルホン、エチルイソプロピルスルホンなどが挙げられる。
　工程（３）にウレア系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）などが挙げられ、好ましくは、ＤＭＩである。
　工程（３）にエステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、γ―バレロラクトンなどが挙げられ、好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルである。
　工程（３）にケトン系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、ジエチルケトンなどが挙げられ、好ましくは、メチルエチルケトン、ジエチルケトンである。
　工程（３）にカーボネート系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、ジブチルカーボネートなどが挙げられ、好ましくは、ジメチルカーボネートである。
　工程（３）にリン酸エステル系溶媒が用いられる場合、該溶媒として具体的には、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチルなどが挙げられ、好ましくはリン酸トリブチルである。
　工程（３）に用いられる溶媒が混合溶媒の場合、混合溶媒は、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、アミド系溶媒、スルホキシド系溶媒、スルホン系溶媒、ウレア系溶媒、エステル系溶媒ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、またはリン酸エステル系溶媒から選択される２種またはそれ以上の溶媒からなっていてもよく、これら以外の任意の溶媒が含まれていてもよい。
　工程（３）で用いられる溶媒が、単独溶媒である場合、該溶媒として、トルエン、クメン、１，２－ジクロロベンゼン、ベンゼン、アニソール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＳＭＯ、ＤＭＩ、ＤＭＰＵ、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、ジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、リン酸トリメチル、リン酸トリブチル、スルホラン、または３－メチルスルホランが好ましい。
　ある態様において、工程（３）に用いられる溶媒は、工程（２）に用いられる溶媒と同一であることもできる。
　工程（３）に用いられる溶媒としては、縮合剤が溶解可能なものが好ましく用いられる。本発明では、工程（２）に用いた塩基が残存していることがあるが、この残存塩基に起因して、アミノ酸あるいはペプチドが過剰に伸長した副生成物が生じる場合がある。縮合剤が溶解可能な溶媒を工程（３）に用いた場合には、かかる過剰伸長体の形成を抑制することができる。
　ある態様において、工程（３）に用いられる縮合剤は、塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがＰＦ６ －またはＢＦ４ －である。このような縮合剤として、具体的には、ＰｙＯｘｉｍ（［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＡＯＰ（（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸）、ＣＯＭＵ（（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＡＴＵ（Ｏ－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＢＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＣＴＵ（Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＤＢＴＵ（Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）、ＨＯＴＵ（Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）、ＴＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩）、ＴＢＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩）、ＴＣＴＵ（Ｏ－（６－クロロ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）、およびＴＯＴＵ（Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩）などが挙げられる。
　工程（３）に用いられる縮合剤は、ＰｙＯｘｉｍ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＣＯＭＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＤＢＴＵ、ＨＯＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＣＴＵ、およびＴＯＴＵからなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましく、これらのいずれか１種を用いることがより好ましい。
　工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量の縮合剤を用いることができる。
　ある態様において、工程（３）の縮合反応は、塩基の存在下で行うことができる。縮合反応の進行に寄与するものであれば、塩基の種類は限定されないが、共役酸の水中でのｐＫａが５～１２の塩基が好ましく、このような塩基として具体的には、例えば、ＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、２，６－ルチジン、２，４，６－トリメチルピリジン、ピリジンなどが挙げられる。工程（３）では、第一のペプチドに対して１当量～２０当量、好ましくは２当量～１０当量の塩基を用いることができる。なお、塩基の共役酸の水中でのｐＫａは、例えばAdvanced Chemistry Development (ACD/Labs) Software V11.02 ((c)1994-2020 ACD/Labs)にて計算される値等を使用することができる。
　ある態様において、本発明は、工程（２）と工程（３）の間に、酸を加えて残存する塩基を中和する工程を含まない。固相法によりペプチド鎖を伸長する場合、一般に、伸長工程に先立つ脱保護工程に用いた塩基の残存は望ましくないと考えられていることから、脱保護工程と伸長工程の間に残存塩基を酸で中和することがある。しかしながら、予想外なことに、本発明においては、そのような中和はかえってＤＫＰ体の生成に繋がり、中和工程が効率的な反応の進行に寄与しないことが見出された。特定の理論に拘束されるものではないが、酸を加えることにより、形成していたカルバミン酸塩を分解してアミン体に変換され、６員環中間体を経由して、ＤＫＰ脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の副生が増加したと推定される。
　ある態様において、本発明は、工程（２）と工程（３）の間に、固相合成用樹脂を洗浄する工程をさらに含んでいてもよい。樹脂の洗浄には、任意の溶媒を用いることができ、例えば、工程（２）に用いた溶媒を用いることが好ましい。樹脂の洗浄は、同じ溶媒あるいは異なる溶媒で複数回行うことができる。
　ある態様において、固相合成用樹脂を洗浄する工程では、該工程に先立ってＣＯ２を接触させた溶媒（例えば、ＣＯ２ガスを用いてバブリングした溶媒）を使用してもよく、ＣＯ２を接触させていない溶媒を使用してもよく、ＣＯ２を接触させた溶媒と接触させていない溶媒とを組み合わせて使用してもよい。洗浄を複数回行う場合には、事前にＣＯ２を接触させた溶媒で１回もしくは複数回、樹脂を洗浄し、次いで事前にＣＯ２を接触させていない溶媒で１回もしくは複数回、樹脂を洗浄することが好ましい。
　ある態様において、工程（３）の反応は、－１００℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０～６０℃で行うことができる。また、工程（３）の反応は、１分～１週間、好ましくは、３０分～２０時間の反応時間で行うことができる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、前記工程（１）～工程（３）を経て製造される第三のペプチドを含むものである。この場合、本発明の方法によって製造されるペプチドは、第三のペプチドに加えて、任意のアミノ酸を任意の数でさらに含むことができる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、前記工程（１）～工程（３）を経て製造される第三のペプチドであることもできる。
　ある態様において、本発明の方法によって製造されるペプチドは、Ｎ－置換アミノ酸を少なくとも１つ、または、２つ以上、３つ以上、４つ以上もしくは５つ以上含むことができる。前記Ｎ－置換アミノ酸としては、Ｎ－アルキルアミノ酸、好ましくはＮ－メチルアミノ酸であることができる。
　ある態様において、本発明の方法は、ペプチド鎖の伸長工程の後に、固相合成用樹脂からのペプチドの切り出し工程を含んでもよい。切り出し工程には、本技術分野に既知の方法や、本実施例に記載の方法を用いることができる。
　ある態様において、本発明は、前記工程（１）および前記工程（２）を含む、固相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法にも関する。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明の内容を以下の実施例、比較例及び参照例でさらに説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。全ての出発物質および試薬は商業的供給業者から入手、もしくは公知の方法を用いて合成した。
　実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ：酢酸アンモニウム
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル基
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル基
ＣＯＭＵ：（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＣＥ：１，２－ジクロロエタン
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
ＤＭＥ：１，２－ジメトキシエタン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＩ：１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン
ＤＫＰ：ジケトピペラジン
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣＩ・ＨＣｌ：１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＦＡ：ギ酸
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
ＨＯＡｔ：１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＯＢｔ：３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン
ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＢＴＵ：Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＣＴＵ：Ｏ－（１Ｈ－６－クロロ－１－イル）－１、１、３、３ －テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＯＴＵ：Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＨＰ１（ｄｍａ）：イミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン
ＭＥＫ：メチルエチルケトン
ＭＴＢＤ：７－メチル－１，５，７－トリアザビシクロ［４．４．０］デカ－５－エン
ＮＭＰ：Ｎ－メチル－２－ピロリドン
Ｎｓ：２－ニトロベンゼンスルホニル基
Ｏｘｙｍａ：シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル
ｐｉｐ：ピペリジン
Ｐ１ｔＢｕ：ｔ－ブチルイミノ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホラン
Ｐ２Ｅｔ：テトラメチル（トリス（ジメチルアミノ）ホスホラニリデン）リン酸トリアミド－エチルイミン
ＰｙＡＯＰ：（７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＰｙＯｘｉｍ：［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ－１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩
ＴＢＭＥ：ｔ－ブチルメチルエーテル
Ｔｅｏｃ：２－トリメチルシリルエトキシカルボニル基
ＴＥＳ：トリエチルシラン
Ｔｆａ：トリフルオロアセチル基
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ：２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＨＰ：テトラヒドロピラニル基
ＴＭＧ：１，１，３，３－テトラメチルグアニジン
ＴＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩
ＴＢＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドテトラフルオロホウ酸塩
ＴＣＴＵ：Ｏ－（６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＤＢＴＵ：Ｏ－（３，４－ジヒドロ－４－オキソ－１,２,３－ベンゾトリアジン－３－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＯＴＵ：Ｏ－［（エトキシカルボニル）シアノメチレンアミノ］－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
　ＬＣＭＳの分析条件は表１に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例１：　本実施例中で使用するアミノ酸やレジンに担持されたペプチド等の調製
実施例１－１：ペプチド合成機によるペプチド合成に用いるＦｍｏｃ－アミノ酸
　本明細書内に記載するペプチド合成において、ペプチド合成機による合成には表２～表４に記載するＦｍｏｃ－アミノ酸を用いた。
　表２記載のＦｍｏｃ－アミノ酸はＷＯ２０１８／２２５８６４およびＷＯ２０２１／０９０８５６に記載の方法に従って合成した。
　表３記載のＦｍｏｃ－アミノ酸は商業的供給業者から購入した。
　表４記載のＦｍｏｃ－アミノ酸は以下に示すスキームのとおり合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
化合物ａａ３－１、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　窒素雰囲気下、市販の（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ，化合物ａａ３－１－ａ）（３ｇ、７．７２ｍｍｏｌ）のトルエン溶液（１０．５ｍＬ）にパラホルムアルデヒド（６９６ｍｇ、２３．１７ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（５．３６ｍＬ、６９．５ｍｍｏｌ）を加え、４０℃にて２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮することで粗生成物である化合物ａａ３－１－ｂ（２．９５ｇ、９５％）を得た。これ以上の精製を行わずに次の反応に用いた。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　窒素雰囲気下、上記の粗生成物である化合物ａａ３－１－ｂ（２．９５ｇ）の１，２－ジクロロエタン（ＤＣＥ）（１５．５ｍＬ）溶液にトリエチルシラン（ＴＥＳ）（１０．５９ｍＬ、６６．３ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１５．３２ｍＬ、１９９ｍｍｏｌ）を室温にて加え、７０℃にて５時間攪拌した。反応液を室温に冷却し、減圧下溶媒を留去することで得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解し、ｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘキサン＝９／１（４０ｍＬ）を加え、攪拌した。この混合物を冷蔵庫で３０分冷却した後、生じた固体をろ過し、ｔ－ブチルメチルエーテル／ｎ－ヘキサン＝９／１（３０ｍＬ）で３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。得られた粗生成物をＤＣＭ（５０ｍＬ）に懸濁させ、３ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液（４５ｍＬ，１．５ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む）を加えて撹拌し、水層を除いた後に有機層を３ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム水溶液（４５ｍＬ，１．５ｍｏｌ／Ｌの食塩を含む）で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して得られた残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水／アセトニトリル）にて精製することで、化合物ａａ３－１、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］－３－ピリジン－３－イルプロパン酸、Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－ＯＨ）を得た（２．６７ｇ，９０％）。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ３－２、（２Ｓ）－３－ ［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－２－（２－トリメチルシリルエトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　窒素雰囲気下、市販の（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）プロパン酸（Ｈ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ，化合物ａａ３－２－ａ）(２．００ｇ、８．５８ｍｍｏｌ)を水（１２．０ｍＬ）に溶解させた後、トリエチルアミン（２．３８ｍＬ、１７．１５ｍｍｏｌ）と１，４－ジオキサン（１０．０ｍＬ）の混合溶液を加え、室温にて１０分攪拌した。その後、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（２－（トリメチルシリル）エチル）カーボネート（２．４５ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液に２－メチルテトラヒドロフラン（５ｍＬ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で２回洗浄した。得られた有機層を飽和硫酸水素カリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄した後、１０％塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後にろ過を行った。得られた溶液を減圧下濃縮することで、化合物ａａ３－２、２Ｓ）－３－ ［４－（トリフルオロメチル）フェニル］ －２－（２－トリメチルシリルエトキシカルボニルアミノ）プロパン酸（Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－ＯＨ）を得た。（２．８８ｇ，８９％）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３７６（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ３－３、（２Ｓ）－２－（アリルオキシカルボニルアミノ）－３－フェニルプロパン酸（Ａｌｌｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　Ｌ－フェニルアラニン（１．００ｇ，６．０５ｍｍｏｌ）に対し５０％１，４－ジオキサン水溶液（２０ｍＬ）を加え混合した後、炭酸水素ナトリウム（１．２７ｇ，１５．１ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。混合液を氷浴で冷却しながらクロロギ酸アリル（０．９７ｍＬ，９．１ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌した後、ジクロロメタン（１０ｍＬ、１０ｖ／ｗ）で希釈しリン酸（０．５３ｍＬ、１．５当量）を加え水層を酸性にし、有機層と水層を分離した。水層を更にジクロロメタン（５ｍＬ、５ｖ／ｗ）で洗浄した後、得られた有機層を半飽和食塩水（１５ｍＬ、１５ｖ／ｗ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後にろ過を行い、溶液を減圧下濃縮した。得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％－ギ酸入りアセトニトリル／０．１％－ギ酸入り蒸留水）にて精製し、集めたフラクションを逆相カラムクロマトグラフィー（無添加－アセトニトリル／蒸留水）にて精製することで化合物ａａ３－３、（２Ｓ）－２－（アリルオキシカルボニルアミノ）－３－フェニルプロパン酸（Ａｌｌｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ）（０．５２ｇ、３５％）を得た。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２４８（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
化合物ａａ３－４、２－メチル－２－［（２－ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロパン酸（Ｎｓ－Ａｉｂ－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　市販の２－アミノ－２－メチルプロパン酸メチルエステル塩酸塩（４．０ｇ、２６．０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０．９２ｍＬ、６２．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（２２．１ｍＬ）に２－ニトロベンゼンスルホニルクロリド（６．９３ｇ、３１．２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（３０．０ｍＬ）を氷浴で冷却しながら加え、０℃で５分間攪拌した後、室温で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、粗生成物ａａ３－４－ｂを得た。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３０１（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　得られた粗生成物ａａ３－４－ｂ（３．６３ｇ）のＴＨＦ／メタノール溶液（１／１、５２ｍＬ）に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２６ｍＬ）を氷浴で冷やしながら加え、０℃で５分間攪拌した後、室温で５時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後、得られた残渣を４Ｎ塩酸（３０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を留去した。混合物を酢酸エチルで２回抽出した後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後にろ過を行い、溶液を減圧下濃縮した。得られた粗生成物を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％－ギ酸入りアセトニトリル／０．１％－ギ酸入り蒸留水）にて２回精製することで、化合物ａａ３－４、２－メチル－２－［（２－ニトロフェニル）スルホニルアミノ］プロパン酸（Ｎｓ－Ａｉｂ－ＯＨ）（２．４６ｇ、７１％）を得た。
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２８７（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例１－２：本実施例中で使用するレジンに担持されたアミノ酸およびペプチド等の調製
実施例１－２－１：（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ、化合物１－２－１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　本明細書では、ポリマーやレジンと化合物が結合した場合、ポリマーやレジン部位を〇にて表記する場合がある。また、レジン部位の反応点を明確にさせる目的で、〇に接続させて反応部位の化学構造を表記させる場合がある。例えば、上記の構造（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－１））では、レジンの２－クロロトリチル基がＡｓｐの側鎖カルボン酸とエステル結合を介して結合している。なお、ｐｙｒｒｏとはピロリジンを意味し、上記の構造ではＣ末端のカルボン酸基がピロリジンとアミド結合を形成している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　窒素雰囲気下、０℃にてＤＭＦ（６００ｍＬ）にＥＤＣＩ・ＨＣｌ（６７．１ｇ，３５０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（４３．３ｇ，３２１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（１２０ｇ，２９２９ｍｍｏｌ）を順に加え、０℃で１時間攪拌した。反応液に酢酸エチル（１０ｖ）と０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水（２ｖ）を０℃で加え、有機層を分離した。得られた有機層を０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸水、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（１／１（ｖ／ｖ））、飽和食塩水／水（１／１（ｖ／ｖ））で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下溶媒留去して化合物１－２－１－ａを粗生成物として得た。（１３７．１ｇ，ｑｕａｎｔ．）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４６５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．０５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
　氷冷下にて、化合物１－２－１－ａ（１３７ｇ，３９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１３７ｍＬ）溶液にＴＦＡ（２７１ｍＬ）を内温が１０℃を超えないようにゆっくり加えた。室温で１時間撹拌後、ジイソプロピルエーテル（３．４Ｌ）を４回に分けて加え、析出した固体をろ取し、乾燥して化合物１－２－１－ｂ（（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸，Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ）を得た。（１０８．４ｇ，９０％）
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４０９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８３分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
　Ｆｍｏｃアミノ酸のレジンへの担持反応は、ＷＯ２０１３／１００１３２もしくはＷＯ２０１８／２２５８６４に記載の方法に従って行った。フィルター付きの反応容器に２－クロロトリチルクロライドレジン（１．６０ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、４８．７ｇ）と脱水ジクロロメタン（５００ｍＬ）を入れ、室温にて２０分間振とうした。窒素圧をかけてジクロロメタンを除いた後、化合物１－２－１－ｂ（１５．９１ｇ） と脱水ジクロロメタン（３５０ｍＬ）に脱水メタノール（１２．６３ｍＬ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３２．６ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、６０分間振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、脱水ジクロロメタン（３５０ｍＬ）に脱水メタノール（９７．３ｍＬ）とジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３２．６ｍＬ）を加えた混合液を反応容器に添加し、１時間３０分振とうした。窒素圧をかけて反応液を除いた後、ジクロロメタン（３５０ｍＬ）を入れ５分間振とうした後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このジクロロメタンでのレジンの洗浄を５回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、（３Ｓ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－４－オキソ－４－ピロリジン－１－イルブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ、化合物１－２－１、５９．７９ｇ）を得た。
　担持率の確認のため、得られた化合物１－２－１（１２．６ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えて、室温にて１時間振とうした。その後、ＤＢＵ（４０μＬ）を加えて３０℃で３０分間振とうした。その後、反応混合液にＤＭＦ（８ｍＬ）を加え、その溶液１ｍＬをＤＭＦ（１１．５ｍＬ）で希釈した。得られた希釈溶液の吸光度（２９４ｎｍ）を測定し（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶ－１６００ＰＣ（セル長１．０ｃｍ）を用いて測定）、化合物１－２－１ の担持量を０．４６４ｍｍｏｌ／ｇと算出した。
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットについてもペプチド合成や検討等に使用した。
実施例１－２－２：（Ｓ）－３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)－４－オキソ－４－(ピペリジン－１－イル)ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ、化合物１－２－２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　（Ｓ）－３－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－オキソ－４－（ピペリジン－１－イル）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（化合物１－２－２、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ）は、文献記載の方法にて合成した（文献：国際公開番号 ＷＯ ２０１３／１００１３２　Ａ１）。なお、ｐｉｐとはピペリジンを意味し、上記の構造ではＣ末端のカルボン酸基がピペリジンとアミド結合を形成している。
実施例１－２－３：（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ、化合物１－２－３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　商業的供給業者より購入した（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ）（７．１ｇ，２１．８２ｍｍｏｌ）と２－クロロトリチルクロライドレジン（１．６ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、２７．２５ｇ、４３．６ｍｍｏｌ）を用い、化合物１－２－１の合成と同様の手法にて、化合物１－２－３、（３Ｒ）－３－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）ブタン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）を得た。（３３．４４ｇ，担持量０．５９８ｍｍｏｌ／ｇ）
　なお、同様に合成した担持量が異なる別ロットにおいても本実施例におけるペプチド合成に使用した。
実施例１－２－４：（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］プロパン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ、化合物１－２－４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　商業的供給業者より購入した（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］プロパン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ）（１．０ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）と２－クロロトリチルクロライドレジン（１．２５ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ、４．９２ｇ、６．１５ｍｍｏｌ）を用い、化合物１－２－１の合成と同様の手法にて、化合物１－２－４、（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル（メチル）アミノ］プロパン酸－２－クロロトリチルレジン（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）を得た。（５．４２ｇ、担持量０．５１４ｍｍｏｌ／ｇ）
実施例１－２－５：本実施例中にて使用する固相担持されたペプチド化合物（化合物１－２－５～化合物１－２－１２）の調製
　本実施例中にて使用する化合物１－２－５から化合物１－２－１２の調製は、ペプチド合成機（Multipep RS；　Intavis社製）を用いて、Ｆｍｏｃ法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　目的とするペプチドを構成するＦｍｏｃ保護アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とカルボン酸の活性化剤としてＨＯＡｔもしくはＯｘｙｍａもしくはＨＯＯＢｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）をＮＭＰに溶解させて溶液１を調製した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸もしくはＨＯＯＢｔが難溶の場合、２０％となるようＤＭＳＯを添加して溶液１を調製した。Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１０ｖ／ｖ％）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合し、溶液２を調製した。
　実施例１－２－１～１－２－３にて調製したＮ末端がＦｍｏｃ基で保護されたアスパラギン酸の側鎖カルボン酸部位、もしくはＮ末端がＦｍｏｃ基で保護されたアミノ酸の主鎖カルボン酸部位が結合した２－クロロトリチルレジン（化合物１－２－１から化合物１－２－３）（１カラムあたり１００ｍｇ）を固相反応容器に加え、ペプチド合成機にセットした。このレジン（１００ｍｇ）にジクロロメタン（ＤＣＭ）（１．０ｍＬ）を加えて３０分程度静置することでレジンの膨潤を行った。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）にて２回洗浄した。
脱Ｆｍｏｃ工程
　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。１残基目の脱保護においては４．５分間反応させ、２残基目以降の脱保護においては１０分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。続いてＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回、ＤＩＰＥＡ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．１４ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＦに溶かした溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）で１回、ＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。
伸長工程
　溶液１（１カラムあたり０．３ｍＬ）と溶液２（１カラムあたり０．３６ｍＬ）を合成機のｍｉｘｉｎｇ　ｖｉａｌで混合した後に、レジンに添加し、固相反応容器を４０℃から難伸長配列の場合は６０℃まで加温し、２．５時間から難伸長配列の場合は１４時間反応することでレジン上のアミノ基とＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。伸長効率が低い場合、このＦｍｏｃ保護アミノ酸の縮合反応を更に１回もしくは２回繰り返して行った。次いでレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で３回洗浄した。
　このＦｍｏｃ基の脱保護反応に次ぐＦｍｏｃアミノ酸の縮合反応を１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことでレジン表面上にペプチドを伸長させた。最後のアミノ酸の伸長後は脱Ｆｍｏｃ工程を行わずに、さらにＤＣＭ（１カラムあたり１．０ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた後、以後の検討に用いた。本手法を標準条件として用いて、以下の固相担持されたペプチド化合物（化合物１－２－５～化合物１－２－１２）を調製した。
　なお、前述の通り、１カラムあたり１００ｍｇの化合物１－２－１～化合物１－２－３を用いて調製したが、１配列あたり複数本のカラムを並べて同様に調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（配列番号：１）（化合物１－２－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｙｒｒｏ（化合物１－２－１、０．５５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（配列番号：２）（化合物１－２－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（配列番号：３）（化合物１－２－７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（配列番号：４）（化合物１－２－８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（配列番号：５）（化合物１－２－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（配列番号：６）（化合物１－２－１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
　Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ）－ｐｉｐ（化合物１－２－２、０．４５２ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－３、０．５１９ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－１２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　Ｆｍｏｃ－Ｄ－３－Ａｂｕ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－３、０．５１９ｍｍｏｌ／ｇ）から調製した。
　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＭｅＡｌａ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　化合物１－２－５～化合物１－２－１２と同様の手法にて、ペプチド合成機の代わりに、２０ｍＬのフィルター付きカラムに１ｇのＦｍｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ（化合物１－２－４、０．５１４ｍｍｏｌ／ｇ）を加えて固相反応を実施し、脱Ｆｍｏｃ工程時のレジン洗浄はＤＭＦ（７ｍＬ）で４回洗浄することで、化合物１－２－１３（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＭｅＡｌａ－Ｏ－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－ｒｅｓｉｎ、０．４０８ｍｍｏｌ／ｇ）を調製した。
　なお、一例として化合物１－２－５が得られたことを確認する目的で、得られたレジンの一部に対し、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳにて分析したところ、目的ペプチド（化合物１－２－５＊）の生成が確認された。化合物１－２－６から化合物１－２－１２においても、化合物１－２－５と同様の方法にて目的ペプチド（化合物１－２－６＊から化合物１－２－１２＊）の生成を確認した。なお、本実施例において、化合物番号に＊を付した場合には、反応の確認のためにレジンからペプチドを切り出して確認した化合物を示す。化合物１－２－５＊は、化合物１－２－５に含まれるペプチドのカルボン酸と、レジンの２－クロロトリチル基との結合を切断したペプチド化合物を示す。
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：９）（化合物１－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９２８．７９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１０）（化合物１－２－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９２８．８４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１１）（化合物１－２－７＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１００３．８２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．１１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１２）（化合物１－２－８＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８５５．８３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１３）（化合物１－２－９＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８８．７８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．１０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１４）（化合物１－２－１０＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７８４．７５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（化合物１－２－１１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５０８．６０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．７３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（化合物１－２－１２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝３２６．５６（Ｍ－Ｈ）－
　Ｆｍｏｃ保護が外れたフラグメントのＭＳ（（Ｍ－Ｈ－Ｆｍｏｃ）－）として検出
　保持時間：０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（化合物１－２－１３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
　ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３９７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例２：　ペプチドの固相合成において、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程について、試薬および溶媒の効果について確認をした実験
　ペプチドの固相合成においては、脱Ｆｍｏｃ、樹脂洗浄を経て、続くアミノ酸の伸長を行う。本実施例では、固相担持されたペプチド配列として化合物１－２－５を用い、それぞれの工程の試薬や溶媒を変更し、ペプチド合成によって生じる不純物（ジケトピペラジン脱離体、６員環状アミジン骨格構造体、および過剰伸長体）の低減の程度を比較し、適切な条件の範囲を特定した。
基本操作Ａ（表５、ｒｕｎ１～２４）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表５中に記載の塩基を表５中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンを洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）を伸長溶媒に溶かした溶液（１カラムあたり０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。なお、溶媒としてＤＣＭを用いた場合には室温で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表５のｒｕｎ３においては、基本操作Ａに基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．４９７ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＦ溶液（０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド化合物（ＴＭ）（２－１＊）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体（化合物２－２＊）と６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）とＭｅＬｅｕ過剰伸長体（化合物２－４＊）の生成を確認した。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：１５）（化合物２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８３３．７９（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．６４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：１６）（化合物２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６３５．５８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．１２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６８８．６５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ＭｅＬｅｕ過剰伸長体、Ｈ－ＭｅＬｅｕ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：１７）（化合物２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９６０．９０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．０４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
基本操作Ｂ（表５、ｒｕｎ２５～５４）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表５中に記載の塩基を表５中に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンを洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とウロニウム系もしくはホスホニウム系の縮合剤（４当量）を伸長溶媒に溶かした溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表５のｒｕｎ２６においては、基本操作Ｂに基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のトルエン溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３３１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
基本操作Ｃ（表５、ｒｕｎ５５）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のトルエン溶液（２％ｖ／ｖ、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｃｌ（後述）（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＮＭＰ溶液（０．７ｍＬ）と２，４，６－トリメチルピリジン（０．５５ｍｍｏｌ、１０当量）の混合液を添加し、４０℃で１．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。なお、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｃｌの調製については以下のように実施した。（２Ｓ）－２－［９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニル(メチル)アミノ］－４－メチルペンタン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ）（８０．８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４４ｍＬ）に溶解させ、その溶液を氷浴で冷やしながらＤＭＦ（１７．０μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を滴下し、次に塩化チオニル（２４．１μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で３０分攪拌した後、減圧下濃縮した。得られた残渣にトルエン（０．８１ｍＬ、１０ｖ／ｗ）を添加し、減圧下濃縮する操作を２回行った。得られた粗生成物をＮＭＰ（０．７ｍＬ）に溶解させ、上述の反応に用いた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した。
　なお、ジケトピペラジン脱離体の生成はペプチド合成において、一般的に広く知られている合成上の不具合である。６員環状アミジン骨格構造体の生成は、前例がなく本願発明者らが見出したペプチド合成上の新たな課題である。特定の理論に限定するものではないが、ジケトピペラジン脱離体の生成は、Ｎ末端のアミノ基が、Ｎ末端から２番目のアミド結合を形成するカルボニル基に対し６員環を形成するように求核攻撃した後、元のアミド結合を形成するアミノ基が脱離することによって進行する。一方で、６員環状アミジン骨格構造体の生成は、同様に６員環を形成した後、求核攻撃によって発生したカルボニル基由来のヒドロキシ基が脱離することによって進行していると考えられる。つまり、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の形成は、いずれも６員環を形成することに起因するペプチド合成上の課題であることが共通している。
　得られた結果（それぞれの条件での、化合物２－１＊、化合物２－２＊、化合物２－３＊、化合物２－４＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　ｒｕｎ１は一般的なペプチド合成において広く実施されている脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程である（比較実験）。脱Ｆｍｏｃの塩基はピペリジン（ｐｉｐ）（ｐＫａ　１９．３５ (アセトニトリル中)、参考文献　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．　２０１９，　６７３５－６７４８）が使用されている。この条件においては、２残基欠損したジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成、および６員環状アミジン骨格構造体の生成が、それぞれ８％程度ずつ確認された。それに対しｒｕｎ２から５の通り、共役酸のｐＫａが２３以上のより強い塩基を用いた場合にジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成が抑制できることが確認できた。
　次に、脱Ｆｍｏｃ工程の塩基をＤＢＵとして固定し、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程の溶媒検討を行った。その結果、ｒｕｎ３と比較して、ｒｕｎ６からｒｕｎ１８の通り、使用する溶媒をＤＭＦからハロゲン系溶媒（ＤＣＭ）、芳香族炭化水素系溶媒（トルエン、クメン）、エーテル系溶媒（ＴＨＦ、ＤＭＥ、１，３－ジオキソラン、２－メチルテトラヒドロフラン）、リン酸エステル系溶媒（リン酸トリブチル）、エステル系溶媒（プロピオン酸メチル、酢酸ブチル）、ケトン系溶媒（ジエチルケトン、メチルエチルケトン）、カーボネート系溶媒（ジメチルカーボネート）に変更することで、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成が抑制できることが確認できた。この結果は、ｒｕｎ１９～２１にて、ＤＭＦ以外のアミド系溶媒（ＤＭＡ、ＮＭＰ）やＤＭＩを用いた場合にジケトピペラジン脱離体とアミジン体の生成抑制効果が確認できなかったこととは対照的な結果である。なお、ジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成抑制を確認できた溶媒群は共通してＤＮ（ドナーナンバー）の値が２６以下である。一方で、生成抑制効果を示さないアミド系溶媒、ウレア系溶媒の溶媒群のＤＮ（ドナーナンバー）の値は共通して２６より大きい。特定の理論に拘束されないが、６員環中間体を経てジケトピペラジン脱離するまでのエネルギー計算を実施したところ、溶媒の水素受容能が高いほど配位による安定化が大きく、溶媒の非共有電子対の供与性の指標であるドナーナンバー（ＤＮ）値が重要なパラメーターと推測される。これを基に上記の溶媒検討結果を考察すると、ＤＮ値が２６以下の溶媒にてジケトピペラジン脱離体と６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できたのは、６員環中間体を経由する反応が抑制されたことが一因であると考えられ、ＤＮ値が２６以下の溶媒であれば上記で示した溶媒群に限らず幅広く本発明に適用できると推定される。また、ｒｕｎ２２～２４の通り、脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程の溶媒をトルエンに固定し、伸長溶媒を酢酸エチル、メチルエチルケトン、２－メチルテトラヒドロフランに変更した場合にも、ジケトピペラジン脱離体とアミジン体の生成が抑制できることを確認できた。なお、一連の検討結果より過剰伸長体の生成がペプチド生成物の純度低下の別の課題となる場合があることが確認できた。
　脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程に加えて、本願発明者らが見出した条件による伸長工程をおこなった結果をｒｕｎ２５からｒｕｎ４３、４５、４７、４８、および５０に示す。これらの条件においては、ジケトピペラジン脱離体、６員環状アミジン骨格構造体に加えて、過剰伸長体の生成抑制効果が確認され、目的のペプチドを高純度にて得られることが確認できた。
　なお、ｒｕｎ４４、４６、４９に示す結果のとおり、本願発明者らが見出した脱Ｆｍｏｃ時の溶媒を用い、樹脂洗浄工程、および本願発明者らが見出した条件による伸長工程を行ったとしても、最も一般的に使用されているピペリジンを脱Ｆｍｏｃ時の塩基として用いた際には、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制することができないことがあらためて確認された。
　本発明においては、脱Ｆｍｏｃ工程にて、一度に２種類以上の塩基を共存させてもよい。例えば、２種類の塩基を共存させるケースとして、ｒｕｎ５１のように一方を至適な塩基（ここではＤＢＵ）を用いてさえすれば、脱Ｆｍｏｃ工程にて発生するジベンゾフルベンに対する付加体を与えることが広く知られているピペリジンを共存させても、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制できる。
　また、ＤＢＵよりもさらに強い塩基であるＨＰ１（ｄｍａ）、Ｐ１ｔＢｕ、Ｐ２Ｅｔを共存させた場合においては、わずかながら目的ペプチドの異性化（エピメリゼーション）の進行が確認されたものの、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能であることが確認できた（ｒｕｎ５２から５４）。
　本発明においては、伸長工程に酸クロリドを用いてもよい。例えば、ｒｕｎ５５のように、本願発明者らが見出した脱Ｆｍｏｃ時の溶媒を用い、樹脂洗浄工程を経た後、別途調製した酸クロリドを２，４，６－トリメチルピリジン存在下、ＮＭＰ中で作用させた場合にも、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能であることが確認できた。
　以上、実施例２の結果より、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制可能な各工程（脱Ｆｍｏｃ工程、樹脂洗浄工程、伸長工程）の範囲の概要が特定された。なお、ジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成抑制においては、実施例２に示す反応条件の組み合わせに限定されない。
実施例３：　ペプチドの固相合成において、脱Ｆｍｏｃ工程にて塩基の中和工程を加えたペプチド合成の実験
　文献では、脱Ｆｍｏｃ工程もしくはその後の樹脂洗浄工程において、脱Ｆｍｏｃ反応に使用した塩基の中和を行っている例がみられる。
　例えば、固相でのペプチド合成において、ジケトピペラジン脱離を抑制する目的で、ＤＢＵ／ＤＭＦにて素早く脱Ｆｍｏｃ反応を行い、続いてＨＯＢｔを添加することで中和を行う例が知られている（Org. Lett., 2008, 10, 3857-3860.）。
　また、アンカー基を用いたペプチド合成においては、ワンポットで脱Ｆｍｏｃ反応と続く伸長を行うために、ＤＢＵを用いた脱Ｆｍｏｃ後に塩酸等を用いた中和を行う例が報告されている（WO 2012165546 A1）。
　これらの中和工程が、ジケトピペラジン脱離体の生成にどのような影響を及ぼすか、確認実験を行った。
基本操作（表６）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンを表６に記載の脱Ｆｍｏｃ時に使用する溶媒(１カラムあたり０．７ｍＬ)で２回洗浄した。脱Ｆｍｏｃ溶液（１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間静置し、Ｆｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、脱Ｆｍｏｃ溶液は、表６に記載の塩基を表６に記載の体積パーセント濃度（ｖ／ｖ％）で脱Ｆｍｏｃ溶媒に溶かして調製した。続いて、中和工程として、ＨＯＡｔ（０．２５ｍｏｌ／Ｌあるいは０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液０．４ｍＬ（固相に担持されたペプチドに対して、およそ２当量あるいは４当量相当）を加えてさらに５分間静置した。なお、対比実験として中和工程を行わずに脱Ｆｍｏｃ工程を１０分実施した後ＤＭＦ（０．４ｍＬ）を加え、さらに５分間静置した実験も並べて実施した。溶液をフリットから排出した後、レジンを表６に記載の洗浄溶媒（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＣＭ溶液（０．３ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＣＭ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３３１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で２時間あるいは４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　例えば、表６のrun２においては、基本操作に基づき、以下のように実施した。
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＣＭ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を加えて室温で１０分間静置し、脱Ｆｍｏｃを行った。続いて、中和工程として、ＨＯＡｔ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液０．４ｍＬ（固相に担持されたペプチドに対して、およそ４当量相当）を加えてさらに５分間静置した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．２２１ｍｍｏｌ，４当量）のＤＣＭ溶液（０．３ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＣＭ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３３１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させ、ＤＭＦにて２回洗浄した後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出し、レジンをＤＭＦで４回、ＤＣＭで４回洗浄した後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析した結果、表６に示す通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　以上、実施例３の結果より、中和工程を行う場合には中和工程を行わない場合と比較し、ジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成が増加してしまい、目的ペプチドの純度低下の原因となることが確認された。
実施例４：　見出した条件によるペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果のペプチド配列一般性確認実験
　本実施例では、実施例１－２－５にて調製した種々のペプチド配列（表７のＣｏｒｅ２まで伸長したペプチド配列、化合物１－２－６～化合物１－２－１２）に対して、一般的な従来法（条件－１）と本発明の方法（条件－２）でＣｏｒｅ１に記載のアミノ酸を伸長し、ジケトピペラジン脱離体の生成量を比較した。
条件－１（従来法）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－６～化合物１－２－１２（それぞれ表７のｒｕｎ１から７に対応））１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。ピペリジンのＤＭＦ溶液（２０ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で８回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＨＯＡｔ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＦ溶液（０．３６ｍＬ）を混合した溶液を添加し、４０℃で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
条件－２（本発明の方法）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－６～化合物１－２－１２（それぞれ表７のｒｕｎ１から７に対応））１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のトルエン溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄し、続いてＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（４当量）のＤＣＭ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（４当量）のＤＣＭ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（６当量）を混合して１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で４時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物４－１－１＊～化合物４－１－７＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物４－２－１＊～化合物４－２－７＊）の生成を確認した。
　各配列、各条件におけるジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量を表７に示す。なお表７に示すジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとした時の、ジケトピペラジン（ＤＫＰ）脱離体のＵＶ面積パーセントである。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ｉｌｅ－ＭｅＧｌｙ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１８）（ｒｕｎ１）（化合物４－１－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１０５６．１０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．１１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：１９）（ｒｕｎ１）（化合物４－２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８７１．９４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＭｅＡｌａ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：２０）（ｒｕｎ２）（化合物４－１－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１１６０．９０（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：２１）（ｒｕｎ２）（化合物４－２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９１８．７７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｎｌｅ－ＭｅＡｌａ（３－Ｐｙｒ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：２２）（ｒｕｎ３）（化合物４－１－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９６８．９４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ３）（化合物４－２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９３．７２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｎｌｅ－ＭｅＰｈｅ（３－Ｃｌ）－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：２３）（ｒｕｎ４）（化合物４－１－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１００１．８６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ４）（化合物４－２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９３．７２（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（ｎＰｒ）－ＭｅＡｌａ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（配列番号：２４）（ｒｕｎ５）（化合物４－１－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８１．７８（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－ｐｉｐ（ｒｕｎ５）（化合物４－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６６７．６４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（配列番号：２５）（ｒｕｎ６）（化合物４－１－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６３５．７１（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．３５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ６）（化合物４－２－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４５３．５５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ｃＬｅｕ－ＭｅＶａｌ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（配列番号：２６）（ｒｕｎ７）（化合物４－１－７＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６４５．７９（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．３３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（ｒｕｎ７）（化合物４－２－７＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４２３．５３（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　以上、実施例４の結果より、特定のペプチド配列に限らず種々のペプチド合成において、一般的な従来法に比べ、本発明の方法で伸長を行う場合にはジケトピペラジン脱離体の抑制効果があることを確認した。
実施例５：見出した条件によるペプチド合成時のジケトピペラジン脱離軽減効果の伸長するカルボン酸の基質一般性確認実験
　本実施例では、実施例１－２－５にて調製したペプチド配列（化合物１－２－５）に対して、本発明の方法（条件－３）でＣｏｒｅ１に記載の種々カルボン酸を伸長し、ジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成量を確認した。
条件－３（本発明の方法）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５５２ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－１から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－５）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のトルエン溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、表８に記載の伸長するカルボン酸（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２１ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５７ｍＬ、０．３３１ｍｍｏｌ、６当量）を混合して、１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇあるいはＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物５－１－１＊～化合物５－１－６＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物５－２－１＊～化合物５－２－６＊）および６員環状アミジン骨格構造体（化合物２－３＊）の生成を確認した。
　各配列におけるジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）および６員環状アミジン骨格構造体の生成量を表８に示す。なお、表８に示すジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）および６員環状アミジン骨格構造体の生成量は、目的ペプチド（ＴＭ）とジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）および６員環状アミジン骨格構造体のＬＣＭＳでのＵＶ面積パーセントを合わせて１００パーセントとしたときの、ジケトピペラジン脱離体（ＴＭ－ＤＫＰ）および６員環状アミジン骨格構造体のＵＶ面積パーセントである。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３４）（ｒｕｎ１）（化合物５－１－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝１０６５．７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｔｅｏｃ－Ｐｈｅ（４－ＣＦ３）－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３５）（ｒｕｎ１）（化合物５－２－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８６７．５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｂｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３６）（ｒｕｎ２）（化合物５－１－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８９１．７（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．０７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｂｏｃ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３７）（ｒｕｎ２）（化合物５－２－２＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６９１．６（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．７７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ａｌｌｏｃ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３８）（ｒｕｎ３）（化合物５－１－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９３７．６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：３．０２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ａｌｌｏｃ－Ｐｈｅ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：３９）（ｒｕｎ３）（化合物５－２－３＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７３９．５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．９０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ａｃ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４０）（ｒｕｎ４）（化合物５－１－４＊）
　なお、Ａｃの表記は酢酸を伸長したアセチル基を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７４８．６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：１．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ａｃ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４１）（ｒｕｎ４）（化合物５－２－４＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５４８．５（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：１．２２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｔｆａ－Ａｉｂ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４２）（ｒｕｎ５）（化合物５－１－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000072
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝８８７．６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．７５分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｔｆａ－Ａｉｂ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４３）（ｒｕｎ５）（化合物５－２－５＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000073
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝６８７．６（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：２．４２分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｎｓ－Ａｉｂ－Ｉｌｅ－ＭｅＡｌａ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４４）（ｒｕｎ６）（化合物５－１－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000074
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝９７６．６（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．０８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　ジケトピペラジン脱離体、Ｎｓ－Ａｉｂ－Ａｚｅ（２）－ＭｅＣｈａ－ＭｅＧｌｙ－Ａｓｐ－ｐｙｒｒｏ（配列番号：４５）（ｒｕｎ６）（化合物５－２－６＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝７７６．５（Ｍ－Ｈ）－
　保持時間：１．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
　以上、実施例５の結果より、特定のＦｍｏｃアミノ酸に限らず種々のカルボン酸の伸長において、本発明の方法で伸長を行うことでジケトピペラジン脱離体や６員環状アミジン骨格構造体の生成を抑制して、目的ペプチドを合成できることを確認した。
実施例６：見出した条件による、エステル結合にて固相に担持されたジペプチドのジケトピペラジン形成に対する効果の確認
　一般的にジケトピペラジン脱離が問題となるのは、固相に担持されたジペプチドのエステル結合が切断されることでジケトピペラジンが形成される場合である。
　本実施例では、実施例１－２－４にて調製した固相にエステル結合を介して担持されたジペプチドに対して、一般的な従来法（条件－４）と本発明の方法（条件－５）でＦｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨを伸長し、本発明の方法を用いることでジケトピペラジン形成にどのような影響を及ぼすか、確認実験を行った。
条件－４（従来法）（ｒｕｎ１）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのジペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－１３）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。ピペリジンのＤＭＦ溶液(２０ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ)を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラム当たり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．６ｍｏｌ／Ｌ）とＯｘｙｍａ（０．３７５ｍｏｌ／Ｌ）のＤＭＦ溶液（０．３ｍＬ）とＤＩＣ（１０ｖ／ｖ％）のＤＭＦ溶液（０．３６ｍL）を混合した溶液を添加し、４０℃で２．５時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
条件－５（本発明の方法）（ｒｕｎ２およびｒｕｎ３）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（化合物１－２－１３）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のトルエン溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをトルエン（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－ＯＨ（０．１６３ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦあるいはＤＣＭ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．１６３ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦあるいはＤＣＭ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０４０ｍＬ、０．２４５ｍｍｏｌ、６当量）を混合して、１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物６－１＊）の生成を確認した。
　目的ペプチド化合物（ＴＭ）、Ｆｍｏｃ－ＭｅＬｅｕ－Ａｌａ－ＭｅＡｌａ－ＯＨ（化合物６－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000077
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５２４．５（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：２．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Ｆｍｏｃ定量法
　担持量の確認のため、得られたレジン（ｒｕｎ１、１０．６４ｍｇ）を反応容器に入れ、ＤＭＦ（４．０ｍＬ）を加えて、室温にて３０分間振盪した。その後、ＤＢＵ（４０μＬ）を加えて３０℃で１５分間振盪した。その後、反応混合液が１０．０ｍＬになるようにＤＭＦを加え、その溶液８０μＬをＤＭＦ（９２０μＬ）で希釈した。得られた希釈溶液をＬＣＭＳで分析し（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ：５μＬ）、ジベンゾフルベンのＵＶａｒｅａ値（２９４ｎｍ：８８．６１、３０４ｎｍ：７２．０１）より、得られたレジンの担持量を０．０２１ｍｍｏｌ／ｇと算出した。（濃度既知のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（商業的供給業者から購入）とＤＢＵの混合溶液を標準物質として測定日ごとに波長２９４ｎｍと３０４ｎｍにおけるジベンゾフルベンのＵＶａｒｅａ値をもとに作成した検量線を用い、各々の波長で算出された担持量の平均値をレジンの担持量とした。）
　ｒｕｎ２においても同様のＦｍｏｃ定量法にて担持量を算出すると、０．３２１ｍｍｏｌ／ｇであった。（２９４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：１４３２．１５、３０４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：１２１７．７０）
　ｒｕｎ３においても同様のＦｍｏｃ定量法にて担持量を算出すると、０．３０６ｍｍｏｌ／ｇであった。（２９４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：１３６４．６７、３０４ｎｍにおけるＵＶａｒｅａ値：１１６２．５８）
回収率算出法
　実施例６では、回収率を以下のように定義し、固相反応中のレジンからのジケトピペラジン脱離の抑制率を評価した。
　回収率＝反応生成物担持レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）÷目的物が１００％生成した場合のレジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）（式１）
　目的物が１００％生成した場合のレジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）は以下の様に算出される。
　目的物が１００％生成した場合のレジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×原料レジンの重量（ｇ）÷目的物が１００％生成した場合のレジンの重量（ｇ）（式２）
　目的物が１００％生成した場合のレジンの重量（ｇ）は以下のように算出される。
　目的物が１００％生成した場合のレジンの重量（ｇ）＝原料レジンの重量（ｇ）－原料レジン上のペプチド成分の重量（ｇ）＋目的物が１００％生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（ｇ）（式３）
　原料レジン上のペプチド成分の重量（ｇ）は以下のように算出される。
　原料レジン上のペプチド成分の重量（ｇ）＝原料レジンの重量（ｇ）×原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×原料レジン上のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１(ｍｏｌ／ｍｍｏｌ)（式４）
　目的物が１００％生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（ｇ）は以下のように算出される。
　目的物が１００％生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（ｇ）=原料レジンの重量（ｇ）×原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×目的物のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１(ｍｏｌ／ｍｍｏｌ)（式５）
　式２に式３、式４、および式５を代入すると、
　目的物が１００％生成した場合のレジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）÷（１－原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×原料レジン上のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ）＋原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×目的物のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ））＝１÷（１÷原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）－原料レジン上のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ）＋目的物のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ））（式６）
　式１に式６を代入すると、回収率は以下の式により算出される。
　回収率＝反応生成物担持レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）×（１÷原料レジンの担持量（ｍｍｏｌ／ｇ）－原料レジン上のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ）＋目的物のペプチド成分の分子量（ｇ／ｍｏｌ）×０．００１（ｍｏｌ／ｍｍｏｌ））
　従来法（条件‐４）と本発明の方法（条件－５）にて伸長を行い、それぞれ得られたレジンについて、上記Ｆｍｏｃ定量法で算出した担持量と回収率算出法で算出した回収率を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
　以上、実施例６の結果より、固相にエステル結合を介して担持されたジペプチドに対して、本発明の方法で伸長を行うことでジケトピペラジン形成を抑制し、収率良く目的ペプチドを合成できることを確認した。
実施例７：脱Ｆｍｏｃ工程におけるカルバミン酸塩の存在確認と、ジケトピペラジン脱離に及ぼす影響の確認
　実施例中に記載する化合物を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
　実施例中では以下の略号を使用した。
ＮＭＲ：核磁気共鳴分光法
ＲＯＥＳＹ：回転座標系Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果分光法
ＮＯＥＳＹ：核Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ効果分光法
ＨＳＱＣ：異種核一量子相関
ＨＭＢＣ：異種核多結合相関
ｃｐｄ.：化合物
　ＮＭＲ測定はＢｒｕｋｅｒ社製のＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ６００ Ｃｒｙｏ-ＴＣＩまたはＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ６００ ＢＢＦＯを用いて２９８Ｋにて行った。
　複数の窒素原子を含む塩基がプロトン化されカチオンとなり系中のアニオンと塩を組む場合には、いずれかの窒素原子がプロトン化されたものがカチオン源となり得る。例えば、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）の場合には、下の三つがカチオン源となる可能性が考えられるが、本明細書ではいずれのカチオンが対応するアニオンと塩を形成したとしてもそれぞれを区別することなくＤＢＵ塩と呼ぶこととする（図１）。他の塩基、例えば、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）やイミノトリス（ジメチルアミノ）ホスフォオラン（ＨＰ１（ｄｍａ））についても同様にＴＭＧ塩もしくはＨＰ１（ｄｍａ）塩と呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000080
化合物１－３－１、９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－１－ベンジル－２－（ジメチルアミノ)-2-オキソ-エチル]カルバマート（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）の合成
　市販のＮ－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－Ｌ－フェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ, ＣＡＳ：３５６６１－４０－６，化合物ａａ２－１２）（２．０ｇ、５．１６ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１４ｍL）とジクロロメタン（ＤＣＭ）（４ｍL）の混合溶液に対し室温で１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）（１．１９ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシベンゾトリアゾール(ＨＯＢｔ)（０．７６７ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）を加えた後、氷冷下ジメチルアミンのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液（２．０Ｍ、２．８４ｍL、５．６８ｍｍｏｌ）をさらに加え１５分撹拌した。溶液に酢酸イソプロピル（２０ｍL）を加え、有機相を１Ｍの塩酸（２０ｍL）で二回、水（５０ｍL）で一回、半飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍL）で二回、半飽和塩化ナトリウム水溶液（２０ｍL）で二回洗浄した。得られた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過し得られた母液の溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をトルエンで二回共沸させた後、５℃で放冷した結果、化合物１－３－１の白色結晶（１．８８ｇ、８８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000081
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ｔｏｌｕｅｎｅ－ｄ８，２９８Ｋ）δ７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．４３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．２１－７．１６（ｍ，２Ｈ），７．１４－７．０７（ｍ，２Ｈ），７．０５－７．００（ｍ，４Ｈ），７．００－６．９５（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＮＨ），４．８８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４，８．４，６．０Ｈｚ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５，７．４Ｈｚ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５，７．４Ｈｚ），４．０３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０，８．４Ｈｚ），２．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０，６．０Ｈｚ），２．４９（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ）．
　１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ｔｏｌｕｅｎｅ－ｄ８，２９８Ｋ）δ１７１．１，１５５．９，１４４．６，１４１．８，１２９．９，１２８．５，１２７．８（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｏｌｖｅｎｔ　ｐｅａｋ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＣＨ－ＨＳＱＣ ），１２７．３，１２７．０，１２５．６，１２５．４，１２０．２，６７．２，５２．３，４７．７，４０．２，３６．０，３５．０．
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝４１５．４４（Ｍ＋Ｈ）＋
　保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例７－１：化合物１－３－１をＤＢＵにて処理した際のＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ の存在確認
実施例７－１－１：化合物１－３－１をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液中でＤＢＵにて処理した際の生成物
　化合物１－３－１（１２．９ ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液（０．５　ｍＬ）の１Ｈ－ＮＭＲを測定した（図１－ｂ））後、当該溶液に対して１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（５．１１　μＬ、０．０３４ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌後、１Ｈ－ＮＭＲ（図１－ａ））、１Ｄ－ＲＯＥＳＹ（（図２－ａ）－２）、（図２－ａ）－３））を測定した。その結果、主に３つの化合物が生成していることをＮＭＲスペクトルから確認した。すなわち、ジベンゾフルベン、および、化合物１－３－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）、Ｎ－［（１Ｓ）－１－ベンジル－２－（ジメチルアミノ）－２－オキソ-エチル]カルバマートＤＢＵ塩（化合物１－３－３ａ，ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）の３つが当該溶液中に存在しており化合物１－３－２と化合物１－３－３ａが化学交換を起こしていることを確認した。なお、当該溶液中の化合物１－３－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）の同定に関しては本実施例（実施例７－１－１）に、化合物１－３－３ａの同定に関しては実施例７－１－３で詳しく説明した。
ＤＭＦ－ｄ７中、化合物１－３－１に対してＤＢＵを作用させ生じる化合物１－３－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）と化合物１－３－３ａが化学交換を起こしていることとそれらの比率の確認
　当該溶液の１Ｄ－ＲＯＥＳＹを測定した結果（４．８４ｐｐｍおよび３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起、図２－ａ）－２、図２－ａ）－３）、化合物１－３－３ａの４．８４ ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－３－２のαメチンのプロトンに相当する３．９５ ｐｐｍの１Ｈシグナルが系中で化学交換を起こしていることを確認した（（図２－ａ）－２）、（図２－ａ）－３））。すなわち、４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図２－ａ）－２）、３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図２－ａ）－３）、選択励起したシグナルと同位相のＲＯＥＳＹが観測されたことから、それぞれのシグナルは化学交換していることを確認した（図２－ａ））。さらに、１Ｈ－ＮＭＲの１Ｈシグナルの積分比から化合物１－３－３ａと化合物１－３－２の存在比が８２：１８であることを確認した（図２－ｂ））。
当該溶液中の化合物１－３－２（Ｈ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ ２ ）の存在確認
　別途用意した化合物１－３－２の標品３μＬを当該溶液に混合し１Ｈ－ＮＭＲ（図３－ａ）－３、図３－ｂ））および１Ｄ－ＮＯＳＥＹ（図３－ａ）－４、図３－ａ）－５）を測定した。
　１）化合物１－３－２の標品３μＬを当該溶液に加えて得られる溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、当該溶液の１Ｈ－ＮＭＲで観測された３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナル（図３－ａ）-２）と化合物１－３－２の標品で観測される３．９４ｐｐｍの１Ｈシグナル（図３－ａ）-１）が分離することなく３．９５ｐｐｍにトリプレットの１Ｈシグナルとして完全に一致した状態で観測された（図３－ａ）-３）。
　２）化合物１－３－２の標品３μＬと当該溶液に加えて得られる溶液の１Ｄ－ＮＯＥＳＹを測定した結果（４．８４ｐｐｍおよび３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起）、４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図３－ａ）-４）、３．９５ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルから（図３－ａ）-５）、選択励起したシグナルと同位相かつ元のシグナルと同形のＮＯＥＳＹ（４．８５ｐｐｍ：ダブルトリプレット、３．９５ｐｐｍ：トリプレット）が観測された。
　３）化合物１－３－２の標品３μＬを当該溶液に加えると、化合物１－３－３ａの４．８４ ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－３－２の３．９５ ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分比が８２：１８（化合物１－３－２を加える前の積分比[図２－ｂ）]）から６１：３９に変化した（図３－ｂ））。
　以上の１）～３）の３点から当該溶液中に化合物１－３－２が存在することを確認した。
実施例７－１－２：化合物１－３－２に対して １３ ＣＯ ２ を吹き付けてＤＢＵを作用させたときに生じる化合物１－３－３ａの同定
　実施例７－１－２中の下記の実験操作はすべてグローブボックス内（窒素雰囲気下、脱水条件）で実施した。なお、マイクロウェーブで高温に加熱後、真空下で放冷すること（ｘ２）で活性化させたＭＳ４Ａで１２時間以上乾燥させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）を溶媒として用い、グローブボックス内でバルブ付き高気密ＮＭＲチューブにサンプリングし外気との接触を完全に遮断したサンプルでＮＭＲを測定した。
溶液Ａ（ＳｏｌＡ）の調整
　化合物１－３－２(４．６４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ)のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた後、１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ｂ））、１３Ｃ－ＮＭＲ（図５－ａ）），１Ｄ－ＮＯＥＳＹ（４．７７ｐｐｍおよび３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルそれぞれを選択励起、（図４－ｃ）、図４－ｄ））を測定した。その後、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（３．９７μＬ、０．０２７ｍｍｏｌ）を加え化合物１－３－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）を含む溶液Ａを調整し１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ｅ））、１３Ｃ－ＮＭＲ（図５－ｂ））を測定した。
溶液Ａ中の化合物１－３－３ａの同定
　化合物１－３－３ａの構造は、１Ｈ－ＮＭＲ，１３Ｃ－ＮＭＲ，１Ｄ－ＮＯＥＳＹの測定結果から矛盾なく説明できる。
　４）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、原料の化合物１－３－２の１Ｈ－ＮＭＲ（図４－ａ））では観測されなかった４．７６ｐｐｍの新な１Ｈシグナルを確認した（図４－ｂ））（カルバマートアニオンもしくはカルバミン酸の生成、図５－a）参照）。
　５）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた溶液の１Ｈ－ＮＭＲで観測された４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルと化合物１－３－２のαメチレンに相当する３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルの積分値を測定したところ、５２：４８の比率であることを確認した（図４－ｆ）。
　６）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた溶液の１Ｄ－ＮＯＥＳＹを測定した結果、４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には３．９６ｐｐｍ１Ｈシグナルから（図４－ｃ））、また、３．９６ｐｐｍの１Ｈシグナルを選択励起した場合には４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルから同位相のＮＯＥＳＹが観測された（図４－ｄ））ことから両者が化学交換を起こしていることを確認した。
　７）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた後にさらにＤＢＵを加えた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、ＤＢＵを加える前に観測された４．７６ｐｐｍの１Ｈシグナルが、ＤＢＵを加えると、高磁場シフトし４．８３ｐｐｍに変化することを確認した（図４－ｅ））（化合物１－３－３ａの生成確認）。
　８）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせた後にさらにＤＢＵを加えた溶液の１Ｈ－ＮＭＲを測定した結果、αメチンの４．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルと１３Ｃラベルされた１６１．５ｐｐｍのカルボニルの１３Ｃシグナル（図５－ｂ））との間で２．７Ｈｚの３ＪＣＨのカップリングを確認した（図４－ｇ））。
　９）化合物１－３－２のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）（０．５ ｍＬ）溶液に対して、１３ＣＯ２を1分間バブリングさせて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲを測定し（図５－ａ））、その後さらにＤＢＵを加えて得られる溶液の１３Ｃ－ＮＭＲを測定し（図５－ｂ））比較した結果、１３Ｃラベルされたカルボニルに相当する１３ＣシグナルがＤＢＵを加えることで１５７．１ｐｐｍから１６１．５ｐｐｍへ高磁場シフトしたことを確認した（化合物１－３－３ａの生成確認）。
　４）～９）の６点から溶液Ａ（ＳｏｌＡ）の調整で、化合物１－３－２の１級アミンと１３ＣＯ２が反応し、カルバマートもしくはカルバミン酸が形成され、そこに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）を作用させることにより化合物１－３－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）が生成したことを確認した。上記実験により化合物１－３－３ａ（ＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２）が生成したとして矛盾はない。本構造については実施例７－１－３でより詳細に同定を行った。
実施例７－１－３：溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中に存在する化合物１－３－３ａの構造証明
　実施例７－１－３に記載されている下記の実験操作はすべてグローブボックス内（窒素雰囲気下、脱水条件）で実施した。なお、マイクロウェーブで高温に加熱後、真空下で放冷すること（ｘ２）で活性化させたＭＳ４Ａで１２時間以上乾燥させたＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）を溶媒として用い、グローブボックス内でバルブ付き高気密ＮＭＲチューブにサンプリングし外気との接触を完全に遮断したサンプルでＮＭＲを測定した。
溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の調整
　化合物１－３－１（ １１．５ ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）溶液（０．５ ｍＬ）に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（４．５６　μＬ、０．０３１ｍｍｏｌ）を加え溶液Ｂを調整し１Ｈ－ＮＭＲを測定した（ＳｏｌＢ、図６－ａ））。
溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）の調整
　上記の溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）（０．１５　ｍＬ、図６－ａ）、０．００８４ｍｍｏｌ）と溶液Ａ（ＳｏｌＡ）（０．３５ ｍＬ、ＳｏｌＡ、図６－ｃ）、０．０１６８ｍｍｏｌ）を混合させ１Ｈ－ＮＭＲ（図６－ｂ）），１３Ｃ－ＮＭＲ，ＣＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｃ）），ＣＨ－ＨＳＱＣ，ＮＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｂ）），ＮＨ－ＨＳＱＣ（図７－ａ））を測定した。
溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）中の化合物１－３－３ａの存在確認
　溶液Ａの１Ｈ－ＮＭＲで観測された化合物１－３－３ａのαメチンに相当する４．８３ ｐｐｍの１Ｈシグナル（図６－ｃ））と溶液Ｂの１Ｈ－ＮＭＲで観測された４．８５ ｐｐｍの１Ｈシグナル（図６－ａ））がそれぞれ４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルにシフトしながら完全に一致したことを確認した（図６－ｂ））。すなわち、溶液Ｂで観測された４．８５ｐｐｍの１Ｈシグナルの中でカップリングのない低磁場側のピーク（図６－ａ）の点線で囲ったピーク）と、溶液Ａで観測された４．８３ｐｐｍの中で１Ｈシグナルの１３Ｃとのカップリング（２．７Ｈｚ）が認識できる低磁場側のピーク（図６－ｂ）の丸で囲ったピーク）は、溶液Ｂと溶液Ａを混合させるとお互いにシフトし中間のブロード形状のピーク（（図６－ｂ）の丸で囲ったピーク）に変換されることを確認した。これらの結果から、１Ｈシグナルが（ＳｏｌＢ）に化合物１－３－３ａが存在することを確認した。
溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中の化合物１－３－３ａの構造証明
　溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）中の化合物１－３－３ａの構造は、１Ｈ－ＮＭＲ（図６－ｂ）），１３Ｃ－ＮＭＲ，ＣＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｃ）），ＣＨ－ＨＳＱＣ，ＮＨ－ＨＭＢＣ（図７－ｂ）），ＮＨ－ＨＳＱＣ（図７－ａ））を用いることで、カルバミン酸ＤＢＵ塩であることを矛盾なく説明できる。
　１０）溶液Ａ（ＳｏｌＡ）＋溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の混合溶液のＣＨ－ＨＭＢＣを測定した結果、αメチンの４．８４ｐｐｍの１Ｈシグナルと溶媒の１３Ｃシグナルより高い１３Ｃラベルされた１６１．５ｐｐｍの１３Ｃシグナルとの間にＣＨ－ＨＭＢＣ相関があることを確認した（図７－ｃ））。すなわち、ＣＨ－ＨＭＢＣ相関および１３Ｃシグナルの値、実験的に１３Ｃの由来がバブリングした１３ＣＯ２であるため、１６１．５ｐｐｍの１３Ｃシグナルはカルバマートのカルボニルと同定して矛盾がない。
　１１）溶液Ａ（ＳｏｌＡ）＋溶液Ｂ（ＳｏｌＢ）の混合溶液のＮＨ－ＨＳＱＣを測定した結果、ＮＨの１Ｈシグナルと同定された５．３０ｐｐｍと９１．４ｐｐｍの１５ＮシグナルにＮＨ－ＨＳＱＣ相関がみられたことから９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルはカルバマートの窒素原子と同定した（図７－ａ））。なお、ベンジルメチレンの２．９１/２．８３ｐｐｍの１Ｈシグナルとカルバマートの窒素原子に相当する９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルとの間にはＮＨ－ＨＭＢＣ相関も確認しており（図７－ｂ））、１５Ｎシグナルの値としても９１．４ｐｐｍの１５Ｎシグナルがカルバマートの窒素原子であることを矛盾なく説明できる。
　１０）、１１）の２点から溶液Ａ＋溶液Ｂ（ＳｏｌＡ＋ＳｏｌＢ）を調整した際、化合物１－３－３ａが系中に存在することを確認した。また下記の通り、化合物１－３－３ａのカルバマート部位のＮＭＲシグナルをすべて帰属することができ（図８）、すべてのＮＭＲシグナルの値が化合物１－３－３ａの構造を矛盾なく説明できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000082
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ）δ７．２９－７．２３（ｍ，４Ｈ），７．２２－７．１１（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），４．９０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，６．２Ｈｚ，３ＪＣＨ＝　２．７Ｈｚ），２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．３，６．８Ｈｚ），２．８７（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．３，６．２Ｈｚ），２．７８（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ－ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ）δ１７３．６（ｑＣ），１６１．５（ｑＣ），１３９．４（ｑＣ），１２９．７（ＣＨ　ｘ２），１２８．３（ＣＨ　ｘ２），１２６．３（ＣＨ），５３．０（ＣＨ），４０．０（ＣＨ２），３６．４（ＣＨ３），３４．８（ＣＨ３）．
　１５Ｎ－ＮＭＲ（６１ＭＨｚ，ＤＭＦ－ｄ７，２９８Ｋ，ａｓｓｉｇｎｅｄ ｂｙ ＮＨ－ＨＳＱＣ ａｎｄ ＮＨ－ＨＭＢＣ）δ９６，９１．
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基をＤＢＵにて処理した際、ジベンゾフルベンの脱離に続いて脱炭酸まで進行して完全にアミノ基が露出するのではなく、大部分はＤＢＵ・ＨＯＣＯ－Ｐｈｅ－ＮＭｅ２として存在していることが確認された。また、その存在と存在比率は１Ｈ－ＮＭＲにて確認できることが示された。
実施例７－２：　化合物１－３－１を各種溶媒中、ＤＢＵまたはピペリジンにて処理した際のカルバミン酸塩の存在確認
基本操作
　化合物１－３－１（約２５ｍｇ）の重溶媒溶液（１．２５ｍＬ，テトラヒドロフラン－ｄ８（ＴＨＦ－ｄ８）［Ｅｎｔｒｙ１］，トルエン－ｄ８［Ｅｎｔｒｙ２］，ジクロロメタン－ｄ２（ＤＣＭ－ｄ２）［Ｅｎｔｒｙ３］，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ７（ＤＭＦ－ｄ７）［Ｅｎｔｒｙ４］を調整後、当該溶液１．０ｍＬを二つにわけ（０．５ｍＬ）、片方には１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）(６．８ μＬ)を、もう片方にはピぺリジン（６７．５μＬ）を作用させ、それぞれのＮＭＲを測定し、化合物１－３－３ａと化合物１－３－２の比率を１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた（表１１）。本実験において、化合物１－３－１はentry1では２５．１ｍｇ、ｅｎｔｒｙ２では２４．８ｍｇ、ｅｎｔｒｙ３では２５．０ｍｇ、ｅｎｔｒｙ４では２５．３ｍｇ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000083
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基をＤＢＵを用いて処理した場合には、いずれの溶媒中においてもカルバミン酸塩が過半数以上の比率で存在することが確認できた。一方、ピペリジンを用いて処理した場合には、いずれの溶媒中においてもカルバミン酸塩は検出されず、脱炭酸まで進行し完全にアミノ基が露出していることが確認できた。
　本知見を基に固相での実験結果を考察した場合、特定の理論に拘束されるものではないが、以下の式の通り、カルバミン酸塩の存在によって、ジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことが低減効果につながっていると説明できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000085
　例えば、ＮＭＲにてカルバミン酸塩の形成が確認されたＤＢＵでの脱保護と確認されなかったピペリジンでの脱保護を固相実験にて比較し、どのような影響を及ぼすか確認した。実施例２に記載の基本操作Ｂと同様の手法にて、表１２、ｒｕｎ１～２に記載の試薬や溶媒を用いて反応を行い、得られた結果（それぞれの条件での、化合物２－１＊、化合物２－２＊、化合物２－３＊、化合物２－４＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
　特定の理論に拘束されないが、表１２、ｒｕｎ１（２％ＤＢＵ）とｒｕｎ２（２０％ピペリジン）を比較した際、ＤＢＵにて処理した場合にジケトピペラジン脱離体および６員環状アミジン骨格構造体の生成が大きく抑制できるのは、カルバミン酸塩の存在によってジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことによると、矛盾なく説明できる。
実施例７－３：　化合物１－３－１をＴＨＦ中、各種塩基にて処理した際の化合物１－３－３の存在確認
基本操作
　化合物１－３－１（約１０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン－ｄ８（ＴＨＦ－ｄ８）溶液（０．５ｍＬ）を四つ調整後、ピぺリジン（６７．５ μＬ，Ｅｎｔｒｙ１）、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）（１３．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ２）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ） (６．８ μＬ，Ｅｎｔｒｙ３)、イミノトリス（ジメチルアミノ）ホスフォオラン（ＨＰ１（ｄｍａ））（１３．５μＬ，Ｅｎｔｒｙ４）、の四つの塩基それぞれを作用させ、３０分後それぞれのＮＭＲを測定し、化合物１－３－３および化合物１－３－２の比率を１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた（表１３）。本実験において、化合物１－３－１はentry1では１０．０ mg、ｅｎｔｒｙ２では１０．０ mg、entry３では１０．０ mg、ｅｎｔｒｙ４では１０．１ mg用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基を共役酸のｐＫａが２３以上の範囲の塩基を用いて処理した場合にカルバミン酸塩が過半数の比率で存在することが確認できた。
　本知見を基に固相での実験結果を考察した場合、特定の理論に限定されるものではないが、実施例２のｒｕｎ４７，４８にてジケトピペラジン脱離等を低減できたのは、上述の通り、カルバミン酸塩の存在によってジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことが寄与している。
実施例７－４：　化合物１－３－１をＤＢＵで処理した後に酸（ＨＯＡｔ）を加えた際の挙動の確認
　化合物１－３－１（約２５ｍｇ）の重溶媒溶液（１．２５ｍＬ，テトラヒドロフラン－ｄ８（ＴＨＦ－ｄ８）［Ｅｎｔｒｙ１］，トルエン－ｄ８［Ｅｎｔｒｙ２］，ジクロロメタン－ｄ２（ＤＣＭ－ｄ２）［Ｅｎｔｒｙ３］，Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド－ｄ7（ＤＭＦ－ｄ7）［Ｅｎｔｒｙ４］）に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（９．０μＬ）を加えた後、当該溶液１．０ｍＬを二つにわけ（０．５ｍＬ）、片方には１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）（３．３ｍｇ，ｗｉｔｈ ＨＯＡｔ）を加え、もう片方にはなにも加えず（ｗｉｔｈｏｕｔ ＨＯＡｔ）、それぞれのＮＭＲを測定し、化合物１－３－３ａおよび化合物１－３－２の比率を１Ｈ－ＮＭＲのプロトン積分比から求めた（表１４）。本実験において、化合物１－３－１はentry1では２４．９ｍｇ、ｅｎｔｒｙ２では２５．３ｍｇ、entry３では２５．２ｍｇ、ｅｎｔｒｙ４では２４．９ｍｇ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
　以上の結果から、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ基をＤＢＵで処理した後、酸であるＨＯＡｔ（水中でのｐＫａ ３．２８）を加えると、カルバミン酸塩の存在比率が大きく低下することが確認できた。
　本知見を基に固相での実験結果を考察した場合、特定の理論に限定されるものではないが、実施例３にてＨＯＡｔを加えて中和を試みた場合にジケトピペラジン脱離体およびアミジン体の比率が増加したのは、カルバミン酸塩の存在比率が下がったことが一因であると、矛盾なく説明できる。
　以上、特定の理論に限定されるものではないが、Ｆｍｏｃ保護を塩基で処理した際、Ｎ末端のアミノ基がカルバミン酸塩として存在することによってジケトピペラジン脱離等を軽減できる。また、実施例７－３の結果から、カルバミン酸塩として存在可能な塩基の範囲が特定された。
実施例７－５：ペプチドの固相合成において、脱Ｆｍｏｃ工程にてＣＯ ２ バブリングをした溶媒を用いたペプチド合成の実験
　実施例７－１～７－４において、カルバミン酸塩の存在によって、ジケトピペラジン脱離等の原因となる６員環を形成しないことがジケトピペラジン形成の抑制につながっていることが説明できた。そこで脱Ｆｍｏｃ反応時のカルバミン酸塩の安定化のため、炭酸源としてＣＯ２バブリングをした溶媒を用いることで、ジケトピペラジン脱離体の生成にどのような影響を及ぼすか、確認実験を行った。
条件Ａ（表１５、ｒｕｎ１、ＣＯ２バブリングをしない条件）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５６７ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－３から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－１１）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－ＯＨ（０．２２７ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２７ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５６ｍＬ、０．３４０ｍｍｏｌ、６当量）を混合して、１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
条件Ｂ（表１５、ｒｕｎ２、ＣＯ２バブリングした溶媒を用いる条件）
　実施例１－２－５にて既に調製済みのペプチドの担持された固相樹脂（０．５６７ｍｍｏｌ／ｇの化合物１－２－３から実施例１－２－５にて調製した化合物１－２－１１）１００ｍｇを固相反応容器に入れ、窒素置換されたグローブボックス内にてＤＣＭ（１．０ｍＬ）を加え１０分間静置することでレジンの膨潤を行った。その後、溶液をフリットから排出し、続いてレジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で２回洗浄した。１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）のＣＯ２－ＤＭＦ溶液（２ｖ／ｖ％、１カラムあたり０．７ｍＬ）を添加し、室温にて１０分間反応させてＦｍｏｃ基の脱保護を行った。なお、ＣＯ２－ＤＭＦ溶媒は、１００ｍＬのガラス瓶入れた５０ｍＬのＤＭＦに対してＣＯ２ガスを５分間バブリングさせることで調製した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で６回洗浄した。
　上記により得られたレジンに対し、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－ＯＨ（０．２２７ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）と［エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト－Ｏ２］トリ１－ピロリジニルホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＯｘｉｍ）（０．２２７ｍｍｏｌ、４当量）のＤＭＦ溶液（０．２５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．０５６ｍＬ、０．３４０ｍｍｏｌ、６当量）を混合して、１～２分程度静置した溶液を添加し、室温で２時間振盪した。溶液をフリットから排出した後、レジンをＤＭＦ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回、ＤＣＭ（１カラムあたり０．７ｍＬ）で４回洗浄し、乾燥させた。
　反応の進行を確認するため、それぞれ得られたレジンの一部をとりだし、ＤＣＭで膨潤させた後、ＤＩＰＥＡ（０．０４５ｍｏｌ／Ｌ）を含むＴＦＥ／ＤＣＭ溶液（１／１（ｖ／ｖ））にてペプチドの切り出しをおこなった。切り出した溶液をＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）にて分析し、目的ペプチド（ＴＭ）（化合物４－１－６＊）とジケトピペラジン脱離体（化合物４－２－６＊）とＭｅＩｌｅ過剰伸長体（化合物７－５－１＊）の生成を確認した。
　ＭｅＩｌｅ過剰伸長体、Ｆｍｏｃ－ＭｅＩｌｅ－ＭｅＩｌｅ－Ａｉｂ－Ｐｒｏ－Ｄ－３－Ａｂｕ－ＯＨ（化合物７－５－１＊）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
　ＬＣＭＳ　（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ＝５３８．７（Ｍ－Ｈ）－
　Ｆｍｏｃ保護が外れたフラグメントのＭＳ（（Ｍ－Ｈ－Ｆｍｏｃ）－）として検出
　保持時間：２．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
　得られた結果（それぞれの条件での、化合物４－１－６＊、化合物４－２－６＊、化合物７－５－１＊のＬＣＭＳでのＵＶ面積の相対比率をパーセントにて表記）を以下の表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
　以上、実施列７－５の結果より、脱Ｆｍｏｃ反応時にＣＯ２バブリングをした溶媒を用いる場合（ｒｕｎ２）には、ＣＯ２バブリングをしない溶媒を用いる場合（ｒｕｎ１）と比較し、ジケトピペラジン脱離体の生成を抑制できることを確認した。
　本発明により、固相法を用いたペプチドの製造において、ジケトピペラジンや６員環状アミジン骨格構造体などの副生成物の形成を抑制して、効率的にペプチド鎖を伸長できることが見出された。本発明は、固相法によるペプチド合成の分野において有用である。

Claims (17)

  1. 　固相法によるペプチドの製造方法であって、
    （１）固相合成用樹脂に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程、
    （２）前記工程（１）の後に、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程；および
    （３）前記工程（２）の後に、前記第一のペプチドと、カルボン酸またはカルボン酸類縁体とを、溶媒中、縮合剤の存在下または非存在下で縮合させて、第三のペプチドを得る工程を含む、前記製造方法。
  2. 　前記工程（２）に先立って、前記第一のペプチドを単一の塩基としてのピペリジンで処理する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（２）と前記工程（３）の間に、酸を加えて残存する塩基を中和する工程を含まない、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記工程（２）により得られる第一のペプチドの少なくとも一部が、カルバミン酸塩の形態にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記工程（２）における前記溶媒が、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を２５ｖ／ｖ％以上含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記芳香族炭化水素系溶媒がトルエン、ベンゼン、キシレン、クロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、ブロモベンゼン、アニソール、エチルベンゼン、ニトロベンゼン、およびクメンからなる群より選択される１種または複数種であり、
    　前記ハロゲン系溶媒がジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および四塩化炭素からなる群より選択される１種または複数種であり、
    　前記エーテル系溶媒がテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、２－メチルテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン、１，３－ジオキソラン、ジイソプロピルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン、ジグリム、トリグリム、およびテトラグリムからなる群より選択される１種または複数種であり、
    　前記エステル系溶媒が酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸イソブチル、酢酸ペンチル、およびγ―バレロラクトンからなる群より選択される１種または複数種であり、
    　前記ケトン系溶媒がアセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、およびジエチルケトンからなる群より選択される１種または複数種であり、
    　前記カーボネート系溶媒がジメチルカーボネート、ジエチルカーボネート、およびジブチルカーボネートからなる群より選択される１種または複数種であり、および
    　前記リン酸エステル系溶媒がリン酸トリメチル、リン酸トリエチル、およびリン酸トリブチルからなる群より選択される１種または複数種である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記工程（２）における前記溶媒が、２６以下のドナーナンバー値を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記工程（２）における前記塩基が、アミジン類、グアニジン類およびホスファゼン類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記工程（２）における前記塩基が、ＤＢＵ、ＭＴＢＤ、ＴＭＧ、Ｐ１ｔＢｕ、Ｐ２ＥｔおよびＨＰ１（ｄｍａ）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　前記工程（２）が、前記溶媒にＣＯ２を接触させる工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸、もしくはＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸であるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸、保護基を有する第二のペプチド、C1-C8アルキルカルボン酸、もしくはC6-C10アリールカルボン酸の酸ハロゲン化物であり、該Ｃ１－Ｃ８アルキルカルボン酸およびＣ６－Ｃ１０アリールカルボン酸は、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、ジアルキルアミノ、シアノ、アルコキシカルボニル、およびジアルキルアミノカルボニルからなる群より独立して選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記第一のペプチドがジペプチドである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　前記カルボン酸またはカルボン酸類縁体が、Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの活性エステルであるか、または保護基を有するアミノ酸もしくは第二のペプチドの酸ハロゲン化物であり、前記第一のペプチド、および／または前記Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第二のペプチドが、１つまたは複数のＮ－置換アミノ酸を含む、および／または前記Ｆｍｏｃ骨格を含む保護基を有するアミノ酸がＮ－置換アミノ酸である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記第一のペプチドのＮ末端から２残基目のアミノ酸が、Ｎ－置換アミノ酸である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記工程（３）における前記縮合剤が塩の形態にあり、そのカウンターアニオンがＰＦ６ －またはＢＦ４ －である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記工程（３）における前記縮合剤が、ＰｙＯｘｉｍ、ＰｙＡＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＣＯＭＵ、ＨＡＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＤＢＴＵ、ＨＯＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＴＣＴＵ、およびＴＯＴＵからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　固相法によるペプチドの製造における、ジケトピペラジン不純物および／または６員環状アミジン骨格構造体不純物の生成量を低減させる方法であって、
    （１）固相に担持されたＦｍｏｃ骨格を含む保護基を有する第一のペプチドを提供する工程；および
    （２）前記工程（１）の後に、芳香族炭化水素系溶媒、ハロゲン系溶媒、エーテル系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、カーボネート系溶媒、およびリン酸エステル系溶媒からなる群より選択される少なくとも１種を含む溶媒中、前記第一のペプチドを、共役酸のアセトニトリル中でのｐＫａが２３以上である塩基を少なくとも含む１種または複数種の塩基で処理する工程
    を含む、前記方法。
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