CN117279928A - 包含n-取代氨基酸残基的环状化合物的制备方法 - Google Patents

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CN117279928A CN202280031973.4A CN202280031973A CN117279928A CN 117279928 A CN117279928 A CN 117279928A CN 202280031973 A CN202280031973 A CN 202280031973A CN 117279928 A CN117279928 A CN 117279928A
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侯增烨
濑户健太郎
田中耕太
青木雅英
佐近彩
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Abstract

本发明发现在包含选自不与水混溶的溶剂、水溶性烷基腈类、和水溶性醚类的1个或多个的溶剂中，通过使肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接，可以有效制备环状肽化合物。

Description

包含N-取代氨基酸残基的环状化合物的制备方法
技术领域
本发明涉及包含N-取代氨基酸残基的环状化合物的制备方法。
背景技术
如里宾斯基法则中已知的那样，以往作为口服药应用的化合物期望分子量为500g/mol以下(非专利文献1)。近年来，已知分子量超过500g/mol的化合物在以往的低分子化合物中难以相互作用，可有助于在被称为硬靶(tough target)的靶标蛋白表面的相互作用，即蛋白-蛋白相互作用抑制等。这些分子既不是作为口服药应用的分子量为500g/mol以下的低分子，也不是如抗体药物那样分子量超过100000g/mol的高分子，被称为中分子化合物(分子量500-2000g/mol)，作为可实现对硬靶的制药的新模式受到关注(非专利文献2)。
如高血糖症的治疗中应用的胰岛素那样，由天然氨基酸组成的肽缺乏代谢稳定性，以往难以将肽作为口服药开发。但是，发现通过肽的环化、肽中应用由N-甲基氨基酸示例的非天然氨基酸，肽的代谢稳定性、膜通透性提高(非专利文献3、4)。
已知在包含非天然氨基酸的环状肽中，特别是包含N-取代氨基酸的环状肽可具有代谢稳定性、膜通透性，即可具有药物类似性(专利文献1)。
提示着包含非天然型氨基酸的环状肽的化合物对蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的创造是有用的(非专利文献5)。
随着肽作为药物受到重视，其合成法也得到广泛研究(非专利文献6)。肽的合成是通过将氨基酸依次进行酰胺键形成反应而向期望的氨基酸序列延伸来实现的，但对于在该序列中含有非天然氨基酸的肽、特别是含有N-甲基氨基酸的肽的制备，N-甲基的空间位阻引起的缩合反应的低反应性和氨基酸残基的α位的外消旋化等导致的目标物的收率的降低成为问题(非专利文献7)。卤代烃溶剂(例如二氯甲烷等)和酰胺溶剂(例如DMF等)在肽合成中广泛被使用，但这样的副反应可在具有N-取代氨基酸等低反应性氨基酸的肽合成中观察到(非专利文献8)。此外，从环境负荷的观点出发，卤代烃溶剂(例如二氯甲烷等)、酰胺溶剂(例如DMF等)的使用受到限制(非专利文献9)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/100132号
非专利文献
非专利文献1：Adv.Drug Del.Rev.1997,23,3-25.
非专利文献2：Future Med.Chem.,2009,1,1289-1310.
非专利文献3：Acc.Chem.Res.,2008,41,1331-1342.
非专利文献4：Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,254-269.
非专利文献5：Chem.Rev.,2019,119,10360-10391.
非专利文献6：Amino Acids,Peptides and Proteins in Organic Chemistry：Building Blocks,Catalysis and Coupling Chemistry,Volume 3,2011.
非专利文献7：J.Peptide Res.,2005,65,153-166.
非专利文献8：Side Reactions in Peptide Synthesis,Academic Press,2015.
非专利文献9：Green Chem.Lett.Rev.,2021,14,153-164.
发明概述
发明要解决的问题
本发明是鉴于这样状况而完成的，在一方面，本发明的问题是提供有效制备肽化合物、特别是包含多个N-取代氨基酸等非天然氨基酸的直链或环状的肽化合物的方法，其利用不分离中间体、例如作为下一步骤的前操作不分离中间体，也可用于大规模尺度的手段。在一方面，本发明的问题是提供不依赖柱色谱而分离、纯化目标的环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物的方法。在一个方式中，本发明的目的是提供通过用溶解稳定剂的溶剂洗涤肽化合物的制备步骤中应用的溶剂中所包含的稳定剂(例如，BHT等抗氧化剂)，在不分离各步骤中制备的目标物的情况下，除去稳定剂的方法。在一个方式中，本发明的目的特别是提供如下方法：将含有N-取代氨基酸等多个非天然氨基酸的例如直链状或环状的肽化合物通过不分离各个反应步骤的中间体或肽化合物而缩短各步骤中的作业时间，连续进行下一步骤。因此，本说明书中记载的本发明的1个方面是提供肽化合物的制备方法，其可包括包含溶解稳定剂的溶剂的使用的1个以上反应步骤。
肽合成一般通过重复将氨基酸或肽的C末端的羧基与氨基酸或肽的N末端的氨基连接的步骤、延伸肽链而进行，但已知在该步骤中可发生各种副反应(Side Reactions inPeptide Synthesis,Academic Press,2015.)。因此，在肽合成，特别是通过液相法的肽合成中，通常在延伸步骤之间或环化步骤之前分离、纯化产物。但是，在工业尺度的肽合成中，由于中间体的分离、纯化导致合成时间的延长和费用的增加，期望不分离、纯化到达目标肽之前的中间体而连续进行下一延伸反应和环化反应。
另一方面，在肽链的延伸反应中，延伸源的氨基酸或肽的羧基、被延伸的氨基酸或肽的氨基大多受到保护，氨基酸的ω链也常受到保护(肽合成的基础和实验：泉屋信夫(著)丸善(1985).)。这样的保护氨基酸或保护肽容易从反应液中析出，常不溶于有机溶剂(国际公开第2017/038650号、国际公开第2018/021233号、国际公开第2018/155669号、国际公开第2019/123994号、国际公开第2017/221889号)。此外，无保护氨基酸或无保护肽也因其亲水性难以溶于有机溶剂。进一步，随着延伸肽链，促进凝集，肽化合物的溶解性降低的情况也很多(生物和化学,2018,56(8),558；J.Biol.Chem.,1963,238,4074.、Sci Rep,2016,6(28),1.)。
为了溶解这些氨基酸或肽，在肽的合成反应中，应用溶解能力高的溶剂，例如DMF或二甲基亚砜，另外，也多使用具有优异溶解能力的二氯甲烷。例如，据报告，在肽合成中，DMF以整体的47％使用，二氯甲烷以36％的比例使用，将这些溶剂的使用比例合并，则为整体的83％(Green Chem.,2013,15,596-600.)。
但是，由于二氯甲烷有毒性，DMF因使用量成为法规的对象，所以在工业制备方法中，应避免这些溶剂的使用。此外，DMF和二甲基亚砜可通过加热而分解，而且沸点高，因此如果它们混入作为目标的产物，则难以除去。进一步，由于通过DMF的分解产生的二甲胺可参与肽延伸反应，导致不期望的肽副产物(Side Reactions in Peptide Synthesis,Academic Press,2015.)。也存在由二甲基亚砜产生的二甲基硫醚散发异味的问题。
特别地，在工业尺度，由于使用的溶剂变得大量，其蒸馏除去也常需要严酷的时间和加热，所以容易推测在这样的操作中分解物增加。因此，发现在蒸馏除去溶剂时热稳定、且能够有效进行肽链的延伸反应或环化反应的溶剂是重要的。
此外，由于DMF或二甲基亚砜对水的溶解度高，与水混溶，因此有时目标物与这些有机溶剂一起转移到水层而引起产量的降低，与水溶液的分液处理操作也变得低效。例如，当水混入有机层时，在蒸馏除去含有目标物的有机溶剂后，水残留，根据情形，引起肽键的水解(Side Reactions in Peptide Synthesis,Academic Press,2015.)。
在工业制法中，由于蒸馏除去溶剂所需的时间也增大，因此不仅产量降低，还容易产生水的混入引起的副反应也成为问题。
因而，需要发现在分液操作中形成与水层分离良好的有机层的方法，和能够合成肽且对水的溶解度低而难以与水混溶的溶剂。
进一步，根据溶剂，有时含有稳定剂(例如BHT等抗氧化剂)。在少量尺度或短步骤的合成中，残存的稳定剂总量不多，作为杂质不突出。但是，步骤数和生产量增加时，由于稳定剂在中间体等中原样大量残留，因此对其后的步骤的影响有时不能忽视(例如，中间体中所包含的稳定剂对下一步中化学反应产生影响的情形、药物的有效成分的情形、作为目标的最终化合物中所包含的稳定剂引起药效以外的预想不到的作用的情形等)。当中间体被分离和纯化时，可经这些过程除去稳定剂。但是，关于期望省略这样的操作的工业生产工艺，稳定剂有可能在中间体和最终化合物中蓄积。在工业生产工艺中，需要用于有效去除稳定剂的一般技术。
此外，为了不分离、纯化中间体连续进行肽链的延伸而合成最终产物，在缩合或脱保护等各步骤中，需要抑制副反应，使反应条件为仅以分液操作等后处理进行下一步骤。特别地，在工业尺度的肽合成的情形中，由于目标物用柱色谱的纯化效率低，需要不依赖柱色谱、通过晶析得到可纯化的粗产物的方法或仅用分液操作等后处理得到目标物的方法，还需要新发现为此的反应条件和后处理条件。
用于解决问题的手段
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现与以往惯用于肽的液相合成的DMF、二氯甲烷、二甲基亚砜等溶剂不同的特定的溶剂，例如，满足下列要件的肽合成中有用的溶剂：(i)难以通过加热分解、(ii)在分液操作中与水层的分离良好、并且(iii)肽链的延伸反应、环化反应进行良好。本说明书中记载的方法中有用的溶剂对热分解可具有抵抗性。这样的抵抗性优选可以应用测定仪器(例如，GC、LC或NMR，优选GC)，通过某温度范围的溶剂的稳定性试验来确定。特定用途的溶剂可以在高温具有抵抗性(例如，在沸点附近稳定48小时、或在室温附近稳定2个月，优选在沸点附近稳定48小时)，在上述示例的条件下，它们的纯度可以保持在99％以上、优选99.9％以上。本发明的溶剂在分液操作中可以显示与水层良好的分离。这样的分离可通过如下方式确定：将溶剂和水各等量在分液漏斗、反应烧瓶或反应槽中，在室温附近(例如，15℃～40℃、优选20℃～30℃)混合30分钟以内、优选15分钟以内。本发明的溶剂可以充分进行肽链的延伸反应和环化反应。这样的反应进行优选可以通过使用测定仪器(例如，GC、LC或NMR，优选GC)确定目标化合物的化学收率或起始物质向目标化合物的化学转化来确定。特定用途的溶剂可赋予化学收率70％～100％、或化学转化率70％～100％，优选化学收率和化学转化率的两者为80％～100％。更优选地，本发明的溶剂是在沸点附近可稳定48小时的溶剂、在20℃-30℃在15分钟内用分液操作可显示良好分离的溶剂、起始物质的化学收率和化学转化两者可达到80％～100％的溶剂。通过在各反应或反应的后处理操作时适当组合应用满足这些要件的1种或多种溶剂，可以不分离中间体，仅通过分液或过滤等简便的操作连续延伸肽链，可以环化肽化合物，可以除去溶剂中所包含的稳定剂。即，关于其后的反应，不需要如本技术领域理解的那样分离中间体，例如单一的产物。相反，根据本发明，用于下一反应的溶液包含中间体(前一反应的产物)，且可进一步包含前一反应的1个以上反应物质、或试剂，它们可在下一反应之前溶解。此外，本发明人等发现，在分液操作中，通过应用特定的水溶液或有机溶剂，可以有效洗涤有机层或水层。进一步，本发明人等发现，根据本发明的方法，通过将不分离、纯化中间体制备的环状肽化合物不依赖于柱色谱经晶析分离、纯化，可以得到环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物，进一步得到环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物的晶体。此外，本发明人等发现可抑制缩合和脱保护的各反应中副产物的生成的反应条件。
本发明在非限定的具体的一个方式中包含以下内容。
[1]通过液相法制备环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物的方法，其包括：在包含选自1种或多种不与水混溶的溶剂、1种或多种水溶性烷基腈类、和1种或多种水溶性醚类的1个或多个的溶剂(溶剂A)中，将肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤。
[1-1][1]中记载的方法，其中，溶剂A包含1个以上选自2-MeTHF、THF、4-甲基四氢吡喃、MTBE、CPME、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、苯甲醚、MeCN、庚烷、和甲苯的溶剂。
[2][1]中记载的方法，其中，N末端的氨基酸残基和C末端的氨基酸残基通过选自酰胺键、或-(CH2)nS(CH2)m-、-(CH2)nS(O)(CH2)m-、或-(CH2)nS(O)2(CH2)m-的键连接，此处，n和m分别独立为1或2。
[3][1]或[2]中记载的方法，其中，环状肽化合物包含8～20个氨基酸残基，该氨基酸残基的至少1个是非天然氨基酸残基。
[4][1]～[3]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物包含9～15个氨基酸残基，该氨基酸残基的至少1个是非天然氨基酸残基。
[5][1]～[4]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物包含至少1个N-取代的非天然氨基酸残基。
[6][1]～[5]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物包含至少1个N-非取代的非天然氨基酸残基。
[7][1]～[6]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物包含至少1个α,α二取代氨基酸残基。
[8][1]～[7]的任一项中记载的方法，其中，C末端的氨基酸残基或N末端的氨基酸残基的一者或两者是在羧基的α位碳没有不对称碳的氨基酸残基。
[9][1]～[8]的任一项中记载的方法，其中，C末端的氨基酸残基是在羧基的α位碳没有不对称碳的氨基酸残基。
[10][1]～[8]的任一项中记载的方法，其中，N末端的氨基酸残基是N-非取代的氨基酸残基。
[11][1]～[10]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物是环状肽化合物的溶剂化物。
[12][1]～[11]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物的溶剂化物是环状肽化合物的水合物。
[13][1]～[12]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物由下述式表示。
[化学式1]
[14][1]～[13]的任一项中记载的方法，其中，环状肽化合物的分离和/或纯化中不应用柱色谱。
[15][1]～[14]的任一项中记载的方法，其进一步包括通过晶析分离和/或纯化环状肽化合物，得到环状肽化合物的晶体的步骤。
[16][15]中记载的方法，其中，环状肽化合物的晶体是由下述式表示的环状肽化合物的非溶剂化物晶体、或溶剂化物晶体。
[化学式2]
[17][16]中记载的方法，其中，环状肽化合物的溶剂化物晶体是水合物晶体。
[18][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少7个峰。
[18-1][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少8个峰。
[18-2][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少9个峰。
[18-3][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少10个峰。
[18-4][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少11个峰。
[18-5][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少12个峰。
[18-6][17]中记载的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的峰。
[19][16]中记载的方法，其中，非溶剂化物晶体是F型晶体，前述F型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为5.370°、6.934°、8.940°、9.838°、10.771°、12.181°、13.525°、15.179°、16.202°、和17.554°(±0.2°)的峰。
[20][16]中记载的方法，其中，溶剂化物晶体是A型的DMSO-水合物晶体，前述A型的DMSO-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为8.006°、9.002°、9.943°、11.501°、13.067°、14.854°、16.320°、17.275°、19.261°、和20.324°(±0.2°)的峰。
[21][16]中记载的方法，其中，溶剂化物晶体是B型的DMSO-水合物晶体，前述B型的DMSO-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为8.223°、9.594°、9.976°、11.879°、13.841°、14.572°、15.934°、16.350°、19.805°、和20.480°(±0.2°)的峰。
[22][16]中记载的方法，其中，溶剂化物晶体是H型的丙酮-水合物晶体，前述H型的丙酮-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为7.942°、8.283°、8.861°、10.097°、10.491°、11.805°、12.673°、12.830°、13.514°、13.855°、15.853°、16.405°、16.642°、和17.772°(±0.2°)的峰。
[23][1]～[22]的任一项中记载的方法，其中，溶剂A是由2-MeTHF组成的溶剂、或包含2-MeTHF的溶剂。
[23-1][1]～[22]的任一项中记载的方法，其中，溶剂A包含选自2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃、庚烷、和甲苯的1个以上的不与水混溶的溶剂。
[24][1]～[22]的任一项中记载的方法，其中，溶剂A包含作为乙腈和/或丙腈的水溶性烷基腈类。
[25][1]～[22]的任一项中记载的方法，其中，溶剂A包含选自THF、1,4-二噁烷、1,3-二噁烷、和二甲氧基乙烷的1个以上的水溶性醚类。
[26]通过液相法制备肽化合物的方法，其包括：
步骤1：将N-保护氨基酸或N-保护肽连接于C-保护氨基酸或C-保护肽的步骤，
步骤2：在步骤1之后除去N-保护基的步骤，和
任选地，多次重复步骤1与步骤2，制备肽化合物的步骤，
该方法不包括分离步骤1与步骤2的产物的步骤。
[27][1]～[26]的任一项中记载的方法，其中，肽化合物是直链肽化合物。
[28][26]或[27]中记载的方法，其中，肽化合物包含环状结构作为其部分结构。
[29][1]～[25]的任一项中记载的方法，其中，溶剂A包含制备肽化合物后的溶剂，肽化合物通过[26]中记载的方法制备。
[30][26]～[29]的任一项中记载的方法，其中，分别进行1次步骤1与步骤2，或重复2次～20次步骤1与步骤2。
[31][26]～[30]的任一项中记载的方法，其中，制备肽化合物的方法进一步包括除去C-保护基的步骤3。
[32][26]～[31]的任一项中记载的方法，其中，重复的最终次不包括步骤2。
[33][31]或[32]中记载的方法，其中，步骤3在重复的最终次的步骤1之后进行。
[34][26]～[33]的任一项中记载的方法，其中，制备肽化合物的方法中包含的各步骤在独立选自甲苯、丙酮、DMF、乙腈、THF、2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、庚烷、乙酸乙酯、MTBE、和4-甲基四氢吡喃的1个或多个溶剂(溶剂B)中进行。
[34-1][26]～[33]的任一项中记载的方法，其中，溶剂B选自2-MeTHF、MTBE、乙酸异丙酯、和乙酸乙酯。
[35][26]～[34]的任一项中记载的方法，其中，制备肽化合物的方法中包含的各步骤的后处理包括选自分液操作、过滤操作、和浓缩操作的1个或多个操作。
[36][35]中记载的方法，其中，在分液操作之前，添加不与水混溶的溶剂(溶剂C)、水溶性烷基腈类、和/或水溶性醚类。
[37][36]中记载的方法，其中，溶剂C是选自2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃、和庚烷的1个或多个。
[38][36]或[37]中记载的方法，其中，溶剂C是2-MeTHF。
[39][36]～[38]的任一项中记载的方法，其中，溶剂C以可分离的量添加于水层和有机层。
[40][39]中记载的方法，其中，可分离的量相对于有机层整体是约50重量％～100重量％。
[41][35]～[40]的任一项中记载的方法，其中，有机层包含2-MeTHF。
[42][35]～[40]的任一项中记载的方法，其中，分液操作包括有机层的洗涤操作。
[42-1][35]～[41]的任一项中记载的方法，其中，洗涤操作包括：应用包含柠檬酸和磷酸氢二钾的水溶液进行的有机层的洗涤操作，或应用2-MeTHF、庚烷、MTBE、或乙酸异丙酯进行的水层的洗涤操作。
[43][35]～[42]的任一项中记载的方法，其中，洗涤操作包括应用乙腈和碳酸钾水溶液的混合液进行的有机层的洗涤操作。
[44][35]～[43]的任一项中记载的方法，其中，分液操作包括应用碳酸钠水溶液、硫酸氢钠水溶液、和/或碳酸钠水溶液进行的有机层的洗涤操作。
[44-1][35]～[43]的任一项中记载的方法，其中，分液操作包括应用碳酸钠水溶液、硫酸氢钠水溶液、和碳酸钠水溶液进行的有机层的洗涤操作。
[45][35]～[44]的任一项中记载的方法，其中，分液操作后，有机层相对于目标物含有2％以下的BHT。
[45-1][1]～[23-1]的任一项中记载的方法，其中，(1)肽化合物用[26]～[45]的任一项的方法制备，和(2)溶剂A进一步包含[35]～[45]的任一项的方法中使用的溶剂。
[46][26]～[45]的任一项中记载的方法，其中，步骤1包括将C-保护氨基酸或C-保护肽的N末端的氨基、和N-保护氨基酸或N-保护肽的C末端的羧基缩合的步骤。
[47][46]中记载的方法，其中，羧基被活化。
[48][46]中记载的方法，其中，步骤1在缩合试剂的存在下进行。
[49][48]中记载的方法，其中，缩合试剂包含选自T3P、EDCI、HATU、COMU、BEP、PyBOP、DMT-MM、和PyOxim的缩合剂。
[50][26]～[49]的任一项中记载的方法，其中，步骤2在催化剂的存在下通过接触氢化进行。
[51][50]中记载的方法，其中，催化剂选自Pd/C、Pd(OH)2/C、或PtO2。
[52][26]～[49]的任一项中记载的方法，其中，步骤2在脱保护试剂的存在下进行。
[53][52]中记载的方法，其中，脱保护试剂选自TBAF、LiBH4、哌啶、三氟乙酸、或甲磺酸。
[54][26]～[53]的任一项中记载的方法，其中，N-保护基选自Cbz、对硝基苄氧基羰基、2-萘基甲基氧基羰基、二苯基甲基氧基羰基、9-蒽基甲基氧基羰基、Teoc、Boc、三氟乙酰基、Fmoc、或Alloc。
[55][26]～[44]的任一项中记载的方法，其中，步骤3在脱保护试剂的存在下进行。
[56][55]中记载的方法，其中，脱保护反应在酸性条件进行。
[57][56]中记载的方法，其中，酸性条件用HMDS与选自TMSOTf、TMSI、TMSBr和TMSCl的试剂的组合实现。
[58][26]～[57]的任一项中记载的方法，其中，C-保护基选自t-Bu、三苯甲基、枯基、甲基、或乙基。
[59][26]～[58]的任一项中记载的方法，其中，C-保护肽和N-保护肽的一者或两者包含2～20个氨基酸残基，该C-保护肽和N-保护肽的一者或两者中包含的该氨基酸残基的至少1个是非天然氨基酸残基。
[60][26]～[59]的任一项中记载的方法，其中，C-保护肽和N-保护肽的一者或两者包含至少1个N-取代氨基酸残基。
[61][26]～[60]的任一项中记载的方法，其中，C-保护肽和N-保护肽的一者或两者包含至少1个N-非取代的非天然氨基酸残基。
[62][26]～[61]的任一项中记载的方法，其中，重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽和N-保护肽的一者或两者包含4个以上N-取代氨基酸残基，或包含2个以上N-取代氨基酸残基，并且包含1个以上α,α二取代氨基酸残基。
[63][26]～[62]中记载的方法，其中，重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽和N-保护肽的一者或两者由5个或6个氨基酸残基组成，包含4个或5个非天然氨基酸残基。
[64][63]中记载的方法，其中，重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽是C-保护的MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGly，重复的最终次的步骤1中应用的N-保护肽是N-保护的Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2。
[65][26]～[61]的任一项中记载的方法，其中，C-保护氨基酸或其盐、或C-保护肽或其盐是：
[化学式3]
[66][26]～[61]的任一项中记载的方法，其中，N-保护氨基酸或其盐、或N-保护肽或其盐是：
[化学式4]
[67][26]～[61]的任一项中记载的方法，其中，肽化合物是：
[化学式5]
/>
[68][26]～[67]的任一项中记载的方法，其进一步包括将肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤。
[69]由下述式：
[化学式7]
表示的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的制备方法，其包括：
(1)准备由下述式：
[化学式6]
表示的直链肽化合物的步骤，
(2)将N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤。
[70]由下述式表示的环状肽化合物的盐、溶剂化物、或盐的溶剂化物。
[化学式8]
[70-1]由式1表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物，其具有90％以上、95％以上、98％以上、或99％以上的纯度，前述纯度是根据经HPLC分析的在210nm的UV面积值来确定的。
[70-2]高纯度的由式1表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物，其特征在于，根据经HPLC分析的在210nm的UV面积％来确定的总杂质的量为小于5％、小于2％、小于1％、小于0.5％、或无法检测的量。
[70-3][70-2]中记载的高纯度的由式1表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物，其特征在于，根据经HPLC分析的在210nm的UV面积％来确定的杂质各自的量为分别小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或无法检测的量。
[70-4][70-2]或[70-3]中记载的高纯度的由式1表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物，其特征在于，根据经HPLC分析的在210nm的UV面积％来确定的杂质的量为小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或无法检测的量，该杂质选自差向异构体、过度延伸体、缺损体、二聚体、和三聚体。
[70-5][70-2]、[70-3]或[70-4]中记载的高纯度的由式1表示的化合物、其盐、或它们的溶剂化物，其特征在于，根据经HPLC分析的在210nm的UV面积％来确定的杂质的量为小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或无法检测的量，该杂质是以下所示环状二聚体(环状二聚体)、和/或以下所示环状三聚体(环状三聚体)。
[化学式9]
/>
[71][70]中记载的环状肽化合物的溶剂化物，其为水合物、DMSO-水合物、丙酮-水合物、或DMSO溶剂化物。
[72]由下述式表示的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的晶体。
[化学式10]
[73][72]中记载的晶体，其中，晶体选自非溶剂化物晶体、溶剂化物晶体、盐的晶体、和盐的溶剂化物晶体。
[74][73]中记载的晶体，其中，晶体是溶剂化物晶体。
[75][72]中记载的晶体，其中，溶剂化物晶体是水合物晶体。
[76][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少7个峰。
[76-1][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少8个峰。
[76-2][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少9个峰。
[76-3][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少10个峰。
[76-4][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少11个峰。
[76-5][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少12个峰。
[76-6][75]中记载的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，前述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的峰。
[77][73]中记载的晶体，其中，非溶剂化物晶体是F型晶体，所述F型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为5.370°、6.934°、8.940°、9.838°、10.771°、12.181°、13.525°、15.179°、16.202°、和17.554°(±0.2°)的峰。
[78][73]中记载的晶体，其中，溶剂化物晶体是A型的DMSO-水合物晶体，前述A型的DMSO-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为8.006°、9.002°、9.943°、11.501°、13.067°、14.854°、16.320°、17.275°、19.261°、和20.324°(±0.2°)的峰。
[79][73]中记载的晶体，其中，溶剂化物晶体是B型的DMSO-水合物晶体，前述B型的DMSO-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为8.223°、9.594°、9.976°、11.879°、13.841°、14.572°、15.934°、16.350°、19.805°、和20.480°(±0.2°)的峰。
[80][73]中记载的晶体，其中，溶剂化物晶体是H型的丙酮-水合物晶体，前述H型的丙酮-水合物晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为7.942°、8.283°、8.861°、10.097°、10.491°、11.805°、12.673°、12.830°、13.514°、13.855°、15.853°、16.405°、16.642°、和17.772°(±0.2°)的峰。
[81]制备由下述式表示的环状肽化合物的水合物晶体的方法，其包括：
使该环状肽化合物溶解于可溶解该环状肽化合物的量的极性有机溶剂，得到溶液的步骤，
浓缩该溶液，得到该环状肽化合物的残渣的步骤，和
在该残渣中加入水和极性有机溶剂的混合液，得到该环状肽化合物的水合物晶体的步骤。
[化学式11]
[82]制备由下述式表示的环状肽化合物的水合物晶体的方法，其包括：
使无定形状态的该环状肽化合物溶解于DMSO，得到溶液的步骤，冷冻干燥该溶液，得到该环状肽化合物的冷冻干燥物的步骤，和
在该冷冻干燥物中加入水-乙腈混合液，得到该环状肽化合物的水合物晶体的步骤。
[化学式12]
除非特别说明，在上述编号中，从属项引用的编号包括该编号的分支号。例如，从属项中引用的[1]表示包含[1]和作为其分支号的[1-1]。其它编号也同样。
发明效果
根据本发明，即使在具有包含多个非天然氨基酸残基的复杂氨基酸序列的情况下，也可以抑制氨基酸残基的外消旋化或分子间反应，有效制备环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物。此外，根据本发明，由于不分离、纯化中间体，仅进行分液、过滤、和浓缩等简单后处理，就能够进行肽链的连续延伸或其后的环化，因此可以有效制备作为目标的肽化合物。由于本发明的制备方法可以削减肽化合物的制备成本，也可以减轻环境负荷，因此在大规模尺度的肽合成中特别有用。
附图简述
[图1]图1显示实施例25中得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的粉末X线衍射测定的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
[图2]图2显示实施例25-2中得到的化合物1的非溶剂化物晶体(F型晶体)的粉末X线衍射测定的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
[图3]图3显示实施例25-3中得到的化合物1的晶体(A型晶体)的粉末X线衍射测定的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
[图4]图4显示实施例25-3中得到的化合物1的晶体(B型晶体)的粉末X线衍射测定的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
[图5]图5显示实施例25-3中得到的化合物1的晶体(B型晶体)的热重/差热分析的结果。横轴是温度(℃)，右纵轴是热重分析中样品的重量变化(％)。左纵轴表示差热分析中观测的热流。
[图6]图6显示实施例25-3中得到的化合物1的晶体(B型晶体)的1H-NMR测定的结果。
[图7]图7显示实施例25-4中得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的相对湿度75％、30％、0％中粉末X线衍射测定的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
[图8]图8显示实施例26中得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的热重/差热分析的结果。横轴是温度(℃)和测定时间(分钟)，右纵轴是热重分析中样品的重量变化(mg)。左纵轴表示差热分析中观测的热流(mW)。
[图9]图9显示实施例26中得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的通过单晶体X线结构分析的晶体结构。
[图10]图10显示实施例26中得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的动态水蒸气吸附测定的结果。纵轴是重量变化(％)，横轴是相对湿度(％)。在图10中，“循环1吸附”(黑色菱形标记)表示循环1中的吸附，“循环1解吸”(黑色方形标记)表示循环1中的脱离，“循环2吸附”(黑色三角标记)表示循环2中的吸附，“循环2解吸”(黑色方形标记)表示循环2中的脱离。
[图11]图11显示实施例26-1中得到的化合物1的DMSO-水合物晶体(A型晶体)通过单晶体X线结构分析的晶体结构。该晶体结构中化合物1：DMSO：水建模为1：6：3。
[图12]图12显示实施例26-2中得到的化合物1的丙酮-水合物晶体(H型晶体、单晶体X线结构分析用)通过单晶体X线结构分析的晶体结构。该晶体结构中化合物1：丙酮：水建模为1：1：4。
[图13]图13显示实施例26-2中得到的化合物1的丙酮-水合物晶体(H型晶体、粉末X线衍射测定用)的结果。纵轴是衍射强度，横轴是衍射角2θ(°)。
用于实施发明的方式
本说明书中使用的缩写如下所述。
2-MeTHF：2-甲基四氢呋喃
AcOEt：乙酸乙酯
Alloc：烯丙氧羰基
BEP：2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
BHT：2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚
Boc：叔丁氧羰基
Cbz：苄氧基羰基
COMU：(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉基-碳鎓六氟磷酸盐
CPME：环戊基甲基醚
CSA：10-樟脑磺酸
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺
DMA：二甲基乙酰胺
DMAP：4-二甲基氨基吡啶
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMT-MM：4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物
EDCI：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HMDS：1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt：1-羟基苯并三唑
IPAc：乙酸异丙酯
MeCN：乙腈
MTBE：甲基叔丁基醚
MTHP：4-甲基四氢吡喃
NMP：N-甲基吡咯烷酮
PyBOP：1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐
PyOxim：(乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸-O2)-三-(1-吡咯烷基)-磷鎓六氟磷酸盐
T3P：丙基膦酸酐
TBAF：四丁基氟化铵
Teoc：2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基
THF：四氢呋喃
TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基
官能团等定义(以下示例的术语是示例性的，没有特别限定，本领域技术人员可以共同理解)
作为本说明书中的“卤素原子”，示例F、Cl、Br或I。
本说明书中的“烷基”是从脂肪族烃除去任意1个氢原子衍生的1价基团，具有骨架中不含杂原子(指碳和氢原子以外的原子。)或不饱和碳-碳键、含有氢和碳原子的烃基(hydrocarbyl)或烃基团结构的子集。烷基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烷基，具体地，列举碳原子数1～20(C1-C20，下文“Cp-Cq”意味着碳原子数p～q个)的烷基，优选C1-C10烷基，更优选C1-C6烷基。作为烷基，具体地，列举甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基(2-甲基丙基)、正戊基、仲戊基(1-甲基丁基)、叔戊基(1,1-二甲基丙基)、新戊基(2,2-二甲基丙基)、异戊基(3-甲基丁基)、3-戊基(1-乙基丙基)、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基等。
本说明书中的“烯基”是具有至少1个双键(2个相邻SP2碳原子)的1价基团。根据双键和取代基(存在时)的构型，双键的几何学形式可以是entgegen(E)或zusammen(Z)、顺式或反式构型。烯基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为烯基，优选列举C2-C10烯基、更优选列举C2-C6烯基，具体地，例如，列举乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包括顺式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。
本说明书中的“炔基”是具有至少1个三键(2个相邻SP碳原子)的1价基团。炔基不仅包含直链状的那种，也包含支链状的那种。作为炔基，优选列举C2-C10炔基、更优选列举C2-C6炔基，具体地，例如，列举乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羟基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。
本说明书中的“环烷基”意味着饱和或部分饱和的环状1价脂肪族烃基，包含单环、双环、螺环。作为环烷基，优选列举C3-C8环烷基，具体地，例如，列举环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、螺[3.3]庚基等。
本说明书中的“芳基”意味着1价芳香族烃环，优选列举C6-C10芳基。作为芳基，具体地，例如，列举苯基、萘基(例如，1-萘基、2-萘基)等。
本说明书中的“杂环基”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子的非芳香族环状1价基团。杂环基可以在环中具有双键和或三键，环中的碳原子可以被氧化形成羰基，杂环基可以是单环或稠环。构成环的原子数目是优选4～10(4～10元杂环基)、更优选4～7(4～7元杂环基)。作为杂环基，具体地，例如，列举氮杂环丁烷基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1,2-噻嗪烷、噻二唑烷基、氮杂环丁烷基、噁唑烷酮、苯并二噁烷基、苯并噁唑基、二氧戊环基、二噁烷基、四氢吡咯并[1,2-c]咪唑、硫杂环丁烷基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚烷基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、磺内酰胺、2-氧杂螺[3.3]庚基等。
本说明书中的“杂芳基”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子的芳香族性的环状1价基团。环可以是单环，也可以是与其它环的稠环，还可以部分饱和。构成环的原子数目是优选5～10(5～10元杂芳基)，更优选5～7(5～7元杂芳基)。作为杂芳基，具体地，例如，列举呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、中氮茚基、咪唑并吡啶基等。
本说明书中的“烷氧基”意味着前述定义的“烷基”结合的氧基，优选列举C1-C6烷氧基。作为烷氧基，具体地，例如，列举甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。
本说明书中的“烯基氧基”意味着前述定义的“烯基”结合的氧基，优选列举C2-C6烯基氧基。作为烯基氧基，具体地，例如，列举乙烯基氧基、烯丙基氧基、1-丙烯基氧基、2-丙烯基氧基、1-丁烯基氧基、2-丁烯基氧基(包括顺式、反式)、3-丁烯基氧基、戊烯基氧基、己烯基氧基等。
本说明书中的“环烷氧基”意味着前述定义的“环烷基”结合的氧基，优选列举C3-C8环烷氧基。作为环烷氧基，具体地，例如，列举环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基等。
本说明书中的“芳基氧基”意味着前述定义的“芳基”结合的氧基，优选列举C6-C10芳基氧基。作为芳基氧基，具体地，例如，列举苯氧基、1-萘氧基、2-萘氧基等。
本说明书中的“氨基”在狭义上意味着-NH2，在广义上意味着-NRR’，此处R和R’独立选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基，或R和R’与它们结合的氮原子一起形成环。作为氨基，优选列举-NH2、单C1-C6烷基氨基、二C1-C6烷基氨基、4～8元环状氨基等。
本说明书中的“单烷基氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R是氢、并且R’是前述定义的“烷基”的基团，优选列举单C1-C6烷基氨基。作为单烷基氨基，具体地，例如，列举甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、仲丁基氨基、叔丁基氨基等。
本说明书中的“二烷基氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R和R’独立为前述定义的“烷基”的基团，优选列举二C1-C6烷基氨基。作为二烷基氨基，具体地，例如，列举二甲基氨基、二乙基氨基等。
本说明书中的“环状氨基”意味着前述定义的“氨基”之中R和R’与它们结合的氮原子一起形成环的基团，优选列举4～8元环状氨基。作为环状氨基，具体地，例如，列举1-氮杂环丁烷基、1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-吗啉基、3-噁唑烷基、1,1-二氧硫代吗啉基-4-基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基等。
本说明书中的“保护氨基”意味着被任意的保护基保护的氨基。作为保护氨基，具体地，例如，列举被Boc、Fmoc、Cbz、Troc、Alloc、Teoc、或三氟乙酰基等保护基保护的氨基。
本说明书中的“氨基羰基”意味着前述定义的“氨基”结合的羰基，优选列举-CONH2、单C1-C6烷基氨基羰基、二C1-C6烷基氨基羰基、4～8元环状氨基羰基。作为氨基羰基，具体地，例如，列举-CONH2、二甲基氨基羰基、1-氮杂环丁烷基羰基、1-吡咯烷基羰基、1-哌啶基羰基、1-哌嗪基羰基、4-吗啉基羰基、3-噁唑烷基羰基、1,1-二氧硫代吗啉基-4-基羰基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基羰基等。
本说明书中的“烯基氧基羰基”意味着前述定义的“烯基氧基”结合的羰基，优选列举C2-C6烯基氧基羰基。作为烯基氧基羰基，具体地，例如，列举乙烯基氧基羰基、烯丙氧羰基、1-丙烯基氧基羰基、2-丙烯基氧基羰基、1-丁烯基氧基羰基、2-丁烯基氧基羰基(包括顺式、反式)、3-丁烯基氧基羰基、戊烯基氧基羰基、己烯基氧基羰基等。
本说明书中的“烷基磺酰基”意味着前述定义的“烷基”结合的磺酰基，优选列举C1-C6烷基磺酰基。作为烷基磺酰基，具体地，例如，列举甲基磺酰基等。
本说明书中的“羟基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被羟基取代的基团，优选C1-C6羟基烷基。作为羟基烷基，具体地，例如，列举羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、2-羟基-2-甲基丙基、5-羟基戊基等。
本说明书中的“卤烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被卤素取代的基团，优选C1-C6卤烷基，更优选C1-C6氟烷基。作为卤烷基，具体地，例如，列举二氟甲基、三氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3-二氟丙基、4,4-二氟丁基、5,5-二氟戊基等。
本说明书中的“氰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被氰基取代的基团，优选C1-C6氰基烷基。作为氰基烷基，具体地，例如，列举氰基甲基、2-氰基乙基等。
本说明书中的“氨基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“氨基”取代的基团，优选C1-C6氨基烷基。作为氨基烷基，具体地，例如，列举1-吡啶基甲基、2-(1-哌啶基)乙基、3-(1-哌啶基)丙基、4-氨基丁基等。
本说明书中的“羧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被羧基取代的基团，优选C2-C6羧基烷基。作为羧基烷基，具体地，例如，列举羧基甲基等。
本说明书中的“烯基氧基羰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“烯基氧基羰基”取代的基团，优选C2-C6烯基氧基羰基C1-C6烷基，更优选C2-C6烯基氧基羰基C1-C2烷基。作为烯基氧基羰基烷基，具体地，例如，列举烯丙氧羰基甲基、2-(烯丙氧羰基)乙基等。
本说明书中的“烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“烷氧基”取代的基团，优选C1-C6烷氧基C1-C6烷基，更优选C1-C6烷氧基C1-C2烷基。作为烷氧基烷基，具体地，例如，列举甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基等。
本说明书中的“环烷基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“环烷基”取代的基团，优选C3-C8环烷基C1-C6烷基，更优选C3-C6环烷基C1-C2烷基。作为环烷基烷基，具体地，例如，列举环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。
本说明书中的“环烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“环烷氧基”取代的基团，优选C3-C8环烷氧基C1-C6烷基，更优选C3-C6环烷氧基C1-C2烷基。作为环烷氧基烷基，具体地，例如，列举环丙氧基甲基、环丁氧基甲基等。
本说明书中的“杂环基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“杂环基”取代的基团，优选4～7元杂环基C1-C6烷基，更优选4～7元杂环基C1-C2烷基。作为杂环基烷基，具体地，例如，列举2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基、2-(氮杂环丁烷-3-基)乙基等。
本说明书中的“烷基磺酰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“烷基磺酰基”取代的基团，优选C1-C6烷基磺酰基C1-C6烷基，更优选C1-C6烷基磺酰基C1-C2烷基。作为烷基磺酰基烷基，具体地，例如，列举甲基磺酰基甲基、2-(甲基磺酰基)乙基等。
本说明书中的“氨基羰基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“氨基羰基”取代的基团，优选氨基羰基C1-C6烷基，更优选氨基羰基C1-C4烷基。作为氨基羰基烷基，具体地，例如，列举甲基氨基羰基甲基、二甲基氨基羰基甲基、叔丁基氨基羰基甲基、1-氮杂环丁烷基羰基甲基、1-吡咯烷基羰基甲基、1-哌啶基羰基甲基、4-吗啉基羰基甲基、2-(甲基氨基羰基)乙基、2-(二甲基氨基羰基)乙基、2-(1-氮杂环丁烷基羰基)乙基、2-(1-吡咯烷基羰基)乙基、2-(4-吗啉基羰基)乙基、3-(二甲基氨基羰基)丙基、4-(二甲基氨基羰基)丁基等。
本说明书中的“芳基氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“芳基氧基”取代的基团，优选C6-C10芳基氧基C1-C6烷基，更优选C6-C10芳基氧基C1-C2烷基。作为芳基氧基烷基，具体地，例如，列举苯氧基甲基、2-苯氧基乙基等。
本说明书中的“芳烷基(芳基烷基)”意味着前述定义的“烷基”的至少1个氢原子被前述定义的“芳基”取代的基团，优选C7-C14芳烷基，更优选C7-C10芳烷基。作为芳烷基，具体地，例如，列举苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。
本说明书中的“芳烷氧基”意味着前述定义的“芳烷基”结合的氧基，优选C7-C14芳烷氧基，更优选C7-C10芳烷氧基。作为芳烷氧基，具体地，例如，列举苄氧基、苯乙氧基、3-苯基丙氧基等。
本说明书中的“芳烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“芳烷氧基”取代的基团，优选C7-C14芳烷氧基C1-C6烷基，更优选C7-C14芳烷氧基C1-C2烷基。作为芳烷氧基烷基，具体地，例如，列举苄氧基甲基、1-(苄氧基)乙基等。
本说明书中的“杂芳基烷基”意味着前述定义的“烷基”的至少1个氢原子被前述定义的“杂芳基”取代的基团，优选5～10元杂芳基C1-C6烷基，更优选5～10元杂芳基C1-C2烷基。作为杂芳基烷基，具体地，例如，列举3-噻吩基甲基、4-噻唑基甲基、2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、2-(2-吡啶基)乙基、2-(3-吡啶基)乙基、2-(4-吡啶基)乙基、2-(6-喹啉基)乙基、2-(7-喹啉基)乙基、2-(6-吲哚基)乙基、2-(5-吲哚基)乙基、2-(5-苯并呋喃基)乙基等。
本说明书中的“杂芳基烷氧基”意味着前述定义的“杂芳基烷基”结合的氧基，优选5～10元杂芳基C1-C6烷氧基，更优选5～10元杂芳基C1-C2烷氧基。作为杂芳基烷氧基，具体地，例如，列举3-噻吩基甲氧基、3-吡啶基甲氧基。
本说明书中的“杂芳基烷氧基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“杂芳基烷氧基”取代的基团，优选5～10元杂芳基C1-C6烷氧基C1-C6烷基，更优选5～10元杂芳基C1-C2烷氧基C1-C2烷基。作为杂芳基烷氧基烷基，具体地，例如，列举3-吡啶基甲氧基甲基等。
本说明书中的“杂环烷叉基烷基”意味着前述定义的“烷基”的1个或多个氢被前述定义的“杂环烷叉基”取代的基团，优选4～7元杂环烷叉基C1-C6烷基，更优选4～7元杂环烷叉基C1-C2烷基。作为杂芳基烷氧基烷基，具体地，例如，列举四氢-4H-吡喃-4-叉基甲基、氮杂环丁烷-3-叉基甲基等。
本说明书中的“烷氧基烯基”意味着前述定义的“烯基”的1个或多个氢被前述定义的“烷氧基”取代的基团，优选C1-C6烷氧基C2-C6烯基。作为烷氧基烯基，具体地，例如，列举(E)-4-甲氧基丁-2-烯-1-基等。
本说明书中的“氨基羰基烯基”意味着前述定义的“烯基”的1个或多个氢被前述定义的“氨基羰基”取代的基团，优选氨基羰基C2-C6烯基。作为氨基羰基烯基，具体地，例如，列举(E)-3-(二甲基氨基羰基)-丙-2-烯-1-基等。
本说明书中的“卤烷氧基”意味着前述定义的“烷氧基”的1个或多个氢被卤素取代的基团，优选C1-C6卤烷氧基。作为卤烷氧基，具体地，例如，列举二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基等。
本说明书中的“亚烷基”意味着从前述“烷基”进一步除去任意的氢原子而衍生的二价基团，优选C4-C8亚烷基。作为亚烷基，具体地，列举-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-CH(CH3)CH2-、-C(CH3)2-、-(CH2)4-、-CH(CH3)CH2CH2-、-C(CH3)2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-等。
本说明书中的“脂环”意味着非芳香族烃环。脂环可以在环中具有不饱和键，也可以是具有2个以上环的多环。此外，构成环的碳原子可以被氧化形成羰基。作为脂环，优选列举3～8元脂环，具体地，例如，列举环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环庚烷环、环辛烷环、双环[2.2.1]庚烷环等。
本说明书中的“饱和杂环”意味着除碳原子外还包含1～5个杂原子、在环中不含双键和/或三键的非芳香族的杂环。饱和杂环可以是单环，也可以与其它的环、例如苯环等芳香环形成稠环。作为饱和杂环，优选列举4～7元饱和杂环，具体地，例如，列举氮杂环丁烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、吡咯烷环、4-氧代吡咯烷环、哌啶环、4-氧代哌啶环、哌嗪环、吡唑烷环、咪唑烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、噻唑烷环、异噻唑烷环、噻二唑烷环、噁唑烷酮环、二氧戊环、二噁烷环、硫杂环丁烷环、八氢吲哚环、二氢吲哚环等。
本说明书中的“肽”只要是天然氨基酸和/或非天然氨基酸酰胺键合或酯键合形成的肽，则没有特别限定，优选5～30个残基、更优选7～15个残基、进一步优选9～13个残基的肽。肽可以是直链肽也可以是环状肽。
在本说明书中，“肽链”指1、2、3、4、或其以上的天然氨基酸和/或非天然氨基酸通过酰胺键和/或酯键连接的肽链。作为肽链，优选包含1～4个氨基酸残基的肽链，更优选由1～4个氨基酸残基组成的肽链。
本说明书中的“任选取代”意味着某基团可以被任意的取代基取代。
本说明书中的“任选保护”意味着某基团可以被任意的保护基保护。
本说明书中的“1个或多个”意味着1个或2个以上的数目。“1个或多个”在与某基团的取代基有关的上下文中应用时，该术语意味着从1个至该基团容许的取代基的最大数目的数目。作为“1个或多个”，具体地，例如，列举1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、和/或比其大的数目。
本发明的化合物可以是其盐，优选其化学或药学上容许的盐。此外，本发明的化合物或其盐可以是它们的溶剂化物，优选其化学或药学上容许的溶剂化物。本发明的化合物的盐例如包含：盐酸盐；氢溴酸盐；氢碘酸盐；磷酸盐；膦酸盐；硫酸盐；甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐等羧酸盐；或钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土金属盐；铵盐、烷基铵盐、二烷基铵盐、三烷基铵盐、四烷基铵盐等铵盐等。这些盐例如通过将该化合物与药物的制备中可使用的酸或碱接触而制备。在本发明中，化合物的溶剂化物指化合物与溶剂一起形成一个分子集团的那种，只要是通过伴随药物施用容许摄取的溶剂形成的溶剂化物，则没有特别限定。如果溶剂是水则称为水合物。作为本发明的化合物的溶剂化物，优选水合物，作为这样的水合物，具体地，列举1～10水合物、优选1～5水合物、进一步优选1～3水合物。本发明的化合物的溶剂化物不仅包含与水、醇(例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等)、二甲基甲酰胺等单独的溶剂的溶剂化物，也包含与多个溶剂的溶剂化物。
本说明书中的“氨基酸”包含天然氨基酸、和非天然氨基酸。本说明书中的“天然氨基酸”指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。非天然氨基酸没有特别限定，示例β-氨基酸、γ-氨基酸、D型氨基酸、N取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、侧链与天然不同的氨基酸、羟基羧酸等。作为本说明书中的氨基酸，容许任意的立体构型。氨基酸的侧链的选择不设特别限制，除氢原子外也自由选自例如烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，这些基团中不相邻的1或2个亚甲基可以被氧原子、羰基(-CO-)、或磺酰基(-SO2-)取代。可以分别赋予取代基，这些取代基也没有限制，例如，可以从包含卤素原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子、或P原子的任意的取代基中独立地自由选择1个或2个以上。即，示例任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等。在非限定的一个方式中，本说明书中的氨基酸可以是同一分子内具有羧基与氨基的化合物(即使该情形中，如脯氨酸、羟脯氨酸这样的亚氨基酸也包含在氨基酸中)。
氨基酸的主链氨基可以是非取代(NH2基)的，也可以是被取代的(即，-NHR基：R表示任选具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，这些基团中不相邻的1或2个亚甲基可以被氧原子、羰基(-CO-)、或磺酰基(-SO2-)取代，此外，也可以如脯氨酸那样与N原子结合的碳链和α位的碳原子形成环。)。前述R的取代基与上述的氨基酸侧链中的取代基同样地选择。主链氨基被取代的情形中的前述R包含在本说明书中的“氨基酸的侧链”中。这样的主链氨基被取代的氨基酸在本说明书中称为“N取代氨基酸”。作为本说明书中的“N取代氨基酸”，优选示例N-烷基氨基酸、N-C1-C6烷基氨基酸、N-C1-C4烷基氨基酸、N-甲基氨基酸，但不限于这些。
构成本说明书中的肽化合物的“氨基酸”包含与每种氨基酸对应的所有同位素。“氨基酸”的同位素是至少1个原子被原子编号(质子数)相同、质量数(质子和中子数之和)不同的原子以与天然不同的存在比取代的那种。作为构成本发明的肽化合物的“氨基酸”中包含的同位素的实例，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，分别含有2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl等。
作为本说明书中包含卤素原子的取代基，示例取代基中有卤素的烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，更具体地，示例氟烷基、二氟烷基、三氟烷基等。
作为包含O原子的取代基，列举羟基(-OH)、氧基(-OR)、羰基(-C＝O-R)、羧基(-CO2H)、氧基羰基(-C＝O-OR)、羰基氧基(-O-C＝O-R)、硫代羰基(-C＝O-SR)、羰基硫代(-S-C＝O-R)、氨基羰基(-C＝O-NHR)、羰基氨基(-NH-C＝O-R)、氧基羰基氨基(-NH-C＝O-OR)、磺酰基氨基(-NH-SO2-R)、氨基磺酰基(-SO2-NHR)、氨磺酰氨基(-NH-SO2-NHR)、硫代羧基(-C(＝O)-SH)、羧基羰基(-C(＝O)-CO2H)等基团。
作为氧基(-OR)的实例，列举烷氧基、环烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基等。作为烷氧基，优选C1-C4烷氧基、C1-C2烷氧基，特别优选甲氧基、或乙氧基。
作为羰基(-C＝O-R)的实例，列举甲酰基(-C＝O-H)、烷基羰基、环烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、芳烷基羰基等。
作为氧基羰基(-C＝O-OR)的实例，列举烷基氧基羰基、环烷基氧基羰基、烯基氧基羰基、炔基氧基羰基、芳基氧基羰基、杂芳基氧基羰基、芳烷基氧基羰基等。
作为羰基氧基(-O-C＝O-R)的实例，列举烷基羰基氧基、环烷基羰基氧基、烯基羰基氧基、炔基羰基氧基、芳基羰基氧基、杂芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基等。
作为硫代羰基(-C＝O-SR)的实例，列举烷基硫代羰基、环烷基硫代羰基、烯基硫代羰基、炔基硫代羰基、芳基硫代羰基、杂芳基硫代羰基、芳烷基硫代羰基等。
作为羰基硫代(-S-C＝O-R)的实例，列举烷基羰基硫代、环烷基羰基硫代、烯基羰基硫代、炔基羰基硫代、芳基羰基硫代、杂芳基羰基硫代、芳烷基羰基硫代等。
作为氨基羰基(-C＝O-NHR)的实例，列举烷基氨基羰基(例如，C1-C6或C1-C4烷基氨基羰基，特别示例乙基氨基羰基、甲基氨基羰基等。)、环烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、炔基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基等。除这些外，还列举与-C＝O-NHR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
作为羰基氨基(-NH-C＝O-R)的实例，列举烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、烯基羰基氨基、炔基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-C＝O-R中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
作为氧基羰基氨基(-NH-C＝O-OR)的实例，列举烷氧基羰基氨基、环烷氧基羰基氨基、烯基氧基羰基氨基、炔基氧基羰基氨基、芳基氧基羰基氨基、杂芳基氧基羰基氨基、芳烷基氧基羰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-C＝O-OR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
作为磺酰基氨基(-NH-SO2-R)的实例，列举烷基磺酰基氨基、环烷基磺酰基氨基、烯基磺酰基氨基、炔基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、芳烷基磺酰基氨基等。除这些外，还列举与-NH-SO2-R中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
作为氨基磺酰基(-SO2-NHR)的实例，列举烷基氨基磺酰基、环烷基氨基磺酰基、烯基氨基磺酰基、炔基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基等。除这些外，还列举与-SO2-NHR中的N原子结合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。
作为氨磺酰氨基(-NH-SO2-NHR)的实例，列举烷基氨磺酰氨基、环烷基氨磺酰氨基、烯基氨磺酰氨基、炔基氨磺酰氨基、芳基氨磺酰氨基、杂芳基氨磺酰氨基、芳烷基氨磺酰氨基等。进一步，与-NH-SO2-NHR中的N原子结合的2个H原子可以被独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、和芳烷基的取代基取代，此外，这2个取代基可以形成环。
作为包含S原子的取代基，列举硫醇(-SH)、硫代(-S-R)、亚磺酰基(-S＝O-R)、磺酰基(-SO2-R)、磺基(-SO3H)等基团。
作为硫代(-S-R)的实例，选自烷基硫代、环烷基硫代、烯基硫代、炔基硫代、芳基硫代、杂芳基硫代、芳烷基硫代等。
作为磺酰基(-SO2-R)的实例，列举烷基磺酰基、环烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、芳烷基磺酰基等。
作为包含N原子的取代基，列举叠氮(-N3，也称为“叠氮基”)、氰基(-CN)、伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NH-R；也称为单取代氨基)、叔氨基(-NR(R')；也称为二取代氨基)、脒基(-C(＝NH)-NH2)、取代脒基(-C(＝NR)-NR'R")、胍基(-NH-C(＝NH)-NH2)、取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R")、氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R")、吡啶基、哌啶基、吗啉代、氮杂环丁烷基等基团。
作为仲氨基(-NH-R；单取代氨基)的实例，列举烷基氨基、环烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、芳烷基氨基等。
作为叔氨基(-NR(R')；二取代氨基)的实例，例如，列举烷基(芳烷基)氨基等具有任意2个取代基的氨基，前述取代基分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等，这些任意2个取代基也可以形成环。具体地，示例二烷基氨基，特别是C1-C6二烷基氨基、C1-C4二烷基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。本说明书中的“Cp-Cq二烷基氨基”指氨基中取代有2个Cp-Cq烷基的基团，两个Cp-Cq烷基可以相同也可以不同。
作为取代脒基(-C(＝NR)-NR'R")的实例，列举N原子上的3个取代基R、R'、和R"分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。
作为取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R”)的实例，列举R、R'、R”、和R”'分别独立地选自烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
作为氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R”)的实例，列举R、R'、和R”分别独立地选自氢原子、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基的基团，或它们形成环的基团等。
构成本说明书中肽化合物的“氨基酸残基”有时简单称为“氨基酸”。
在本说明书中，术语“和/或”的含义包括适当组合“和”与“或”的任何组合。具体地，例如，“A、B、和/或C”包括以下的7种变化：
(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A和B、(v)A和C、(vi)B和C、(vii)A、B、和C。
本说明书中使用的表述“实质上/实质上地”意味着本说明书中列举的成分是主要成分(例如，包含环状肽化合物、环状肽化合物和肽化合物的晶体形式，但不限于这些)，在对本发明的实施方式的效果不产生负面影响的情形中、不产生这样的负面影响程度的量的情形中、或不产生这样的负面影响程度的实施方式中，意味着可包含其它成分。例如，作为其它成分，本说明书中未记载的成分(示例由作为目标的晶体形式以外的晶体、反应副产物、或未反应物质等所示例的杂质，但不限于这些)在对本发明的实施方式不产生负面影响的情形中、不产生这样的负面影响程度的量的情形中、或不产生这样的负面影响程度的实施方式中，有时包含这些成分。
本说明书中使用的表述“实质上不包含/不包含”意味着本说明书中列举的成分是主要成分(例如，包含环状肽化合物、环状肽化合物和肽化合物的晶体形式，但不限于这些)，不包含其它成分，或在这样的成分对本发明的实施方式的效果不产生负面影响的情形中、不产生这样的负面影响程度的量的情形中、或不产生这样的负面影响程度的实施方式中，可包含其它成分。例如，本说明书中记载的这样的成分在对发明的实施方式的效果不产生负面影响的情形中、不产生这样的负面影响程度的量的情形中、或不产生这样的负面影响程度的实施方式中，有时包含这些成分。
与本发明的效果相关使用的术语“负面影响”意味着抵消本发明的效果的影响。例如，在应自然显示的作用为100％的情形中，将本发明的作用降低为30％、20％、10％、或5％以下也可以称为有“负面影响”。
制备环状肽化合物的方法
在某一方式中，本发明涉及通过液相法制备环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的方法，该方法包括，在包含选自1种或多种不与水混溶的溶剂(例如，对水溶解度低的溶剂、水/辛醇系数(log Kow)大的溶剂、或水/辛醇系数预测值大的溶剂)、1种或多种水溶性烷基腈类、和1种或多种水溶性醚类的1个或多个的溶剂(溶剂A)中，将肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有3以上且10以下的碳原子的酯，具体地，示例乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丙酯、乙酸叔丁酯、丙酸甲酯或丙酸乙酯等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有4以上且10以下的碳原子的环状醚，具体地，示例2-MeTHF、THF、4-甲基四氢吡喃或1,4-二噁烷等。在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有4以上且10以下的碳原子的非环状醚，具体地，示例MTBE、二异丙基醚或二乙基醚等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为包含具有6以上且10以下的碳原子的环状和非环状烷基两者的醚，具体地，示例CPME等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有3以上且10以下的碳原子的碳酸酯，具体地，示例碳酸二甲酯、碳酸二乙酯或碳酸二异丙酯等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有5以上且10以下的碳原子的烃，具体地，示例戊烷、己烷或庚烷等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为具有6以上且10以下的碳原子的芳香族烃环，具体地，示例甲苯、二甲苯或苯等。
在某一实施方式中，不与水混溶的溶剂可以表征为在环境压力(约1气压)具有低沸点。在某一实施方式中，在常压(1气压附近)的低沸点示例为35℃以上且小于140℃。
在某一实施方式中，如DMF、DMA、NMP或二甲基亚砜这样的在常压(约1气压)具有140℃以上的沸点的溶剂可以在本发明中排除。
在特定的实施方式中，可具有与肽化合物或环状肽化合物反应的可能性的溶剂可以从本发明中的水不混溶性溶剂排除。
在某一实施方式中，作为不与水混溶的溶剂的不适当溶剂可以表征为胺(例如，正丙胺或二异丙胺)、或醇(例如，甲醇、乙醇、正丙醇、苯酚)。
在某一实施方式中，本说明书中应用的不与水混溶的溶剂没有特别限定，包含具有低水溶性(例如，具有150g/L以下的对水的溶解度)的溶剂。对水的溶解度是本技术领域已知的，可通过本说明书中记载的任一方法确定。用于确定溶解性的示例方法没有特别限定，包含气相色谱，也可以通过测定将溶剂在室温(例如，15℃～40℃、优选20℃～30℃)与等量的水混合而配制的水中的前述溶剂的浓度来确定。
如本说明书中所使用的，具有大的水/辛醇系数(log Kow)值的溶剂优选具有大于0(零)且小于5的系数。水/辛醇系数(log Kow)是本技术领域已知的，可通过本说明书中记载的任意方法确定。此外，具有大的水/辛醇系数(log Kow)的溶剂包含具有大的水/辛醇系数的预测值的溶剂，没有特别限定，例如，可经数据库检索或文献检索，在另行明示的测定中通过公知的手段确定。
在某一方式中，不与水混溶的溶剂是选自THF、2-MeTHF、MTHP、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯的溶剂，优选THF、或2-MeTHF，进一步优选2-MeTHF。溶剂与水的混溶性在Merck Index 14th Edition中记载，例如，记载了DMSO在水中溶解，乙腈与水混溶。另一方面，记载了庚烷不溶于水。2-MeTHF不与水混溶(Org.Process Res.Dev.2007,11,1,156-159.)。关于溶剂与水的混溶性的确定，本领域技术人员可用以下示例的公知方法测定。例如，可通过在室温附近(例如15℃～40度、优选20℃～30℃)将同容量的溶剂与水混和时，溶剂与水分离为二层来显示。溶剂与水的混溶性试验可以如下进行：在室温附近(例如15℃～40度、优选20℃～30℃)，将同容量的溶剂与水在分液漏斗、反应烧瓶、或反应釜等容器中混和，例如经目视确认溶剂与水是否分离为二层，采取容器中的上层部分和下层部分的液体而确认。用这样的方法能够确认溶剂与水分离为二层的情形中，有时将该溶剂指为不与水混溶的溶剂。
溶剂与水的混溶性可依赖于溶剂对水的溶解度。不与水混溶的溶剂列举对水的溶解度低的溶剂。对水的溶解度可根据温度而变化，但本说明书中的溶解度意味着室温附近、例如20℃～30℃附近的溶解度。溶剂对水的溶解度实际上也可用上述示例的方法中未指定的方法测定，但记载于商业供应商的目录、Merck Index 14th Edition中。Merck Index14th Edition中记载了对1L水，碳酸二甲酯溶解139g，乙酸异丙酯溶解43g，乙酸乙酯溶解100g。记载了庚烷不溶于水。记载了对1L水，2-MeTHF溶解140g(Org.ProcessRes.Dev.2007,11,1,156-159.)，碳酸二甲酯溶解139g(J.Mol.Catal.AChem.2010,317,1-18.)。此外，溶剂对水的溶解度预测也可以通过SciFinder(注册商标)等数据库检索工具研究。记载了对1L水，苯甲醚溶解3.2g，乙酸异丙酯溶解20g，乙酸乙酯溶解39g，庚烷溶解4.7mg。在ChemIDplus Advanced(NIH)([2022年5月1日检索]、因特网〈URL：https：//chem.nlm.nih.gov/chemidplus/〉)中，也可以研究对水的溶解度。与水混溶的乙腈、THF、和DMSO对水的溶解度记载为1000g/L。即，不与水混溶的溶剂对水的溶解度是999g/L以下、500g/L以下、250g/L以下，优选200g/L以下，更优选150g/L以下。
受到关注的是，2-MeTHF在室温(例如，25℃)对水的溶解度是150g/L。因此，在室温(例如25℃)附近、溶剂对水的溶解度是150g/L以下的性质也可以称为，该溶剂具有与2-MeTHF同等或比其优异的性质。如本说明书中记载，应用本发明的溶剂的方法满足如下，即(1)在作为反应溶剂应用的情形中，由于不与水混溶，因此在应用反应混合物的水溶液的后处理中可以作为萃取溶剂利用，(2)在作为萃取溶剂应用的情形中，可以将包含肽化合物的萃取溶液作为用于后续步骤/反应的起始材料(即，包含后续步骤的起始化合物的溶液)使用等，所以对在不与水混溶的溶剂的肽化合物合成中使用是有用的。在某一实施方式中，根据本方法，可从起始反应的溶剂不分离中间体而实施完成全部反应。
对水的溶解度低的溶剂包含对水的溶解度为999g/L以下的溶剂，没有特别限定，例如，2-MeTHF、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、庚烷、苯甲醚、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃、甲苯等相当于对水的溶解度为999g/L以下的溶剂。从提高环化反应中向目标物的转化率、抑制副产物的生成的观点出发，优选应用2-MeTHF、碳酸二甲酯、或苯甲醚、或包含它们的1种或多种的溶剂。
如本说明书所述，溶剂与水的混溶性可依赖于溶剂固有的水/辛醇系数(logKow)、或水/辛醇系数预测值。水/辛醇系数表示化合物的脂溶性，已知脂溶性高的那种的数值大。如本说明书中记载，log Kow实际上也可以由本领域技术人员公知的方法测定。作为另一方式，log Kow值的预测值例如为文献记载的值，也可以通过应用SciFinder(注册商标)等数据库检索工具的检索、ChemIDplus Advanced(NIH)([2022年5月1日检索]、用因特网〈URL：https：//chem.nlm.nih.gov/chemidplus/〉)的检索得知。不与水混溶的溶剂的logKow值、或log Kow值的预测值的示例分别采取正值，2-MeTHF为1.35、碳酸二甲酯为0.23、苯甲醚为2.11、乙酸异丙酯为1.02、乙酸乙酯为0.73、庚烷为4.66。另一方面，与水混溶的溶剂的log Kow值、或log Kow值的预测值分别采取负值，乙腈为-0.34、DMSO为-0.31。即，不与水混溶的溶剂的log Kow值、或log Ko值w的预测值优选采取正值，优选示例0以上且5以下。
作为水/辛醇系数(log Kow值)大的溶剂、或水/辛醇系数预测值大的溶剂，列举2-MeTHF、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、庚烷、苯甲醚、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃等。
不与水混溶的溶剂列举对水的溶解度低的溶剂、或水/辛醇系数(log Kow)采取正数的那种。
作为水溶性烷基腈类，列举乙腈、丙腈等。
作为水溶性醚类，列举THF、1,4-二噁烷、二甲氧基乙烷等。
在某一方式中，溶剂A可包含选自属于由不与水混溶的溶剂、水溶性烷基腈类、和水溶性醚类组成的组的溶剂的1个或多个。在某一方式中，溶剂A可包含选自2-MeTHF、THF、MTHP、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、苯甲醚、乙腈、二氯甲烷、和甲苯的溶剂。例如，溶剂A可以仅由选自1个以上不与水混溶的溶剂、1个以上水溶性烷基腈类、和1个以上水溶性醚类的1种溶剂组成，也可以包含选自它们的2种以上的溶剂。在某一方式中，在溶剂A中包含不与水混溶的溶剂的情形中，溶剂A中包含的该溶剂可以是选自水溶性烷基腈类、和水溶性醚类的1种以上。在某一方式中，在溶剂A中包含水溶性烷基腈类的情形中，溶剂A中包含的该溶剂可以是选自不与水混溶的溶剂、和水溶性醚类的1种以上。在某一方式中，在溶剂A中包含水溶性醚类的情形中，溶剂A中包含的该溶剂可以是选自水溶性烷基腈类、和不与水混溶的溶剂的1种以上。
在某一方式中，溶剂A中除不与水混溶的溶剂、水溶性烷基腈类、和水溶性醚类之外，还可以包含不相当于它们中任一的溶剂，例如，DMF、丙酮。
在某一实施方式中，溶剂A有时不包含可具有与本说明书中记载的肽化合物或环状肽化合物反应的可能性的溶剂，例如选自醇(MeOH、EtOH、n-PrOH、iPrOH、nBuOH、iBuOH、tBuOH)、伯胺(nPrNH2、iPrNH2、nBuNH2、tBuNH2)、仲胺(Et2NH、nPr2NH、iPr2NH、nBu2NH、tBu2NH)、和羧酸(AcOH、EtCO2H、nPrCO2H)等质子性溶剂的溶剂。
在溶剂A中包含不相当于不与水混溶的溶剂、水溶性烷基腈类、和水溶性醚类的任一的溶剂的情形中，该溶剂优选为溶剂A整体的40重量％以下，更优选30重量％以下、25重量％以下、20重量％以下、15重量％以下、10重量％以下、或5重量％以下。
在某一方式中，本发明的肽化合物可以是直链肽化合物。在另一方式中，本发明的肽化合物可以是环状肽化合物。在某一方式中，直链或环状肽化合物可包含环状结构作为其部分结构。作为环状结构，具体地，列举某氨基酸残基的侧链与另一氨基酸残基的侧链连接的那种、某氨基酸残基的N取代基与另一氨基酸残基的侧链连接的那种、某氨基酸残基的N取代基与另一氨基酸残基的N取代基连接的那种等。参与用于环状结构的连接的2个氨基酸残基可以不相邻，其间可以存在任意数目的氨基酸残基，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、或19个氨基酸残基。通过环状结构形成的环的大小没有特别限定，示例4元环、5元环、6元环、7元环、8元环、9元环、10元环、11元环、12元环、13元环、14元环、15元环、16元环、17元环、18元环、19元环、20元环、21元环、22元环、23元环、24元环、25元环、26元环、27元环、28元环、29元环、30元环、31元环、32元环、33元环、34元环、或35元环等。在肽化合物中存在环状结构的情形中，环状结构的数目不受限定，优选存在1个、2个、3个、4个、或5个环状结构。
在本发明中，肽化合物的N末端侧的氨基酸残基与C末端侧的氨基酸残基通过选自酰胺键、或-(CH2)nS(CH2)m-、-(CH2)nS(O)(CH2)m-、或-(CH2)nS(O)2(CH2)m-的键连接。此处，n和m分别独立为1或2。
在将肽化合物的N末端侧的氨基酸残基与C末端侧的氨基酸残基通过酰胺键连接的情形中，通过将N末端的氨基酸残基的氨基、与C末端的氨基酸残基的羧基缩合，可制备环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物。酰胺键可以在N末端氨基酸残基的主链的氨基与C末端氨基酸残基的主链的羧基之间形成，可以在N末端氨基酸残基的主链的氨基与C末端氨基酸残基的侧链的羧基之间形成，可以在N末端氨基酸残基的侧链的氨基与C末端氨基酸残基的主链的羧基之间形成，可以在N末端氨基酸残基的侧链的氨基与C末端氨基酸残基的侧链的羧基之间形成。缩合时，可以应用缩合试剂将羧基在系统中活化，也可以利用预先将羧基转化为活性酯的那种。在本说明书中，“氨基与羧基的缩合”在用酰胺键连接氨基与羧基的情形中应用。
在某一方式中，缩合反应可以如下进行：在缩合试剂的存在下或不存在下，在溶剂A中，在-20℃～溶剂的沸点附近的温度、优选-20℃～100℃、优选-5℃～60℃的温度，将反应混合物搅拌10分钟～48小时。在缩合反应中应用缩合试剂的情形中，可以在包含原料和任选的碱的溶剂中添加缩合试剂或包含缩合试剂的溶液，也可以在包含缩合试剂的溶液中添加包含原料和任选的碱的溶液。在本说明书中，有时将在包含缩合试剂的溶液中滴加包含原料和任选的碱的溶液的操作称为“反滴加”。通过将包含缩合试剂的溶液长时间、例如，经数小时～数日、优选1～24小时、更优选1～10小时反滴加，可以抑制二聚体或三聚体的副产物。在缩合反应中不应用缩合试剂的情形中，可以利用预先将羧基转化为活性酯的那种。
作为缩合氨基与羧基时的缩合剂及其使用量，只要可以形成酰胺键则没有特别限定，优选肽合成中一般使用的缩合剂和使用量(例如，Peptide Coupling Reagents,Morethan a Letter Soup(Chem.Rev.2011,111,6557-6602.))。
作为这样的缩合剂，具体地，例如，列举具有碳二亚胺骨架的缩合剂。例如，具有碳二亚胺骨架的缩合剂可以与能够形成活性酯的羟基化合物组合用于缩合反应。作为具有碳二亚胺骨架的缩合剂，例如，列举N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI HCl)等(例如，参考WATANABEChemical的目录、Amino acids and chiral building blocks to new medicine)。
作为能够形成活性酯的羟基化合物，例如，列举1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(oxyma)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt或HODhbt)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONB)、2,3,4,5,6-五氟苯酚(HOPfp)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、6-氯-1-羟基-1H-苯并三唑(Cl-HOBt)(例如，参考WATANABE Chemical的目录、Amino acids and chiral building blocksto new medicine)。此外，也可以应用具有这些骨架的盐，例如作为oxyma的钾盐的K-oxyma等。其中特别优选HOBt、HOAt、oxyma、HOOBt。其中，优选组合应用DIC和HOAt，或组合应用DIC和oxyma。此外，可以将作为磷鎓系缩合剂/脲鎓系缩合剂的O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)、O-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)、N-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基(吗啉代)]脲鎓六氟磷酸盐(COMU)、O-[(乙氧基羰基)氰基亚甲基氨基]-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HOTU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)、[乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸-O2]三-1-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐(PyOxim)、2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、1H-苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)、1H-苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、溴三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyBroP)、氯三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸盐(PyCloP)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸(PyAOP)、溴三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸(Brop)、3-(二乙氧基磷酰基氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮(DEPBT)、N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸(TSTU)、N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓六氟磷酸(HSTU)、O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TDBTU)、四甲基硫脲鎓S-(1-氧-2-吡啶基)-N,N,N’,N’-四氟硼酸盐(TOTT)、O-(2-氧代-1(2H)吡啶基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸(TPTU)之中的任一、和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)、2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-可力丁)、2,6-二甲基吡啶(2,6-卢剔啶)之中的任一碱组合，在缩合反应中利用。特别地，优选组合应用HATU和DIPEA，或组合应用COMU和DIPEA。此外，也可以利用N,N’-羰基二咪唑(CDI)、1,1’-羰基-二-(1,2,4-三唑)(CDT)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMT-MM)、丙基膦酸酐(T3P)等缩合剂。从提高环化反应的转化率、抑制副产物的观点出发，作为本发明的缩合剂，优选HATU、PyBOP、PyOxim。此外，溶剂与缩合剂的组合优选HATU与苯甲醚、碳酸二甲酯、或2-MeTHF，PyBOP与乙腈、苯甲醚、碳酸二甲酯、2-MeTHF、4-甲基四氢吡喃、或乙酸乙酯，PyOxim与乙腈、苯甲醚、碳酸二甲酯、2-MeTHF、乙酸乙酯。溶剂与缩合剂的组合更优选苯甲醚与PyBOP、碳酸二甲酯与PyBOP、2-MeTHF与PyBOP的组合。
在将肽化合物的N末端侧的氨基酸残基与C末端侧的氨基酸残基通过选自-(CH2)nS(CH2)m-、-(CH2)nS(O)(CH2)m-、或-(CH2)nS(O)2(CH2)m-的键连接的情形中，例如，使N末端侧的氨基酸残基中包含的卤烷基或乙烯基、与C末端侧的氨基酸残基中包含的硫醇基反应，形成C-S-C键，按需要，通过将硫原子氧化转化为亚砜、砜，可制备环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物包含8～20、优选9～15个氨基酸残基，该氨基酸残基之中，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个可以是非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为根据本发明的方法制备的环状肽化合物中包含的非天然氨基酸的比例，示例肽化合物中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
环状肽化合物中包含的非天然氨基酸残基可以是N-取代的非天然氨基酸残基，也可以是N-非取代的非天然氨基酸残基。天然氨基酸的主链的氨基被氢以外的某原子或官能团取代的氨基酸残基、和侧链具有与天然氨基酸不同的结构并且主链的氨基被氢以外的某原子或官能团取代的氨基酸残基相当于N-取代的非天然氨基酸残基。此外，主链的氨基未被取代、但侧链具有与天然氨基酸不同的结构的氨基酸残基相当于N-非取代的非天然氨基酸残基。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-取代氨基酸残基。在某一方式中，作为根据本发明的方法制备的环状肽化合物中包含的N-取代氨基酸残基的比例，示例肽化合物中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。N-取代氨基酸残基可以是N-取代的非天然氨基酸残基。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-非取代的非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为根据本发明的方法制备的环状肽化合物中包含的N-非取代的非天然氨基酸残基的比例，示例肽化合物中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个α,α二取代氨基酸残基。在某一方式中，作为根据本发明的方法制备的环状肽化合物中包含的α,α二取代氨基酸残基的比例，示例肽化合物中包含的氨基酸的总数的5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
根据本发明的方法制备的环状肽化合物由9～11个氨基酸残基组成，其中的1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、或6个以上是N-取代氨基酸残基，其中的1个以上或2个以上可为N-非取代的非天然氨基酸残基。本发明的方法在包含多个这样的非天然氨基酸残的环状肽化合物的大规模尺度制备中特别有用。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物优选溶剂化物，更优选水合物、DMSO-水合物、丙酮-水合物、或DMSO溶剂化物，进一步优选水合物。
在某一方式中，直链肽化合物的C末端侧的氨基酸残基或N末端侧的氨基酸残基的一者或两者可以是在羧基的α位碳没有不对称碳的氨基酸残基。通过使供给环化的氨基酸残基为没有这样的不对称碳的那种，可以抑制环化反应时的外消旋化。作为在羧基的α位碳没有不对称碳的氨基酸残基，列举α位碳上的取代基相同的那种。例如，α位碳被2个氢原子取代、即α位碳是-CH2-的氨基酸原子(例如甘氨酸、如N-甲基甘氨酸的N-取代甘氨酸)没有不对称碳。作为α位碳上的取代基相同的那种，具有如甲基与甲基这样的相同取代基的那种没有不对称碳。α位碳被螺环丙基、螺环丁基、螺环戊基、螺环己基等螺环基取代的那种、即α位碳上的取代基彼此与该α位碳一起形成环的那种(例如cLeu等)也在羧基的α位碳没有不对称碳。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物是由下述式(1)：
[化学式13]
表示的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物。如国际公开第2013/100132号中记载的那样，由式1表示的化合物作为KRAS抑制剂有用，可在各种有关KRAS的疾病、例如有关KRAS的癌症中使用。
式(1)的环状肽化合物可通过包括将具有下述式(2)：
[化学式14]
的直链肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤的方法制备。在某一方式中，该连接的步骤包括：在包含选自1种或多种不与水混溶的溶剂、1种或多种水溶性烷基腈类、和1种或多种水溶性醚类的1个或多个的溶剂中，使式(2)的化合物的N末端的氨基与C末端的羧基缩合。该环状肽化合物的制备中优选应用水溶性烷基腈类，例如包含乙腈的溶剂，和不与水混溶的溶剂，例如包含苯甲醚、碳酸二甲酯和/或2-MeTHF的溶剂。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的分离和/或纯化优选不应用柱色谱。
根据本发明的方法制备的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物可以通过例如经晶析结晶化替代柱色谱而分离和/或纯化。
具体地，例如，通过将缩合反应后的反应溶液供给分液操作，按需要将有机层浓缩、和/或过滤后，在得到的残渣中加入适于晶析的溶剂、任选地加入晶种，按需要搅拌，由此可以得到环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的晶体。晶析时添加的溶剂只要是环状肽化合物能够形成晶体的溶剂则没有特别限制，优选能够对溶解了环状肽化合物的溶液进行使环状肽化合物的溶解度降低的操作的溶剂。例如，在通过不良溶剂的添加、溶液的冷却使环状肽化合物的溶解度降低而可结晶化的情形中，示例可进行这样的操作的溶剂。此外，在能够通过将环状肽化合物的粗晶体在悬浮液状态下保持悬浮状态任意的时间而得到环状肽化合物的晶体的情形中，可进行这样的操作的溶剂可以用于结晶化。作为晶析时添加的溶剂，具体地，例如，列举丙酮、水、DMSO、乙腈、或乙醇、和它们的混合溶剂等。
在某一方式中，根据本发明的方法制备的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的晶体可以是如后述的式(1)的化合物的非溶剂化物晶体、溶剂化物晶体、盐的晶体、或盐的溶剂化物晶体。在某一方式中，非溶剂化物晶体(无溶剂化晶体)有时指不是溶剂化晶体、或水合物晶体的晶体。式(1)的化合物的溶剂化物晶体优选DMSO-水合物晶体(A型晶体、或B型晶体)、水合物晶体(C型晶体)、或丙酮-水合物晶体(H型晶体)，更优选水合物晶体。
制备肽化合物的方法
在某一方式中，本发明涉及通过液相法制备肽化合物的方法。该方法不包括分离各步骤的产物的步骤，包括以下的步骤1和步骤2，任选地将该步骤1和该步骤2重复多次，由此可以制备肽化合物。
(步骤1)将N-保护氨基酸或N-保护肽与C-保护氨基酸或C-保护肽连接/缩合的步骤；
(步骤2)在步骤1之后将N-保护基除去/脱保护的步骤。
在某一方式中，本发明的方法可以分别包括步骤1与步骤2各1次，在某一方式中，本发明的方法可以将步骤1与步骤2重复多次。为了使肽链连续延伸，优选将步骤1与步骤2重复多次，例如2～20次。
本说明书中的“C-保护氨基酸”意味着羧基被保护的天然或非天然的氨基酸，“C-保护肽”意味着C末端的氨基酸残基的羧基被保护的肽。该肽可以仅由天然氨基酸残基构成，可以仅由非天然氨基酸残基构成，也可以由天然氨基酸残基和非天然氨基酸残基的任意组合构成。
C-保护肽可以包含2～20个氨基酸残基，优选至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个是非天然氨基酸残基。C-保护肽中包含的非天然氨基酸残基可以是N-取代氨基酸残基，也可以是N-非取代的非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为C-保护肽中包含的非天然氨基酸残基的比例，示例C-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
在C-保护肽包含N-取代氨基酸残基的情形中，C-保护肽可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-取代氨基酸残基。在某一方式中，作为C-保护肽中包含的N-取代氨基酸残基的比例，示例C-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。N-取代氨基酸残基可以是非天然氨基酸残基。
在C-保护肽包含N-非取代的非天然氨基酸残基的情形中，C-保护肽可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-非取代的非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为C-保护肽中包含的N-非取代的非天然氨基酸残基的比例，示例C-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
“C-保护氨基酸”和“C-保护肽”的羧基的保护基只要不降低肽对溶剂的溶解性，则可以利用本技术领域已知的任意的保护基。C-保护氨基酸、和C-保护肽的溶解度在将它们用于反应的溶剂中为至少1％(w/v)以上，进一步优选5％(w/v)以上。作为这样的羧基的保护基，具体地，列举甲基、乙基、t-Bu基、三苯甲基、枯基等，它们之中优选t-Bu基。
本说明书中的“N-保护氨基酸”意味着氨基被保护的天然或非天然的氨基酸，“N-保护肽”意味着N末端的氨基酸残基的氨基被保护的肽。该肽可以仅由天然氨基酸残基构成，可以仅由非天然氨基酸残基构成，也可以由天然氨基酸残基和非天然氨基酸残基的任意的组合构成。
N-保护肽可以包含2～20个氨基酸残基，优选至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个是非天然氨基酸残基。N-保护肽中包含的非天然氨基酸残基可以是N-取代氨基酸残基，也可以是N-非取代的非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为N-保护肽中包含的非天然氨基酸残基的比例，示例N-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
在N-保护肽包含N-取代氨基酸残基的情形中，N-保护肽可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-取代氨基酸残基。在某一方式中，作为N-保护肽中包含的N-取代氨基酸残基的比例，示例N-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。N-取代氨基酸残基可以是非天然氨基酸残基。
在N-保护肽包含N-非取代的非天然氨基酸残基的情形中，N-保护肽可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、或至少19个N-非取代的非天然氨基酸残基。在某一方式中，作为N-保护肽中包含的N-非取代的非天然氨基酸残基的比例，示例N-保护肽中包含的氨基酸的总数的30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上。
“N-保护氨基酸”和“N-保护肽”的氨基的保护基只要不降低肽对溶剂的溶解性，则可以利用本技术领域已知的任意的保护基。作为这样的氨基的保护基，具体地，列举Cbz、对硝基苄氧基羰基、2-萘基甲基氧基羰基、二苯基甲基氧基羰基、9-蒽基甲基氧基羰基、Teoc、Boc、三氟乙酰基、或Alloc等，其中优选Cbz、Teoc、或三氟乙酰基。
如本技术领域公知的，关于N-保护和C-保护氨基酸、和/或N-保护和C-保护肽各自的保护基通常相应于化学反应条件选择，可以通过本技术领域公知的通常的方法确定。
例如，在应用不与水混溶的溶剂(例如，亲油性溶剂)的情形中，由于亲水性保护基可降低有机溶剂中的保护化合物的溶解度，因此这样的亲水性保护基有时并不是适合的保护基。因此，在如本说明书中记载使用不与水混溶的溶剂的情形中，由于亲油性保护基可维持不与水混溶的溶剂中的例如肽化合物的溶解度，因此可为优选的保护基。
这样的保护基的选择可以通过本技术领域已知的方法、或本说明书中记载的方法、例如“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,Fifth Edition,2014”中记载的方法等进行。
作为非限定的实施方式，作为本发明的方法中可使用的N-保护基的示例，列举Cbz基。在氨基酸在氨基酸残基中的α位具有如螺-环烷基这样的空间位阻大的官能团的情形中，优选示例三氟乙酰基。
(缩合)
步骤1是将N-保护氨基酸或N-保护肽与C-保护氨基酸或C-保护肽连接，得到N末端和C末端分别被保护的直链肽化合物的步骤。
在某一方式中，步骤1中C-保护氨基酸或C-保护肽、和N-保护氨基酸或N-保护肽的连接通过将C-保护氨基酸或C-保护肽的N末端的氨基、和N-保护氨基酸或N-保护肽的C末端的羧基在缩合试剂的存在下或非存在下缩合而进行。在缩合试剂存在下进行反应的情形中，可以将系统中的羧基活化。在缩合试剂不存在下进行反应的情形中，可以利用将羧基预先活化的N-保护氨基酸或N-保护肽。
在步骤1中，除了溶剂外，可以采用之前的“制备环状肽化合物的方法”项中记载的方法，例如，反应条件、试剂，本步骤中优选应用的缩合试剂包含选自T3P、EDCI、HATU、COMU、BEP、PyBOP、DMT-MM、和PyOxim的缩合剂。
步骤1可以在独立选自甲苯、丙酮、DMF、乙腈、THF、2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、庚烷、乙酸乙酯、和4-甲基四氢吡喃的1个或多个的溶剂(溶剂B)中进行反应和其后的后处理，可以不分离、纯化产物、即目标的缩合体进行下一步骤。溶剂B优选包含至少1重量％以上、5重量％以上、10重量％以上、15重量％以上、20重量％以上、25重量％以上、30重量％以上、35重量％以上、40重量％以上、45重量％以上、50重量％以上、55重量％以上、60重量％以上、65重量％以上、70重量％以上、75重量％以上、80重量％以上、85重量％以上、90重量％以上、或95重量％以上的2-MeTHF、2-MeTHF与乙腈的混合溶剂(混合比：相对于1重量份乙腈，2-MeTHF为0.5重量份以上、优选0.5重量份至20重量份、进一步优选1重量份至10重量份、进一步优选1重量份至5重量份)、4-甲基四氢吡喃、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、和/或苯甲醚。该倾向特别是在应用HATU作为缩合剂的情形中是显著的。此外，在多次进行步骤1的情形中，在其中的至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、或至少10次中，或所有步骤1的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％中，溶剂B优选包含至少1重量％以上、5重量％以上、10重量％以上、15重量％以上、20重量％以上、25重量％以上、30重量％以上、35重量％以上、40重量％以上、45重量％以上、或50重量％以上、55重量％以上、60重量％以上、65重量％以上、70重量％以上、75重量％以上、80重量％以上、85重量％以上、90重量％以上、或95重量％以上的2-MeTHF。
(脱保护)
步骤2是从步骤1中得到的、N末端与C末端分别被保护的肽除去N末端的保护基的步骤。
在某一方式中，步骤2在例如N-保护基是Cbz、对硝基苄氧基羰基、2-萘基甲基氧基羰基、二苯基甲基氧基羰基、和9-蒽基甲基氧基羰基的情形中等，可以通过接触氢化进行。接触氢化可以应用本技术领域已知的任意的催化剂。作为催化剂，具体地，例如，列举Pd/C、Pd(OH)2/C、或PtO2等，优选Pd/C。接触氢化中应用的氢可以在常压应用，也可以加压应用。在加压应用的情形中，只要是1atm(14.7psi)以上即可，优选1atm(14.7psi)以上且3atm(44.1psi)以下，优选1atm(14.7psi)以上且2atm(29.4psi)以下，更优选1atm(14.7psi)以上且1.8atm(26.5psi)以下。伴随反应的进行，例如在氢压减少至反应开始时的氢压的90％以下左右的情形中，可再度追加氢直至反应开始时的初期氢压左右，其次数不受限制，可以进行直至目标的脱保护反应达到成为目标的反应转化率。此外，可以在起始原料存在下用氢置换反应容器内而开始反应，也可以在起始原料不存在下用氢置换反应容器内后将起始原料投入反应容器内而开始反应。
在某一方式中，步骤2可以在脱保护试剂的存在下进行。脱保护试剂相应于N-保护基的种类可以利用本技术领域已知的任意的试剂，例如，“Greene's Protective Groupsin Organic Synthesis,Fifth Edition,2014”中记载的试剂，例如，在N-保护基是Teoc、三氟乙酰基、Fmoc、或Boc的情形中等，优选应用TBAF、LiBH4、哌啶、三氟乙酸、或甲磺酸等。
在应用三氟乙酰基作为非天然氨基酸和肽的氮原子的保护基的情形中，已知可以用硼氢化钠等金属氢化物还原剂除去(Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis,Fifth Edition,2014)，根据情形，有时无法完全除去，产生副产物。本发明人等遭遇了，用硼氢化钠处理用三氟乙酰基保护的cLeu衍生物(TFA-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)NMe2)时，除了期望的脱保护体外，酰胺键被切断的MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)NMe2作为副产物产生。因而，发现应用硼氢化锂时，副反应被抑制。此外，知晓反应结束后立即应用氯化铵水溶液作为反应停止剂时，作为副产物产生了过剩还原体。因而，对反应条件进行了研究，结果发现在将氯化铵水溶液作为反应停止剂投入反应液之前，通过在-20～-10℃加入三氟乙醇后经1小时使其为0℃，其后搅拌1小时后加入氯化铵水溶液进行分液处理，可以抑制过剩还原体的副产物。此外，发现该分液操作后，由于硼原子与脱保护体的氮原子结合，因此在10℃～30℃加入三氟乙酸并在25℃搅拌后，通过与氢氧化钠水溶液混合并进行分液操作，可得到硼-氮键被切断的期望肽。此时，发现为了防止硼与氮的再结合，在10℃～30℃经50～90分钟向氢氧化钠水溶液滴加上述用三氟乙酸处理的溶液是重要的。
作为非限定的一个实施方式，也提供如下方法，该方法包括在三氟乙酰基的脱保护反应中，(1)使用硼氢化锂作为还原试剂、和/或(2)添加作为停止剂的氨水前使用三氟乙醇。在使用三氟乙酰基作为保护基的情形中，该方法优选包括下列两者：(1)使用硼氢化锂作为还原试剂、和(2)添加作为停止剂的氨水前使用三氟乙醇。
步骤2与步骤1同样，可以在独立选自甲苯、丙酮、DMF、乙腈、THF、2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、庚烷、乙酸乙酯、和4-甲基四氢吡喃的1个或多个溶剂(溶剂B)中进行反应和其后的后处理，可以不分离、纯化产物、即目标的脱保护体而进行下一步骤。溶剂B优选包含2-MeTHF。
在某一方式中，步骤2可以通过在-40℃～溶剂的沸点附近的温度、优选-30℃～100℃的温度、优选-5℃～40℃的温度将反应混合物搅拌15分钟～48小时而进行。
以下显示示例性反应参数和条件。在一个方式中，本说明书中记载的方法包括C-保护肽的保护基是tBu的肽化合物的C-末端氨基酸的脱保护，进一步，脱保护试剂是HMDS和TMSOTf的组合，脱保护步骤中的溶剂包含IPAc或2-MeTHF，C-保护肽可以是由2～13个氨基酸残基组成的肽化合物。
在相关的或另一方式中，本说明书中记载的方法包括肽化合物的N-末端氨基酸的脱保护反应，此处，N-保护肽的保护基是Cbz基，脱保护条件是催化氢化，氢化中的催化剂是Pd/C，氢化中的氢压是1atm(14.7psi)以上且3atm(44.1psi)以下，脱保护步骤中的溶剂包含2-MeTHF或THF，N-保护肽可以是由2～13个氨基酸残基组成的肽化合物。
在相关的或另一方式中，本说明书中记载的方法包括肽化合物的N末端氨基酸的脱保护反应，此处，N-保护肽的保护基是Teoc，脱保护试剂可以生成氟化物阴离子，脱保护试剂是TBAF，脱保护步骤的溶剂包含2-MeTHF、乙酸异丙酯、碳酸二甲酯或苯甲醚，N-保护肽可以是由2～13个氨基酸残基组成的肽化合物。
在相关的或另一方式中，本说明书中记载的方法包括肽化合物的N末端氨基酸的脱保护反应，此处，N-保护肽的保护基是三氟乙酰基(TFA)，脱保护试剂是还原试剂，脱保护试剂是硼氢化锂，脱保护步骤的溶剂包含2-MeTHF或甲醇，N-保护肽可以是由2～13个氨基酸残基组成的肽化合物。
已知除去肽的N末端的氨基酸残基的氮原子的保护基时，有时形成二酮哌嗪，得不到作为目标的脱保护体(J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1987,1155-1156.)。
本发明人等发现，为了除去作为Cbz-Ile-MeAla-Aze衍生物的末端氮原子的保护基的Cbz基，进行加氢分解反应时，反应中形成了二酮哌嗪，无法继续肽延伸。
因而，对脱Cbz反应和肽延伸的反应条件进行了研究，结果发现在氨基酸活性酯存在下，将Cbz体交付于加氢分解，进行脱Cbz时，可以有效地肽延伸。文献(J.Chem.Soc.,Chem.Ccmmun.,1987,1155-6.)报告了，在氨基酸活性酯存在下，将Cbz体交付于加氢分解而进行肽延伸的实例，作为Cbz体，仅报告了Cbz-Ala-D-Pro-OMe、Cbz-Asu(OBut)-D-Pro-OMe-、Cbz-D-Val-Pro-OMe，关于有关Aze衍生物的实例，尚未记载。此外，关于与N-烷基氨基酸活性酯的反应的实例也未公开。对于N-烷基氨基酸活性酯，根据其立体因素容易地推断，与氮未烷基化的通常的氨基酸活性酯相比反应性降低。因此，脱Cbz产生比N-烷基氨基酸活性酯反应的时间早时，生成了二酮哌嗪。即，需要发现脱Cbz后快速地与N-烷基氨基酸活性酯反应的条件。本发明人等对反应条件进行了研究，结果发现，在作为N-烷基氨基酸活性酯的Teoc MeLeu-pFp存在下，将Cbz-Ile-MeAla-Aze-EtPh(4-Me)-MeGly体在乙酸异丙酯中加入N-甲基吗啉和Pd/C，在氢压0.10～0.18MPaG进行加氢分解反应时，抑制二酮哌嗪的生成，可得到Teoc-MeLeu-Ile-MeAla-Aze-EtPh(4-Me)-MeGly体。此外，此时发现，通过在丙酮存在下进行本反应，反应后进行分液操作，可以除去未反应的脱保护的肽。即，知晓的是，使丙酮存在36当量进行加氢分解反应时，未反应的脱保护的肽的氨基被异亚丙基化，抑制向二酮哌嗪转化，由于该异亚丙基化的肽是末端氮未被酰胺化的碱性化合物，因此用反应后的分液处理酸洗可以容易地除去。
本发明的制备肽化合物的方法可以进一步包括除去C-保护基的步骤3。
步骤3例如在C-保护基是t-Bu、三苯甲基、枯基、甲基、或乙基的情形中等可以在脱保护试剂的存在下，在酸性条件进行。脱保护试剂可以利用本技术领域已知的任意的试剂，例如，“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,Fifth Edition,2014”中记载的试剂。本发明中，为了实现酸性条件，例如，优选应用HMDS与选自TMSOTf、TMSI、TMSBr、和TMSCl的试剂的组合。
步骤3与步骤1和步骤2同样，可以在独立选自甲苯、丙酮、DMF、乙腈、THF、2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、庚烷、乙酸乙酯、和4-甲基四氢吡喃的1个或多个溶剂(溶剂B)中进行反应和其后的后处理，可以不分离、纯化产物、即目标的脱保护体而进行下一步骤。溶剂B优选包含2-MeTHF。
步骤3可以在步骤1之后(即，步骤1与步骤2之间)、或步骤2之后的任一进行。更具体地，如后述，在本发明的方法中，步骤1与步骤2可重复多次，步骤3可以在最初的步骤1之后或步骤2之后进行，可以在步骤1与步骤2的某次重复的步骤1之后或步骤2之后进行，也可以在步骤1与步骤2的最终次重复的步骤1之后或步骤2之后进行。在某一方式中，步骤3优选在步骤1与步骤2的最终次重复的步骤1之后或步骤2之后进行，更优选在最终次重复的步骤1之后进行。在步骤1之后进行步骤3的情形中，可以得到仅N末端被保护的直链肽化合物。在步骤2之后进行步骤3的情形中，可以得到N末端与C末端两者被脱保护的直链肽化合物。
在某一方式中，步骤3可以通过在-20℃～溶剂的沸点附近的温度、优选0℃～180℃的温度将反应混合物搅拌15分钟～48小时而进行。
(步骤1与步骤2的重复)
在某一方式中，本发明的制备肽化合物的方法包括重复前述步骤1和前述步骤2，由此可以延伸肽链。重复的次数不受限定，优选2次～20次，更优选2～15次。重复步骤1与步骤2时，重复的最终次可以不包括步骤2。在某一方式中，在重复的最终次不包括步骤2的情形中，本发明的方法的最终步骤可为步骤1。该情形中，制备的直链肽化合物可为N末端和C末端两者被保护的直链肽化合物。在某一方式中，在重复的最终次不包括步骤2的情形中，步骤1之后进行的步骤3可为本发明的方法的最终步骤。该情形中，制备的直链肽化合物可为仅N末端被保护的直链肽化合物。
(后处理)
步骤1～步骤3的各反应后可以进行后处理，通过该后处理，可以不分离中间体进行下一反应。作为后处理，具体地，包括：选自包含有机层或水层的洗涤的分液操作、过滤操作、和浓缩操作的1个或多个操作，可以适当组合这些操作使得成为适于下一步骤的状态。例如，在应用缩合试剂、脱保护试剂进行步骤1～步骤3的各反应的情形中，作为该后处理，通常，进行至少1次以上的分液操作。此外，在通过接触氢化进行步骤2的反应的情形中，通常，作为该后处理进行过滤操作。在任一情形中，例如，以调节下一步骤中准备的溶剂量为目的、或者以溶剂的置换为目的，可以进一步进行浓缩操作而蒸馏除去溶剂的一部分。
在某一方式中，分液操作可以在步骤1～步骤3的各反应完成后进行，以便液液萃取目标物，其中也可包括有机层或水层的洗涤。在进行分液操作的情形中，在系统中添加适于分液操作的量，例如，有机层：水层成为20：80～80：20的体积比的范围内的量的水和/或水溶液和/或有机溶剂。作为用于分液操作添加的水溶液，列举硫酸氢钠水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸钠水溶液、磷酸氢二钾水溶液、磷酸氢二钠水溶液、磷酸二氢钠水溶液、氯化钠水溶液、柠檬酸水溶液、氨水溶液、盐酸水溶液等。作为用于分液操作添加的有机溶剂，列举不与水混溶的溶剂、水溶性烷基腈类、和水溶性醚类等。在本说明书中，用于分液操作添加的、不与水混溶的溶剂有时称为“溶剂C”。作为用于分液操作添加的有机溶剂，具体地，例如，列举选自2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃、庚烷、和乙腈的1个或多个等。此外，分液操作时，有机层优选包含对碱性稳定、化合物的溶解性优异的2-MeTHF。
在某一方式中，在步骤1～步骤3的各反应后含有许多乙腈、THF的情形中等，溶剂B与水为混溶性、水层与有机层不适当分离的情形中，在分液操作之前，通过除水和/或水溶液外，还加入不与水混溶的溶剂(溶剂C)，可以分离水层与有机层。用步骤1～步骤3的各反应后的分液操作，确定水层与有机层是否适当分离，作为非限定的示例，可以在步骤1～步骤3的各反应后的分液操作后静置1～30分钟，确定是否形成2层。作为溶剂C，列举对水的溶解度低的溶剂，例如，对水的溶解度是999g/L以下的溶剂、500g/L以下的溶剂、250g/L以下的溶剂，优选200g/L以下的溶剂，更优选150g/L以下的溶剂。此外，作为溶剂C，优选log Kow值、或log Kow值的预测值采取正值、例如0以上且5以下的值的溶剂。具体地，列举2-MeTHF、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、庚烷、苯甲醚、MTBE、CPME、4-甲基四氢吡喃等，从可高效用有机溶剂萃取通过反应的产物的观点出发，优选应用2-MeTHF、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、或庚烷、或包含它们的溶剂。
溶剂C优选以可分离的量添加至水层和有机层，例如，相对于有机层整体，可以以约50重量％～100重量％的量向系统中添加。水层和有机层的分离可以用标准方法确定，该方法示例为，在分液操作中添加溶剂C后，将水层和有机层的混合物静置1～30分钟，观察是否形成2层的方法。
在某一方式中，分液操作可以包括有机层或水层的洗涤。分液操作中的洗涤可为了应用不包含目标物的溶液从包含目标物的溶液除去可成为目标物以外的杂质的物质而进行。目标物通常在有机层中存在，该情形中，通过用水溶液洗涤有机层，可以将水层中可成为杂质的物质萃取而除去。另一方面，在分液操作过程中将目标物暂时从有机层移至水层的情形等目标物在水层中存在的情形中，洗涤水层。
有机层的洗涤可以应用中性、碱性或酸性的水溶液。作为有机层的洗涤中可利用的水溶液，具体地，可以利用硫酸氢钠水溶液、硫酸氢钾水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸钠水溶液、磷酸氢二钾水溶液、磷酸氢二钠水溶液、磷酸二氢钠水溶液、氯化钠水溶液、柠檬酸水溶液、氨水溶液、盐酸水溶液等水溶液。在某一方式中，为了充分去除系统在存在的未反应的氨基酸、肽，优选以碳酸钠水溶液、硫酸氢钠水溶液、和/或碳酸钠水溶液的顺序洗涤有机层。即使如此，在无法充分除去氨基酸、肽的情形中等，通过应用包含柠檬酸和磷酸氢二钾的水溶液洗涤有机层，可以有效除去它们。此外，在某一方式中，在脂溶性高的氨基酸、肽的除去中，应用乙腈和碳酸钾水溶液的混合液洗涤有机层是有效的。
水层的洗涤可以应用不与水混溶的有机溶剂，优选应用2-MeTHF、庚烷、MTBE、乙酸异丙酯等有机溶剂。
本发明涉及除去作为来自溶剂的稳定剂的BHT(2,6-二-叔丁基-4-甲基苯酚)的方法。具体地，该方法包括，在分液操作、例如本发明的各步骤后的分液操作中，作为有机层，应用包含乙腈、丙腈、2-MeTHF、和庚烷的溶剂，由此可以有效除去BHT。通过该方法，可将有机层中的BHT的残存量以HPLC分析中在210nm的UV面积％值设成相对于目标物2.0％以下、1.9％以下、1.8％以下、1.7％以下、1.6％以下、1.5％以下、1.4％以下、1.3％以下、1.2％以下、1.1％以下、1.0％以下、0.9％以下、0.8％以下、0.7％以下、0.6％以下、0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下、0.1％以下、或0.05％以下。将目标物溶解于包含水和水溶性烷基腈的水层后，通过应用特定的溶剂作为有机层可除去BHT。此处应用的水溶性烷基腈优选乙腈。可用于除去BHT的有机层优选包含不与水混溶的溶剂。也可组合应用多个不与水混溶的溶剂，优选的组合是2-MeTHF和庚烷、或MTBE和庚烷。对于优选溶剂的比，相对于水溶性烷基腈，优选应用100重量％以上的不与水混溶的溶剂，更优选地，通过以100重量％以上且400重量％以下的范围、进一步优选100重量％以上且300重量％以下的范围应用，可有效除去BHT。在组合应用2-MeTHF和庚烷、或MTBE和庚烷的情形中，通过相对于庚烷以10重量％以上且100重量％以下的范围、优选10重量％以上且80重量％以下的范围应用2-MeTHF或MTBE，可有效除去BHT。
市售的THF、2-MeTHF有时作为稳定剂包含150～400ppm左右的BHT。在大量应用这样的THF、2-MeTHF的情形中，例如，步骤数成为20步骤以上时，BHT的残存量达到4％，对反应的不良影响可不能无视。通过应用本发明的方法，不需要进行事先从溶剂除去BHT的操作、用于除去步骤途中蓄积的BHT的分离操作(例如，柱色谱)。因此，通过在包含多个步骤、大尺度的肽的液相合成的情形等中使用该方法，可以连续延伸肽链，可以有效得到目标的肽化合物。
本发明中的过滤操作和浓缩操作可以利用本技术领域已知的过滤操作和浓缩操作。
在某一方式中，作为各步骤的后处理，在选自分液操作、过滤操作、和浓缩操作的1个或多个操作之前或之后，或开始下一步骤的反应之前，有时在系统中添加溶剂，例如，洗涤反应釜等反应容器的溶剂。具体地，例如，可在系统中添加独立选自甲苯、丙酮、DMF、乙腈、THF、2-MeTHF、碳酸二甲酯、苯甲醚、乙酸异丙酯、庚烷、乙酸乙酯、和4-甲基四氢吡喃的1个或多个溶剂。在本说明书中，添加该溶剂的操作也包含在后处理中。
本发明的制备肽化合物的方法不包括将中间体作为单一化合物分离的步骤。因此，初次的步骤2的后处理后的溶剂、或步骤1与步骤2的某次重复的步骤2的后处理后的溶剂可成为它们的下一次的步骤1的反应溶剂(溶剂B)。同样地，初次的步骤1的后处理后的溶剂、或步骤1与步骤2的某次重复的步骤1的后处理后的溶剂可成为它们的次的步骤2的反应溶剂(溶剂B)。即，随着重复步骤1与步骤2，溶剂B的组成可改变，但构成溶剂B的溶剂种类可与此前的步骤1和步骤2的反应和后处理中应用的溶剂种类一致。
在某一方式中，本发明的制备环状肽化合物的方法中应用的溶剂(溶剂A)包含通过本发明的制备肽化合物的方法制备直链肽化合物后的溶剂(溶剂X)。在某一方式中，将溶剂X作为溶剂A，可以原样在环化反应中利用。在另一方式中，可以在溶剂X中进一步加入选自1种或多种不与水混溶的溶剂、1种或多种水溶性烷基腈类、和1种或多种水溶性醚类的1个或多个，作为溶剂A。在溶剂X中进一步加入溶剂作为溶剂A的情形中，作为加入的溶剂，优选列举2-MeTHF、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、苯甲醚、乙腈、THF、4-MeTHP、氯苯、1,3-二甲氧基苯、MTBE、CPME等，特别优选乙腈、2-MeTHF、苯甲醚、碳酸二甲酯。例如，在溶剂X中加入溶剂例如乙腈、2-MeTHF、苯甲醚、或碳酸二甲酯作为溶剂A的情形中，优选加入相对于溶剂X的重量为20～80倍量的溶剂。
如前述，在本发明的制备肽化合物的方法中，步骤1与步骤2可重复，但该重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽和N-保护肽的一者或两者优选包含4个以上N-取代氨基酸残基，或包含2个以上N-取代氨基酸残基，并且包含1个以上α,α二取代氨基酸残基。作为N-取代氨基酸残基，优选N-甲基或N-乙基氨基酸残基等N-烷基氨基酸残基、或脯氨酸或Aze(2)等N-取代环状氨基酸残基。此外，作为α,α二取代氨基酸残基，优选α,α二甲基氨基酸残基等α,α二烷基氨基酸残基和α位存在的2个基团连接形成脂环的cLeu等α,α二取代环状氨基酸残基等。
此外，在某一方式中，重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽和N-保护肽的一者或两者优选由5个氨基酸残基组成，其中的4个是非天然氨基酸残基。
在另一方式中，重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽和N-保护肽的一者或两者优选由6个氨基酸残基组成，其中的5个是非天然氨基酸残基。
在某一方式中，本发明的制备肽化合物的方法可以用于得到本发明的制备环状肽化合物的方法的原料中应用的直链肽化合物。例如，通过本发明的制备环状肽化合物的方法，制备前述式1的环状肽化合物的情形中，为了制备成为其原料的直链肽化合物，作为重复的最终次的步骤1中应用的C-保护肽，可以应用C-保护的MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGly，此外，作为重复的最终次的步骤1中应用的N-保护肽，可以应用N-保护的Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2。
在某一方式中，通过应用本发明的制备肽化合物的方法，可以制备可成为前述式(1)的环状肽化合物的制备原料的、前述式(2)的直链肽化合物。
具体地，例如，作为第1批次，作为C-保护氨基酸，应用
[化学式15]
(MeAsp(OtBu)-NMe2)
，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式16]
(Z-MeGly(cPent))
，经步骤1，可以制备
[化学式17]
(Z-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)
，经步骤2，可以制备
[化学式18]
(MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)。
随后，将该化合物作为C-保护氨基酸应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式19]
(TFA-cLeu)
或
[化学式20]
(Cbz-cLeu)
，经步骤1，可以制备
[化学式21]
(TFA-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)
或
[化学式22]
(Cbz-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)
，经步骤2，可以制备
[化学式23]
(cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用[化学式24]
，经步骤1，可以制备
[化学式25]
(Z-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)
，经步骤2，可以制备
[化学式26]
(Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式27]
(Z-Hph(4-CF3-35F2)Cy2NH)
，经步骤1，可以制备
[化学式28]
(Z-Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp(OtBu)-NMe2)
，经步骤3，可以制备作为该批次的目标物的[化学式29]
(Z-Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2)。
该批次是在步骤1之后包含步骤3、并且步骤1与步骤2的重复的最终次不包含步骤2的情形。
随后，作为第2批次，作为C-保护氨基酸，应用
[化学式30]
(MeGlyOtBu HCl)
，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式31]
(Z-EtPhe(4-Me)Cy2NH)
，经步骤1，可以制备
[化学式32]
(Z-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤2，可以制备
[化学式33]
(EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式34]
(Z-Aze(2))
，经步骤1，可以制备
[化学式35]
(Z-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤2，可以制备
[化学式36]
(Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式37]
(Z-MeAla)
，经步骤1，可以制备
[化学式38]
(Z-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤2，可以制备
[化学式39]
(MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式40]
/>
(Z-Ile)
，经步骤1，可以制备
[化学式41]
(Z-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤2，可以制备
[化学式42]
(Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，应用
[化学式43]
(Teoc-MeLeu-Opfp)
，经步骤1，可以制备
[化学式44]
(Teoc-MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤2，可以制备
[化学式45]
/>
(MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)。
随后，将该化合物作为C-保护肽应用，作为N-保护氨基酸，在第1批次中制备。应用
[化学式46]
，经步骤1，可以制备
[化学式47]
Z-Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2-MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGlyOtBu)
，经步骤3，可以制备
[化学式48]
Z-Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2-MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGly)
，经步骤2，可以制备作为该批次的目标物的化合物(2)：
[化学式49]
Hph(4-CF3-35F2)-Pro-cLeu-MeGly(cPent)-MeAsp-NMe2-MeLeu-Ile-MeAla-Aze(2)-EtPhe(4-Me)-MeGly)。
该批次是在步骤1与步骤2的重复的最终次中步骤1之后包含步骤3的情形。
此外，该批次中得到的化合物2可以不分离、纯化而作为本发明的制备环状肽化合物的方法的原料利用。
由于应用本发明的方法的上述批次均可以不分离、纯化中间体而有效制备目标的直链肽化合物，本发明的方法在大规模尺度的肽合成中非常有用。
在某一方式中，本发明的制备肽化合物的方法可以进一步包括将肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤，通过经该步骤可以制备环状肽化合物。在某一方式中，N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基的连接通过将经多次重复步骤1与步骤2制备的、直链肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接而实现。在某一方式中，在本步骤中，可以适用前述的“制备环状肽化合物的方法”的项中记载的方法，例如，反应条件、试剂。
在某一方式中，本发明涉及由前述式(1)表示的环状肽化合物的盐、溶剂化物、或盐的溶剂化物。该化合物的溶剂化物优选水合物或DMSO-水溶剂化物。
在某一方式中，本发明涉及前述式(1)的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的晶体。作为该化合物的晶体，具体地，列举该化合物的非溶剂化物晶体、或溶剂化物晶体、或者该化合物的盐的非溶剂化物晶体、或溶剂化物晶体。作为溶剂化物晶体，优选列举水合物晶体、DMSO-水合物晶体、丙酮-水合物晶体。
粉末X线衍射中的衍射角2θ是应用CuKα、或CuKα1放射线测定的衍射峰。有时将这些溶剂化物晶体进一步用经粉末X线衍射的衍射角2θ来特定的晶体称为例如以下所示水合物的“C型晶体”，有时也简单称为“C型”。
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是水合物晶体的情形中，该晶体是C型晶体，该C型晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述之中的至少1个峰。
4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是水合物晶体的情形中，该晶体是C型晶体，该C型晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述的峰。
4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)
在衍射角2θ的标记中列出的衍射角2θ的最后记载为“(±0.2°)”的情形中，意味着在列出的全部衍射角2θ中，对记载的各值容许±0.2°的范围。
在某一方式中，该C型晶体具有与图1中记载的那种实质上相同的X线衍射图。在某一方式中，该C型晶体具有与图8中记载的那种实质上相同的DSC和TG热图。
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是非溶剂化物晶体的情形中，该晶体是F型晶体，该F型晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述之中的至少1个峰。
5.370°、6.934°、8.940°、9.838°、10.771°、12.181°、13.525°、15.179°、16.202°、或17.554°(±0.2°)
在某一方式中，该F型晶体具有与图2中记载的那种实质上相同的X线衍射图。
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是溶剂化物晶体的情形中，该晶体是A型的DMSO-水合物晶体，该A型的DMSO-水合物晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述之中的至少1个峰。
8.006°、9.002°、9.943°、11.501°、13.067°、14.854°、16.320°、17.275°、19.261°、或20.324°(±0.2°)
在某一方式中，该A型晶体具有与图3中记载的那种实质上相同的X线衍射图。
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是溶剂化物晶体的情形中，该晶体是B型的DMSO-水合物晶体，该B型的DMSO-水合物晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述之中的至少1个峰。
8.223°、9.594°、9.976°、11.879°、13.841°、14.572°、15.934°、16.350°、19.805°、20.480°(±0.2°)
在某一方式中，该B型晶体具有与图4中记载的那种实质上相同的X线衍射图。在某一方式中，该B型晶体具有与图5中记载的那种实质上相同的DSC热图。
在某一方式中，在式(1)的化合物的晶体是溶剂化物晶体的情形中，该晶体是H型的丙酮-水合物晶体，该H型的丙酮-水合物晶体在粉末X线衍射中具有粉末X线衍射图，该衍射图包含作为衍射角2θ的下述之中的至少1个峰。
7.942°、8.283°、8.861°、10.097°、10.491°、11.805°、12.673°、12.830°、13.514°、13.855°、15.853°、16.405°、16.642°、和17.772°(±0.2°)
在某一方式中，该H型晶体具有与图13中记载的那种实质上相同的X线衍射图。
在某一方式中，式(1)的化合物的晶体在任一形式均实质上不包含杂质。例如，式(1)的化合物的晶体可具有至少约90％的纯度。在某一方式中，式(1)的化合物的晶体具有至少约95％的纯度。在某一方式中，式(1)的化合物的晶体具有至少约98％的纯度。例如，式(1)的化合物的晶体可具有至少98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％的纯度。在某一方式中，式(1)的化合物的晶体实质上不包含其它形式。
在一个方式中，C型晶体实质上不包含由式(1)表示的化合物的其它晶体形式。
在一个方式中，F型晶体实质上不包含由式(1)表示的化合物的其它晶体形式。
在一个方式中，A型晶体实质上不包含由式(1)表示的化合物的其它晶体形式。
在一个方式中，B型晶体实质上不包含由式(1)表示的化合物的其它晶体形式。
在一个方式中，H型晶体实质上不包含由式(1)表示的化合物的其它晶体形式。
在某一方式中，本发明涉及由前述式(1)表示的环状肽化合物的水合物晶体的制备方法。该制备方法包括以下的步骤。
步骤A：使环状肽化合物溶解于可溶解该环状肽化合物的量的极性有机溶剂，得到溶液的步骤，
步骤B：浓缩该溶液，得到该环状肽化合物的残渣的步骤，和
步骤C：在该残渣中加入水和极性有机溶剂的混合液，得到该环状肽化合物的水合物晶体的步骤。
在某一方式中，步骤A中应用的极性有机溶剂可以应用可溶解式(1)的环状肽化合物、例如粗纯化物状态的该环状肽化合物的溶剂，具体地，优选示例DMSO、DMF、DMA、NMP、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈等，更优选示例丙酮、DMSO、或乙醇。作为可溶解的量，相对于式(1)的环状肽化合物，可以应用3～10w/v的范围、优选3～7w/v的范围。
在某一方式中，步骤B中的浓缩包括冷冻干燥。在某一方式中，步骤B中得到的残渣可以是无定形、油状物质、或固体。在某一方式中，步骤B中得到的残渣可以是冷冻干燥物。
在某一方式中，步骤C中应用的极性有机溶剂可以是与步骤A中应用的极性有机溶剂同样的溶剂。作为步骤C中应用的混合液中水与极性有机溶剂的混合比，相对于1重量份极性有机溶剂，可以应用0.5～10重量份水，优选应用1～7重量份水、进一步优选应用1～5重量份水是优选的。此外，步骤C中应用的极性有机溶剂优选乙腈、乙醇、或丙酮。
本发明涉及由前述式(1)表示的环状肽化合物的晶体的制备方法。该制备方法包括：
使无定形状态的该环状肽化合物溶解于DMSO，得到溶液的步骤，将该溶液冷冻干燥，得到该环状肽化合物的冷冻干燥物的步骤，和
在该冷冻干燥物中加入水-乙腈混合液，得到该环状肽化合物的水合物晶体的步骤。
另外，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考并入本说明书。
实施例
用以下的实施例对本发明的内容进一步说明，但本发明不限于该内容。除非特别记载，起始物质、起始原料、溶剂和试剂得自商业供应商，或应用公知的方法合成。化合物2和化合物30通过国际公开第2020/189540号中记载的方法制备。
通过HPLC的分析条件如下所示。
HPLC分析条件方法1
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：Ascentis Express 90AC18(Sigma-Aldrich),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(5min)→5％(5.1min)→5％(7min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
HPLC分析条件方法2
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：Ascentis Express 90A C18(Sigma-Aldrich),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(6min)→5％(6.1min)→5％(8min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
HPLC分析条件方法3
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：CAPCELL CORE ADME(OSAKASODA),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)：5％(0min)→100％(5min)→5％(5.1min)→5％(7min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
HPLC分析条件方法4
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：ACQUITY UPLC CSH C18(Waters),2.1mm ID×100mm,1.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)20％(0min)→100％(10min)→100％(13.5min)→20％(13.6min)→20％(18.0min)
流速：0.3mL/min
柱温：50℃
检测波长：210nm(PDA)
HPLC分析条件方法5
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：ACQUITY UPLC CSH C18(Waters),2.1mm ID×150mm,1.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)20％(0min)→100％(24min)→100％(29min)→20％(29.1min)→20％(34min)
流速：0.3mL/min
柱温：50℃
检测波长：220nm(PDA)
HPLC分析条件方法6
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class
柱：CAPCELL CORE ADME(OSAKA SODA),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)：5％(0min)→100％(10min)→5％(10.1min)→5％(12min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
[表1]
实施例编号(化合物编号) HPLC分析条件 保留时间(分钟)
实施例1(化合物4) 方法1 4.500
实施例2(化合物5) 方法1 2.389
实施例3(化合物7) 方法1 4.065
实施例4(化合物8) 方法1 2.538
实施例5(化合物10) 方法1 4.004
实施例6(化合物11) 方法1 2.510
实施例7(化合物13) 方法1 4.235
实施例8(化合物15) 方法2 6.175
实施例9(化合物16) 方法2 5.964
实施例10(化合物17) 方法1 3.057
实施例11(化合物19) 方法3 3.510
实施例12(化合物20) 方法3 1.560
实施例13(化合物22) 方法3 4.356
实施例14(化合物23) 方法3 2.297
实施例15(化合物25) 方法3 6.166
实施例15-1(化合物25a) 方法6 6.712
实施例16(化合物26) 方法3 2.725
实施例17(化合物28) 方法3 4.189
实施例18(化合物29) 方法3 2.846
实施例19(化合物31) 方法3 4.978
实施例20(化合物32) 方法3 4.220
实施例21(化合物33) 方法4 10.272
实施例22(化合物34) 方法4 9.215
实施例23(化合物35) 方法4 6.480
实施例24(化个物1) 方法5 18.008
通过LCMS的分析条件如下所示。
LCMS分析条件方法1
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class+ACQUITY QDA
柱：Ascentis Express 90AC18(Sigma-Aldrich),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(5min)→5％(5.1min)→5％(7min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
LCMS分析条件方法2
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class+ACQUITY QDA
柱：Ascentis Express 90A C18(Sigma-Aldrich),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(6min)→5％(6.1min)→5％(8min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
LCMS分析条件方法3
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class+ACQUITY QDA
柱：CAPCELL CORE ADME(OSAKASODA),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(5min)→5％(5.1min)→5％(7min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
LCMS分析条件方法4
装置：Waters SQD2
柱：ACQUITY UPLC CSH C18(Waters),2.1mm ID×100mm,1.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)20％(0min)→100％(10min)→100％(13.5min)→20％(13.6min)→20％(18.0min)
流速：0.3mL/min
柱温：50℃
检测波长：210nm(PDA)
LCMS分析条件方法5
装置：Waters SQD2
柱：ACQUITY UPLC CSH C18(Waters),2.1mm ID×150mm,1.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)20％(0min)→100％(24min)→100％(29min)→20％(29.1min)→20％(34min)
流速：0.3mL/min
柱温：50℃
检测波长：220nm(PDA)
LCMS分析条件方法6
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class+ACQUITY QDA
柱：CAPCELL CORE ADME(OSAKA SODA),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)：5％(0min)→100％(10min)→5％(10.1min)→5％(12min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
[表2]
/>
1H-NMR谱应用核磁共振装置ECX500II(JEOL公司制)测定，以用作内部标准物质的Me4Si的化学位移为0ppm，参考来自样品溶剂的氘锁信号。对于样品溶液，相应于测定目的将市售的氘化溶剂用作样品溶剂，与测定对象化合物混合并调整。信号的积分值根据各信号的信号面积强度比算出。
关于通过qNMR的测定法，将含有目标化合物的残渣和内部标准物质溶解于DMSO-d6，按以下的分析条件进行。应用通过qNMR算出的残渣中的目标物的含量的值、和通过HPLC分析算出的残渣的目标物纯度的值，利用以下的式进行收率的算出。
[数学式1]
测定装置：JNM-ECZ500R
内部标准物质：3，5-双(三氟甲基)苯甲酸
测定条件(1H-NMR)：DMSO-d6,24.3℃,脉冲角度90℃,数字分辨率0.25Hz,缓和时间60秒、无旋转、累计次数8次
测定条件(19F-NMR)：DMSO-d6,24.3℃,脉冲角度90℃,数字分辨率0.22Hz,缓和时间60秒、无旋转、累计次数8次
粉末X线(XRPD)衍射测定用以下的条件测定，算出扫描范围的2θ值。X线衍射图在横轴上绘制衍射的角度(2θ值)，在纵轴上绘制衍射强度。
(测定方法1)
测定装置：SmartLab System(Rigaku Corporation公司制)
线源：CuKα1
管电压：45kV
管电流：200mA
扫描范围：3～35°
采样宽度：0.02°
(测定方法2)
测定装置：SmartLab System、D/Tex Ultra detector(Rigaku公司制)
线源：CuKα1
管电压：45kV
管电流：200mA
扫描范围：5～30°
扫描速度：5°/分钟
采样宽度：0.02°
(测定方法3)
测定装置：D8 Discover、2D VANTEC-500solid state detector(Bruker公司制)
线源：CuKα
管电压、管电流：40kV、40mA或50kV、1000μA(微焦点X线源IμS使用时)
测定范围：5～31°
曝光时间：100秒或600秒(微焦点X线源IμS使用时)
(测定方法4)
测定装置：X’pert-pro MPD(PANalytical公司制)
线源：CuKα
管电压：45kV
管电流：40mA
扫描范围：3～40°
扫描速度：4.2°/分钟
采样宽度：0.017°
(测定方法4)
测定装置：X’pert-pro MPD(PANalytical公司制)
线源：Cu
管电压：45kV
管电流：40mA
扫描范围：3～25°
扫描速度：0.33°/秒
采样宽度：0.026°
测定：将采样的悬浮液装入X线晶体分析用毛细管，测定。
热分析在以下的条件测定。
(测定方法1)
测定装置：EXSTAR TG/DTA6200R装置(Seiko Instruments(现公司名：日立HighTech Science)公司制)
测定范围：30～350℃
升温速度：10℃/分钟
气氛：氮
(测定方法2)
测定装置：SmartLab System、DSC attachment(Rigaku公司制)
测定范围：35～270℃
气氛：氮
DSC条件示于表3。
[表3]
设定温度(℃) 升温速度(℃/分钟) 保留时间(分钟)
35.0 5.0 0
270.0 5.0 5
35.0 20.0 5
(测定方法3)
测定装置：STA7200RV+AS-3T(日立High Tech Science制)
测定范围：30～350℃
升温速度：10℃/分钟
气氛：氮
(测定方法4)
测定装置：TGA/DSC 3+(Mettler Toledo制)
测定范围：25～350℃
升温速度：10℃/分钟
气氛：干燥氮
关于通过HPLC的测定法，将包含目标化合物的混合液用以下的任一方法进行样品配制，按上述的分析条件进行。
样品配制法1：用乙腈稀释包含目标化合物的混合液。
样品配制法2：用以9比1的比率混合乙腈与丙胺的混合液稀释包含目标化合物的混合液。
样品配制法3：用甲醇稀释包含目标化合物的混合液。
样品调整法4：用以4比1的比率混合甲醇与水的混合液稀释包含目标化合物的混合液。
应用通过HPLC分析算出的原料的面积值与目标物的面积值、或原料的面积值与原料的丙酰胺体的面积值与目标物的面积值、或反应前的原料的面积值与反应后的原料的面积值，利用以下的任一式进行反应转化率的算出。
式1：反应转化率(％)＝目标物的面积值/(原料的面积值+目标物的面积值)×100
式2：反应转化率(％)＝目标物的面积值/(原料的面积值+原料的丙酰胺体的面积值+目标物的面积值)×100
式3：反应转化率(％)＝100-(反应后的原料的面积值/反应前的原料的面积值×100)
实施例1
化合物4：(叔丁基2-[[(2S)-2-[苄氧基羰基(乙基)氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]- 甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式50]
在用氮置换的反应釜中，在室温加入化合物2(4.60kg)和化合物3(1.92kg)，随后加入2-MeTHF(22.8kg)搅拌。将反应釜的外温设定为10℃，加入DIPEA(6.15kg)后，滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、13.45kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌5小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法2)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式2)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边滴加5％碳酸钠水溶液(26.6kg)，随后，加入水(6.9kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌20分钟后，从反应釜排出水层。同样在外温25℃用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(34.5kgx3)、5％碳酸钠水溶液(34.5kg)洗涤得到的有机层。在保管容器中回收得到的有机层，合并用2-MeTHF(25.6kg)洗涤反应釜的洗涤液，作为保管溶液在保管容器中回收。边用2-MeTHF(1.7kg)清洗保管容器内，边在用氮置换的反应釜中加入前述的保管溶液。将反应釜的外温设定为50℃，减压浓缩，直至液量成为12L左右。在保管容器中回收得到的残渣，合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤反应釜的洗涤液，得到包含化合物4的2-MeTHF溶液(17.8kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.500分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例2
化合物5：(叔丁基2-[[(2S)-2-(乙基氨基)-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙 酸酯)的合成
[化学式51]
在用氮置换的反应釜中，加入实施例1中得到的包含化合物4的2-MeTHF溶液(16.9kg)、2-MeTHF(8.6kg)后，加入5％Pd/C(1.78kg、50％含水物)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压，直至反应釜的内压成为0.18MPaG。1小时后，确认没有内压的变动后，氮置换后进一步用氢加压直至0.18MPaG，搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应容器内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.8kg)洗涤反应釜和过滤器后，将滤液和洗涤液作为保管溶液在保管容器中回收。将得到的滤液和洗涤液在外温40℃减压浓缩，直至液量成为5L左右。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤反应釜的洗涤液，得到包含化合物5的2-MeTHF溶液(12.4kg)。
通过HPLC分析的保留时间：2.389分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例3
化合物7：(苄基(2S)-2-[[(1S)-2-[(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-甲基-氨基]-2- 氧代-1-(对甲苯基甲基)乙基]-乙基-氨基甲酰基]氮杂环丁烷-1-甲酸酯)的合成
[化学式52]
在用氮置换的反应釜中，边用2-MeTHF(8.0kg)清洗，边在搅拌的同时加入实施例2中得到的包含化合物5的2-MeTHF溶液(12.3kg)、与将化合物6(2.92kg)溶解于2-MeTHF(3.87kg)的溶液。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边加入DIPEA(5.35kg)后，滴加T3P(1.6M 2-MeTHF溶液、15.53kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌反应混合物2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边在反应混合物中加入5％碳酸钠水溶液(25.2kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(33.2kg)洗涤有机层2次后，用5％碳酸钠水溶液(33.2kg)洗涤。在保管容器中回收有机层，合并用2-MeTHF(25.6kg)洗涤反应釜的洗涤液，作为保管溶液在保管容器中回收。在用氮置换的反应釜中，边用2-MeTHF(1.7kg)清洗保管容器内边加入前述保管溶液。将反应釜的外温设定为50℃，边搅拌边减压浓缩直至液量成为12L左右。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤得到的残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物7的2-MeTHF溶液(18.9kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.065分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例4
化合物8：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对 甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式53]
在用氮置换的反应釜中，边用2-MeTHF(6.9kg)清洗保管容器边加入实施例3中得到的包含化合物7的2-MeTHF溶液(18.7kg)。在反应釜中加入5％Pd/C(1.74kg、50％含水物)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。搅拌50分钟后，确认没有内压的变动后，氮置换后进一步用氢加压至0.18MPaG，搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应容器内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.6kg)洗涤反应釜和过滤器后，将滤液和洗涤液作为保管溶液在保管容器中回收。将得到的滤液和洗涤液在外温40℃减压浓缩，直至液量成为6L左右。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物8的2-MeTHF溶液(14.0kg)。
通过HPLC分析的保留时间：2.538分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例5
化合物10：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]丙 酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合 成
[化学式54]
/>
在用氮置换的反应釜中，顺次加入实施例4中得到的包含化合物8的2-MeTHF溶液(13.9kg)、化合物9(2.31kg)、2-MeTHF(10.4kg)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边加入DIPEA(4.61kg)后，滴加T3P(1.6M2-MeTHF溶液,12.15kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌反应混合物1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为96.8％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边在反应混合物中加入5％碳酸钠水溶液(24.3kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。将有机层用5％硫酸氢钠一水合水溶液(32.4kg)洗涤2次后，用5％碳酸钠水溶液(32.4kg)洗涤。在得到的有机层中加入2-MeTHF(25.6kg)。将反应釜的外温设定为50℃，边搅拌边减压浓缩直至液量成为12L左右后，将残渣在保管容器中回收。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤反应釜的洗涤液，得到包含化合物10的溶液(19.0kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.004分钟(分析条件：方法1)
实施例6
化合物11：(叔丁基2-[[(2S)-2-[乙基-[(2S)-1-[(2S)-2-(甲基氨基)丙酰基]氮 杂环丁烷-2-羰基]氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式55]
在用氮置换的反应釜中，顺次加入实施例5中得到的包含化合物10的溶液(18.8kg)、2-MeTHF(7.0kg)。在反应釜中加入5％Pd/C(1.70kg、50％含水物)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。1小时40分钟后，确认没有内压的变动，氮置换后用氢加压至0.18MPaG，搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.3kg)洗涤反应釜和过滤器后，将滤液和洗涤液作为保管溶液回收。在外温40℃减压浓缩得到的滤液和洗涤液，直至液量成为7L左右。合并用甲苯(10.4kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物11的溶液(16.7kg)。
通过HPLC分析的保留时间：2.510分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例7
化合物13：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-(苄氧基羰基氨 基)-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯 基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式56]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例6中得到的包含化合物11的溶液(16.5kg)、2-MeTHF(2.12kg)。随后，向反应釜中在室温顺次加入将化合物12(2.52kg)溶解于2-MeTHF(8.1kg)的溶液、2-MeTHF(8.1kg)、乙腈(3.1kg)。在室温边搅拌边加入DIPEA(4.51kg)后，将反应釜的外温设定为25℃，顺次加入HATU(4.52kg)、2-MeTHF(0.3L)后，在25℃搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。在反应釜中加入N-甲基咪唑(0.65kg)，进一步边搅拌边加入5％碳酸钠水溶液(23.9kg)后搅拌1小时。随后，加入2.5％氨水溶液(23.9kg)，搅拌30分钟后，从反应釜排出水层。将得到的有机层用2.5％氨水溶液(31.9kg)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(31.9kg×2)、3％磷酸氢二钾水溶液(31.9kg)洗涤。在得到的有机层中加入2-MeTHF(25.6kg)。将反应釜的外温设定为50℃，边搅拌边减压浓缩直至液量成为12L左右。合并用丙酮(7.9kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物13的溶液(18.2kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.235分钟(HPLC分析条件：方法1)
化合物11和化合物12的缩合反应(实施例7的反应条件研究)
研究化合物11和化合物12的缩合反应中的溶剂。缩合反应通过HPLC分析追踪。收率通过经HPLC分析求得的面积％(面积％)算出。
[化学式57]
实施例7-1
化合物13：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-(苄氧基羰基氨 基)-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯 基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成(溶剂的研究)
在反应容器中加入实施例6中得到的包含化合物11(50.69mg(0.100mmol))的溶液(72.62mg)，在外温60℃减压浓缩干固。随后，在反应容器中加入化合物12(32.50mg(0.122mmol))，在室温加入2-MeTHF(0.35mL)。在室温边搅拌边加入DIPEA(58.3mg(0.451mmol))后，将反应容器的外温设定为25℃，加入HATU(58.37mg(0.154mmol))后，在25℃搅拌4小时。在反应容器中加入N-甲基咪唑(8.17mg(0.099mmol))，进一步边搅拌边加入5％碳酸钠水溶液(300μL)后搅拌2小时30分钟。随后，用棉塞滤去不溶物后，排出水层。在得到的有机层中加入2.5％氨水溶液(300μL)，搅拌5分钟后，排出水层。用2.5％氨水溶液(320μL)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(320μL×2)、3％磷酸氢二钾水溶液(320μL)洗涤得到的有机层。将得到的有机层在外温60℃减压浓缩干固。用HPLC分析得到的残渣。应用标准品的HPLC分析的结果是，得到的化合物13为56.77mg(75.1％收率)。
化合物13的LCMS(ESI)：保留时间：4.012分钟、m/z＝750[M+H]+(LCMS分析条件：方法1)
通过HPLC分析的保留时间：4.261分钟(HPLC分析条件：方法1)
替代上述的化合物13的合成法(溶剂的研究)中应用的2-MeTHF，应用4-甲基四氢吡喃、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、或苯甲醚作为溶剂的情形的结果示于下表。
[表4]
化合物13的制备
实施例编号 溶剂 收率(％)
实施例7-1 2-Me THF 75
实施例7-2 4-甲基四氢吡喃 63
实施例7-3 碳酸二甲酯 66
实施例7-4 乙酸乙酯 62
实施例7-5 苯甲醚 60
根据这些结果，显示除2-MeTHF之外，4-甲基四氢吡喃、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、或苯甲醚也是适于应用HATU的缩合反应的溶剂。显示除2-MeTHF之外，4-甲基四氢吡喃、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、或苯甲醚也是适于使化合物11和化合物12缩合制备化合物13的溶剂。特别地，显示2-MeTHF从目标物的收率的观点出发是适合的溶剂。
实施例8
化合物15：((2，3，4，5，6-五氟苯基)(2S)-4-甲基-2-[甲基(2-三甲基甲硅烷基乙 氧基羰基)氨基]戊酸酯)的合成
[化学式58]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入化合物14(3.0kg)、乙酸异丙酯(13.7kg)、和DMF(18.3kg)。在室温边搅拌边顺次加入将五氟苯酚(2.38kg)溶解于乙酸异丙酯(2.8kg)的溶液、乙酸异丙酯(0.6kg)。将反应釜的外温设定为0℃，在反应釜中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.48kg)。将反应釜的外温经1小时升温至25℃后，在外温25℃搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认未检测到原料的化合物14(反应转化率的计算式3)。将反应釜的外温设定为0℃，加入0.5M盐酸水溶液(19.4kg)。将反应釜的外温设定为25℃后搅拌10分钟，停止搅拌后，从反应釜排出水层。用0.5M盐酸水溶液(27.5kg)洗涤得到的有机层。在得到的有机层中加入5％碳酸钾水溶液(27.5kg×2)、随后加入DMF(2.8kg)。将反应混合物搅拌10分钟，停止搅拌后，从反应釜排出水层。用5％碳酸钾水溶液(27.5kg)、随后10％氯化钠水溶液(27.5kg)洗涤得到的有机层。加入乙酸异丙酯(27.6kg)后，在外温40℃减压浓缩直至液量成为8L左右。合并用丙酮(8.7kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物15的溶液(16.2kg)。
通过HPLC分析的保留时间：6.175分钟(HPLC分析条件：方法2)
实施例9
化合物16：(叔丁基2-[[(2S)-2-[乙基-[(2S)-1-[(2S)-2-[甲基-[(2S,3S)-3-甲 基-2-[[(2S)-4-甲基-2-[甲基(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基)氨基]戊酰基]氨基]戊酰 基]氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯) 的合成
[化学式59]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例8中得到的包含化合物15的溶液(7.4kg)、和实施例7中得到的包含化合物13的溶液(9.0kg)、乙酸异丙酯(4.0kg)、N-甲基吗啉(2.38kg)。在反应釜中，加入5％Pd/C(0.83kg、50％含水物)后，将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。1小时后，确认没有内压的变动后，用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.0kg×2)洗涤反应釜内和过滤器后，合并滤液和洗涤液，作为保管溶液(第一批次)得到。
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例8中得到的包含化合物15的溶液(7.4kg)、和实施例7中得到的包含化合物13的溶液(9.0kg)、乙酸异丙酯(4.0kg)、N-甲基吗啉(2.38kg)。在反应釜中，加入5％Pd/C(0.83kg、50％含水物)后，将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。1小时后，确认没有内压的变动后，用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.0kg×2)洗涤反应釜内和过滤器后，合并滤液和洗涤液，作为保管溶液(第二批次)得到。
在用氮置换的反应釜中加入前述的各自的保管溶液和2-MeTHF(1.8kg)，在外温40℃减压浓缩直至液量成为20L左右。将浓缩残渣加压过滤。用2-MeTHF(8.5kgx2)洗涤反应釜内和过滤器后，合并滤液和洗涤液，作为保管溶液在保管容器中回收。在用氮置换的反应釜中，加入上述的保管溶液和2-MeTHF(3.1kg)。将反应釜的外温设定为25℃，边搅拌边顺次加入5％碳酸钾水溶液(25.9kg)和4-二甲基氨基吡啶(0.96kg)。30分钟后停止搅拌，从反应釜排出水层。用5％硫酸氢钾水溶液(34.1kg×2)、5％碳酸钾水溶液(34.1kg)洗涤有机层2次。加入2-MeTHF(26.5kg)，在外温50℃减压浓缩直至液量成为12L左右。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤得到的残渣和反应釜内的洗涤液，得到包含化合物16的溶液(19.0kg)。
通过HPLC分析的保留时间：5.964分钟(HPLC分析条件：方法2)
实施例9-1(替代实施例9中应用的乙酸异丙酯、应用2-MeTHF的情形)化合物16(叔 丁基2-[[(2S)-2-[乙基-[(2S)-1-[(2S)-2-[甲基-[(2S,3S)-3-甲基-2-[[(2S)-4-甲基-2- [甲基(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基)氨基]戊酰基]氨基]戊酰基]氨基]丙酰基]氮杂环丁 烷-2-羰基]氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式60]
在反应容器中，加入实施例7中得到的包含化合物13的保管溶液(482.7mg)并减压浓缩，得到包含化合物13的残渣。在反应容器中，在室温顺次加入包含化合物15的残渣(91.2mg，81.2wt％)和2-MeTHF(1000μL)。在反应容器中，加入5％Pd/C(29.8mg、50％含水物)后将外温设定为25℃，通过氢气进行脱气置换并搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。过滤反应混合物，用2-MeTHF(400μL×2)洗涤残渣。将包含滤液的反应容器的外温设定为25℃，边搅拌边顺次加入5％碳酸钾水溶液(440μL)和4-二甲基氨基吡啶(16.6mg)。30分钟后停止搅拌，排出水层。用5％硫酸氢钾水溶液(440μL×2)、5％碳酸钾水溶液(440μL×2)洗涤有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物16的残渣(113.3mg)。用乙腈稀释取得的残渣，进行LCMS分析(方法2：化合物16的保留时间；5.573分钟、m/z＝910[M+Na]+)。使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：58％)。
实施例9-2(替代实施例9中应用的乙酸异丙酯、应用碳酸二甲酯的情形)
化合物16(叔丁基2-[[(2S)-2-[乙基-[(2S)-1-[(2S)-2-[甲基-[(2S,3S)-3-甲 基-2-[[(2S)-4-甲基-2-[甲基(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基)氨基]戊酰基]氨基]戊酰 基]氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯) 的合成
在反应容器中，加入实施例7中得到的包含化合物13的保管溶液(477.4mg)并减压浓缩，得到包含化合物13的残渣。在反应容器中，在室温顺次加入包含化合物15的残渣(92.0mg，81.2wt％)和碳酸二甲酯(1000μL)。在反应容器中，加入5％Pd/C(29.7mg、50％含水物)后将外温设定为25℃，通过氢气进行脱气置换并搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将反应混合物过滤，用碳酸二甲酯(400μL×2)洗涤残渣。将包含滤液的反应容器的外温设定为25℃，边搅拌边顺次加入5％碳酸钾水溶液(880μL)和4-二甲基氨基吡啶(17.1mg)。30分钟后停止搅拌，排出水层。用5％硫酸氢钾水溶液(880μL×2)、5％碳酸钾水溶液(880μL×2)洗涤有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物16的残渣(107.3mg)。用乙腈稀释取得的残渣，进行LCMS分析(方法2：化合物16的保留时间；5.579分钟、m/z＝910[M+Na]+)。将得到的残渣和3，5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：62％)。
实施例9-3(替代实施例9中应用的乙酸异丙酯、应用苯甲醚的情形)
替代化合物16的上述的合成法中应用的2-MeTHF、应用碳酸二甲酯、苯甲醚作为溶剂的情形的结果示于下表。
[表5]
化合物16的制备
实施例编号 溶剂 收率(％)
实施例9-1 2-MeTHF 58
实施例9-2 碳酸二甲酯 62
实施例9-3 苯甲醚 78
实施例10
化合物17：(叔丁基2-[[(2S)-2-[乙基-[(2S)-1-[(2S)-2-[甲基-[(2S,3S)-3-甲 基-2-[[(2S)-4-甲基-2-(甲基氨基)戊酰基]氨基]戊酰基]氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰 基]氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式61]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例9中得到的包含化合物16的溶液(18.8kg)、2-MeTHF(5.8kg)。将反应釜的外温设定为47℃，经1小时加入四丁基氟化铵(1MTHF溶液、17.6kg)。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认未检测到原料的化合物16(反应转化率的计算式1)。搅拌停止后，将反应混合物分割为各一半。在分割的反应混合物中加入乙酸异丙酯(9.1kg)，将反应釜的外温设定为25℃，边搅拌边用5％碳酸钾水溶液(10.3kgx3)洗涤有机层。将得到的有机层在保管溶液中保管。分割的另一个反应混合物也进行同样的操作，合并得到的有机层，减压浓缩直至液量成为12L左右。合并用2-MeTHF(8.5kg)洗涤得到的残渣和反应釜内的洗涤液，得到包含化合物17的溶液(12.6kg)。
通过HPLC分析的保留时间：3.057分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例11
化合物19：(叔丁基(3S)-3-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代- 丁酸酯)的合成
[化学式62]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入化合物18(4.78kg)、2-MeTHF(23.8kg)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌反应混合物边顺次加入DIPEA(3.22kg)、二甲胺-THF溶液(2M、THF溶液、5.49kg)并搅拌30分钟。加入T3P(50％w/w 2-MeTHF溶液、8.64kg)后，将反应釜的外温设定为25℃，搅拌6小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法3)，通过HPLC分析确认反应转化率为96.2％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为10℃，在反应混合物中加入10％柠檬酸一水合物水溶液(28.7kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。用10％柠檬酸一水合物水溶液(28.7kg×2)和5％碳酸钠水溶液(28.7kgx3)洗涤得到的有机层。在得到的有机层中加入2-MeTHF(26.0kg)，在外温60℃减压浓缩直至液量成为7L左右。合并用2-MeTHF(6.8kg×2)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物19的溶液(19.8kg)。
通过HPLC分析的保留时间：3.510分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例12
化合物20：(叔丁基(3S)-4-(二甲基氨基)-3-(甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式63]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入5％Pd/C(1.31kg、50％含水物)、实施例11中得到的包含化合物19的溶液(19.8kg)、2-MeTHF(6.0kg)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。搅拌2小时后，确认没有内压的变动后，将反应釜用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1.5小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为100％(未检测到原料)(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(11.3kgx3)洗涤反应釜内和过滤器后，将滤液和洗涤液作为保管溶液在保管容器中回收。在氮置换的反应釜中，加入前述保管溶液和2-MeTHF(0.4kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩直至液量成为4L左右。合并用2-MeTHF(6.8kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物20的溶液(10.4kg)。
通过HPLC分析的保留时间：1.560分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例13
化合物22：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-2-环戊基-乙酰 基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式64]
加入实施例12中得到的包含化合物20的溶液(10.3kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩直至液量成为10L左右。在室温加入化合物21(61w/w％MeTHF溶液、4.97kg)、2-MeTHF(1.0L)、乙腈(2.8kg)。将外温冷却至10℃，顺次加入DIPEA(4.93kg)、HATU(4.95kg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌4小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.3％(反应转化率的计算式1)。在反应釜中顺次加入CPME(4.0kg)、5％碳酸钾水溶液(3.5kg)、N-甲基咪唑(712g)，搅拌30分钟。接着，加入2.5％氨水溶液(14.1kg)和2-MeTHF(3.9kg)并搅拌10分钟后，排出水层。用2.5％氨水溶液(17.6kg)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(17.6kgx3)、5％碳酸钾水溶液(17.6kg)洗涤得到的有机层。在外温40℃边搅拌边减压浓缩得到的有机层，直至液量成为9L左右。合并加入用2-MeTHF(13.6kg)洗涤的洗涤液，得到包含化合物22的溶液(21.6kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.356分钟(HPLC分析条件：方法3)
化合物20和化合物21的缩合反应(实施例13的反应条件研究)
研究化合物20和化合物21的缩合反应中的溶剂。缩合反应通过HPLC分析追踪。收率通过经HPLC分析求出的面积％(面积％)、和qNMR的测定值算出。
实施例13-1(替代实施例13中应用的2-MeTHF和乙腈、应用苯甲醚的情形)
化合物22(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-2-环戊基-乙酰 基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式65]
在反应容器中顺次加入实施例12中得到的包含化合物20的溶液(590.9mg)、化合物21(61w/w％2-MeTHF溶液、252.7mg)，减压浓缩，得到包含化合物20和21的残渣。在室温向反应容器中加入苯甲醚(800μL)，使残渣溶解。将外温冷却至10℃，在反应混合物中顺次加入DIPEA(334μL)、HATU(248.2mg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌5小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为97.0％(反应转化率的计算式1)。将外温设定为10℃，在反应容器中顺次加入N-甲基咪唑(34.6μL)、5％碳酸钾水溶液(200μL)，将外温设定为25℃并搅拌30分钟。接着，加入2.5％氨水溶液(800μL)和苯甲醚(260μL)并搅拌10分钟后，排出水层。用2.5％氨水溶液(1000μL)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(1000μL×3)洗涤得到的有机层。在得到的有机层中加入溶剂(苯甲醚(260μL))，用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(1000μL×1)、5％碳酸钾水溶液(1000μL×2)洗涤。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物22(175.7mg、收率：82％)的残渣。
LCMS(ESI)：保留时间：4.269分钟、m/z＝526[M+Na]+(LCMS分析条件方法3)
收率：82％(使得到的残渣和3，5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
替代实施例13-1的化合物22的合成法(溶剂的研究)中应用的苯甲醚、应用碳酸二甲酯、乙酸乙酯、或2-MeTHF作为溶剂的情形的结果示于下表。
[表6]
化合物22的制备
实施例编号 溶剂 收率(％)
实施例13-1 苯甲醚 82
实施例13-2 碳酸二甲酯 67
实施例13-3 乙酸乙酯 81
实施例13-4 2-Me THF 64
根据这些结果，显示替代乙腈，苯甲醚、碳酸二甲酯、乙酸乙酯和2-MeTHF是化合物22的制备中适合的溶剂。特别地，显示应用苯甲醚或乙酸乙酯作为溶剂时，从目标物的收率的观点出发是适合的。
实施例14
化合物23：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-环戊基-2-(甲基氨基)乙酰基]-甲基-氨 基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式66]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入5％Pd/C(1.26kg、50％含水物)、实施例13中得到的包含化合物22的溶液(21.0kg)、2-MeTHF(5.1kg)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应容器的内压成为0.18MPaG。搅拌40分钟后，确认没有内压的变动后，将反应釜用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析反应确认转化率为100％(未检测到原料)(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.9kgx4、5.4kg)洗涤反应釜内和过滤器，将滤液和洗涤液作为保管溶液回收。在外温60℃边搅拌边减压浓缩得到的滤液和洗涤液，直至反应混合物的液量成为6L左右。合并用2-MeTHF(6.8kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物23的溶液(11.8kg)。
通过HPLC分析的保留时间：2.297分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例15
化合物25：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-环戊基-2-[甲基-[1-[(2,2,2-三氟乙酰基) 氨基]环戊烷羰基]氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式67]
在用氮置换的反应釜中，在室温加入化合物24(3.76kg)、2-MeTHF(13.0kg)。将反应釜的外温设定为10℃，顺次加入DIPEA(5.39kg)、实施例14中得到的包含化合物23的溶液(11.7kg)、T3P(50％2-MeTHF溶液、14.1kg)、和DMAP(2.04kg)。将反应釜的外温设定为50℃，搅拌4小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.0％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为10℃，加入5％碳酸钠水溶液(25.3kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌30分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。接着，将反应釜的外温设定为15℃，加入5％硫酸氢钠一水合物水溶液(25.3kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(25.3kg)、5％碳酸钠水溶液(25.3kg)洗涤得到的有机层。加入2-MeTHF(26.0kg)，在外温60℃减压浓缩直至液量成为10L左右。合并用2-MeTHF(4.5kg)和MeOH(2.1kg)的混合溶剂洗涤残渣、反应釜的洗涤液，以及用2-MeTHF(6.8kg)洗涤反应釜的洗涤液，得到包含化合物25的溶液(22.6kg)。
通过HPLC分析的保留时间：6.166分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例16
化合物26：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[(1-氨基环戊烷羰基)-甲基-氨基]-2-环戊 基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式68]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例15中得到的包含化合物25的溶液(22.4kg)、2-MeTHF(0.76kg)。将反应釜的外温设定为-20℃，边搅拌边加入LiBH4(10w/w％THF溶液、3.67kg)后，搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法4)，通过HPLC分析确认反应转化率为100％(未检测到原料)(反应转化率的计算式1)。在反应釜中在外温-20～-30℃经3小时滴加2,2,2-三氟乙醇(16.5kg)。接着，将反应釜的外温经1小时升温至0℃后，在外温0℃进一步搅拌1小时。在反应釜中加入20％氯化铵水溶液(14.3kg)，搅拌13分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。将反应釜的外温设定为10℃，加入三氟乙酸(1.88kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌1小时。合并用2-MeTHF(6.7kg)洗涤得到的反应混合物和反应釜的洗涤液，在保管容器中回收。在室温向用氮置换的另一反应釜中加入2M氢氧化钠水溶液(61.9kg)，将反应釜的外温设定为10℃。与之相对，在上述的在保管容器中经70分钟滴加回收的反应混合物后，加入2-MeTHF(0.6kg)，将反应釜的外温设定为25℃。搅拌10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。用2M氢氧化钠水溶液(47.6kgx2)、10％磷酸氢二钾水溶液(23.8kg)洗涤得到的有机层。在外温40℃减压浓缩得到的有机层，直至液量成为40L左右。在得到的浓缩液中加入2-MeTHF(30.5kg)后，用2.5％硫酸氢钠一水合物水溶液(34kg)、普通水(34kg)洗涤有机层，将目标物在水层中萃取。用2-MeTHF(48.9kg)和庚烷(3.9kg)的混合液洗涤合并的水层2次后，加入2-MeTHF(53.8kg)，边搅拌边加入15％碳酸钠水溶液(15.2kg)。排出水层后，用5％磷酸氢二钾水溶液(31.5kg)洗涤有机层。在得到的有机层中加入2-MeTHF(25.9kg)后，在外温40℃减压浓缩直至反应混合物的液量成为8L左右。在得到的残渣中加入2-MeTHF(9.8kg)，在外温40℃减压浓缩直至反应混合物的液量成为8L左右。合并用乙腈(6.2kgx2)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物26的溶液(19.3kg)。
通过HPLC分析的保留时间：2.725分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例15-1
化合物25a：叔丁基N2-{(2S)-2-[(1-{[(苄氧基)羰基]氨基}环戊烷-1-羰基)(甲 基)氨基]-2-环戊基乙酰基}-N,N,N2-三甲基-L-α-天冬酰胺的合成
[化学式69]
在反应容器中，在室温顺次加入化合物23HCl盐(1.00g)、乙腈(10.01mL)。随后，在室温边搅拌边加入DIPEA(2.72mL)后，加入化合物24a(1.74g)、HATU(2.75g)，在50℃搅拌6小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.7％(反应转化率的计算式1)。在反应容器中，加入N-甲基咪唑(0.78mL)、城市水(3.99mL)后搅拌1小时。随后，冷却至25℃后搅拌14小时。过滤反应混合物，用乙腈/水混合液(8：3(v/v)，5.33mL)洗涤残渣。减压干燥过滤后的固体，得到化合物25a(1.27g)。
用乙腈稀释取得的固体，进行HPLC分析(方法6，化合物25a的保留时间；6.712分钟)
LCMS(ESI)：保留时间：6.696分钟、m/z＝637.29[M+Na]+(LCMS分析条件方法6)
收率：84％
实施例16-1
化合物26：叔丁基N2-{(2S)-2-[(1-氨基环戊烷-1-羰基)(甲基)氨基]-2-环戊基 乙酰基}-N,N,N2-三甲基-L-α-天冬酰胺的合成
[化学式70]
在反应容器中，在室温加入5％Pd/C(0.85g、50％含水物)和THF(14.04mL)后将外温设定为25℃。随后，在反应容器中在室温加入溶解于THF(42.12mL)的化合物25a(3.51g)后，将外温设定为25℃，通过氢气进行脱气置换并搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。过滤反应混合物，用THF(14.04mL×2)洗涤残渣。将得到的溶液减压浓缩，得到包含化合物26的残渣(7.37g)。使得到的残渣和得到的残渣与1,3,5-三甲氧基苯溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：93％)。
LCMS(ESI)：保留时间：2.421分钟、m/z＝503.19[M+Na]+(LCMS分析条件方法3)
实施例17
化合物28：(苄基(2S)-2-[[1-[[(1S)-2-[[(1S)-3-叔丁氧基-1-(二甲基氨基甲酰 基)-3-氧代-丙基]-甲基-氨基]-1-环戊基-2-氧代-乙基]-甲基-氨基甲酰基]环戊基]氨基 甲酰基]吡咯烷-1-甲酸酯)的合成
[化学式71]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入化合物27(2.65kg)、乙腈(2.9kg)。将反应釜的外温设定为10℃，顺次加入实施例16中得到的包含化合物26的溶液(19.1kg)、DIPEA(3.17kg)、和2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(3.36kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.3％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为10℃，顺次加入CPME(34.1kg)、5％碳酸钠水溶液(23.6kg)、N-甲基咪唑(0.67kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌40分钟后，从反应釜排出水层。将反应釜的外温设定为10℃，加入5％硫酸氢钠一水合物水溶液(23.6kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，从反应釜排出水层。用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(23.6kg×2)、5％碳酸钠水溶液(23.6kgx2)洗涤得到的有机层后，加入2-MeTHF(26.0kg)。在外温40℃边搅拌边减压浓缩得到的有机层，直至液量成为12L左右。对得到的残渣加入THF(19.7kg)后，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为12L左右。将反应釜的外温设定为20℃后，在反应釜中加入CPME(9.0kg)。在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为12L左右。在反应釜中加入CPME(10.0kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为12L左右。搅拌停止后，在反应釜中加入THF(14.1kg)。合并用THF(5.2kg)洗涤得到的残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物28的溶液(28.8kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.189分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例17-1(替代实施例17的合成法中应用的乙腈、应用2-MeTHF的情形)
化合物28：(苄基(2S)-2-[[1-[[(1S)-2-[[(1S)-3-叔丁氧基-1-(二甲基氨基甲酰 基)-3-氧代-丙基]-甲基-氨基]-1-环戊基-2-氧代-乙基]-甲基-氨基甲酰基]环戊基]氨基 甲酰基]吡咯烷-1-甲酸酯)的合成
[化学式72]
/>
在反应容器中加入包含化合物26的保管溶液(1.29g)，在外温40度减压浓缩干固。随后，在反应容器中加入2-MeTHF(0.91mL)、化合物27(126.90mg)。在室温边搅拌边加入DIPEA(0.37mL)后，加入HATU(338.30mg)，在室温搅拌3小时。在反应容器中加入2-MeTHF(1.84mL)、5％碳酸钠水溶液(1.09mL)，进一步加入N-甲基咪唑(30.30μL)后搅拌30分钟。排出水层后，用2.5％氨水溶液(1.09mL)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(1.09mL×2)、5％碳酸钠水溶液(1.09mL×2)、2.5％氨水溶液(1.09mL×3)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(1.09mL×2)、5％碳酸钠水溶液(1.09mL×2)洗涤得到的有机层。在外温40℃减压浓缩干固得到的有机层，得到包含化合物28的残渣(0.19g、收率50.9％)。
LCMS(ESI)：保留时间：4.178分钟、m/z＝735[M+Na]+(LCMS分析条件方法3)
收率：50.9％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例18
化合物29：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-环戊基-2-[甲基-[1-[[(2S)-吡咯烷-2-羰 基]氨基]环戊烷羰基]氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合 成
[化学式73]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入5％Pd/C(1.16kg、50％含水物)、实施例17中得到的包含化合物28的溶液(27.4kg)、THF(0.4kg)。将反应釜的外温设定为25℃，用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。2小时30分钟后，确认没有内压的变动后，氮置换后用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(10.0kgx3)洗涤反应釜和过滤器。在外温40℃边搅拌边减压浓缩得到的滤液和洗涤液，直至液量成为9L左右。在得到的残渣中加入2-MeTHF(6.9kg)，再度在外温40℃减压浓缩，直至反应混合物的液量成为9L左右。再度在得到的残渣中加入2-MeTHF(4.3kg)，在外温40℃减压浓缩，直至反应混合物的液量成为9L左右，得到包含化合物29的反应混合物的浓缩液。
通过HPLC分析的保留时间：2.846分钟(HPLC分析条件：方法3)实施例18-1(替代实 施例18的合成法中应用的THF/2-MeTHF、应用2-MeTHF的情形)
化合物29：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-环戊基-2-[甲基-[1-[[(2S)-吡咯烷-2-羰 基]氨基]环戊烷羰基]氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合 成
[化学式74]
在反应容器中加入实施例17中得到的包含化合物28(121.49mg)的溶液(1014.92mg)，在外温60℃减压浓缩干固。随后，在用氮置换的反应容器中，在室温顺次加入2-MeTHF(2081mg)、5％Pd/C(25.89mg、50％含水物)。将反应容器的外温设定为25℃，用氢加压直至反应容器的内压成为0.18MPaG。7小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应容器内后，将反应混合物减压过滤。用2-MeTHF(1041mgx3)洗涤反应容器与桐山漏斗和滤器。用HPLC分析得到的溶液。应用标准品的HPLC分析的结果是，得到的化合物29为91.00mg(92.3％收率)。
化合物29的LCMS(ESI)：保留时间：2.826分钟、m/z＝578[M+H]+(LCMS分析条件：方法3)
实施例19
化合物31：(叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨 基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基- 氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯)的合成
[化学式75]
在加入了实施例18中得到的包含化合物29的反应混合物的浓缩液的、用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入2-MeTHF(5.0kg)、化合物30(3.08kg)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边顺次加入DIPEA(2.44kg)、T3P(50wt％2-MeTHF溶液(6.56kg))、2-MeTHF(0.4kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.3％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为15℃，边搅拌边加入5％碳酸钾水溶液(15.9kg)、N-甲基咪唑(352.4g)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌3小时30分钟后，从反应釜排出水层。将反应釜的外温设定为20℃，加入10％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.9kg)。将反应釜的外温设定为25℃。搅拌15分钟后，从反应釜排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.9kg)洗涤得到的有机层后，在得到的有机层中在外温25℃顺次加入乙腈(4.5kg)、MTBE(4.4kg)、庚烷(6.2kg)、和2.5％碳酸钾水溶液(14.1kg)。搅拌10分钟后，停止搅拌后，从反应釜排出水层。在得到的有机层中加入2.5％碳酸钾水溶液(21.3kg)、乙腈(6.6kg)、和2-MeTHF(2.1kg)并搅拌10分钟，停止搅拌后，从反应釜排出水层。在得到的有机层中加入2.5％碳酸钾水溶液(21.3kg)、和乙腈(6.6kg)并搅拌10分钟，停止搅拌后，从反应釜排出水层。在得到的有机层中追加2-MeTHF(26.0kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至反应混合物的液量成为9L左右。将在得到的残渣中加入乙酸异丙酯(15.1kg)、减压浓缩直至反应混合物的液量成为9L左右的操作重复2次。合并用乙酸异丙酯(7.0kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物31的溶液(16.5kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.978分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例20
化合物32：((3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3, 5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环 戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸)的合成
[化学式76]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例19中得到的包含化合物31的溶液(16.3kg)、乙酸异丙酯(5.7kg)、六甲基二硅氮烷(1.69kg)。将反应釜的外温设定为10℃，边搅拌边加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(1.87kg)。边将外温保持在20℃至30℃，边搅拌反应混合物1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为0℃，在反应釜中顺次加入2-MeTHF(17.6kg)、5％磷酸氢二钾水溶液(41.1kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌反应混合物10分钟后，停止搅拌，从反应釜排出水层。接着，用5％磷酸二氢钠水溶液(41.1kg)洗涤有机层。在得到的有机层中，边搅拌边加入DIPEA(2.39kg)和2-MeTHF(26.0kg)后，在外温30～33℃减压浓缩，直至液量成为8L左右。合并用2-MeTHF(6.8kgx2)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，得到包含化合物32的溶液(14.7kg)。
通过HPLC分析的保留时间：4.220分钟(HPLC分析条件：方法3)实施例20-1(替代实 施例20的合成法中应用的乙酸异丙酯、应用2-MeTHF的情形)
化合物32：((3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3, 5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环 戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸)的合成
[化学式77]
在反应容器中，加入实施例19中得到的包含化合物31(93.45mg)的溶液(401.94mg)，在外温60℃减压浓缩干固。在室温顺次加入2-MeTHF(402mg)、六甲基二硅氮烷(38.6mg)。将反应容器的外温设定为0℃，边搅拌边加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(43.4mg)。将反应容器的外温设定为25℃，搅拌反应混合物1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将反应容器的外温设定为0℃，在反应容器中顺次加入2-MeTHF(402mg)、5％磷酸氢二钾水溶液(0.93mL)。将反应容器的外温设定为室温，搅拌反应混合物10分钟后，停止搅拌，从反应容器排出水层。接着，用5％磷酸二氢钠水溶液(0.93mL)洗涤有机层。在得到的有机层中，边搅拌边加入DIPEA(54.4mg)。用HPLC分析得到的溶液。应用标准品的HPLC分析的结果是，得到的化合物32是81.01mg(92.0％收率)。
化合物32的LCMS(ESI)：保留时间：4.132分钟、m/z＝921[M+H]+(LCMS分析条件：方法3)
实施例21
化合物33：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2- [[(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲 基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲 基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基- 戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式78]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例10中得到的包含化合物17的溶液(11.9kg)、实施例20中得到的包含化合物32的溶液(12.84kg)、和2-MeTHF(3.1kg)。将反应釜的外温设定为10℃，在反应混合物中加入DMF(6.4kg)、DIPEA(1.6kg)、和HATU(2.78kg)。边将外温保持在20℃至30℃，边搅拌3小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式1)。在外温10℃加入2.5％氨水溶液(19.9kg)后，将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟。停止搅拌，从反应釜排出水层后，向得到的有机层在外温20℃加入10％硫酸氢钠一水合物水溶液(19.9kg)后，将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟。停止搅拌，从反应釜排出水层后，用5％碳酸钠水溶液(19.9kg)洗涤得到的有机层。在外温40℃边搅拌边减压浓缩得到的有机层，直至液量成为10L左右。将在反应混合物中加入2-MeTHF(17.0kg)、在外温40℃边搅拌边将减压浓缩直至液量成为10L左右的操作进行2次。合并用2-MeTHF(6.8kg)洗涤残渣和反应釜的洗涤液，作为包含化合物33的溶液(23.9kg)在保管容器中回收。
通过HPLC分析的保留时间：10.272分钟(HPLC分析条件：方法4)
化合物17和化合物32的缩合反应(实施例21的反应条件研究)
研究化合物17和化合物32的缩合反应中的溶剂。缩合反应通过HPLC分析追踪。收率通过经HPLC分析求出的面积％(面积％)、和qNMR的测定值算出。
实施例21-1(替代实施例21的合成法中应用的2-MeTHF和DMF、应用2-MeTHF和乙腈的情形)
化合物33：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2- [[(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲 基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲 基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基- 戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯)的合成
[化学式79]
在烧瓶中在室温顺次加入实施例10中得到的包含化合物17的溶液(1017.1mg)、实施例20中得到的包含化合物32的溶液(1133.0mg)、和2-MeTHF(313.7μL)。将外温冷却至10℃，在反应混合物中加入乙腈(575μL)、DIPEA(266μL)、和HATU(238.0mg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌3小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.8％(反应转化率的计算式1)。将外温设定为10℃，加入2.5％氨水溶液(1700μL)后，将外温设定为25℃并搅拌10分钟，排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(1700μL)、5％碳酸钠水溶液(1700μL)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物33的残渣(622.6mg)。
LCMS(ESI)：保留时间：10.35分钟、m/z＝1669[M+Na]+(LCMS分析条件方法4)
收率：83％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例21-2(替代实施例21的合成法中应用的2-MeTHF和DMF、应用2-MeTHF的情形)
化合物33：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2- [[(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲 基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲 基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基- 戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯)的合成
在烧瓶中，在室温顺次加入实施例10中得到的包含化合物17的溶液(4062.5mg)、实施例20中得到的包含化合物32的溶液(4534.0mg)、和2-MeTHF(1254μL)，得到包含化合物17和化合物31的溶液。在反应容器中加入包含化合物17和化合物31的溶液(969.5mg)，在外温40℃减压浓缩，得到包含化合物17和31的残渣。在反应容器中在室温加入2-MeTHF(1140μL)，使残渣溶解。将外温冷却至10℃，在反应混合物中加入DIPEA(106μL)、和HATU(94.9mg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌3小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.8％(反应转化率的计算式1)。将外温设定为10℃，加入2.5％氨水溶液(680μL)后，将外温设定为25℃并搅拌10分钟，排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(680μL)、5％碳酸钠水溶液(680μL)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物33的残渣(262.3mg)。
LCMS(ESI)：保留时间：10.49分钟、m/z＝1669[M+Na]+(LCMS分析条件方法4)
收率：85％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例21-3(替代实施例21的合成法中应用的2-MeTHF和DMF、应用苯甲醚的情形)
化合物33：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2- [[(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲 基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲 基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基- 戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯)的合成
在烧瓶中，在室温顺次加入实施例10中得到的包含化合物17的溶液(4062.5mg)、实施例20中得到的包含化合物32的溶液(4534.0mg)、和2-MeTHF(1254μL)，得到包含化合物17和化合物32的溶液。在反应容器中加入包含化合物17和化合物32的溶液(969.8mg)，在外温40℃减压浓缩，得到包含化合物17和32的残渣。在反应容器中在室温加入苯甲醚(1140μL)，使残渣溶解。将外温冷却至10℃，在反应混合物中加入DIPEA(106μL)、和HATU(97.7mg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌3小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％(反应转化率的计算式1)。将外温设定为10℃，加入2.5％氨水溶液(680μL)后，将外温设定为25℃并搅拌10分钟。在反应容器中加入苯甲醚(570μL)和2.5％氨水溶液(340μL)，搅拌10分钟，排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(920μL)、5％碳酸钠水溶液(920μL)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物33的残渣(207.3mg)。
LCMS(ESI)：保留时间：10.38分钟、m/z＝1669[M+Na]+(LCMS分析条件方法4)
收率：68％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例21-4(替代实施例21的合成法中应用的2-MeTHF和DMF、应用碳酸二甲酯的情形)
化合物33：(叔丁基2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2- [[(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲 基)苯基]丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲 基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基- 戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯)的合成
在烧瓶中，在室温顺次加入实施例10中得到的包含化合物17的溶液(4062.5mg)、实施例20中得到的包含化合物32的溶液(4534.0mg)、和2-MeTHF(1254μL)，得到包含化合物17和化合物32的溶液。在反应容器中加入包含化合物17和化合物32的溶液(968.4mg)，在外温40℃减压浓缩，得到包含化合物17和32的残渣。在反应容器中在室温加入碳酸二甲酯(1140μL)，使残渣溶解。将外温冷却至10℃，在反应混合物中加入DIPEA(106μL)、和HATU(95.2mg)后，将外温升温至25℃。将反应混合物在25℃搅拌3小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％(反应转化率的计算式1)。将外温设定为10℃，加入2.5％氨水溶液(680μL)后，将外温设定为25℃并搅拌10分钟。在反应容器中加入碳酸二甲酯(1140μL)和2.5％氨水溶液(680μL)，搅拌10分钟，排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(1360μL)、5％碳酸钠水溶液(1360μL)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物33的残渣(264.6mg)。
LCMS(ESI)：保留时间：10.35分钟、m/z＝1669[M+Na]+(LCMS分析条件方法4)
收率：84％(将得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例21-5和实施例21-6
除了替代2-MeTHF/乙腈应用乙酸乙酯(实施例21-5)、或乙酸异丙酯(实施例21-6)外，以与实施例21-1同样的条件合成化合物33。实施例21-5中以76％的收率、实施例21-6中以75％的收率得到化合物33。
实施例21-1～21-6的结果示于下表。
[表7]
化合物33的制备
实施例编号 溶剂 收率(％)
实施例21-1 2-Me THF/乙腈 83
实施例21-2 2-Me THF 85
实施例21-3 苯甲醚 68
实施例21-4 碳酸二甲酯 84
实施例21-5 乙酸乙酯 76
实施例21-6 乙酸异丙酯 75
根据这些结果发现，替代实施例21中使用的2-MeTHF与DMF的混合溶剂，应用2-MeTHF与乙腈的混合溶剂、和2-MeTHF、苯甲醚、碳酸二甲酯、乙酸乙酯、或乙酸异丙酯的情形也可高收率制备化合物33。
实施例22
化合物34：(2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S，3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[2S)-2-[[1-[[(2S-1)-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-[3，5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁 酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4- (二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲 基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙醚基]-甲基-氨基]乙 酸)的合成
[化学式80]
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入实施例21中得到的包含化合物33的溶液(23.7kg)、2-MeTHF(32.0kg)、六甲基二硅氮烷(3.46kg)。将反应釜的外温设定为0℃，边搅拌边加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基(3.99kg)。将外温保持在20℃至30℃，搅拌3小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％以上(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为0℃，在反应混合物中加入5％磷酸氢二钾水溶液(23.8kg)。将反应釜的外温设定为25℃，搅拌10分钟后，从反应釜排出水层。用包含柠檬酸一水合物(0.57kg)和磷酸氢二钾(0.88kg)的水溶液(23.3kgx4)洗涤得到的有机层后，进一步用5％碳酸钠水溶液(23.8kg)洗涤。在得到的有机层加入2-MeTHF(26.0kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为10L左右。在得到的残渣中追加THF(13.6kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为10L左右。随后，追加2-MeTHF(8.5kg)，在外温40℃边搅拌边减压浓缩，直至液量成为10L左右。合并在得到的残渣中加入THF(6.8kg)的溶液、和用THF(6.6kg)、2-MeTHF(7.1kg)洗涤反应釜的洗涤液，得到包含化合物34的溶液(29.0kg)。
通过HPLC分析的保留时间：9.215分钟(HPLC分析条件：方法4)
实施例23
化合物35：(2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-氨基-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁酰基]吡咯 烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨 基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]丙 酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸)的合成
[化学式81]
实施例23应用实施例22中得到的包含化合物34的溶液(14.5kg)，分二次实施下述操作。
在用氮置换的反应釜中，加入5％Pd/C(756.6g、50％含水物)后，加入THF(7.5kg)。将反应釜的外温设定为25℃。顺次加入实施例22中得到的包含化合物34的溶液(14.5kg)、THF(0.7kg)。将反应釜的外温设定为25℃，边搅拌边用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。2.5小时后，确认没有内压的变动后，将反应釜用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(4.9kgx2)洗涤反应釜内和过滤器后，合并滤液和洗涤液，得到包含化合物34的保管溶液(第一批次)。
在用氮置换的反应釜中，加入5％Pd/C(756.6g、50％含水物)后，加入THF(7.5kg)。将反应釜的外温设定为25℃。顺次加入实施例22中得到的包含化合物34的溶液(14.5kg)、THF(0.7kg)。将反应釜的外温设定为25℃，边搅拌边用氢加压直至反应釜的内压成为0.18MPaG。1小时后，确认没有内压的变动后，将反应釜用氢加压至0.18MPaG，进一步搅拌1小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.6％(反应转化率的计算式1)。用氮置换反应釜内后，将反应混合物加压过滤。用2-MeTHF(4.9kgx3)洗涤反应釜内和过滤器后，合并滤液、洗涤液和上述得到的第一批次的保管溶液，得到包含化合物34的保管溶液(60.5kg)。
在用氮置换的反应釜中，在室温顺次加入包含上述的化合物34的保管溶液(60.5kg)、2-MeTHF(0.4kg)。在外温40℃边搅拌边减压浓缩直至液量成为7.3L后，将外温设定为25℃。在得到的残渣中加入乙腈(20.3kg)、2-MeTHF(6.3kg)、和庚烷(35.4kg)，搅拌30分钟。停止搅拌后，将下层在保管容器中回收。在得到的下层的有机层中加入乙腈(52.7kg)和DIPEA(1.6kg)，得到包含化合物35的溶液(83.6kg)。
通过HPLC分析的保留时间：6.480分钟(HPLC分析条件：方法4)
实施例23-1(替代实施例23的合成法中应用的THF、应用2-MeTHF的情形)
化合物35：(2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-氨基-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]丁酰基]吡咯 烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨 基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]丙 酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸)的合成
[化学式82]
在反应容器中加入实施例22中得到的包含化合物34的溶液(2447.7mg)并减压浓缩，得到包含化合物34的残渣。在反应容器中，加入2-MeTHF(2040μL)、5％Pd/C(96.8mg、50％含水物)后，通过氢气进行脱气置换并搅拌4小时。在反应容器中，加入2-MeTHF(460μL)、5％Pd/C(47.3mg、50％含水物)后，通过氢气进行脱气置换并搅拌4小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.7％(反应转化率的计算式1)。将反应混合物过滤，用2-MeTHF(690μL×2)洗涤残渣。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物35的残渣(670.1mg)。用乙腈稀释取得的残渣，进行LCMS分析(LCMS分析条件：方法4：化合物35的保留时间；保留时间：6.94分钟、m/z＝1457[M+H]+)。使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：95％)。
实施例24
化合物1：((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的合成
[化学式83]
在用氮置换的反应釜中，加入乙腈(21.4kg)、HATU(3.86kg)，进一步加入乙腈(55.0kg)。将反应釜的外温设定为25℃，以0.3～0.4kg/分钟在反应混合物中滴加实施例23中得到的包含化合物35的溶液(82.8kg)。用乙腈(6.1kg)实施清洗，加入漂洗液，搅拌30分钟。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，通过HPLC分析确认反应转化率为99.9％(反应转化率的计算式1)。将反应釜的外温设定为30℃，边搅拌边减压浓缩直至液量成为27L左右。将反应釜的外温设定为25℃，在得到的残渣中加入乙酸乙酯(104.7kg)。在外温25℃边搅拌边加入2.5％氨水溶液(77.8kg)，搅拌85分钟。从反应釜排出水层后，在得到的有机层中在外温20℃边搅拌边加入5％硫酸氢钾一水合物水溶液(89.8kg)。在外温25℃搅拌12分钟。从反应釜排出水层后，在外温25℃用5％磷酸氢二钠水溶液(89.8kg)、5％氯化钠水溶液(89.8kg)、和0.5％氯化钠水溶液(89.8kgx2)洗涤得到的有机层。边搅拌得到的有机层边将反应釜的外温设定为40℃并减压浓缩直至液量成为19L左右。将得到的残渣加压过滤，用乙酸乙酯(17.4kg)洗涤反应釜和过滤器后，边用乙酸乙酯(17.4kg)清洗滤液和洗涤液边得到包含化合物1的溶液(63.1kg)。在包含上述化合物1的保管溶液(63.1kg)中，将加入丙酮(15.3kg)、减压浓缩直至液量成为8～12L左右的操作重复7次。将得到的残渣加压过滤，作为保管溶液回收。用丙酮(15.3kgx2)洗涤反应釜和过滤器后，加压过滤，合并洗涤液，作为包含化合物1的溶液(51.4kg)在保管容器中回收。
通过HPLC分析的保留时间：18.008分钟(HPLC分析条件：方法5)
化合物35的环化反应(实施例24的反应条件研究)
应用化合物35作为起始原料，对在向化合物1的环化反应中的缩合剂和溶剂进行研究。环化反应通过HPLC分析追踪。将苯甲酸甲酯作为内部标准物质应用，通过HPLC分析根据面积％比算出收率。
[化学式84]
/>
实施例24-1
化合物1：((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的合成(使用HATU作为缩合剂、使用乙 腈作为溶剂)
在反应容器中称量化合物35(10.44mg(7.17μmol))和内部标准物质(苯甲酸甲酯、3.60mg(26.44μmol))，用溶剂(乙腈、2mL(200v/w))溶解。在室温边搅拌边加入DIPEA(5.74μL(32.9μmol))。将反应容器的外温设定为25℃，加入缩合剂(HATU、10.39mg(27.3μmol))并搅拌30分钟。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，配制用于HPLC分析的溶液。应用苯甲酸甲酯作为内部标准物质的HPLC分析的结果是，收率为76％(HPLC分析条件：方法5)。
化合物1的LCMS(ESI)：保留时间：18.08分钟、m/z＝1439[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
化合物35的丙酰胺体的LCMS(ESI)：保留时间：13.39分钟、m/z＝1498[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
环状二聚体(c-二聚体)的LCMS(ESI)：保留时间：23.18分钟、m/z＝2898[M+Na]+(LCMS分析条件方法5)
环状三聚体(c-三聚体)的LCMS(ESI)：保留时间：25.74分钟、m/z＝2157[M+2H]2+(LCMS分析条件方法5)
应用各种缩合剂和溶剂进行化合物1的合成的结果示于表7。实验操作以使用HATU作为缩合剂、使用乙腈作为溶剂时(实施例24-1)为标准。表中的SM是化合物35和化合物35的丙酰胺体的残存量的合计(HPLC的面积％比)。此外，表中的TM是目标物(化合物1)，c-二聚体和c-三聚体分别是作为副产物的环状二聚体和环状三聚体，它们的生成量显示为HPLC测定中的面积％比(HPLC分析条件：方法5)。通过将苯甲酸甲酯用作内部标准物质的HPLC分析，算出收率。
[表8]
根据这些结果显示，考虑向目标物的转化率高、副产物的生成率低、以及环境负荷，作为溶剂，苯甲醚、碳酸二甲酯和2-MeTHF是优选的溶剂。显示缩合剂优选HATU、PyBOP和PyOxim。显示溶剂和缩合剂的组合优选苯甲醚与PyBOP、碳酸二甲酯与PyBOP、和2-甲基四氢呋喃与PyBOP的组合。
提高实施例24-15和实施例24-16的反应尺度，进行与化合物1的合成(使用PyBOP作为缩合剂，使用2-MeTHF或碳酸二甲酯作为溶剂)的实验同样的操作。
实施例24-39
化合物1：((3S,9S,12S,17S,20S,23S,27S,30S,36S)-30-环戊基-3-[2-[3,5-二 氟-4-(三氟甲基)苯基]乙基]-10-乙基-23-异丁基-N,N,7,17,18,24,28,31-八甲基-20- [(1S)-1-甲基丙基]-2,5,8,11,16,19,22,25,29,32,35-十一氧代-9-(对甲苯基甲基)螺 [1,4,7,10,15,18,21,24,28,31,34-十一氮杂三环[34.3.0.012,15]三十九烷-33,1'-环戊 烷]-27-甲酰胺)的合成
[化学式85]
加入实施例23中得到的包含化合物35(100.16mg(0.069mmol))的溶液(2152.63mg)，在外温40℃减压浓缩干固。在浓缩残渣中加入2-MeTHF(2150mg)和DIPEA(42.2mg)，得到包含化合物35的溶液。在用氮置换的反应容器中加入PyBOP(141.10mg)、2-MeTHF(2150mg)。将反应容器的外温设定为25℃，经4小时在反应混合物中滴加包含化合物35的溶液。用2-MeTHF(172mg)实施清洗，加入漂洗液，搅拌2小时。在外温25℃边搅拌边加入2.5％氨水溶液(2mL)，搅拌90分钟。将反应混合物减压过滤。用2-MeTHF(172mg)洗涤反应容器和桐山漏斗。排出水层后，在得到的有机层中在外温25℃边搅拌边加入5％硫酸氢钾一水合物水溶液(2mL)。在外温25℃搅拌4分钟。排出水层后，在外温25℃用5％磷酸氢二钠水溶液(2mL)、5％氯化钠水溶液(2mL)、和0.5％氯化钠水溶液(2mLx2)洗涤得到的有机层。用HPLC分析得到的有机层。应用标准品的HPLC分析的结果是，得到的化合物1为78.38mg(79.2％收率)。
通过HPLC分析的保留时间：17.992分钟(HPLC分析条件：方法5)
在上述的缩合剂中应用PyBOP的化合物1的合成法中，替代溶剂中应用的2-MeTHF、应用碳酸二甲酯作为溶剂的情形的结果示于下表。
[表9]
/>
实施例25
化合物1的结晶化：((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁 基)-18-环戊基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12, 16,19,33-八甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四 氢-2H,4H-螺[氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22, 25,28,31]十一氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的水合物晶体(C型晶 体)的合成
在用氮置换的放入包含化合物1的溶液的反应釜中，将反应釜的外温设定为40℃，过滤并加入纯化水(10.9kg)。在丙酮(59.2g)/水(61.2g)的混合液中，加入通过与实施例25-1同样的操作得到的、化合物1的粉碎晶体(10.2g)，将得到的悬浮液加入反应釜中。边用丙酮(59.2g)/水(61.2g)的混合液清洗放入悬浮液的容器边加入反应釜中后，搅拌2小时1分钟。加入过滤的纯化水(2.7kg)，搅拌7小时10分钟。进一步，在丙酮(59.2g)/水(61.2g)的混合液中，加入通过与实施例25-1同样的操作得到的化合物1的粉碎晶体(10.2g)，将得到的悬浮液加入反应釜中。边用丙酮(59.2g)/水(61.2g)的混合液清洗放入悬浮液的容器，边加入反应釜中，搅拌12小时40分钟。加入过滤的纯化水(2.7kg)，搅拌2小时。将反应釜的外温经1小时从40℃降温至25℃后，将反应混合物搅拌18小时44分钟。将反应混合物加压过滤，边用过滤的丙酮(7.5kg)和纯化水(7.5kg)的混合液洗涤反应釜内和过滤器，边洗涤得到的晶体。用过滤的纯化水(17.0kgx2)洗涤得到的晶体，将回收晶体的过滤装置减压，将过滤装置的外温设定为70℃，将晶体干燥17小时。进一步，使外温为室温～30℃，将晶体干燥27小时。从过滤器回收干燥粉末，得到白色的粉末(2.6kg)。
通过HPLC分析的保留时间：18.199分钟(HPLC分析条件：方法5)应用XRPD装置的粉末X线分析(测定方法4)的结果是，对于2θ值，观测到4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)为主要峰。图1显示分析结果。
实施例25-1：实施例25中使用的晶种的制备实施例
将无定形状态的化合物1(122.3mg)溶解于DMSO(0.612mL)，将该溶解液(0.015mL)在-20℃冷冻干燥2日。在得到的冷冻干燥物中加入水-乙腈混合液(3：1，0.015mL)，通过在室温振荡7日得到化合物1的水合物晶体(C型晶体)。
化合物1的结晶化的研究
实施例25-2
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的非溶剂化物晶体(F型)的合成
将用与实施例24同样的方法得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)紧密装入7mm×7mm×0.25mm铝样品容器，通过在以下的条件(粉末X线(XRPD)衍射测定的测定方法2、和热分析的测定方法2)进行XRD-DSC同时测定，测定结束后作为样品得到化合物1的非溶剂化物晶体(F型)。
应用XRPD装置的粉末X线分析(测定方法2)的结果是，对于2θ值，观测到5.370°、6.934°、8.940°、9.838°、10.771°、12.181°、13.525°、15.179°、16.202°、和17.554°(±0.2°)为主要峰。图2显示分析结果。
实施例25-3
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的DMSO-水合物晶体(A型和B型)的合 成
在化合物1的水合物晶体(C型晶体、104.3mg)中加入DMSO(0.52mL)，通过在室温以100rpm振荡搅拌17小时，作为粉末状晶体得到标题化合物的DMSO-水合物晶体(33.8mg)。过滤后即刻的粉末状晶体为DMSO-水合物晶体A型，过滤后在室温减压干燥8小时的粉末状晶体为DMSO-水合物晶体B型。
将化合物1的DMSO-水合物晶体(DMSO-水合物晶体A型、和DMSO-水合物晶体B型)分别供给粉末X线衍射测定(测定方法3)。结果示于以下。
对于DMSO-水合物晶体A型的2θ值，观测到8.006°、9.002°、9.943°、11.501°、13.067°、14.854°、16.320°、17.275°、19.261°、和20.324°(±0.2°)为主要峰。图3显示分析结果。
DMSO-水合物晶体B型的2θ值：观测到8.223°、9.594°、9.976°、11.879°、13.841°、14.572°、15.934°、16.350°、19.805°、和20.480°(±0.2°)为主要峰。图4显示分析结果。
热重/差热分析
将实施例25-3中得到的化合物1的DMSO-水合物晶体(DMSO-水合物晶体B型)供给热分析(测定方法3)。结果示于图5。
1H-NMR测定
将实施例25-3中得到的化合物1的DMSO-水合物晶体(DMSO-水合物晶体B型)供给1H-NMR测定。结果示于图6。
根据热重/差热分析中的重量变化、和1H-NMR测定中化合物1与DMSO峰的积分值面积比，确认DMSO-水合物晶体B型是相对于化合物1包含2.5当量的DMSO的DMSO-水合物晶体。
实施例25-4
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的水合物晶体(C型晶体)的合成
将无定形状态的化合物1(293.2mg)室温溶解于乙醇(0.586mL)。在该溶液中加入水(0.147mL)、和用与实施例25-1同样的方法得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的晶种，在室温搅拌30分钟。进一步加入水(0.147mL)，在室温搅拌2小时。进一步加入水(0.147mL)，在室温搅拌30分钟后，加入水(0.147mL)，在室温搅拌30分钟，过滤回收沉淀物，用水洗涤，通过减压干燥，作为粉末状晶体得到化合物1的水合物晶体(C型晶体、256.0mg)。
实施例26
化合物1的水合物晶体(C型晶体)的物理化学性质的测定
应用用与实施例25同样的方法得到的化合物1的水合物晶体(C型晶体)，进行粉末X线衍射测定、热重/差热分析、水分量的测定、和单晶体X线结构分析。
(1)粉末X线衍射测定
用以下的方法，实施实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的湿度变化粉末X线衍射测定。
测定装置：SmartLab System、D/Tex Ultra detector、水蒸气发生装置HUM-SL(Rigaku公司制)
对阴极：Cu
管电压：45kV
管电流：200mA
扫描范围：5～30°
扫描速度：0.7°/分钟
采样宽度：0.02°
湿度变化条件：
[表10]
设定温度(℃) 相对湿度(％) 保留时间(分钟)
35.0 75 120
35.0 70 120
35.0 60 120
35.0 50 120
35.0 40 120
35.0 30 120
35.0 20 120
35.0 10 120
35.0 0 120
确认在相对湿度75％至0％的环境下，2θ值的偏移落入实施例25中得到的水合物晶体(C型晶体)的2θ值±0.2°的范围。结果示于图7。
湿度75％的水合物晶体(C型晶体)的2θ值：在7.904°、8.277°、8.833°、9.937°、10.416°、11.711°、12.683°、13.533°、13.885°、15.887°、16.627°、17.799°(±0.2°)具有衍射峰。
湿度30％的水合物晶体(C型晶体)的2θ值：在7.892°、8.286°、8.839°、9.921°、10.424°、11.703°、12.710°、13.556°、13.903°、15.891°、16.664°、17.846°(±0.2°)具有衍射峰。
湿度0％的水合物晶体(C型晶体)的2θ值：在7.883°、8.306°、8.845°、9.923°、10.446°、11.702°、12.767°、13.546°、13.896°、15.875°、16.694°、17.935°(±0.2°)具有衍射峰。
(2)热重/差热分析
用热分析的测定方法4实施实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的热重/差热分析。结果示于图8。
(3)水分量的测定
用卡尔费休滴定法测定实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的水分量。将样本在实验室环境下适应后，应用CA-310(日东精工Analytech制)进行测定。测定的结果是，化合物1的水合物晶体(C型晶体)的水分量为6.50wt％。
(4)单晶体X线结构分析
用以下的方法，进行实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的单晶体X线结构分析。
测定装置：Rigaku R-AXIS RAPID-II，带有VariMax Cu diffractometer(Rigaku公司制)
对阴极：Cu
管电压：40kV
管电流：30mA
温度：-180℃
测定：用认为在结构分析中得到足够衍射斑点的策略、曝光时间进行测定。
结构分析：用直接法(SIR2004、CrystalStructure、Rigaku)进行初始结构确定，用全矩阵最小二乘法(SHELXL-2017/1、APEX3、Bruker)进行结构细化。所有非氢原子用各向异性温度因子细化。水分子的氢原子应用约束(restrain)置于适当位置，用结合的氧原子的1.5倍大的各向同性温度因子细化。其它氢原子应用骑乘模型(riding model)置于适当位置，作为结合的非氢原子的1.2倍大的各向同性温度因子。
结果示于图9。
根据粉末X线衍射测定、热重/差热分析、水分量的测定、和单晶体X线结构分析的结果，确认实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)在晶体结构中具有水分子，正是水合物晶体。
用以下的方法，实施实施例26中配制的化合物1的水合物晶体(C型晶体)的动态水蒸气吸附测定。结果示于图10。
测定装置：DVS Intrinsic(Surface Measurement Systems制)
温度：25℃
相对湿度(％)测定点：
循环1：0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,95,90,80,70,60,50,40,30,20,10,0(％)；循环2：10,20,30,40,50,60,70,80,90,95,90,80,70,60,50,40,30,20,10,0(％)
阈值：0.001dm/dt(％/分钟)
最小吸附时间：10分钟
最大吸附时间：1440分钟
测定的结果确认，化合物1的水合物晶体(C型晶体)是下列水合物晶体，其在相对湿度0～95％的范围，随着水合数变化，与相对湿度0％时的重量比较，水合数可在3.3％重量的范围变化。
实施例26-1
化合物1的DMSO-水合物晶体(A型)的单晶体X线的测定
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的DMSO-水合物晶体(A型)的合成
将化合物1的水合物晶体(C型晶体)(54.9mg)室温溶解于DMSO(0.784mL)。将该溶液在室温振荡110分钟时，在DMSO中得到化合物1的DMSO-水合物晶体(A型)。
单晶体X线结构分析
用以下的方法，进行实施例26-1中配制的化合物1的DMSO-水合物晶体(A型晶体)的单晶体X线结构分析。
测定装置：Rigaku XtaLAB Synergy Custom，带有VariMax Cu diffractometer(Rigaku公司制)
对阴极：Cu
管电压：40kV
管电流：30mA
温度：-180℃
测定：用认为在结构分析中得到足够衍射斑点的策略、曝光时间进行测定。
结构分析：用直接法(SHELXT-2018/2、CrysAlisPro、Rigaku)进行初始结构确定，用全矩阵最小二乘法(SHELXL-2017/1、APEX3、Bruker)进行结构细化。非氢原子的温度因子基本上为各向异性，但无序的原子以各向同性细化。水分子的氢原子应用约束(restrain)置于适当位置，用结合的氧原子的1.5倍大的各向同性温度因子细化。其它氢原子应用骑乘模型置于适当位置，作为结合的非氢原子的1.2倍或1.5倍大的各向同性温度因子。结果示于图11。
实施例26-2
化合物1的丙酮-水合物晶体(H型)的物理化学性质的测定
(1)单晶体X线结构分析
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的丙酮-水合物晶体(H型、单晶体X线 结构分析用)的合成
在9mL小瓶中添加丙酮(0.8mL)和水(0.2mL)后混和，其中放入添加了化合物1的非晶质固体(约1mg)的0.3mL小瓶，对9mL小瓶加盖，通过使溶剂蒸气扩散，3小时后得到晶体。
用以下的方法，进行上述得到的化合物1的丙酮-水合物晶体(H型、单晶体X线结构分析用)的单晶体X线结构分析。
测定装置：Rigaku XtaLAB Synergy Custom，带有VariMax Cu diffractometer(Rigaku公司制)
对阴极：Cu
管电压：40kV
管电流：30mA
温度：-180℃
测定：用认为在结构分析中得到足够衍射斑点的策略、曝光时间进行测定。
结构分析：用直接法(SHELXT-2018/2、CrysAlisPro、Rigaku)进行初始结构确定，用全矩阵最小二乘法(SHELXL-2018/3、Olex2、OlexSys)进行结构细化。非氢原子的温度因子作为各向异性细化。水分子的氢原子置于适当位置，用结合的氧原子的1.5倍大的各向同性温度因子细化。其它氢原子应用骑乘模型置于适当位置，作为结合的非氢原子的1.2倍或1.5倍大的各向同性温度因子。结果示于图12。
(2)粉末X线衍射测定
化合物1((5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊 基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八 甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺 [氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一 氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺)的丙酮-水合物晶体(H型、粉末X线衍 射测定用和溶剂含有量的测定用)的合成
在反应容器中，加入化合物1的水合物晶体(C型晶体)(2.1g)和丙酮(16mL)。将外温设定为40℃，边搅拌边加入水(6.4mL)。在玻璃小瓶中加入乳钵粉碎的化合物1的水合物晶体(6mg)，用丙酮水混合液(80μL、5/4v/v)悬浮后，在反应容器中加入悬浮液。进一步在玻璃小瓶中加入丙酮水混合液(80μL、5/4v/v)，在反应容器中加入悬浮液。将晶析液搅拌2小时。经10分钟加入水(1.6mL)后，将悬浮液搅拌3小时。经10分钟加入水(1.6mL)后，将悬浮液搅拌2小时。将悬浮液经1小时冷却至外温25℃。将悬浮液静置保管过夜。次日，在外温25℃搅拌后，采样一部分悬浮液，以悬浮液状态实施粉末X线衍射测定(测定方法4)。用桐山漏斗过滤悬浮液后，用丙酮水混合液(5.6mL、4.4mL)洗涤晶体。接着，用水(10mL)洗涤晶体2次。将得到的湿性粉末用于溶剂含有量的测定。
用以下的方法，将上述得到的化合物1的丙酮-水合物晶体(H型、粉末X线衍射测定用)供给粉末X线衍射测定(测定方法4)。结果示于以下。
对于丙酮-水合物晶体(H型)的2θ值，观测到7.942°、8.283°、8.861°、10.097°、10.491°、11.805°、12.673°、12.830°、13.514°、13.855°、15.853°、16.405°、16.642°、和17.772°(±0.2°)为主要峰。图13显示分析结果。
(3)溶剂含有量的测定
通过GC的丙酮量的分析条件示于以下。
装置：GC-2010(岛津公司制)
柱：DB-624(Agilent),0.530mm ID×30m,3.00μm
柱温：50℃(5min)→10℃/min→90℃(0min)→50℃/min→240℃(5min)
注入口温度：230℃
检测器温度：250℃
分流比：20/1
流量：30cm/sec
通过卡尔费休滴定法的水分量的分析条件示于以下。
装置：CA-200(日东精工Analytech公司制)
阳极液：Aquamicron AKX
阴极液：Aquamicron CXU
在这些测定中，湿性粉末的丙酮量是3.7％，水分量是17.5％。
配制例1：无定形状态的化合物1的制备
按下述的方案1合成具有下述结构的化合物1(“(5S,8S,11S,15S,18S,23aS,29S,35S,37aS)-8-((S)-仲丁基)-18-环戊基-29-(3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯乙基)-36-乙基-11-异丁基-N,N,5,6,12,16,19,33-八甲基-35-(4-甲基苄基)-4,7,10,13,17,20,23,28,31,34,37-十一氧代三十四氢-2H,4H-螺[氮杂环丁二烯并(azeto)[2,1-u]吡咯并[2,1-i][1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31]十一氮杂环三十四碳十七烯-21,1'-环戊烷]-15-甲酰胺”)。
化合物1
[化学式86]
方案1
[化学式87]
化合物aa033-b((2S)-2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]-4-氧代-4-丙-2- 烯氧基丁酸)的合成
[化学式88]
将Fmoc-Asp(OAl)-OH((2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-4-氧代-4-丙-2-烯氧基丁酸、CAS编号146982-24-3)(200g，506mmol)，对甲苯磺酸(5.7g，0.05当量)、低聚甲醛(45.6g，3当量)与甲苯混合，在110℃搅拌16小时。将反应液减压下蒸馏除去溶剂，将残渣溶解于乙酸乙酯，用碳酸氢钠水溶液洗涤2次。用无水硫酸钠干燥有机层后，减压下蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚、0/100～30/70)纯化残渣，得到化合物aa033-a(9H-芴-9-基甲基(4S)-5-氧代-4-(2-氧代-2-丙-2-烯氧基乙基)-1,3-噁唑烷-3-甲酸酯)(175g，85％)。将同样合成的另一批次混合，用于下一反应。
LCMS(ESI)m/z＝408(M+H)+
保留时间：1.407分钟(分析条件SMD方法＿20)
将化合物aa033-a(100g，245mmol)，溴化锌(ZnBr2)(110g，496mmol)，三乙基硅烷(TES)(56g，481.6mmol)的二氯甲烷(DCM)(1L)混合溶液在氮气氛下在室温搅拌48小时。将相同尺度的4批次的反应液混合，减压下蒸馏除去溶剂。将残渣溶解于MTBE，用0.5M磷酸缓冲液(pH＝约7.5)萃取10次。混合水层，用5M盐酸水将pH调整至2，用乙酸异丙酯(IPAC)萃取2次。混合有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。为了除去IPAC，将向得到的残渣添加MTBE、减压下蒸馏除去溶剂重复6次，得到化合物aa033-b((2S)-2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]-4-氧代-4-丙-2-烯氧基丁酸)。(270g，54％)
LCMS(ESI)m/z＝410(M+H)+
保留时间：1.956分钟(分析条件SMD方法＿05)
化合物aa011-a的合成
在氮气氛下，在冰冷下向WSCI·HCl(27.4g，143mmol)的DMF(217mL)溶液中加入HOBt(17.72g，131mmol)，进一步将化合物aa033b(48.8g，119mmol)作为与DCM(90mL)和DMF(90mL)的混合溶液加入，在0℃搅拌30分钟。在其中滴加二甲胺的THF溶液(2mol/L，65.6mL，131mmol)，在0℃搅拌30分钟。用乙酸乙酯(488mL)稀释反应液，将有机层用盐酸(1mol/L，390mL)洗涤2次，进一步用饱和碳酸氢钠水溶液与水的混合溶液(1：1，488mL))洗涤2次，进一步，用饱和盐水与水的混合溶液(1：1、488mL)洗涤1次后，将得到的有机层用无水硫酸钠干燥，减压下蒸馏除去溶剂，得到化合物aa011-a。(51.16g，收率98％)。
LCMS(ESI)m/z＝437.0(M+H)+
保留时间：1.262分钟(分析条件SMDFA05)
化合物aa079、(2S)-2-环戊基-2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸 (Fmoc-MeGly(cPent)-OH)的合成
[化学式89]
在化合物aa079-a((2S)-2-环戊基-2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基]乙酸、Fmoc-Gly(cPent)-OH)(CAS编号：220497-61-0)(30.0g，82mmol)、低聚甲醛(7.39g，246mmol)和CSA(0.954g，4.10mmol)的甲苯(160mL)混合液中，加入三氟乙酸(TFA)(9.0mL)后，在60℃搅拌4小时。将反应液冷却至室温后，通过过滤除去固体。减压下浓缩滤液，用乙酸乙酯(220mL)稀释后，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水按顺序洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩，作为粗产物得到化合物aa079-b。不实施进一步纯化进行下一反应。
LCMS(ESI)m/z＝378(M+H)+
保留时间：1.01分钟(分析条件SQDFA05)
应用上述得到的化合物aa079-b的总量，在三乙基硅烷(TES)(65.5mL，410mmol)和aa079-b的二氯乙烷(DCE)(90mL)的混合液中加入三氟乙酸(TFA)(76mL，984mmol)，在60℃搅拌16小时。将反应液冷却至室温后减压浓缩，将得到的固体用正己烷/乙酸乙酯(95/5)洗涤，通过减压干燥得到化合物aa079((2S)-2-环戊基-2-[9H-芴-9-基甲氧基羰基(甲基)氨基]乙酸、Fmoc-MeGly(cPent)-OH)(29.1g，2步骤93％)。
LCMS(ESI)m/z＝380(M+H)+
保留时间：0.92分钟(分析条件SQDFA05)
化合物1217-a的合成
在室温向化合物aa079(42.2g，111mmol)和Oxyma(19.99g，141mmol)的DMF(391mL)溶液中加入WSCI·HCl(31.5g，164mmol)，搅拌30分钟，得到溶液A。
在氮气氛下，在室温向化合物aa011-a(51.16g，117mmol)的DMF(391mL)溶液中滴加DBU(17.49mL，117mmol)，搅拌5分钟。在其中加入吡啶盐酸盐(14.9g，129mmol)，搅拌10分钟。在得到的反应液中加入溶液A和DIPEA(22.46mL，129mmol)，在氮气氛下，在室温搅拌7小时。将反应液用乙酸乙酯(422mL)稀释，用盐酸(1mol/L，422mL)洗涤2次，将得到的水层用乙酸乙酯(422mL)萃取2次。混合所有的有机层，用水(422mL)、饱和碳酸氢钠水溶液和水的混合溶液(1：1，422mL)、饱和盐水和水的混合溶液(1：1、422mL)按顺序洗涤后，将得到的有机层用硫酸钠干燥，减压下蒸馏除去溶剂。在得到的残渣中加入DCM(422mL)，搅拌0.5小时。在其中加入硫酸镁(30g)，搅拌30分钟后，过滤除去固形物。将得到的溶液用硅胶柱色谱(己烷/乙酸乙酯)纯化，得到化合物1217-a。(55.55g、收率87％)
LCMS(ESI)m/z＝598.2(M+Na)+
保留时间：1.320分钟(分析条件SMDAM05)
化合物1217-b的合成
在氮气氛下，在室温向化合物1217-a(55.55g，96mmol)的DCM(193mL)溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(1.115g，0.965mmol)，进一步滴加苯基硅烷(8.31mL、67.5mmol)，搅拌30分钟。将反应液用MTBE(556mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液和水的混合溶液(1：1，556mL)萃取。将得到的有机层用水(278mL)萃取。混合水层，加入DCM(556mL)。在其中滴加磷酸(56.7g，579mmol)将pH调整至2～3，分离有机层后，用DCM(556mL)萃取水层。混合得到的有机层，用饱和盐水和水的混合溶液(1：1、556mL)洗涤后，用硫酸钠干燥，减压下蒸馏除去溶剂，得到化合物1217-b。(48.87g，收率95％)
LCMS(ESI)m/z＝536(M+H)+
保留时间：1.138分钟(分析条件SMDAM05)
化合物1217-b-树脂的合成
在带滤器的反应容器中设置2-氯三苯甲基氯树脂(购自SUNRESIN公司，1.36mmol/g，114g、155mmol)，加入DCM(1140mL)，在25℃搅拌45分钟后，从滤器排出溶剂。在反应容器中加入化合物1217-b(48.87g，91mmol)和甲醇(29.6mL，730mmol)与DIPEA(76mL，438mmol)的DCM(798mL)溶液，在25℃搅拌60分钟，从滤器排出溶液。随后，在反应容器中加入甲醇(111mL，2737mmol)和DIPEA(76mL，438mmol)的DCM(684mL)溶液，在25℃搅拌90分钟，从滤器排出溶液。在反应容器中加入DCM(570mL)并搅拌5分钟，从滤器排出溶液。将该树脂的洗涤操作进一步重复4次，将得到的树脂减压下干燥，得到化合物1217-b-树脂(140.5g)。通过定量与树脂结合的化合物的Fmoc基，算出负载量为0.482mmol/g。
化合物1217-c-树脂的合成
将上述得到的树脂(0.482mmol/g、60g、28.92mmol)置于塑料制固相反应容器。在室温向该固相反应容器中加入DCM(600mL)，振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。在该固相反应容器中加入DMF(420mL)，振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复1次。在该固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、420mL)，进行Fmoc基的脱保护。振荡10分钟后从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DMF(420mL)，振荡5分钟后，从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入三乙胺盐酸盐(7.96g、57.8mmol)的DCM(420mL)溶液，振荡5分钟后，从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DCM(420mL)，振荡5分钟后，从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DMF(420mL)，振荡5分钟后，从筛板排出溶液。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复1次。
混合Fmoc-cLeu-OH(37.98g、108mmol)(CAS编号：117322-30-2)和Oxyma(9.6g、67.6mmol)的DMF(180mL)溶液、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10％、216mL)，2分钟后，加入通过上述得到的固相反应容器。将该固相反应容器在50℃振荡24小时后，从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DMF(420mL)，在室温振荡5分钟后，从筛板排出溶液。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复4次。在该固相反应容器中加入DCM(420mL)，在室温振荡5分钟后，从筛板排出溶液。将该通过DCM的树脂的洗涤步骤进一步重复5次。将得到的树脂减压下干燥，得到化合物1217-c-树脂(62.5g)。
化合物aa134的合成
化合物aa134、(2S)-4-[3，5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰 基氨基)丁酸、Fmoc-Hph(4-CF3-35-F2)-OH的合成
[化学式90]
化合物aa132-a、(1-O-苄基5-O-(1，3-二氧代异吲哚-2-基)(2S)-2-[(2-甲基丙 烷-2-基)氧基羰基氨基]戊二酸酯)的合成
[化学式91]
在氮气氛下，在0℃向(4S)-4-[(2-甲基丙烷-2-基)氧基羰基氨基]-5-氧代-5-苯基甲氧基戊酸(Boc-Glu-OBn、CAS编号30924-93-7)(200g，592.82mmol)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(106g，649.78mmol，1.10当量)、DMAP(3.6g，29.47mmol，0.05当量)的THF(2L)溶液中，滴加DIC(138mL，1.54当量)。将反应液在25℃搅拌16小时，通过过滤除去固形物，将滤液减压下蒸馏除去溶剂。用甲苯稀释残渣，通过过滤除去生成的固体，将滤液减压下蒸馏除去溶剂。通过重结晶(丙酮/庚烷)纯化残渣，得到化合物aa132-a(1-O-苄基5-O-(1，3-二氧代异吲哚-2-基)(2S)-2-[(2-甲基丙烷-2-基)氧基羰基氨基]戊二酸酯)。(230g，80％)
LCMS(ESI)m/z＝505.2(M+Na)+
保留时间：0.992分钟(分析条件SMD方法＿16)
将溴化镍三水合物(NiBr2·3H2O)(13.5g，49.7mmol，0.3当量)和4,4'-二-叔丁基-2,2’-联吡啶(dtbbpy，CAS编号72914-19-3)(13.3g，49.7mmol、0.3当量)加入DMA(400mL)中，在氮气氛下，在50℃搅拌3小时，配制Ni溶液。
将化合物aa132-a(1-O-苄基5-O-(1,3-二氧代异吲哚-2-基)(2S)-2-[(2-甲基丙烷-2-基)氧基羰基氨基]戊二酸酯)(80g，166mmol)、锌粉末(54.2g，829mmol，5当量)和4-溴-1,3-二氟-2-(三氟甲基)苯(CAS编号156243-64-0，86.6g，332mmol、2当量)的DMA(400mL)混合液在氮气氛下、在室温搅拌1小时，添加预先调整的Ni溶液，在室温搅拌16小时。在反应液中加入EDTA·2Na水溶液(800mL，10％)，过滤除去固体。用乙酸乙酯萃取滤液，用饱和盐水洗涤合并的有机层后，用无水硫酸钠干燥，减压下蒸馏除去溶剂。用硅胶柱色谱(乙酸乙酯/石油醚)纯化得到的残渣，得到化合物aa134-a。(57.2g，69％)。
LCMS(ESI)m/z＝496(M+Na)+
保留时间：1.544分钟(分析条件SMD方法＿15)
将化合物aa134-a(57.2g，121mmol)的甲苯混合液(690mL)冷却至0℃，滴加三氟甲磺酸(TfOH)(54.4g，362mmol，3当量)。在室温搅拌1小时后，加入水(58mL)。用水萃取该混合液，用乙酸乙酯萃取合并的水层。用水洗涤合并的有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压下蒸馏除去溶剂，得到60g的残渣。在残渣中加入乙腈/水(400/400mL)，用氢氧化钠水溶液(48％)将pH调整至7。在该溶液中加入Fmoc-OSu(36.6g，108.6mmol，0.9当量)，用氢氧化钠水溶液(48％)将pH调整至8.0后，在室温搅拌16小时。边用乙腈/水(1/1)清洗边将反应液过滤除去固体成分，将滤液用乙腈稀释，通过用6mol/L盐酸水调整至酸性析出固体，通过过滤收集该固体，得到化合物aa134((2S)-4-[3,5-二氟-4-(三氟甲基)苯基]-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)丁酸、Fmoc-Hph(4-CF3-35-F2)-OH)。(52g，83％)
LCMS(ESI)m/z＝528.45(M+Na)+
保留时间：3.538分钟(分析条件SMD方法＿14)
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：12.69(s，1H)，7.90(d，J＝7.5Hz，2H)，7.78-7.54(m，3H)，7.48-7.20(m，6H)，4.33(d，J＝6.3Hz，2H)，4.24(t，J＝6.9Hz，1H)，3.97-3.84(m，1H)，2.79-2.65(m，2H)，2.15-2.00(m，1H)，2.00-1.83(m，1H)
化合物aa113、(2S)-2-[乙基(9H-芴-9-基甲氧基羰基)氨基]-3-(4-甲基苯基)丙 酸(Fmoc-EtPhe(4-Me)-OH)的合成
[化学式92]
在氮气氛下，将化合物aa113-a((2S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(4-甲基苯基)丙酸、Fmoc-Phe(4-Me)-OH)(5.62g，14.0mmol，CAS编号199006-54-7)悬浮于二氯乙烷(DCE)(17.5mL)，加入仲醛(5.61mL，42.0mmol)、三氟乙酸(TFA)(9.65mL，126mmol)，在60度搅拌6小时。将包含得到的化合物aa113-b的反应液原样用于下一步骤。
LCMS(ESI)m/z＝428(M+H)+
保留时间：1.03分钟(分析条件SQDFA05)
在得到的化合物aa113-b的反应液中，加入二氯乙烷(DCE)(17.5mL)、三氟乙酸(TFA)(19.3mL，252mmol)、三乙基硅烷(TES)(20.1mL，126mmol)，在60度搅拌17小时。冷却至室温，减压浓缩后，将得到的残渣溶解于乙酸乙酯(40mL)。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)、饱和盐水(40mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压下蒸馏除去溶剂。将得到的残渣溶解于乙腈(30mL)，用己烷(15mL)洗涤2次，减压下蒸馏除去溶剂。将得到的残渣用反相柱色谱(0.1％-加入甲酸的乙腈/0.1％-加入甲酸的蒸馏水)纯化，得到化合物aa113((2S)-2-[乙基(9H-芴-9-基甲氧基羰基)氨基]-3-(4-甲基苯基)丙酸、Fmoc-EtPhe(4-Me)-OH)。(4.4g，2步骤73％)
LCMS(ESI)m/z＝430(M+H)+
保留时间：0.95分钟(分析条件SQDFA05)
以下的Fmoc-Pro-OH(CAS编号：71989-31-6)、Fmoc-Hph(4-CF3-35-F2)-OH(化合物aa134)、Fmoc-MeGly-OH(CAS编号：77128-70-2)、Fmoc-EtPhe(4-Me)-OH(化合物aa113)、Fmoc-Aze(2)-OH(CAS编号：136552-06-2)、Fmoc-MeAla-OH(CAS编号：84000-07-7)和Fmoc-Ile-OH(CAS编号：71989-23-6)的延伸应用Intavis公司制肽合成仪(Multipep RSi)通过Fmoc固相合成法合成。关于操作的详细顺序，按照合成仪所附手册。
将通过上述得到的化合物1217-c-树脂(对于1个固相反应容器为200mg)加入30个固相反应容器中，置于肽合成仪。通过在所有该30个固相反应容器中加入二氯甲烷(DCM)并静置1小时，进行树脂的膨胀。其后，从筛板排出溶剂。
Fmoc-Pro-OH的延伸
在所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至30℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-Pro-OH(CAS编号71989-31-6)(0.6mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置4小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-Hph(4-CF3-35-F2)-OH(化合物aa134)的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-Hph(4-CF3-35-F2)-OH(化合物aa134)(0.45mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置2.5小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-MeGly-OH的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-MeGly-OH(0.6mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置2.5小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-EtPhe(4-Me)-OH(化合物aa113)的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将如前述制备的Fmoc-EtPhe(4-Me)-OH(0.6mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置2.5小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-Aze(2)-OH的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-Aze(2)-OH(0.6mol/L)和HOOBt(0.375mol/L)的NMP和DMSO的混合溶液(7：3)(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在60℃静置5小时。其后，向所有30个固相反应容器添加N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)，在60℃静置5小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-MeAla-OH的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-MeAla-OH(0.6mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置2.5小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。
Fmoc-Ile-OH的延伸
在包含上述得到的树脂的所有30个固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、对于1个固相反应容器为1.4mL)，加温至35℃，10分钟后从筛板排出溶液。在所有该30个固相反应容器中加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。然后，将Fmoc-Ile-OH(0.6mol/L)和HOAt(0.375mol/L)的NMP溶液(对于1个固相反应容器为0.6mL)、和N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)的DMF溶液(10v/v％、对于1个固相反应容器为0.72mL)在合成仪的混合小瓶中混合后，向所有30个固相反应容器添加，在40℃静置10小时。其后，从筛板排出溶液。向所有30个固相反应容器加入DMF(对于1个固相反应容器为1.4mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复2次。然后，向所有30个固相反应容器加入DCM(对于1个固相反应容器为1.6mL)，从筛板排出溶剂。将该树脂的洗涤步骤进一步重复5次。从所有30个固相反应容器回收树脂，混合，继续进行操作。
Fmoc-MeLeu-OH(CAS编号：103478-62-2)的延伸
将上述得到的树脂加入200mL的塑料制固相反应容器，其中加入DCM(60mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。在该固相反应容器中加入甲苯(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过甲苯的树脂的洗涤步骤进一步重复1次。在该固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的甲苯溶液(2v/v％、45mL)，在30℃振荡5分钟后从筛板排出溶液。
在该固相反应容器中加入甲苯(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过甲苯的树脂的洗涤步骤进一步重复1次。在该固相反应容器中加入DCM(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DCM的树脂的洗涤步骤进一步重复1次。在该固相反应容器中，加入Fmoc-MeLeu-OH(4.25g、11.57mmol)、[乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸-O2]三-1-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸(PyOxim)(6.10g、11.57mmol)、DIPEA(3.03mL、17.35mmol)的DCM(45mL)溶液，在30℃振荡3小时。其后，从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DMF(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复4次。在该固相反应容器中加入DCM(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DCM的树脂的洗涤步骤进一步重复3次。其后，得到的树脂在减压下干燥。
在上述的固相反应容器中加入DCM(60mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。在该固相反应容器中加入DMF(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复1次。在该固相反应容器中添加二氮杂双环十一烯(DBU)的DMF溶液(2v/v％、45mL)，在30℃振荡15分钟后从筛板排出溶液。在该固相反应容器中加入DMF(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DMF的树脂的洗涤步骤进一步重复4次。在该固相反应容器中加入DCM(50mL)，在30℃振荡5分钟后，从筛板排出溶剂。将该通过DCM的树脂的洗涤步骤进一步重复4次，得到负载化合物1217-d的树脂。
化合物1217-d的合成(肽从树脂的切割)
在包含通过上述得到的树脂的固相反应容器中，加入2,2,2-三氟乙醇(TFE)(60mL)和DCM(60mL)和DIPEA(0.909mL)的混合溶液，在室温振荡2小时。其后，从筛板回收溶液。在该固相反应容器中加入2,2,2-三氟乙醇(TFE)(30mL)和DCM(30mL)的混合溶液，在室温5分钟振荡后，从筛板回收溶液。进一步在该固相反应容器中，加入2,2,2-三氟乙醇(TFE)(30mL)和DCM(30mL)的混合溶液，在室温5分钟振荡后，从筛板回收溶液。混合回收的所有的溶液，减压下蒸馏除去溶剂，作为粗产物得到化合物1217-d。(3.85g)
LCMS(ESI)m/z＝1453.9(M-H)-
保留时间：0.67分钟(分析条件SQDAA50)
化合物1的合成(肽的环化和纯化)
将通过上述得到的化合物1217-d(3.85g)溶解于乙酸异丙酯(529mL)和DIPEA(0.915mL、5.24mmol)的混合液，加入HCTU(O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸、CAS编号330645-87-9)(1.805g、4.36mmol)，在室温21小时。其后，减压下蒸馏除去溶剂直至溶液量成为约一半。在得到的溶液中，加入饱和氯化铵水溶液(40mL)和水(40mL)的混合溶液，用乙酸异丙酯(350mL)萃取。将得到的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和水(40mL)的混合溶液、饱和盐水(40mL)和水(40mL)的混合溶液按顺序洗涤后，用硫酸钠干燥，减压下蒸馏除去溶剂，得到3.36g的残渣。将得到的残渣用反相硅胶柱色谱(Daisogel SP-120-40/60-ODS-RPS、作为洗脱液使用乙腈(包含0.1％的甲酸)/水(包含0.1％的甲酸))纯化，通过冷冻干燥包含目标物的洗脱液，得到无定形状态的化合物1(1.36g、收率34％)。得到的化合物1的质谱的值和液相色谱的保留时间如下述。
LCMS(ESI)m/z＝1437.7(M+H)+
保留时间：7.496分钟(分析条件SSC-A-AF-01)
配制例1中LC/MS的分析条件示于表11。
[表11]
[表12]
/>
实施例27步骤H’1
化合物a03：叔丁基2-[[(2S)-2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式93]
在反应容器中加入化合物a01(2.00g)和化合物a02(1.37g)，随后加入2-MeTHF(19.0mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(5.5mL)后，边将反应混合物的内温保持在32℃以下边滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、11.7mL)，其后在室温搅拌1小时。滴加5％碳酸钠水溶液(12mL)以便将反应混合物的内温保持在36℃以下并搅拌后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(12mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(12mLx1)、10％氯化钠水溶液(50mLx2)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物a03的残渣(2.72g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.499分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例28步骤H’2-1
化合物a04：叔丁基2-[[(2S)-3-环己基-2-(甲基氨基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸 酯的合成
[化学式94]
在步骤H’1中得到的包含化合物a03的残渣(2.70g)中加入2-MeTHF(18mL)后，加入5％Pd/C(1.27g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌2小时。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(18mLx3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a04的残渣(1.77g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.419分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例29步骤H’2-2
化合物a06：叔丁基2-[[(2S)-2-[[2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]乙酰基]-甲基-氨 基]-3-环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式95]
使步骤H’2-1中得到的包含化合物a04的残渣(1.71g)、和化合物a05(1.29g)溶解于2-MeTHF(11.6mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(3.4mL)后，边将反应混合物的内温保持在27℃以下边滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、7.2mL)，其后在室温搅拌2小时。滴加5％碳酸钠水溶液(7.2mL)以便将反应混合物的内温保持在29℃以下并搅拌后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(7.2mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(7.2mLx1)、10％氯化钠水溶液(7.2mLx2)洗涤得到的有机层。减压浓缩得到的有机层，得到包含化合物a06的残渣(2.70g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.458分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例30步骤H’3-1
化合物a07：叔丁基2-[[(2S)-3-环己基-2-[甲基-[2-(甲基氨基)乙酰基]氨基]丙 酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式96]
/>
在步骤H’2-2中得到的包含化合物a06的残渣(2.70g)中加入2-MeTHF(10mL)后，加入5％Pd/C(0.71g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌2小时。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(10mLx3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a07的残渣(1.82g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.848分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例31步骤H’3-2
化合物a09：叔丁基2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]乙酰基]-甲 基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式97]
使步骤H’3-1中得到的包含化合物a07的残渣(1.80g)、和化合物a08(1.57g)溶解于2-MeTHF(14.2mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(4.1mL)后，边将反应混合物的内温保持在30℃以下边滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、8.8mL)，其后在室温搅拌2小时。滴加5％碳酸钠水溶液(10.8mL)以便将反应混合物的内温保持在33℃以下并搅拌后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(10.8mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(10.8mLx1)、5％碳酸钠水溶液(10.8mLx1)洗涤得到的有机层。减压浓缩得到的有机层，得到包含化合物a09的残渣(2.61g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.055分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例32步骤H’4-1
化合物a10：叔丁基2-[[(2S)-3-环己基-2-[甲基-[2-[甲基-[2-(甲基氨基)乙酰 基]氨基]乙酰基]氨基]丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式98]
/>
在步骤H’3-2中得到的包含化合物a09的残渣(2.40g)中加入2-MeTHF(12.3mL)后，加入5％Pd/C(0.44g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌1小时。
应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(12mLx3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a10的残渣(1.97g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.521分钟(分析条件：方法3)
实施例33步骤H’4-2
化合物a12：叔丁基2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3S)-2-(苄氧基羰基氨基)-3-甲 基-戊酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲 基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式99]
使步骤H’4-1中得到的包含化合物a10的残渣(1.92g)、和化合物a11(1.69g)溶解于2-MeTHF(12.8mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(3.7mL)后，边将反应混合物的内温保持在29℃以下边滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、7.8mL)，其后在室温搅拌2小时。滴加5％碳酸钠水溶液(14.4mL)以便将反应混合物的内温保持在33℃以下并搅拌后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.4mLx1)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1)洗涤得到的有机层。将进一步用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.4mLx1)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1)洗涤得到的有机层重复2次。加入2-MeTHF(14.4mL)，将其用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.4mLx1)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1)洗涤。进一步用1％碳酸钠水溶液(14.4mLx3)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx5)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.4mLx1)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(14.4mLx1)、5％碳酸钠水溶液(14.4mLx1、7.2mLx10)洗涤。进一步用2.5％氨水(7.2mLx3)、10％氯化钠水溶液(1mLx1)洗涤。减压浓缩得到的有机层，得到包含化合物a12的残渣(2.39g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.006分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例34步骤H’5-1
化合物a13：叔丁基2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3S)-2-氨基-3-甲基-戊酰基]-甲 基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸 酯的合成
[化学式100]
在步骤H’4-2中得到的包含化合物a12的残渣(2.15g)中加入2-MeTHF(9.3mL)后，加入5％Pd/C(0.66g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌2小时。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(10mLx3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a13的残渣(1.95g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.776分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例35步骤H’5-2
化合物a15：叔丁基2-[[(2S)-3-环己基-2-[甲基-[2-[甲基-[2-[甲基-[(2S,3S)- 3-甲基-2-[[(2S)-4-甲基-2-[甲基(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基)氨基]戊酰基]氨基]戊 酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式101]
使步骤H’5-1中得到的包含化合物a13的残渣(1.94g)、和化合物a14(1.49g)溶解于2-MeTHF(10.3mL)并搅拌。用冰浴冷却反应容器，加入DIPEA(3.0mL)后，边将反应混合物的内温保持在9℃以下边滴加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、6.3mL)，其后取下冰浴在室温搅拌1小时。滴加5％碳酸钠水溶液(12mL)以便将反应混合物的内温保持在22℃以下并搅拌后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(12mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(12mLx1)、5％碳酸钠水溶液(12mLx1)洗涤得到的有机层，将得到的有机层减压浓缩。在2-MeTHF(20mL)中再度溶解，用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(12mLx2)、5％碳酸钠水溶液(12mLx2)洗涤。在有机层中加入N-甲基咪唑(0.3mL)和5％碳酸钠水溶液(12mL)并搅拌6.5小时后，排出水层。用5％碳酸钠水溶液(12mLx1)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(12mLx2)、5％碳酸钠水溶液(12mLx2)洗涤，减压浓缩。在2-MeTHF(20mL)中再度溶解，进一步加入庚烷：MTBE混合液(1.5：1)(20mL)，用5％碳酸钠水溶液(20mLx2)洗涤，通过减压浓缩，得到包含化合物a15的残渣(2.38g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.919分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例36步骤H’6
化合物a16：叔丁基2-[[(2S)-3-环己基-2-[甲基-[2-[甲基-[2-[甲基-[(2S,3S)- 3-甲基-2-[[(2S)-4-甲基-2-(甲基氨基)戊酰基]氨基]戊酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰 基]氨基]丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式102]
在步骤H’5-2中得到的包含化合物a15的残渣(2.35g)中加入2-MeTHF(14mL)后，将反应容器的外温设定为50℃，加入四丁基氟化铵(1M THF溶液、7.0mL)。原样将反应液搅拌2小时。冷却至室温后加入乙酸异丙酯(7mL)，用5％碳酸钾水溶液(7mLx6)洗涤后，减压浓缩，得到包含化合物a16的残渣(1.92g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.909分钟(HPLC分析条件：方法1)
实施例37步骤S’0
化合物a19：叔丁基(3S)-3-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸 酯的合成
[化学式103]
在反应容器中加入化合物a17(2.01g)、2-MeTHF(11.7mL)并搅拌。加入DIPEA(1.8mL)、化合物a18(0.53mL)后，在室温添加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、3.61mL)，其后搅拌1小时。边搅拌边加入10％柠檬酸水溶液(12mL)后，排出水层。用10％柠檬酸水溶液(12mL×1)、5％碳酸钠水溶液(12mL×2)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物a19的残渣(1.56g)。
通过HPLC分析的保留时间：3.934分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例38步骤S’1-1
化合物a20：叔丁基(3S)-3-(甲基氨基)-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式104]
在步骤S’0中得到的包含化合物a19的残渣(3.08g)中加入2-MeTHF(21.3mL)后，添加5％Pd/C(4.09g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌2小时。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(21.3mL×3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a20的残渣(2.09g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.058分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例39步骤S’1-2
化合物a22：叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[苄氧基羰基(甲基)氨基]-3-甲基-丁酰 基]-甲基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式105]
使步骤S’1-1中得到的包含化合物a20的残渣(2.04g)和化合物a21(2.14g)溶解于2-MeTHF(6.3mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(5.3mL)后，在室温添加2-MeTHF(5.9mL)和MeCN(4.1mL)中溶解的HATU(3.95g)，其后在50℃搅拌5小时。在室温加入CPME(5.3mL)后，加入5％碳酸钾水溶液(4.1mL)和NMI(0.55mL)，搅拌1小时30分钟。边搅拌边加入2.5％铵水溶液(16.3mL)后，排出水层。用2.5％铵水溶液(16.3mL×1)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(20.4mL×4)、5％碳酸钾水溶液(20.4mL×1)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(20.4mL×3)、5％碳酸钾水溶液(20.4mL×1)洗涤得到的有机层。减压浓缩得到的有机层，得到包含化合物a22的残渣(3.66g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.428分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例40步骤S’2-1
化合物a23：叔丁基(3S)-3-[甲基-[(2S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰基]氨基]-4- 氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式106]
在步骤S’1-2中得到的包含化合物a22的残渣(3.56g)中加入2-MeTHF(18.3mL)后，添加5％Pd/C(2.10g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌2小时30分钟。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF(18.3mL×3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a23的残渣(2.58g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.393分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例41步骤S’2-2
化合物a25：叔丁基(3S)-3-[甲基-[(2S)-3-甲基-2-[甲基-[1-[(2,2,2-三氟乙酰 基)氨基]环戊烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式107]
使化合物a24(2.90g)溶解于2-MeTHF(18.6mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(5.4mL)和步骤S’2-1中得到的包含化合物a23的残渣(2.50g)后，在室温添加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、10.4mL)和DMAP(1.59g)，其后搅拌8小时。分别追加化合物a24(1.47g)、DMAP(0.80g)、T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、5.5mL)、DIPEA(2.8mL)后，搅拌2小时。边搅拌边加入5％碳酸钠水溶液(20.5mL)后，排出水层。用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(20.5mL×4)、5％碳酸钠水溶液(20.5mL×2)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(20.5mL×2)、5％碳酸钠水溶液(20.5mL×1)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物a25的残渣(3.45g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.002分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例42步骤S’3-1
化合物a26：叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[(1-氨基环戊烷羰基)-甲基-氨基]-3-甲 基-丁酰基]-甲基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式108]
使步骤S’2-2中得到的包含化合物a25的残渣(3.41g)溶解于2-MeTHF(1362mL)和MeOH(1.4mL)并搅拌。在-20℃滴加LiBH4(2M THF溶液、4.5mL)，其后搅拌2小时。滴加2,2,2-三氟乙醇(6.4mL)后升温至0℃，其后搅拌20分钟。滴加20％氯化铵水溶液(10.2mL)，排出水层。对得到的有机层，在室温加入三氟乙酸(0.69mL)后搅拌10分钟。对包含2M氢氧化钠水溶液(44.3mL)的反应容器，滴加包含化合物a25的反应溶液。排出水层，其后用2M氢氧化钠水溶液(34.1mL×2)、10％磷酸氢二钾水溶液(17.0mL×1)洗涤。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物a26的残渣(2.90g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.868分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例43步骤S’3-2
化合物a28：苄基(2S)-2-[[1-[[(1S)-1-[[(1S)-3-叔丁氧基-3-氧代-1-(哌啶-1- 羰基)丙基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基-氨基甲酰基]环戊基]氨基甲酰基]吡 咯烷-1-甲酸酯的合成
[化学式109]
使步骤S’3-1中得到的包含化合物a26的残渣(2.90g)和化合物a27(1.66g)溶解于MeCN(14.5mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(2.67mL)后，在室温添加BEP(2.11g)，其后搅拌3小时。加入CPME(29.3mL)后，加入5％碳酸钾水溶液(17.4mL)和N-甲基咪唑(0.41mL)，在室温搅拌30分钟。排出水层后，用5％硫酸氢钠一水合物水溶液(17.4mL×5)、5％碳酸钠水溶液(17.4mL×2)、5％硫酸氢钠一水合物水溶液(17.4mL×3)、5％碳酸钠水溶液(17.4mL×2)洗涤得到的有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物a28的残渣(3.86g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.323分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例44步骤S’4-1
化合物a29：叔丁基(3S)-3-[甲基-[(2S)-3-甲基-2-[甲基-[1-[[(2S)-吡咯烷-2- 羰基]氨基]环戊烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式110]
在步骤S’3-2中得到的包含化合物a28的残渣(3.81g)中加入THF(16.8mL)后，添加5％Pd/C(0.40g、50％含水物)。通过氢气实施脱气置换3次，其后搅拌4小时30分钟。追加5％Pd/C(0.20g、50％含水物)，其后搅拌1小时30分钟。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(6.6mL×3)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩，得到包含化合物a29的残渣(3.12g)。
通过HPLC分析的保留时间：2.970分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例45步骤S’4-2
化合物a31：叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨 基)-4-苯基-丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-3-甲基-丁酰基]-甲 基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸酯的合成
[化学式111]
使步骤S’4-1中得到的包含化合物a29的残渣(2.06g)和化合物a30(1.10g)溶解于2-MeTHF(10.3mL)并搅拌。进一步加入DIPEA(2.8mL)后，在室温添加T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、5.4mL)，其后搅拌2小时。分别追加化合物a30(0.55g)、DIPEA(1.1mL)、T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、2.2mL)后，搅拌5小时。进一步，追加化合物a30(0.57g)、DIPEA(1.1mL)、T3P(50w/w％2-MeTHF溶液、2.2mL)并静置过夜，次日搅拌2小时。加入5％碳酸钾水溶液(12.4mL)和N-甲基咪唑(0.29mL)，在室温搅拌3小时。加入N-甲基咪唑(0.23mL)，搅拌1小时后排出水层。加入2-MeTHF(12.4mL)、N-甲基咪唑(0.23mL)、5％碳酸钾水溶液(12.4mL)，搅拌1小时后，排出水层。用10％硫酸氢钠一水合物水溶液(12.4mL×2)、5％碳酸钾水溶液(12.4mL×1)洗涤得到的有机层。在有机层中加入庚烷和MTBE的混合溶液(庚烷/MTBE＝1.5：1、12.4mL)、MeCN(4.7mL)并排出水层。在有机层中加入2-MeTHF(2.1mL)后，用MeCN(7.0mL)和5％碳酸钾水溶液(17.7mL)洗涤7次。对有机层加入乙酸异丙酯(7.6mL)后减压浓缩，在得到的残渣中加入乙酸异丙酯(7.6mL)，得到包含化合物a31的溶液(10.31g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.794分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例46步骤1’
化合物a32：(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-苯 基-丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-3-甲基-丁酰基]-甲基-氨 基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酸的合成
[化学式112]
使步骤S’4-2中得到的包含化合物a31的残渣(10.27g)溶解于乙酸异丙酯(51.4mL)并搅拌。加入HMDS(2.1mL)后，在0℃滴加TMSOTf(1.4mL)，其后在室温搅拌2小时30分钟。在室温加入2-MeTHF(51.4mL)、5％磷酸氢二钾水溶液(102.8mL)，排出水层。用5％磷酸二氢钠水溶液(102.8mL)洗涤有机层后，在得到的有机层中加入DIPEA(3.0mL)并减压浓缩，加入乙酸异丙酯(7.6mL)而得到包含化合物a32的溶液(7.92g)。
通过HPLC分析的保留时间：4.001分钟(HPLC分析条件：方法3)
实施例47步骤2’
化合物a33：叔丁基2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-苯基-丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨 基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-3-甲基-丁酰基]-甲基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酰 基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨 基]乙酰基]-甲基-氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸酯的合成
[化学式113]
使步骤2’中得到的包含化合物a32的残渣(7.92g)和步骤H’6中得到的包含化合物a16的残渣(1.33g)溶解于2-MeTHF(4.6mL)并搅拌。在室温添加DIPEA(1.6mL)、HATU(1.43g)，其后搅拌2小时。添加包含化合物a16的残渣(约300mg)，进一步搅拌2小时。其后，追加包含化合物a16的残渣(约300mg)，搅拌1小时30分钟。加入HATU(0.79g)后，搅拌1小时。加入CPME(3.5mL)、N-甲基咪唑(0.13mL)、5％碳酸钾水溶液(2.7mL)，在室温搅拌3小时。排出水层后，用2.5％氨水溶液(9.2mL×1)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(9.2mL×1)、5％碳酸钠水溶液(9.2mL×1)、10％硫酸氢钠一水合物水溶液(9.2mL×3)、5％碳酸氢钠水溶液(9.2mL×2)洗涤。在有机层中加入庚烷/MTBE(1.5：1、9.2mL)后，用5％碳酸钠水溶液(9.2mL×2)洗涤。对得到的有机层，加入2-MeTHF(9.2mL)，减压浓缩，得到包含化合物a33的残渣(4.49g)。
通过HPLC分析的保留时间：10.65分钟(分析条件：方法4)
实施例48步骤3’
化合物a34：2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3-[[(2S)-2- [[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-(苄氧基羰基氨基)-4-苯基-丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷 羰基]-甲基-氨基]-3-甲基-丁酰基]-甲基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酰基]-甲基-氨 基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲 基-氨基]-3-环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸的合成
[化学式114]
使步骤2’中得到的包含化合物a33的残渣(4.49g)溶解于2-MeTHF(49.5mL)并搅拌。在室温添加HMDS(2.9mL)和TMSOTf(2.1mL)，其后搅拌2小时。加入5％磷酸氢二钾水溶液(14.2mL)后，排出水层。将得到的有机层用10％柠檬酸水溶液(3.4mL)和5％磷酸氢二钾水溶液(10.5mL)的混合水溶液洗涤3次，用5％碳酸钠水溶液洗涤1次。对有机层，加入THF(20.9mL)进行共沸脱水3次后，对得到的残渣加入THF(5.9mL)，得到包含化合物a34的溶液(9.59g)。
通过HPLC分析的保留时间：9.26分钟(分析条件：方法4)
实施例49步骤4’
化合物a35：2-[[(2S)-2-[[2-[[2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3-[[(2S)-2- [[1-[[(2S)-1-[(2S)-2-氨基-4-苯基-丁酰基]吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基- 氨基]-3-甲基-丁酰基]-甲基-氨基]-4-氧代-4-(1-哌啶基)丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基- 戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]乙酰基]-甲基-氨基]-3- 环己基-丙酰基]-甲基-氨基]乙酸的合成
[化学式115]
将5％Pd/C(0.49g50％含水物)加入反应容器中，悬浮于THF(8mL)，在氢气氛下搅拌30分钟。其后进行氮置换，加入将步骤3’中得到的包含化合物a34的残渣(9.3g)溶解于THF(8mL)的溶液，在氢气氛下搅拌6小时时反应转化率是76％。进行氮置换并在冰箱中保管过夜后，次日返回室温搅拌2小时时反应转化率是87％。进行氮置换后，将5％Pd/C(0.24g、50％含水物)的THF(4mL)悬浮液加入反应液，氢取代后搅拌4小时(反应转化率99.0％)。进行氮置换并在冰箱中保管过夜后，次日返回室温测定时，反应转化率是99.4％。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用2-MeTHF溶液(6.5mLx10)洗涤残渣。合并得到的滤液和洗涤液，减压浓缩。将得到的残渣溶解于乙腈(16.3mL)和2-MeTHF(6.5mL)，用庚烷(37.1mL)洗涤后浓缩。将得到的残渣再度溶解于乙腈(16.3mL)和2-MeTHF(6.5mL)，用庚烷(37.1mL)洗涤后浓缩，得到包含化合物a35的残渣(2.96g)。
通过HPLC分析的保留时间：12.39分钟(HPLC分析条件：方法4)
实施例50步骤5’
化合物a36：(3S,9S,18S,21S,25S,28S,34S)-9-(环己基甲基)-21-异丁基-28-异 丙基-7,10,13,16,22,26,29-七甲基-18-[(1S)-1-甲基丙基]-3-(2-苯基乙基)-25-(哌啶- 1-羰基)螺[1,4,7,10,13,16,19,22,26,29,32-十一氮杂双环[32.3.0]三十七烷-31,1'-环 戊烷]-2,5,8,11,14,17,20,23,27,30,33-十一酮的合成
[化学式116]
配制含有前步骤中得到的包含化合物a35的残渣(2.90g)和DIPEA(1.44mL)的碳酸二甲酯溶液(72.5mL)，将其在PyBOP(4.34g)的碳酸二甲酯溶液(72.5mL)中经3小时滴加。在滴加结束后30分钟的时点采样确认反应后，应用滤纸通过吸引过滤滤去不溶物，用碳酸二甲酯(15mL)洗涤残渣。将合并滤液和洗涤液的溶液用2.5％氨水溶液(58mL)、5％硫酸氢钾水溶液(58mL)、5％磷酸氢二钠水溶液(58mL)、5％氯化钠水溶液(58mL)、0.5％氯化钠水溶液(58mL)洗涤。通过将得到的有机层减压下浓缩，得到包含化合物a36的残渣(2.72g)。
通过HPLC分析的保留时间：18.69分钟(HPLC分析条件：方法5)
实施例50-1
化合物a36：(3S,9S,18S,21S,25S,28S,34S)-9-(环己基甲基)-21-异丁基-28-异 丙基-7,10,13,16,22,26,29-七甲基-18-[(1S)-1-甲基丙基]-3-(2-苯基乙基)-25-(哌啶- 1-羰基)螺[1,4,7,10,13,16,19,22,26,29,32-十一氮杂双环[32.3.0]三十七烷-31,1'-环 戊烷]-2,5,8,11,14,17,20,23,27,30,33-十一酮的合成(使用PyBOP作为缩合剂，使用碳酸 二甲酯作为溶剂)
[化学式117]
在反应容器中称量化合物a35(9.7mg)，用碳酸二甲酯(2mL)溶解。在室温边搅拌边加入DIPEA(6.1μL)。在其中加入PyBOP(14.9mg)并搅拌30分钟。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，应用该溶液进行HPLC分析。目标物：环状二聚体的面积％比、和目标物的LC纯度(％)示于表13。
实施例50-2
将苯甲醚和2-甲基四氢呋喃用作溶剂的情形的结果也示于表13(实验操作与实施例50-1同样进行)。任一情形都未观测到环状三聚体。
实施例50-3
化合物a36：(3S,9S,18S,21S,25S,28S,34S)-9-(环己基甲基)-21-异丁基-28-异 丙基-7,10,13,16,22,26,29-七甲基-18-[(1S)-1-甲基丙基]-3-(2-苯基乙基)-25-(哌啶- 1-羰基)螺[1,4,7,10,13,16,19,22,26,29,32-十一氮杂双环[32.3.0]三十七烷-31,1'-环 戊烷]-2,5,8,11,14,17,20,23,27,30,33-十一酮的合成(使用PyBOP作为缩合剂，使用碳酸 二甲酯作为溶剂，通过反滴加法制备)
在反应容器中称量PyBOP(59.9mg)，悬浮于碳酸二甲酯(1mL)。在另一容器中将化合物a35(39.9mg)溶解于碳酸二甲酯(1mL)，在其中加入DIPEA(24.3μL)。将该原料的溶液应用注射泵在室温经3小时加入PyBOP悬浮液。加入结束后用碳酸二甲酯(0.2mL)清洗容器中残留的原料溶液，其后搅拌30分钟。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，应用该溶液进行HPLC分析。结果示于表13。
[表13]
/>
[化学式118]
a37：本衍生物中的c-二聚体
实施例51
化合物b1：(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-苄氧基羰基吡咯烷-2-羰基]氨基]环 戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸的 合成
[化学式119]
在反应容器中，加入包含化合物28的2-MeTHF溶液(17.45g、11.7wt％)并减压浓缩，在得到的残渣中加入IPAc(10.2mL)。在室温边搅拌边加入HMDS(1.52mL)后，将外温冷却至0℃，缓慢滴加TMSOTf(1.04mL)。升温至室温，搅拌30分钟。采样反应混合物进行样品配制(样品调整法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将外温冷却至0℃，在反应液中滴加5％磷酸氢二钾水溶液(14.3mL)，在室温搅拌10分钟。除去有机层，在水层中加入0.5M盐酸水溶液(11.2mL)和IPAc(10.2mL)并搅拌10分钟。排出水层，用5％氯化钠水溶液(14.3mL)洗涤有机层后，排出水层。将得到的有机层在外温30℃减压浓缩干固，得到包含化合物b1的残渣(1.88g、收率94.1％)。
LCMS(ESI)：保留时间：2.929分钟、m/z＝678.61[M+Na]+(LCMS分析条件方法1)
收率：94.1％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例52
化合物b2：(2S)-2-[[1-[[(1S)-2-[[(1S)-3-[[(1S)-1-[[(1S,2S)-1-[[(1S)-2- [(2S)-2-[[(1S)-2-[(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-甲基-氨基]-2-氧代-1-(对甲苯基甲基) 乙基]-乙基-氨基甲酰基]氮杂环丁烷-1-基]-1-甲基-2-氧代-乙基]-甲基-氨基甲酰基]- 2-甲基-丁基]氨基甲酰基]-3-甲基-丁基]-甲基-氨基]-1-(二甲基氨基甲酰基)-3-氧代- 丙基]-甲基-氨基]-1-环戊基-2-氧代-乙基]-甲基-氨基甲酰基]环戊基]氨基甲酰基]吡咯 烷-1-甲酸苄酯的合成
[化学式120]
在反应容器中称量包含化合物17的IPAc溶液(1.50g、55.0wt％)和化合物b1(0.98g、78.3wt％)，加入2-MeTHF(5.44mL)和MeCN(0.80mL)。在室温边搅拌边加入DIPEA(1.05mL)后，加入HATU(988.4mg)。在室温搅拌4小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品调整法2)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式2)。将外温冷却至0℃，在反应液中加入N-甲基咪唑(86μL)和5％碳酸钠水溶液(5.6mL)，在室温搅拌10分钟。排出水层，用2.5％氨水溶液(5.6mL)、5％硫酸氢钠水溶液(5.6mL×2)、5％碳酸钠水溶液(8.2mL×3)洗涤有机层。将得到的有机层在外温30℃减压浓缩干固，得到包含化合物b2的残渣(1.88g、收率93.8％)。
LCMS(ESI)：保留时间：21.17分钟、m/z＝1403.06[M+Na]+(LCMS分析条件方法5)
收率：93.8％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例53
化合物b3：2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-[[(2S)-1-苄氧基羰基吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2- 环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊 酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3- (对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸的合成
[化学式121]
在反应容器中，加入实施例52中得到的包含化合物b2的残渣(1.44g、90.3wt％)并加入IPAc(6.50mL)。在室温边搅拌边加入HMDS(0.50mL)后，将外温冷却至0℃，缓慢滴加TMSOTf(0.340mL)。升温至室温，搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品调整1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。在反应液中滴加5％磷酸氢二钾水溶液(9.10mL)，在室温搅拌10分钟。除去有机层，在水层中加入0.5M盐酸水溶液(7.41mL)和2-MeTHF(9.0mL)并搅拌10分钟。排出水层，用5％氯化钠水溶液(13.0mL)洗涤有机层后，排出水层。将得到的有机层在外温35℃减压浓缩干固，得到包含化合物b3的残渣(3.36g、收率92.7％)。
LCMS(ESI)：保留时间：18.19分钟、m/z＝1325.02[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
收率：92.7％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例54
化合物b4：2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-环戊基-2-[甲基-[1-[[(2S)-吡咯烷-2-羰基]氨基]环戊烷羰基]氨基]乙酰基]- 甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲 基-戊酰基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰 基]-甲基-氨基]乙酸的合成
[化学式122]
在反应容器中，在室温顺次加入实施例53中得到的化合物b3(1.01g、0.762mmol)和2-MeTHF(2.02mL)、THF(6.87mL)。在反应容器中，加入5％Pd/C(0.162g、50％含水物)后，通过氢气进行脱气置换3次并搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。应用滤纸和膜滤器过滤反应混合物，用2-MeTHF(5.0mL×2)洗涤残渣。将得到的滤液减压浓缩，得到包含化合物b4的残渣(1.43g、收率96.7％)。
LCMS(ESI)：保留时间：2.921分钟、m/z＝1191.00[M+H]+(LCMS分析条件方法1)
收率：96.7％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
化合物b4的环化反应(实施例55的反应条件研究)
将化合物b4用作起始原料，对在向化合物b5的环化反应中的缩合剂和溶剂进行研究。环化反应通过HPLC分析追踪。
[化学式123]
实施例55-6
化合物b5：(6S,9S,14S,17S,20S,24S,27S,33S)-27-环戊基-7-乙基-20-异丁基- N,N,4,14,15,21,25,28-八甲基-17-[(1S)-1-甲基丙基]-2,5,8,13,16,19,22,26,29,32- 十氧代-6-(对甲苯基甲基)螺[1,4,7,12,15,18,21,25,28,31-十氮杂三环[31.3.0.09,12] 三十六烷-30,1'-环戊烷]-24-甲酰胺的合成
在反应容器中称量化合物b4(9.99mg(8.39μmol))，加入溶剂(2-MeTHF、2.0mL(200v/w))。在室温边搅拌边加入DIPEA(6.74μL(38.6μmol))。将反应容器的外温设定为25℃，加入缩合剂(PyAOP、17.2mg(33.0μmol))并搅拌30分钟。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，配制用于HPLC分析的溶液。
化合物b5的LCMS(ESI)：保留时间：16.81分钟、m/z＝1173.51[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
环状二聚体b6(c-二聚体)的LCMS(ESI)：保留时间：22.36分钟、m/z＝2367.91[M+Na]+(LCMS分析条件方法5)
环状三聚体b7(c-三聚体)的LCMS(ESI)：保留时间：24.41分钟、m/z＝1759.26[M+2H]2+(LCMS分析条件方法5)
[化学式124]
应用下表所示的缩合剂和溶剂，进行与实施例55-6(使用PyAOP作为缩合剂，使用2-MeTHF作为溶剂)的实验同样的操作，测定起始原料(SM,化合物b5)的消耗、目标物(TM,化合物b5)的生成、以及副产物(环状二聚体b6(c-二聚体)和环状三聚体b7(c-三聚体))的生成量，研究优选的反应条件。表中总结起始原料：起始原料的丙酰胺体(化合物b8)：目标物：环状二聚体：环状三聚体的面积％比。
[表14]
[化学式125]
实施例55-11(通过实施例55-6的反滴加法制备)
在小瓶中加入化合物b4(9.89mg(8.31μmol))和2-MeTHF(0.99mL(100v/w))，在50℃搅拌10分钟。确认原料的溶解后，加入DIPEA(6.67μL(38.2μmol))，将反应溶液吸入注射器。在另一反应容器中加入PyAOP(17.1mg(32.8μmol))和2-MeTHF(0.99mL(100v/w))，在室温边搅拌边经3小时滴加前述注射器内的溶液。滴加结束后，用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，配制用于HPLC分析的溶液。
[表15]
实施例56
化合物c1：叔丁基(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-(苄氧基羰基氨基)环戊烷羰基]-甲基- 氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸酯的合成
[化学式126]
在反应容器中，在室温加入包含化合物23的2-MeTHF溶液(16.006g、32.5wt％)，减压浓缩。将使残渣溶解于MeCN(10.0mL)、减压浓缩的操作重复3次。在反应容器中，在室温加入MeCN(53.9mL)、1-(((苄氧基)羰基)氨基)环戊烷-1-甲酸(9.604g)和DIPEA(12.7mL)并搅拌。将反应容器的外温设定为55℃，边搅拌边在反应混合物中分2次加入HATU(15.257g)，搅拌6小时。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液稀释反应混合物，进行HPLC分析确认反应转化率为99.6％以上(反应转化率的计算式2)。在反应混合物中，加入N-甲基咪唑(4.3mL)并搅拌5分钟，随后加入自来水(27.0mL)并搅拌30分钟后，将反应容器的外温从55℃降温至25℃，将反应混合物搅拌过夜。应用滤纸吸引过滤反应混合物，用MeCN(18.0mL)和自来水(9.0mL)的混合液洗涤残渣。将过滤的晶体在40℃真空干燥3小时，得到包含化合物c1的白色的粉末(6.957g)。用MeCN稀释得到的晶体，用下述的分析条件进行LCMS测定(化合物c1的保留时间；6.914分钟、m/z＝637.30[M+Na]+)。
LCMS分析条件
装置：Waters ACQUITY UPLC H-Class+ACQUITY QDA
柱：CAPCELL CORE ADME(OSAKASODA),2.1mm ID×50mm,2.7μm
流动相：0.05％TFA/水(A)、0.05％TFA/MeCN(B)
洗脱法：B)5％(0min)→100％(10min)→5％(10.1min)→5％(12min)
流速：0.5mL/min
柱温：35℃
检测波长：210nm(PDA)
使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：78.32％)。
实施例57
化合物c2：(3S)-3-[[(2S)-2-[[1-(苄氧基羰基氨基)环戊烷羰基]-甲基-氨基]- 2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酸的合成
[化学式127]
在反应容器中，在室温加入包含化合物c1的白色的粉末(2.504g、95.9wt％)和二氯甲烷(12.0mL)后，加入HMDS(2.07mL)。将反应容器用冰浴冷却，边搅拌边加入TMSOTf(1.41mL)。将反应容器从冰浴取出，在室温搅拌1小时。用MeCN稀释反应混合物，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将反应容器用冰浴冷却，加入二氯甲烷(12.0mL)和5％磷酸氢二钾水溶液(24.0mL)，搅拌10分钟，排出有机层。在水层中加入2-MeTHF(72.0mL)后，用0.5M盐酸水溶液(12.0mL)、5％氯化钠水溶液(24.0mL)洗涤有机层。将得到的有机层减压浓缩，得到包含化合物c2的白色的粉末(1.977g)。用MeCN稀释得到的白色的粉末，进行LCMS分析(方法3化合物c2的保留时间；3.307分钟、m/z＝581.13[M+Na]+)。使得到的白色的粉末和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析(收率：81.51％)。
实施例58
化合物c3：2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-(苄氧基羰基氨基)环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨 基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰 基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基- 氨基]乙酸叔丁酯的合成
[化学式128]
在反应容器中称量包含化合物c2(618.1mg、90.0wt％)和化合物17的2-MeTHF溶液(1.22g、55.0wt％)，加入2-MeTHF(10.9mL)和MeCN(1.22mL)。在室温边搅拌边加入DIPEA(0.885mL)后，加入HATU(792mg)。在室温搅拌2小时后，采样反应混合物进行样品配制(样品调整法2)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式2)。将外温冷却至0℃，在反应液中加入N-甲基咪唑(72μL)、和5％碳酸钠水溶液(10mL)，在室温搅拌10分钟。排出水层，用2.5％氨水溶液(10mL)、5％硫酸氢钠水溶液(10mL×2)、5％碳酸钠水溶液(10mL×2)洗涤有机层。将得到的有机层在外温30℃减压浓缩干固，得到包含化合物c3的残渣1.94g、收率91.2％)を得た。
HPLC：保留时间：4.606分钟(HPLC分析条件方法1)
收率：91.2％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例59
化合物c4：2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[[1-(苄氧基羰基氨基)环戊烷羰基]-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨 基]-4-(二甲基氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰 基]-甲基-氨基]丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基- 氨基]乙酸的合成
[化学式129]
在反应容器中，加入实施例58中得到的包含化合物c3的残渣(1.41g、50.2wt％)并加入2-MeTHF(7.0mL)。在室温边搅拌边加入HMDS(579μL)后，将外温冷却至0℃，缓慢滴加TMSOTf(394μL)。升温至室温，搅拌2小时。采样反应混合物进行样品配制(样品调整法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.9％以上(反应转化率的计算式1)。将外温冷却至0℃，在反应液中滴加5％磷酸氢二钾水溶液(5.25mL)，在室温搅拌10分钟。排出水层，用5％磷酸氢二钾水溶液(5.25mL)和0.5M盐酸水溶液(3.5mL)洗涤有机层2次后，用5％氯化钠水溶液(7.0mL)洗涤，排出水层。将得到的有机层在外温30℃减压浓缩干固，得到包含化合物c4的残渣(0.85g、收率95.2％)。
LCMS(ESI)：保留时间：3.974分钟、m/z＝1228.38[M+H]+(LCMS分析条件方法1)
收率：95.2％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
实施例60
化合物c5：2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(3S)-3- [[(2S)-2-[(1-氨基环戊烷羰基)-甲基-氨基]-2-环戊基-乙酰基]-甲基-氨基]-4-(二甲基 氨基)-4-氧代-丁酰基]-甲基-氨基]-4-甲基-戊酰基]氨基]-3-甲基-戊酰基]-甲基-氨基] 丙酰基]氮杂环丁烷-2-羰基]-乙基-氨基]-3-(对甲苯基)丙酰基]-甲基-氨基]乙酸的合成
[化学式130]
在反应容器中，在室温顺次加入实施例59中得到的化合物c4(462mg、53.5wt％)和2-MeTHF(2.47mL)。在反应容器中，加入5％Pd/C(74.7mg、50％含水物)后，通过氢气进行脱气置换3次并搅拌8小时。采样反应混合物进行样品配制(样品配制法1)，进行HPLC分析确认反应转化率为99.7％(反应转化率的计算式1)。在反应混合物中加入2-MeTHF(10mL)后，应用滤纸和膜滤器过滤，用2-MeTHF(5.0mL×2)洗涤残渣。将得到的滤液减压浓缩，得到包含化合物c5的溶液(1.16g、收率91.0％)。
LCMS(ESI)：保留时间：2.920分钟、m/z＝1093.88[M+H]+(LCMS分析条件方法1)
收率：91.0％(使得到的残渣和3,5-双(三氟甲基)苯甲酸溶解于DMSO-d6，进行qNMR分析。)
化合物c5的环化反应(实施例61的反应条件研究)
将化合物c5用作起始原料，对在向化合物c6的环化反应中的缩合剂和溶剂进行研究。环化反应通过HPLC分析追踪。
[化学式131]
实施例61-1
化合物c6：(3S,6S,9S,13S,16S,25S,28S)-16-环戊基-26-乙基-9-异丁基-N,N,3, 4,10,14,17,23-八甲基-6-[(1S)-1-甲基丙基]-2,5,8,11,15,18,21,24,27-九氧代-25- (对甲苯基甲基)螺[1,4,7,10,14,17,20,23,26-九氮杂双环[26.2.0]三十烷-19,1'-环戊 烷]-13-甲酰胺的合成
在反应容器中称量化合物c5(44.19mg、21.8wt％(8.81μmol))，浓缩干固后加入溶剂(MeCN、1.9mL(200v/w))。在室温边搅拌边加入DIPEA(7.19μL(41.2μmol))。加入缩合剂(HATU、12.84mg(33.8μmol))并搅拌30分钟。用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，配制用于HPLC分析的溶液。
化合物c6的LCMS(ESI)：保留时间：17.22分钟、m/z＝1076.38[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
环状二聚体c7(c-二聚体)的LCMS(ESI)：保留时间：21.85分钟、m/z＝2151.42[M+H]+(LCMS分析条件方法5)
环状三聚体c8的LCMS(ESI)：保留时间：24.50分钟、m/z＝1614.13[M+2H]2+(LCMS分析条件方法5)
[化学式132]
应用下表所示缩合剂和溶剂，进行与实施例61-1(使用PyAOP作为缩合剂，使用2-MeTHF作为溶剂)的实验同样的操作，测定起始原料(SM、化合物c5)的消耗、目标物(TM、化合物c6)的生成、以及副产物(环状二聚体c7(c-二聚体)和环状三聚体c8(c-三聚体))的生成量，研究优选的反应条件。表中总结了起始原料：起始原料的丙酰胺体(化合物c9)：目标物：环状二聚体：环状三聚体的面积％比。
[表16]
/>
[化学式133]
实施例61-5(通过实施例61-4的反滴加法制备)
在小瓶中称量化合物c5(45.0mg、21.8wt％(8.97μmol))，浓缩干固后加入2-MeTHF(0.98mL(100v/w))，在50℃搅拌10分钟。确认原料的溶解后，加入DIPEA(7.21μL(41.2μmol))，将反应液吸入注射器。在另一反应容器中加入PyAOP(17.8mg(34.1μmol))和2-MeTHF(0.98mL(100v/w))，在室温边搅拌边经3小时滴加前述注射器内的溶液。滴加结束后，用MeCN/丙胺(9：1)的混合液(100μL)稀释反应液(50μL)，配制用于HPLC分析的溶液。
[表17]
产业上的可利用性
根据本发明，提供制备作为药物有用的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的方法，和制备该环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的制备中应用的肽化合物的方法。

Claims (16)

1.通过液相法制备环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物的方法，其包括：在包含选自1种或多种不与水混溶的溶剂、1种或多种水溶性烷基腈类、和1种或多种水溶性醚类的1个或多个的溶剂(溶剂A)中，将肽化合物的N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基连接的步骤。
2.权利要求1中所述的方法，其中，N末端的氨基酸残基与C末端的氨基酸残基通过选自酰胺键、或-(CH2)nS(CH2)m-、-(CH2)nS(O)(CH2)m-、或-(CH2)nS(O)2(CH2)m-的键连接，此处，n和m分别独立为1或2。
3.权利要求1或2中所述的方法，其中，环状肽化合物包含8～20个氨基酸残基，所述氨基酸残基的至少1个是非天然氨基酸残基。
4.权利要求1～3的任一项中所述的方法，其中，环状肽化合物包含至少1个N-取代的非天然氨基酸残基。
5.权利要求1～4的任一项中所述的方法，其中，环状肽化合物包含至少1个N-非取代的非天然氨基酸残基。
6.权利要求1～5的任一项中所述的方法，其中，C末端的氨基酸残基或N末端的氨基酸残基的一者或两者是在羧基的α位碳没有不对称碳的氨基酸残基。
7.权利要求1～6的任一项中所述的方法，其中，环状肽化合物或其盐或它们的溶剂化物是环状肽化合物的溶剂化物。
8.权利要求1～7的任一项中所述的方法，其中，环状肽化合物由下述式表示：
[化学式1]
9.权利要求1～8的任一项中所述的方法，其进一步包括通过晶析分离和/或纯化环状肽化合物，得到环状肽化合物的晶体的步骤。
10.权利要求9中所述的方法，其中，环状肽化合物的晶体是由下述式表示的环状肽化合物的非溶剂化物晶体、或溶剂化物晶体：
[化学式2]
11.权利要求10中所述的方法，其中，环状肽化合物的溶剂化物晶体是水合物晶体。
12.权利要求11中所述的方法，其中，水合物晶体是C型晶体，所述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少7个峰。
13.由下述式表示的环状肽化合物、或其盐或它们的溶剂化物的晶体：
[化学式3]
14.权利要求13中所述的晶体，其中，晶体选自非溶剂化物晶体、溶剂化物晶体、盐的晶体、和盐的溶剂化物晶体。
15.权利要求14中所述的晶体，其中，溶剂化物晶体是水合物晶体。
16.权利要求15中所述的晶体，其中，水合物晶体是C型晶体，所述C型晶体包含通过粉末X线衍射的衍射角(2θ值)为选自4.964°、7.921°、8.296°、8.855°、9.956°、10.435°、11.729°、12.704°、13.552°、13.901°、15.895°、16.643°、和17.813°(±0.2°)的至少7个峰。
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