CN115698032A

CN115698032A - 困难序列的高效的肽缩合法

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Publication number: CN115698032A
Application number: CN202180039631.2A
Authority: CN
Inventors: 岩崎浩太郎; 和田本学; 椎名淳一
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2023-02-03
Also published as: EP4144747A4; EP4144747A1; JPWO2021246471A1; TW202210498A; WO2021246471A1; US20230295221A1; KR20230019120A

Abstract

本发明发现，通过相对于追加于N末端的氨基酸或肽使用较少添加剂，即使在包含空间位阻大的氨基酸的情况下也能够高效地推进缩合反应，以高收率、高纯度获得作为目标的肽化合物。

Description

困难序列的高效的肽缩合法

技术领域

本发明涉及一种使用缩合反应的肽化合物的制造方法。

背景技术

肽是多个氨基酸连结而成的分子，在生物从事生命活动方面发挥不可欠缺的作用。随着生物学、化学的发展，对肽的理解加深，并且正在积极地进行旨在创造新型药物的天然肽的有效利用、基于肽的人工设计的功能性肽的研究、开发(非专利文献1)。尤其是报告过肽的环化、构成氨基酸的N-烷基化、特别是N-甲基化有助于膜透过性、代谢稳定性提高(非专利文献2、非专利文献3)、成为细胞内迁移、口服药的开发的关键的类药性的环状肽结构的见解、考察，该结构在肽的新药研制方面的重要性的认知度正在逐渐提高(专利文献1)。

肽的合成是通过利用酰胺键的形成延长至所期望的序列而实现的。作为更具体的方法，可以举出液相法和固相法(非专利文献4)。

其中，固相法以连结于聚合物树脂(固相合成用树脂)的原子团作为接头，由如下工序组成(非专利文献5、6)：

1)与氨基酸或肽的C末端的羧基的共价键的形成(担载工序)、

2)接在担载氨基酸或肽的N末端氨基的脱保护反应之后，反复进行与下一个序列的氨基酸的缩合反应以及达到所期望的序列为止的这些脱保护反应以及缩合反应(伸长工序)、

3)肽从固相合成用树脂的切割(脱树脂工序)。

固相法在包括使键合有目标物的固体的固相合成用树脂与溶解有脱保护反应以及缩合反应用试剂的液体的反应液接触的工序的、固体与液体的两相的反应体系中进行。由于目标物的肽键合于固相合成用树脂，因此只要在各工序间加入固相合成用树脂的清洗操作，就能够从键合有目标物的肽的固相合成用树脂中分离过量的试剂以及来源于试剂的杂质，从而能够简便地实施逐次的伸长。

作为固相法中使用的氨基酸主链N末端的氨基的保护基，广泛使用Fmoc基、Boc基。

另一方面，固相合成用树脂由与树脂中使用的聚合物键合的成为接头的原子团大致上区分，广泛使用键合有包含三苯甲基、苄基的接头原子团的固相合成用树脂。更具体而言，CTC resin、Wang resin、SASRIN resin、或Rink Amide resin等为代表性的树脂。虽然脱树脂工序主要在酸性条件下实施，然而根据接头原子团对于酸的稳定性来确定脱树脂的容易度。例如，在弱酸性试剂中也能够实施从能够以三苯甲基作为接头来键合肽的CTCresin脱除肽的脱树脂反应。另一方面，从能够以苄基作为接头来键合肽的Wang resin中脱除肽的脱树脂反应则适用强酸条件(非专利文献6)。

如前所述，无论是固相法还是液相法，肽的伸长工序都是由将氨基酸或肽的氨基与新导入的保护N末端的氨基的氨基酸的羧基脱水缩合的缩合工序、和除去新导入的N末端的氨基的保护基的脱保护工序的重复组成。在该重复工序中，若缩合反应的未达成和/或副反应的竞争不断累积，则会从作为目标的氨基酸序列的肽副生成缺损或附加氨基酸的杂质，从而有具有目标序列的肽的收率和/或纯度降低的情况。

作为在固相法的缩合反应时易于发生的副反应，报告过缩合反应的未达成，此外还报告过由羧酸的活化、反应溶液的液性引起的羧基α位的差向异构化、N末端的胍基化、或脱N-Fmoc化、它们的同时发生(非专利文献6)。其中，作为缩合反应的反应未达成的对策，有最好通过使反应时间延长而再次付诸相同条件的报告(非专利文献6)。另外，有因没有达成所期望的缩合反应的未反应的N末端的氨基与新导入的N末端的氨基受到保护的氨基酸(也称作下一个序列的氨基酸)反应而产生缺损体的情况。为了防止该缺损体的生成，使以乙酸酐或苯甲酰氯例示的酰化剂在吡啶存在下反应，由此可以将没有达成所期望的缩合反应的未反应的N末端的氨基用酰化剂封端，阻止不希望的序列的伸长(非专利文献6)。

如前所述，若使用CTC resin，则能够在温和的弱酸条件下进行肽的脱树脂反应。在使用CTC resin的肽的制造时，能够对具有在酸性下易于被除去的保护基的肽不脱除该保护基地选择性地进行脱树脂化，对于制造由所期望的保护基保护的肽而言有用(非专利文献7)。另一方面报告过，在使用CTC resin的肽的固相合成中，能够将肽在温和的条件下从CTC resin中脱树脂。因此，在缩合反应条件下，担载于CTC resin的氨基酸、或肽与resin的接头的共价键被切割，作为目标的肽的收率降低(也被称作提前裂解(prematurecleavage)、或提前肽释放(Premature peptide release)、提前酸解(prematureacidolytic cleavage))(非专利文献8)。本文献中作为担载于CTC resin的氨基酸例示出Gly、Pro、Leu，对各个氨基酸调查了与Fmoc-Gly-OH的缩合反应中的担载有氨基酸的CTCresin的稳定性。其结果是，在实施作为缩合剂添加有N,N’-二异丙基碳二亚胺、作为添加剂组合有HOAt、Oxyma、或HOBt的缩合反应的情况下，只是程度的差别，无论担载氨基酸、添加剂的种类如何，都观察到收率降低以及收率降低随时间推移增大的情况。

对于使用CTC resin的固相合成法有过如下的报告，即，DIC/K-Oxyma的缩合条件与DIC/Oxyma相比，大幅度地改善了收率，以同等以上的纯度提供髓磷脂碱性蛋白(myelinbasic protein：MBP)的部分序列(非专利文献9)。

然而根据记载，使用DIC/K-Oxyma的缩合反应中，用于生成由氨基酸和缩合剂得到的活性酯的前处理时间只是几分钟不同，C末端羰基α位的差向异构化即大幅度加剧。因而，鉴于伴随着放大所致的试剂的投入时间的延长，使用K-Oxyma的肽的固相合成法不仅有可能造成放大时的差向异构化率的增大，还有可能造成纯度的降低。

作为DIC代用试剂使用TOTU(非专利文献10)，然而由于需要碱性条件下的反应，因此有可能发生差向异构化。此外，由于TOTU是昂贵的试剂，因此成为推高制造费用的要因，所以不优选。另外，本文献中，不仅记载了提前裂解所致的收率降低，还记载了过量伸长体的副生成所致的纯度降低的事例。即记载有，在以使Gly担载于固相合成用树脂而得的Gly-OCTC作为起始原料、实施使用DIC/HOBt的Fmoc氨基酸的伸长反应时，可以获得具有Gly-Gly-OCTC的序列的副产物。该副产物被认为是在第2个残基的氨基酸的伸长反应时、担载于CTC resin的Gly残基被脱除、并与未反应的Gly-OCTC缩合而得的物质。

另外记载，通过对键合于CTC resin的Gly将第2个残基的氨基酸伸长，CTC resin上的肽对于酸的稳定性增大，然而与非专利文献8中记载的收率随着时间延长而降低的记载相反。即，可以说目前还不知晓提前裂解的有效的解决方法。根据以上的情况，在使用CTCresin的最初的伸长、即二肽合成中，收率的降低和担载氨基酸残基被过量地引入的过量伸长体副生成所致的纯度降低是应当解决的课题。

已知有在氨基酸的缩合反应中使用Oxyma作为添加剂的方法。根据记载，若使用Oxyma作为添加剂，则能够抑制差向异构化，改善酰化速度(非专利文献11)。

后述的专利文献1、2、3、4、5以及6、非专利文献12中，在基于缩合反应的肽的制造时，使用各种各样的缩合剂及添加剂。但是，这些文献中，对于以提前裂解所例示的肽的缩合反应中的课题没有记载。

专利文献1涉及提供对以往难以研制药物的tough target的有效的研制药物方法的肽的新型环化法和新型肽、包含它们的库。该文献中有以特定的比率使用试剂的实施例，然而没有出于解决以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题的目的来设定反应条件的记述。

专利文献2中，实施了使用CTC resin的肽的固相合成法。文献中仅记载，过去的制造方法中受采取伴随着肽链伸长的非典型的立体构象的影响而使副反应推进以及为了解决该问题而改良制造法。另外，由于在构成肽的氨基酸中不包含以N取代氨基酸为代表的非天然氨基酸，因此没有关于由特殊的氨基酸结构引起的缩合反应的未达成等不佳状况的记述、用于解决关于缩合反应的不佳状况的课题的记载。

专利文献3中，利用如下的方法进行使用Rink’s amide resin的肽的固相合成，即，预先实施将C末端氨基酸转换为活性酯的前处理工序(也称作预活化)，其后，向进行了前处理工序的反应液中加入固相合成用树脂。然而，专利文献3中，只不过记载了特定序列的肽(AMG416或其盐)的制造，没有公开空间位阻大的氨基酸之间的缩合反应中例示的低反应性氨基酸的伸长反应的改良。

专利文献4对脱Fmoc化反应的改良进行了记载。但是，对于以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题没有记载。另外，该文献中由于所使用的氨基酸需要大大过量，因此不适于制造包含与天然氨基酸相比难以获取的以N取代氨基酸为代表的非天然氨基酸的肽。

专利文献5中，对在固相合成中避免包含对于酸不稳定的N取代氨基酸的肽的损伤的平稳的脱树脂工序法和本脱树脂工序中未被除去的侧链官能团的保护基进行了记载。但是，对于以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题没有记载。

专利文献6中，对固相合成的脱保护工序中的脱保护剂的处理方法进行了记载。但是，对于以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题没有记载。

非专利文献12中，对不使用固相法中通用的DMF、DCM而使用环境友好性高的替代溶剂的固相法进行了记载。但是，没有记载以N取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、或β-支链氨基酸所例示的空间位阻大的氨基酸的缩合反应。

如上所示，在肽的制造时，缩合反应的收率、副反应所致的肽纯度的降低一直是已知的，而以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题在最近才为人所知。以前只是知道，在固相合成用树脂中担载有Gly、Pro以及Leu的情况下，在缩合反应中，氨基酸与固相合成用树脂的键合发生开裂，此外，在使导入了保护基的天然氨基酸相对于在固相合成用树脂中担载有Gly的Gly-OCTC发生缩合的情况下，可以得到具有与目标的氨基酸序列不同的序列的过量伸长体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2013100132

专利文献2：WO2011006644

专利文献3：WO2015154031

专利文献4：WO2017070512

专利文献5：WO2018225851

专利文献6：WO2019117274

非专利文献

非专利文献1：Future Med.Chem.,2009,1,1289-1310.

非专利文献2：Acc Chem.Res.,2008,41,1331-1342.

非专利文献3：Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52,254-269.

非专利文献4：Amino Acids,Peptides and Proteins in Organic Chemistry：Building Blocks,Catalysis and Coupling Chemistry,Volume 3,2011.

非专利文献5：Amino Acids,2018,50,39-68.

非专利文献6：Solid phase peptide synthesis(Bachem公司发行)[2020年5月28日检索]、互联网<URL：https：//www.bachem.com/fileadmin/user_upload/pdf/Catalogs_Brochures/Solid_Ph ase_Peptide_Synthesis.pdf>

非专利文献7：QSAR Comb.Sci.,2007,26,1027-1035.

非专利文献8：ACS Comb.Sci.,2013,15,229-234.

非专利文献9：Eur.J.Org.Chem.2013,6372-6378.

非专利文献10：Side Reactions in Peptide Synthesis,2015,1-31,AcademicPress.

非专利文献11：Chem.Eur.J.2009,15,9394-9403.

非专利文献12：Green.Chem.,2019,21,2594-2600.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明人等面对如下的课题，即，在将以往的肽合成中通用的固相法的缩合反应条件应用于使用CTC resin的包含非天然氨基酸的肽化合物的制造时，缩合反应的未达成、提前裂解导致大幅度的收率、纯度的降低。本发明人等发现此种缩合反应时的不佳状况不仅在非专利文献8、9、10中记载的天然α氨基酸之间的缩合反应中显著，而且在以N取代氨基酸、具有侧链的β位处的支链的氨基酸(也称作β-支链氨基酸)所例示的空间位阻大、缺乏缩合反应的反应性的序列中也显著。本发明的课题在于，提供一种方法，其在肽的固相合成法的、尤其是缩合反应的工序中，抑制提前裂解，并且还能够抑制反应的未达成、差向异构化的竞争等副反应，此外使用能够容易地获取的缩合剂和添加剂，在也能够应用于因稀有性高而优选削减使用量的非天然氨基酸的缩合条件下，以高收率制造高纯度的肽化合物。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题，主要深入研究了如下的1残基+1残基合成，即，使第二氨基酸与在固相合成用树脂担载有N取代氨基酸的第一氨基酸缩合，得到2残基的肽。在使用了肽合成中通用的作为缩合剂的以DIC所例示的碳二亚胺化合物与作为添加剂的以Oxyma所例示的N-羟基化合物的缩合反应中，以相同的当量比使用所导入的氨基酸、缩合剂以及添加剂被视为通用条件。但是，在该通用条件下，无法解决以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题。为了解决该课题而进行了深入研究，本发明人等研究了缩合剂以及添加剂各自相对于第一氨基酸或肽和/或第二氨基酸或肽的当量比的变更，结果发现了解决以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题的方法。

即发现如下的方法，在使因空间位阻大而难以推进酰胺化反应的序列、具体而言是N取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、β-支链氨基酸、或侧链体积大的氨基酸缩合而伸长氨基酸的缩合反应中，使用基于第一氨基酸或肽和/或第二氨基酸或肽计算出的摩尔比的缩合剂以及添加剂。发现本发明的方法在其一个方面中，解决以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题。此外发现，本发明的方法在其一个方面中能够制造具有目标的序列的肽化合物。此外发现，本发明的方法在其一个方面中，能够以高收率进行目标缩合反应。此外发现，本发明的方法在其一个方面中，能够抑制以差向异构化所例示的副反应。此外发现，本发明的方法在其一个方面中，由于酰胺化反应以充分的转换率推进，因此能够以高收率、高纯度得到作为目标的肽化合物。

具体而言，发现变更添加剂相对于追加于N末端的氨基酸或肽(即第二氨基酸或肽)的摩尔比是有效的，特别是最好相对于追加于N末端的氨基酸或肽较少地使用添加剂。此外发现，变更缩合剂的摩尔比也是有效的，特别是最好相对于追加于N末端的氨基酸或肽过量地使用缩合剂。此外发现，变更缩合剂和添加剂双方的摩尔比更加有效。发现本发明的方法不仅在空间位阻大的氨基酸或肽的缩合中，而且在空间位阻小的氨基酸或肽的缩合反应中，酰胺化反应也以充分的转换率推进，能够以高收率、高纯度得到作为目标的肽化合物。

即，本发明在非限定的具体的一个方式中包含以下内容。

〔1〕一种方法，是包括使第一氨基酸或肽与第二氨基酸或肽在添加剂及缩合剂的存在下缩合而得到缩合体的工序的制造肽化合物的方法，

添加剂的摩尔数少于第二氨基酸或肽的摩尔数。

〔2〕根据〔1〕中记载的方法，其中，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为0.8以下。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕中记载的方法，其中，缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为1.0以上。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项记载的方法，其中，缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为1.2～4.0。

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为10以下。

〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1～2，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为0.7以下。

〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比(第1摩尔比)为2以上，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为第1摩尔比－1以下。

〔8〕根据〔1〕～〔7〕中任一项记载的方法，其中，添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为2.0以下。

〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项记载的方法，其中，缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1.3以上。

〔10〕根据〔1〕中记载的方法，其中，第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂的摩尔比为第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约2：约4～6：约1。

〔11〕根据〔1〕中记载的方法，其中，第一氨基酸或肽、第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂的摩尔比为第一氨基酸或肽：第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约1：约2：约4：约1、约1：约2.4：约7.2：约1.2、或约1：约3：约6：约1.5。

〔12〕根据〔1〕～〔11〕中任一项记载的方法，其中，添加剂为Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt。

〔13〕根据〔1〕～〔12〕中任一项记载的方法，其中，缩合剂为DIC、DCC、EDCI、或EDCI·HCl。

〔14〕根据〔1〕～〔13〕中任一项记载的方法其中，添加剂为Oxyma。

〔15〕根据〔1〕～〔14〕中任一项记载的方法，其中，上述肽化合物为上述缩合体、或上述肽化合物在其结构中包含上述缩合体。

〔16〕根据〔1〕～〔15〕中任一项记载的方法，其以固相法进行。

〔17〕根据〔1〕～〔16〕中任一项记载的方法，其中，第一氨基酸或肽担载于固相合成用树脂。

〔18〕根据〔17〕中记载的方法，其中，固相合成用树脂为三苯甲基系树脂。

〔19〕根据〔18〕中记载的方法，其中，三苯甲基系树脂为CTC resin、Mmt resin、或Mtt resin。

〔20〕根据〔1〕～〔19〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或肽的氨基由保护基保护。

〔21〕根据〔20〕中记载的方法，其中，保护基为具有Fmoc骨架的保护基。

〔22〕根据〔1〕～〔21〕中任一项记载的制造方法，其中，上述工序在选自DMF、NMP、DMI、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、碳酸二甲酯以及乙腈中的溶剂中进行。

〔23〕根据〔17〕～〔22〕中任一项记载的方法，其中，还包括除去固相合成用树脂的工序。

〔24〕根据〔20〕～〔23〕中任一项记载的方法，其中，还包括除去保护基的工序。

〔25〕根据〔1〕～〔24〕中任一项记载的方法，其中，第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸和/或第一肽的C末端的氨基酸为N-烷基氨基酸。

〔26〕根据〔24〕中记载的方法，其中，第一氨基酸或第一肽的C末端的氨基酸为N-烷基β氨基酸。

〔27〕根据〔25〕中记载的方法，其中，第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸和/或第一肽的C末端的氨基酸以下式表示：

式中，

在第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₁为氢，在第一肽的C末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₁表示与相邻的氨基酸的键合点，

P₁₁为氢或C₁-C₆烷基，并且R₁₂为氢、CONR_12AR_12B、COOR_12c、C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₇-C₁₄芳烷基、5～10元杂芳基C₁-C₆烷基、保护5～10元杂芳基C₁-C₆烷基、C₁-C₆羟基烷基、保护C₁-C₆羟基烷基、C₁-C₆羧基烷基、保护C₁-C₆羧基烷基、C₁-C₆氨基烷基、保护C₁-C₆氨基烷基、C₁-C₆烷硫基C₁-C₆烷基、或者

P₁₁及R₁₂与P₁₁所键合的氮原子及R₁₂所键合的碳原子一起形成4～7元饱和杂环，

Q₁₂为氢、或C₁-C₆烷基，

R_12A及R_12B独立地为C₁-C₄烷基、或R_12A及R_12B与它们所键合的氮原子一起形成可以包含1个或多个追加的杂原子的4～8元环，

L₁₁为单键或-CH₂-，

在第一氨基酸或第一肽的C末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₃是指与固相合成用树脂的键合点，在第一肽的N末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₃是指与相邻的氨基酸的键合点。

〔28〕根据〔27〕中记载的方法，其中，第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸和/或第一肽的C末端的氨基酸为MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、MeAsp-NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly(cPent)、MeChg、MePhe、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、MeMet、Aze(2)、或Aib。

〔29〕根据〔1〕～〔28〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或第二肽的C末端的氨基酸为α,α-二取代氨基酸、β-支链氨基酸、N-烷基氨基酸、或其他的具有碳数2以上的侧链的氨基酸。

〔30〕根据〔29〕中记载的方法，其中，β-支链氨基酸以下式表示：

式中，

P₂₁为氢或C₁-C₆烷基，

R₂₁及R₂₂各自独立地为C₁-C₄烷基、C₁-C₆烷氧基、或C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基，或者R₂₁及R₂₂与它们所键合的碳一起形成3～8元脂环式环，

在第二氨基酸为以式(2A)表示的氨基酸的情况下，R₂₃是指氨基的与保护基的键合点，在第二肽的C末端的氨基酸为以式(2A)表示的氨基酸的情况下，R₂₃是指与相邻的氨基酸的键合点。

〔31〕根据〔30〕中记载的方法，其中，β-支链氨基酸为MeVal、D-MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly(cPent)、Gly(cPent)、MeGly(cBu)、Gly(cBu)、MeGly(cPr)、Gly(cPr)、MeThr(tBu)、或Thr(tBu)。

〔32〕根据〔29〕中记载的方法，其中，α,α-二取代氨基酸以下式表示：

式中，

P₂₂为氢或C₁-C₆烷基，

R₂₃及R₂₄从C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、或可以被取代的C₇-C₁₄芳烷基中独立地选择，或者R₂₃及R₂₄与它们所键合的碳原子一起形成3～8元脂环式环或4～7元饱和杂环，

在第二氨基酸为以式(2B)表示的氨基酸的情况下，R₂₅是指氨基的与保护基的键合点，在第二肽的C末端的氨基酸为以式(2B)表示的氨基酸的情况下，R₂₅是指与相邻的氨基酸的键合点。

〔33〕根据〔32〕中记载的方法，其中，α,α-二取代氨基酸为Aib、(Me)Abu、(Me)Leu、(Me)Algly、(Me)Phe、(Me)Phe(3-I)、1-ACPrC、cVal、cLeu、cHex、或Athpc。

〔34〕根据〔1〕～〔33〕中任一项记载的方法，其中，第二氨基酸或第二肽的C末端的氨基酸为N-烷基氨基酸。

〔35〕根据〔34〕中记载的方法，其中，N-烷基氨基酸为MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze(2)、Pro、MeAsp-NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly(cPent)、MeGly(cBu)、MeGly(cPr)、MeThr(tBu)、D-MeVal、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、或MeMet。

〔36〕根据〔29〕中记载的方法，其中，其他的具有碳数2以上的侧链的氨基酸为Lys(Z)、Glu(OBzl)、或Ser(tBu)。

〔37〕一种环状肽化合物的制造方法，其包括利用〔1〕～〔36〕中任一项记载的方法得到肽化合物的工序、以及将该肽化合物环化的工序。

发明效果

利用本发明，能够高效地制造包含缺乏缩合反应的反应性的序列的肽化合物。具体而言，能够提高包括肽化合物的收率、纯度在内的生产率。即，本发明的方法在其一个方面中，不仅有提前裂解的抑制效果，即使是包含应用以往方法时不能达成缩合反应的氨基酸序列的肽化合物、包含差向异构化拮抗的氨基酸序列的肽化合物也能够制造，因此能够提高肽化合物的收率和/或纯度。另外，本发明的方法在其一个方面中，即使延长缩合反应时间，也能够将副反应抑制在最小限度，并且/或者能够以最低限度的量使用追加于N末端的氨基酸或肽来完结反应，因此能够减少其使用量。本发明的方法中，即使减少试剂的量也会完结反应，因此与以往方法不同，无需使用过多量的试剂、或实施重复相同条件的双重偶联(double coupling)。其结果是，即使在使用酰胺化的难度高的氨基酸、肽时，也能够将试剂的量抑制为最小限度。这是特别适于合成包含高价且稀少的非天然氨基酸残基的肽化合物的方法。另外，在一个方面中，本发明的方法与以往方法相比，削减缩合时的溶剂，以高浓度实施反应时的反应促进效果大，所使用的氨基酸量也能够削减，因此不仅当然能够削减缩合时所必需的溶剂量，还能够削减缩合后的试剂清洗所必需的溶剂量。

此外已知，在超过以往方法中经过最佳化的量地在各种固相合成用树脂担载氨基酸的情况下，若是以往方法，则缩合反应不会完结，或者副反应变得显著。然而，即使在使用此种量的情况下，若应用本发明的一个方式，则能够完结反应。因而，能够增加在一次基于固相法的制造中能够产生的肽的量。

本发明能够在解决以提前裂解所例示的肽的缩合反应中特有的课题的同时，充分地消耗担载于树脂的氨基酸或肽地进行担载于三苯甲基系树脂(例如CTC resin)的氨基酸或肽与所要伸长的氨基酸或肽的缩合反应，能够将起始原料高效地转换为目标物。

具体实施方式

将本说明书中使用的缩写词记述如下。

A％：area％

Alloc：烯丙氧羰基

Aze：氮杂环丁烷基

Boc：叔丁氧羰基

Cbz：苄氧羰基

COMU：(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉基-碳鎓六氟磷酸盐

CTC：2-氯三苯甲基

CTC resin：Cl-Trt(2-Cl)resin

DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺

DCM：二氯甲烷

DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺

DMA：N,N-二甲基乙酰胺

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMI：1,3-二甲基-2-咪唑烷酮

EDCI：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺

Fmoc：9-芴基甲氧羰基

HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

HMDS：1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷

HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

HPLC：高效液相色谱

iPr₂NEt：N,N-二异丙基乙基胺

K-Oxyma：氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯钾盐

MeCN：乙腈

MeOH：甲醇

2-MeTHF：2-甲基四氢呋喃

Mmt resin：4-甲氧基三苯基氯甲烷resin

Mor：吗啉基

MTBE：甲基叔丁基醚

Mtt resin：4-甲基三苯基氯甲烷resin

NMP：N-甲基-2-吡咯烷酮

Oxyma：氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯

PDA：光电二极管阵列检测器

Pip：哌啶基

Pyrro：吡咯烷基

t-Bu：叔丁基

Teoc：2-(三甲基硅基)乙氧基羰基

TFA：三氟乙酸

TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅脂

TMU：四甲基脲

TOTU：O-[(乙氧基羰基)氰基甲胺]-N,N,N',N'-四甲基硫脲四氟硼酸盐

将本说明书中使用的β-支链氨基酸、α,α-二取代氨基酸以及N-烷基氨基酸的缩略语与其结构的关系表示如下。需要说明的是，以下的表中将各氨基酸以利用Fmoc基保护氨基的形式列举，然而也可以根据以下的表来把握被除去Fmoc基后具有游离的氨基的各氨基酸、其残基的缩略语与它们的结构的关系。具体而言，例如，对于本领域技术人员显而易见，MeAsp(OH)-pip为具有从下述表的Fmoc-MeAsp(OH)-pip中除去Fmoc基后的以下的结构的氨基酸，对于本领域技术人员而言作为其氨基酸残基的MeAsp-pip的结构也是显而易见的。

[表1-1]

[表1-2]

(官能团等的定义)

作为本说明书中的“卤素原子”，可以例示出F、Cl、Br或I。

本说明书中所谓“烷基”，是从脂肪族烃中去掉1个任意的氢原子后衍生的1价的基团，在骨架中不含有杂原子(是指碳及氢原子以外的原子。)或不饱和的碳-碳键，而是含有氢及碳原子，具有烃基或烃基结构的部分集合。烷基不仅包括直链状的基团，还包括支链状的基团。作为烷基，具体而言，可以举出碳原子数1～20(C₁-C₂₀、以下所谓“C_p-C_q”是指碳原子数为p～q个)的烷基，优选举出C₁-C₁₀烷基，更优选举出C₁-C₆烷基。作为烷基，具体而言，可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基(2-甲基丙基)、正戊基、仲戊基(1-甲基丁基)、叔戊基(1,1-二甲基丙基)、新戊基(2,2-二甲基丙基)、异戊基(3-甲基丁基)、3-戊基(1-乙基丙基)、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、正己基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2,2-四甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基等。

本说明书中所谓“烯基”，是具有至少1个双键(2个相邻SP²碳原子)的1价的基团。根据双键及取代组分(存在时)的配置不同，双键的几何学的形态可以采取异侧(E)或同侧(Z)、顺式或反式配置。烯基不仅包括直链状的基团，还包括支链状的基团。作为烯基优选举出C₂-C₁₀烯基，更优选举出C₂-C₆烯基，具体而言，例如可以举出乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基(包括顺式、反式)、3-丁烯基、戊烯基、3-甲基-2-丁烯基、己烯基等。

本说明书中所谓“炔基”，是具有至少1个三键(2个相邻SP碳原子)的1价的基团。炔基不仅包括直链状的基团，还包括支链状的基团。作为炔基优选举出C₂-C₁₀炔基，更优选举出C₂-C₆炔基，具体而言，例如可以举出乙炔基、1-丙炔基、炔丙基、3-丁炔基、戊炔基、己炔基、3-苯基-2-丙炔基、3-(2'-氟苯基)-2-丙炔基、2-羟基-2-丙炔基、3-(3-氟苯基)-2-丙炔基、3-甲基-(5-苯基)-4-戊炔基等。

本说明书中所谓“环烷基”，是指饱和或部分地饱和的环状的1价的脂肪族烃基，包括单环、双环、螺环。作为环烷基优选举出C₃-C₈环烷基，具体而言，例如可以举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、双环[2.2.1]庚基、螺[3.3]庚基等。

本说明书中所谓“芳基”是指1价的芳香族烃环，优选举出C₆-C₁₀芳基。作为芳基，具体而言，例如可以举出苯基、萘基(例如1-萘基、2-萘基)等。

本说明书中所谓“杂环基”，是指在碳原子的基础上还含有1～5个杂原子的非芳香族的环状的1价的基团。杂环基可以在环中具有双键和/或三键，环中的碳原子可以被氧化而形成羰基，可以是单环，也可以是稠合环。构成环的原子的数优选为4～10(4～10元杂环基)，更优选为4～7(4～7元杂环基)。作为杂环基，具体而言，例如可以举出氮杂环丁基、氧杂环丁基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1,2-噻嗪、噻二唑烷基(thiadiazolidinyl)、氮杂环丁基、噁唑烷酮、苯并二噁烷基、苯并噁唑基、二氧杂环戊基、二氧杂环己基、四氢螺[1,2-c]咪唑、硫化环丙基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚基、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛基、磺内酰胺、2-氧杂螺[3.3]庚基等。

本说明书中所谓“杂芳基”，是指在碳原子的基础上还含有1～5个杂原子的芳香族性的环状的1价的基团。环可以是单环，也可以是与其他环的稠合环，也可以部分地饱和。构成环的原子的数优选为5～10(5～10元杂芳基)，更优选为5～7(5～7元杂芳基)。作为杂芳基，具体而言，例如可以举出呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、苯并二氧杂环戊基、吲嗪基、咪唑并吡啶基等。

本说明书中所谓“烷氧基”，是指键合有上述定义的“烷基”的氧基，优选举出C₁-C₆烷氧基。作为烷氧基，具体而言，例如可以举出甲氧基、乙氧基、1-丙氧基、2-丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、3-甲基丁氧基等。

本说明书中所谓“烷硫基”，是指键合有上述定义的“烷基”的硫基，优选举出C₁-C₆烷硫基。作为烷氧基，具体而言，例如可以举出甲硫基、乙硫基、1-丙硫基、2-丙硫基、正丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基等。

本说明书中所谓“氨基”，狭义地是指-NH₂，广义地是指-NRR’，此处R及R’独立地从氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、或杂芳基中选择，或者R及R’与它们所键合的氮原子一起形成环。作为氨基，优选举出-NH₂、单C₁-C₆烷基氨基、二C₁-C₆烷基氨基、4～8元环状氨基等。

本说明书中的“酰基(烷酰基)”是指在氢或上述“烷基”键合羰基而得的基团，优选举出C₁-C₆酰基，更优选举出C₂-C₄酰基。作为酰基，具体而言，可以例示出甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等。

本说明书中所谓“环烷氧基”，是指键合有上述定义的“环烷基”的氧基，优选举出C₃-C₈环烷氧基。作为环烷氧基，具体而言，例如可以举出环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基等。

本说明书中所谓“烷基磺酰基”，是指键合有上述定义的“烷基”的磺酰基，优选举出C₁-C₆烷基磺酰基。作为烷基磺酰基，具体而言，例如可以举出甲基磺酰基等。

本说明书中的所谓“羟基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个、或多个氢由羟基取代的基团，优选C₁-C₆羟基烷基。作为羟基烷基，具体而言，例如可以举出羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、2-羟基-2-甲基丙基、5-羟基戊基等。

本说明书中的所谓“羧基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个、或多个氢由羧基取代的基团，优选C₁-C₆羧基烷基。作为羧基烷基，具体而言，例如可以举出羧基甲基、1-羧基乙基、2-羧基乙基等。

本说明书中所谓“保护羧基烷基”，是指上述定义的“羧基烷基”中含有的羧基由任意的保护基保护的基团。作为羧基的保护基，具体而言，可以举出甲基、乙基、叔丁基、苄基、三苯甲基、异丙苯基、甲氧基三苯甲基、2-(三甲基硅基)乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基等。

本说明书中的所谓“氨基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“氨基”取代的基团，优选C₁-C₆氨基烷基。作为氨基烷基，具体而言，例如可以举出1-吡啶基甲基、2-(1-哌啶基)乙基、3-(1-哌啶基)丙基、4-氨基丁基等。

本说明书中所谓“保护氨基烷基”，是指上述定义的“氨基烷基”中含有的氨基由任意的保护基保护的基团。作为氨基的保护基，具体而言，可以举出Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙酰基、五氟丙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基、2,4-二硝基苯磺酰基等。

本说明书中的所谓“卤代烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由卤素取代的基团，优选C₁-C₆卤代烷基，更优选C₁-C₆氟烷基。作为卤代烷基，具体而言，例如可以举出二氟甲基、三氟甲基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3-二氟丙基、4,4-二氟丁基、5,5-二氟戊基等。

本说明书中的所谓“烷氧基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“烷氧基”取代的基团，优选C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基，更优选C₁-C₆烷氧基C₁-C₂烷基。作为烷氧基烷基，具体而言，例如可以举出甲氧基甲基、乙氧基甲基、1-丙氧基甲基、2-丙氧基甲基、正丁氧基甲基、异丁氧基甲基、仲丁氧基甲基、叔丁氧基甲基、戊氧基甲基、3-甲基丁氧基甲基、1-甲氧基乙基、2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基等。

本说明书中的所谓“烷硫基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“烷硫基”取代的基团，优选C₁-C₆烷硫基C₁-C₆烷基，更优选C₁-C₆烷硫基C₁-C₂烷基。作为烷硫基烷基，具体而言，例如可以举出甲硫基甲基、乙硫基甲基、1-丙硫基甲基、2-丙硫基甲基、正丁硫基甲基、异丁硫基甲基、仲丁硫基甲基、叔丁硫基甲基、1-甲硫基乙基、2-乙硫基乙基等。

本说明书中的所谓“卤代烷氧基”，是指上述定义的“烷氧基”的1个或多个氢由卤素取代的基团，优选C₁-C₆卤代烷氧基。作为卤代烷氧基，具体而言，例如可以举出二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2-二氟乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基等。

本说明书中的所谓“卤代酰基(卤代烷酰基)”，是指在上述“卤代烷基”键合羰基而得的基团，优选举出C₂-C₆卤代酰基，更优选举出C₂-C₄卤代酰基。作为卤代酰基，具体而言，可以例示出三氟乙酰基、三氯乙酰基、五氟丙酰基、2,3,3,3-四氟-2-(三氟甲基)丙酰基、3,3,3-三氟-2-(三氟甲基)丙酰基等。

本说明书中的所谓“环烷基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“环烷基”取代的基团，优选C₃-C₈环烷基C₁-C₆烷基，更优选C₃-C₆环烷基C₁-C₂烷基。作为环烷基烷基，具体而言，例如可以举出环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。

本说明书中的所谓“环烷氧基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“环烷氧基”取代的基团，优选C₃-C₈环烷氧基C₁-C₆烷基，更优选C₃-C₆环烷氧基C₁-C₂烷基。作为环烷氧基烷基，具体而言，例如可以举出环丙氧基甲基、环丁氧基甲基等。

本说明书中的所谓“烷基磺酰基烷基”，是指上述定义的“烷基”的1个或多个氢由上述定义的“烷基磺酰基”取代的基团，优选C₁-C₆烷基磺酰基C₁-C₆烷基，更优选C₁-C₆烷基磺酰基C₁-C₂烷基。作为烷基磺酰基烷基，具体而言，例如可以举出甲基磺酰基甲基、2-(甲基磺酰基)乙基等。

本说明书中所谓“芳烷基(芳基烷基)”，是指上述定义的“烷基”的至少一个氢原子由上述定义的“芳基”取代的基团，优选C₇-C₁₄芳烷基，更优选C₇-C₁₀芳烷基。作为芳烷基，具体而言，例如可以举出苄基、苯乙基、3-苯基丙基等。

本说明书中所谓“杂芳基烷基”，是指上述定义的“烷基”的至少一个氢原子由上述定义的“杂芳基”取代的基团，优选5～10元杂芳基C₁-C₆烷基，更优选5～10元杂芳基C₁-C₂烷基。作为杂芳基烷基，具体而言，例如可以举出3-噻吩基甲基、4-噻唑基甲基、2-吡啶基甲基、3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基、2-(2-吡啶基)乙基、2-(3-吡啶基)乙基、2-(4-吡啶基)乙基、2-(6-喹啉基)乙基、2-(7-喹啉基)乙基、2-(6-吲哚基)乙基、2-(5-吲哚基)乙基、2-(5-苯并呋喃基)乙基等。

本说明书中所谓“保护杂芳基烷基”，是指上述定义的“杂芳基烷基”中含有的1个或多个官能团、例如氨基由任意的保护基保护的基团。作为保护基，具体而言，可以举出Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙酰基、五氟丙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基、2,4-二硝基苯磺酰基等。

本说明书中作为“羧基的保护基”，可以举出烷基酯型的保护基、苄基酯型的保护基、经过取代的烷基酯型的保护基等。作为羧基的保护基，具体而言，可以例示出甲基、乙基、叔丁基、苄基、三苯甲基、异丙苯基、甲氧基三苯甲基、2-(三甲基硅基)乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基等。

本说明书中作为“氨基的保护基”，可以举出氨基甲酸酯型的保护基、酰胺型的保护基、酰亚胺型的保护基、磺酰胺型的保护基等。作为氨基的保护基，具体而言，可以例示出Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙酰基、五氟丙酰基、邻苯二甲酰基、甲苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基、2,4-二硝基苯磺酰基等。

本说明书中的“脂环式环”是指非芳香族烃环。脂环式环可以在环中具有不饱和键，可以是具有2个以上的环的多环性的环。另外，构成环的碳原子可以被氧化而形成羰基。作为脂环式环，优选举出3～8元脂环式环，具体而言，例如可以举出环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环庚烷环、环辛烷环、双环[2.2.1]庚烷环等。

本说明书中的“饱和杂环”，是指在碳原子的基础上还含有1～5个杂原子、在环中不包含双键和/或三键的非芳香族的杂环。饱和杂环可以是单环，也可以与其他的环、例如苯环等芳香环形成稠合环。作为饱和杂环，优选举出4～7元饱和杂环，具体而言，例如可以举出氮杂环丁烷环、氧杂环丁烷环、四氢呋喃环、四氢吡喃环、吗啉环、硫代吗啉环、吡咯烷环、4-氧杂吡咯烷环、哌啶环、4-氧杂哌啶环、哌嗪环、吡唑烷环、咪唑烷环、噁唑烷环、异噁唑烷环、噻唑烷环、异噻唑烷环、噻二唑烷环、唑烷酮环、二氧戊环、二噁烷环、硫杂环丁烷环、八氢吲哚环、吲哚啉环等。

本说明书中，所谓“肽”，是指将1个或其以上的天然氨基酸和/或非天然氨基酸利用酰胺键和/或酯键连结的肽。作为肽，优选为包含1～15个氨基酸残基的肽，更优选为包含5～12个氨基酸残基的肽。

本说明书中的“肽化合物”，只要是将天然氨基酸和/或非天然氨基酸利用酰胺键或酯键连结的肽化合物，就没有特别限定，然而优选为5～30残基、更优选为8～15残基、进一步优选为9～13残基的肽化合物。本发明中合成的肽化合物优选在1个肽中包含至少3个N取代氨基酸，更优选包含至少5个以上的N取代氨基酸。这些N取代氨基酸可以在肽化合物中连续地存在，也可以不连续地存在。本发明的肽化合物可以是直链状，也可以是环状，优选环状肽化合物。

本说明书中的“环状肽化合物”是能够通过将直链肽化合物的N末端侧的基团与C末端侧的基团环化而得到的环状的肽化合物。环化无论是基于酰胺键之类的碳-氮键的环化、基于酯键、醚键之类的碳-氧键的环化、基于硫醚键之类的碳-硫键的环化、基于碳-碳键的环化、或基于杂环结构的环化等哪种形态都可以。它们当中，优选借助酰胺键或碳-碳键等共价键的环化，更优选借助基于侧链的羧基与N末端的主链的氨基的酰胺键的环化。环化中使用的羧基、氨基等的位置可以是主链上的位置，也可以是侧链上的位置，只要处于能够环化的位置，就没有特别限制。

肽化合物的所谓“环化”，是指形成包含4个以上的氨基酸残基的环状部。本说明书中的环状肽化合物的环状部中含有的氨基酸的个数没有特别限定，可以例示出4～20残基、5～15残基、6～13残基。将直链状的肽化合物转换为环状肽化合物的方法可以通过利用Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional GroupPreparations,3^rd Edition、(R.C.Larock著)、或March's Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms,and Structure、7^th Edition、(M.B.Smith,J.March著)等中记载的方法在分子内进行成键反应来实施。也可以在成键反应后进一步进行官能团转换反应。成键反应可以例示出由羧酸和胺形成的C(O)-N键、利用氧原子的C-O-C键、C(O)-O键、C(S)-O键、利用硫原子的C(O)-S键、C(S)-S键、C-S-S-C键、C-S-C键、C-S(O)-C键、C-S(O2)-C键、利用氮原子的C-N-C键、C＝N-C键、N-C(O)-N键、N-C(S)N键、C(S)-N键等。此外，可以举出铃木反应、Heck反应、Sonogashira反应等以过渡金属作为催化剂的C-C键的形成反应等。作为在成键反应后进一步进行的官能团转换反应，可以例示出氧化反应或还原反应。具体而言，可以例示出将硫原子氧化而转换为亚砜基、砜基的反应。另外，可以例示出将碳-碳键当中的三键、双键还原而转换为双键或单键的还原反应。若2个氨基酸在氨基酸的主链中键合，则可以利用肽键形成闭环结构，然而也可以利用2个氨基酸的侧链之间、侧链与主链的键合等形成2个氨基酸间的共价键。

本说明书中所谓“1个或多个”，是指1个或2个以上的数。在涉及某个基团的取代基的上下文中使用“1个或多个”的情况下，该术语是指从1个到该基团所容许的取代基的最大数目的数。作为“1个或多个”，具体而言，例如可以举出1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和/或更大的数。

本说明书中“固相合成用树脂”只要是能够在基于固相法的肽化合物的合成中使用的树脂，就没有特别限定。作为此种固相合成用树脂，具体而言，例如可以举出CTCresin、NovaSyn TGT resin(TGT resin)、Wang resin、SASRIN resin、三苯基氯甲烷resin(Trt resin)、4-甲基三苯基氯甲烷resin(Mtt resin)、4-甲氧基三苯基氯甲烷resin(Mmtresin)等能够在酸性条件下除去的树脂。树脂可以根据所用的氨基酸的官能团恰当地选择。例如，在使用羧基(主链羧基、或以Asp、Glu代表的侧链羧基)、或芳香环上的羟基(以Tyr代表的酚基)作为氨基酸的官能团的情况下，优选使用三苯基氯甲烷resin(Trt resin)或2-氯三苯基氯甲烷resin(CTC resin)作为树脂。在使用脂肪族羟基(以Ser、Thr代表的脂肪族醇基)作为氨基酸的官能团的情况下，优选使用三苯基氯甲烷resin(Trt resin)、2-氯三苯基氯甲烷resin(CTC resin)或4-甲基三苯基氯甲烷resin(Mtt resin)作为树脂。需要说明的是，本说明书中，有时也将树脂记作resin。

对于构成树脂的聚合物的种类也没有特别限定。在由聚苯乙烯形成的树脂的情况下，可以使用100-200目或200-400目的任一者。另外，对于交联率也没有特别限定，优选交联1％DVB(二乙烯基苯)的树脂。另外，作为构成树脂的聚合物的种类，可以举出TentaGel(注册商标)、或ChemMatrix(注册商标)。

在本说明书中记载的化合物的制造中，在定义了的基团在实施方法的条件下受到不希望的化学转换的情况下，例如可以通过使用官能团的保护、脱保护等方法来制造该化合物。此处保护基的选择及脱除操作例如可以举出《Greene’s,“Protective Groups inOrganic Synthesis”(第5版，John Wiley&Sons 2014)》中记载的方法，只要根据反应条件恰当地使用这些方法即可。另外，根据需要也可以改变取代基导入等反应工序的顺序。

本说明书中，在附加有“可以被取代的”这样的修饰语句的情况下，作为其取代基，例如可以例示出烷基、烷氧基、氟烷基、氟烷氧基、氧杂、氨基羰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基、芳基烷基、杂芳基烷基、卤素、硝基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、氰基、羧基、烷氧基羰基、甲酰基等。

可以进一步向它们分别附加取代基，这些取代基也不受限制，例如可以从包含卤素原子、氧原子、硫原子、氮原子、硼原子、硅原子、或磷原子的任意的取代基中独立地自由选择1个或2个以上。即，可以例示出可以被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等。

本说明书中记载的化合物可以是其盐或它们的溶剂合物。在化合物的盐中，例如包含盐酸盐；氢溴酸盐；氢碘酸盐；磷酸盐；膦酸盐；硫酸盐；甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐；乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、水杨酸盐等羧酸盐；或钠盐、钾盐等碱金属盐；镁盐、钙盐等碱土金属盐；铵盐、烷基铵盐、二烷基铵盐、三烷基铵盐、四烷基铵盐等铵盐等。这些盐例如可以通过使化合物与酸或碱接触来制造。所谓化合物的溶剂合物，是指溶液中溶质分子吸引溶剂分子而形成一个分子集团的现象，若溶剂为水则称作水合物。本说明书中记载的化合物可以是与选自醇(例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇等)、二甲基甲酰胺、或二甘醇二甲醚等有机溶剂、或水等中的单独的溶剂的溶剂合物，也可以是与多种溶剂的溶剂合物。

本说明书中的“氨基酸”中，包含天然氨基酸及非天然氨基酸(有时称作氨基酸衍生物)。另外，本说明书中有时“氨基酸”是指氨基酸残基。本说明书中的所谓“天然氨基酸”，是指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。非天然氨基酸(氨基酸衍生物)没有特别限定，然而可以例示出β-氨基酸、D型氨基酸、N取代氨基酸、α,α-二取代氨基酸、侧链与天然氨基酸不同的氨基酸、羟基羧酸等。作为本说明书中的氨基酸，容许任意的立体配置。氨基酸的侧链的选择没有特别设置限制，除了可以选择氢原子以外，例如还可以从烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基、发生螺环键合的环烷基中自由地选择。各自可以附加取代基，这些取代基也没有限制，例如可以从包含卤素原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子、或P原子的任意的取代基中独立地自由选择1个或2个以上。即，可以例示出可以被取代的烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基等、或氧杂、氨基羰基、卤素原子等。在非限定的一个方式中，本说明书中的氨基酸可以是在同一分子内具有羧基和氨基的化合物(在该情况下，脯氨酸、羟基脯氨酸之类的亚氨基酸也包含于氨基酸中)。

作为来源于卤素的取代基，可以举出氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)、碘(-I)等。

作为来源于O原子的取代基，可以举出羟基(-OH)、氧基(-OR)、羰基(-C＝O-R)、羧基(-CO₂H)、氧基羰基(-C＝O-OR)、羰氧基(-O-C＝O-R)、硫代羰基(-C＝O-SR)、羰基硫基(-S-C＝O-R)、氨基羰基(-C＝O-NHR)、羰基氨基(-NH-C＝O-R)、氧基羰基氨基(-NH-C＝O-OR)、磺酰基氨基(-NH-SO₂-R)、氨基磺酰基(-SO₂-NHR)、氨磺酰基氨基(-NH-SO₂-NHR)、硫代羧基(-C(＝O)-SH)、羧基羰基(-C(＝O)-CO₂H)。

作为氧基(-OR)的例子，可以举出烷氧基、环烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、杂芳氧基、芳烷氧基等。

作为羰基(-C＝O-R)的例子，可以举出甲酰基(-C＝O-H)、烷基羰基、环烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、芳烷基羰基等。

作为氧基羰基(-C＝O-OR)的例子，可以举出烷氧基羰基、环烷氧基羰基、烯氧基羰基、炔氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、芳烷氧基羰基等。

作为羰氧基(-O-C＝O-R)的例子，可以举出烷基羰氧基、环烷基羰氧基、烯基羰氧基、炔基羰氧基、芳基羰氧基、杂芳基羰氧基、芳烷基羰氧基等。

作为硫代羰基(-C＝O-SR)的例子，可以举出烷硫基羰基、环烷硫基羰基、烯硫基羰基、炔硫基羰基、芳硫基羰基、杂芳硫基羰基、芳烷硫基羰基等。

作为羰基硫基(-S-C＝O-R)的例子，可以举出烷基羰基硫基、环烷基羰基硫基、烯基羰基硫基、炔基羰基硫基、芳基羰基硫基、杂芳基羰基硫基、芳烷基羰基硫基等。

作为氨基羰基(-C＝O-NHR)的例子，可以举出烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、炔基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、芳烷基氨基羰基等。在它们以外，还可以举出-C＝O-NHR中的与N原子键合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。

作为羰基氨基(-NH-C＝O-R)的例子，可以举出烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、烯基羰基氨基、炔基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基等。在它们以外，还可以举出-NH-C＝O-R中的与N原子键合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。

作为氧基羰基氨基(-NH-C＝O-OR)的例子，可以举出烷氧基羰基氨基、环烷氧基羰基氨基、烯氧基羰基氨基、炔氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、杂芳氧基羰基氨基、芳烷氧基羰基氨基等。在它们以外，还可以举出-NH-C＝O-OR中的与N原子键合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。

作为磺酰基氨基(-NH-SO₂-R)的例子，可以举出烷基磺酰基氨基、环烷基磺酰基氨基、烯基磺酰基氨基、炔基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、芳烷基磺酰基氨基等。在它们以外，还可以举出-NH-SO₂-R中的与N原子键合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。

作为氨基磺酰基(-SO₂-NHR)的例子，可以举出烷基氨基磺酰基、环烷基氨基磺酰基、烯基氨基磺酰基、炔基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、杂芳基氨基磺酰基、芳烷基氨基磺酰基等。在它们以外，还可以举出-SO₂-NHR中的与N原子键合的H原子被烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基进一步取代的基团。

作为氨磺酰基氨基(-NH-SO₂-NHR)的例子，可以举出烷基氨磺酰基氨基、环烷基氨磺酰基氨基、烯基氨磺酰基氨基、炔基氨磺酰基氨基、芳基氨磺酰基氨基、杂芳基氨磺酰基氨基、芳烷基氨磺酰基氨基等。此外，-NH-SO₂-NHR中的与N原子键合的2个H原子可以被从烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基以及芳烷基中独立地选择的取代基取代，另外，它们中的2个取代基可以形成环。

作为来源于S原子的取代基，可以举出硫醇(-SH)、硫基(-S-R)、亚磺酰基(-S＝O-R)、磺酰基(-S(O)₂-R)、磺基(-SO₃H)、五氟硫基(-SF₅)。

作为硫基(-S-R)的例子，可以从烷硫基、环烷硫基、烯硫基、炔硫基、芳硫基、杂芳硫基、芳烷硫基等中选择。

作为亚磺酰基(-S＝O-R)的例子，可以举出烷基亚磺酰基、环烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、杂芳基亚磺酰基、芳烷基亚磺酰基等。

作为磺酰基(-S(O)₂-R)的例子，可以举出烷基磺酰基、环烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、芳基磺酰基、杂芳基磺酰基、芳烷基磺酰基等。

作为来源于N原子的取代基，可以举出叠氮(-N₃、也称作“叠氮基”)、氰基(-CN)、伯氨基(-NH₂)、仲氨基(-NH-R)、叔氨基(-NR(R'))、脒基(-C(＝NH)-NH₂)、取代脒基(-C(＝NR)-NR'R”)、胍基(-NH-C(＝NH)-NH₂)、取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R”)、氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R”)。

作为仲氨基(-NH-R)的例子，可以举出烷基氨基、环烷基氨基、烯基氨基、炔基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、芳烷基氨基等。

作为叔氨基(-NR(R'))的例子，例如可以举出烷基(芳烷基)氨基等、具有从烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等中分别独立地选择的、任意的2个取代基的氨基，它们中的任意的2个取代基可以形成环。

作为取代脒基(-C(＝NR)-NR'R”)的例子，可以举出N原子上的3个取代基R、R'以及R”为从烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基中分别独立地选择的基团，例如烷基(芳烷基)(芳基)脒基等。

作为取代胍基(-NR-C(＝NR”')-NR'R”)的例子，可以举出R、R'、R”以及R”'为从烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基中分别独立地选择的基团、或它们形成环的基团等。

作为氨基羰基氨基(-NR-CO-NR'R”)的例子，可以举出R、R'以及R”为从氢原子、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基中分别独立地选择的基团、或它们形成环的基团等。

作为来源于B原子的取代基，可以举出硼基(-Br(R'))、二氧基硼基(-B(OR)(OR'))等。它们中的2个取代基R及R'从烷基、环烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基等中分别独立地选择，或者它们可以形成环。具体而言，可以举出环状硼基，更具体而言，可以举出频哪醇硼基、新戊二醇硼基、儿茶酚硼基等。

作为本说明书中的N取代氨基酸的氮原子上的取代基，具体而言，可以例示出烷基、C₁-C₆烷基、C₁-C₄烷基、甲基、C₇-C₁₄芳烷基、苄基、苯乙基等。

氨基酸的主链氨基可以是未取代(-NH₂)，也可以被取代(即-NHR。此处，R表示可以具有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烷基，另外可以像脯氨酸那样键合于N原子的碳链与α位的碳原子形成环。)。在本说明书中有时将此种主链氨基被取代的氨基酸称作“N取代氨基酸”。作为本说明书中的“N取代氨基酸”，优选例示出N-烷基氨基酸、N-C₁-C₆烷基氨基酸、N-C₁-C₄烷基氨基酸、N-甲基氨基酸、N-C₇-C₁₄芳烷基氨基酸、N-苄基氨基酸、N-苯乙基氨基酸，然而并不限定于它们。

本说明书的“氨基酸”中包含各自对应的全部同位素。“氨基酸”的同位素是至少1个原子由原子序号(质子数)相同、质量数(质子与中子的数的和)不同的原子置换的元素。作为本说明书的“氨基酸”中含有的同位素的例子，有氢原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，各自包含²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl等。

本说明书中，表示数值范围的所谓“～”包含其两端的值，例如，“A～B”是指A以上并且B以下的数值范围。

本说明书中，“约”这样的术语在与数值组合使用的情况下，是指该数值的+10％及-10％的值范围。

本说明书中，“和/或”这样的术语的意义包含将“和”与“或”恰当地组合的所有组合。具体而言，例如，在“A、B和/或C”中，包含以下的7种变化：

(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A及B、(v)A及C、(vi)B及C、(vii)A、B以及C。

(制造方法)

本发明涉及一种方法，是包括使第一氨基酸或肽与第二氨基酸或肽在添加剂及缩合剂的存在下缩合而得到缩合体的工序的制造肽化合物的方法，其中，添加剂的摩尔数少于第二氨基酸或肽的摩尔数。

在某个方式中，利用本发明的制造方法得到的肽化合物可以是基于固相法或液相法的氨基酸或肽的伸长工序的中间体，也可以是最终产物。伸长工序可以根据所期望的肽化合物的氨基酸序列的长度进行多次，本发明的缩合工序在该伸长工序中包含至少1次，可以包含多次。伸长工序中，在本发明的缩合工序以外的缩合工序中可以使用本技术领域中公知的方法。

在某个方式中，在将本发明的缩合工序用于伸长工序的最终工序的情况下，利用本发明的缩合工序得到的缩合体可以成为具有所期望的序列的肽化合物。另一方面，在本发明的缩合工序的基础上还利用公知的方法进行进一步的伸长、得到具有所期望的序列的肽化合物的情况下，利用本发明的缩合工序得到的缩合体作为肽化合物的部分结构包含于其中。

本发明中，“第一氨基酸”可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸。

本发明中，“第一肽”可以仅由天然氨基酸构成，也可以仅由非天然氨基酸构成，也可以由天然及非天然氨基酸的任意的组合构成。

在某个方式中，第一氨基酸或第一肽优选为氨基酸，更优选为非天然的氨基酸。

在某个方式中，第一氨基酸或第一肽可以为主链氨基没有被保护的氨基酸或肽。没有被保护的主链氨基优选位于第一氨基酸或第一肽的N末端。

在本发明的缩合反应中使用固相法的情况下，第一氨基酸或第一肽的C末端的氨基酸被担载于固相合成用树脂(resin)。该情况下，若第一氨基酸或第一肽的N末端和/或C末端的氨基酸为非天然氨基酸、尤其是N-烷基氨基酸等N取代氨基酸，则由于提前裂解的原因，在以往方法中有不会充分地推进目标缩合反应的情况。该情况在将固相合成用树脂与氨基酸键合的树脂接头中使用了三苯甲基系的原子团的情况下显著。即使在此种情况下，通过使用本发明的方法，也能够高效地推进缩合反应。

在某个方式中，在第一氨基酸或第一肽的N末端和/或C末端的氨基酸为N-烷基氨基酸的情况下，作为N-烷基氨基酸，可以举出侧链与天然氨基酸不同的N-烷基氨基酸、α、β、或γ氨基酸等，优选例示出N-烷基β氨基酸。

作为第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸和/或第一肽的C末端的氨基酸，具体而言，可以举出具有以下的式(1)的氨基酸。

在第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₁为氢。另一方面，在第一肽的C末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₁是指与相邻的氨基酸的键合点，通常，式(1)的氨基酸在该部位与相邻的氨基酸形成酰胺键。

在某个方式中，式(1)中，P₁₁为氢或C₁-C₆烷基，并且R₁₂为氢、CONR_12AR_12B、COOR_12c、C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₇-C₁₄芳烷基、5～10元杂芳基C₁-C₆烷基、保护5～10元杂芳基C₁-C₆烷基、C₁-C₆羟基烷基、保护C₁-C₆羟基烷基、C₁-C₆羧基烷基、保护C₁-C₆羧基烷基、C₁-C₆氨基烷基、保护C₁-C₆氨基烷基、C₁-C₆烷硫基C₁-C₆烷基。

P₁₁优选为氢或甲基，更优选为甲基。

在R₁₂为CONR_12AR_12B的情况下，R_12A及R_12B独立地为C₁-C₄烷基(优选为甲基、乙基)，或者R_12A及R_12B与它们所键合的氮原子一起形成可以包含1个或多个追加的杂原子的4～8元环(优选为哌啶环、氮杂环丁烷环、吡咯烷环、吗啉环、或3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷环)。

在R₁₂为COOR_12C的情况下，R_12C为烯丙基、叔丁基、或苄基。

在R₁₂为C₁-C₆烷基的情况下，优选R₁₂为甲基、异丙基、或异丁基。

在R₁₂为C₃-C₈环烷基的情况下，优选R₁₂为环戊基、或环己基。

在R₁₂为C₇-C₁₄芳烷基的情况下，优选R₁₂为苄基或苯乙基。

在R₁₂为5～10元杂芳基C₁-C₆烷基的情况下，优选R₁₂为5～10元杂芳基甲基或5～10元杂芳基乙基。另外，在R₁₂为保护5～10元杂芳基C₁-C₆烷基的情况下，R₁₂优选为将前述的基团中含有的官能团、例如氨基用Boc基保护的基团。

在R₁₂为C₁-C₆羟基烷基的情况下，优选R₁₂为羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基，更优选为1-羟基乙基。另外，在R₁₂为保护C₁-C₆羟基烷基的情况下，R₁₂优选为将前述的基团用羟基的保护基、例如Bzl基、tBu基保护的基团。

在R₁₂为C₁-C₆羧基烷基的情况下，优选R₁₂为羧基甲基、1-羧基乙基、2-羧基乙基，更优选为2-羧基乙基。另外，在R₁₂为保护C₁-C₆羧基烷基的情况下，R₁₂优选为将前述的基团用羧基的保护基、例如Bzl基、tBu基保护的基团。

在R₁₂为C₁-C₆氨基烷基的情况下，优选R₁₂为4-氨基丁基。另外，在R₁₂为保护C₁-C₆氨基烷基的情况下，R₁₂优选为将前述的基团用氨基的保护基、例如Boc基保护的基团。

在R₁₂为C₁-C₆烷硫基C₁-C₆烷基的情况下，优选R₁₂为2-甲硫基乙基。

在某个方式中，P₁₁及R₁₂与P₁₁所键合的氮原子及R₁₂所键合的碳原子一起形成4～7元饱和杂环。作为4～7元饱和杂环，优选氮杂环丁烷环、吡咯烷环、哌啶环、哌嗪环、吗啉环。

式(1)中，Q₁₂为氢、或C₁-C₆烷基，优选为氢或甲基。

式(1)中，L₁₁为单键或-CH₂-。

在第一氨基酸或第一肽的C末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₃是指与固相合成用树脂的键合点。另一方面，在第一肽的N末端的氨基酸为以式(1)表示的氨基酸的情况下，R₁₃是指与相邻的氨基酸的键合点，通常，式(1)的氨基酸在该部位与相邻的氨基酸形成酰胺键。

作为第一氨基酸或第一肽的N末端和/或C末端的氨基酸，更具体而言，例如可以举出MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、MeAsp-NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly(cPent)、MeChg、MePhe、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、MeMet、Aze(2)、Aib等。

根据本发明的缩合工序，即使在以利用以往方法会产生肽从树脂中的脱除的高担载量(例如基于Fmoc定量法为0.5mmol/g以上)将第一氨基酸或肽担载于固相合成树脂的情况下，也能够在维持该担载量不变的状态下获得缩合体。

因而，本发明的方法中，作为第一氨基酸或肽相对于固相合成用树脂的担载量，可以使用任意的量，例如基于Fmoc定量法，可以使用0.2mmol/g以上且0.8mmol/g以下的量，即使是0.3mmol/g以上、进一步为0.5mmol/g以上的高担载量，也能够高效地推进反应。

本发明中，“第二氨基酸”可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸。

在某个方式中，第二氨基酸或肽可以是主链羧基没有被保护的氨基酸或肽。没有被保护的主链羧基优选位于第二氨基酸或肽的C末端。

本发明中，“第二肽”可以仅由天然氨基酸构成，也可以仅由非天然氨基酸构成，也可以由天然及非天然氨基酸的任意的组合构成。

在某个方式中，在第二氨基酸或第二肽的C末端的氨基酸为非天然氨基酸、尤其是N-烷基氨基酸等N取代氨基酸、其侧链的碳数为2个以上的氨基酸(例如α,α-二取代氨基酸、β-支链氨基酸)等情况下，利用以往方法会有不能充分地推进缩合反应的情况。即使在此种情况下，通过使用本发明的方法，也能够实现高效的缩合。

本发明中，第二氨基酸或肽的氨基优选由保护基保护。作为此种保护基，可以举出作为“氨基的保护基”在前面所述的基团，具体而言，例如可以举出具有Fmoc骨架的保护基、Cbz、Boc、Teoc以及Alloc等。

本发明中所谓“具有Fmoc骨架的保护基”，是指向Fmoc基或Fmoc基的构成骨架的任意的位置导入了任意的取代基的基团。作为此种具有Fmoc骨架的保护基，具体而言可以举出以下式表示的保护基：

(式中，

R₁～R₈独立地选自氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₈氟烷基、卤素、磺基以及三甲基硅基中，

R₉～R₁₀独立地为氢或甲基)。

作为具有Fmoc骨架的保护基，更具体而言，例如可以举出9-芴基甲氧基羰(Fmoc)基、2,7-二-叔丁基-Fmoc(Fmoc(2,7tb))基、1-甲基-Fmoc(Fmoc(1Me))基、2-氟-Fmoc(Fmoc(2F))基、2,7-二溴-Fmoc(Fmoc(2,7Br))基、2-单异辛基-Fmoc(mio-Fmoc)基、2,7-二异辛基-Fmoc(dio-Fmoc)基、2,7-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟辛基)-Fmoc(tdf-Fmoc)基、2,7-双(三甲基硅基)-Fmoc(Fmoc(2TMS))基、(2-磺基-9H-芴-9-基)甲氧基羰基(Fmoc(2so3h))、[(1S)-1-(9H-芴-9-基)乙氧基]羰基(sm-Fmoc)以及[(1R)-1-(9H-芴-9-基)乙氧基]羰基(Rm-Fmoc)等。

在第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸为β-支链氨基酸的情况下，作为β-支链氨基酸，具体而言，可以举出具有以下的式(2A)的氨基酸。

式(2A)中，P₂₁为氢或C₁-C₆烷基。在P₂₁为C₁-C₆烷基的情况下，优选为甲基。

式(2A)中，R₂₁及R₂₂各自独立地为C₁-C₄烷基、C₁-C₆烷氧基、或C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基，或者R₂₁及R₂₂与它们所键合的碳一起形成3～8元脂环式环。在R₂₁及R₂₂为C₁-C₄烷基、C₁-C₆烷氧基、或C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基的情况下，作为R₂₁及R₂₂优选为甲基、乙基、叔丁氧基，作为R₂₁及R₂₂的优选的组合，可以举出甲基与甲基、甲基与乙基、甲基与叔丁氧基。

在R₂₁及R₂₂一起形成3～8元脂环式环的情况下，作为3～8元脂环式环优选为环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、或环己烷环。

在第二氨基酸为以式(2A)表示的氨基酸的情况下，R₂₃是指氨基的与保护基的键合点。另一方面，在第二肽的C末端的氨基酸为以式(2A)表示的氨基酸的情况下，R₂₃是指与相邻的氨基酸的键合点，通常，式(2A)的氨基酸在该部位与相邻的氨基酸形成酰胺键。

作为此种第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸的β-支链氨基酸，更具体而言，可以举出MeVal、D-MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly(cPent)、Gly(cPent)、MeGly(cBu)、Gly(cBu)、MeGly(cPr)、Gly(cPr)、MeThr(tBu)以及Thr(tBu)等。

在第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸为α,α-二取代氨基酸的情况下，作为α,α-二取代氨基酸，具体而言，可以举出具有以下的式(2B)的氨基酸。

式(2B)中，P₂₂为氢或C₁-C₆烷基，在P₂₂为C₁-C₆烷基的情况下，优选为氢。

式(2B)中，R₂₃及R₂₄从C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、或可以被取代的C₇-C₁₄芳烷基中独立地选择，或者R₂₃及R₂₄与它们所键合的碳原子一起形成3～8元脂环式环或4～7元饱和杂环。

在R₂₃及R₂₄为C₁-C₆烷基的情况下，优选为甲基、乙基、或异丙基，在R₂₃及R₂₄为C₂-C₆烯基的情况下，优选为烯丙基，在R₂₃及R₂₄为C₇-C₁₄芳烷基的情况下，优选为可以被卤素取代的苄基。R₂₃及R₂₄的组合优选为甲基与甲基、甲基与乙基、甲基与异丙基、甲基与异丁基、甲基与烯丙基、甲基与可以被卤素取代的苄基。

另外，在R₂₃及R₂₄与它们所键合的碳原子一起形成3～8元脂环式环的情况下，作为脂环式环，优选为环丙烷环、环丁烷环、环戊烷环、或环己烷环，在R₂₃及R₂₄与它们所键合的碳原子一起形成4～7元饱和杂环的情况下，作为饱和杂环优选为四氢吡喃环。

在第二氨基酸为以式(2B)表示的氨基酸的情况下，R₂₅是指氨基的与保护基的键合点。另一方面，在第二肽的C末端的氨基酸为以式(2B)表示的氨基酸的情况下，R₂₅是指与相邻的氨基酸的键合点，通常，式(2B)的氨基酸在该部位与相邻的氨基酸形成酰胺键。

作为此种第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸的α,α-二取代氨基酸，更具体而言，可以举出Aib、(Me)Abu、(Me)Leu、(Me)Algly、(Me)Phe、(Me)Phe(3-I)、1-ACPrC、cVal、cLeu、cHex、Athpc等。

在某个方式中，第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸为N-烷基氨基酸，具体而言，可以举出MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze(2)、Pro、MeAsp-NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly(cPent)、MeGly(cBu)、MeGly(cPr)、MeThr(tBu)、D-MeVal、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、或MeMet等，优选举出MeVal或MeIle。

在某个方式中，第二氨基酸、或第二肽的C末端的氨基酸可以为其侧链的碳数为2个以上、且不相当于β-支链氨基酸或α,α-二取代氨基酸的氨基酸。例如，Lys(Z)、Glu(OBzl)、或Ser(tBu)相当于侧链的碳数为2个以上的氨基酸。

本发明中，相对于第一氨基酸或肽以相等或更多的量使用第二氨基酸或肽。具体而言，第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比可以设为利用选自1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0中的下限以及选自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及10.0中的上限的组合能够确定的范围。需要说明的是，本说明书中所谓“下限”包含“以上”及“更多”两方面的含义，所谓“上限”，包含“以下”及“更少”两方面的含义。第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比优选为1.5以上，更优选为2以上。另外，第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比优选为8以下，更优选为4以下。第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比最优选为约2。

作为本发明的缩合反应中使用的添加剂，可以举出Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt等。

本发明中，以比第二氨基酸或肽的摩尔数更少的摩尔数使用添加剂。换言之，本发明中，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比小于1。该摩尔比优选为0.8以下，例如为0.1～0.8。该情况下，作为该摩尔比，例如可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.7中的下限以及选自0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7及0.8中的上限的组合能够确定的范围。添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比更优选为0.3～0.7。

在某个方式中，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1～2的情况下，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比优选为0.7以下。具体而言，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1～2的情况下，可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为0.7以下的范围、0.6以下的范围、0.5以下的范围、0.4以下的范围、0.3以下的范围、0.2以下的范围或0.1以下的范围。

或者，在本发明中，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1～2的情况下，可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5以及0.6中的下限以及选自0.2、0.3、0.4、0.5、0.6以及0.7中的上限的组合能够确定的范围。

在另一方式中，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比(有时将该摩尔比称作“第1摩尔比”)为2以上的情况下，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比优选为“(第1摩尔比)-1”以下。具体而言，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为2以上的情况下，可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-1以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-2以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-3以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-4以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-5以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-6以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-7以下的范围、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-8以下的范围、或(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-9以下的范围。

或者，在本发明中，在第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为2以上的情况下，可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-9、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-8、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-7、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-6、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-5、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-4、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-3及(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-2中的下限以及选自(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-8、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-7、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-6、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-5、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-4、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-3、(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-2及(第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比)-1中的上限的组合能够确定的范围。

在某个方式中，添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比可以为0.5～2.0。具体而言，添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比可以使用利用选自包含0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8以及1.9的值中的下限以及选自包含0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9以及2.0的值中的上限的组合能够确定的范围的摩尔比。添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比特别优选为约1。

作为本发明的缩合反应中使用的缩合剂，可以举出DIC、DCC、EDCI、EDCI·HCl等。

本发明中，以与第二氨基酸或肽的摩尔数相等、或者更多的摩尔数使用缩合剂。具体而言，在本发明中，缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比可以设为1以上的范围、2以上的范围、3以上的范围或4以上的范围。更具体而言，缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比可以设为利用选自1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9及4.0中的下限以及选自1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9以及5.0中的上限的组合能够确定的范围。作为缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比的优选的范围，可以举出1.0～5.0、1.2～4.0、1.2～4.0、1.2～3.0、2.0～3.0。

在某个方式中，相对于第一氨基酸或肽以相等或更多的量使用缩合剂。具体而言，例如，缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比可以设为1.0以上的范围、1.1以上的范围、1.2以上的范围、1.3以上的范围、1.4以上的范围、1.5以上的范围、1.6以上的范围、1.7以上的范围、1.8以上的范围、1.9以上的范围、2.0以上的范围、2.1以上的范围、2.2以上的范围、2.3以上的范围、2.4以上的范围、2.5以上的范围、2.6以上的范围、2.7以上的范围、2.8以上的范围、2.9以上的范围、3.0以上的范围、3.1以上的范围、3.2以上的范围、3.3以上的范围、3.4以上的范围、3.5以上的范围、3.6以上的范围、3.7以上的范围、3.8以上的范围、3.9以上的范围、4.0以上的范围、4.1以上的范围、4.2以上的范围、4.3以上的范围、4.4以上的范围、4.5以上的范围、4.6以上的范围、4.7以上的范围、4.8以上的范围、4.9以上的范围、5.0以上的范围、5.1以上的范围、5.2以上的范围、5.3以上的范围、5.4以上的范围、5.5以上的范围、5.6以上的范围、5.7以上的范围、5.8以上的范围、5.9以上的范围、6.0以上的范围、6.1以上的范围、6.2以上的范围、6.3以上的范围、6.4以上的范围、6.5以上的范围、6.6以上的范围、6.7以上的范围、6.8以上的范围、6.9以上的范围、7.0以上的范围、7.1以上的范围、7.2以上的范围、7.3以上的范围、7.4以上的范围、7.5以上的范围、7.6以上的范围、7.7以上的范围、7.8以上的范围、7.9以上的范围、8.0以上的范围、8.1以上的范围、8.2以上的范围、8.3以上的范围、8.4以上的范围、8.5以上的范围、8.6以上的范围、8.7以上的范围、8.8以上的范围、8.9以上的范围、9.0以上的范围、9.1以上的范围、9.2以上的范围、9.3以上的范围、9.4以上的范围、9.5以上的范围、9.6以上的范围、9.7以上的范围、9.8以上的范围、或9.9以上的范围。

或者，在本发明中，缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比可以设为利用选自1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9以及9.0中的下限以及选自2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9以及10.0中的上限的组合能够确定的范围。

缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比优选为1.3以上，更优选为2.0以上。另外，缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比优选为10以下，更优选为8.0以下。作为缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比，最优选为约4。

在本发明中，对于缩合剂及添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比，

可以将缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自包含1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9以及2.0的值中的下限以及选自包含2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9以及3.0的值中的上限的组合能够确定的范围，

可以将添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自包含0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4以及0.5的值中的下限以及选自包含0.6、0.7、0.8、0.9及1.0的值中的上限的组合能够确定的范围。

作为缩合剂及添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比，优选为第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约2：约4～6：约1。

在本发明中，对于第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比，

可以将第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自包含1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0的值中的下限以及选自包含2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9以及4.0的值中的上限的组合能够确定的范围，

可以将缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自包含1.0、2.0、3.0及4.0的值中的下限以及选自包含5.0、6.0、7.0、8.0及9.0的值中的上限的组合能够确定的范围，

可以将添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比设为利用选自包含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0的值中的下限以及选自包含1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0的值中的上限的组合能够确定的范围。

作为第一氨基酸或肽、第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂的摩尔比，优选为第一氨基酸或肽：第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约1：约2：约4：约1、第一氨基酸或肽：第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约1：约2.4：约7.2：约1.2、或第一氨基酸或肽：第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约1：约3：约6：约1.5，更优选为第一氨基酸或肽：第二氨基酸或肽：缩合剂：添加剂＝约1：约2：约4：约1。

本发明的缩合反应可以在0～100℃、优选在5～60℃、更优选在10～40℃的反应温度进行。

本发明的缩合反应可以以10分钟～1周、优选以10分钟～3天、更优选以1小时～2天的反应时间进行。

本发明中，优选添加剂为Oxyma、并且缩合剂为DIC、DCC、EDCI、或EDCI·HCl。

本发明中，更优选添加剂为Oxyma、并且缩合剂为DIC。

本发明的缩合反应可以在适当的溶剂中进行。溶剂可以使用非质子性溶剂，可以举出酰胺系溶剂、酯系溶剂、醚系溶剂、烷基腈系溶剂以及尿素系溶剂等。作为酰胺系溶剂，可以举出DMF、DMA以及NMP。作为酯系溶剂，可以举出乙酸乙酯以及碳酸二甲酯等。作为醚系溶剂，可以举出四氢呋喃以及2-甲基四氢呋喃等。作为烷基腈系溶剂，可以举出乙腈等。作为尿素系溶剂，可以举出DMI以及TMU等。

本发明的方法可以适用于固相法，也可以适用于液相法。

在利用固相法进行的情况下，本发明的方法可以通过使第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂接触键合于树脂的第一氨基酸或肽来进行。使第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂接触第一氨基酸或肽的顺序任选，可以使第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂同时接触第一氨基酸或肽，也可以依次接触。可以将第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂的全部、或者任意者事先混合，使所得的混合物接触第一氨基酸或肽。在使第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂接触第一氨基酸或肽时，可以使用将它们与适当的溶剂混合而得的混合物。

本发明的方法可以使用固相合成装置进行。在某个方式中，本发明的方法可以通过将第二氨基酸或肽、缩合剂及添加剂在适当的溶剂中混合来进行与键合于树脂的第一氨基酸或肽的接触。在将固相合成用树脂与这些试剂类混合时，作为其前处理，利用与适当的溶剂的接触，使固相合成用树脂溶胀，由此能够高效地推进目标缩合反应。对于该前处理中使用的溶剂的量，只要将溶胀了的resin浸渍于溶剂中，则可以使用任意的量，例如，在使用DMF作为溶剂的情况下，可以使用3v/w～15v/w、优选为4v/w～10v/w、更优选为4v/w～8v/w的量。将溶剂量记作4v/w的意思表示相对于1g树脂重量而言的溶剂量为4ml。

反应结束后，从固相合成装置中排出反应液，将残留的固相合成用树脂用适当的溶剂清洗，由此可以排出过量的试剂、副产物，取得与固相合成用树脂键合的目标的肽化合物。作为适用于对固相合成用树脂进行清洗和/或溶胀的溶剂，可以例示出酰胺系、溶剂醇系溶剂，优选DMF或2-丙醇。这些溶剂可以使用多次，也可以交替地使用。可以根据需要使溶胀了的固相合成用树脂收缩，为此使用利用醇系溶剂、或醚系的溶剂的清洗。作为醇系溶剂，优选甲醇，作为醚系的溶剂优选MTBE。

本发明即使在不同时发生提前裂解的情况下，与以往方法相比也能够提高缩合反应的收率、缩合体的纯度，因此可以使用任意的树脂。作为可发生提前裂解的树脂接头，可以例示出Novabiochem固相合成手册中记载的酸感受性分类为“H(＜5％TFA in CH₂Cl₂)”的树脂接头，作为具备此种树脂接头的树脂，可以举出2-氯三苯基氯甲烷resin(CTC resin)、TGT resin、三苯基氯甲烷resin(Trt resin)、4-甲基三苯基氯甲烷resin(Mtt resin)、4-甲氧基三苯基氯甲烷resin(Mmt resin)等使用三苯甲基系的原子团作为树脂接头的固相合成用树脂(有时将此种树脂称作“三苯甲基系树脂”)，在使用此种树脂的情况下，本发明特别有益。

对于本发明中使用的固相合成用树脂，对构成该固相合成用树脂的聚合物的种类没有特别限定，然而优选由聚苯乙烯形成的树脂。另外，固相合成用树脂的粒子尺寸可以优选使用100-200目、或200-400目左右的粒子尺寸。对于树脂的交联率也没有特别限定，然而优选交联1％DVB(二乙烯基苯)的树脂。作为构成树脂的聚合物的种类，可以举出TentaGel(注册商标)、ChemMatrix(注册商标)等。

在某个方式中，可以在进行缩合反应前预先制备将第二氨基酸或肽、缩合剂以及添加剂在溶剂中事先混合的混合物，用于缩合反应中。混合时间没有特别限定，然而优选为0分钟～2小时，更优选为0分钟～1小时，进一步优选为30分钟。

使用自动合成装置的树脂的搅拌、振荡在使树脂充分地浸透到反应溶液中、像所期望的那样推进反应的方面可成为重要的因素。搅拌速度、振荡速度、它们的频度没有特别限定，然而过度的搅拌有可能引起树脂的物理损伤，因此例如可以举出每1小时实施2分钟左右的60rpm的搅拌的例子。另外，若浸透充分，则不一定需要进行搅拌、振荡。

在某个方式中，本发明的方法可以还包括除去固相合成用树脂的工序，该工序中可以使用本技术领域中公知的方法。可以使伸长到所期望的序列的肽化合物从树脂脱离、分离。

在某个方式中，本发明的方法可以还包括除去保护基的工序，该工序中可以使用本技术领域中公知的方法。例如可以举出《GReene’s,“Protective Groups in OrganicSynthesis”(第5版，John Wiley&Sons 2014)》中记载的方法，只要根据反应条件恰当地使用这些方法即可。具体而言，在第二氨基酸的氨基、或第二肽的N末端的氨基酸的氨基由保护基保护的情况下，通过除去该保护基，可以用于下面的缩合反应。可以在缩合反应的同时除去保护基，也可以独立于缩合反应地除去保护基。

在某个方式中，本发明还涉及如下的方法，即，使用本发明的方法得到直链肽化合物，然后利用Comprehensive Organic Transformations、AGuide to Functional GroupPreparations,3^rd Edition(R.C.Larock著)、或March's Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms,and Structure、7^th Edition(M.B.Smith,J.March著)等中记载的公知的方法将其N末端侧的基团与C末端侧的基团环化，由此制造环状肽化合物。

在某个方式中，本发明还涉及使用了本发明的方法的提前裂解的抑制方法。

需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献被作为参照引入本说明书中。

实施例

以下的实施例利用Waters的HPLC方法A-D的任意一种以上进行分析。

分析：Waters的HPLC(反应转换率、纯度)

HPLC方法A

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：Ascentis Express C18(2.7μm，4.6mm×50mm)，Supelco

柱温：35deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

梯度(B)：5％(0min.)→100％(4min.)→100％(4.5min.)→5％(4.6min.)→5％(6min.)

流速：1.0mL/min

检测：PDA 210nm(200-400nm PDA total)

注入体积：A-a)0.30μL，A-b)1.0μL，A-c)2.0μL

样品制备：

A-a)5μL上清液/995μL MeCN用于评估上样

A-b)5μL上清液/995μL MeCN用于评估上样

A-c)40μL上清液/960μL MeCN用于评估Gly-cap

HPLC方法B

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：CAPCELL Core ADME(2.7μm，2.1mm×50mm)

柱温：50deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

梯度(B)：30％(0min.)→70％(20.0min.)→100％(20.1min.)→100％(22.0min.)→30％(22.1min.)→30％(24.0min.)

流速：0.3mL/min

检测：PDA 210nm(200-400nm PDA total)

注入体积：1.0μL

样品制备：40μL上清液/960μL MeCN

HPLC方法C

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：ACQUITY UPLC CSHFluoro-Phenyl(1.7μm，2.1mm×150mm)

柱温：35deg.

洗脱剂：A)0.1％甲酸/水，B)0.1％甲酸/MeCN

梯度(B)：5％(0min.)→100％(15.0min.)→100％(18.0min.)→5％(18.01min.)→5％(20.0min.)

流速：0.3mL/min

检测：PDA 254nm(200-380nm PDA total)

注入体积：2.0μL

样品制备：0.37mg/ml

HPLC方法D

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：Bioshell A160 peptide(2.7μm，2.1mm×150mm)

柱温：40deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

梯度(B)：20％(0min.)→60％(20min.)→100％(20.1min.)→100％(22.0min.)→100％(22.1min.)→20％(24min.)

流速：0.5mL/min

检测：PDA 254nm

注入体积：2.0μL

样品制备：5μL上清液/1000μL MeCN

HPLC方法E

仪器：Acquity UPLC/SQD2

色谱柱：Ascentis Express C18

柱温：35deg.

洗脱剂：A)0.1％FA/水，B)0.1％FA/乙腈

梯度(B)：5％(0min.)→100％(1.0min.)→100％(1.4min.)

流速：1.0mL/min

检测：PDA 210-400nm(total)

HPLC方法F

仪器：Acquity UPLC/SQD2

色谱柱：Ascentis Express C18

柱温：35deg.

洗脱剂：A)0.1％FA/水，B)0.1％FA/乙腈

梯度(B)：5％(0min.)→100％(4.5min.)→100％(5.0min.)

流速：1.0mL/min

检测：PDA 210-400nm(total)

HPLC方法G

仪器：Acquity UPLC/SQD2

色谱柱：Ascentis Express C18

柱温：35deg.

洗脱剂：A)10mM AA/水，B)甲醇

梯度(B)：50％(0min.)→100％(4.5min.)→100％(5.0min.)

流速：1.0mL/min

检测：PDA 210-400nm(total)

HPLC方法H

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：Ascentis Express RP-amide(2.7μm，2.1mm×50mm)，Supelco

柱温：35deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

流速：0.5mL/min

检测：PDA 210nm(200-400nm PDA total)

注入体积：E-a)0.50μL，E-b)0.50μL，E-c)1.0μL

样品制备：

E-a)5μL上清液/960μL MeCN用于评估Gly-cap或评估纯度

HPLC方法I

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：Ascentis Express RP-amide(2.7μm，2.1mm×50mm)，Supelco

柱温：50deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

梯度(B)：5％(0min.)→70％(20min.)→70％(21min.)→100％(22min.)→100％(22.1min.)→5％(22.6min.)→5％(24.0min.)

流速：0.5mL/min

检测：PDA 210nm(200-400nm PDA total)

注入体积：0.50或1.0μL

样品制备：40μL上清液/960μL MeCN

HPLC方法J

仪器：ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：ACQUITY UPLC CSHFluoro-Phenyl(1.7μm，2.1mm×150mm)

柱温：40deg.

洗脱剂：A)0.05％TFA/水，B)0.05％TFA/MeCN

梯度(B)：20％(0min.)→100％(20min.)→20％(20.1min.)→12％(24.0min.)

流速：0.3mL/min

检测：PDA 254nm(200-400nm PDA total)

注入体积：1.0μL

样品制备：40μL上清液/960μL MeCN

以下的Fmoc氨基酸购入市售品。

[表A]

[液相合成实验]

[起始原料合成]

(起始原料合成1)

Fmoc-MeAsp(OtBu)-pip(化合物2)的合成

向500mL的3口烧瓶中加入26.9g(63.2mmol，1.0eq)的Fmoc-MeAsp(OtBu)-OH(化合物1)、9.23g(75.9mmol，1.2eq)的哌啶盐酸盐、10.8g(69.5mmol，1.1eq)的Oxyma、135mL的N，N-二甲基甲酰胺并进行搅拌。使用滴液漏斗在0℃用10分钟滴加12.2mL(69.5mmol，1.1eq)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。滴加后，使用N，N-二甲基甲酰胺1.25mL对滴液漏斗再次进行清洗。反应开始5小时后，加入269mL的2-MeTHF，然后用10分钟加入135mL的0.5mol/L盐酸水溶液。排出水层后，向有机层中加入135mL的5％碳酸钠水溶液。排出水层后，向有机层中加入135mL的10％氯化钠水溶液。排出水层后，将有机层在室温下保管一夜。将约60ml的有机溶剂减压蒸馏除去后，在室温下向浓缩液中加入81mL的乙酸乙酯。一并搅拌一边加入323mL的庚烷。将外温设定为0℃，1小时20分钟后，加入161ml的庚烷。使用桐山漏斗对晶体进行过滤清洗后，将所得的晶体在外温40℃减压干燥，得到白色固体28.2g(化合物2)。

[表2]

	质量(g)	收率(％)
			起始原料(化合物1)	26.9	-
生成物(化合物2)	28.2	90.5

[表3]

分析(HPLC方法C：纯度确定)

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					起始原料(化合物1)	425.2	-	-	-
生成物(化合物2)	492.3	*	10.3	99.3

*在脱叔丁基化时观察到生成物的LCMS峰。

参照化合物3的合成实施例。

(起始原料合成2)

Fmoc-MeAsp(OH)-pip(化合物3)的合成

在100mL的3口梨形烧瓶中称量1.58g(3.20mmol，1.0eq)的Fmoc-MeAsp(OtBu)-pip(化合物2)后，在氮气气氛下用注射器加入9.5mL的2-MeTHF并进行搅拌，用注射器加入1.0mL(4.8mmol，1.5eq)的HMDS。将烧瓶浸渍在冰浴中，在内温达到1℃时用注射器加入0.79mL(4.4mmol，1.4eq)的TMSOTf。滴加结束5分钟后升温到室温，1小时后，利用HPLC(方法A-a)确认反应率为100％。将反应容器再次浸渍在冰浴中，在内温达到5℃时加入15mL的5％碳酸钠水溶液。加完碳酸钠水溶液后搅拌反应溶液数分钟，然后停止搅拌。将反应容器转移到50mL分液漏斗中并分层后，分离收集水层。将所得的水层用15mL的MTBE清洗。向分离收集的水层中加入15mL的MTBE后，加入1.1mL的磷酸(质量百分率85％以上)。在分液漏斗中振荡溶液后进行分层，分离收集有机层。向所得的有机层中加入硫酸镁后，过滤掉硫酸镁。向滤液中加入1.5mL的庚烷，进行减压浓缩，得到白色固体1.42g(化合物3)(含量未测定)。

[表4]

	质量(g)	收率(％)
			起始原料(化合物2)	1.58	-
生成物(化合物3)	1.42	定量的

[表5]

分析(HPLC方法A-a：生成物鉴定和纯度确定^*)

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					起始原料(化合物2)	492.6	493.3([M+H]<sup>+</sup>)	3.2	99.4
生成物(化合物3)	436.5	437.3([M+H]<sup>+</sup>)	2.4	99.9

*除去2-MeTHF溶剂中含有的稳定剂(2.6-二叔丁基对甲酚)峰后算出LC A％。

(起始原料合成3)

Fmoc-MeAsp(OH)-NMe2(化合物21)的合成

在氮气气流下，向反应容器中加入EDCI(16.9g，88.0mmol)以及DMF(144mL)，冷却到0℃。在0℃依次加入HOBt(10.9g，80.6mmol)以及依照WO2018/225864中记载的方法合成的化合物19(30.0g，73.3mmol)的溶解于DCM/DMF(60mL/60mL)中的溶液，在0℃搅拌30分钟。在0℃滴加二甲胺(2mol/L THF溶液，40.5mL，80.6mmol)后，在0℃搅拌30分钟。向反应液中加入乙酸乙酯(300mL)，将有机层依次用1mol/L盐酸水溶液(240mL)清洗2次，用水(300mL)清洗2次，用饱和碳酸氢钠水溶液/水(1/1300mL)清洗2次，用饱和氯化钠水溶液/水(1/1300mL)清洗后，将有机层用硫酸钠干燥。过滤掉干燥剂后，减压浓缩滤液，以淡褐色无定形晶体的形式得到32.7g(收率102％)的化合物20。

LCMS(ESI)m/z＝437.2(M+H)⁺

保持时间：0.86分钟(分析条件HPLC方法E)

以化合物20(32.0g，73.3mmol)为起始原料，将四(三苯基)膦钯与DCM混合，然后，滴加苯基硅烷后，在室温下将反应液搅拌30分钟。进行目标物的萃取操作，将包含目标物的溶液浓缩干燥固化，由此以淡褐色无定形晶体的形式得到25.1g(收率86％)的化合物21。

LCMS(ESI)m/z＝397.2(M+H)⁺

保持时间：0.68分钟(分析条件HPLC方法E)

Cl-Trt(2-Cl)resin(1.25～1.60mmol/g，100-200目，1％DVB)从渡边化学工业株式会社或SUNRESIN公司购入。

[固相合成实验]

本说明书中，在固相支持体与化合物键合的情况下，有时将聚合物、树脂部位用●表述。另外，出于使与固相支持体部位的反应点明确的目的，有时与●连接来表述作为反应部位的接头的化学结构。例如，在下述的结构(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-resin)pip(化合物3)中，固相支持体的2-氯三苯甲基与MeAsp的侧链羧基形成酯键。需要说明的是，所谓pip是指哌啶基，在上述的结构中，C末端的羧基与哌啶形成酰胺键。

[1残基+1残基缩合实验]

本说明书中，有时将实施固相反应时的溶剂量以倍量(v/w)来表述。倍量的基准是担载工序的Cl-Trt(2-Cl)resin的质量，例如在固相原料合成1中，在相对于3.97g的Cl-Trt(2-Cl)resin使用40mL的二氯甲烷的情况下，即为40/3.97≈10v/w。另外，在1残基+1残基缩合实验中，将担载工序中得到的树脂中间体细分后使用。1残基+1残基缩合实验时的溶剂量为4v/w，对其进行体积换算，则相当于4(mL/g)×细分树脂(g)÷担载后的树脂(g)×担载工序原料树脂(g)＝4(mL/g)×细分树脂(g)/5.79×3.97mL。

本说明书中，作为固相缩合反应的纯度评价，对使用伸长后得到的干燥树脂的脱树脂反应后的反应液利用LC进行测定，确认担载于固相合成用树脂的化合物的纯度。给出具体的步骤。将伸长后的干燥树脂约20mg加入带有滤片的5mL一次性注射器，用一次性注射器抽吸1mL的二氯甲烷并在室温下静置15分钟。排出二氯甲烷，加入0.20mL的包含1％TFA的二氯甲烷，在室温下振荡30秒。将溶液排出到1mL小瓶中。将排出液40μL用乙腈960μL稀释，制备出LC样品液。

在本说明书的实施例2-2～实施例2-11以外(实施例2-1、实施例2-12～2-31)，根据Fmoc定量值(mmol/g)、干燥树脂重量(g)以及LC纯度(面积％)的积算出目标物的物质的量(mmol)，评价固相缩合反应的收率。给出Fmoc定量的具体的步骤。在100mL容量瓶中称量干燥树脂约20mg后，加入包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并进行定容。将该溶液在室温下振荡45分钟。使用分光光度计(UV3900-01)测定溶液的吸光度(波长289.80nm、系数ε＝6089)，由下式算出担载于树脂的具有Fmoc基的化合物的每单位重量的物质的量(Fmoc定量)。

测定溶液的摩尔浓度(mol/L)＝吸光度÷ε

Fmoc定量值(mmol/g)＝测定溶液的摩尔浓度(mol/L)÷测定用树脂(g)×100(mL)

本说明书的实施例2-2～实施例2-11中使用以下的Fmoc定量法：

Fmoc定量法(实施例2-2～实施例2-11)

在10mL容量瓶中称量市售的Fmoc-Gly-OH约10mg后，加入DMF(4ml)。在室温下振荡30分钟后，加入DBU(40μL)，将该溶液在室温下振荡15分钟。其后，加入DMF并定容为10mL。由溶液上清液30μL和4ml的DMF溶液制备样品液，取得LC数据(5μL注射量)。由取得数据在294nm及304nm的各波长制作出标准曲线。

在10mL容量瓶中称量反应后的树脂约10mg后，加入DMF(4ml)。在室温下振荡30分钟后，加入DBU(40μl)，将该溶液在室温下振荡15分钟。其后，加入DMF并定容为10mL。由溶液上清液80μl和920μl的DMF溶液制备样品液，取得LC数据(5μl注射量)。根据对各波长取得数据的面积和制作所得的标准曲线算出担载于树脂的具有Fmoc基的化合物的每单位重量的物质的量，将其平均值设为Fmoc定量值。

[起始原料合成]

(固相原料合成1)

Fmoc-MeAsp(OH)-pip(化合物3)在Trt(2-Cl)resin上的担载

对固相反应用色谱柱称量3.97g(1.36mmol/g，5.40mmol，1.7eq)的Cl-Trt(2-Cl)resin，加入40mL(10v/w)的二氯甲烷并在室温下静置30分钟。排出二氯甲烷后，将在30mL(7.5v/w)的二氯甲烷中溶解有1.40g(3.20mmol，1.0eq)的Fmoc-MeAsp(OH)-pip(化合物3)及1.6mL(9.0mmol，2.8eq)的N,N-二异丙基乙基胺的溶液在室温下加入反应用色谱柱后，在室温下振荡2小时。排出反应溶液后，将在27mL(6.8v/w)的N,N-二甲基甲酰胺中溶解有3.2mL(0.8v/w)的甲醇和1.6mL(0.4v/w)的N,N-二异丙基乙基胺的溶液在室温下加入反应用色谱柱。在室温下振荡2小时后，排出反应溶液。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺40mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇40mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇40mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到5.79g的干燥树脂(化合物4)。在100mL容量瓶中量取19.4mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容，在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LCA％算出收率。

[表6]

*包括脱叔丁基工序的2阶段收率(将(化合物2)设为含量100％来进行计算)

[表7]

分析(HPLC方法B：生成物鉴定和纯度确定)

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					生成物(化合物3)<sup>*</sup>	436.2	437.3([M+H]<sup>+</sup>)	6.8	99.0

*为了确认担载前后的纯度变化而分析经过脱树脂后的化合物3

(固相原料合成2)

Fmoc-MeAsp(OH)-NMe2(化合物21)在Trt(2-Cl)resin上的担载

向带有滤片的反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)resin(1.60mmol/g，8.83g，14.1mmol)和DCM(90mL)，在室温下振荡20分钟。实施氮气鼓泡而除去DCM后，将化合物21(2.80g，7.06mmol)、甲醇(2.29mL，56.5mmol)、DIPEA(5.91mL，33.9mmol)以及DCM(64mL)的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡60分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，将甲醇(9.17mL，226mmol)、DIPEA(5.91mL，33.9mmol)以及DCM(64mL)的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡90分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，加入DCM(90mL)并振荡5分钟后，实施氮气鼓泡而除去反应液。重复进行2次该使用了DCM的resin的清洗操作，使所得的resin在减压下干燥一夜，得到10.4g的化合物22。使用干燥resin(11.04mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.442mmol/g(294nm处的UVarea值：4990.63、304nm处的UVarea值：4516.89)。

(固相原料合成3)

Fmoc-D-3-MeAbu-OH(化合物23)在Trt(2-Cl)resin上的担载

向带有滤片的反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)resin(1.60mmol/g，25.0g，40.0mmol)和DCM(125mL)，在室温下振荡20分钟。实施氮气鼓泡而除去DCM后，将向Fmoc-D-3-MeAbu-OH(化合物23，3.60g，10.6mmol)、甲醇(0.859mL，21.2mmol)及DIPEA(12.3mL，70.7mmol)中加入DCM而制备成合计145mL的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡30分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，将向甲醇(12.5mL，143mmol)及DIPEA(12.5mL，71.8mmol)中加入DCM而制备成合计250mL的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡90分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，加入DCM(180mL)并振荡5分钟后，实施氮气鼓泡而除去反应液。重复进行3次该使用了DCM的resin的清洗操作，使所得的resin在减压下干燥一夜，得到28.3g的化合物24。使用干燥resin(10.36mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.369mmol/g(294nm处的UVarea值：3920.38、304nm处的UVarea值：3530.84)。

(固相原料合成4)

Fmoc-MeGly-OH(化合物25)在Trt(2-Cl)resin上的担载

向带有滤片的反应容器中加入Cl-Trt(2-Cl)resin(1.60mmol/g，12.3g，19.7mmol)和DCM(125mL)，在室温下振荡20分钟。实施氮气鼓泡而除去DCM后，将从商业的供应商购入的Fmoc-MeGly-OH(3.07g，9.87mmol)、DIPEA(8.25mL，47.4mmol)以及DCM(110mL)的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡60分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，将甲醇(12.8mL，316mmol)、DIPEA(8.25mL，47.4mmol)以及DCM(110mL)的混合液添加到反应容器中，在室温下振荡90分钟。实施氮气鼓泡而除去反应液后，加入DCM(180mL)并振荡5分钟后实施氮气鼓泡而除去反应液。重复进行2次该使用了DCM的resin的清洗操作，使所得的resin在减压下干燥一夜，得到22.2g的化合物26。使用干燥resin(10.00mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.573mmol/g(294nm处的UVarea值：5879.66、304nm处的UVarea值：5289.40)。

(固相原料合成5)

Fmoc-MeLeu-OH(化合物37)在Trt(2-Cl)resin上的担载

对固相反应用色谱柱中称量1.01g(1.13mmol/g，1.14mmol，1.4eq)的Cl-Trt(2-Cl)resin，加入10mL(10v/w)的二氯甲烷并在室温下静置30分钟。排出二氯甲烷后，将在二氯甲烷8.0mL(8v/w)中溶解有0.29g(0.79mmol，1.0eq)的Fmoc-MeLeu-OH(化合物1)及0.40mL(2.3mmol，2.9eq)的N,N-二异丙基乙基胺的溶液在室温下加入反应用色谱柱后，在室温下振荡2小时。排出反应溶液后，将在N,N-二甲基甲酰胺6.8mL(6.8v/w)中溶解有0.80mL(0.8v/w)的甲醇和0.40mL(0.4v/w)的N,N-二异丙基乙基胺的溶液在室温下加入反应用色谱柱。在室温下振荡2小时后，排出反应溶液。将树脂用N,N-二甲基甲酰胺10mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇10mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇10mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到1.27g的干燥树脂(化合物38)。在100mL容量瓶中量取17.7mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表8]

[表9]

分析(HPLC方法H：纯度确定)

	Rt(min)	LC A％
			脱树脂体(化合物37)	3.1	100

付诸与上文同样的反应条件，将下述的市售氨基酸担载于CTC resin，将所得的结果表示如下。

[表10]

ND:无数据

^＊记载再合成时的数据

实施例1、实施例2-1以及实施例2-12～实施例2-31中，相对于固相合成用树脂的氨基酸，分别使用2当量、4当量、1当量的Fmoc氨基酸、DIC以及Oxyma，由此使氨基酸伸长(实施例条件A)。

[实施例1]

(1残基+1残基缩合实验)

Fmoc-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip(化合物5)的合成(相对于resin的氨基酸，Fmoc氨基酸：DIC：添加剂(Oxyma)＝2：4：1的反应条件：以下称作实施例条件A)

对固相反应用色谱柱中称量3.01g(0.525mmol/g，1.57mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物4)，加入21mL(10v/w)的N,N-二甲基甲酰胺，在室温下静置30分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，加入17mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入17ml(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺21mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量1.12g(3.16mmol，2.0eq)的Fmoc-MeVal-OH和0.226g(1.58mmol，1.0eq)的Oxyma，加入8.2mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解，将本溶液加入固相合成用色谱柱。接着加入0.99mL(6.3mmol，4.0eq)的DIC，密封后在室温下振荡6小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺21mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇21mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇21mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到2.78g的干燥树脂(化合物5)。在100mL容量瓶中称量23.2mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表11]

(HPLC方法B:目标物的鉴定和纯度的测定)

[表12]

能够以高收率得到目标物(化合物7)。过量伸长体(化合物8)及差向异构体(化合物6)的生成分别为2.3A％、0.4A％。

[实施例2-1]

Fmoc-D-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip(化合物10)的合成(基于实施例条件A的合成)

在带有滤片的5mL一次性注射器中称量0.195g(0.525mmol/g，0.101mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物4)，加入1.3mL(10v/w)的N，N-二甲基甲酰胺并在室温下静置30分钟。排出N，N-二甲基甲酰胺后，加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量72mg(0.21mmol，2.0eq)的Fmoc-D-MeVal-OH和15mg(0.11mmol，1.0eq)的Oxyma，加入0.54mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解，用一次性注射器抽吸该溶液。接下来加入66μL(0.42mmol，4eq)的DIC，密封后在室温下振荡6小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇1.3mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇1.3mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到0.188g的干燥树脂(化合物10)。在100mL容量瓶中称量22.6mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表13]

(HPLC方法B:目标物的鉴定和纯度的测定)

[表14]

能够以高收率得到目标物(化合物10)。过量伸长体(化合物11)及差向异构体(化合物7)的生成分别为1.9A％、0.1A％。

实施例2-2～实施例2-11中记载的基于固相反应的肽合成使用肽合成仪(Multipep RS；Intavis公司制)利用Fmoc法进行。对于操作的详细的步骤，遵从合成仪中附带的操作手册。

将实施例2-2～实施例2-11的详细的合成条件表示于以下的合成法1中。

合成法1

使用构成作为目标的肽的Fmoc氨基酸(第二氨基酸)、作为添加剂的HOAt或Oxyma以及NMP并溶解，使得Fmoc氨基酸的浓度为0.6mol/L、添加剂的浓度为0.375mol/L，制备出溶液1。在Fmoc氨基酸难溶的情况下，添加DMSO，使之为20～30％(v/v)，制备出溶液1。另外，与DMF混合，使得DIC为10％(v/v)，制备出溶液2。将固相原料合成1～4中制备的担载有Fmoc氨基酸或肽的resin(100mg)加入带有过滤器(滤头)的固相反应容器并安置于肽合成仪中。加入DCM(1.2mL)并静置30分钟，由此进行resin的溶胀后，将溶液从滤头中排出。将溶液1及溶液2安置于肽合成仪中，开始利用肽合成仪的自动合成。

向包含resin的固相反应容器中添加DBU的DMF溶液(2％v/v，0.7mL)，在室温下进行Fmoc基的除去反应。在第1个残基的脱保护中反应4.5分钟，在第2个残基以后的脱保护中反应10分钟后，将溶液从滤头中排出。向其中加入DMF(0.7mL)，静置5分钟后，将溶液从滤头中排出。再重复3次该resin的清洗工序。接下来，将溶液1(0.3mL)和溶液2(0.36mL)在合成仪的混合瓶中混合(Fmoc氨基酸：缩合剂：添加剂的混合比约为1.6：2：1)后添加到resin中，将固相反应容器加热到40℃或50℃，进行2.5小时或10小时反应，由此进行resin上的氨基与Fmoc氨基酸的缩合反应后，将溶液从滤头中排出。然后将resin用DMF(0.7mL)清洗3次。将接在该Fmoc基的除去反应后的Fmoc氨基酸的缩合反应设为1个循环，重复进行该循环，使肽伸长。

完成肽伸长后，将所得的resin用DMF(0.7mL)清洗4次，然后用DCM(0.7mL)清洗4次，在室温下自然干燥48小时。将所得的resin的一部分(10mg左右)加入反应容器，依照上述的Fmoc定量法算出resin上的肽的担载率。另外，将所得的resin的一部分(20mg左右)加入反应容器，加入包含或不包含0.75％(v/v)的DIPEA的TFE/DCM溶液(1/1，1mL)并在室温下振荡2小时，进行肽的切出反应。反应后，对切出溶液利用LCMS进行分析。

算出利用使用了肽合成仪的固相反应在以下的2个条件下合成[实施例2-2]～[实施例2-11]所示的三肽时的回收率以及纯度。

[表15]

将实施例2-1～实施例2-30中的回收率的定义以及算出方法表示于以下的回收率算出法中。

回收率算出法

实施例2中如下所示地定义回收率。回收率越高，则提前裂解越得到抑制。

回收率＝伸长反应后的实际的Fmoc定量值(mmol/g)÷伸长反应后的理论的Fmoc定量值(mmol/g)(式1)

伸长反应后的理论的Fmoc定量值(mmol/g)如下所示地算出。

伸长反应后的理论的Fmoc定量值(mmol/g)＝原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)×原料resin的重量(g)÷100％生成目标物时的resin的重量(g)(式2)

100％生成目标物时的resin的重量(g)如下所示地算出。

100％生成目标物时的resin的重量(g)＝原料resin的重量(g)-原料resin上的氨基酸、或肽成分的重量(g)+100％生成目标物时的resin上的肽成分的重量(g)(式3)

原料resin上的氨基酸、或肽成分的重量(g)如下所示地算出。

原料resin上的氨基酸、或肽成分的重量(g)＝原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)×原料resin的重量(g)×原料resin上的氨基酸、或肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol)(式4)

100％生成目标物时的resin上的肽成分的重量(g)如下所示地算出。

100％生成目标物时的resin上的肽成分的重量(g)＝原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)×原料resin的重量(g)×目标物的肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol)(式5)

将式3、式4以及式5代入式2，则有：

伸长反应后的理论的Fmoc定量值(mmol/g)＝原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)÷(1-原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)×原料resin上的氨基酸、或肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol)+原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)×目标物的肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol))＝1÷(1÷原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)-原料resin上的氨基酸、或肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol)+目标物的肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol))(式6)

将式6代入式1，则可以利用下式算出回收率。

回收率＝伸长反应后的实际的Fmoc定量值(mmol/g)×(1÷原料resin的Fmoc定量值(mmol/g)-原料resin上的氨基酸、或肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol)+目标物的肽成分的分子量(g/mol)×0.001(mol/mmol))

[实施例2-2]

Fmoc-Ile-MeVal-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip(化合物27)的合成

基于条件1的化合物27的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物27。使用干燥resin(10.45mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.292mmol/g(294nm处的UVarea值：3046.82、304nm处的UVarea值：2746.87)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.292×(1÷0.455-436.51×0.001+662.83×0.001)＝70.8％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物27的脱树脂体的纯度为61.6area％，差向异构体(化合物27a)为6.5area％，过量伸长体(化合物27b)为2.4area％，缺损体(化合物27c)为29.5area％。

分析条件：HPLC方法G

[表16]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物27)	662.83	663.7([M+H]<sup>+</sup>)	1.78	61.6
差向异构体(化合物27a)	662.83	663.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.00	6.5
					过量伸长体(化合物27b)	859.08	859.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.18	2.4
缺损体(化合物27c)	549.67	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	1.63	29.5

基于条件2的化合物27的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物27。使用干燥resin(10.89mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.332mmol/g(294nm处的UVarea值：3612.81、304nm处的UVarea值：3267.35)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.332×(1÷0.455-436.51×0.001+662.83×0.001)＝80.5％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物27的脱树脂体的纯度为93.7area％，差向异构体(化合物27a)为2.6area％，过量伸长体(化合物27b)为3.7area％。

分析条件：HPLC方法G

[表17]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物27)	662.83	663.6([M+H]<sup>+</sup>)	1.79	93.7
差向异构体(化合物27a)	662.83	663.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.02	2.6
					过量伸长体(化合物27b)	859.08	859.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.20	3.7

将以上的结果汇总于下表中。

[表18]

[实施例2-3]

Fmoc-Ile-MeIle-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip(化合物28)的合成

基于条件1的化合物28的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeIle-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物28。使用干燥resin(10.81mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.326mmol/g(294nm处的UVarea值：3524.40、304nm处的UVarea值：3171.55)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.326×(1÷0.455-436.51×0.001+676.86×0.001)＝79.5％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物28的脱树脂体的纯度为58.0area％，差向异构体(化合物28a)为1.4area％，过量伸长体(化合物28b)为1.8area％，缺损体(化合物27c)为38.8area％。

分析条件：HPLC方法G

[表19]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物28)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.00	58.0
差向异构体(化合物28a)	676.86	677.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.20	1.4
					过量伸长体(化合物28b)	873.11	873.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.37	1.8
缺损体(化合物27c)	549.67	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	1.62	38.8

基于条件2的化合物28的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeIle-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物28。使用干燥resin(10.41mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.330mmol/g(294nm处的UVarea值：3437.60、304nm处的UVarea值：3100.91)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.330×(1÷0.455-436.51×0.001+676.86×0.001)＝80.5％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物28的脱树脂体的纯度为95.2area％，差向异构体(化合物28a)为1.4area％，过量伸长体(化合物28b)为3.4area％。

分析条件：HPLC方法G

[表20]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物28)	676.86	677.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.01	95.2
差向异构体(化合物28a)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.22	1.4
					过量伸长体(化合物28b)	873.11	873.9([M+H]<sup>+</sup>)	2.39	3.4

将以上的结果汇总于下表中。

[表21]

[实施例2-4]

Fmoc-Ile-MeGly(cPent)-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip(化合物29)的合成

基于条件1的化合物29的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeGly(cPent)-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物29。使用干燥resin(10.05mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.320mmol/g(294nm处的UVarea值：3216.77、304nm处的UVarea值：2905.18)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.320×(1÷0.455-436.51×0.001+688.87×0.001)＝78.4％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物29的脱树脂体的纯度为83.9area％，差向异构体(化合物29a)为1.2area％，过量伸长体(化合物29b)为3.9area％，缺损体(化合物27c)为11.0area％。

分析条件：HPLC方法G

[表22]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物29)	688.87	689.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.06	83.9
差向异构体(化合物29a)	688.87	689.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.27	1.2
					过量伸长体(化合物29b)	885.12	885.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.43	3.9
缺损体(化合物27c)	549.67	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	1.63	11.0

基于条件2的化合物29的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeGly(cPent)-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物29。使用干燥resin(9.45mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.232mmol/g(294nm处的UVarea值：2194.45、304nm处的UVarea值：1975.12)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.232×(1÷0.455-436.51×0.001+688.87×0.001)＝56.8％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物29的脱树脂体的纯度为91.4area％，差向异构体(化合物29a)为0.1area％，过量伸长体(化合物29b)为8.5area％。

分析条件：HPLC方法G

[表23]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物29)	688.87	689.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.09	91.4
差向异构体(化合物29a)	688.87	689.5([M+H]<sup>+</sup>)	2.29	0.1
					过量伸长体(化合物29b)	885.12	885.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.45	8.5

将以上的结果汇总于下表中。

[表24]

[实施例2-5]

Fmoc-Ile-MeChg-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip(化合物30)的合成

基于条件1的化合物30的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeChg-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物30。使用干燥resin(9.68mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.314mmol/g(294nm处的UVarea值：3037.14、304nm处的UVarea值：2743.09)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.314×(1÷0.455-436.51×0.001+702.89×0.001)＝77.4％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物30的脱树脂体的纯度为74.1area％，差向异构体(化合物30a)为2.3area％，过量伸长体(化合物30b)为4.0area％，缺损体(化合物27c)为19.5area％。

分析条件：HPLC方法G

[表25]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物30)	702.89	703.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.24	74.1
差向异构体(化合物30a)	702.89	703.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.43	2.3
					过量伸长体(化合物30b)	899.14	899.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.58	4.0
缺损体(化合物27c)	549.67	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	1.63	19.5

基于条件2的化合物30的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-C1)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeChg-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物30。使用干燥resin(9.91mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.226mmol/g(294nm处的UVarea值：2235.50、304nm处的UVarea值：2016.81)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.226×(1÷0.455-436.51×0.001+702.89×0.001)＝55.7％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物30的脱树脂体的纯度为91.7area％，差向异构体(化合物30a)为0.6area％，过量伸长体(化合物30b)为7.7area％。

分析条件：HPLC方法G

[表26]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物30)	702.89	703.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.26	91.7
差向异构体(化合物30a)	702.89	703.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.44	0.6
					过量伸长体(化合物30b)	899.14	899.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.60	7.7

将以上的结果汇总于下表中。

[表27]

[实施例2-6]

Fmoc-Ile-MeLeu-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip(化合物31)的合成

基于条件1的化合物31的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeLeu-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物31。使用干燥resin(10.74mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.369mmol/g(294nm处的UVarea值：3953.19、304nm处的UVarea值：3570.96)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.369×(1÷0.455-436.51×0.001+676.86×0.001)＝90.0％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物31的脱树脂体的纯度为98.3area％，差向异构体(化合物31a)为0.1area％，过量伸长体(化合物31b)为1.6area％。本基质中在条件1下也观测不到缺损体(化合物27c)。

分析条件：HPLC方法G

[表28]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物31)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.03	98.3
差向异构体(化合物31a)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.23	0.1
					过量伸长体(化合物31b)	873.11	873.8([M+H]<sup>+</sup>)	2.41	1.6
缺损体(化合物27c)	549.67	未检出

基于条件2的化合物31的合成(合成法1)

以固相原料合成1中制备的担载有氨基酸的resin(化合物4)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip)(100mg，0.455mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeLeu-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物31。使用干燥resin(10.73mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.337mmol/g(294nm处的UVarea值：3610.72、304nm处的UVarea值：3254.78)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.337×(1÷0.455-436.51×0.001+676.86×0.001)＝82.2％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物31的脱树脂体的纯度为97.7area％，差向异构体(化合物31a)为0.1area％，过量伸长体(化合物31b)为2.2area％。

分析条件：HPLC方法G

[表29]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物31)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.05	97.7
差向异构体(化合物31a)	676.86	677.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.25	0.1
					过量伸长体(化合物31b)	873.11	873.9([M+H]<sup>+</sup>)	2.42	2.2

将以上的结果汇总于下表中。

[表30]

[实施例2-7]

Fmoc-Ile-MeGly(cPent)-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2(化合物32)的合成

基于条件1的化合物32的合成(合成法1)

以固相原料合成2中制备的担载有氨基酸的resin(化合物22)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2)(100mg，0.442mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeGly(cPent)-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物32。使用干燥resin(10.73mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.304mmol/g(294nm处的UVarea值：3263.10、304nm处的UVarea值：2945.28)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.304×(1÷0.442-396.44×0.001+648.80×0.001)＝76.5％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物32的脱树脂体的纯度为76.3area％，差向异构体(化合物32a)为1.2area％，过量伸长体(化合物32b)为5.6area％，缺损体(化合物32c)为16.9area％。

分析条件：HPLC方法E

[表31]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物32)	648.80	649.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.97	76.3
差向异构体(化合物32a)	648.80	649.6([M+H]<sup>+</sup>)	1.03	1.2
					过量伸长体(化合物32b)	804.98	805.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.93	5.6
缺损体(化合物32c)	509.60	510.5([M+H]<sup>+</sup>)	0.88	16.9

基于条件2的化合物32的合成(合成法1)

以固相原料合成2中制备的担载有氨基酸的resin(化合物22)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2)(100mg，0.442mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeGly(cPent)-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物32。使用干燥resin(10.60mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.211mmol/g(294nm处的UVarea值：2239.56、304nm处的UVarea值：2018.13)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.211×(1÷0.442-396.44×0.001+648.80×0.001)＝53.1％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物32的脱树脂体的纯度为85.9area％，过量伸长体(化合物32a)为14.1area％。

分析条件：HPLC方法E

[表32]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物32)	648.80	649.6([M+H]<sup>+</sup>)	0.96	85.9
差向异构体(化合物32a)	648.80	未检出
					过量伸长体(化合物32b)	804.98	805.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.92	14.1

将以上的结果汇总于下表中。

[表33]

[实施例2-8]

Fmoc-Ile-MeLeu-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2(化合物33)的合成

基于条件1的化合物33的合成(合成法1)

以固相原料合成2中制备的担载有氨基酸的resin(化合物22)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2)(100mg，0.442mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeLeu-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物33。使用干燥resin(10.15mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.371mmol/g(294nm处的UVarea值：3770.57、304nm处的UVarea值：3391.62)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.371×(1÷0.442-396.44×0.001+636.79×0.001)＝92.9％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物33的脱树脂体的纯度为97.9area％，过量伸长体(化合物33b)为2.1area％。本基质中在条件1下也观测不到缺损体(化合物32c)。

分析条件：HPLC方法E

[表34]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物33)	636.79	637.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.97	97.9
差向异构体(化合物33a)	636.79	未检出
					过量伸长体(化合物33b)	792.97	793.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.92	2.1
缺损体(化合物32c)	509.60	未检出

基于条件2的化合物33的合成(合成法1)

以固相原料合成2中制备的担载有氨基酸的resin(化合物22)(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2)(100mg，0.442mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeLeu-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物33。使用干燥resin(10.73mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.334mmol/g(294nm处的UVarea值：3587.19、304nm处的UVarea值：3234.07)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.334×(1÷0.442-396.44×0.001+636.79×0.001)＝83.6％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物33的脱树脂体的纯度为96.6area％，过量伸长体(化合物33b)为3.4area％。

分析条件：HPLC方法E

[表35]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物33)	636.79	637.6([M+H]<sup>+</sup>)	0.96	96.6
差向异构体(化合物33a)	636.79	未检出
					过量伸长体(化合物33b)	792.97	793.7([M+H]<sup>+</sup>)	0.92	3.4

将以上的结果汇总于下表中。

[表36]

[实施例2-9]

Fmoc-Ile-MeVal-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin(化合物34)的合成

基于条件1的化合物34的合成(合成法1)

以固相原料合成3中制备的担载有氨基酸的resin(化合物24)(Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin)(100mg，0.369mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成化合物34。使用干燥resin(10.62mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.295mmol/g(294nm处的UVarea值：3138.26、304nm处的UVarea值：2821.05)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.295×(1÷0.369-339.39×0.001+565.71×0.001)＝86.6％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物34的脱树脂体的纯度为99.1area％，过量伸长体(化合物34b)为1.0area％。本基质中在条件1下也观测不到缺损体(化合物34c)。

分析条件：HPLC方法G

[表37]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物34)	565.71	566.5([M+H]<sup>+</sup>)	1.50	99.1
差向异构体(化合物34a)	565.71	未检出
					过量伸长体(化合物34b)	664.84	665.6([M+H]<sup>+</sup>)	1.58	1.0
缺损体(化合物34c)	452.55	未检出

基于条件2的化合物34的合成(合成法1)

以固相原料合成3中制备的担载有氨基酸的resin(化合物24)(Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin)(100mg，0.369mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物34。使用干燥resin(10.44mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.284mmol/g(294nm处的UVarea值：2964.86、304nm处的UVarea值：2667.78)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.284×(1÷0.369-339.39×0.001+565.71×0.001)＝83.4％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物34的脱树脂体的纯度为98.1area％，过量伸长体(化合物34b)为1.9area％。

分析条件：HPLC方法G

[表38]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物34)	565.71	566.6([M+H]<sup>+</sup>)	1.51	98.1
差向异构体(化合物34a)	565.71	未检出
					过量伸长体(化合物34b)	664.84	665.6([M+H]<sup>+</sup>)	1.59	1.9

将以上的结果汇总于下表中。

[表39]

[实施例2-10]

Fmoc-Ile-MeChg-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin(化合物35)的合成

基于条件1的化合物35的合成(合成法1)

以固相原料合成3中制备的担载有氨基酸的resin(化合物24)(Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin)(100mg，0.369mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeChg-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物35。使用干燥resin(10.20mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.293mmol/g(294nm处的UVarea值：2987.04、304nm处的UVarea值：2692.68)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.293×(1÷0.369-339.39×0.001+605.78×0.001)＝87.2％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物35的脱树脂体的纯度为92.8area％，过量伸长体(化合物35b)为3.4area％，缺损体(化合物34c)为3.8area％。

分析条件：HPLC方法F

[表40]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物35)	605.78	606.5([M+H]<sup>+</sup>)	3.03	92.8
差向异构体(化合物35a)	605.78	未检出
					过量伸长体(化合物35b)	704.91	705.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.96	3.4
缺损体(化合物34c)	452.56	453.5([M+H]<sup>+</sup>)	2.52	3.8

基于条件2的化合物35的合成(合成法1)

以固相原料合成3中制备的担载有氨基酸的resin(化合物24)(Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin)(100mg，0.369mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeChg-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物35。使用干燥resin(9.56mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.217mmol/g(294nm处的UVarea值：2072.81、304nm处的UVarea值：1864.82)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.217×(1÷0.369-339.39×0.001+605.78×0.001)＝64.6％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物35的脱树脂体的纯度为94.5area％，过量伸长体(化合物35b)为5.5area％。

分析条件：HPLC方法F

[表41]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物35)	605.78	606.6([M+H]<sup>+</sup>)	2.97	94.5
差向异构体(化合物35a)	605.78	未检出
					过量伸长体(化合物35b)	704.91	705.7([M+H]<sup>+</sup>)	2.92	5.5

将以上的结果汇总于下表中。

[表42]

[实施例2-11]

Fmoc-Ile-MeVal-MeGly-O-Trt(2-Cl)resin(化合物36)的合成

基于条件1的化合物36的合成(合成法1)

以固相原料合成4中制备的担载有氨基酸的resin(化合物26)(Fmoc-MeGly-O-Trt(2-Cl)resin)(100mg，0.573mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成化合物36。使用干燥resin(10.20mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.326mmol/g(294nm处的UVarea值：3322.12、304nm处的UVarea值：3002.34)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.326×(1÷0.573-311.34×0.001+537.66×0.001)＝64.3％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物36的脱树脂体的纯度为95.6area％，过量伸长体(化合物36b)为4.4area％。本基质中在条件1下也观测不到缺损体(化合物36c)。

分析条件：HPLC方法E

[表43]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物36)	537.66	538.5([M+H]<sup>+</sup>)	0.94	95.6
差向异构体(化合物36a)	537.66	未检出
					过量伸长体(化合物36b)	608.74	607.4([M+H]<sup>+</sup>)	0.90	4.4
缺损体(化合物36c)	424.50	未检出

基于条件2的化合物36的合成(合成法1)

以固相原料合成4中制备的担载有氨基酸的resin(化合物26)(Fmoc-MeGly-(O-Trt(2-Cl)resin))(100mg，0.573mmol/g)作为起始原料，依照合成法1，进行Fmoc-MeVal-OH的伸长(Oxyma、50℃、10小时)，然后进行Fmoc-Ile-OH的伸长(HOAt、40℃、2.5小时)，合成出化合物36。使用干燥resin(10.69mg)，利用Fmoc定量法算出担载率，结果为0.331mmol/g(294nm处的UVarea值：3542.66、304nm处的UVarea值：3189.92)。

依照回收率算出法，利用下式算出回收率。

回收率＝0.331×(1÷0.573-311.34×0.001+537.66×0.001)＝65.3％

另外，对切出反应液利用LCMS进行分析，其结果是，观测到化合物36的脱树脂体的纯度为93.9area％，过量伸长体(化合物36b)为6.1area％。

分析条件：HPLC方法E

[表44]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(化合物36)	537.66	538.5([M+H]<sup>+</sup>)	0.93	93.9
差向异构体(化合物36a)	537.66	未检出
					过量伸长体(化合物36b)	608.74	607.6([M+H]<sup>+</sup>)	0.89	6.1

将以上的结果汇总于下表中。

[表45]

以多种多样的序列验证实施例条件A的提前裂解抑制效果

[实施例2-12]

Fmoc-MeVal-MeLeu-OCTC(化合物39)的合成(基于实施例条件A的合成)

在带有滤片的5mL一次性注射器中称量0.195g(0.650mmol/g，0.127mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物38)，加入1.6mL(10v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并在室温下静置30分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，加入1.3mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入1.3ml(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.6mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量90mg(0.25mmol，2.0eq)的Fmoc-MeVal-OH和18mg(0.13mmol，1.0eq)的Oxyma，加入0.62mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。向该溶液中加入80μL(0.51mmol，4.0eq)的DIC后，立即用一次性注射器进行抽吸，密封后在室温下振荡18小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.6mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇1.6mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇1.6mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到0.201g的干燥树脂(化合物39)。在100mL容量瓶中称量16.7mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表46]

(HPLC方法I:目标物的鉴定和纯度的测定)

[表47]

(HPLC方法I:纯度的算出)

另外，为了确认起始原料残留率实施了甘氨酸封端。即，在带有滤片的5mL一次性注射器中称量进行了缩合反应的干燥树脂约10mg后，加入N,N-二甲基甲酰胺1mL并在室温下静置15分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，将反应用鸡尾酒溶液(在小瓶中称量Fmoc-Gly-OH约70mg和HATU约0.11g，使之悬浮于N,N-二甲基甲酰胺0.45mL中后，加入N,N-二异丙基乙基胺45μL并振荡1分钟所得的淡黄色的均匀溶液)用一次性注射器抽吸，在室温下振荡1小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1mL清洗6次，然后用二氯甲烷1mL清洗4次后，进行脱树脂反应。根据Gly-cap体(化合物40)与目标物(化合物39)、差向异构体(化合物39a)、过量伸长体(化合物39b)的LC A％的和算出起始原料残留率为0％(0÷(0+98.6+0+0))。

[表48]

(HPLC方法H-b：反应转换率的算出)

能够以良好的收率得到脱树脂体(化合物39)。没有观察到过量伸长体(化合物39b)及差向异构体(化合物39a)的生成。

[参照例4]

基于Chem.Eur.J.，2009，15，9394-9403中记载的反应条件(相对于resin的氨基酸，Fmoc氨基酸：DIC：添加剂(Oxyma)＝2：2：2的反应条件：以下称作参照例条件A)的Fmoc- MeVal-MeLeu-OCTC(化合物39)的合成

在带有滤片的5mL一次性注射器中称量0.204g(0.650mmol/g，0.133mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物38)，加入1.6mL(10v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并在室温下静置30分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，加入1.3mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入1.3mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.6mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量96mg(0.26mmol，2.0eq)的Fmoc-MeVal-OH和38mg(0.26mmol，2.0eq)的Oxyma，加入0.65mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。接下来将42μl(0.26mmol，2.0eq)的DIC在室温下加入小瓶后，密闭容器并在室温下振荡2分钟。用一次性注射器抽吸该溶液，密封后在室温下振荡18小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.6mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇1.6mL(10v/w)清洗2次，接下来用甲醇1.6mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到0.181g的干燥树脂(化合物3)。在100mL容量瓶中称量19.0mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表49]

(HPLC方法E-b:目标物的鉴定和纯度的测定)

使用与实施例条件A同样的方法，在参照例条件A下也确认起始原料残留率为0％。

[表50]

(HPLC方法H-b：反应转换率的算出)

	Rt(min)	LC A％
			Glyc-cap体(化合物40)	未检出	未检出
脱树脂体(化合物39)	3.11	79.8
			差向异构体(化合物39a)

可知在上述的参照例条件A的反应条件下，目标物的收率、纯度均降低。

基于上述1残基+1残基缩合实验，在实施例条件A和参照例条件A下合成出以下的序列。

[实施例2-13]

Fmoc-D-MeVal-MeLeu-OCTC(化合物41)的合成(基于实施例条件A的合成)

[表51]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表52]

(HPLC方法I：实施例条件A的目标物的鉴定)

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(41)	480.3	481.3([M+H]<sup>+</sup>)	13.7	98.2

[实施例2-14]

Fmoc-Lys(Z)-MeVal-OCTC(化合物43)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表53]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表54]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-15]

Fmoc-MeVal-MeAla-OCTC(化合物45)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表55]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表56]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-16]

Fmoc-MeVal-MeGly-OCTC(化合物47)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表57]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表58]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-17]

Fmoc-MeVal-MePhe-OCTC(化合物49)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表59]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表60]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-18]

Fmoc-Glu(OBzl)-MeTrp(Boc)-OCTC(化合物51)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表61]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表62]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-19]

Fmoc-Aze(2)-MeThr(Bzl)-OCTC(化合物53)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表63]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表64]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-20]

Fmoc-Lys(Z)-MeGlu(OtBu)-OCTC(化合物55)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表65]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表66]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-21]

Fmoc-Thr(tBu)-MeLys(Boc)-OCTC(化合物57)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表67]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表68]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-22]

Fmoc-MePhe-MeMet-OCTC(化合物59)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表69]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表70]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-23]

Fmoc-cVal-Aze(2)-OCTC(化合物61)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表71]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表72]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-24]

Fmoc-Gly-Gly-OCTC(化合物63)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表73]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表74]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[表75]

Entry	条件	反应时间	收率(％)
				1	实施例条件A	18小时	64
2	实施例条件A	1小时	67
				3	参照例条件A	1小时	61

需要说明的是，Entry2及3中，将反应时间从18小时缩短为1小时。

[实施例2-25]

Fmoc-Gly-Leu-OCTC(化合物65)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表76]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表77]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[表78]

Entry	条件	反应时间	收率(％)
				1	实施例条件A	18小时	76
2	实施例条件A	1小时	76
				3	参照例条件A	1小时	72

[实施例2-26]

Fmoc-Pro-Aib-OCTC(化合物67)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表79]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表80]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-27]

Fmoc-Gly-bAla-OCTC(化合物69)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A的合成)

[表81]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表82]

(HPLC方法H-b：实施例条件A下的目标物的鉴定)

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					脱树脂体(69)	368.1	369.2([M+H]<sup>+</sup>)	2.4	98.3

[实施例2-28]

Fmoc-MeVal-bMeAla-OCTC(化合物71)的合成

[表83]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

将实施例条件A变更3点后实施本序列的伸长。

[表84]

	实施例条件A	本序列的伸长
			添加剂	0xyma	0xyma-B
缩合溶剂量	4v/w	8v/w
			反应时间	18小时	3小时

[表85]

(HPLC方法H-b：本序列的伸长反应中的目标物的鉴定)

[实施例2-29]

Fmoc-MeVal-D-3-MeAbu-OCTC(化合物73)的合成(基于实施例条件A及参照例条件 A的合成)

[表86]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

(ND：不确定，参照例条件A下的收率是不考虑纯度地使用根据resin质量和Fmoc定量值算出的物质的量。)

将实施例条件A变更1点后实施本序列的伸长。

[表87]

	实施例条件A	本序列的伸长
			反应时间	18小时	3小时

[表88]

(HPLC方法J：实施例条件A下的目标物的鉴定)

[实施例2-30]

Fmoc-Ser(tBu)-MeLeu-OCTC(化合物75)的合成(基于实施例条件A及参照例条件A 的合成)

[表89]

(HPLC方法H-b：反应转换率、纯度的算出)

[表90]

(HPLC方法H：实施例条件A下的目标物的鉴定)

将以上的结果汇总于下表中。

[表91]

无论在哪个序列中，实施例条件A与参照例条件A相比都抑制提前裂解，以良好的收率提供2残基的肽。尤其是N-Meα氨基酸的情况下的抑制效果显著。

[实施例2-31]

产生提前裂解的抑制效果的试剂当量范围的探索实验

基于上述[1残基+1残基缩合实验](实施例条件A)变更试剂当量后实施相同的反应，将所得的结果表示如下。

[表92]

在参照例条件A下即使增加Fmoc氨基酸的当量，收率也基本上没有改善(Entry1、3)。

另一方面，若减小Oxyma的当量，则纯度、收率改善(Entry4、8、13、16)。

另外，若增大DIC的当量，则纯度、收率改善(Entry5、6)。

此外若减小Oxyma的当量并且增大DIC的当量，则纯度、收率改善(Entry2、9、10、11、12、14、15)。

尤其是在Entry2、9、10、11中得到收率大于75％的结果。

以上，在实施例2-1～实施例2-31中，在相对于Fmoc氨基酸使用1当量以上的DIC、使用1当量以下的添加剂的条件下，将N末端被N-Me化了的氨基酸或肽伸长，合成出目标的肽。伸长至第3个残基时的回收率均大于53％，高的实施例中为90％以上。与参照例条件A进行比较实验的例子中，实施例条件A的收率及纯度均为同等以上。

[参照例1]

Chem.Eur.J.,2009,15,9394-9403的Fmoc-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip(化合物5)的合成(相对于resin的氨基酸，Fmoc氨基酸：DIC：添加剂(Oxyma)＝2：2：2的反应条件：参照例条件A)

在带有滤片的5mL一次性注射器中称量0.200g(0.525mmol/g，0.104mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物4)，加入1.3mL(10v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并在室温下静置30分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量74mg(0.21mmol，2.0eq)的Fmoc-MeVal-OH和30mg(0.21mmol，2.0eq)的Oxyma，加入0.54mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。接下来将33μl(0.21mmol，2.0eq)的DIC在室温下加入小瓶后，密闭容器并在室温下振荡2分钟。用一次性注射器抽吸该溶液，密封后在室温下振荡6小时。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇1.3mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇1.3mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到0.178g的干燥树脂(化合物5)。在100mL容量瓶中称量21.6mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表93]

(HPLC方法B：目标物的鉴定和纯度的测定)

[表94]

*根据甘氨酸封端实验的质谱鉴定为过量伸长体B。

另外，为了确认起始原料残留率而实施了甘氨酸封端。即，将过滤缩合反应后的反应液而得的树脂约10mg制成N，N-二甲基甲酰胺悬浮液后转移到带有滤片的5mL一次性注射器中。排出N，N-二甲基甲酰胺后，用N，N-二甲基甲酰胺1mL清洗3次。将反应用鸡尾酒溶液(在小瓶中称量Fmoc-Gly-OH约70mg和HATU约0.11g，使之悬浮于N，N-二甲基甲酰胺0.45mL中后，加入45μL的N，N-二异丙基乙基胺并振荡1分钟所得的淡黄色的均匀溶液)用一次性注射器抽吸，在室温下振荡1小时。排出反应溶液后，用N，N-二甲基甲酰胺1mL清洗6次，然后用二氯甲烷1mL清洗4次后，进行脱树脂反应。根据Gly-cap体(化合物13)与差向异构体(化合物6)、目标物(化合物7)、过量伸长体(化合物8)、过量伸长体(化合物9)的LC A％的和算出起始原料残留率为1.3％(1.3÷(1.3+79.9+13.4+2.3))。

[表95]

(HPLC方法A-c：生成物的鉴定和反应转换率的算出)

可知在上述的反应条件下，目标物的收率降低。根据Gly-cap体(化合物13)的生成确认反应未完结，另一方面，观察到过量伸长体(化合物8以及化合物9)的生成。

[参照例2]

Eur.J.Org,Chem.,2013,6372-6378中记载的反应条件下的Fmoc-MeVal-MeAsp (OCTC)-pip(化合物5)的合成(相对于resin的氨基酸，Fmoc氨基酸：DIC：添加剂(K-Oxyma) ＝2：2：2的反应条件)

在带有滤片的5mL一次性注射器中称量0.202g(0.525mmol/g，0.105mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物4)，加入1.3mL(10v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并在室温下静置30分钟。排出N,N-二甲基甲酰胺后，加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，再次加入1.1mL(8v/w)的包含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液并在室温下振荡15分钟。排出反应溶液后，用N,N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗8次。然后在小瓶中称量75mg(0.21mmol，2.0eq)的Fmoc-MeVal-OH和40mg(0.21mmol，2.0eq)的K-Oxyma，加入0.54mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。接下来将33μl(0.21mmol，2.0eq)的DIC在室温下加入小瓶后，立即用一次性注射器抽吸该溶液，密封后在室温下振荡6小时。排出反应溶液后，用N，N-二甲基甲酰胺1.3mL(10v/w)清洗4次，然后用2-丙醇1.3mL(10v/w)清洗2次，接着用甲醇1.3mL(10v/w)清洗4次后，在室温下彻夜进行减压干燥，得到0.188g的干燥树脂(化合物5)。在100mL容量瓶中称量21.0mg的所得的树脂，用包含20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液定容并在室温下振荡45分钟。使用分光光度计根据溶液的吸光度进行Fmoc定量，根据所得的Fmoc定量值、干燥树脂的质量和LC A％算出收率。

[表96]

(HPLC方法B：目标物的鉴定和纯度的测定)

[表97]

	Mw	m/z	Rt(min)	LC A％
					差向异构体(化合物6)	549.7	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	9.0	20.2
目标物(化合物7)	549.7	550.5([M+H]<sup>+</sup>)	9.4	77.6
					讨量伸长体(化合物8)	745.9	746.5([M+H]<sup>+</sup>)	12.1	0.6
过量伸长体(化合物9)	942.2	未检出	未检出	未检出

可知在上述的反应条件下，目标物的收率降低。虽然过量伸长体(化合物8)得到抑制，然而观察到差向异构体(化合物6)的生成增加。

[1残基+2残基缩合实验][起始原料合成]

沿用本说明书中记载的担载、缩合、脱Fmoc条件，合成出作为缩合反应用的起始原料的H-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip(化合物14)。依照实施例条件A实施1残基+1残基的缩合。

缩合反应用的原料(化合物14)的肽担载率在理论上为0.63mmol/g。如下所示地算出该值。

1.实施在CTC resin担载Fmoc-MeAsp(OH)-pip(化合物3)后的干燥树脂(化合物4)的Fmoc定量，测定值为0.59mmol/g。

2.考虑到化合物3的分子量为436.51(g/mol)，则该干燥树脂(化合物4)1g根据下式由0.258g的化合物1和0.742g的树脂成分构成。

化合物3：0.59(mmol/g)×1(g)x436.51(g/mol)＝0.258(g)。

树脂成分：1(g)-0.258(g)＝0.742(g)

3.对于由干燥树脂(化合物4)1g得到的缩合反应用的原料(化合物14)的理论产量，考虑到H-MeVal-MeAsp(OH)-pip(化合物15)质量可以基于化合物3的物质的量和肽的分子量算出，树脂成分质量在反应前后不变，则根据：

化合物14：0.59(mmol/g)×1(g)×327.43(g/mol)+0.742＝0.935(g)

而有：

理论上的缩合反应用的原料(化合物14)的肽担载率为0.63(mmol/g)(0.59÷0.935＝0.63)。

本参照例中，有时也将固相反应实施时的溶剂量用倍量(v/w)表述。与1残基+1残基缩合实验不同，本参照例中的倍量的基准为干燥树脂(化合物14)的质量，相对于干燥树脂100mg使用N,N-二甲基甲酰胺0.80mL时的倍量为0.80mL÷0.100(g)＝8v/w。

[实施例3]

Fmoc-cLeu-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip(化合物16)的合成(基于实施例条件A的合成)

[缩合实验]

在小瓶中称量67mg(0.19mmol，3.0eq)的Fmoc-cLeu-OH和13mg(0.095mmol，1.5eq)的Oxyma，加入0.80mL(8v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。向该溶液中加入59μL(0.38mmol，6.0eq)的DIC，在室温下振荡2小时。向该反应溶液中加入0.10g(0.63mmol/g，0.063mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物14)，在室温下振荡24小时。

[转换率确认实验]

在另一个小瓶中称量62mg(0.21mmol，3.3eq)的Fmoc-Gly-OH和30mg(0.21mmol，3.3eq)的Oxyma，加入0.40mL(4v/w)的N,N-二甲基甲酰胺并溶解。向该溶液中加入65μL(0.42mmol，6.6eq)的DIC，在室温下振荡1小时。将该溶液转移到Fmoc-cLeu-OH的反应溶液中，在室温下振荡2小时。将反应溶液转移到带有滤片的一次性注射器中，过滤分离反应溶液和resin。使用N,N-二甲基甲酰胺0.80mL(8v/w)、异丙醇0.80mL(8v/w)将树脂交替地各清洗2次后，用N,N-二甲基甲酰胺0.80mL(8v/w)清洗2次，最后用0.80mL(8v/w)的MTBE清洗，在室温下通风干燥。将所得的干燥树脂(化合物16)浸渍在1％TFA的二氯甲烷溶液1mL中，进行脱树脂反应。

根据Gly-cap体(化合物17)和目标物(化合物18)的LC A％，算出转换率为75％(68.9÷(23.5+68.9)。

[表98]

(HPLC方法D：转换率的算出)

	Rt(min)	LC A％
			Gly-cap体(化合物17)	14.6	23.5
目标物(化合物18)	16.2	68.9

基于上述[缩合实验]，变更[缩合实验]的一部分后实施相同的反应，将所得的结果表示如下。

[表99]

Entry	变更点	变更后	转换率(％)
				1	-	-	75
2	Oxyma 1.5eq	HOAt 1.5eq	21
				3	Oxyma 1.5eq	HOOBt 1.5eq	3
4	Oxyma 1.5eq	TCNHPI 1.5eq	6
				5	Oxyma 1.5eq	Oxyma 0 eq	6
6	反应用DMF 8v/w	反应用DMF 4v/w	92

可知若在使作为空间位阻大的氨基酸的Fmoc-cLeu-OH缩合的反应中使用DIC和Oxyma，则高效地推进缩合反应。与Entry1相比，将添加剂从Oxyma分别变更为HOAt、HOOBt、或TCNHPI(Entry2～Entry4)后，转换率显著地降低。在不使用Oxyma的情况下(Entry5)，转换率显著地降低。在将溶剂从8v/w(Entry1)变更为4v/w(Entry6)的情况下，转换率提高。就添加剂而言，可知Oxyma优异。可知若使用Oxyma则转换率提高。可知若减少反应溶剂则转换率提高。

[参照例3]

Chem.Eur.J.,2009,15,9404-9416中记载的反应条件下的Fmoc-cLeu-MeVal- MeAsp(OCTC)-pip(化合物15)的合成(相对于resin的氨基酸，Fmoc氨基酸：缩合剂(COMU)＝ 3：3的反应条件)

[缩合实验]

在小瓶中称量73mg(0.21mmol，3.0eq)的Fmoc-cLeu-OH和89mg(0.21mmol，3.0eq)的COMU，加入0.80mL(8v/w)的N，N-二甲基甲酰胺并溶解。向该溶液中加入73μL(0.42mmol，6.0eq)的N，N-二异丙基乙基胺，在室温下振荡30分钟。向该反应溶液中加入0.10g(0.63mmol/g，0.063mmol，1.0eq)的干燥树脂(化合物14)，在室温下振荡16小时。

[转换率确认实验]

在另一个小瓶中称量62mg(0.21mmol，3.3eq)的Fmoc-Gly-OH和30mg(0.21mmol，3.3eq)的Oxyma，加入0.40mL(4v/w)的N，N-二甲基甲酰胺并溶解。向该溶液中加入65μL(0.42mmol，6.6eq)的DIC，在室温下振荡1小时。将该溶液转移到Fmoc-cLeu-OH的反应溶液中，在室温下振荡2小时。将反应溶液转移到带有滤片的一次性注射器中，过滤分离反应溶液和resin。用N，N-二甲基甲酰胺0.80mL(8v/w)、异丙醇0.80mL(8v/w)将树脂交替地各清洗2次后，用N，N-二甲基甲酰胺O.80mL(8v/w)清洗2次，最后用0.80mL(8v/w)的MTBE清洗，在室温下通风干燥。将所得的干燥树脂(化合物16)浸渍在1％TFA的二氯甲烷溶液1mL中，进行脱树脂反应。

根据Gly-cap体(化合物17)和目标物(化合物18)的LC A％，算出转换率为5.1％(4.7÷(88.3+4.7)。

[表100]

(HPLC方法D：转换率的算出)

	Rt(min)	LC A％
			Gly-cap体(化合物17)	15.5	88.3
目标物(化合物18)	17.1	4.7

若在使作为空间位阻大的氨基酸的Fmoc-cLeu-OH缩合的反应中使用COMU，则缩合反应的推进率为5％，未反应的Gly-cap体(化合物17)为主获得物。

产业上的可利用性

利用本发明，可以提供高效地制造肽化合物的方法，该肽化合物包含应用以往方法时不能达成缩合反应的、缺乏反应性的序列。

Claims

1.一种制造肽化合物的方法，是包括使第一氨基酸或肽与第二氨基酸或肽在添加剂及缩合剂的存在下缩合而得到缩合体的工序的制造肽化合物的方法，

添加剂的摩尔数少于第二氨基酸或肽的摩尔数。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为0.8以下。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为1.0以上。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

缩合剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为1.2～4.0。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为10以下。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1～2，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为0.7以下。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

第二氨基酸或肽相对于第一氨基酸或肽的摩尔比、即第1摩尔比为2以上，添加剂相对于第二氨基酸或肽的摩尔比为第1摩尔比-1以下。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

添加剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为2.0以下。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，

缩合剂相对于第一氨基酸或肽的摩尔比为1.3以上。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，

添加剂为Oxyma、HOBt、HOOBt或HOAt。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，

缩合剂为DIC、DCC、EDCI或EDCI·HCl。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，

所述肽化合物为所述缩合体，或者所述肽化合物在其结构中包含所述缩合体。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，

第一氨基酸或第一肽的N末端的氨基酸和/或第一肽的C末端的氨基酸为N-烷基氨基酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，

第一氨基酸或第一肽的C末端的氨基酸为N-烷基β氨基酸。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中，

第二氨基酸或第二肽的C末端的氨基酸为α,α-二取代氨基酸、β-支链氨基酸或N-烷基氨基酸。

16.一种环状肽化合物的制造方法，其包括利用权利要求1～15中任一项所述的方法得到肽化合物的工序、以及

将所述肽化合物环化的工序。