TW202210498A - 高難度序列之有效率的胜肽縮合法 - Google Patents

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岩崎浩太郎
和田本学
椎名淳一
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Abstract

發現經由對在N端追加的胺基酸或胜肽少量使用添加劑，即使在含有立體阻障大的胺基酸的情形，也能有效率地進行縮合反應，以高產率、高純度獲得目的之胜肽化合物。

Description

高難度序列之有效率的胜肽縮合法
本發明關於使用縮合反應之胜肽化合物的製造方法。
胜肽為胺基酸多數連結的分子，在生物進行生命活動上具有不可欠缺的作用。隨著生物學、化學的發展，對胜肽的理解加深，同時立志於新穎醫藥的創造之天然胜肽的利用、活用，或者經由胜肽的人為設計之機能性胜肽的研究、開發正在盛行（非專利文獻1）。特別是，已報導胜肽的環化、或構成胺基酸的N－烷基化、特別是N－甲基化，導致膜通透性或代謝安定性提升（非專利文獻2、非專利文獻3），或者成為細胞內移動或經口試劑的開發關鍵之類藥性（drug－like）的環狀胜肽結構的知識見解或調查，在胜肽創新藥物中該結構的重要性的認知度正在升高（專利文獻1）。
胜肽的合成是透過經由醯胺鍵的形成延長至所欲的序列所達成。更具體的方法例如液相法及固相法（非專利文獻4）。
其中，固相法是以連接於聚合物樹脂（固相合成用樹脂）的原子團作為連接子（linker），由 1）和胺基酸或胜肽的C端的羧基之共價鍵的形成（擔載步驟）， 2）在擔載的胺基酸或胜肽的N端胺基的脫保護反應之後，和下一個序列的胺基酸之縮合反應，以及達到所欲序列為止的這些脫保護反應及縮合反應的重複（延長步驟）， 3）從固相合成用樹脂之胜肽的切斷（脫樹脂步驟）， 所構成（非專利文獻5、6）。 固相法包含鍵結有目的物的固體的固相合成用樹脂，和溶解脫保護反應及縮合反應用試劑的液體的反應液接觸之步驟，在固體和液體的二層反應系統進行。由於目的物之胜肽鍵結於固相合成用樹脂，在各步驟之間，只要加入固相合成用樹脂的洗淨操作，就能夠讓過剩的試劑、及來自試劑的雜質從鍵結目的物胜肽的固相合成用樹脂分離，因此可簡便地實施逐次的延長。
在固相法所使用的胺基酸主鏈N端的胺基的保護基，廣泛使用Fmoc基或Boc基。
另一方面，固相合成用樹脂根據成為與樹脂所使用的聚合物鍵結的連接子之原子團而大致區別，廣泛使用與含有三苯甲基或苄基的連接子原子團鍵結的固相合成用樹脂。更具體地說，以CTC樹脂、Wang樹脂、SASRIN樹脂、或Rink Amide樹脂等為代表。脫樹脂步驟主要在酸性條件實施，但是根據連接子原子團對酸的安定性，決定脫樹脂的容易程度。例如，能夠以三苯甲基作為連接子而與胜肽鍵結的CLC樹脂之胜肽的脫樹脂反應，即使在弱酸性試劑也可實施。另一方面，能夠以苄基作為連接子而與胜肽鍵結的Wang樹脂之胜肽的脫樹脂反應，適用強酸條件（非專利文獻6）。
如已說明之胜肽的延長步驟，不管是固相法、液相法，都由胺基酸或胜肽的胺基、和新導入的N端胺基受保護之胺基酸的羧基，進行脫水縮合的縮合步驟，以及去除新的已導入的N端胺基的保護基之脫保護步驟的重複進行所構成。在此重複進行的步驟，當累積縮合反應的未完成、及／或副反應的競爭時，則有目的胺基酸序列的胜肽，產生胺基酸缺少、或加成之雜質的副產物，而有具有目的序列的胜肽的產率及／或純度下降之事。
在固相法的縮合反應時容易發生的副反應，已報導有除了縮合反應的未完成外，還有起因於羧酸的活化或反應溶液的液性之羧基α位的差向異構化（epimerization）、N端的甲脒基化（guanylation）、或脫N－Fmoc化或此等合併發生（非專利文獻6）。其中，縮合反應之反應未完成的對策，有報導比起使反應長時間化，再次提供於相同條件者較佳（非專利文獻6）。又有經由未完成所期望的縮合反應之未反應的N端胺基，和新導入的N端胺基受保護的之胺基酸（也稱為下一個序列的胺基酸）反應，產生缺損體的情形。為了防止此缺損體的生成，使例如無水醋酸或苯甲醯氯之醯化劑在吡啶存在下反應，使未完成所期望的縮合反應之未反應的N端胺基以醯化劑進行加蓋（capping），可阻止不期望的序列延長（非專利文獻6）。
當使用如所述的CTC樹脂，有可能在溫和的弱酸條件下進行胜肽的脫樹脂反應。使用CTC樹脂之胜肽的製造，有可能使具有在酸性下容易被去除的保護基的胜肽，在該保護基未被脫保護就選擇性地脫樹脂化，對於以所期望的保護基保護的胜肽之製造是有用的（非專利文獻7）。另一方面，使用CTC樹脂之胜肽的固相合成，胜肽可在溫和的條件從CTC樹脂被脫樹脂。因此，被報導在縮合反應條件下，擔載於CTC樹脂的胺基酸、或胜肽，和樹脂的連接子的共價鍵被切斷，使目的胜肽的產率下降（也稱為過早裂解（premature cleavage），或過早胜肽釋放（premature peptide release）、過早酸裂解（premature acidolytic cleavage））（非專利文獻8）。在此文獻，例示Gly、Pro、Leu作為擔載於CTC樹脂的胺基酸，分別調查在和Fmoc－Gly－OH的縮合反應中擔載胺基酸的CTC樹脂的安定性。結果確認，在組合以N,N’－二異丙基碳二亞胺作為縮合劑，以HOAt、Oxyma、或HOBt作為添加劑實施縮合反應的情形時，雖然有程度的差別，但不管是擔載的胺基酸或添加劑的種類，產率都下降，及產率的下降經時地增大。
對於使用CTC樹脂的固相合成法，有DIC／K－Oxyma的縮合條件，和DIC／Oxyma相比，大幅改善產率，以同等以上的純度提供髓鞘鹼性蛋白（myelin basic protein （MBP））的部分序列之報告（非專利文獻9）。
然而，使用DIC／K－Oxyma的縮合反應，被記載用於生成從胺基酸和縮合劑所獲得的活性酯的前處理時間的只有數分鐘的差異，造成C端羰基α位的差向異構化大幅地進行。因此，使用K－Oxyma的胜肽的固相合成法，有鑑於放大規模(scale up)伴隨的試劑的投入時間的長時間化，除了放大規模時的差向異構化率的增大外，純度的下降也被擔憂。
DIC替代試劑使用TOTU（非專利文獻10），但是必須在鹼性條件下反應，因此有差向異構化的可能性。再者，TOTU為昂貴的試劑，所以成為製造費用增加的主因，因此不佳。又，在該文獻也記載，除了因過早裂解的產率下降外，因過剩的延長體的副生成而純度下降之事例。亦即，記載使擔載Gly的固相合成用樹脂的Gly－OCTC作為起始原料，使用DIC／HOBt實施Fmoc胺基酸的延長反應時，獲得具有Gly－Gly－OCTC序列的副生成物。此副生成物推測是在第2殘基的胺基酸的延長反應時，擔載於CTC樹脂的Gly殘基被脫樹脂，和未反應的Gly－OCTC縮合所獲得者。
又記載，對於連接於CTC樹脂的Gly，透過使第2殘基的胺基酸延長，對CTC樹脂上的胜肽的酸的安定性增加，但是和非專利文獻8所記載的伴隨時間延長而產率下降之記載相反。亦即，可以說現在還不知道過早裂解的有效解決方法。從以上所述，在使用CTC樹脂之最初的延長、即二胜肽合成，產率下降和因擔載胺基酸殘基剩餘地被加入的過剩延長體的副生成而導致的純度下降是課題。
在胺基酸的縮合反應使用Oxyma作為添加劑的方法是已知。已記載當使用Oxyma作為添加劑，可抑制差向異構化，改善醯基化速度（非專利文獻11）。
在後述的專利文獻1、2、3、4、5、及6、和非專利文獻12，在經縮合反應的胜肽的製造中，使用多樣的縮合劑及添加劑。然而，在此等文獻沒有記載對於例如於過早裂解的胜肽的縮合反應中的課題。
專利文獻1提供對於過去為藥物開發困難的艱難目標（tough target）的有效的藥物開發技術，關於胜肽的新穎環化法和新穎胜肽或包含該等的資料庫。此文獻雖有以特定比例使用試劑的實施例，但沒有以解決例如於過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題為目的所設定之反應條件的記載。
在專利文獻2實施使用CTC樹脂的胜肽固相合成法。在文獻中只有記載，過去的製造方法受到伴隨胜肽鏈延長的非典型立體構形的影響，副反應進行，以及為了解決此問題而改良製造方法。又，構成胜肽的胺基酸不含有代表N取代胺基酸的非天然胺基酸，因此未記載關於起因於特殊的胺基酸結構之縮合反應的未完成等的問題之記述，或者用以解決關於縮合反應的問題之課題。
在專利文獻3進行，將使用Rink’s醯胺樹脂的胜肽的固相合成，實施事先將C端胺基酸轉換成活性酯的前處理步驟（也稱為預活化（preactivation）），之後，在已進行前處理步驟的反應液加入固相合成用樹脂之方法。但是，專利文獻3不過是記載了特定序列的胜肽（AMG416或其鹽）的製造，沒有揭示例如在立體阻障大的胺基酸彼此間的縮合反應之低反應性胺基酸的延長反應的改良。
專利文獻4記載關於脫Fmoc化反應的改良。但是，沒有記載對於例如在過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題。又，在此文獻所使用的胺基酸必須大量過剩，因此不適合用於含有較天然胺基酸難以獲得的N取代胺基酸所代表的非天然胺基酸之胜肽的製造。
專利文獻5記載，避免在固相合成中含有對酸不穩定的N取代胺基酸的胜肽的損壞之平穩的脫樹脂步驟法，及以該脫樹脂步驟無法去除的側鏈官能基的保護基。但是，沒有記載對於例如在過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題。
專利文獻6記載關於在固相合成的脫保護步驟中脫保護劑的處理方法。但是，沒有記載例如在過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題。
在非專利文獻12，記載對於不使用在固相法泛用的DMF或DCM，而使用環境調和性高的替代溶劑的固相法。但是，沒有記載例如在N取代胺基酸、α,α－二取代胺基酸、或β－支鏈胺基酸的立體阻障大的胺基酸的縮合反應。
如上所述，雖然已知在胜肽的製造上，縮合反應的產率、或因副反應而導致的胜肽純度的下降，但例如在過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題是最近才知道。在過去，僅僅知道在固相合成用樹脂擔載Gly、Pro、及Leu的情形，在縮合反應中胺基酸和固相合成用樹脂的鍵結斷裂，而且對於固相合成用樹脂擔載Gly之Gly－OCTC和導入保護基的天然胺基酸進行縮合的情形，獲得具有和目的胺基酸序列不同序列的過剩延長體。 ［先前技術文獻］ ［專利文獻］
專利文獻1：WO2013100132 專利文獻2：WO2011006644 專利文獻3：WO2015154031 專利文獻4：WO2017070512 專利文獻5：WO2018225851 專利文獻6：WO2019117274 ［非專利文獻］
非專利文獻1：Future Med. Chem., 2009, 1, 1289-1310. 非專利文獻2：Acc Chem. Res., 2008, 41, 1331-1342. 非專利文獻3：Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 254-269. 非專利文獻4：Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Volume 3, 2011. 非專利文獻5：Amino Acids, 2018, 50, 39-68. 非專利文獻6：Solid phase peptide synthesis （Bachem社發行）［2020年5月28日檢索］，Internet ＜URL: https:／／www.bachem.com／fileadmin／user_upload／pdf／Catalogs_Brochures／Solid_Phase_Peptide_Synthesis.pdf＞ 非專利文獻7：QSAR Comb. Sci., 2007, 26, 1027-1035. 非專利文獻8：ACS Comb. Sci., 2013, 15, 229-234. 非專利文獻9：Eur. J. Org. Chem. 2013, 6372-6378. 非專利文獻10：Side reactions in Peptide Synthesis, 2015, 1-31, Academic Press. 非專利文獻11：Chem. Eur. J. 2009, 15, 9394-9403. 非專利文獻12：Green. Chem., 2019, 21, 2594-2600.
［發明所欲解決之課題］
本發明人等面對習知以來的胜肽合成所廣泛使用的固相法的縮合反應條件應用於使用CTC樹脂的含有非天然胺基酸之胜肽化合物的製造上，因縮合反應的未完成、過早裂解導致的大幅的產率、純度下降的課題。如此縮合反應時的問題不僅是非專利文獻8、9、10所記載的天然α胺基酸彼此的縮合反應，發現在例如N取代胺基酸、或在側鏈β位具有支鏈的胺基酸（也稱為β－支鏈胺基酸）的立體阻障大、縮合反應的反應性差的序列中顯著。本發明以提供在胜肽的固相合成法、特別是縮合反應的步驟中，可抑制過早裂解，且也可抑制反應的未完成、差向異構化的競爭等的副反應，而且使用可容易獲取的縮合劑及添加劑，即使在因稀少性的程度而減少使用量為佳的非天然胺基酸也可適用的縮合條件，以高產率製造高純度的胜肽化合物之方法為課題。 ［用以解決課題之手段］
本發明人等為了解決上述課題，致力檢討對於主要在固相合成用樹脂擔載N取代胺基酸的第一胺基酸，使第二胺基酸縮合，獲得2殘基的胜肽之1殘基+1殘基的合成。在使用泛用於胜肽合成的縮合劑之例如DIC的碳二亞胺化合物、和添加劑之例如Oxyma的N－羥基化合物的縮合反應中，將導入的胺基酸、縮合劑、及添加劑以相同的當量比使用是泛用的條件。但是，此泛用條件無法解決在例如過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題。為了解決如此課題進行致力研究，本發明人等在檢討對於第一胺基酸或胜肽、及／或第二胺基酸或胜肽的縮合劑、及添加劑的各種的當量比的改變時，發現解決在例如過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題之方法。
亦即發現，在使因為立體阻障大而使醯胺化反應難以進行的序列，具體為N取代胺基酸、α,α－二取代胺基酸、β－支鏈胺基酸、或側鏈體積大的胺基酸，進行縮合、延長胺基酸的縮合反應，使用根據第一胺基酸或胜肽、及／或第二胺基酸或胜肽所計算的莫耳比的縮合劑及添加劑之方法。本發明之方法在該一方面，發現解決在例如過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題。再者，本發明之方法在該一方面，發現可製造具有目的序列的胜肽化合物。再者，本發明之方法在該一方面，發現能夠以高產率進行目的縮合反應。再者，本發明之方法在該一方面，發現可抑制例如差向異構化的副反應。再者，本發明之方法在該一方面，發現由於醯胺化反應以充足的轉換率進行，能夠以高產率、高純度獲得目的之胜肽化合物。
具體地發現，對於追加在N端的胺基酸或胜肽（即，第二胺基酸或胜肽），改變添加劑的莫耳比是有效果的，特別是對於追加在N端的胺基酸或胜肽，少量使用添加劑者為佳。再者，發現改變縮合劑的莫耳比也是有效果的，特別是對追加在N端的胺基酸或胜肽，過剩地使用縮合劑者為佳。再者，發現改變縮合劑和添加劑雙方的莫耳比更為有效。本發明之方法發現不僅是在立體阻障大的胺基酸或胜肽的縮合，即使是在立體阻障小的胺基酸或胜肽的縮合反應，醯胺化反應以充足的轉換率進行，以高產率、高純度獲得目的之胜肽化合物。
亦即，本發明在非限定的具體一態樣包含下述。 ［1］一種製造胜肽化合物之方法，包括使第一胺基酸或胜肽、和第二胺基酸或胜肽，在添加劑和縮合劑的存在下進行縮合，獲得縮合體之步驟， 其中，添加劑的莫耳數小於第二胺基酸或胜肽的莫耳數。 ［2］如［1］記載之方法，其中，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.8以下。 ［3］如［1］或［2］記載之方法，其中，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為1.0以上。 ［4］如［1］～［3］任一項記載之方法，其中，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為1.2～4.0。 ［5］如［1］～［4］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為10以下。 ［6］如［1］～［5］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1～2，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.7以下。 ［7］如［1］～［6］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比（第一莫耳比）為2以上，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為第一莫耳比－1以下。 ［8］如［1］～［7］任一項記載之方法，其中，添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為2.0以下。 ［9］如［1］～［8］任一項記載之方法，其中，縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1.3以上。 ［10］如［1］記載之方法，其中，第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑的莫耳比為，第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約2：約4～6：約1。 ［11］如［1］記載之方法，其中，第一胺基酸或胜肽、第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑的莫耳比為，第一胺基酸或胜肽：第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約1：約2：約4：約1、約1：約2.4：約7.2：約1.2、或約1：約3：約6：約1.5。 ［12］如［1］～［11］任一項記載之方法，其中，添加劑為Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt。 ［13］如［1］～［12］任一項記載之方法，其中，縮合劑為DIC、DCC、EDCI、或EDCI・HCl。 ［14］如［1］～［13］任一項記載之方法，其中，添加劑為Oxyma。 ［15］如［1］～［14］任一項記載之方法，其中，該胜肽化合物為該縮合體，或者該胜肽化合物在其結構中包含該縮合體。 ［16］如［1］～［15］任一項記載之方法，其以固相法進行。 ［17］如［1］～［16］任一項記載之方法，其中，第一胺基酸或胜肽擔載於固相合成用樹脂。 ［18］如［17］之方法，其中，該固相合成用樹脂為三苯甲基型樹脂。 ［19］如［18］之方法，其中，該三苯甲基型樹脂為CTC樹脂、Mmt樹脂、或Mtt樹脂。 ［20］如［1］～［19］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸或胜肽的胺基受保護基保護。 ［21］如［20］之方法，其中，該保護基為具有Fmoc骨架結構的保護基。 ［22］如［1］～［21］任一項記載之方法，其中，該步驟在選自由DMF、NMP、DMI、四氫呋喃、2－甲基四氫呋喃、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、及乙腈所組成的群組之溶劑中進行。 ［23］如［17］～［22］任一項記載之方法，其中，更包括去除固相合成用樹脂的步驟。 ［24］如［20］～［23］任一項記載之方法，其中，更包括去除保護基的步驟。 ［25］如［1］～［24］任一項記載之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的N端的胺基酸，及／或第一胜肽的C端的胺基酸，為N－烷基胺基酸。 ［26］如［24］記載之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的C端的胺基酸為N－烷基β胺基酸。 ［27］如［25］記載之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的N端的胺基酸，及／或第一胜肽的C端的胺基酸，為下式所表：
Figure 02_image001
式中， 當第一胺基酸、或第一胜肽的N端的胺基酸為式（1）所表胺基酸的情形時，R11 為氫，當第一胜肽的C端的胺基酸為式（1）所表胺基酸的情形時，R11 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點， P11 為氫或C1 －C6 烷基，且R12 為氫、CONR12A R12B 、COOR12C 、C1 －C6 烷基、C3 －C8 環烷基、C7 －C14 芳烷基、5～10員雜芳基C1 －C6 烷基、受保護的5～10員雜芳基C1 －C6 烷基、C1 －C6 羥烷基、受保護的C1 －C6 羥烷基、C1 －C6 羧烷基、受保護的C1 －C6 羧烷基、C1 －C6 胺烷基、受保護的C1 －C6 胺烷基、C1 －C6 烷基硫基C1 －C6 烷基，或者 P11 及R12 和P11 所鍵結的氮原子及R12 所鍵結的碳原子一起形成4～7員飽和雜環， Q12 為氫或C1 －C6 烷基， R12A 及R12B 獨立為C1 －C4 烷基，或者 R12A 及R12B 和該等鍵結的氮原子一起形成也可包含1個或複數個追加的雜原子的4～8員環， L11 為單鍵或－CH2 －， 當第一胺基酸、或第一胜肽的C端的胺基酸為式（1）所表的胺基酸的情形時，R13 表示和固相合成用樹脂的鍵結點，當第一胜肽的N端的胺基酸為式（1）所表的胺基酸的情形時，R13 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點。 ［28］如［27］記載之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的N端的胺基酸、及／或第一胜肽的C端的胺基酸為MeAsp－pip、MeAsp－aze、MeAsp－pyrro、MeAsp－mor、MeAsp－mor（26－bicyc）、MeAsp－OtBu、MeAsp－NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D－3－MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly（cPent）、MeChg、MePhe、MeTrp（Boc）、MeThr（Bzl）、MeGlu（OtBu）、MeLys（Boc）、MeMet、Aze（2）、或Aib。 ［29］如［1］～［28］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸為α,α－二取代胺基酸、β－支鏈胺基酸、N－烷基胺基酸、或其他具有碳數2以上的側鏈的胺基酸。 ［30］如［29］記載之方法，其中，β－支鏈胺基酸為下式所表：
Figure 02_image004
式中， P21 為氫或C1 －C6 烷基， R21 及R22 各自獨立為C1 －C4 烷基、C1 －C6 烷氧基、或C1 －C6 烷氧基C1 －C6 烷基，或者R21 及R22 和此等鍵結的碳一起形成3～8員脂環式環， 當第二胺基酸為式（2A）所表的胺基酸的情形時，R23 表示和胺基的保護基的鍵結點，當第二胜肽的C端的胺基酸為式（2A）所表的胺基酸的情形時，R23 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點。 ［31］如［30］記載之方法，其中，β－支鏈胺基酸為MeVal、D－MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly（cPent）、Gly（cPent）、MeGly（cBu）、Gly（cBu）、MeGly（cPr）、Gly（cPr）、MeThr（tBu）、或Thr（tBu）。 ［32］如［29］記載之方法，其中，α,α－二取代胺基酸為下式所表：
Figure 02_image006
式中， P22 為氫或C1 －C6 烷基， R23 及R24 獨立選自C1 －C6 烷基、C2 －C6 烯基、或可被取代的C7 －C14 芳烷基，或者 R23 及R24 和該等鍵結的碳原子一起形成3～8員脂環式環或4～7員飽和雜環， 當第二胺基酸為式（2B）所表的胺基酸的情形時，R25 表示和胺基的保護基的鍵結點，當第二胜肽的C端的胺基酸為式（2B）所表的胺基酸的情形時，R25 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點。 ［33］如［32］記載之方法，其中，α,α－二取代胺基酸為Aib、（Me）Abu、（Me）Leu、（Me）Algly、（Me）Phe、（Me）Phe（3－I）、1－ACPrC、cVal、cLeu、cHex、或Athpc。 ［34］如［1］～［33］任一項記載之方法，其中，第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸為N－烷基胺基酸。 ［35］如［34］記載之方法，其中，N－烷基胺基酸為MeAsp－pip、MeAsp－aze、MeAsp－pyrro、MeAsp－mor、MeAsp－mor（26－bicyc）、MeAsp－OtBu、D－3－MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze（2）、Pro、MeAsp－NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly（cPent）、MeGly（cBu）、MeGly（cPr）、MeThr（tBu）、D－MeVal、MeTrp（Boc）、MeThr（Bzl）、MeGlu（OtBu）、MeLys（Boc）、或MeMet。 ［36］如［29］記載之方法，其中，其他具有碳數2以上的側鏈的胺基酸為Lys（Z）、Glu（OBzl）、或Ser（tBu）。 ［37］一種環狀胜肽化合物之製造方法，包括 經由如［1］～［36］任一項記載之方法獲得胜肽化合物之步驟，以及 使該胜肽化合物環化之步驟。 ［發明功效］
根據本發明，可效率良好地製造含有縮合反應的反應性差的序列之胜肽化合物。具體地說，可提高包括胜肽化合物的產率、純度的提升的生產性。亦即，本發明之方法，在該一方面，不用說過早裂解的抑制效果，也能製造即使含有在應用習知方法時縮合反應未完成的胺基酸序列之胜肽化合物，或是含有和差向異構化拮抗的胺基酸序列之胜肽化合物，因此，可提高胜肽化合物的產率及／或純度。又，本發明之方法，在該一方面，即使縮合反應長時間化也能將副反應抑制到最小限度，及／或追加在N端的胺基酸或胜肽能使用最低限度的量完成結束反應，因此可減少其使用量。以本發明之方法，即使減少試劑量也能使反應完成結束，因此和習知方法不同，不必使用過量的試劑，或實施重複相同條件的雙耦合法（double coupling）。結果即使在使用醯胺化難度高的胺基酸或胜肽的情形時，也可抑制試劑量至最小限度。這是特別適合含有昂貴且稀少的非天然胺基酸殘基之胜肽化合物的合成之方法。又，在一方面，本發明之方法和習知方法相比，減少縮合時的溶劑，在高濃度實施反應時的反應促進效果大，也可減少所使用的胺基酸量，因此不用說在縮合時、在縮合後的試劑洗淨的必要溶劑量也可以減少。
再者，已知當超過習知方法的最佳化的量、在各種固相合成用樹脂擔載胺基酸的情形時，以習知方法則縮合反應不完成結束、副反應變得顯著。但是，即使是使用那樣的量的情形，如果應用本發明之一態樣，也能使反應完成結束。因此，能夠增加經由一次的固相法的製造而產生的胜肽的量。
本發明解決擔載在三苯甲基型樹脂（例如CTC樹脂）的胺基酸或胜肽、和使延長的胺基酸或胜肽的縮合反應在例如過早裂解的胜肽的縮合反應之特有的課題，且可使擔載於樹脂的胺基酸或胜肽進行充分地消耗，因此可有效率地將起始原料轉換為目的物。
［用以實施發明的形態］
在本說明所使用的簡稱如下記載。 A%：面積%（area %） Alloc：烯丙基氧羰基 Aze：氮雜環丁酮基（azetidino） Boc：tert－丁氧基羰基 Cbz: 苄基氧羰基 COMU：（1－氰基－2－乙氧基－2－側氧基亞乙基胺基氧基）二甲基胺基－嗎啉基－碳鎓六氟磷酸鹽（（1－cyano－2－ethoxy－2－oxoethylidenaminooxy）dimethylamino－morpholino－carbenium hexafluorophosphate） CTC：2－氯三苯甲基 CTC樹脂：2－氯三苯甲基氯（Cl-Trt（2-Cl））樹脂 DCC：N,N’－二環己基碳二亞胺 DCM：二氯甲烷 DIC：N,N’－二異丙基碳二亞胺 DMA：N,N－二甲基乙醯胺 DMF：N,N－二甲基甲醯胺 DMI：1,3－二甲基－2－咪唑啶酮（1,3－dimethyl－2－imidazolidinone） EDCI：1－乙基－3－（3－二甲基胺基丙基）碳二亞胺 Fmoc：9－茀基甲基氧羰基 HATU：O－（7－氮雜苯并三唑－1－基）－N,N,N',N'－四甲基脲六氟磷酸鹽（O－（7－azabenzotriazol－1－yl）－N,N,N',N'－tetramethyluronium hexafluorophosphate） HMDS：1,1,1,3,3,3－六甲基二矽氮烷（1,1,1,3,3,3－hexamethyldisilazane） HOAt：1－羥基－7－氮雜苯并三唑 HOBt：1－羥基苯并三唑 HPLC：高效液相層析法 iPr2 NEt：N,N－二異丙基乙基胺 K－Oxyma：（羥基亞胺基）氰基乙酸乙酯鉀鹽 MeCN：乙腈 MeOH：甲醇 2－MeTHF：2－甲基四氫呋喃 Mmt樹脂：4－甲氧基三苯甲基氯樹脂 Mor：嗎啉基 MTBE：甲基tert－丁基醚 Mtt樹脂：4－甲基三苯甲基氯樹脂 NMP：N－甲基－2－吡咯酮 Oxyma：（羥基亞胺基）氰基乙酸乙酯 PDA：光電二極體陣列偵測器 Pip：哌啶基（piperidino） Pyrro：吡咯啶基 t－Bu：t－丁基 Teoc：2－（三甲基矽基）乙氧基羰基 TFA：三氟乙酸 TMSOTf：三氟甲烷磺酸三甲基矽酯 TMU：四甲基脲 TOTU：O－［（乙氧基羰基）氰基亞甲基胺基］－N,N,N',N'－四甲基脲四氟硼酸鹽（O－［（ethoxycarbonyl）cyanomethylenamino］－N,N,N',N'－tetramethyluronium Tetrafluoroborate）
本說明書中所使用的β－支鏈胺基酸、α,α—二取代胺基酸、及N－烷基胺基酸的簡稱及其結構之關係如下所示。又在下表列舉各胺基酸以Fmoc基保護胺基的形式，但是去除Fmoc基而具有游離的胺基的各胺基酸或其殘基的簡稱及該等的結構之關係，也可從下表掌握。具體地說，例如MeAsp（OH）－pip為具有從下表的Fmoc－MeAsp（OH）－pip去除Fmoc基的以下結構之胺基酸，是此技術領域之人士自可理解，為該胺基酸殘基的MeAsp－pip的結構也是此技術領域之人士自可理解。
Figure 02_image008
［表1－1］
Figure 02_image010
［表1－2］
Figure 02_image012
（官能基等的定義） 本說明書中的「鹵素原子」為例如F、Cl、Br、或I。
本說明書中的「烷基」為從脂肪族烴去除任意的1個氫原子所衍生的1價基，骨架結構中不含有雜原子（碳及氫原子以外的原子）或不飽和的碳－碳鍵，具有含氫及碳原子的烴基（hydrocarbyl）或烴基（hydrocarbon group）結構的部分集合。烷基不僅有直鏈狀者，也包含支鏈狀者。烷基具體為碳原子數1～20（C1 －C20 ，下述的「Cp －Cq 」表示碳原子數為p～q個）的烷基，較佳如C1 －C10 烷基，更佳如C1 －C6 烷基。烷基具體例如甲基、乙基、n－丙基、i－丙基、n－丁基、s－丁基、t－丁基、異丁基（2－甲基丙基）、n－戊基、s－戊基（1－甲基丁基）、t－戊基（1,1－二甲基丙基）、新戊基（2,2－二甲基丙基）、異戊基（3－甲基丁基）、3－戊基（1－乙基丙基）、1,2—二甲基丙基、2－甲基丁基、n－己基、1,1,2－三甲基丙基、1,2,2－三甲基丙基、1,1,2,2－四甲基丙基、1,1－二甲基丁基、1,2－二甲基丁基、1,3－二甲基丁基、2,2－二甲基丁基、2,3－二甲基丁基、3,3－二甲基丁基、1－乙基丁基、2－乙基丁基等。
本說明書中「烯基」為具有至少1個雙鍵（2個鄰接SP2 碳原子）的1價基。根據雙鍵及取代部分（如果存在的話）的配置，雙鍵的幾何學形態可採對側（entgegen，E）或同側（zusammen，Z）、順式或反式配置。烯基不只有直鏈狀，也包含支鏈狀。烯基較佳如C2 －C10 烯基，更佳如C2 －C6 烯基，具體例如乙烯基、烯丙基、1－丙烯基、2－丙烯基、1－丁烯基、2－丁烯基（包含順式、反式）、3－丁烯基、戊烯基、3－甲基－2－丁烯基、己烯基等。
本說明書中「炔基」為具有至少1個三鍵（2個鄰接SP碳原子）的1價基。炔基不只有直鏈狀，也包含支鏈狀。炔基較佳如C2 －C10 炔基，更佳如C2 －C6 炔基，具體例如乙炔基、1－丙炔基、炔丙基、3－丁炔基、戊炔基、己炔基、3－苯基－2－丙炔基、3－（2’－氟苯基）－2－丙炔基、2－羥基－2－丙炔基、3－（3－氟苯基）－2－丙炔基、3－甲基－（5－苯基）－4－戊炔基等。
本說明書中「環烷基」表示飽和或部分飽和的環狀1價脂肪族烴基，包含單環、雙環、螺環。環烷基較佳如C3 －C8 環烷基，具體如環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基、雙環［2.2.1］庚基、螺［3.3］庚基等。
本說明書中「芳基」表示1價的芳香族烴環，較佳如C6 －C10 芳基。芳基具體如苯基、萘基（如1－萘基、2－萘基）等。
本說明書中「雜環基」表示除碳原子外還含有1～5個雜環子的非芳香族環狀1價基。雜環基可為環中具有雙鍵及三鍵，也可為環中的碳原子氧化形成羰基，可為單環也可為縮合環。構成環的原子數較佳為4～10（4～10員雜環基），更佳為4～7（4～7員雜環基）。雜環基具體如四氫氮唉基（azetidinyl）、氧環丁基（oxetanyl）、二氫呋喃基（dihydrofuryl）、四氫呋喃基、二氫哌喃基（dihydropyranyl）、四氫哌喃基、四氫吡啶基（tetrahydropyridyl）、四氫嘧啶基（tetrahydropyrimidyl）、嗎啉基（morpholinyl）、硫代嗎啉基、吡咯啶基（pyrrolidinyl）、哌啶基（piperidinyl）、哌嗪基（piperazinyl）、吡唑啶基（pyrazolidinyl）、咪唑啉基（imidazolinyl）、咪唑啶基（imidazolidinyl）、噁唑啶基（oxazolidinyl）、異噁唑啶基、四氫噻唑基（thiazolidinyl）、異四氫噻唑基、1,2－噻嗪烷（1,2－thiazinane）、噻二唑啶基（thiadiazolidinyl）、四氫氮唉基（azetidinyl）、噁唑烷酮（oxazolidone）、苯并二噁烷基（benzodioxanyl）、苯并噁唑基（benzoxazolyl）、二氧環戊烷基（dioxolanyl）、二氧雜環己烷基（dioxanyl）、四氫吡咯併［1,2－c］咪唑基（tetrahydropyrrolo［1,2-c］imidazole）、硫雜環丁基（thietanyl）、3,6－二氮雜雙環［3.1.1］庚基（3,6-diazabicyclo［3.1.1］heptanyl）、2,5－二氮雜雙環［2.2.1］庚基（2,5-diazabicyclo［2.2.1］heptanyl）、3－氧雜－8－氮雜雙環［3.2.1］辛基（3-oxa-8-azabicyclo［3.2.1］octanyl）、磺內醯胺（sultams）、2－氧雜螺［3.3］庚基（2-oxaspiro［3.3］heptyl）等。
本說明書中「雜芳基」表示除了碳原子外還含有1～5個雜原子的芳香族性環狀1價基。環可為單環，也可為和其他環的縮合環，也可部分飽和。構成環的原子數較佳為5～10（5～10員雜芳基），更佳為5～7（5～7員雜芳基）。雜芳基具體如呋喃基（furyl）、噻吩基（thienyl）、吡咯基（pyrrolyl）、咪唑基（imidazolyl）、吡唑基（pyrazolyl）、噻唑基（thiazolyl）、異噻唑基（isothiazolyl）、噁唑基（oxazolyl）、異噁唑基（isoxazolyl）、噁二唑基（oxadiazolyl）、噻二唑基（thiadiazolyl）、三唑基（triazolyl）、四唑基（tetrazolyl）、吡啶基（pyridyl）、嘧啶基（pyrrimidyl）、嗒嗪基（pyridazinyl）、吡嗪基（pyrazinyl）、三嗪基（triazinyl）、苯并呋喃基（benzofuranyl）、苯并噻吩基（benzothienyl）、苯并噻二唑基（benzothiadiazolyl）、苯并噻唑基（benzothiazolyl）、苯并噁唑基（benzoxazolyl）、苯并噁二唑基（benzoxadiazolyl）、苯并咪唑基（benzoimidazolyl）、吲哚基（indolyl）、異吲哚基（isoindolyl）、吲唑基（indazolyl）、喹啉基（quinolyl）、異喹啉基（isoquinolyl）、辛啉基（cinnolinyl）、喹唑啉基（quinazolinyl）、喹噁啉基（quinoxalinyl）、苯并1,3-二氧呃基（benzodioxolyl）、吲哚嗪基（indolizinyl）、咪唑併吡啶基等。
本說明書中「烷氧基」表示上述定義之「烷基」鍵結的氧基，較佳如C1 －C6 烷氧基。烷氧基具體如甲氧基、乙氧基、1－丙氧基、2－丙氧基、n－丁氧基、i－丁氧基、s－丁氧基、t－丁氧基、戊氧基、3－甲基丁氧基等。
本說明書中「烷基硫基」表示上述定義之「烷基」鍵結的硫基，較佳如C1 －C6 烷基硫基。烷氧基具體如甲基硫基、乙基硫基、1－丙基硫基、2－丙基硫基、n－丁基硫基、i－丁基硫基、s－丁基硫基、t－丁基硫基等。
本說明書中「胺基」狹義地表示－NH2 ，廣義地表示－NRR’，此處R及R’獨立選自氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基、或雜芳基，或者R及R’和該等鍵結的氮原子一起形成環。胺基較佳如－NH2 、單C1 －C6 烷基胺基、二C1 －C6 烷基胺基、4～8員環狀胺基等。
本說明書中「醯基（acyl、alkanoyl）」表示在氫或上述「烷基」鍵結羰基之基，較佳如C1 －C6 醯基，更佳如C2 －C4 醯基。醯基具體如甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基等。
本說明書中「環烷氧基」表示上述定義之「環烷基」鍵結的氧基，較佳如C3 －C8 環烷氧基。環烷氧基具體如環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基等。
本說明書中「烷基磺醯基」表示上述定義之「烷基」鍵結的磺醯基，較佳如C1 －C6 烷基磺醯基。烷基磺醯基具體例如甲基磺醯基等。
本說明書中「羥烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個的氫被羥基取代的基，較佳為C1 －C6 羥烷基。羥烷基具體如羥甲基、1－羥乙基、2－羥乙基、2－羥基－2－甲基丙基、5－羥戊基等。
本說明書中「羧烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個的氫被羧基取代的基，較佳為C1 －C6 羧烷基。羧烷基具體如羧甲基、1－羧乙基、2－羧乙基等。
本說明書中「受保護的羧烷基」表示上述定義之「羧烷基」所含的羧基被任意的保護基所保護的基。羧基的保護基具體如甲基、乙基、t－Bu基、苄基、三苯甲基、異丙苯基（cumyl）、甲氧基三苯甲基、2－（三甲基矽基）乙基、2,2,2－三氯乙基、烯丙基等。
本說明書中「胺烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個氫被上述定義之「胺基」所取代的基，較佳為C1 －C6 胺烷基。胺烷基具體如1－吡啶基甲基、2－（1－哌啶基）乙基、3－（1－哌啶基）丙基、4－胺基丁基等。
本說明書中「受保護的胺烷基」表示上述定義之「胺烷基」所含的胺基被任意的保護基所保護的基。胺基的保護基具體如Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙醯基、五氟丙醯基、酞醯基（phthaloyl）、甲苯磺醯基（tosyl）、2－硝基苯磺醯基、4－硝基苯磺醯基、2,4－二硝基苯磺醯基等。
本說明書中「鹵烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個氫被鹵素所取代的基，較佳為C1 －C6 鹵烷基，更佳為C1 －C6 氟烷基。鹵烷基具體如二氟甲基、三氟甲基、2,2－二氟乙基、2,2,2－三氟乙基、3,3－二氟丙基、4,4－二氟丁基、5,5－二氟戊基等。
本說明書中「烷氧基烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個氫被上述定義之「烷氧基」所取代的基，以C1 －C6 烷氧基C1 －C6 烷基為佳，以C1 －C6 烷氧基C1 －C2 烷基較佳。烷氧基烷基具體如甲氧基甲基、乙氧基甲基、1－丙氧基甲基、2－丙氧基甲基、n－丁氧基甲基、i－丁氧基甲基、s－丁氧基甲基、t－丁氧基甲基、戊氧基甲基、3－甲基丁氧基甲基、1－甲氧基乙基、2－甲氧基乙基、2－乙氧基乙基等。
本說明書中「烷基硫基烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個氫被上述定義之「烷基硫基」所取代的基，以C1 －C6 烷基硫基C1 －C6 烷基為佳，以C1 －C6 烷基硫基C1 －C2 烷基較佳。烷基硫基烷基具體如甲基硫基甲基、乙基硫基甲基、1－丙基硫基甲基、2－丙基硫基甲基、n－丁基硫基甲基、i－丁基硫基甲基、s－丁基硫基甲基、t－丁基硫基甲基、1－甲基硫基乙基、2－乙基硫基乙基等。
本說明書中「鹵烷氧基」表示上述定義之「烷氧基」的1個或複數個的氫被鹵素所取代的基，較佳為C1 －C6 鹵烷氧基。鹵烷氧基具體如二氟甲氧基、三氟甲氧基、2,2－二氟乙氧基、2,2,－三氟乙氧基等。
本說明書中「鹵醯基（鹵化醯基）」表示羰基鍵結在上述定義之「鹵烷基」的基，較佳如C2 －C6 鹵醯基，更佳如C2 －C4 鹵醯基。鹵醯基具體如三氟乙醯基、三氯乙醯基、五氟丙醯基、2,3,3,3－四氟－2－（三氟甲基）丙醯基、3,3,3－三氟－2－（三氟甲基）丙醯基等。
本說明書中「環烷基烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個的氫被上述定義之「環烷基」所取代的基，較佳為C3 －C8 環烷基C1 －C6 烷基，更佳為C3 －C6 環烷基C1 －C2 烷基。環烷基烷基具體如環丙基甲基、環丁基甲基、環戊基甲基、環己基甲基等。
本說明書中「環烷氧基烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個的氫被上述定義之「環烷氧基」所取代的基，以C3 －C8 環烷氧基C1 －C6 烷基為佳，以C3 －C6 環烷氧基C1 －C2 烷基較佳。環烷氧基烷基具體如環丙氧基甲基、環丁氧基甲基等。
本說明書中「烷基磺醯基烷基」表示上述定義之「烷基」的1個或複數個的氫被上述定義之「烷基磺醯基」所取代的基，以C1 －C6 烷基磺醯基C1 －C6 烷基為佳，以C1 －C6 烷基磺醯基C1 －C2 烷基較佳。烷基磺醯基烷基具體如甲基磺醯基甲基、2－（甲基磺醯基）乙基等。
本說明書中「芳烷基（芳基烷基）」表示上述定義之「烷基」的至少1個氫原子被上述定義之「芳基」所取代的基，以C7 －C14 芳烷基為佳，以C7 －C10 芳烷基較佳。芳烷基具體如苄基、苯乙基、3－苯基丙基等。
本說明書中「雜芳基烷基」表示上述定義之「烷基」的至少1個氫原子被上述定義之「雜芳基」所取代的基，以5～10員雜芳基C1 －C6 烷基為佳，以5～10員雜芳基C1 －C2 烷基較佳。雜芳基烷基具體如3－噻吩基甲基、4－噻唑基甲基、2－吡啶基甲基、3－吡啶基甲基、4－吡啶基甲基、2－（2－吡啶基）乙基、2－（3－吡啶基）乙基、2－（4－吡啶基）乙基、2－（6－喹啉基）乙基、2－（7－喹啉基）乙基、2－（6－吲哚基）乙基、2－（5－吲哚基）乙基、2－（5－苯并呋喃基）乙基等。
本說明書中「受保護的雜芳基烷基」表示上述定義之「雜芳基烷基」所含的1個或複數個的官能基例如胺基被任意的保護基所保護的基。保護基具體如Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙醯基、五氟丙醯基、酞醯基（phthaloyl）、甲苯磺醯基、2－硝基苯磺醯基、4－硝基苯磺醯基、2,4－二硝基苯磺醯基等。
本說明書中「羧基的保護基」例如烷基酯型的保護基、苄基酯型的保護基、經取代的烷基酯型的保護基等。羧基的保護基具體如甲基、乙基、t－Bu基、苄基、三苯甲基、異丙苯基（cumyl）、甲氧基三苯甲基、2－（三甲基矽基）乙基、2,2,2－三氯乙基、烯丙基等。
本說明書中「胺基的保護基」例如胺甲酸酯型的保護基、醯胺型的保護基、亞胺型的保護基、磺胺型的保護基等。胺基的保護基具體如Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、三氟乙醯基、五氟丙醯基、酞醯基（phthaloyl）、甲苯磺醯基、2－硝基苯磺醯基、4－硝基苯磺醯基、2,4－二硝基苯磺醯基等。
本說明書中的「脂環式環」表示非芳香族烴環。脂環式環可在環中具有不飽和鍵，也可以是具有2個以上的環之多環性的環。又，也可以是構成環的碳原子被氧化形成羰基。脂環式環較佳如3～8員脂環式環，具體如環丙烷環、環丁烷環、環戊烷環、環己烷環、環庚烷環、環辛烷環、雙環［2.2.1］庚烷環等。
本說明書中的「飽和雜環」表示除碳原子外還含有1～5個雜原子、環中不含雙鍵及／或三鍵之非芳香族的雜環。飽和雜環也為單環，也可以和其他環如苯環等的芳香環形成縮合環。飽和雜環較佳如4～7員飽和雜環，具體如四氫氮唉環（azetidine）、氧環丁烷環（oxetane）、四氫呋喃環、四氫吡喃環、嗎啉環、硫代嗎啉環、吡咯啶環（pyrrolidine）、4－側氧基吡咯啶環、哌啶環、4－側氧基哌啶環、哌嗪環（piperazine）、吡唑啶環（pyrazolidine）、咪唑啉環（imidazoline）、噁唑啶環（oxazolidine）、異噁唑啶環、四氫噻唑環（thiazolidine）、異四氫噻唑環、噻二唑啶環（thiadiazolidine）、唑烷酮環（oxazolidone）、二氧環戊烷環（dioxolane）、二噁烷環（dioxane）、硫雜環丁烷環（thietane）、八氫吲哚環、吲哚啉環（indoline）等。
本說明書中「胜肽」表示1個或其以上的天然胺基酸及／或非天然胺基酸經醯胺鍵及／或酯鍵所連接的胜肽。胜肽較佳為含有1～15個胺基酸殘基的胜肽，更佳為由5～12個胺基酸殘基所形成的胜肽。
本說明書中之「胜肽化合物」只要是天然胺基酸及／或非天然胺基酸經醯胺鍵及／或酯鍵所連接的胜肽化合物，則沒有特別限定，較佳為5～30個殘基、更佳為8～15個殘基、再更佳為9～13個殘基的胜肽化合物。在本發明所合成的胜肽化合物，較佳為1個胜肽中含有至少3個N取代胺基酸者，更佳為含有至少5個以上的N取代胺基酸者。這些N取代胺基酸可在胜肽化合物中連續地存在，也可不連續地存在。本發明中的胜肽化合物可為直鏈狀也可為環狀，以環狀胜肽化合物為佳。
本說明書中之「環狀胜肽化合物」為，經由使直鏈胜肽化合物的N端側的基和C端側的基環化可得的環狀的胜肽化合物。環化可為經由如醯胺鍵的碳－氮鍵的環化、經由如酯鍵或醚鍵的碳－氧鍵的環化、經由如硫醚鍵的碳－硫鍵的環化、經由碳－碳鍵的環化、或者經由雜環構築的環化等之任何形態。這些之中，以透過醯胺鍵或碳－碳鍵等的共價鍵的環化為佳，以透過經側鏈的羧基和N端的主鏈的胺基之醯胺鍵的環化為較佳。環化所使用的羧基或胺基等的位置可在主鏈上，也可在側鏈上，只要在可環化的位置則沒有特別限制。
胜肽化合物的「環化」表示形成含有4個以上的胺基酸殘基的環狀部者。本說明書中的環狀胜肽化合物的環狀部所含的胺基酸數目沒有特別限制，例如4～20個殘基、5～15個殘基、6～13個殘基。使直鏈狀的胜肽化合物轉換成環狀胜肽化合物的方法可經由Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition（R. C. Larock著）、或March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition（M. B. Smith, J. March著）等所記載之方法，在分子內進行鍵形成反應而實施。在鍵形成反應之後，也可再進行官能基轉換反應。鍵形成反應例如從羧酸和胺所形成的C（O）－N鍵；利用氧原子的C－O－C鍵、C（O）－O鍵、C（S）－O鍵；利用硫原子的C（O）－S鍵、C（S）－S鍵、C－S－S－C鍵、C－S－C鍵、C－S（O）－C鍵、C－S（O2）－C鍵；利用氮原子的C－N－C鍵、C＝N－C鍵、N－C（O）－N鍵、N－C（S）N鍵、C（S）－N鍵等。再者，例如鈴木反應、Heck反應、Sonogashira反應等、以過渡金屬作為觸媒的C－C鍵的形成反應等。鍵形成反應之後再進行的官能基轉換反應，例如氧化反應或還原反應。具體例如，使硫原子氧化轉換成亞碸基或磺酸基的反應。又例如，碳－碳鍵之中，使三鍵或雙鍵還原變成雙鍵或單鍵的還原反應。當2個胺基酸在胺基酸的主鏈中鍵結，經由胜肽鍵而形成閉環結構，但是也可經由2個胺基酸的側鏈彼此、側鏈和主鏈的鍵結等，形成2個胺基酸間的共價鍵。
本說明書中「1個或複數個」表示1個或2個以上的數。「1個或複數個」在用於和某基的取代基相關的內容時，此用語表示從1個到該基容許的取代基的最大數之數。「1個或複數個」具體如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及／或比這些大的數。
本說明書中「固相合成用樹脂」只要是可用於經固相法的胜肽化合物的合成者，沒有特別限定。如此的固相合成用樹脂具體如CTC樹脂、NovaSyn TGT樹脂（TGT樹脂）、Wang樹脂、SASRIN樹脂、三苯甲基氯樹脂（Trt樹脂）、4－甲基三苯甲基氯樹脂（Mtt樹脂）、4－甲氧基三苯甲基氯樹脂（Mmt樹脂）等之在酸性條件可被去除者。樹脂可依符合所使用的胺基酸的官能基做適宜選擇。例如，在使用羧基（主鏈羧基、或Asp或Glu代表的側鏈羧基）、或芳香環上的羥基（Tyr代表的酚基）作為胺基酸的官能基時，樹脂以使用三苯甲基氯樹脂（Trt樹脂）、或2－氯三苯甲基氯樹脂（CTC樹脂）為佳。在使用脂肪族羥基（Ser或Thr代表的脂肪族醇基）作為胺基酸的官能基時，樹脂以使用三苯甲基氯樹脂（Trt樹脂）、2－氯三苯甲基氯樹脂（CTC樹脂）、或4－甲基三苯甲基氯樹脂（Mtt樹脂）為佳。又本說明書中也有將樹脂記為樹脂（resin）的情形。
對於構成樹脂的聚合物的種類也沒有特別限定。在以聚苯乙烯構成的樹脂的情形，也可使用100－200mesh或200－400mesh任一者。又，對於交聯度也沒有特別限定，以1%DVB（二乙烯基苯）交聯者為佳。又，構成樹脂的聚合物的種類，例如TentaGel（登記商標）、或ChemMatrix（登記商標）。
在本說明書記載的化合物之製造中，當定義的基在實施方法的條件下受到不希望的化學變化時，可藉由使用例如官能基的保護、脫保護等的手段來製造該化合物。此處保護基的選擇及加脫操作可例如「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」記載之方法，根據此等的反應條件而適宜使用。又也可視需要變更取代基導入等的反應步驟的順序。
本說明書中，當被賦予「也可被取代」之修飾詞時，該取代基例如烷基、烷氧基、氟烷基、氟烷氧基、側氧基、胺基羰基、烷基磺醯基、烷基磺醯基胺基、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基、芳基烷基、雜芳基烷基、鹵素、硝基、胺基、單烷基胺基、二烷基胺基、氰基、羧基、烷氧基羰基、甲醯基等。
而且，這些各別也可被賦予取代基，這些取代基也沒有限制，例如可從包含鹵原子、氧原子、硫原子、氮原子、硼原子、矽原子、或磷原子的任意的取代基之中獨立自由選擇1個或2個以上。亦即，例如可被取代的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等。
本說明書所記載之化合物可為其鹽或該等的溶劑合物。化合物的鹽包括例如鹽酸鹽；氫溴酸鹽；氫碘酸鹽；磷酸鹽；膦酸鹽；硫酸鹽；甲烷磺酸鹽、p－甲苯磺酸鹽等的磺酸鹽；乙酸鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、水楊酸鹽等的羧酸鹽；或鈉鹽、鉀鹽等的鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等的鹼土金屬鹽；銨鹽、烷基銨鹽、二烷基銨鹽、三烷基銨鹽、四烷基銨鹽等的銨鹽等。這些鹽例如經由使化合物和酸或鹼接觸所製造。所謂化合物的溶劑合物是指在溶液中溶質分子吸引溶劑分子，形成1個分子集團的現象，如果溶劑是水則稱為水合物。本說明書所記載的化合物可以是和選自醇類（如甲醇、乙醇、1－丙醇、2－丙醇等）、二甲基甲醯胺、或二甘二甲醚（diglyme）等的有機溶劑、或水等的單獨的溶劑的溶劑合物，也可以是和複數種溶劑的溶劑合物。
本說明書中的「胺基酸」包括天然胺基酸及非天然胺基酸（有稱為胺基酸衍生物者）。又本說明書中「胺基酸」有表示胺基酸殘基者。本說明書中的「天然胺基酸」是指Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Pro。非天然胺基酸（胺基酸衍生物）沒有特別限定，例如β－胺基酸、D型胺基酸、N取代胺基酸、α,α－二取代胺基酸、側鏈和天然胺基酸不同的胺基酸、羥基羧酸等。本說明書中的胺基酸容許任意的立體配置。胺基酸的側鏈的選擇沒有設限，除氫原子外，也可自由選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環烷基、螺鍵結的環烷基。各自可賦予取代基，該等取代基也沒有限制，例如可從含有鹵原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子、或P原子的任意取代基之中獨立自由選擇1個或2個以上。亦即，例如可被取代的烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基等，或者側氧基、胺基羰基、鹵原子等。在非限定的一態樣中，本說明書中的胺基酸可為，在同一分子內具有羧基及胺基的化合物（即是在此情形，如脯胺酸、羥基脯胺酸的亞胺酸也包含於胺基酸）。
來自鹵素的取代基，例如氟（－F）、氯（－Cl）、溴（－Br）、碘（－I）等。
來自O原子的取代基，例如羥基（－OH）、氧基（－OR）、羰基（－C＝O－R）、羧基（－CO2 H）、氧羰基（－C＝O－OR）、羰氧基（－O－C＝O－R）、硫基羰基（－C＝O－SR）、羰基硫基（－S－C＝O－R）、胺羰基（－C＝O－NHR）、羰胺基（－NH－C＝O－R）、氧羰基胺基（－NH－C＝O－OR）、磺醯基胺基（－NH－SO2 －R）、胺基磺醯基（－SO2 －NHR）、胺磺醯基胺基（－NH－SO2 －NHR）、硫基羧基（－C（＝O）－SH）、羧基羰基（－C（＝O）－CO2 H）。
氧基（－OR）之例，如烷氧基、環烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳氧基、雜芳氧基、芳烷基氧基等。
羰基（－C＝O－R）之例，如甲醯基（－C＝O－H）、烷基羰基、環烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、芳基羰基、雜芳基羰基、芳烷基羰基等。
氧羰基（－C＝O－OR）之例，如烷基氧羰基、環烷基氧羰基、烯基氧羰基、炔基氧羰基、芳基氧羰基、雜芳基氧羰基、芳烷基氧羰基等。
羰氧基（－O－C＝O－R）之例，如烷基羰氧基、環烷基羰氧基、烯基羰氧基、炔基羰氧基、芳基羰氧基、雜芳基羰氧基、芳烷基羰氧基等。
硫基羰基（－C＝O－SR）之例，如烷基硫基羰基、環烷基硫基羰基、烯基硫基羰基、炔基硫基羰基、芳基硫基羰基、雜芳基硫基羰基、芳烷基硫基羰基等。
羰基硫基（－S－C＝O－R）之例，如烷基羰基硫基、環烷基羰基硫基、烯基羰基硫基、炔基羰基硫基、芳基羰基硫基、雜芳基羰基硫基、芳烷基羰基硫基等。
胺羰基（－C＝O－NHR）之例，如烷基胺羰基、環烷基胺羰基、烯基胺羰基、炔基胺羰基、芳基胺羰基、雜芳基胺羰基、芳烷基胺羰基等。除這些以外，例如和－C＝O－NHR中的N原子鍵結的H原子再被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基所取代的基。
羰胺基（－NH－C＝O－R）之例，如烷基羰胺基、環烷基羰胺基、烯基羰胺基、炔基羰胺基、芳基羰胺基、雜芳基羰胺基、芳烷基羰胺基等。除這些以外，例如和－NH－C＝O－R中的N原子鍵結的H原子再被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基所取代的基。
氧羰基胺基（－NH－C＝O－OR）之例，如烷氧基羰基胺基、環烷氧基羰基胺基、烯基氧羰基胺基、炔基氧羰基胺基、芳基氧羰基胺基、雜芳基氧羰基胺基、芳烷基氧羰基胺基等。除這些以外，例如和－NH－C＝O－OR中的N原子鍵結的H原子再被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基所取代的基。
磺醯基胺基（－NH－SO2 －R）之例，如烷基磺醯基胺基、環烷基磺醯基胺基、烯基磺醯基胺基、炔基磺醯基胺基、芳基磺醯基胺基、雜芳基磺醯基胺基、芳烷基磺醯基胺基等。除這些以外，例如和－NH－SO2 －R中的N原子鍵結的H原子再被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基所取代的基。
胺基磺醯基（－SO2 －NHR）之例，如烷基胺基磺醯基、環烷基胺基磺醯基、烯基胺基磺醯基、炔基胺基磺醯基、芳基胺基磺醯基、雜芳基胺基磺醯基、芳烷基胺基磺醯基等。除這些以外，例如和－SO2 －NHR中的N原子鍵結的H原子再被烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基所取代的基。
胺磺醯基胺基（－NH－SO2 －NHR）之例，如烷基胺磺醯基胺基、環烷基胺磺醯基胺基、烯基胺磺醯基胺基、炔基胺磺醯基胺基、芳基胺磺醯基胺基、雜芳基胺磺醯基胺基、芳烷基胺磺醯基胺基等。再者，和－NH－SO2 －NHR中的N原子鍵結的2個H原子也可以被獨立選自由烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、及芳烷基所組成的群組的取代基所取代，又也可以此等的2個取代基形成環。
來自S原子的取代基例如硫醇基（－SH）、硫基（－S－R）、亞磺醯基（－S＝O－R）、磺醯基（－S（O）2 －R）、磺酸基（－SO3 H）、五氟硫基（－SF5 ）。
硫基（－S－R）之例，選自烷基硫基、環烷基硫基、烯基硫基、炔基硫基、芳基硫基、雜芳基硫基、芳烷基硫基等之中。
亞磺醯基（－S＝O－R）之例，如烷基亞磺醯基、環烷基亞磺醯基、烯基亞磺醯基、炔基亞磺醯基、芳基亞磺醯基、雜芳基亞磺醯基、芳烷基亞磺醯基等。
磺醯基（－S（O）2 －R）之例，如烷基磺醯基、環烷基磺醯基、烯基磺醯基、炔基磺醯基、芳基磺醯基、雜芳基磺醯基、芳烷基磺醯基等。
來自N原子的取代基，例如疊氮（－N3 ，也稱為「疊氮基」）、氰基（－CN）、1級胺基（－NH2 ）、2級胺基（－NH－R）、3級胺基（－NR（R'））、脒基（－C（＝NH）－NH2 ）、經取代的脒基（－C（＝NR）－NR'R''）、胍基（－NH－C（＝NH）－NH2 ）、經取代的胍基（－NR－C（＝NR'''）－NR'R''）、胺羰基胺基（－NR－CO－NR'R''）。
2級胺基（－NH－R）之例，如烷基胺基、環烷基胺基、烯基胺基、炔基胺基、芳基胺基、雜芳基胺基、芳烷基胺基等。
3級胺基（－NR（R'））之例，如烷基（芳烷基）胺基等，具有從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等之中各自獨立選擇的任意2個取代基的胺基，此等任意的2個取代基也可形成環。
經取代的脒基（－C（＝NR）－NR'R''）之例，如N原子上的3個取代基R、R’及R’’ 為從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等之中各自獨立選擇的基，例如烷基（芳烷基）（芳基） 脒基等。
經取代的胍基（－NR－C（＝NR'''）－NR'R''）之例，如R、R'、R''及R'''為從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中各自獨立選擇的基，或此等形成環的基等。
胺羰基胺基（－NR－CO－NR'R''）之例，如R、R'、及R''為從氫原子、烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基之中各自獨立選擇的基，或此等形成環的基等。
來自B原子的取代基，例如硼烷基（－BR（R'））或二氧硼烷基（－B（OR）（OR'））等。此等的2個取代基R及R'可從烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基等之中各自獨立選擇，或此等也可形成環。具體如環狀硼烷基，更具體如頻那醇硼烷基（pinacolato boryl）、新戊烷二醇硼烷基（neopentane diolate boryl）、兒茶酚硼烷基（catecholate boryl）等。
本說明書中的N取代胺基酸的氮原子上的取代基，具體例如烷基、C1 －C6 烷基、C1 －C4 烷基、甲基、C7 －C14 芳烷基、苄基、苯乙基等。
胺基酸的主鏈胺基可為未取代（－NH2 ）也可為被取代（即－NHR。此處，R表示亦可有取代基的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基，又也可如脯胺酸般使鍵結在N原子的碳鏈和α位的碳原子形成環）。如此的主鏈胺基被取代的胺基酸，在本說明書中有稱為「N取代胺基酸」的情形。本說明書中的「N取代胺基酸」較佳如N－烷基胺基酸、N－C1 －C6 烷基胺基酸、N－C1 －C4 烷基胺基酸、N－甲基胺基酸、N－C7 －C14 芳烷基胺基酸、N－苄基胺基酸、N－苯乙基胺基酸，但不限定於此等。
本說明書中的「胺基酸」包含各自對應的所有同位素。「胺基酸」的同位素為至少1個原子以原子序（質子數）相同、質量數（質子數和中子數的和）不同的原子取代者。本說明書中的「胺基酸」所含的同位素之例，有氫原子、碳原子、氮原子、氧原子、磷原子、硫原子、氟原子、氯原子等，各自包含2 H、3 H、13 C、14 C、15 N、17 O、18 O、32 P、35 S、18 F、36 Cl等。
本說明書中，顯示數值範圍的「～」包含其兩端點的數值，例如「A～B」表示A以上且B以下的數值範圍。
本說明書中，「約」用語在和數值組合使用時，表示該數值的+10%及－10%的數值範圍。
本說明書中，「及／或」的用語的意義包含適當組合「及」和「或」的所有組合。具體例如「A、B、及／或C」包含下列7種變化； （i） A、（ii） B、（iii） C、（iv） A及B、（v） A及C、（vi） B及C、（vii） A、B、及C。
（製造方法） 本發明關於製造胜肽化合物之方法，包括使第一胺基酸或胜肽、和第二胺基酸或胜肽，在添加劑及縮合劑的存在下進行縮合，獲得縮合體之步驟，其中，添加劑的莫耳數小於第二胺基酸或胜肽的莫耳數之方法。
在一態樣中，經由本發明之製造方法所得的胜肽化合物可以是經由固相法或液相法的胺基酸或胜肽的延長步驟中的中間體，也可以是最終產物。延長步驟可視所期望的胜肽化合物的胺基酸序列的長度進行複數次，根據本發明的縮合步驟，在如此延長步驟中包含至少1次，也可包含複數次。延長步驟中，根據本發明之縮合步驟以外的縮合步驟可使用本技術領域中公知的方法。
在一態樣中，本發明之縮合步驟在用於延長步驟的最終步驟時，經本發明之縮合步驟所獲得的縮合體可成為具有所期望序列的胜肽化合物。另一方面，除了本發明之縮合步驟外，以公知方法進行進一步延長、獲得具有所期望序列的胜肽化合物時，經本發明之縮合步驟所得的縮合體作為胜肽化合物的部分結構而被包含於其中。
本發明中，「第一胺基酸」可為天然胺基酸，也可為非天然胺基酸。
本發明中，「第一胜肽」可只由天然胺基酸所構成，也可只由非天然胺基酸所構成，也可由天然及非天然胺基酸的任意組合所構成。
在一態樣中，第一胺基酸或第一胜肽為胺基酸者為佳，為非天然的胺基酸者較佳。
在一態樣中，第一胺基酸或第一胜肽也可為主鏈胺基未受保護的胺基酸或胜肽。未受保護的主鏈胺基為第一胺基酸或第一胜肽的N端者為佳。
在本發明之縮合反應使用固相法的情形時，第一胺基酸或第一胜肽的C端胺基酸擔載於固相合成用樹脂（resin）。在此情形，當第一胺基酸或第一胜肽的N端及／或C端的胺基酸為非天然胺基酸、特別是N－烷基胺基酸等的N取代胺基酸時，則有起因於過早裂解、以習知方法不能充分進行目的之縮合反應的情形。此在使固相合成用樹脂和胺基酸鍵結的樹脂連接子使用三苯甲基類的原子團的情形時是顯著的。即使在如此的情形，透過使用本發明之方法也可有效率地進行縮合反應。
在一態樣中，在第一胺基酸或第一胜肽的N端及／或C端的胺基酸為N－烷基胺基酸時，N－烷基胺基酸例如側鏈和天然胺基酸不同者，或α、β、或γ胺基酸等，以N－烷基β胺基酸為較佳例。
第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸及／或第一胜肽的C端的胺基酸具體如具有下式（1）者。
Figure 02_image001
當第一胺基酸或第一胜肽的N端的胺基酸為式（1）所表的胺基酸的情形時，R11 為氫。另一方面，當第一胜肽的C端的胺基酸為式（1）所表的胺基酸的情形時，R11 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點，通常，式（1）的胺基酸在該部位和鄰接的胺基酸形成醯胺鍵。
在一態樣中，式（1）中，P11 為氫或C1 －C6 烷基，且R12 為氫、CONR12A R12B 、COOR12C 、C1 －C6 烷基、C3 －C8 環烷基、C7 －C14 芳烷基、5～10員雜芳基C1 －C6 烷基、受保護的5～10員雜芳基C1 －C6 烷基、C1 －C6 羥烷基、受保護的C1 －C6 羥烷基、C1 －C6 羧烷基、受保護的C1 －C6 羧烷基、C1 －C6 胺烷基、受保護的C1 －C6 胺烷基、C1 －C6 烷基硫基C1 －C6 烷基。
P11 以氫或甲基為佳，以甲基較佳。
當R12 為CONR12A R12B 時，R12A 及R12B 獨立為C1 －C4 烷基（較佳為甲基、乙基），或R12A 及R12B 和該等鍵結的氮原子一起形成可含有1個或複數個追加的雜原子的4～8員環（較佳為哌啶環、四氫氮唉環、吡咯啶環、嗎啉環、或3－氧雜－8－氮雜雙環［3.2.1］辛烷環）。
當R12 為COOR12C 時，R12C 為烯丙基、t－丁基、或苄基。
當R12 為C1 －C6 烷基時，較佳為R12 為甲基、異丙基、或異丁基。
當R12 為C3 －C8 環烷基時，較佳為R12 為環戊基、或環己基。
當R12 為C7 －C14 芳烷基時，較佳為R12 為苄基或苯乙基。
當R12 為5～10員雜芳基C1 －C6 烷基時，較佳為R12 為5～10員雜芳基甲基或5～10員雜芳基乙基。又，當R12 為受保護的5～10員雜芳基C1 －C6 烷基時，R12 以上述之基所含的官能基，例如胺基，受Boc基保護者為佳。
當R12 為C1 －C6 羥烷基時，較佳為R12 為羥甲基、1－羥基乙基、2－羥基乙基，以1－羥基乙基更佳。又，當R12 為受保護的C1 －C6 羥烷基時，R12 以上述之基受羥基的保護基、例如Bzl基或tBu基所保護者為較佳。
當R12 為C1 －C6 羧烷基時，較佳為R12 為羧甲基、1－羧基乙基、2－羧基乙基，以2－羧基乙基更佳。又當R12 為受保護的C1 －C6 羧烷基時，R12 以上述之基受羧基的保護基、例如Bzl基或tBu基所保護者為較佳。
當R12 為C1 －C6 胺烷基時，較佳為R12 為4－胺基丁基。又當R12 為受保護的C1 －C6 胺烷基時，R12 以上述之基受胺基的保護基、例如Boc基所保護者為較佳。
當R12 為C1 －C6 烷基硫基C1 －C6 烷基時，較佳為R12 為2－甲基硫基乙基。
在一態樣中，P11 及R12 為P11 鍵結的氮原子及R12 鍵結的碳原子一起形成4～7員飽和雜環。4～7員飽和雜環以四氫氮唉環、吡咯啶環、哌啶環、哌嗪環、嗎啉環為佳。
式（1）中，Q12 為氫或C1 －C6 烷基，較佳為氫或甲基。
式（1）中，L11 為單鍵或－CH2 －。
當第一胺基酸或第一胜肽的C端的胺基酸為式（1）中所表的胺基酸的情形時，R13 表示和固相合成用樹脂的鍵結點。另一方面，當第一胜肽的N端的胺基酸為式（1）中所表的胺基酸的情形時，R13 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點，通常式（1）的胺基酸在該部位和鄰接的胺基酸形成醯胺鍵。
第一胺基酸、或第一胜肽的N端及／或C端的胺基酸，更具體例如MeAsp－pip、MeAsp－aze、MeAsp－pyrro、MeAsp－mor、MeAsp－mor（26－bicyc）、MeAsp－OtBu、MeAsp－NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D－3－MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly（cPent）、MeChg、MePhe、MeTrp（Boc）、MeThr（Bzl）、MeGlu（OtBu）、MeLys（Boc）、MeMet、Aze（2）、Aib等。
根據本發明之縮合步驟，即使是在以習知方法發生胜肽從樹脂脫落這樣的高擔載量（亦即，根據Fmoc定量法為0.5mmol／g以上），將第一胺基酸或胜肽擔載於固相合成用樹脂的情形，維持該擔載量也可獲得縮合體。 因此，在本發明之方法，第一胺基酸或胜肽的相對於固相合成用樹脂的擔載量可使用任意量，例如根據Fmoc定量法，為0.2mmol／g以上、0.8mmol／g以下的量，即使是以0.3mmol／g以上、再者0.5mmol／g以上的高擔載量，也能有效率地進行反應。
本發明中，「第二胺基酸」可為天然胺基酸，也可為非天然胺基酸。
在一態樣，第二胺基酸或胜肽也可以是主鏈羧基未受保護的胺基酸或胜肽。未受保護的主鏈羧基在第二胺基酸或胜肽的C端者為佳。
本發明中，「第二胜肽」可只由天然胺基酸所構成，也可只由非天然胺基酸所構成，也可由天然及非天然胺基酸的任意組合所構成。
在一態樣中，在第二胺基酸或第二胜肽的C端的胺基酸為非天然胺基酸，特別是N－烷基胺基酸等的N取代胺基酸，或該側鏈的碳數2個以上的胺基酸（例如α,α－二取代胺基酸或β－支鏈胺基酸）的情形等，有以習知方法不能充分進行縮合反應的情形。即使在如此的情形，透過使用本發明之方法，也有可能有效率的縮合。
在本發明，第二胺基酸或胜肽的胺基，以受保護基所保護者為佳。如此的保護基如前述之「胺基的保護基」者，具體例如具有Fmoc骨架結構的保護基、Cbz、Boc、Teoc、及Alloc等。
在本發明，「具有Fmoc骨架結構的保護基」表示在Fmoc基或Fmoc基的構成骨架的任意位置導入任意的取代基之基。此種具有Fmoc骨架結構的保護基具體例如下式所表的保護基。
Figure 02_image015
（式中， R1 ～R8 獨立選自由氫、C1 －C8 烷基、C1 －C8 氟烷基、鹵素、磺酸基、及三甲基矽基所組成的群組， R9 ～R10 獨立為氫或甲基）。
具有Fmoc骨架結構的保護基更具體例如9－茀基甲基氧羰基（Fmoc）基、2,7－二－tert－丁基－Fmoc （Fmoc（2,7tb））基、1－甲基－Fmoc （Fmoc（1Me））基、2－氟－Fmoc （Fmoc（2F））基、2,7－二溴－Fmoc （Fmoc（2,7Br））基、2－單異辛基－Fmoc （mio－Fmoc）基、2,7－二異辛基－Fmoc （dio－Fmoc）基、2,7－（3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8－十三氟辛基）－Fmoc （tdf－Fmoc）基、2,7－雙（三甲基矽基）－Fmoc（Fmoc（2TMS））基、（2－磺酸基－9H－茀－9－基）甲氧基羰基（Fmoc（2so3h））、［（1S）－1－（9H－茀－9－基）乙氧基］羰基（sm－Fmoc）、及［（1R）－1－（9H－茀－9－基）乙氧基］羰基（rm－Fmoc）等。
當第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸為β－支鏈胺基酸的情形時，β－支鏈胺基酸具體例如具有下式（2A）者。
Figure 02_image004
式（2A）中，為氫或C1 －C6 烷基。當P21 為C1 －C6 烷基時，較佳為甲基。
式（2A）中，R21 及R22 各自獨立為C1 －C4 烷基、C1 －C6 烷氧基、或C1 －C6 烷氧基C1 －C6 烷基，或者R21 及R22 和此等鍵結的碳一起形成3～8員脂環式環。當R21 及R22 為C1 －C4 烷基、C1 －C6 烷氧基、或C1 －C6 烷氧基C1 －C6 烷基的情形時，R21 及R22 較佳為甲基、乙基、tert－丁氧基，R21 及R22 的較佳組合例如甲基和甲基、甲基和乙基、甲基和tert－丁氧基。 當R21 及R22 一起形成3～8員脂環式環的情形時，3～8員脂環式環較佳為環丙烷環、環丁烷環、環戊烷環、或環己烷環。
當第二胺基酸為式（2A）所表的胺基酸的情形時，R23 表示和胺基的保護基的鍵結點。另一方面，當第二胜肽的C端的胺基酸為式（2A）所表的胺基酸的情形時，R23 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點，通常，式（2A）的胺基酸在該部位和鄰接的胺基酸形成醯胺鍵。
此種的第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸的β－支鏈胺基酸，具體例如MeVal、D－MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly（cPent）、Gly（cPent）、MeGly（cBu）、Gly（cBu）、MeGly（cPr）、Gly（cPr）、MeThr（tBu）、及Thr（tBu）等。
當第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸為α,α－二取代胺基酸的情形時，α,α－二取代胺基酸具體例如具有下式（2B）者。
Figure 02_image018
式（2B）中，P22 為氫或C1 －C6烷基，當P22 為C1 －C6 烷基時，較佳為氫。
式（2B）中，R23 及R24 獨立選自C1 －C6 烷基、C2 －C6 烯基、或可被取代的C7 －C14 芳烷基，或者R23 及R24 和該等鍵結的碳原子一起形成3～8員脂環式環或4～7員飽和雜環。 當R23 及R24 為C1 －C6 烷基時，較佳為甲基、乙基、或異丙基，當R23 及R24 為C2 －C6 烯基時，較佳為烯丙基，當R23 及R24 為C7 －C14 芳烷基時，較佳為可被鹵素取代的苄基。R23 及R24 的組合較佳為甲基和甲基、甲基和乙基、甲基和異丙基、甲基和異丁基、甲基和烯丙基、甲基和可被鹵素取代的苄基。 又，當R23 及R24 和該等鍵結的碳原子一起形成3～8員脂環式環的情形時，脂環式環較佳為環丙烷環、環丁烷環、環戊烷環、或環己烷環，當R23 及R24 和該等鍵結的碳原子一起形成4～7員飽和雜環的情形時，飽和雜環較佳為四氫呋喃環。
當第二胺基酸為式（2B）所表的胺基酸的情形時，R25 表示和胺基的保護基的鍵結點。另一方面，當第二胜肽的C端的胺基酸為式（2B）所表的胺基酸的情形時，R25 表示和鄰接的胺基酸的鍵結點，通常，式（2B）的胺基酸在該部位和鄰接的胺基酸形成醯胺鍵。
如此的第二胺基酸、或第二胜肽的C端胺基酸的α,α－二取代胺基酸更具體如Aib、（Me）Abu、（Me）Leu、（Me）Algly、（Me）Phe、（Me）Phe（3－I）、1－ACPrC、cVal、cLeu、cHex、Athpc等。
在一態樣中，第二胺基酸、或第二胜肽的C端胺基酸為N－烷基胺基胺，具體例如MeAsp－pip、MeAsp－aze、MeAsp－pyrro、MeAsp－mor、MeAsp－mor（26－bicyc）、MeAsp－OtBu、D－3－MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze（2）、Pro、MeAsp－NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly（cPent）、MeGly（cBu）、MeGly（cPr）、MeThr（tBu）、D－MeVal、MeTrp（Boc）、MeThr（Bzl）、MeGlu（OtBu）、MeLys（Boc）、或MeMet等，較佳例如MeVal或MeIle。
在一態樣中，第二胺基酸、或第二胜肽的C端胺基酸其側鏈的碳數為2個以上，可為不屬於β－支鏈胺基酸或α,α－二取代胺基酸的胺基酸。例如Lys（Z）、Glu（OBzl）、或Ser（tBu）屬於側鏈的碳數為2個以上的胺基酸。
本發明中，相對於第一胺基酸或胜肽，以等量或過量，使用第二胺基酸或胜肽。具體地說，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0所組成的群組之下限，以及和選自2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，7.0、8.0、9.0及10.0所組成的群組之上限的組合而限定作為可能的範圍。又，本說明書中「下限」包含「以上」及「大於」兩者意思，「上限」包含「以下」及「小於」兩者意思。第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為1.5以上為佳，2以上較佳。第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為8以下為佳，4以下較佳。第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為約2為最佳。
本發明之縮合反應所使用的添加劑，例如Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt等。
在本發明，以小於第二胺基酸或胜肽的莫耳數之莫耳數，使用添加劑。換句話說，在本發明，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比小於1。該莫耳比為0.8以下，例如0.1～0.8為佳。在此情形，該莫耳比，例如添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.7所組成的群組之下限，以及和選自0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7及0.8所組成的群組之上限的組合而限定作為可能的範圍。添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.3～0.7者較佳。
在一態樣中，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1～2的情形時，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.7以下為佳。具體地說，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1～2的情形時，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比可為0.7以下的範圍、0.6以下的範圍、0.5以下的範圍、0.4以下的範圍、0.3以下的範圍、0.2以下的範圍、或0.1以下的範圍。 或者，在本發明，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1～2的情形時，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比可根據選自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、及0.6所組成的群組之下限，以及和選自0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、及0.7所組成的群組之上限的組合而限定作為可能的範圍。
在別的態樣，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比（有將此莫耳比稱為「第一莫耳比」者）為2以上的情形時，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為「（第一莫耳比）－1」以下者為佳。具體地說，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為2以上的情形時，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為，（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－1以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－2以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－3以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－4以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－5以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－6以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－7以下的範圍、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－8以下的範圍、或（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－9以下的範圍。 或者，在本發明，當第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為2以上的情形，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－9、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－8、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－7、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－6、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－5、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－4、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－3、及（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－2所組成的群組的下限，以及選自（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－8、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－7、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－6、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－5、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－4、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－3、（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－2及（第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比）－1所組成的群組的上限的組合而限定者，作為可能的範圍。
在一態樣中，添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比可為0.5～2.0。具體地說，添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、及1.9所組成的群組之下限，和選自0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、及2.0所組成的群組之上限的組合而限定者，使用為可能範圍的莫耳比。添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為約1者特佳。
本發明之縮合反應所使用的縮合劑，例如DIC、DCC、EDCI、EDCI・HCl等。
在本發明，以和第二胺基酸或胜肽的莫耳數等量或較多的莫耳數使用縮合劑。具體地說，在本發明，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可為1以上的範圍、2以上的範圍、3以上的範圍、或4以上的範圍。更具體地說，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9及4.0所組成的群組的下限，以及選自1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、及5.0所組成的群組的上限的組合而限定者，作為可能範圍。縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比的較佳範圍，例如1.0～5.0、1.2～4.0、1.2～4.0、1.2～3.0、2.0～3.0。
在一態樣，相對於第一胺基酸或胜肽，以等量或過量使用縮合劑。具體例如，縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可為1.0以上的範圍、1.1以上的範圍、1.2以上的範圍、1.3以上的範圍、1.4以上的範圍、1.5以上的範圍、1.6以上的範圍、1.7以上的範圍、1.8以上的範圍、1.9以上的範圍、2.0以上的範圍、2.1以上的範圍、2.2以上的範圍、2.3以上的範圍、2.4以上的範圍，2.5以上的範圍、2.6以上的範圍、2.7以上的範圍、2.8以上的範圍、2.9以上的範圍、3.0以上的範圍、3.1以上的範圍、3.2以上的範圍、3.3以上的範圍、3.4以上的範圍，3.5以上的範圍、3.6以上的範圍、3.7以上的範圍、3.8以上的範圍、3.9以上的範圍、4.0以上的範圍、4.1以上的範圍、4.2以上的範圍、4.3以上的範圍、4.4以上的範圍，4.5以上的範圍、4.6以上的範圍、4.7以上的範圍、4.8以上的範圍、4.9以上的範圍、5.0以上的範圍、5.1以上的範圍、5.2以上的範圍、5.3以上的範圍、5.4以上的範圍，5.5以上的範圍、5.6以上的範圍、5.7以上的範圍、5.8以上的範圍、5.9以上的範圍、6.0以上的範圍、6.1以上的範圍、6.2以上的範圍、6.3以上的範圍、6.4以上的範圍、6.5以上的範圍、6.6以上的範圍、6.7以上的範圍、6.8以上的範圍、6.9以上的範圍、7.0以上的範圍、7.1以上的範圍、7.2以上的範圍、7.3以上的範圍、7.4以上的範圍、7.5以上的範圍、7.6以上的範圍、7.7以上的範圍、7.8以上的範圍、7.9以上的範圍、8.0以上的範圍、8.1以上的範圍、8.2以上的範圍、8.3以上的範圍、8.4以上的範圍、8.5以上的範圍、8.6以上的範圍、8.7以上的範圍、8.8以上的範圍、8.9以上的範圍、9.0以上的範圍、9.1以上的範圍、9.2以上的範圍、9.3以上的範圍、9.4以上的範圍、9.5以上的範圍、9.6以上的範圍、9.7以上的範圍、9.8以上的範圍、或9.9以上的範圍。 或者，在本發明，縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4，2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4，6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、及9.0所組成的群組的下限，以及選自2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、及10.0所組成的群組的上限的組合而限定者，作為可能的範圍。 縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為1.3以上者為佳，為2.0以上者較佳。又，縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為10以下者為佳，為8.0以下者較佳。縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，為約4者為最佳。
在本發明，縮合劑及添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比， 縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、及2.0所組成的數值的下限，以及選自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、及3.0所組成的數值的上限的組合而限定者，作為可能的範圍， 添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、及0.5所組成的數值的下限，以及選自0.6、0.7、0.8、0.9及1.0所組成的數值的上限的組合而限定者，作為可能的範圍。 縮合劑及添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比，較佳為第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約2：約4～6：約1。
在本發明，第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為， 第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0所組成的數值的下限，以及選自2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、及4.0所組成的數值的上限的組合而限定者，作為可能的範圍， 縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自1.0、2.0、3.0及4.0所組成的數值的下限，以及選自5.0、6.0、7.0、8.0及9.0所組成的數值的上限的組合而限定者，作為可能的範圍， 添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比，可根據選自0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0所組成的數值的下限，以及選自1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0所組成的數值的上限的組合而限定者，作為可能的範圍。 第一胺基酸或胜肽、第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑的莫耳比，較佳為第一胺基酸或胜肽：第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約1：約2：約4：約1；第一胺基酸或胜肽：第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約1：約2.4：約7.2：約1.2；或者，第一胺基酸或胜肽：第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約1：約3：約6：約1.5；更佳為，第一胺基酸或胜肽：第二胺基酸或胜肽：縮合劑：添加劑＝約1：約2：約4：約1。
本發明之縮合反應在0～100℃、較佳為5～60℃、更佳為10～40℃的反應溫度進行。
本發明之縮合反應以10分鐘～1週、較佳為10分鐘～3天、更佳為1小時～2天的反應時間進行。
在本發明，以添加劑為Oxyma、且縮合劑為DIC、DCC、EDCI、或EDCI・HCl者為佳。
在本發明，以添加劑為Oxyma、且縮合劑為DIC者為佳。
本發明之縮合反應可在適當溶劑中進行。溶劑可使用非質子性溶劑，例如醯胺類溶劑、酯類溶劑、醚類溶劑、烷基腈類溶劑、及尿素類溶劑等。醯胺類溶劑例如DMF、DMA、及NMP。酯類溶劑例如乙酸乙酯、及碳酸二甲酯等。醚類溶劑例如四氫呋喃、及2－甲基四氫呋喃等。烷基腈類溶劑例如乙腈等。尿素類溶劑例如DMI、及TMU等。
本發明之方法也可適用於固相法及液相法。
當經由固相法進行時，本發明之方法可經由使鍵結於樹脂的第一胺基酸或胜肽，和第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑接觸而進行。使第一胺基酸或胜肽和第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑接觸的順序是任意的，對於第一胺基酸或胜肽，可使第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑同時接觸，也可以依序接觸。也可以將第二胺基酸或胜肽、縮合劑、添加劑全部、或任一個事先混合，再和第一胺基酸或胜肽接觸。在第一胺基酸或胜肽和第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑接觸之時，也可使用將此等與適當溶劑混合者。
本發明之方法，也可使用固相合成裝置來進行。在一態樣，本發明之方法可經由使鍵結於樹脂的第一胺基酸或胜肽，和第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑，在適當的溶劑中混合而進行。在將固相合成用樹脂和此等的試劑類混合之時，透過和適當的溶劑接觸而使固相合成用樹脂膨潤作為其前處理，可效率良好的進行目的縮合反應。在此前處理所使用的溶劑量，只要是能將膨潤的樹脂浸於溶劑，可使用任意的量，例如，在使用DMF作為溶劑時，可使用3v／w～15v／w，較佳為4v／w～10v／w，更佳為4v／w～8v／w的量。溶劑量記載為4v／w者表示相對於樹脂重量1g的溶劑量為4ml。
反應結束後，從固相合成裝置排出反應液，透過以適當的溶劑洗淨殘留的固相合成用樹脂，排出過剩的試劑或副生成物，可取得鍵結在固性合成用樹脂的目的胜肽化合物。作為適合用於洗淨及／或使固相合成用樹脂膨潤的溶劑，例如醯胺類或溶劑醇類溶劑，以DMF或2－丙醇為佳。此等的溶劑可複數次使用，也可交互使用。膨潤的固相合成用樹脂可視需要使其收縮，對其使用以醇類溶劑、或醚類溶劑的洗淨。醇類溶劑以甲醇為佳，醚類溶劑以MTBE為佳。
本發明即使是在未併發過早裂解的情形，和習知方法相比，也可提高縮合反應的產率或縮合體的純度，因此可使用任意的樹脂。作為可發生過早裂解的樹脂連接子，例如Novabiochem固相合成操作手冊所記載的酸敏感性「H（＜5%TFA in CH2 Cl2 ）」所分類者，具有如此的樹脂連接子的樹脂，例如在2－氯三苯甲基氯樹脂（CTC樹脂）、TGT樹脂、三苯甲基氯樹脂（Trt樹脂）、4－甲基三苯甲基氯樹脂（Mtt樹脂）、4－甲氧基三苯甲基氯樹脂（Mmt樹脂）等的樹脂連接子，使用三苯甲基類的原子團的固相合成用樹脂（如此的樹脂有稱為「三苯甲基型樹脂」），在使用如此的樹脂的情形時，本發明特別有益。
關於用於本發明的固相合成用樹脂，構成該等的聚合物的種類沒有特別限定，但以聚苯乙烯所構成的樹脂為佳。又，固相合成用樹脂的粒徑可較佳使用約100－200mesh或200－400mesh者。對於樹脂的交聯度沒有特別限定，以1%DVB（二乙烯苯）交聯者為佳。構成樹脂的聚合物的種類例如TentaGel（登記商標）或ChemMatrix（登記商標）等。
在一態樣，也可在進行縮合反應之前，預先調配事先在溶劑中混合第二胺基酸或胜肽、縮合劑、及添加劑的混合物，用於縮合反應。混合時間沒有特別限制，較佳為0分鐘～2小時，更佳為0分鐘～1小時，再更佳為30分鐘。
使用自動合成裝置的樹脂的攪拌或震盪，在使樹脂充分浸透反應溶液、如所希望地進行反應上是重要的。攪拌速度、震盪速度、該等的頻率沒有特別限定，但由於過度的攪拌恐會引起樹脂的物理性損傷，因此例如每1小時實施約2分鐘60rpm的攪拌。又，如果浸透充足的話，攪拌或震盪不一定需要進行。
在一態樣，本發明之方法也可進一步包含去除固相合成用樹脂之步驟，此可使用此技術領域中公知方法。可將延長至所期望序列的胜肽化合物從樹脂脫離、分離。
在一態樣，本發明之方法也可進一步包含去除保護基之步驟，此可使用此技術領域中公知方法。可例如「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」所記載之方法，也可視反應條件適宜使用此等。具體地說，在第二胺基酸的胺基、或第二胜肽的N端的胺基酸的胺基受保護基所保護的情形，透過去除該保護基，可用於之後的縮合反應。保護基可在縮合反應的同時被去除，也可和縮合反應分開被去除。
在一態樣，本發明也關於製造環狀胜肽化合物之方法，經由使用本發明之方法獲得直鏈狀胜肽化合物，之後根據Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition （R. C. Larock著）、或March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、7th Edition （M. B. Smith, J. March著）等所記載的公知手法，使該N端側的基和C端側的基環化。
在一態樣，本發明也關於使用本發明之方法的過早裂解的抑制方法。
又，本說明書中所引用的所有先前技術文獻作為參考併入本說明書。 ［實施例］
以下的實施例以Waters的HPLC 方法 A－D的任一個以上進行分析。
分析：Waters的HPLC（反應轉換率、純度） HPLC 方法 A 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：Ascentis Express C18 （2.7 μm, 4.6 mm × 50 mm）, Supelco 管柱溫度：35度 洗提液：A） 0.05% TFA／水， B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B）: 5% （0 min.） → 100% （4 min.） → 100% （4.5 min.） → 5% （4.6 min.） → 5% （6 min.） 流速：1.0 mL／min 偵測：PDA 210 nm （200－400 nm PDA total） 注入體積：A－a） 0.30 μL，A－b） 1.0 μL，A－c） 2.0 μL 樣本準備： A－a） 5 μL的懸浮液／995 μL MeCN用於載藥評估（loading evaluation） A－b） 5 μL的懸浮液／995 μL MeCN用於載藥評估 A－c） 40 μL的懸浮液／960 μL MeCN用於Gly－cap評估
HPLC 方法 B 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：CAPCELL Core ADME （2.7 μm, 2.1 mm × 50 mm） 管柱溫度：50度 洗提液：A） 0.05% TFA／水， B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B） ： 30% （0 min.） → 70% （20.0 min.） → 100% （20.1 min.） → 100% （22.0 min.） → 30% （22.1 min.） → 30% （24.0 min.） 流速：0.3 mL／min 偵測：PDA 210 nm （200－400 nm PDA total） 注入體積：1.0 μL 樣本準備：40μL的懸浮液／960 μL MeCN
HPLC 方法 C 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：ACQUITY UPLC CSH Fluoro－Phenyl （1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm） 管柱溫度：35度 洗提液：A） 0.1% 甲酸／水，B） 0.1% 甲酸／MeCN 梯度（B）：5% （0 min.） → 100% （15.0 min.） → 100% （18.0 min.） → 5% （18.01 min.） → 5% （20.0 min.） 流速：0.3 mL／min 偵測：PDA 254 nm （200－380 nm PDA total） 注入體積：2.0 μL 樣本準備：0.37 mg／ml
HPLC 方法 D 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：Bioshell A160 peptide （2.7 μm，2.1 mm × 150 mm） 管柱溫度：40度 洗提液：A） 0.05% TFA／水， B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B） ：20% （0 min.） → 60% （20 min.） → 100% （20.1 min.） → 100% （22.0 min.） → 100% （22.1 min.） → 20% （24 min.） 流速：0.5 mL／min 偵測：PDA 254 nm 注入體積：2.0 μL 樣本準備：5μL懸浮液／1000 μL MeCN
HPLC 方法 E 器材：Acquity UPLC／SQD2 管柱：Ascentis Express C18 管柱溫度：35度 洗提液：A） 0.1% FA／水，B） 0.1% FA／乙腈 梯度（B）：5% （0 min.） → 100% （1.0 min.） → 100% （1.4 min.） 流速：1.0 mL／min 偵測：PDA 210－400 nm（total）
HPLC 方法 F 器材：Acquity UPLC／SQD2 管柱：Ascentis Express C18 管柱溫度：35度 洗提液：A） 0.1% FA／水，B） 0.1% FA／乙腈 梯度（B） ：5% （0 min.） → 100% （4.5 min.） → 100% （5.0 min.） 流速：1.0 mL／min 偵測：PDA 210－400 nm（total）
HPLC 方法 G 器材：Acquity UPLC／SQD2 管柱：Ascentis Express C18 管柱溫度：35度 洗提液：A） 10mM AA／水，B）甲醇 梯度（B）：50% （0 min.） → 100% （4.5 min.） → 100% （5.0 min.） 流速：1.0 mL／min 偵測：PDA 210－400 nm（total）
HPLC 方法 H 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：Ascentis Express RP－amide （2.7 μm, 2.1 mm × 50 mm）, Supelco 管柱溫度：35度 洗提液：A） 0.05% TFA／water，B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B） ：5% （0 min.） → 100% （4 min.） → 100% （4.5 min.） → 5% （4.6 min.） → 5% （6 min.） 流速：0.5 mL／min 偵測：PDA 210 nm （200－400 nm PDA total） 注入體積：E－a） 0.50 μL，E－b） 0.50 μL, E－c） 1.0 μL 樣本準備： E－a） 5 μL的懸浮液／ 960 μL MeCN用於Gly－cap評估或純度評估
HPLC 方法 I 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：Ascentis Express RP－amide （2.7 μm, 2.1 mm × 50 mm），Supelco 管柱溫度：50度 洗提液：A） 0.05% TFA／水， B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B） ：5% （0 min.） → 70% （20 min.） → 70% （21 min.） → 100% （22 min.） → 100% （22.1 min.） → 5% （22.6 min.） → 5% （24.0 min.） 流速：0.5 mL／min 偵測：PDA 210 nm （200－400 nm PDA total） 注入體積：0.50或1.0 μL 樣本準備：40μL的懸浮液／960 μL MeCN
HPLC 方法 J 器材：ACQUITY UPLC H－Class 管柱：ACQUITY UPLC CSH Fluoro－Phenyl （1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm） 管柱溫度：40度 洗提液：A） 0.05% TFA／水，B） 0.05% TFA／MeCN 梯度（B）：20% （0 min.） → 100% （20 min.） → 20% （20.1 min.） → 12% （24.0 min.） 流速：0.3 mL／min 偵測：PDA 254 nm （200－400 nm PDA total） 注入體積：1.0 μL 樣本準備：40μL的懸浮液／960 μL MeCN
以下的Fmoc胺基酸是購入市售品。 ［表A］
Figure 02_image020
Figure 02_image022
［液相合成實驗］ ［起始原料合成］ （起始原料合成1） Fmoc－MeAsp（OtBu）－pip （化合物2）的合成
Figure 02_image024
在500 mL的三頸燒瓶，加入Fmoc－MeAsp（OtBu）－OH （化合物1） 26.9 g （63.2 mmol, 1.0 eq）、哌啶鹽酸鹽9.23 g （75.9 mmol, 1.2 eq）、Oxyma 10.8 g （69.5 mmol, 1.1 eq）、N,N－二甲基甲醯胺135 mL，並攪拌。使用滴液漏斗在0℃花費10分鐘滴下1－乙基－3－（3－二甲基胺基丙基）碳二亞胺12.2 mL（69.5 mmol, 1.1 eq）。滴下後使用N,N－二甲基甲醯胺1.25 mL，洗淨滴液漏斗二次。反應開始5小時後，加入2－MeTHF 269 mL後，花費10分鐘加入0.5 mol／L鹽酸水溶液135 mL。排出水層後，在有機層加入5%碳酸鈉水溶液135 mL。排出水層後，在有機層加入10%氯化鈉水溶液135 mL。排出水層後，將有機層在室溫保存一夜。減壓餾去約60 mL的有機溶劑後，在室溫於濃縮液加入乙酸乙酯81 mL。邊攪拌同時加入庚烷323 mL。外溫設定0℃，1小時20分鐘後，加入庚烷 161 mL。使用桐山漏斗過濾洗淨結晶後，將所得結晶在外溫40℃進行減壓乾燥，獲得白色固體28.2 g（化合物2）。
［表2］
  質量（g） 產率（%）
起始原料（化合物1） 26.9 －
產物（化合物2） 28.2 90.5
［表3］ 分析（HPLC方法C：確定純度）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
起始原料（化合物1） 425.2 － － －
產物（化合物2） 492.3 * 10.3 99.3
*產物的LCMS峰在脫t－Bu化時確認。 參照化合物3的合成實施例。
（起始原料合成2） Fmoc－MeAsp（OH）－pip （化合物3）的合成
Figure 02_image026
在100mL的三頸茄形燒瓶秤量Fmoc－MeAsp（OtBu）－pip （化合物2） 1.58 g （3.20 mmol, 1.0 eq），在氮氣環境下以針筒加入2－MeTHF 9.5mL並攪拌，以針筒加入HMDS 1.0 mL （4.8 mmol, 1.5 eq）。將燒瓶浸於冰水浴，在內溫達到1℃時，以針筒加入TMSOTf 0.79 mL （4.4 mmol, 1.4 eq）。滴下結束5分鐘後，升溫至室溫，1小時後，以HPLC（方法 A－a）確認反應率為100%。再次將反應容器浸入冰水浴，在內溫達到5℃時，加入5%碳酸鈉水溶液15 mL。加入碳酸鈉水溶液結束後攪拌反應溶液數分鐘後，停止攪拌。將反應容器移到50 mL分液漏斗，使其分層後，取水層。將所得水層以MTBE 15 mL洗淨。在所取的水層加入MTBE 15 mL後，加入磷酸（質量分率85%以上）1.1 mL。以分液漏斗震盪溶液後，使其分層，取有機層。在所得有機層加入硫酸鎂後，過濾硫酸鎂。在濾液加入庚烷1.5 mL，進行減壓濃縮，獲得白色固體1.42 g （化合物3）（未測量含量）。
［表4］
  質量（g） 產率（%）
起始原料（化合物2） 1.58 －
產物（化合物3） 1.42 定量
［表5］ 分析（HPLC方法A－a：鑑定產物和確定純度* ）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
起始原料（化合物2） 492.6 493.3（[M＋H]＋ ） 3.2 99.4
產物（化合物3） 436.5 437.3（[M＋H]＋ ） 2.4 99.9
* 扣除2－MeTHF溶劑所含的安定化劑（2,6－二t－丁基p甲酚）峰，算出LC A%。
（起始原料合成3） Fmoc－MeAsp（OH）－NMe2 （化合物21）的合成
Figure 02_image028
在氮氣流下，在反應容器加入EDCI（16.9 g, 88.0 mmol）、及DMF（144 mL），冷卻至0℃。在0℃依序加入HOBt（10.9 g, 80.6 mmol）、及根據WO2018／225864記載的方法所合成的化合物19（30.0 g, 73.3 mmol）溶於DCM／DMF（60 mL／60 mL）的溶液，在0℃攪拌30分鐘。在0℃滴下二甲基胺（2 mol／L THF溶液, 40.5 mL, 80.6 mmol）後，在0℃攪拌30分鐘。在反應液加入乙酸乙酯（300mL），有機層依序以1 mol／L鹽酸水溶液（240 mL）洗淨2次、水（300mL）洗淨2次、飽和碳酸氫鈉水溶液／水（1／1, 300 mL）洗淨2次、飽和氯化鈉水溶液／水（1／1, 300 mL）洗淨後，有機層以硫酸鈉乾燥。過濾乾燥劑後，減壓濃縮濾液，獲得淡褐色無定形結晶之化合物20 32.7 g（產率102%）。 LCMS（ESI） m／z ＝ 437.2 （M+H）+ 滯留時間：0.86分（分析條件 HPLC 方法 E）
以化合物20（32.0 g, 73.3 mmol）作為起始原料，混合肆（三苯基膦）鈀和DCM，之後滴下苯基矽烷後，在室溫攪拌反應液30分鐘。進行目的物的萃取操作，使含有目的物的溶液濃縮乾燥，獲得化合物21為淡褐色無定形結晶25.1 g（產率 86%）。 LCMS（ESI） m／z ＝ 397.2 （M+H）+ 滯留時間：0.68分（分析條件 HPLC 方法 E）
Cl－Trt（2－Cl） 樹脂（1.25～1.60 mmol／g, 100－200 mesh, 1%DVB）購自渡邊化學工業股份公司、或SUNRESIN社。
［固相合成實驗］ 在本說明書，當固相載體和化合物鍵結時，聚合物或樹脂部位有記為˙的情形。又，以使和固相載體部位的反應點明確之目的，有標明連接於˙而為反應部位的連接子的化學結構的情形。例如，在下列的結構（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）－resin）pip （化合物3），固相載體的2－氯三苯甲基和MeAsp的側鏈羧基形成酯鍵。pip表示哌啶基，在上述結構，C端的羧基和哌啶形成醯胺鍵。
Figure 02_image030
［1殘基+1殘基縮合實驗］ 在本說明書，有固相反應實施時的溶劑量以倍量（v／w）記載的情形。倍量的基準為擔載步驟的Cl－Trt（2－Cl）樹脂的質量，例如在固相原料合成1中，相對於3.97 g的Cl－Trt（2－Cl）樹脂，使用40mL的二氯甲烷時，為40／3.97 ≒ 10 v／w。又，在1殘基+1殘基縮合實驗，在擔載步驟所得的樹脂中間體分成小份使用。1殘基+1殘基縮合實驗時的溶劑量為4v／w，但將其體積換算，則相當於4 （mL／g）×小份樹脂 （g） ÷ 擔載後的樹脂 （g） × 擔載步驟原料樹脂 （g） ＝ 4 （mL／g） × 小份樹脂 （g） ／ 5.79 × 3.97 mL。
在本說明書，固相縮合反應的純度評估，是將使用延長後所得的乾燥樹脂之脫樹脂反應後的反應液以LC測量，確認擔載於固相合成用樹脂的化合物的純度。顯示具體的步驟順序。將延長後的乾燥樹脂約20mg放入帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，以拋棄式針筒吸取二氯甲烷1mL，在室溫靜置15分鐘。排出二氯甲烷，加入含1%TFA的二氯甲烷0.20mL，在室溫震盪30秒。在玻璃小瓶（vial） 排出溶液1 mL。排出液40μL以乙腈960μL稀釋，調製LC樣本液。
本說明書之實施例2－2～實施例2－11以外（實施例2－1、實施例2－12～2－31），從Fmoc定量值（mmol／g）、乾燥樹脂重量（g）、及LC純度（area%）的積計算出目的物的物質量（mmol），評估固相縮合反應的產率。顯示Fmoc定量的具體步驟順序。以100mL量瓶秤量乾燥樹脂約20mg後，加入含有20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行量瓶稀釋。將此溶液在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計（UV3900－01），測量溶液的吸光度（波長289.80 nm，係數ε＝6089），以下式計算擔載於樹脂的具有Fmoc基的化合物的每單位重量的物質量（Fmoc定量）。 測量溶液的莫耳濃度（mol／L） ＝ 吸光度 ÷ ε Fmoc定量值（mmol／g） ＝ 測量溶液的莫耳濃度（mol／L） ÷ 測量用樹脂（g） × 100 （mL）
在本說明書的實施例2－2～實施例2－11，使用下列的Fmoc定量法： Fmoc定量法：（實施例2－2～實施例2－11） 在10mL容量瓶秤量市售的Fmoc－Gly－OH約10 mg後，加入DMF （4 ml）。在室溫震盪30分鐘後，加入DBU （40 μL），將此溶液在室溫震盪15分鐘。之後，加入DMF進行容量瓶稀釋使成為10mL。以溶液上清液30μL和4mL DMF溶液調製樣本液，取得LC數據（5 μL注入）。從取得的數據作成在294nm及304nm各波長的檢量線。
在10mL容量瓶秤量反應後的樹脂約10mg後，加入DMF （4 ml）。在室溫震盪30分鐘後，加入DBU （40 μL），將此溶液在室溫震盪15分鐘。之後，加入DMF進行容量瓶稀釋使成為10mL。以溶液上清液80μL和920μL的DMF溶液調製樣本液，取得LC數據（5 μL注入）。從對各波長所取得的數據的面積所作成的檢量線，計算出擔載於樹脂之具有Fmoc基的化合物的每單位重量之物質量，將該平均值作為Fmoc定量值。
［起始原料合成］ （固相原料合成1） Fmoc－MeAsp（OH）－pip （化合物3）對Trt（2－Cl）樹脂的擔載
Figure 02_image032
在固相反應柱（column）秤量Cl－Trt（2－Cl）樹脂3.97 g （1.36 mmol／g, 5.40 mmol, 1.7 eq），加入二氯甲烷40 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出二氯甲烷後，將Fmoc－MeAsp（OH）－pip （化合物3） 1.40 g （3.20 mmol, 1.0 eq）及N,N－二異丙基乙基胺1.6 mL （9.0 mmol, 2.8 eq）溶解於二氯甲烷30 mL （7.5 v／w）的溶液，在室溫加入於反應柱後，在室溫震盪2小時。排出反應溶液後，將甲醇3.2 mL （0.8 v／w）和N,N－二異丙基乙基胺1.6 mL （0.4 v／w）溶解於N,N－二甲基甲醯胺27 mL （6.8 v／w）的溶液，在室溫添加於反應柱。在室溫震盪2小時後，排出反應溶液。樹脂以N,N－二甲基甲醯胺40 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇40 mL （10 v／w）洗淨2次、接著以甲醇40 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得5.79 g乾燥樹脂（化合物4）。在100mL容量瓶量取所得樹脂19.4mg，以含有20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表6］
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 產率（%）*
CTC樹脂 3.97 －   －
產物（化合物4） 5.79 0.525 99.0 93.9
* 包含脫t－Bu化步驟的二階段產率（以（化合物2）為含量100%計算）
［表7］ 分析（HPLC方法B：鑑定產物和確定純度）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
產物（化合物3）* 436.2 437.3（[M＋H]＋ ） 6.8 99.0
* 為了確認擔載前後的純度變化，分析脫樹脂的化合物3
（固相原料合成2） Fmoc－MeAsp（OH）－NMe2 （化合物21）對Trt（2－Cl）樹脂的擔載
Figure 02_image034
在帶有過濾器的反應容器，加入Cl－Trt（2－Cl）樹脂（1.60 mmol／g, 8.83 g, 14.1 mmol）和DCM（90 mL），在室溫震盪20分鐘。加上氮氣壓，去除DCM後，在反應容器添加化合物21（2.80 g, 7.06 mmol）、甲醇（2.29 mL, 56.5mmol）、DIPEA（5.91 mL, 33.9 mmol）、及DCM（64 mL）的混合液，在室溫震盪60分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，在反應容器添加甲醇（9.17 mL, 226 mmol）、DIPEA（5.91 mL, 33.9 mmol）、及DCM（64 mL）的混合液，在室溫震盪90分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，加入DCM（90 mL）震盪5分鐘後，加上氮氣壓，去除反應液。重複2次此使用DCM的樹脂洗淨操作，將所得樹脂在減壓下乾燥一夜，獲得10.4 g的化合物22。使用乾燥樹脂（11.04 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.442 mmol／g（在294 nm的UVarea值：4990.63，在304 nm的UVarea值：4516.89）。
（固相原料合成3） Fmoc－D－3－MeAbu－OH （化合物23） 對Trt（2－Cl）樹脂的擔載
Figure 02_image036
在帶有過濾器的反應容器，加入Cl－Trt（2－Cl）樹脂（1.60 mmol／g, 25.0 g, 40.0 mmol）和DCM（125 mL），在室溫震盪20分鐘。加上氮氣壓，去除DCM後，在反應容器添加在Fmoc－D－3－MeAbu－OH（化合物23, 3.60 g, 10.6 mmol）、甲醇（0.859 mL, 21.2 mmol）及DIPEA（12.3 mL, 70.7 mmol）加入DCM調製成總計145mL的混合液，在室溫震盪30分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，在反應容器添加在甲醇（12.5 mL, 143 mmol）及DIPEA（12.5 mL, 71.8 mmol）加入DCM調製成總計250 mL的混合液，在室溫震盪90分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，加入DCM（180 mL）震盪5分鐘後，加上氮氣壓，去除反應液。重複3次此使用DCM的樹脂洗淨操作，將所得樹脂在減壓下乾燥一夜，獲得28.3 g的化合物24。使用乾燥樹脂（10.36 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.369 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3920.38，在304 nm的UVarea值：3530.84）。
（固相原料合成4） Fmoc－MeGly－OH （化合物25）對Trt（2－Cl）樹脂的擔載
Figure 02_image038
在帶有過濾器的反應容器，加入Cl－Trt（2－Cl）樹脂（1.60 mmol／g, 12.3 g, 19.7 mmol）和DCM（125 mL），在室溫震盪20分鐘。加上氮氣壓，去除DCM後，在反應容器添加從商業供應商購入的Fmoc－MeGly－OH（3.07 g, 9.87 mmol）、DIPEA（8.25 mL, 47.4 mmol）、及DCM（110 mL）的混合液，在室溫震盪60分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，在反應容器添加甲醇（12.8 mL, 316 mmol）、DIPEA（8.25 mL, 47.4 mmol）、及DCM（110 mL）的混合液，在室溫震盪90分鐘。加上氮氣壓，去除反應液後，加入DCM（180 mL）震盪5分鐘後，加上氮氣壓，去除反應液。重複2次此使用DCM的樹脂洗淨操作，將所得樹脂在減壓下乾燥一夜，獲得22.2 g的化合物26。使用乾燥樹脂（10.00 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.573 mmol／g（在294 nm的UVarea值：5879.66，在304 nm的UVarea值：5289.40）。
（固相原料合成5） Fmoc－MeLeu－OH （化合物37）對Trt（2－Cl）樹脂的擔載
Figure 02_image040
在固相反應柱秤量Cl－Trt（2－Cl）樹脂1.01 g （1.13 mmol／g, 1.14 mmol, 1.4 eq），加入二氯甲烷10 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出二氯甲烷後，將Fmoc－MeLeu－OH （化合物1） 0.29 g （0.79 mmol, 1.0 eq）及N,N－二異丙基乙基胺0.40 mL （2.3 mmol, 2.9 eq）溶解於二氯甲烷8.0 mL （8 v／w）的溶液，在室溫加入於反應柱後，在室溫震盪2小時。排出反應溶液後，將甲醇0.80 mL （0.8 v／w）和N,N－二異丙基乙基胺0.40 mL （0.4 v／w）溶解於N,N－二甲基甲醯胺6.8 mL （6.8 v／w）的溶液，在室溫加入反應柱。在室溫震盪2小時後，排出反應溶液。樹脂以N,N－二甲基甲醯胺10 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇10 mL （10 v／w）洗淨2次、接著以甲醇10 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得1.27 g乾燥樹脂（化合物38）。在100mL容量瓶量取所得樹脂17.7mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表8］
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 產率（%）
CTC樹脂 1.01 －   －
產物（化合物38） 1.27 0.650 100 102
［表9］ 分析（HPLC方法H：確定純度）
  Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物37） 3.1 100
將下列市售胺基酸以上述相同反應條件擔載於CTC樹脂的結果，如下所示。
［表10］
Figure 02_image042
在實施例1、實施例2－1、及實施例2－12～實施例2－31，相對於固相合成用樹脂的胺基酸，使用Fmoc胺基酸、DIC、及Oxyma各2當量、4當量、1當量，使胺基酸延長（實施例條件A）。 ［實施例1］ （1殘基+1殘基縮合實驗） Fmoc－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物5）的合成（相對於樹脂的胺基酸， Fmoc胺基酸：DIC：添加劑（Oxyma）＝2：4：1的反應條件：以下，稱為實施例條件A）
Figure 02_image044
在固相反應柱秤量乾燥樹脂（化合物4） 3.01 g （0.525 mmol／g, 1.57 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺21 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含有20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液17 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再加入含有20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液17 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺21 mL （10 v／w）洗淨8次。之後，在小玻璃瓶秤量Fmoc－MeVal－OH 1.12 g （3.16 mmol, 2.0 eq）和Oxyma 0.226 g （1.58 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺8.2 mL （4 v／w）使溶解，將本溶液添加於固相合成用柱。接著加入DIC 0.99 mL （6.3 mmol, 4.0 eq），密封後在室溫震盪6小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺21 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇21 mL （10 v／w）洗淨2次、接著以甲醇21 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得2.78g的乾燥樹脂（化合物5）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂23.2mg，以含有20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表11］ （HPLC方法B：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物4） 3.01 0.525 99.0 1.57 －
產物（化合物5） 2.78 0.532 96.1 1.42 90.8
Figure 02_image046
［表12］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
差向異構體（化合物6） 549.7 550.4（[M＋H]＋ ） 9.0 0.4
目的物（化合物7） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.3 96.1
過剩的延長體（化合物8） 745.9 746.6（[M＋H]＋ ） 12.2 2.3
過剩的延長體（化合物9） 942.2 未偵測到 未偵測到 未偵測到
能夠以高產率獲得目的物（化合物7）。過剩延長體（化合物8）及差向異構體（化合物6）的生成分別是2.3 A%、0.4 A%。
［實施例2－1］ Fmoc－D－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物10）的合成（根據實施例條件Ａ的合成）
Figure 02_image048
在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量乾燥樹脂（化合物4） 0.195 g （0.525 mmol／g, 0.101 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再次加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨8次。之後在小玻璃瓶秤量Fmoc－D－MeVal－OH 72 mg （0.21 mmol, 2.0 eq）和Oxyma 15 mg （0.11 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.54 mL （4 v／w）使其溶解，以拋棄式針筒吸取此溶液。接著加入DIC 66 μL （0.42 mmol, 4 eq），密封後在室溫震盪6小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇1.3 mL （10 v／w）洗淨2次、接著以甲醇1.3 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得0.188 g的乾燥樹脂（化合物10）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂22.6 mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表13］ （HPLC方法B：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物4） 0.195 0.525 99.0 0.101 －
產物（化合物10） 0.188 0.517 96.8 0.0939 92.6
Figure 02_image050
［表14］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
目的物（化合物6） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.0 96.8
差向異構體（化合物7） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.3 0.1
過剩的延長體 （化合物11） 745.9 746.6（[M＋H]＋ ） 12.1 1.9
過剩的延長體 （化合物12） 942.2 未偵測到 未偵測到 未偵測到
能夠以高產率獲得目的物（化合物10）。過剩延長體（化合物11）及差向異構體（化合物7）的生成分別是1.9 A%、0.1 A%。
在實施例2－2～實施例2－11所記載之經由固相反應的胜肽合成使用胜肽合成機（Multipep RS；Intavis社製），根據Fmoc法進行。關於操作的詳細順序遵循合成機所附的操作手冊。
在實施例2－2～實施例2－11之詳細的合成條件顯示於下述合成法1。
合成法1 使用構成目的之胜肽的Fmoc胺基酸（第二胺基酸）、作為添加劑之HOAt或Oxyma、及NMP，使其溶解形成Fmoc胺基酸的濃度為0.6 mol／L、添加劑的濃度為0.375 mol／L，調製溶液1。在Fmoc胺基酸難溶的情形，添加DMSO形成20～30%（v／v），調製溶液1。又，使DIC成為10%（v／v）的方式與DMF混合，調製溶液2。將在固相原料合成1～4所調製的擔載有Fmoc胺基酸或胜肽的樹脂（100 mg）加入帶有過濾器（濾片）的固相反應容器，安裝於胜肽合成機。透過加入DCM（1.2 mL）、靜置30分鐘，進行樹脂的膨潤後，從濾片排出溶液。將溶液1及溶液2安裝於胜肽合成機，經胜肽合成機開始自動合成。
在含有樹脂的固相反應容器添加DBU的DMF溶液（2%v／v, 0.7 mL），在室溫進行Fmoc基的去除反應。在第1殘基的脫保護進行反應4.5分鐘，從第2殘基以後的脫保護進行反應10分鐘後，從濾片排出溶液。在此加入DMF（0.7 mL），靜置5分鐘後，從濾片排出溶液。再重複3次此樹脂的洗淨步驟。接著，以合成機的混合小玻璃瓶（mixing vial）混合溶液1（0.3 mL）及溶液2（0.36 mL）（Fmoc胺基酸：縮合劑：添加劑的混合比為約1.6：2：1）後，添加於樹脂，使固相反應容器加溫至40℃或50℃，藉由反應2.5小時或10小時，在樹脂上進行胺基和Fmoc胺基酸的縮合反應後，從濾片排出溶液。之後，以DMF（0.7 mL）洗淨樹脂3次。以此種Fmoc基的去除反應接著Fmoc胺基酸的縮合反應為1循環，重複此循環使胜肽延長。
胜肽延長結束後，以DMF（0.7 mL）洗淨所得樹脂4次後，以DCM（0.7 mL）洗淨4次，在室溫自然乾燥48小時。將所得的樹脂一部分（約10 mg）放入反應容器，根據上述Fmoc定量法，計算樹脂上的胜肽的擔載率。又，將所得的樹脂一部分（約20mg）放入反應容器，加入含有或不含有0.75%（v／v）DIPEA的TFE／DCM溶液（1／1, 1 mL），在室溫震盪2小時，進行胜肽的切除反應。反應後，以LCMS分析切除溶液。
計算［實施例2－2］～［實施例2－11］所示的胜肽經由使用胜肽合成機的固相反應，以下列二條件合成時的回收率及純度。
［表15］
  第2殘基的胺基酸的延長反應的條件 第3殘基的胺基酸的延長反應的條件
條件1 HOAt，40℃，2.5小時 HOAt，40℃，2.5小時
條件2 Oxyma，50℃，10小時 HOAt，40℃，2.5小時
實施例2－1～實施例2－30之回收率的定義、及計算方法顯示於下述的回收率計算法。
回收率計算法 實施例2如下定義回收率。回收率越高，顯示過早裂解越受到抑制。 回收率 ＝ 延長反應後的實際Fmoc定量值（mmol／g） ÷ 延長反應後的理論Fmoc定量值（mmol／g）（公式1）
如下計算延長反應後的理論Fmoc定量值（mmol／g）。 延長反應後的理論Fmoc定量值（mmol／g）＝ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） × 原料樹脂的重量（g） ÷ 目的物100%生成時的樹脂的重量（g）（公式2）
如下計算目的物100%生成時的樹脂的重量（g）。 目的物100%生成時的樹脂的重量（g） ＝ 原料樹脂的重量（g） － 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的重量（g） + 目的物100%生成時的樹脂上的胜肽成分的重量（g）（公式3）
如下計算原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的重量（g）。 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的重量（g） ＝ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） × 原料樹脂的重量（g） × 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol）（公式4）
如下計算目的物100%生成時的樹脂上的胜肽成分的重量（g）。 目的物100%生成時的樹脂上的胜肽成分的重量（g） ＝ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） × 原料樹脂的重量（g） × 目的物的胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol）（公式5）
將公式3、公式4、及公式5帶入公式2， 延長反應後的理論Fmoc定量值（mmol／g） ＝ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） ÷ （1 － 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） × 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol） + 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） × 目的物的胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol）） ＝ 1 ÷ （1 ÷ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） － 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的重量（g／mol） × 0.001（mol／mmol） + 目的物的胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol））（公式6）
將公式6帶入公式1，以下公式計算回收率。 回收率 ＝ 延長反應後的實際Fmoc定量值（mmol／g） × （1 ÷ 原料樹脂的Fmoc定量值（mmol／g） － 原料樹脂上的胺基酸或胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol） + 目的物的胜肽成分的分子量（g／mol） × 0.001（mol／mmol））
［實施例2－2］ Fmoc－Ile－MeVal－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip（化合物27）的合成
Figure 02_image052
根據條件1的化合物27的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物27。使用乾燥樹脂（10.45 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.292 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3046.82，在304 nm的UVarea值：2746.87）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率 ＝ 0.292 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 662.83 × 0.001） ＝ 70.8%
Figure 02_image054
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物27的脫樹脂體的純度為61.6 area%，差向異構體（化合物27a）為6.5 area%，過剩延長體（化合物27b）為2.4 area%，缺損體（化合物27c）為29.5 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表16］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物27） 662.83 663.7（[M＋H]＋ ） 1.78 61.6
差向異構體（化合物27a） 662.83 663.7（[M＋H]＋ ） 2.00 6.5
過剩延長體（化合物27b） 859.08 859.8（[M＋H]＋ ） 2.18 2.4
缺損體（化合物27c） 549.67 550.5（[M＋H]＋ ） 1.63 29.5
根據條件2的化合物27的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物27。使用乾燥樹脂（10.89 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.332 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3612.81，在304 nm的UVarea值：3267.35）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率 ＝ 0.332 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 662.83 × 0.001） ＝ 80.5%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物27的脫樹脂體的純度為93.7 area%，差向異構體（化合物27a）為2.6 area%，過剩延長體（化合物27b）為3.7 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表17］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物27） 662.83 663.6（[M＋H]＋ ） 1.79 93.7
差向異構體（化合物27a） 662.83 663.7（[M＋H]＋ ） 2.02 2.6
過剩延長體（化合物27b） 859.08 859.8（[M＋H]＋ ） 2.20 3.7
以上結果統整如下表。 ［表18］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物27 （LC A%） 差向異構體 化合物27a （LC A%） 過剩延長體 化合物27b （LC A%） 缺損體 化合物27c （LC A%）
條件1 70.8 61.6 6.5 2.4 29.5
條件2 80.5 93.7 2.6 3.7 －
［實施例2－3］ Fmoc－Ile－MeIle－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip（化合物28）的合成
Figure 02_image056
根據條件1的化合物28的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeIle－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物28。使用乾燥樹脂（10.81 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.326 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3524.40，在304 nm的UVarea值：3171.55）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率 ＝0.326 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001） ＝ 79.5%
Figure 02_image058
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物28的脫樹脂體的純度為58.0 area%，差向異構體（化合物28a）為1.4 area%，過剩延長體（化合物28b）為1.8 area%，缺損體（化合物27c）為38.8 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表19］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物28） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.00 58.0
差向異構體（化合物28a） 676.86 677.7（[M＋H]＋ ） 2.20 1.4
過剩延長體（化合物28b） 873.11 873.8（[M＋H]＋ ） 2.37 1.8
缺損體（化合物27c） 549.67 550.5（[M＋H]＋ ） 1.62 38.8
根據條件2的化合物28的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeIle－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物28。使用乾燥樹脂（10.41 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.330 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3437.60，在304 nm的UVarea值：3100.91）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝ 0.330 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001） ＝ 80.5%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物28的脫樹脂體的純度為95.2 area%，差向異構體（化合物28a）為1.4 area%，過剩延長體（化合物28b）為3.4 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表20］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物28） 676.86 677.7（[M＋H]＋ ） 2.01 95.2
差向異構體（化合物28a） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.22 1.4
過剩延長體（化合物28b） 873.11 873.9（[M＋H]＋ ） 2.39 3.4
以上結果統整如下表。 ［表21］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物28 （LC A%） 差向異構體 化合物28a （LC A%） 過剩延長體 化合物28b （LC A%） 缺損體 化合物27c （LC A%）
條件1 79.5 58.0 1.4 1.8 38.8
條件2 80.5 95.2 1.4 3.4 －
［實施例2－4］ Fmoc－Ile－MeGly（cPent）－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip（化合物29）的合成
Figure 02_image060
根據條件1的化合物29的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeGly（cPent）－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物29。使用乾燥樹脂（10.05 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.320 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3216.77，在304 nm的UVarea值：2905.18）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.320 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 688.87 × 0.001）＝78.4%
Figure 02_image062
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物29的脫樹脂體的純度為83.9 area%，差向異構體（化合物29a）為1.2 area%，過剩延長體（化合物29b）為3.9 area%，缺損體（化合物27c）為11.0 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表22］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物29） 688.87 689.6（[M＋H]＋ ） 2.06 83.9
差向異構體（化合物29a） 688.87 689.7（[M＋H]＋ ） 2.27 1.2
過剩延長體（化合物29b） 885.12 885.8（[M＋H]＋ ） 2.43 3.9
缺損體（化合物27c） 549.67 550.5（[M＋H]＋ ） 1.63 11.0
根據條件2的化合物29的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeGly（cPent）－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物29。使用乾燥樹脂（9.45 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.232 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2194.45，在304 nm的UVarea值：1975.12）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.232 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 688.87 × 0.001） ＝56.8%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物29的脫樹脂體的純度為91.4 area%，差向異構體（化合物29a）為0.1 area%，過剩延長體（化合物29b）為8.5 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表23］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物29） 688.87 689.7（[M＋H]＋ ） 2.09 91.4
差向異構體（化合物29a） 688.87 689.5（[M＋H]＋ ） 2.29 0.1
過剩延長體（化合物29b） 885.12 885.8（[M＋H]＋ ） 2.45 8.5
以上結果統整如下表。 ［表24］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物29 （LC A%） 差向異構體 化合物29a （LC A%） 過剩延長體 化合物29b （LC A%） 缺損體 化合物27c （LC A%）
條件1 78.4 83.9 1.2 3.9 11.0
條件2 56.8 91.4 0.1 8.5 －
［實施例2－5］ Fmoc－Ile－MeChg－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip（化合物30）的合成
Figure 02_image064
根據條件1的化合物30的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeChg－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物30。使用乾燥樹脂（9.68 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.314 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3037.14，在304 nm的UVarea值：2743.09）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.314 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 702.89 × 0.001）＝77.4%
Figure 02_image066
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物30的脫樹脂體的純度為74.1 area%，差向異構體（化合物30a）為2.3 area%，過剩延長體（化合物30b）為4.0 area%，缺損體（化合物27c）為19.5 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表25］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物30） 702.89 703.6（[M＋H]＋ ） 2.24 74.1
差向異構體（化合物30a） 702.89 703.6（[M＋H]＋ ） 2.43 2.3
過剩延長體（化合物30b） 899.14 899.8（[M＋H]＋ ） 2.58 4.0
缺損體（化合物27c） 549.67 550.5（[M＋H]＋ ） 1.63 19.5
根據條件2的化合物30的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeChg－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物30。使用乾燥樹脂（9.91 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.226 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2235.50，在304 nm的UVarea值：2016.81）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.226 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 702.89 × 0.001） ＝ 55.7%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物30的脫樹脂體的純度為91.7 area%，差向異構體（化合物30a）為0.6 area%，過剩延長體（化合物30b）為7.7 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表26］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物30） 702.89 703.6（[M＋H]＋ ） 2.26 91.7
差向異構體（化合物30a） 702.89 703.7（[M＋H]＋ ） 2.44 0.6
過剩延長體（化合物30b） 899.14 899.8（[M＋H]＋ ） 2.60 7.7
以上結果統整如下表。 ［表27］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物30 （LC A%） 差向異構體 化合物30a （LC A%） 過剩延長體 化合物30b （LC A%） 缺損體 化合物27c （LC A%）
條件1 77.4 74.1 2.3 4.0 19.5
條件2 55.7 91.7 0.6 7.7 －
［實施例2－6］ Fmoc－Ile－MeLeu－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip（化合物31）的合成
Figure 02_image068
根據條件1的化合物31的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeLeu－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物31。使用乾燥樹脂（10.74 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.369 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3953.19，在304 nm的UVarea值：3570.96）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.369 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001） ＝ 90.0%
Figure 02_image070
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物31的脫樹脂體的純度為98.3 area%，差向異構體（化合物31a）為0.1 area%，過剩延長體（化合物31b）為1.6 area%。本基質即使在條件1也沒有觀察到缺損體（化合物27c）。
分析條件：HPLC方法G ［表28］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物31） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.03 98.3
差向異構體（化合物31a） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.23 0.1
過剩延長體（化合物31b） 873.11 873.8（[M＋H]＋ ） 2.41 1.6
缺損體（化合物27c） 549.67 未偵測到    
根據條件2的化合物31的合成（合成法1） 以固相原料合成1所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物4）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－pip）（100 mg, 0.455 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeLeu－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物31。使用乾燥樹脂（10.73 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.337 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3610.72，在304 nm的UVarea值：3254.78）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.337 × （1 ÷ 0.455 － 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001） ＝ 82.2%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物31的脫樹脂體的純度為97.7 area%，差向異構體（化合物31a）為0.1 area%，過剩延長體（化合物31b）為2.2 area%。
分析條件：HPLC方法G ［表29］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物31） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.05 97.7
差向異構體（化合物31a） 676.86 677.6（[M＋H]＋ ） 2.25 0.1
過剩延長體（化合物31b） 873.11 873.9（[M＋H]＋ ） 2.42 2.2
以上結果統整如下表。 ［表30］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物31 （LC A%） 差向異構體 化合物31a （LC A%） 過剩延長體 化合物31b （LC A%） 缺損體 化合物27c （LC A%）
條件1 90.0 98.3 0.1 1.6 －
條件2 82.2 97.7 0.1 2.2 －
［實施例2－7］ Fmoc－Ile－MeGly（cPent）－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2（化合物32）的合成
Figure 02_image072
根據條件1的化合物32的合成（合成法1） 以固相原料合成2所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物22）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2）（100 mg, 0.442 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeGly（cPent）－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物32。使用乾燥樹脂（10.73 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.304 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3263.10，在304 nm的UVarea值：2945.28）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.304 × （1 ÷ 0.442 － 396.44 × 0.001 + 648.80 × 0.001） ＝ 76.5%
Figure 02_image074
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物32的脫樹脂體的純度為76.3 area%，差向異構體（化合物32a）為1.2 area%，過剩延長體（化合物32b）為5.6 area%，缺損體（化合物32c）為16.9 area%。
分析條件：HPLC方法E ［表31］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物32） 648.80 649.7（[M＋H]＋ ） 0.97 76.3
差向異構體（化合物32a） 648.80 649.6（[M＋H]＋ ） 1.03 1.2
過剩延長體（化合物32b） 804.98 805.7（[M＋H]＋ ） 0.93 5.6
缺損體（化合物32c） 509.60 510.5（[M＋H]＋ ） 0.88 16.9
根據條件2的化合物32的合成（合成法1） 以固相原料合成2所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物22）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2）（100 mg, 0.442 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeGly（cPent）－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物32。使用乾燥樹脂（10.60 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.211 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2239.56，在304 nm的UVarea值：2018.13）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.211 × （1 ÷ 0.442 － 396.44 × 0.001 + 648.80 × 0.001） ＝ 53.1%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物32的脫樹脂體的純度為85.9 area%，過剩延長體（化合物32a）為14.1 area%。
分析條件：HPLC方法 E ［表32］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物32） 648.80 649.6（[M＋H]＋ ） 0.96 85.9
差向異構體（化合物32a） 648.80 未偵測到    
過剩延長體（化合物32b） 804.98 805.7（[M＋H]＋ ） 0.92 14.1
以上結果統整如下表。 ［表33］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物32 （LC A%） 差向異構體 化合物32a （LC A%） 過剩延長體 化合物32b （LC A%） 缺損體 化合物32c （LC A%）
條件1 76.5 76.3 1.2 5.6 16.9
條件2 53.1 85.9 － 14.1 －
［實施例2－8］ Fmoc－Ile－MeLeu－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2（化合物33）的合成
Figure 02_image076
根據條件1的化合物33的合成（合成法1） 以固相原料合成2所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物22）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2）（100 mg, 0.442 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeLeu－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物33。使用乾燥樹脂（10.15 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.371 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3770.57，在304 nm的UVarea值：3391.62）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.371 × （1 ÷ 0.442 － 396.44 × 0.001 + 636.79 × 0.001） ＝ 92.9%
Figure 02_image078
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物33的脫樹脂體的純度為97.9 area%，過剩延長體（化合物33b）為2.1 area%。本基質即使在條件1也沒有觀察到缺損體（化合物32c）。
分析條件：HPLC方法 E ［表34］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物33） 636.79 637.7（[M＋H]＋ ） 0.97 97.9
差向異構體（化合物33a） 636.79 未偵測到    
過剩延長體（化合物33b） 792.97 793.7（[M＋H]＋ ） 0.92 2.1
缺損體（化合物32c） 509.60 未偵測到    
根據條件2的化合物33的合成（合成法1） 以固相原料合成2所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物22）（Fmoc－MeAsp（O－Trt（2－Cl）resin）－NMe2）（100 mg, 0.442 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeLeu－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物33。使用乾燥樹脂（10.73 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.334 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3587.19，在304 nm的UVarea值：3234.07）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.334 × （1 ÷ 0.442 － 396.44 × 0.001 + 636.79 × 0.001） ＝ 83.6%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物33的脫樹脂體的純度為96.6 area%，過剩延長體（化合物33b）為3.4 area%。
分析條件：HPLC方法 E ［表35］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物33） 636.79 637.6（[M＋H]＋ ） 0.96 96.6
差向異構體（化合物33a） 636.79 未偵測到    
過剩延長體（化合物33b） 792.97 793.7（[M＋H]＋ ） 0.92 3.4
以上結果統整如下表。 ［表36］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物33 （LC A%） 差向異構體 化合物33a （LC A%） 過剩延長體 化合物33b （LC A%） 缺損體 化合物32c （LC A%）
條件1 92.9 97.9 － 2.1 －
條件2 83.6 96.6 － 3.4 －
［實施例2－9］ Fmoc－Ile－MeVal－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin（化合物34）的合成
Figure 02_image080
根據條件1的化合物34的合成（合成法1） 以固相原料合成3所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物24）（Fmoc－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.369 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物34。使用乾燥樹脂（10.62 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.295 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3138.26，在304 nm的UVarea值：2821.05）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.295 × （1 ÷ 0.369 － 339.39 × 0.001 + 565.71 × 0.001） ＝ 86.6%
Figure 02_image082
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物34的脫樹脂體的純度為99.1 area%，過剩延長體（化合物34b）為1.0 area%。本基質即使在條件1也沒有觀察到缺損體（化合物34c）。
分析條件：HPLC方法 G ［表37］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物34） 565.71 566.5（[M＋H]＋ ） 1.50 99.1
差向異構體（化合物34a） 565.71 未偵測到    
過剩延長體（化合物34b） 664.84 665.6（[M＋H]＋ ） 1.58 1.0
缺損體（化合物34c） 452.55 未偵測到    
根據條件2的化合物34的合成（合成法1） 以固相原料合成3所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物24）（Fmoc－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.369 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物34。使用乾燥樹脂（10.44 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.284 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2964.86，在304 nm的UVarea值：2667.78）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.284 × （1 ÷ 0.369 － 339.39 × 0.001 + 565.71 × 0.001） ＝ 83.4%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物34的脫樹脂體的純度為98.1 area%，過剩延長體（化合物34b）為1.9 area%。
分析條件：HPLC方法 G ［表38］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物34） 565.71 566.6（[M＋H]＋ ） 1.51 98.1
差向異構體（化合物34a） 565.71 未偵測到    
過剩延長體（化合物34b） 664.84 665.6（[M＋H]＋ ） 1.59 1.9
以上結果統整如下表。 ［表39］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物34 （LC A%） 差向異構體 化合物34a （LC A%） 過剩延長體 化合物34b （LC A%） 缺損體 化合物34c （LC A%）
條件1 86.6 99.1 － 1.0 －
條件2 83.4 98.1 － 1.9 －
［實施例2－10］ Fmoc－Ile－MeChg－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin（化合物35）的合成
Figure 02_image084
根據條件1的化合物35的合成（合成法1） 以固相原料合成3所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物24）（Fmoc－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.369 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeChg－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物35。使用乾燥樹脂（10.20 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.293 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2987.04，在304 nm的UVarea值：2692.68）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.293 × （1 ÷ 0.369 － 339.39 × 0.001 + 605.78 × 0.001） ＝ 87.2%
Figure 02_image086
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物35的脫樹脂體的純度為92.8 area%，過剩延長體（化合物35b）為3.4 area%，缺損體（化合物34c）為3.8 area%。
分析條件：HPLC方法 F ［表40］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物35） 605.78 606.5（[M＋H]＋ ） 3.03 92.8
差向異構體（化合物35a） 605.78 未偵測到    
過剩延長體（化合物35b） 704.91 705.6（[M＋H]＋ ） 2.96 3.4
缺損體（化合物34c） 452.56 453.5（[M＋H]＋ ） 2.52 3.8
根據條件2的化合物35的合成（合成法1） 以固相原料合成3所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物24）（Fmoc－D－3－MeAbu－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.369 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeChg－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物35。使用乾燥樹脂（9.56 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.217 mmol／g（在294 nm的UVarea值：2072.81，在304 nm的UVarea值：1864.82）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.217 × （1 ÷ 0.369 － 339.39 × 0.001 + 605.78 × 0.001） ＝ 64.6%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物35的脫樹脂體的純度為94.5 area%，過剩延長體（化合物35b）為5.5 area%。
分析條件：HPLC方法 F ［表41］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物35） 605.78 606.6（[M＋H]＋ ） 2.97 94.5
差向異構體（化合物35a） 605.78 未偵測到    
過剩延長體（化合物35b） 704.91 705.7（[M＋H]＋ ） 2.92 5.5
以上結果統整如下表。 ［表42］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物35 （LC A%） 差向異構體 化合物35a （LC A%） 過剩延長體 化合物35b （LC A%） 缺損體 化合物34c （LC A%）
條件1 87.2 92.8 － 3.4 3.8
條件2 64.6 94.5 － 5.5 －
［實施例2－11］ Fmoc－Ile－MeVal－MeGly－O－Trt（2－Cl）resin（化合物36）的合成
Figure 02_image088
根據條件1的化合物36的合成（合成法1） 以固相原料合成4所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物26）（Fmoc－MeGly－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.573 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物36。使用乾燥樹脂（10.20 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.326 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3322.12，在304 nm的UVarea值：3002.34）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.326 × （1 ÷ 0.573 － 311.34 × 0.001 + 537.66 × 0.001） ＝ 64.3%
Figure 02_image090
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物36的脫樹脂體的純度為95.6 area%，過剩延長體（化合物36b）為4.4 area%。本基質即使在條件1也沒有觀察到缺損體（化合物36c）。
分析條件：HPLC方法 E ［表43］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物36） 537.66 538.5（[M＋H]＋ ） 0.94 95.6
差向異構體（化合物36a） 537.66 未偵測到    
過剩延長體（化合物36b） 608.74 607.4（[M＋H]＋ ） 0.90 4.4
缺損體（化合物36c） 424.50 未偵測到    
根據條件2的化合物36的合成（合成法1） 以固相原料合成4所調製的擔載胺基酸樹脂（化合物26）（Fmoc－MeGly－O－Trt（2－Cl）resin）（100 mg, 0.573 mmol／g）作為起始原料，根據合成法1，進行Fmoc－MeVal－OH的延長（Oxyma，50℃，10小時），之後進行Fmoc－Ile－OH的延長（HOAt，40℃，2.5小時），合成化合物36。使用乾燥樹脂（10.69 mg），根據Fmoc定量法計算擔載率為0.331 mmol／g（在294 nm的UVarea值：3542.66，在304 nm的UVarea值：3189.92）。
根據回收率計算法，以下式計算出回收率。 回收率＝0.331 × （1 ÷ 0.573 － 311.34 × 0.001 + 537.66 × 0.001） ＝ 65.3%
又，在以LCMS分析切除反應液時，觀察到化合物36的脫樹脂體的純度為93.9 area%，過剩延長體（化合物36b）為6.1 area%。
分析條件：HPLC方法 E ［表44］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物36） 537.66 538.5（[M＋H]＋ ） 0.93 93.9
差向異構體（化合物36a） 537.66 未偵測到    
過剩延長體（化合物36b） 608.74 607.6（[M＋H]＋ ） 0.89 6.1
以上結果統整如下表。 ［表45］
  回收率 （%） 脫樹脂體 化合物36 （LC A%） 差向異構體 化合物36a （LC A%） 過剩延長體 化合物36b （LC A%） 缺損體 化合物36c （LC A%）
條件1 64.3 95.6 － 4.4 －
條件2 65.3 93.9 － 6.1 －
以多樣序列之實施條件A的過早裂解抑制效果的驗證 ［實施例2－12］ Fmoc－MeVal－MeLeu－OCTC （化合物39）的合成（根據實施條件A的合成）
Figure 02_image092
在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量乾燥樹脂（化合物38） 0.195 g （0.650 mmol／g, 0.127 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.3 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.3 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w）洗淨8次。之後在小玻璃瓶秤量Fmoc－MeVal－OH 90 mg （0.25 mmol, 2.0 eq）和Oxyma 18 mg （0.13 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.62 mL （4 v／w）使其溶解。在此溶液加入DIC 80 μL （0.51 mmol, 4.0 eq）後，立刻以拋棄式針筒吸取，密封後在室溫震盪18小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇1.6 mL （10 v／w）洗淨2次、接著以甲醇1.6 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得0.201g的乾燥樹脂（化合物39）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂16.7 mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表46］ （HPLC方法I：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物38） 0.195 0.650 100 0.127 －
產物（化合物39） 0.201 0.494 98.6 0.0978 77
Figure 02_image094
［表47］ （HPLC方法I：純度的計算）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（化合物39） 480.3 481.2（[M＋H]＋ ） 13.5 98.6
差向異構體（化合物39a） 480.3 未偵測到 13.7 未偵測到
過剩延長體（化合物39b） 607.4 未偵測到 未偵測到 未偵測到
又，為了確認起始原料殘存率，進行甘胺酸加蓋（Glycine capping）。亦即，在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量已進行縮合反應的乾燥樹脂約10 mg，之後加入N,N－二甲基甲醯胺1 mL，在室溫靜置15分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，以拋棄式針筒吸取反應用混合液（在小玻璃瓶秤量Fmoc－Gly－OH 約70 mg和HATU約0.11 g，懸浮於N,N－二甲基甲醯胺0.45 mL後，加入N,N－二異丙基乙基胺45 μL，震盪1分鐘的淡黃色均勻溶液），在室溫震盪1小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1 mL洗淨6次，之後以二氯甲烷1 mL洗淨4次後，進行脫樹脂反應。從Gly－cap體 （化合物40）、及目的物 （化合物39）、差向異構體 （化合物39a）、過剩延長體 （化合物39b）的LC A%之和，計算出起始原料殘存率0% （0 ÷ （0 + 98.6 + 0 + 0））。
［表48］ （HPLC方法H－b：反應轉換率的計算）
  Rt（min） LC A%
Gly－cap體 （化合物40） 未偵測出 未偵測出
脫樹脂體 （化合物39） 差向異構體 （化合物39a） 3.11   98.2  
過剩延長體 （化合物39b） 未偵測出 未偵測出
Figure 02_image096
能夠以良好的產率獲得脫樹脂體（化合物39）。未確認到過剩延長體（化合物39b）及差向異構體（化合物39a）的生成。
［參考例4］ 根據Chem. Eur. J., 2009, 15, 9394－9403記載的反應條件（相對於樹脂的胺基酸，Fmoc胺基酸：DIC：添加劑（Oxyma）＝2：2：2的反應條件，以下稱為參考例條件A）之Fmoc－MeVal－MeLeu－OCTC （化合物39）的合成
Figure 02_image098
在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量乾燥樹脂（化合物38） 0.204 g （0.650 mmol／g, 0.133 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.3 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再次加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.3 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w）洗淨8次。之後在小玻璃瓶秤量Fmoc－MeVal－OH 96 mg （0.26 mmol, 2.0 eq）和Oxyma 38 mg （0.26 mmol, 2.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.65 mL （4 v／w）使其溶解。接著在室溫在小玻璃瓶加入DIC 42 μL （0.26 mmol, 2.0 eq），密閉容器，在室溫震盪2分鐘。以拋棄式針筒吸取此溶液，密封後在室溫震盪18小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.6 mL （10 v／w）洗淨4次、之後以2－丙醇1.6 mL （10 v／w）洗淨2次，接著以甲醇1.6 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得0.181 g的乾燥樹脂（化合物3）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂19.0 mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表49］ （HPLC方法E－b：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物38） 0.204 0.650 100 0.133 －
產物（化合物39） 0.181 0.130 79.8 0.0188 14
使用和實施例條件A相同的方法，確認即使以參考例條件A，起始原料殘存率也是0%。
［表50］ （HPLC方法H－b：反應轉換率的計算）
  Rt（min） LC A%
Gly－cap體 （化合物40） 未偵測出 未偵測出
脫樹脂體 （化合物39） 3.11 79.8
差向異構體 （化合物39a）    
了解到以上述參考例條件A的反應條件，目的物的產率、純度皆下降。
根據上述1殘基+1殘基縮合實驗，在實施例條件A和參考例條件A下合成以下序列。 ［實施例2－13］ Fmoc－D－MeVal－MeLeu－OCTC （化合物41）的合成（根據實施例條件A的合成）
Figure 02_image100
［表51］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率（%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.21 0.21 0 0.443 98.2 68
［表52］ （HPLC方法I：實施例條件A的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（41） 480.3 481.3（[M＋H]＋ ） 13.7 98.2
Figure 02_image102
［實施例2－14］ Fmoc－Lys（Z）－MeVal－OCTC （化合物43）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image104
［表53］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.16 0.17 0 0.392 97.6 66
參考例條件A 0.17 0.15 0 0.036 88.5 4
［表54］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（43） 615.3 616.3 （[M＋H]＋ ） 3.3 97.6
Figure 02_image106
［實施例2－15］ Fmoc－MeVal－MeAla－OCTC （化合物45） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image108
［表55］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.21 0 0.537 98.5 84
參考例條件A 0.20 0.18 0 0.208 98.4 29
［表56］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（45） 438.2 439.2 （[M＋H]＋ ） 3.0 98.5
Figure 02_image110
［實施例2－16］ Fmoc－MeVal－MeGly－OCTC （化合物47） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image112
［表57］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.21 0 0.516 95.7 81
參考例條件A 0.20 0.19 0 0.395 91.2 57
［表58］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（47） 424.2 447.1 （[M＋Na]＋ ） 2.9 95.7
Figure 02_image114
［實施例2－17］ Fmoc－MeVal－MePhe－OCTC （化合物49） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image116
［表59］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.20 3 0.401 96.1 62
參考例條件A 0.20 0.17 0 0.066 48 4
［表60］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（49） 51.4.3 515.2 （[M＋H]＋ ） 3.4 96.1
Figure 02_image118
［實施例2－18］ Fmoc－Glu（OBzl）－MeTrp（Boc）－OCTC （化合物51） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image120
［表61］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.23 0 0.479 98.0 90
參考例條件A 0.20 0.19 0 0.267 93.8 38
［表62］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（51） 759.3 704.2 （[M－C4H8＋H]＋ ） 3.9 98.0
Figure 02_image122
［實施例2－19］ Fmoc－Aze（2）－MeThr（Bzl）－OCTC （化合物53） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
［表63］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.21 0 0.432 97.4 70
參考例條件A 0.20 0.17 0 0.107 92.9 14
［表64］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（53） 528.2 529.2 （[M＋H]＋） 3.2 97.4
Figure 02_image124
［實施例2－20］ Fmoc－Lys（Z）－MeGlu（OtBu）－OCTC （化合物55）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image126
［表65］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.24 0 0.378 98.3 74
參考例條件A 0.20 0.19 0 0.148 93.3 21
［表66］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（55） 701.3 724.4 （[M＋Na]＋ ） 3.4 98.3
Figure 02_image128
［實施例2－21］ Fmoc－Thr（tBu）－MeLys（Boc）－OCTC （化合物57）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image130
［表67］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.21 0 0.426 97.0 75
參考例條件A 0.20 0.18 0 0.207 92.4 31
［表68］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（57） 639.4 662.4 （[M＋Na]＋ ） 3.5 97.0
Figure 02_image132
［實施例2－22］ Fmoc－MePhe－MeMet－OCTC （化合物59） 的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image134
［表69］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.21 0.22 0 0.450 96.7 76
參考例條件A 0.20 0.19 0 0.185 93.1 24
［表70］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（34） 546.2 547.1 （[M＋H]＋ ） 3.4 96.7
Figure 02_image136
［實施例2－23］ Fmoc－cVal－Aze（2）－OCTC （化合物61）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image138
［表71］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.19 0.19 0 0.411 93.1 64
參考例條件A 0.19 0.18 0 0.267 87.3 35
［表72］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（61） 420.2 421.2 （[M＋H]＋ ） 2.7 93.1
Figure 02_image140
［實施例2－24］ Fmoc－Gly－Gly－OCTC （化合物63）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image142
［表73］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.19 0 0.474 93.5 64
參考例條件A 0.20 0.18 0 0.379 97.1 54
［表74］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（62） 354.1 355.0 （[M＋H]＋ ） 2.4 93.5
Figure 02_image144
［表75］
編號 條件 反應時間 產率（%）
1 實施例條件A 18小時 64
2 實施例條件A 1小時 67
3 參考例條件A 1小時 61
又，在編號2及3，反應時間從18小時縮短為1小時。
［實施例2－25］ Fmoc－Gly－Leu－OCTC （化合物65）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image146
［表76］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.20 0 0.515 96.1 76
參考例條件A 0.20 0.19 0 0.427 96.6 62
［表77］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（65） 410.2 411.2 （[M＋H]＋ ） 2.9 96.1
Figure 02_image148
［表78］
編號 條件 反應時間 產率（%）
1 實施例條件A 18小時 76
2 實施例條件A 1小時 76
3 參考例條件A 1小時 72
又，在編號2及3，反應時間從18小時縮短為1小時。
［實施例2－26］ Fmoc－Pro－Aib－OCTC （化合物67）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image150
［表79］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.20 0.22 0 0.502 99.1 84
參考例條件A 0.20 0.22 0 0.459 99.5 75
［表80］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（67） 422.2 423.2 （[M＋H]＋ ） 2.7 99.1
Figure 02_image152
［實施例2－27］ Fmoc－Gly－bAla－OCTC （化合物69）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image154
［表81］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.23 0.26 0 0.555 98.3 92
參考例條件A 0.21 0.23 0 0.523 97.8 83
［表82］ （HPLC方法H－b：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（69） 368.1 369.2（[M＋H]＋ ） 2.4 98.3
Figure 02_image156
［實施例2－28］ Fmoc－MeVal－bMeAla－OCTC （化合物71）的合成
Figure 02_image158
［表83］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 3.75 3.52 0 0.556 98.3 88
參考例條件A 0.97 0.89 0 0.532 98.5 83
本序列的延長，變更實施例條件A的三點來實施。
［表84］
  實施例條件A 本序列的延長
添加劑 Oxyma Oxyma－B
縮合溶劑量 4 v／w 8 v／w
反應時間 18小時 3小時
Figure 02_image160
［表85］ （HPLC方法H－b：在本序列的延長反應的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（71） 438.2 439.2 （[M＋H]＋ ） 2.9 98.3
Figure 02_image162
［實施例2－29］ Fmoc－MeVal－D－3－MeAbu－OCTC （化合物73）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image164
［表86］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 6.05 5.98 0 0.586 89.7 86
參考例條件A 0.99 0.93 ND 0.457 無數據 70
（ND：not determined，以參考例條件A的產率不考慮純度，使用從樹脂質量和Fmoc定量值所計算的物質量。）
本序列的延長，改變實施例條件A的一點來實施。
［表87］
  實施例條件A 本序列的延長
反應時間 18小時 3小時
［表88］ （HPLC方法J：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（73） 452.2 453.2 （[M＋H]＋） 8.9 89.7
Figure 02_image166
［實施例2－30］ Fmoc－Ser（tBu）－MeLeu－OCTC （化合物75）的合成（根據實施例條件A及參考例條件A的合成）
Figure 02_image168
［表89］ （HPLC方法H－b：反應轉換率、純度的計算）
條件 原料樹脂 （g） 反應後樹脂 （g） 起始原料殘存率 （%） Fmoc定量值 （mmol／g） 純度 （LC A%） 產率 （%）
實施例條件A 0.21 0.23 0 0.491 98.9 83
參考例條件A 0.21 0.21 0 0.281 98.0 41
［表90］ （HPLC方法H：實施例條件A下的目的物的鑑定）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
脫樹脂體（75） 510.3 533.2 （[M＋Na]＋ ） 3.4 98.9
Figure 02_image170
以上結果整理如下表。
［表91］
編號 條件 第二胺基酸 第一胺基酸 純度 （LC A%） 產率 （%）
1 實施例條件A MeVal MeLeu 98.6 77
2 參考例條件A 79.8 14
3 實施例條件A D－MeVal MeLeu 98.2 68
4 實施例條件A Lys（Z） MeVal 97.6 66
5 參考例條件A 88.5 4
6 實施例條件A MeVal MeAla 98.5 84
7 參考例條件A 98.4 29
8 實施例條件A MeVal MeGly 95.7 81
9 參考例條件A 91.2 57
10 實施例條件A MeVal MePhe 96.1 62
11 參考例條件A 48 4
12 實施例條件A Glu（OBzl） MeTrp（Boc） 98.0 90
13 參考例條件A 93.8 38
14 實施例條件A Aze（2） MeThr（Bzl） 97.4 70
15 參考例條件A 92.9 14
16 實施例條件A Lys（Z） MeGlu（OtBu） 98.3 74
17 參考例條件A 93.3 21
18 實施例條件A Thr（tBu） MeLys（Boc） 97.0 75
19 參考例條件A 92.4 31
20 實施例條件A MePhe MeMet 96.7 76
21 參考例條件A 93.1 24
22 實施例條件A cVal Aze（2） 93.1 64
23 參考例條件A 87.3 35
24 實施例條件A Gly Gly 93.5 64
25 參考例條件A 97.1 54
26 實施例條件A Gly Leu 96.1 76
27 參考例條件A 96.6 62
28 實施例條件A Pro Aib 99.1 84
29 參考例條件A 99.5 75
30 實施例條件A Gly bAla 98.3 92
31 參考例條件A 97.8 83
32 實施例條件A MeVal bMeAla 98.3 88
33 參考例條件A 98.5 83
34 實施例條件A MeVal D－3－MeAbu 89.7 86
35 參考例條件A ND 70
36 實施例條件A Ser（tBu） MeLeu 98.9 83
37 參考例條件A 98.0 41
在任一序列中，和參考例條件A相比，實施例條件A皆能抑制過早裂解，以良好的產率提供2殘基的胜肽。特別是在N－Me α胺基酸的情形時，抑制效果顯著。
［實施例2－31］ 產生過早裂解抑制效果的試劑當量範圍的探索實驗 根據上述［1殘基+1殘基縮合實驗］（實施例條件A），改變試劑當量，實施相同反應的結果顯示如下。
Figure 02_image172
［表92］
Figure 02_image174
在參考例條件A下，即使Fmoc胺基酸的當量增加，產率也幾乎沒有改善（編號1、3）。 另一方面，當減少Oxyma的當量，則改善純度、產率（編號4、8、13、16）。 又，當增加DIC的當量，則改善純度、產率（編號5、6）。 再者，當減少Oxyma的當量、且增加DIC的當量時，改善純度、產率（編號2、9、10、11、12、14、15）。 特別是編號2、9、10、11獲得產率超過75%的結果。
以上，在實施例2－1～實施例2－31，以對Fmoc胺基酸使用DIC 1當量以上、添加劑1當量以下的條件，使N端N－Me化的胺基酸或胜肽延長，合成目的胜肽。延長至第3殘基時的回收率皆超過53%，高者為90%以上。和參考例條件A進行比較實驗者，與實施例條件A的產率及純度為相同以上。
［參考例1］ Chem. Eur. J., 2009, 15, 9394－9403的Fmoc－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物5）的合成（相對於樹脂的胺基酸， Fmoc胺基酸：DIC：添加劑（Oxyma）＝2：2：2的反應條件：參考例條件A）
Figure 02_image176
在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量乾燥樹脂（化合物4）0.200 g （0.525 mmol／g, 0.104 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再次加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨8次。之後在小玻璃瓶秤量Fmoc－MeVal－OH 74 mg （0.21 mmol, 2.0 eq）和Oxyma 30 mg （0.21 mmol, 2.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.54 mL （4 v／w）使其溶解。接著，在室溫在小玻璃瓶加入DIC 33 μl （0.21 mmol, 2.0 eq），密閉容器，在室溫震盪2分鐘。以拋棄式針筒吸取此溶液，密封後室溫震盪6小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨4次，之後以2－丙醇1.3 mL （10 v／w）洗淨2次，接著以甲醇1.3 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得0.178g的乾燥樹脂（化合物5）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂21.6 mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表93］ 分析（HPLC方法B：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物4） 0.200 0.525 99.0 0.104 －
產物（化合物5） 0.178 0.382 81.4 0.0554 53.3
Figure 02_image178
［表94］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
差向異構體（化合物6） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.0 0.4
目的物（化合物7） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.4 81.4
過剩的延長體（化合物8） 745.9 661.5 （[M－pip＋H]＋ ） 12.1 13.8
過剩的延長體（化合物9） 942.2 491.3* 14.2 2.4
* 從甘胺酸加蓋（Glycine capping）實驗的質量分析，鑑定為過剩延長體B。
首先，為了確認起始原料殘存率，進行甘胺酸加蓋（Glycine capping）。亦即，將縮合反應後的反應液過濾，將所得的樹脂約10mg作成N,N－二甲基甲醯胺懸浮液，移到帶有過濾器的5mL拋棄式針筒。排出N,N－二甲基甲醯胺後，以N,N－二甲基甲醯胺 1 mL洗淨3次。以拋棄式針筒吸取反應用混合液（在小玻璃瓶秤量Fmoc－Gly－OH 約70 mg和HATU約0.11 g，懸浮於N,N－二甲基甲醯胺0.45 mL後，加入N,N－二異丙基乙基胺45 μL，震盪1分鐘的淡黃色均勻溶液），在室溫震盪1小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1 mL洗淨6次、之後以二氯甲烷1 mL洗淨4次後，進行脫樹脂反應。從Gly－cap體 （化合物13）、及差向異構體 （化合物6）、目的物 （化合物7）、過剩延長體 （化合物8）、過剩延長體 （化合物9）的LC A%之和，計算出起始原料殘存率1.3% （1.3÷（1.3+79.9+13.4+2.3））。
［表95］ （HPLC方法A－c：生成物的鑑定及反應轉換率的計算）
  Mw m／z Rt（min） LC A%
Gly－cap體（化合物13） 493.6 494.3（[M＋H]＋ ） 2.87 1.3
差向異構體（化合物6） 目的物（化合物7） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 3.28 79.9
過剩的延長體（化合物8） 745.9 661.5 （[M－pip＋H]＋ ） 3.35 13.4
過剩的延長體（化合物9） 942.2 491.3* 3.44 2.3
Figure 02_image180
可知以上述反應條件，目的物的產率下降。從Gly－cap（化合物13）的生成確認反應未結束，另一方面，確認到過剩延長體（化合物8、及化合物9）的生成。
［參考例2］ 以Eur. J. Org. Chem., 2013, 6372－6378所記載的反應條件之Fmoc－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物5）的合成（相對於樹脂的胺基酸， Fmoc胺基酸：DIC：添加劑（K－Oxyma）＝2：2：2的反應條件）
Figure 02_image182
在帶有過濾器的5mL拋棄式針筒，秤量乾燥樹脂（化合物4）0.202 g （0.525 mmol／g, 0.105 mmol, 1.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w），在室溫靜置30分鐘。排出N,N－二甲基甲醯胺後，加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，再次加入含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液1.1 mL （8 v／w），在室溫震盪15分鐘。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨8次。之後在小玻璃瓶秤量Fmoc－MeVal－OH 75 mg （0.21 mmol, 2.0 eq）和K－Oxyma 40 mg （0.21 mmol, 2.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.54 mL （4 v／w）使其溶解。接著，在室溫在小玻璃瓶加入DIC 33 μl （0.21 mmol, 2.0 eq）後，立刻以拋棄式針筒吸取此溶液，密封後在室溫震盪6小時。排出反應溶液後，以N,N－二甲基甲醯胺1.3 mL （10 v／w）洗淨4次，之後以2－丙醇1.3 mL （10 v／w）洗淨2次，接著以甲醇1.3 mL （10 v／w）洗淨4次後，在室溫減壓乾燥過夜，獲得0.188 g的乾燥樹脂（化合物5）。在100mL容量瓶秤量所得樹脂21.0 mg，以含20%哌啶的N,N－二甲基甲醯胺溶液進行容量瓶稀釋，在室溫震盪45分鐘。使用分光光度計，從溶液的吸光度進行Fmoc定量，從所得的Fmoc定量值和乾燥樹脂的質量及LC A%，計算產率。
［表96］ （HPLC方法B：目的物的鑑定和純度的測量）
  質量 （g） Fmoc定量值 （mmol／g） LC A% 物質量 （mmol） 產率 （%）
起始原料（化合物4） 0.202 0.525 99.0 0.105 －
產物（化合物5） 0.188 0.512 77.6 0.0748 71.5
Figure 02_image184
［表97］
  Mw m／z Rt（min） LC A%
差向異構體（化合物6） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.0 20.2
目的物（化合物7） 549.7 550.5（[M＋H]＋ ） 9.4 77.6
過剩的延長體（化合物8） 745.9 746.5（[M＋H]＋ ） 12.1 0.6
過剩的延長體（化合物9） 942.2 未偵測到 未偵測到 未偵測到
可知以上述的反應條件，目的物的產率下降。過剩延長體（化合物8）雖然受到抑制，但是差向異構體（化合物6）的生成增加。
［1殘基+1殘基縮合實驗］［起始原料合成］ 根據本說明書所記載的擔載、縮合、脫Fmoc條件，合成縮合反應用的起始原料H－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物14）。1殘基+1殘基的縮合根據實施例條件A實施。 縮合反應用的原料（化合物14）的胜肽擔載率理論上為0.63 mmol／g。如下計算。 1.實施Fmoc－MeAsp（OH）－pip （化合物3）擔載於CTC樹脂後的乾燥樹脂（化合物4）的Fmoc定量值，測量值為0.59 mmol／g。 2.當考慮化合物3的分子量為436.51（g／mol），此乾燥樹脂（化合物4） 1 g由下式以0.258 g的化合物1和0.742g的樹脂成分所構成。 化合物3： 0.59 （mmol／g） × 1 （g） × 436.51 （g／mol） ＝ 0.258 （g）。 樹脂成分： 1 （g） － 0.258 （g） ＝ 0.742 （g） 3.從乾燥樹脂（化合物4） 1 g所得到的縮合反應用的原料（化合物14）的理論產量為，H－MeVal－MeAsp（OH）－pip （化合物15）質量可根據化合物3的物質量和胜肽的分子量算出，考量樹脂成分質量在反應前後不變， 化合物14： 0.59 （mmol／g） × 1 （g） × 327.43 （g／mol） + 0.742 ＝ 0.935 （g） 理論上的縮合反應用的原料（化合物14）的胜肽擔載率為0.63 （mmol／g） （0.59 ÷ 0.935 ＝ 0.63）。
即使在本參考例，也有以倍量（v／w）記載固相反應實施時的溶劑量的情形。和1殘基+1殘基縮合實驗不同，本參考例的倍量的基準為，乾燥樹脂（化合物14）的質量，相對於乾燥樹脂100 mg使用N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL時的倍量為0.80 mL ÷ 0.100 （g） ＝ 8 v／w。
［實施例3］ Fmoc－cLeu－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物16）的合成（根據實施例條件Ａ的合成）
Figure 02_image186
［縮合實驗］ 在小玻璃瓶秤量Fmoc－cLeu－OH 67 mg （0.19 mmol, 3.0 eq）和Oxyma 13 mg （0.095 mmol, 1.5 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w），使其溶解。在此溶液加入DIC 59 μL （0.38 mmol, 6.0 eq），在室溫震盪2小時。在此反應溶液加入乾燥樹脂（化合物14）0.10 g （0.63 mmol／g, 0.063 mmol, 1.0 eq），在室溫震盪24小時。 ［轉換率確認實驗］ 在另一個小玻璃瓶秤量Fmoc－Gly－OH 62 mg （0.21 mmol, 3.3 eq）及Oxyma 30 mg （0.21 mmol, 3.3 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.40 mL （4 v／w），使其溶解。在此溶液加入DIC 65 μL （0.42 mmol, 6.6 eq），在室溫震盪1小時。將此溶液移向Fmoc－cLeu－OH的反應溶液，在室溫震盪2小時。將反應溶液移向帶有過濾器的拋棄式針筒，過濾出反應溶液和樹脂。使用N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w）、異丙醇0.80 mL （8 v／w）交互各洗淨樹脂2次後，以N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w）洗淨2次，最後以MTBE 0.80 mL （8 v／w）洗淨，在室溫通風乾燥。將所得乾燥樹脂（化合物16）浸於1%TFA的二氯甲烷溶液1mL，進行脫樹脂反應。從Gly－cap體（化合物17）和目的物（化合物18）的LC A%，計算出轉換率75% （68.9 ÷ （23.5 + 68.9））。
［表98］ （HPLC方法D：轉換率的計算）
  Rt（min） LC A%
Gly－cap體（化合物17） 14.6 23.5
目的物（化合物18） 16.2 68.9
Figure 02_image188
基於上述［縮合實驗］，變更一部分的［縮合實驗］，實施相同的反應之結果如下。
［表99］
編號 變更點 變更後 轉換率（%）
1 － － 75
2 Oxyma 1.5 eq HOAt 1.5 eq 21
3 Oxyma 1.5 eq HOOBt 1.5 eq 3
4 Oxyma 1.5 eq TCNHPI 1.5 eq 6
5 Oxyma 1.5 eq Oxyma 0 eq 6
6 反應用DMF 8 v／w 反應用DMF 4 v／w 92
Figure 02_image190
可了解在使立體阻障大的胺基酸之Fmoc－cLeu－OH縮合的反應中使用DIC及Oxyma時，縮合反應效率良好地進行。和編號1相比，當添加劑從Oxyma分別變更為HOAt、HOOBt、或TCNHPI（編號2～編號4）時，轉換率顯著下降。在不使用Oxyma時（編號5），轉換率顯著下降。當溶劑從8 v／w（編號 1）改成4 v／w（編號 6）時，轉換率增加。可了解添加劑以Oxyma為優。可了解當使用Oxyma則轉換率增加。可了解當減少反應溶劑，則轉換率增加。
［參考例3］ 以Chem. Eur. J., 2009, 15, 9404－9416所記載的反應條件之Fmoc－cLeu－MeVal－MeAsp（OCTC）－pip （化合物15）的合成（相對於樹脂的胺基酸，Fmoc胺基酸：縮合劑（COMU）＝3：3的反應條件）
Figure 02_image192
［縮合實驗］ 在小玻璃瓶秤量Fmoc－cLeu－OH 73 mg （0.21 mmol, 3.0 eq）和COMU 89 mg （0.21 mmol, 3.0 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w），使其溶解。在此溶液加入N,N－二異丙基乙基胺73 μL （0.42 mmol, 6.0 eq），在室溫震盪30分鐘。在此反應溶液加入乾燥樹脂（化合物14）0.10 g （0.63 mmol／g, 0.063 mmol, 1.0 eq），在室溫震盪16小時。 ［轉換率確認實驗］ 在另一個小玻璃瓶秤量Fmoc－Gly－OH 62 mg （0.21 mmol, 3.3 eq）及Oxyma 30 mg （0.21 mmol, 3.3 eq），加入N,N－二甲基甲醯胺0.40 mL （4 v／w），使其溶解。在此溶液加入DIC 65 μL （0.42 mmol, 6.6 eq），在室溫震盪1小時。將此溶液移向Fmoc－cLeu－OH的反應溶液，在室溫震盪2小時。將反應溶液移向帶有過濾器的拋棄式針筒，過濾出反應溶液和樹脂。使用N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w）、異丙醇0.80 mL （8 v／w）交互各洗淨樹脂2次後，以N,N－二甲基甲醯胺0.80 mL （8 v／w）洗淨2次，最後以MTBE 0.80 mL （8 v／w）洗淨，在室溫通風乾燥。將所得乾燥樹脂（化合物16）浸於1%TFA的二氯甲烷溶液1mL，進行脫樹脂反應。從Gly－cap體（化合物17）和目的物（化合物18）的LC A%，計算出轉換率5.1% （4.7 ÷ （88.3 + 4.7））。
［表100］ （HPLC方法D：轉換率的計算）
  Rt（min） LC A%
Gly－cap體（化合物17） 15.5 88.3
目的物（化合物18） 17.1 4.7
Figure 02_image194
在使立體阻障大的胺基酸之Fmoc－cLeu－OH進行縮合的反應使用COMU時，縮合反應的進行率為5%，未反應的Gly－cap體（化合物17）為主產物。 ［產業可利用性］
根據本發明，提供有效率地製造含有採用習知方法時縮合反應未完成之反應性差的序列的胜肽化合物之方法。
無。
無。
Figure 110120180-A0101-11-0001-1

Claims (16)

  1. 一種製造胜肽化合物之方法，包括使第一胺基酸或胜肽、和第二胺基酸或胜肽，在添加劑和縮合劑的存在下進行縮合，獲得縮合體之步驟， 其中，添加劑的莫耳數小於第二胺基酸或胜肽的莫耳數。
  2. 如請求項1所述之方法，其中，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.8以下。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為1.0以上。
  4. 如請求項1～3任一項所述之方法，其中，縮合劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為1.2～4.0。
  5. 如請求項1～4任一項所述之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為10以下。
  6. 如請求項1～5任一項所述之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1～2，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為0.7以下。
  7. 如請求項1～6任一項所述之方法，其中，第二胺基酸或胜肽對第一胺基酸或胜肽的莫耳比（第一莫耳比）為2以上，添加劑對第二胺基酸或胜肽的莫耳比為第一莫耳比－1以下。
  8. 如請求項1～7任一項所述之方法，其中，添加劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為2.0以下。
  9. 如請求項1～8任一項所述之方法，其中，縮合劑對第一胺基酸或胜肽的莫耳比為1.3以上。
  10. 如請求項1～9任一項所述之方法，其中，添加劑為Oxyma、HOBt、HOOBt、或HOAt。
  11. 如請求項1～10任一項所述之方法，其中，縮合劑為DIC、DCC、EDCI、或EDCI・HCl。
  12. 如請求項1～11任一項所述之方法，其中，該胜肽化合物為該縮合體，或者該胜肽化合物在其結構中包含該縮合體。
  13. 如請求項1～12任一項所述之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的N端的胺基酸，及／或第一胜肽的C端的胺基酸，為N－烷基胺基酸。
  14. 如請求項13所述之方法，其中，第一胺基酸、或第一胜肽的C端的胺基酸，為N－烷基β胺基酸。
  15. 如請求項1～14任一項所述之方法，其中，第二胺基酸、或第二胜肽的C端的胺基酸為α,α－二取代胺基酸、β－支鏈胺基酸、或N－烷基胺基酸。
  16. 一種環狀胜肽化合物之製造方法，包括 經由如請求項1～15任一項所述之方法獲得胜肽化合物之步驟，以及 使該胜肽化合物環化之步驟。
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