CN105566456B - 末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 - Google Patents
末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105566456B CN105566456B CN201410528075.7A CN201410528075A CN105566456B CN 105566456 B CN105566456 B CN 105566456B CN 201410528075 A CN201410528075 A CN 201410528075A CN 105566456 B CN105566456 B CN 105566456B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- end side
- side chain
- chiral
- diacid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种含有末端侧链‑尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物及其合成方法,其结构式如式(Ⅰ)所示:本发明的多肽的合成方法包括如下步骤:(1)含有手性二酸的多肽的固相合成;(2)用钯催化剂同时脱去二酸保护基Allyl(烯丙基)和氨基保护基Alloc(烯丙氧羰基);(3)在六氟磷酸苯并三唑‑1‑基‑氧基三吡咯烷基磷/1‑羟基苯并三唑条件下分子内酰胺基关环,获得多肽;(4)将步骤(3)的多肽从固相切下,经分离纯化获得含有末端侧链‑尾链连接手性二酸修饰多肽,并通过圆二色谱等方法评价验证多肽的螺旋性,用荧光显微镜成像评价多肽的穿膜性。本发明的多肽及其合成方法成本低、简单高效,对于稳定多肽α‑螺旋,提高其成药性有重要意义。
Description
技术领域:
本发明属于化学生物学稳定多肽方法学领域,具体涉及一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物及其合成方法。
背景技术:
多肽类药物由于其相对于小分子更强的生物分子识别能力,极高的分子进化潜能等特点越来越引起医药行业的关注。但同时多肽类药物存在生物利用度低,难以作用于胞内靶点,组织穿透性差等缺点。
统计数据表明α-螺旋大约占蛋白质结构的近30%,这种二级结构在蛋白质与其它生物分子的识别过程中起关键作用,故α-螺旋在生物医药领域有很高的开发前景。然而,截取自天然蛋白的短肽因为接合面减少造成的焓损失以及难以折叠带来的较高的熵罚难以与靶点有效的结合,加上其易被降解使之成药性很低。
自上世纪八九十年代以来,化学生物学家开始尝试利用各种化学手段来稳定或直接模拟α螺旋。其中稳定方法包括利用各种化学(二硫键、酰胺键、酰胺键、烯烃复分解等)共价或者非共价连接侧链,或者利用末端修饰成核诱导螺旋。稳定螺旋可以提高短肽与靶点结合的能力、稳定性以及穿透细胞膜的能力。
上述稳定方法各有不同程度的缺陷。除了一些方法(离子键、二硫键)在稳定性上的缺陷,侧链-侧链连接对多肽与靶点结合的影响难以预测,导致筛选成本增加。基于末端修饰成核诱导螺旋的氢键替代策略需要较为繁琐的氮烷基化模块的构建等等。
发明内容:
本发明的目的是提供一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,该含有手性二酸修饰的多肽化合物,具有稳定的α-螺旋结构。本发明的另一目的是提供该多肽化合物的合成方法。本发明的末端手性二酸可以有效的稳定短肽螺旋,提高多肽稳定性。同时该方法原料廉价,合成简便高效。该方法还具有序列耐受性好、拥有额外修饰位点等优点。
为了实现上述目的,本发明采用如下的技术方案:
本发明首先提供一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其结构通式如式(Ⅰ)所示:
其中,R为任意氨基酸残基,n为1~2的正整数,R1、R2连接的碳原子至少一个为手性碳原子,且R1、R2各自独立地选自氢、烷基、氨基或其衍生物取代基和羟基或其衍生物取代基中的一种。
本发明中,所述的手性二酸选自酒石酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和天冬氨酸或其衍生物中的一种。
本发明中,所述的手性二酸为L型酒石酸或其衍生物。
本发明中,所述的手性二酸为手性中心位于N端β位的乙酰化天冬氨酸或其衍生物。
本发明中,所述多肽的长度大于或等于5个氨基酸。
本发明中,所述R为L型氨基酸或D型氨基酸。
本发明中,所述R为α氨基酸或β氨基酸。
本发明中,所述n为1。
本发明还提供了一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法,所述方法包括如下步骤:
固相合成末端含手性二酸,倒数第三位含赖氨酸类似物的多肽,同时脱去羧基和氨基保护基,关环得到含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物。
进一步地,本发明提供了一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法,所述方法包括如下步骤:
(1)含有手性二酸的多肽的固相合成,固相合成得到的多肽化合物,其结构式如式(Ⅱ)所示:
(2)用钯催化剂同时脱去二酸保护基和氨基保护基;
(3)在PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)/HOBt(1-羟基苯并三唑)条件下分子内酰胺基关环,获得多肽;
(4)将步骤(3)所得的多肽从固相切下,经分离纯化获得含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物(Ⅰ),通过圆二色谱表征方法验证含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的螺旋性;
其中,所述步骤(2)至步骤(3)的合成路线为:
本发明中,当R2为Fmoc(芴甲氧羰酰)保护的氨基时,需要脱除Fmoc(芴甲氧羰酰),然后保留氨基,酰化或烷基化或连接Biotin生物素或连接荧光基团,其合成路线为:
本发明还提供了含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法在稳定多肽α-螺旋二级结构中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果:
本发明可很好的稳定多肽螺旋,并提高多肽稳定性,序列耐受性好。多肽的合成完全在固相上进行,合成过程中无需非天然氨基酸,与氢键替代策略相比没有构建较为繁琐的氮烷基化模块,成本低。与侧链-侧链连接策略相比,仅消耗一个氨基酸残基,尾环亲水,其引入对多肽结合的影响更具可预测性。本方法末端相对于氢键替代策略有一个额外氨基,可根据需要进行各种修饰。
附图说明:
图1为实施例1中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2在H2O及10%TFE水溶液中CD图。
图2为实施例1中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2热稳定性图。
图3为实施例1中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2纯化后HPLC图。
图4为实施例1中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2质谱图。
图5为实施例2中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]-NH2在H2O中CD图。
图6为实施例2中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]-NH2纯化后HPLC图。
图7为实施例2中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDapAlaAla]-NH2质谱图。
图8为实施例3中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspValValDapAlaAla]-NH2粗产物HPLC图。
图9为实施例3中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspValValDapAlaAla]-NH2在H2O中CD图。
图10为实施例3中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspValValDapAlaAla]-NH2纯化后HPLC图。
图11为实施例3中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspValValDapAlaAla]-NH2质谱图。
图12为实施例4中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGlnValDapAlaAla]-NH2在H2O中CD图。
图13为实施例4中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGlnValDapAlaAla]-NH2纯化后HPLC图。
图14为实施例4中Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGlnValDapAlaAla]-NH2质谱图。
图15为实施例5中长肽HIF-1αB D-TCD Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGluLeuDapArgAlaValAspGln]-NH2在H2O中CD图。
图16为实施例5中长肽HIF-1αB D-TCD Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGluLeuDapArgAlaValAspGln]-NH2纯化后HPLC图。
图17为实施例5中长肽HIF-1αB D-TCD Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGluLeuDapArgAlaValAspGln]-NH2质谱图。
图18为实施例6中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]-NH2在H2O中CD图。
图19为实施例6中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]-NH2纯化后HPLC图。
图20为实施例6中(cyclo-1,4)-[L-tartaric acidAlaAlaDabAlaAla]-NH2质谱图。
图21为实施例7中长肽SRC-1Box2PERM L-TCDa H-(cyclo-2,5)
-[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gln]-NH2在H2O中CD图。
图22为实施例7中长肽SRC-1Box2wtb FITC-βAlaHisLysIleLeuHisArgLeuLeuGln-NH2与长肽SRC-1Box2wtb FITC-βAlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln-NH2细胞成像图,其中(a)为SRC-1Box2PERM L-TCDb FITC通道成像;(b)为SRC-1Box2PERM L-TCDbDAPI通道成像;(c)为SRC-1Box2PERM L-TCDb明场成像;(d)为SRC-1Box2PERM L-TCDbFITC,DAPI,明场成像叠加;(e)为长肽SRC-1Box2wtb FITC通道成像;(f)为SRC-1Box2wtbDAPI通道成像;(g)为SRC-1Box2wtb明场成像;(h)为SRC-1Box2wtb FITC,DAPI,明场成像叠加。
图23为实施例7中长肽SRC-1Box2PERM L-TCDa H-(cyclo-2,5)
-[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gln]-NH2纯化后HPLC图。
图24为实施例7中长肽SRC-1Box2PERM L-TCDa H-(cyclo-2,5)
-[ArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeu Gln]-NH2质谱图。
图25为实施例7中长肽SRC-1Box2PERM L-TCDb FITC-(cyclo-3,6)-[βAlaArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeuGln]-NH2纯化后HPLC图。
图26为实施例7中长肽SRC-1Box2PERM L-TCDb FITC-(cyclo-3,6)-[βAlaArgisoAspIleLeuDapArgLeuLeuGln]-NH2质谱图。
图27为实施例7中长肽SRC-1Box2wtb FITC-βAlaHisLysIleLeuHisArgLeuLeuGln-NH2纯化后HPLC图。
图28为实施例7中长肽SRC-1Box2wtb FITC-βAlaHisLysIleLeuHisArgLeuLeuGln-NH2质谱图。
具体实施方式:
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域内研究者或技术人员可根据本说明书所述内容明确本发明的特点。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
统计数据表明:α-螺旋大约占蛋白质结构的近30%,这种二级结构在蛋白质与其它生物分子的识别过程中起关键作用。虽然短肽特别是α-螺旋在生物医药领域具有很大的应用前景,但是短肽因为其极差的稳定性,较差的进入细胞的能力和较差的靶点亲和力难以被直接开发。
构象稳定是解决α-螺旋成药性问题的一种重要策略,通过化学修饰固定多肽构象不仅可以提高其抵抗水解的能力,还可通过形成分子内氢键提高多肽疏水性以改善穿膜性,克服熵罚以提高与靶点亲和力。
稳定螺旋的方法包括利用各种化学(二硫键、酰胺键、烯烃复分解等)共价或者非共价连接侧链,或者利用末端修饰成核诱导螺旋。上述稳定方法各有不同程度的缺陷。除了一些方法(离子键、二硫键)在稳定性上的缺陷,侧链-侧链连接对多肽与靶点结合的影响难以预测,导致筛选成本增加。基于末端修饰成核诱导螺旋的氢键替代策略需要较为繁琐的氮烷基化模块的构建。
本发明从五肽模型肽出发,构建了末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽,该策略显著提高了单螺旋多肽α-螺旋,提高了多肽的稳定性,同时探索了该方法的序列耐受性。
本发明用高效液相色谱对多肽进行分离纯化,通过圆二色谱等表征方法评价确证了本策略对于五肽α-螺旋含量的提高,同时提高多肽的稳定性。
本发明的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽,其结构通式如式(Ⅰ)所示:
其中,R为任意氨基酸残基,n为1~2的正整数,R1、R2连接的碳原子至少一个为手性碳原子,且R1、R2各自独立地选自氢、烷基、氨基或其衍生物取代基和羟基或其衍生物取代基中的一种。
当n优选为1时,对螺旋性有更显著的提升。
制备上述的稳定多肽的核心反应步骤如下:
高效液相色谱纯化得到的多肽溶于水/乙腈,用圆二色谱确定其构象。多肽在水中呈现稳定的α-螺旋。
本发明可很好的稳定多肽螺旋,并提高多肽稳定性,序列耐受性好。多肽的合成完全在固相上进行,合成过程中无需非天然氨基酸,与氢键替代策略相比没有构建较为繁琐的氮烷基化模块,成本低。与侧链-侧链连接策略相比,仅消耗一个氨基酸残基,尾环亲水,其引入对多肽结合的影响更具可预测性。当手性二酸为天冬氨酸时本方法末端相对于氢键替代策略有一个氨基,可根据需要进行各种修饰。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1:
末端D型天冬氨酸修饰多肽Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2的合成,即结构式(Ⅲ)的合成:
具体路线如下所示:
具体操作步骤为:
(1)多肽固相合成:称取100mg Rink amide MBHA树脂于10ml接肽管中,加入1mlN-甲基吡咯烷酮(NMP),鼓氮气溶胀树脂30min,加入50%(v/v)吗啡啉的NMP溶液(v代表体积),鼓氮气30min,NMP×5,二氯甲烷(DCM)×5交替洗共计10遍树脂。将配好的Fmoc-Ala-OH(5eq,0.4M,NMP)溶液、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(0.38M,NMP)溶液、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)按7.5:7.5:1(v:v:v)混匀后加入树脂中鼓氮气1h;抽掉反应液,按上述方法洗树脂后进行下一步操作。
(2)第二至第五个氨基酸与上述连接方法相同,即将配制好的Fmoc-Ala-OH(5eq,0.4M,NMP)溶液、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)(0.38M,NMP)溶液、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)按7.5:7.5:1(v:v:v)混匀后加入树脂中鼓氮气1h;抽掉反应液,按上述方法洗树脂后进行下一步操作。特别的,第三个氨基酸推荐偶联时间为1.5h。
(3)烯丙基保护的天冬氨酸:50%(v/v)吗啡啉NMP溶液脱保护,按上述方法洗树脂。Fmoc-Asp(OH)-OAllyl,1-羟基苯并三唑(HOBt(1-羟基苯并三唑)),N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)(均为4eq)混合(Fmoc-Asp(OH)-OAllyl终浓度为0.2M,NMP)5min后加入树脂中鼓氮气2-3h,抽掉反应液进行下一步反应。
(4)钯催化脱保护:二甲基巴比妥酸(4eq)与树脂在氮气保护下加入四三苯基膦钯溶液(1eq,1.5ml DCM),避光搅拌2h,抽掉反应液重复反应一次。反应完毕用二乙基二硫代氨基甲酸钠(0.5%,DMF)溶液洗5遍,后用上述常规方法洗10遍。
(5)分子内酰胺键关环:PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)(3.2eq),HOBt(3.2eq),N-甲基吗啡啉(NMM,3.2eq)溶于1mlNMP后加入树脂,鼓氮气4h。必要时可进行两次。
(6)乙酰化:50%(v/v)吗啡啉NMP溶液脱保护,按上述方法洗树脂。Ac2O、DIEA和NMP(v:v:v=1:3:16)的混合液1ml加入树脂,鼓氮气1h。必要时可进行两次。
(7)抽干反应液,用上述常规方法洗10遍,用甲醇(MeOH,1ml)洗涤两遍后抽干,-20℃保存。
(8)将多肽从树脂上切下:取50mg树脂于2ml EP管中,加入0.3ml的TFA、TIPS和H2O(v:v:v=9.5:0.25:0.25)震荡反应1h,树脂过滤除去,用氮气把剪切液吹干,然后加入冷的0.5ml的乙醚和正己烷(v:v=4:1)的混合液;离心去上清,沉淀于空气中挥干残余溶剂。
(9)多肽纯化:将上述沉淀溶于10%乙腈(v/v)的水溶液后用高效液相色谱进行纯化,250*10mm C18反相色谱,A液:0.1%TFA(v/v)的水溶液,B液:0.1%TFA(v/v)的乙腈溶液;溶剂梯度:0至30min 2至30%B液的梯度洗脱。
(10)圆二色谱表征:将产物Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspAlaAlaDapAlaAla]-NH2溶于超纯水以及10%TFE水溶液中测定CD图谱:取0.1-0.5mg样品分别溶于超纯水和10%TFE水溶液中测CD波长范围190nm-250n内的色谱图(图1),然后根据以下公式计算螺旋含量;
alpha螺旋计算公式:
fH=([θ]obs215-[θ]C)/([θ]∞215-[θ]C)
[θ]obs215=θ/(10*C*Np*ι)
[θ]∞215=(-44000+250T)(1-к/Np)
[θ]C=2220-53T=1054
T=25℃,к=4.0,Np=6(对于五肽),ι=0.1(cm),C为样品摩尔浓度M,fH为平均螺旋含量,[θ]obs218为218nm下实际摩尔椭圆率,θ∞218为218nm下极大摩尔椭圆率,θC为无规卷曲摩尔椭圆率,θ为椭圆率。
其结果是,圆二色谱结果含有末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰的多肽在10%TFE下并未显著提高,说明这一侧链稳定方法已经将该五肽α螺旋提高到了最佳值。测定条件为25℃。(图1和表1)
表1多肽Ⅲ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时218nm(长肽负峰位于222nm,短肽负峰会发生位移)、208nm为负峰且θ218/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构。
图2为在不同温度下含有末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰的多肽θ218变化情况,说明在一定温度范围内,含有经过修饰的多肽均保持螺旋的构象。测定条件为H2O。
图3、图4为该多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x 250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-10%,30min-30%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量m/z=527.2620[M+H],549.2397[M+Na]。
实施例2:
末端甲基化L型酒石酸修饰多肽(cyclo-1,4)-[L-tartaricacidAlaAlaDapAlaAla]-NH2的合成,即结构式(Ⅳ)的合成:
实施例1中手性二酸换为甲基化的L型酒石酸。实验步骤与实施例1相同,步骤(5)直接可以得到产物,无需进行步骤(6)。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,产物在H2O(25℃)中螺旋性提高。(图5,表2)
表2多肽IV在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时218nm(长肽负峰位于222nm,短肽负峰会发生位移)、208nm为负峰且θ218/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接酒石酸修饰可以稳定多肽的α螺旋二级结构。
图6、图7为该多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x 250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-10%,30min-30%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量m/z=530.2611[M+H],552.2384[M+Na]。
实施例3:
末端D型天冬氨酸修饰多肽Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspValValDapAlaAla]-NH2的合成,即结构式(Ⅴ)的合成:
实施例1中氨基酸序列换为两个Val。实验步骤与实施例1相同。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,经稳定的多肽在H2O(25℃)中呈现特征的α螺旋(图9,表3)。
表3多肽Ⅴ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时218nm(长肽负峰位于222nm,短肽负峰会发生位移)、208nm为负峰且θ218/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构,并且该方法具有较好的序列耐受性。
图8、图10、图11为该多肽粗产物,纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x 250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-10%,30min-30%)及HRMS(AB SCIEX QSTARElite)结果,可找到对应分子量m/z=583.3230[M+H],605.3018[M+Na]。
实施例4:
末端D型天冬氨酸修饰多肽Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGlnValDapAlaAla]-NH2的合成,即结构式(Ⅵ)的合成:
实施例1中序列换为GlnVal。实验步骤与实施例1相同。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,经稳定的多肽在H2O(25℃)中呈现特征的α螺旋(图12,表4)。
表4多肽Ⅵ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时218nm(长肽负峰位于222nm,短肽负峰会发生位移)、208nm为负峰且θ218/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构,并且该方法具有较好的序列耐受性。
图13、图14为该多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-10%,30min-30%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量m/z=612.3190[M+H],634.2919[M+Na]。
实施例5:
末端D型天冬氨酸修饰长肽HIF-1αB D-TCD Ac-(cyclo-1,4)-[isoD-AspGluLeuDapArgAlaValAspGln]-NH2的合成,即结构式(Ⅶ)的合成:
实施例1中序列换为HIF-1α。实验步骤与实施例1相同。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,经稳定的多肽在H2O(25℃)中呈现特征的α螺旋(图15,表5)。
表5多肽Ⅶ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时222nm、208nm为负峰且θ222/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构,并且该方法具有较好的序列耐受性且可能适用于更长的多肽。
图16、图17为该多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-15%,30min-40%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量m/z=1068.5439[M+H]。
实施例6:
末端甲基化L型酒石酸修饰多肽(cyclo-1,4)-[L-tartaricacidAlaAlaDabAlaAla]-NH2的合成,即结构式(Ⅷ)的合成:
实施例1中手性二酸换为甲基化的L型酒石酸。实验步骤与实施例1相同,步骤(5)直接可以得到产物,无需进行步骤(6)。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,产物在H2O(25℃)中螺旋性提高,呈310螺旋(图18,表6)。
表6多肽Ⅷ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽310螺旋是较α螺旋松散的一种螺旋结构,可用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时218nm(长肽负峰位于222nm,短肽负峰会发生位移)、208nm为负峰且θ218/θ208比例越接近0.5其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接酒石酸结合Dab修饰可以显著稳定多肽的二级结构,Dab由于比Dap多一个碳原子,使得稳定成为较α螺旋松散的310螺旋结构。
图19、图20为该多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-10%,30min-30%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量m/z=544.2735[M+H]。
实施例7:
末端D型天冬氨酸修饰长肽SRC-1Box2PERM L-TCDa H-(cyclo-2,5)-[ArgisoAspIleLeuDapArg LeuLeuGln]-NH2的合成,即结构式(Ⅸ)的合成:
实施例1中序列换为经改进的SRC-1Box2。实验步骤与实施例1相同,步骤(5)后无需进行步骤(6),而是修饰上一个精氨酸,此例证明了末端修饰的可变性。经过高效液相色谱纯化可得到终产物,经稳定的多肽在H2O(25℃)中呈现特征的α螺旋(图21,表7)。
表7多肽Ⅸ在25℃,H2O中圆二色谱数据
多肽α螺旋二级结构用圆二色谱表征,其特征为190nm处为正峰,同时222nm、208nm为负峰且θ222/θ208比例越接近1其螺旋含量越高,而上述结果说明末端侧链-尾链连接天冬氨酸修饰可以显著稳定多肽的α螺旋二级结构,并且该方法具有较好的序列耐受性且可能适用于更长的多肽。在多肽上修饰FITC(SRC-1Box2PERM L-TCDb FITC-(cyclo-3,6)-[βAlaArgisoAspIle LeuDapArgLeuLeuGln]-NH2),与Hela细胞孵育(5μM,37℃,4hr,LeicaCTR7000)发现该多肽具有良好的穿透细胞膜的能力,而相对应的野生型的线性多肽(SRC-1Box2wtb FITC-βAlaHisLysIleLeuHisArg LeuLeuGln-NH2)不具备穿膜能力。上述结果说明该方法可以赋予多肽穿透细胞膜的能力。
图23、图24、图25、图26、图27、图28为所涉及多肽纯化后HPLC(Waters 600,Agilent Zorbax SB-Aq:4.6x 250mm,乙腈/水:0min-2%,5min-15%,30min-50%)及HRMS(AB SCIEX QSTAR Elite)结果,可找到对应分子量SRC-1Box2PERM L-TCDa:m/z=547.3513[M+2H],SRC-1Box2PERM L-TCDb:777.3887[M+2H],SRC-1Box2wtb:808.9271[M+2H]。图22为所涉及FITC修饰的所涉及多肽的细胞成像图。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其结构式如式(Ⅰ)所示:
其中,R为任意氨基酸残基,n为1~2的正整数,R1、R2所在的手性二酸选自手性中心位于N端β位的乙酰化天冬氨酸、甲基化L型酒石酸或精氨酸修饰的D型天冬氨酸中的一种,且R1、R2各自独立地选自氢、甲基、乙酰基氨基、羟甲基或精氨酸取代基中的一种。
2.根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其特征在于,所述多肽的长度大于或等于5个氨基酸。
3.根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其特征在于,所述R为L型氨基酸或者D型氨基酸。
4.根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其特征在于,所述R为α氨基酸或β氨基酸。
5.根据权利要求1所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物,其特征在于,所述n为1。
6.根据权利要求1~5任一权利要求所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
固相合成末端含手性二酸,倒数第三位氨基酸侧链碳的个数为1-2的多肽,同时脱去羧基和氨基保护基,关环得到含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物。
7.根据权利要求6所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)含有手性二酸的多肽的固相合成,固相合成得到的多肽化合物,其结构式如式(Ⅱ)所示:
(2)用钯催化剂同时脱去二酸保护基和氨基保护基;
(3)在六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羟基苯并三唑条件下分子内酰胺基关环,获得多肽;
(4)将步骤(3)所得的多肽从固相切下,经分离纯化获得含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物(Ⅰ),通过圆二色谱表征方法验证含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的螺旋性;
其中,所述步骤(2)至步骤(3)的合成路线为:
8.根据权利要求7所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法,其特征在于,当R2为芴甲氧羰酰保护的氨基时,需要脱除芴甲氧羰酰,然后保留氨基,酰化或烷基化或连接生物素或连接荧光基团,其合成路线为:
9.根据权利要求8所述的含有末端侧链-尾链连接手性二酸修饰的多肽化合物的合成方法在稳定多肽α-螺旋二级结构中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410528075.7A CN105566456B (zh) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | 末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410528075.7A CN105566456B (zh) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | 末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105566456A CN105566456A (zh) | 2016-05-11 |
CN105566456B true CN105566456B (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=55877141
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410528075.7A Active CN105566456B (zh) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | 末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105566456B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106432403A (zh) * | 2016-09-21 | 2017-02-22 | 北京大学深圳研究生院 | 一种螺旋度可调节的多肽化合物的合成方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005044839A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized alpha helical peptides and uses thereof |
-
2014
- 2014-10-09 CN CN201410528075.7A patent/CN105566456B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005044839A2 (en) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stabilized alpha helical peptides and uses thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Contemporary Strategies for the Stabilization of Peptides in the α-Helical Conformation;Laura K. Henchey等;《Curr Opin Chem Biol.》;20081231;第12卷(第6期);第692-697页 |
环肽的合成研究进展;王德心等;《有机化学》;20080415;第28卷(第4期);第549-573页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105566456A (zh) | 2016-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2873677B1 (en) | Method of producing self-assembling peptide derivative | |
EP2651964B1 (en) | Cross-linked peptides and proteins, methods of making same, and uses thereof | |
ES2606753T3 (es) | Procedimiento para la fabricación de Degarelix y sus intermedios | |
CN109195618A (zh) | 用于合成α4β7肽拮抗剂的方法 | |
KR20120030385A (ko) | 데가렐릭스의 제조 방법 | |
HUE031113T2 (en) | Procedure for the preparation of Degarelix and its intermediates | |
JP2776786B2 (ja) | テトラヒドロナフタレン誘導体 | |
CA2466430A1 (en) | Process for the preparation of cyclic peptides | |
KR20070015537A (ko) | 엡티피바타이드 및 관련 중간체 화합물의 제조 방법 | |
Horikawa et al. | Syntheses of potent Leu-enkephalin analogs possessing β-hydroxy-α, α-disubstituted-α-amino acid and their characterization to opioid receptors | |
EP1468013A2 (en) | Conformationally constrained c-backbone cyclic peptides | |
JPWO2009014177A1 (ja) | ジベンゾフルベン誘導体の淘汰方法 | |
CN112245593A (zh) | 具有疏水性侧链的稳定化细胞穿膜肽及制备方法与应用 | |
Rump et al. | Cyclotriveratrylene (CTV) as a new chiral triacid scaffold capable of inducing triple helix formation of collagen peptides containing either a native sequence or Pro‐Hyp‐Gly repeats | |
BRPI0209684B1 (pt) | derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, método para a produção do derivado de magainina e uso do derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis | |
CN105566456B (zh) | 末端侧链-尾链连接手性二酸修饰多肽化合物及合成方法 | |
US7964702B2 (en) | Phalloidin derivatives and methods for their synthesis | |
CN104619717B (zh) | β-转角模拟肽环状化合物的合成 | |
EP0640618B1 (de) | Tetrahydronaphthalin-Peptidderivate | |
JPH0317098A (ja) | 合成ペプチド及びその塩並びにそれらの製造法 | |
Bańkowski et al. | Synthesis, biological activity and resistance to proteolytic digestion of new cyclic dermorphin/deltorphin analogues | |
US20120231996A1 (en) | Phalloidin derivatives and methods for their synthesis | |
CN109908363A (zh) | 一种靶向无痕释放药物缀合物及其制备方法与应用 | |
Ferron et al. | Design and scalable synthesis of new chiral selectors. Part 1: Synthesis and characterization of a new constrained cyclopeptide from unnatural bulky amino acids | |
Yang et al. | Facile solid phase synthesis of N-cycloguanidinyl-formyl peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |