BRPI0209684B1 - derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, método para a produção do derivado de magainina e uso do derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis - Google Patents
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Abstract
"derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, método para a produção do derivado de magainina e uso do derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis". a presente invenção refere-se a uma variedade de derivados de magainina e aos sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir dos mesmos, com os derivados tendo seqüências conforme mostradas abaixo: gly-ile-gly-lys-phe-leu-his-ser-ala-lys-lysphe-gly-lys-ala-phe-val-gly-glu-ile-x-asn-y-oh na qual: x é an resíduo de amino ácido selecionado a partir do grupo consistindo de met, ile e leu, y é a combinação de dois resíduos de amino ácidos selecionados a partir do grupo consistindo de ser, lys, ile, arg e leu. os derivados de acordo com a presente invenção têm a mesma ou uma maior atividade anti-microbial quando comparados com aquela da magainina ocorrendo naturalmente. os mesmos são facilmente produzidos por síntese de fase sólida e, mais facilmente, através de técnicas de bioengenharia.
Description
"DERIVADO DE MAGAININA E SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS PRODUZIDOS A PARTIR DO MESMO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DO DERIVADO DE MAGAININA E USO DO DERIVADO DE MAGAININA E SAIS FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS" Campo da Invenção A presente invenção refere-se a derivados de magainina. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a derivados de magainina dotados de propriedade de atividades antimicrobiana. Há diversas formas de vida, por exemplo, insetos, microorganismos, anfíbios, e seres humanos, que podem produzir materiais peptideo antibacteriano que protegem as suas comunidades. Os referidos peptídeos antibacterianos podem penetrar os lipídios nas membranas celulares e torná-los inativos, podem também afetar as espécies protozoon, células germe e mesmo virus, conseqüentemente, os referidos peptídeos são referidos como super-antibióticos. Os peptídeos antibacterianos, todos portam quantidades de carga positiva, e o mecanismo antibacteriano dos mesmos baseia-se na combinação de cargas positivas portadas pelos peptídeos com as cargas negativas portadas pelos fosfolipídios, que existem na parede celular bacteriana, o que cria um trajeto iônico na membrana celular, aumentando a penet rabilidade; o que faz com que a bactéria se dissolva e morra. Conseqüentemente, a atividade antimicrobiana dos referidos peptídeos não depende da ligação com quaisquer receptores específicos.
Os peptídeos antibacterianos exibem um amplo espectro de atividade antimicrobiana sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas, assim como em bactérias aeróbicas e anaeróbicas. Os mesmos são diferentes dos antibióticos no sentido de que os peptídeos antibacterianos não produzem efeitos de resistência a drogas, mesmo as bactérias que apresentam resistência a diversos tipos de antibióticos, podem ser suprimidas pelos peptídeos antibacterianos. Ademais, os peptídeos antibacterianos apresentam também efeito inibitório com relação às espécies protozoon e a vírus. Na medida em que os produtos metabólicos dos peptídeos antibacterianos são os amino ácidos, os referidos peptídeos são de baixa toxicidade para as células hospedeiras. Em suma, os peptídeos antibacterianos são uma classe de compostos com grande prospecção para serem usadas para drogas antimicrobianas. A magainina é uma categoria de peptídeos antibacterianos de ocorrência natural, derivado da pele do sapo com efeitos antibacterianos. A magainina foi extensamente estudada até agora, as mesmas possuem a característica de serem fáceis de serem sintetizadas, de baixo custo e pouca possibilidade de hemólise. A patente norte-americana No. 5.589.364 descreve um método pelo qual a magainina II (23 amino ácidos) pode ser preparada ao se usar técnicas de bioengenharia. A magainina é um tipo de peptídeo antibacteriano e de ocorrência natural na pele do sapo, dotado de uma sequência de amino ácido como mostrada abaixo: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe- Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-OH na qual: Gly representa glicina, Ile representa isoleucina, Lys representa lisina, Phe representa fenilamina, Leu representa leucina, His representa histidina, Ser representa serina, Ala representa alanina, Vai representa valina, Glu representa ácido glutâmico, Met representa metionina e Asn representa asparaginato. A patente norte-americana No. 6.183.992 descreve um método de produção de MSI-78 (22 amino ácidos), como um derivado de magainina, dotado de uma seqüência de amino ácidos como abaixo: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly- Lys-Ala-Phe-Val-Lys-Ile-Leu-Lys-Lys-NH2 Foi reportado em "ADIS NEW DRUG PROFILE", por Harriet M. Lamb, etc., que o derivado de magainina MSI-78 mostra efeito curativo óbvio no tratamento de infecção traumática e ulceração de crura provocada por diabetes melitus.
Objetivos da Invenção Os objetivos da presente invenção são proporcionar alguns derivados de magainina, que se aproximam da categoria dos derivados de magainina. Os referidos derivados podem ser preparados por método químico sintético, e mais facilmente por técnicas recombinantes, o que torna possivel se reduzir os custos de produção. Os efeitos antimicrobianos dos referidos derivados são os mesmos ou maiores do que os de magainina de ocorrência natural.
Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a alguns derivados de magainina dotados de uma seqüência de amino ácido como mostrada abaixo e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos: Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe- Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile—X-Asn-Y-OH na qual: X é um resíduo de amino ácido selecionado do grupo que consiste em Met, Ile e Leu, Y é uma combinação de dois resíduos de amino ácido, selecionados a partir do grupo que consiste em Ser, Lys, Ile, Arg e Leu.
Os derivados de magainina da presente invenção apresentam as sequências de amino ácidos mostradas em <210> da Listagem de Seqüência.
Os derivados de magainina da presente invenção são compostos anfotéricos, e podem ser suficientemente acidicos ou suficientemente básicos, de modo a reagir com qualquer uma de uma série de bases inorgânicas, e de ácidos orgânicos e inorgânicos, para formar um sal. Os ácidos comumente empregados para formar os sais de adição ácida são ácidos tais como ácido hidrocloridrico, ácido hidrobrômico, ácido hidroiódico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido p-toluenosulfônico, ácido metanosulfônico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfônico, ácido carbônico, ácido succinico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético, e semelhante. Exemplos dos referidos sais incluem sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butina-1,4-dioato, hexina-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato e semelhante. Os sais de adição acidica preferidos, são aqueles formados com ácidos minerais tais como ácido hidrocloridrico e ácido hidrobrômico e, em especial, ácido hidrocloridrico.
Alcalinos podem também ser empregados de modo a reagir com os derivados de magainina para formar sais. Os exemplos representativos dos referidos alcalinos incluem amônia, metais alcalinos, hidróxidos de metais alcalinos, carbonatos e bicarbonatos. Tipicamente, o referido alcalino pode ser hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, e amônia.
Os amino ácidos de derivados de magainina da presente invenção podem ser isômeros do tipo L ou do tipo D.
Um aspecto da presente invenção proporciona um método de produzir os derivados de magainina. O referido método trata da produção dos derivados de magainina por técnicas recombinantes que compreendem: sintetizar fragmentos de genes pela seqüência de amino ácido do derivado de magainina, que ligam os fragmentos de gene, que constroem o plasmideo recombinante, que clonam e obtêm o produto após as etapas de fermentação, separação, purificação e liofilizaçâo.
Outro aspecto da presente invenção proporciona um método de produzir os derivados de magainina. O referido método trata da produção dos derivados de magainina por sintese de fase sólida, que compreende o uso de resina HMP como o veiculo de fase sólida, que protege a alfa-amina de um residuo com 9-fluorofenil metoxicarbonil (Fmomc), e sintetiza o peptideo em um sintetizador de peptideo, e obtém produtos após as etapas de separação, purificação e liofilizaçâo.
Ainda em um outro aspecto, a presente invenção proporciona os usos dos referidos derivados de magainina e dos sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, na preparação de drogas/produtos farmacêuticos, dotados de efeitos antimicrobianos. A presente invenção proporciona uma variedade de derivados de magainina, que se aproximam dos derivados de magainina. Os referidos derivados de magainina podem ser preparados por sintese química, e com maior facilidade, por técnicas recombinantes, o que torna possível se reduzir o custo de produção. Os referidos derivados apresentam os mesmos ou maiores efeitos antimicrobianos, em comparação aos da magainina de ocorrência natural.
Foram mostrados pela experiência do efeito antimicrobiano; o estudo de tempo de extermínio, a hemólise e os testes de toxicidade aguda, que o efeito antimicrobiano em Escherichia coli dos derivados de magainina da presente invenção, é equivalente àquele da magainina de ocorrência natural, e que os referidos derivados de magainina também apresentam efeitos inibitórios em Staphylococcus aureus. A experiência antimicrobiana foi conduzida ao se testar os efeitos dos derivados de magainina da presente invenção a 50 μΐ de solução bacteriana (IO1" bactérias/ml) , mais de 90% das bactérias foram exterminadas dentro de três horas com uma dosagem de 0,5 μg, enquanto com a dosagem de 1 μg, quase todas as bactérias foram exterminadas dentro de três horas. Os estudos de hemólise dos derivados da presente invenção mostraram que a proporção das concentrações eficazes para hemólise de 50% de bactérias (HC50) para a inibição de 50% de bactérias (IC50) foi de cerca de 50:1, enquanto a proporção de magainina de ocorrência natural foi de cerca de 24:1, o que demonstrou que a segurança dos produtos da presente invenção é superior àquela da magainina de ocorrência natural. Ademais, os estudos de toxicidade aguda mostraram que os derivados de magainina da presente invenção apresentam baixa toxicidade.
Descrição das Figuras A presente invenção será adicionalmente ilustrada com referência às seguintes figuras e exemplos. A figura 1 é o diagrama que mostra o estudo de tempo de extermínio dos derivados de magainina obtidos a partir do exemplo 1 em Escherichia coli.
Descrição da Invenção Os seguintes exemplos são ilustrativos e não devem ser vistos como limitantes do âmbito da presente invenção de forma alguma.
Exemplo 1 Preparação do derivado de magainina da presente invenção por técnicas de bioengenharia onde X é Leu e Y é Ser-Arg . (1) Sintetizar os seguintes fragmentos genéticos pela sequência de amino ácido dos derivados de magainina acima: (a) 5' - AAT TCC ATG GGT ATC GGT AAA TTT CTG CAC
AGC GCG AAA AAA
(b) 5'- TTT GGT AAA GCG TTT GTG GGT GAA ATC CTG AAC AGC CGT TAG A
(c) 5' - AG CTT CTA ACG GCT GTT CAG GAT TTC ACC
CAC AAA CGC TTT
(d) 5'- ACC AAA TTT TTT CGC GCT GTG CAG AAA TTT ACC GAT ACC CAT GG (2) Ligação dos fragmentos de DNA: Os fragmentos (a), (b)r (c) e (d), com as densidades óticas dos mesmos em 260 nm (A260nm) igualando a 0,1 foram obtidas, e os fragmentos (a) e (d), assim como os fragmentos (b) e (c), foram dispostos em dois tubos separadamente. O tampão de polinucleotídeo quinase, polinucleotídeo quinase e ATPs foram adicionados aos dois tubos respectivamente. A mistura de reação foi incubada e 37°C por 60 minutos, e então incubada em um banho de água a 95°C por 10 minutos, e então foi naturalmente resfriada à temperatura ambiente. O tampão ligase T4 e a solução de ATP, foram adicionados, seguido da adição da ligase T4, a mistura foi incubada durante a noite a 15°C para conclusão da ligação do fragmento. (3) Clonagem Os plasmideos que contêm o promotor PL (ou Lac ou Tac) foram digeridos com restrição de endonucleases EcoRI e HindIII, extraídos com hidroxibenzeno: solvente clorofórmio, lavados três vezes com clorofórmio, precipitados com solvente isopropanol, e coletados por centrifugação.
Os plasmideos digeridos foram ligados com fragmentos de derivado de magainina, e os plasmideos que continham os fragmentos de gene de derivado de magainina foram obtidos. Os referidos plasmideos foram transformados em células hospedeiras E. coli JM 103 ou JM 109. As colônias de bactérias foram peneiradas após o cultivo na placa Agar. (4) Exame O plasmídeo que contém fragmento de gene do derivado de magainina foi extraído a partir de bactéria mono clonada, e foi duplamente digerido com EcoRI e HindIII. A eletroforese foi conduzida em gel Agar a 1%, seguido por secagem com brometo de etidum. O fragmento de gene clonado foi examinado por comparação com o marcador, e adicionalmente testado por análise de seqüência de DNA. (5) Fermentação A cepa bacteriana foi incubada em um frasco de agitação com a capacidade de 1 litro (10 frascos no total), cada um contendo 300 ml de meio liquido LB, que consistia de 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio. 0,2 mM de beta-D-tiogalactopiranosida de isopropila (IPTG), foi adicionada a 37°C para a indução da proteina a ser expressa. As células bacterianas foram incubadas durante a noite e coletadas por centrifugação. Quando se usa o plasmídeo com o promotor controlado a temperatura Pr,f as células bacterianas foram cultivadas a 30 °C por oito horas. Então a temperatura do meio foi aumentada a 42 "C, e as células bacterianas foram mantidas por quatro horas para tornar o gene expresso. (6) As paredes das células bacterianas foram rompidas sob o efeito de lisozima a 37°C por uma hora. O precipitado foi tratado com 6M de hidrocloreto de guanidina. Após a centrifugação, diálise e etapas de centrifugação adicionais, os corpos de inclusão protéicos foram obtidos. Os corpos de inclusão foram lavados três vezes, com a solução de lavagem contendo 1% de cloreto de sódio, 0,1 % de Triton X-100 e tampão Tris-HCl (20 mM, pH8). A proteina de fusão foi identificada através de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) que contém 12¾ de dodecanosulfonato de sódio (SDS). (7) Os corpos de inclusão foram dissolvidos em 8M de solução de carbamida. Sob a existência de 50 mM de ácido hidrocloridrico, brometo de cianogênio, foi adicionado para a lise, os corpos de inclusão. A solução foi agitada com a proteção de nitrogênio e impedimento de luz. Após a conclusão da reação de lise, o produto bruto de derivado de magainina foi obtido através de Sephadex G-25 com rápida cromatografia de proteina liquida (FPLC? AKTA™, fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech), e o produto final do derivado de magainina, foi adquirido^ através de purificação com cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC, coluna Cl8) e gradiente de elução com CH3CN/tampão TFA. O resultado da análise de HPLC do produto obtido é consistente com os referidos produtos preparados por sintese química.
Exemplo 2 Preparação de derivado de magainina da presente invenção por técnicas de bioengenharia, onde X é Leu e Y é Ser-Lys . A - Síntese dos seguintes fragmentos genéticos por seqüência de mino ácido do derivado de magainina acima: (a) 5' AAT TCC ATG GGT ATC GGT AAA TTT CTG CAC AGC
GCG AAA AAA
(b) 5' TTT GGT AAA GCG TTT GTG GGT GAA ATC CTG AAC
AGC AAG TAG A
(c) 5' AG CTT CTA CTT GCT GTT CAG GAT TTC ACC CAC
AAA CGC TTT
(d) 5' ACC AAA TTT TTT CGC GCT GTG CAG AAA TTT ACC GAT ACC CAT GG
As etapas (2) a (7) deste exemplo, são as mesmas que a etapa 1, e o resultado de análise de HPLC do derivado de magainina obtido é consistente com aqueles resultados preparados por síntese química.
Exemplo 3 Preparação de derivado de magainina da presente invenção por síntese de fase sólida onde X é Leu e Y é Lys-Arg. (1) monômeros de amino ácidos nos quais: Fmoc significa 9-fluorenil metóxicarbonila BOC significa terc-butilóxicarbonila Trt significa tritila i OtBu significa éster de butila terciária, e TBu significa terc-butila (2) Aparelho e Reagentes: Aparelho: sintetizador de peptideo modelo 433A (Applied Biosystem, US) ) Reagentes: N-metil cetopirrolidina, cloreto de metileno, hexahidropiridina, metanol, dimetilaminopiridina/ DMF
N, N-diisopropiletilamina/NMP, 100 mmole HBTU / 0,5 Μ HOBT em DMF, N, N-Diciclohexilcarbodiimida/NMP nos quais: j DMF significa N, N-Dimetilformamida NMP significa N-metilpirrolidona HOBT significa 1-Hidróxibenzotriazola, e HBTU significa hexafluorofosfato de 2-(11 benzotriazola-il-1,1,3, 3-tetrametil-urônio) 3 (3) Procedimentos: a) Sintese Considerando, por exemplo, a escala de sintese dç O, 25 mmol, o processo de sintese foi descrito como se segue. 0,2!: g de resina HMP foi pesada e disposta em um frasco reator dc sintetizador. 1 mmol de diversos resíduos, cada um dos quais acoplado com os grupos de proteção, foram pesados e estruturados em um sintetizador por seqüência de amino ácido do derivado de peptídeo insulinotrópico, a partir do terminal carbóxi para o terminal amino. A temperatura ambiente de 25°C, as reações de remover a proteção de Fmoc, que ativam o resíduo e fixam o resíduo ativado à resina HMP, foram automaticamente circulados até que todo o peptídeo foi sintetizado. Após a conclusão da síntese, a resina fixada a resíduo, com cada resíduo acoplado com os grupos de proteção de cadeia lateral, foi seca a ar em um sintetizador de peptídeo e então pesada. b) Remoção dos grupos de proteção e destacamento de resina: A resina de resíduo fixado, com cada resíduo de derivado de peptídeo insulinotrópico acoplado com grupos de proteção, foi disposto em um frasco de Erlenmeyer tampado, e seguido da adição de reagentes de divagem como mostrado abaixo. A reação de agitação eletromagnética foi realizada a uma temperatura constante de 30 °C por 6 horas. Após a etapa de ) filtragem, o filtrado aquoso foi coletado. A resina foi lavada com uma pequena quantidade de ácido trifluoroacético. Então, o filtrado aquoso coletado e a solução de lavagem foram misturados juntos, e éter foi adicionado para precipitação. A mistura foi filtrada, e o precipitado resultante foi lavado com pequena quantidade de éter. Após a evaporação em um desumidificador, o produto bruto foi obtido. c) Purificação por HPLC e liofilização A separação e a purificação do produto bruto foi alcançada ao se usar HPLC preparatória. O produto final foi obtido após as etapas de congelamento e de liofilização. Através de análise de cromatografia e de espectrograraa de massa juntos, observou-se que o peso molecular do derivado esteve consistente com o valor teórico.
Exemplo 4 Estudos farmacodinâmicos A experiência anti-microbiana do derivado de magainina obtido a partir do Exemplo 1, foi conduzida de acordo com os seguintes procedimentos, em comparação com aquele de magainina de ocorrência natural.
As cepas testadas de of Escherichia coli JM 103 e tsaphylococcus aureus foram cultivadas separadamente, e diluídas a 1 x 106 bactérias/ ml. 20 mM de tampão Tris—HC1 esterilizado (pH 6,5) foi adicionado. Então o derivado de magainina e a magainina II de ocorrência natural, com diversas concentrações, foram adicionados respectivamente, e incubadas a 37°C por diferentes limites de tempo. 50 ml de culturas foi obtido e espalhados em uma placa de Agar, e incubado a 37 °C durante a noite. As colônias de bactérias permanentes foram consideradas, e o percentual de bactérias mortas foi calculado. (1) Tabela que mostra os efeitos antimicrobianos: Comparação dos efeitos antimicrobianos entre o derivado de magainina obtido a partir do Exemplo 1 e a magainina II de ocorrência natural Tabela que mostra os efeitos antimicrobianos do derivado de magainina obtidos a partir do Exemplo 1 no Staphylococos aureus (2) Figura que mostra o resultado do estudo de i tempo-extermínio: O resultado do estudo de tempo-extermínio para o derivado de magainina obtido a partir do Exemplo 1, foi referido na figura 1. (3) Tabela que mostra os resultados do teste de hemólise: 5 (4) Teste de toxicidade Aguda: O teste de toxicidadi aguda foi conduzido em dois camundongos da espécie Kunming. O: camundongos foram injetados por via abdominal com o derivado d< magainina obtido do Exemplo, e a capacidade de vida dos doi; camundongos foi observada após receber injeção por uma hora. .0 Reivindicações
Claims (4)
1. Derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, caracterizado pelo fato que referido derivado tem a sequência de amino ácidos Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-XAsn-Ser-Arg, na qual X é um resíduo de amino ácido a partir do grupo consistindo de Ile e Leu.
2. Derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que referido derivado tem a sequência de amino ácidos Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Leu-Asn-Ser-Arg.
3. Método para produzir o derivado de magainina conforme descrito na reivindicação 1 ou 2 por técnicas de bioengenharia, caracterizado pelo fato que compreende: a síntese de fragmentos de genes para a sequência de amino ácido do derivado de magainina, a ligação dos fragmentos de gene, a construção e a clonagem de um plasmídeo recombinante e a obtenção do produto depois das etapas de fermentação, separação, purificação e liofilização.
4. Uso do derivado de magainina e sais farmaceuticamente aceitáveis conforme descrito na reivindicação 1 ou 2 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de drogas tendo efeitos antimicrobial.
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