BRPI0209685B1 - derivado de peptídeo insulinotrópico e método para a produção de um derivado de peptídeo insulinotrópico - Google Patents

Abstract

"derivado de um peptídeo insulinotrópico e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, método de produção de derivado de peptídeo insulinotrópico e uso de um derivado de peptídeo insulinotrópico e de sais farmaceuticamente aceitáveis". a presente invenção refere-se a derivados de um peptídeo insulinotrópico exendina-4 e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos dos mesmos, que são úteis para o tratamento da diabete do tipo ii. a exendina-4 apresenta uma estrutura química como mostrada abaixo: his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-x-glu-glu-glu-ala-val-yleu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-z na qual: x representa arg, leu ou ile, y representa his, arg ou lys e z representa arg-oh, -oh, -nh~ 2~ ou lys-oh. os derivados da presente invenção podem ser preparados por meios sintéticos químicos e, mais facilmente, por técnicas recombinantes, o que torna possível a produção comercial.

Description

"DERIVADO DE PEPTÍDEO INSULINOTRÓPICO E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM DERIVADO DE PEPTÍDEO INSULINOTRÓPICO" Campo da Invenção [1] A presente invenção refere-se a compostos de peptideo ativos para o tratamento de diabetes do tipo II. Em particular, a presente invenção refere-se a derivados de um peptideo insulinotrópico Exendina-4.

Antecedentes da Invenção [2] Foi observado que, com a mesma quantidade, a administração oral de glucose pode estimular mais secreção de insulina do que a injeção. Após diversas pesquisas que exploram a razão disto, foi verificado que as incretinas desempenho papéis importantes no referido fenômeno. [3] As incretinas são um grupo de compostos de peptideos, entre os quais o peptideo de inibição gástrica (GIF), que apresenta forte atividade inibitória e, peptideo similar a glucagon (GLP-1) foi descrito em 1985. Existem dois tipos de GLP-1, uma é amida GLP-1 (7-36) que é composta de 30 resíduos de amino ácidos; a outra é GLP-1 (7-37), que é composta de 31 resíduos de amino ácidos. Os dois apresentam atividades similares na estimulação da secreção da insulina. Quando atuam nas células das ilhas pancreáticas in vitro, GLP-1 com uma concentração tão inferior quanto 1x10-10 - ΙχΙΟ-llmol/L, são capazes de estimular a secreção de insulina. Foi observado que, pela análise de DNA e das seqüências de amino ácidos., os referidos peptideos insulinotrópicos são originados da proteólise do precursor de: glucagons "proglucagon" sob o efeito de uma enzima proteolítica intestinal e, portanto, são chamados de peptideos similares a glucagon. [4] Uma característica da GLP-1 é que a mesma pode estimular as células beta pancreáticas para sintetizar o mRNA de pró-insulina e pró-insulina, e para liberar insulina. Os efeitos da GLP-1 nas células beta pancreáticas dependem da concentração da glucose. Quando a concentração da glucose sanguínea é superior a 6 mrnol/L, a GLP-1 estimula a secreção de insulina de forma significativa; uma vez que a concentração é restabelecida ao nível normal, a atividade estimulatória da GLP-1 não pode mais ser observada. A referida característica é de grande uso no tratamento da diabete do tipo II. Em arios recentes, testes clínicos entre pacientes com diabetes do tipo II, também verificaram os efeitos da GLP-1 na estimulação da secreção de insulina e em decrescente concentração de glucose. 15 J A estrutura química da amida GLP-1 (7-36) é mostrada como se segue;

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-AIa-Ala-Lys~Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Vai~Lys-Gly-Arg-NHs 16] na qual: (7 J His representa histidina, Ala representa aianina, Glu representa ácido giutâmico, Gly representa glicina, Thr representa treonina, Phe representa fenilalanina, Ser representa serina, Asp representa ácido aspártico, Vai representa valina, Tyr representa tírosina, Leu representa leucina, Gin representa glutamina, Lys representa lisina, Ile representa isoleucina e ftrg representa argínina. í 8 ] O pedido de patente internacional publicado sob o No, WO 91/11457 descreve análogos de peptídeos GLP-1 7-34, 7-35, 7-36 e 7-37, que são úteis para o tratamento da diabete do tipo II. [91 Um composto de peptídeo Exendina-4, que foi separado a partir do veneno de lagarto do México (Heloderma horridum), foi descrito por Jean-Pierre Ranfman em "Regulatory Peptides" em 1996. A Exendina-4 é composta de 39 resíduos de amino ácidos com o terminal carbóxi aminado. A estrutura química da Exendina-4 é mostrada abaixo: 10 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser- 20 Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg- 30 Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro- 39 Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 [10] na qual: [11] Met representa metionina, Asm representa, asparaginas, e Pro representa pralina. [12] A Exendina-4 compartilha 53% de homologia com GLP-1 nas suas seqüências de amino ácidos. Ademais, a Exendina-4 apresenta a capacidade de combinar com um receptor de GLP-1 e de estimular a secreção de insulina. Portanto, é vista como um peptídeo insulinotrópico. [13] A patente norte-americana No. 05424286 descreve os resultados de algumas experiências comparativas conduzidas entre a Exendina-4 e GLP-1 com relação aos efeitos estimulatórios das mesmas na secreção da insulina. Foi mostrado que, em comparação com a GLP-1, a Exendina-4 apresentou uma capacidade mais forte de estimular a secreção de insulina, e precisou de uma concentração mais baixa para apresentar a referida atividade estimulatória. Ademais, a Exendina-4 é dotada de uma meia vida mais longa in vivo do que aquela da GLP-1. Em vista das referidas características, a Exendina-4 pode se tornar um agente terapêutico desejável para o tratamento da diabete do tipo II. [14] Embora a Exendina-4 possa ser preparada por métodos de síntese química, tal como por síntese de fase sólida em um sintetizador de peptídeo, o custo mais alto do referido método e o conseqüente preço de venda, afasta a Exendina-4 da comercialização. Assim, para o objetivo de comercialização, técnicas de bio-engenharia foram tentadas, no sentido de tentar reduzir o custo de produção.

Objetivos da Invenção [15] A presente invenção está orientada para proporcionar alguns derivados de um peptídeo insulinotrópico Exendina-4. Os referidos derivados ajudam a estimular a secreção de insulina e de reduzir a concentração da glucose sanguínea. Portanto, os mesmos podem ser usados para o tratamento da diabete do tipo II. Os referidos derivados podem ser preparados por meios químicos sintéticos, e mais facilmente, por técnicas recombinantes, que tornam possíveis reduzir os custos de produção. Sumário da Invenção [16] A presente invenção proporciona derivados de um peptídeo insulinotrópico e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos do mesmo. O referido peptídeo insulinotrópico é dotado da seqüência de amino ácido mostrada abaixo: 10 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu- 14 20 Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y- 30 Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly- 39 40 Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z [17] na qual: [18] X representa Arg, Leu, Ile ou Met; Y representa HIs, Arg ou Lys; 2 representa Arg-OH, -OH, -NH2 ou Lys-OH; e [19J quando X é Met e Y é Arg, Z não pode ser NH2. [20j Os derivados de peptídeo insulinotrópico da presente invenção, apresentam uma sequência de araino ácido como mostrado na Listagem de Seqüência, em particular, como descrito era <210>I - <21G>4. [21] Os derivados de peptídeo ínsulinotrópíco da presente invenção são compostos anfotéricos, e podem ser suficientemente acidicos ou suf icientemente básicos, de modo a reagir com qualquer número de bases inorgânicas, e ácidos orgânicos ou inorgânicos, para formar um sal. Os ácidos comumente empregados para formar sais de adição acídiea, são ácidos inorgânicos, tais como ácido hidrocloridríco, ácido hidrobrômico, ácido hidroiôdico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, e semelhante, e ácidos orgânicos tais como ácido p-toluenosulfônico, ácido roetanosulfônico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfônico, ácido carbônico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético, e semelhante. Exemplos dos referidos sais incluem sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, raetafosfato, pirofosfato, cloreto, brometo, iodeto, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxaiato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butino-1,4-díoato, hexina-1,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinítrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gama-hidróxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-l-sulfonato, naftâleno-2-sulfonato, mandelato, e semelhante. Sais de adição ácida preferidos são os formados com ácidos minerais tais como ácido hidrocloridrico e ácido hidrobrômico, e em especial, ácido hidrocloridrico. [22] Alcalinos podem também ser empregados para reagir com os derivados da presente invenção para formar os sais. Exemplos representativos dos referidos alcalinos incluem amônia, metais alcalinos, hidróxidos de metais alcalinos, carbonatos e bicarbonatos. Tipicamente, o referido alcalino pode ser um hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia e carbonato de potássio. [23] Um aspecto da presente invenção proporciona um método para produzir um derivado de peptideo insulinotrópico, por síntese de fase sólida, que compreende o uso de resina HMP como um veículo de fase sólida, que protege a alfa-alanina de um amino ácido com 9-fluorenil metoxicarbonila (Fmoc), que sintetiza o resíduo em um peptideo sintetizador pela seqüência de amino ácido de um derivado de peptideo insulinotrópico, e se obtém os produtos após as etapas de separação, purificação e liofilização. [24] Em um outro aspecto, a presente invenção ."proporciona um método de produzir derivado de peptideo insulinotrópico, por técnicas recombinantes que compreendem: [25] a. sintetizar fragmentos de gene pela· seqüência de amino ácido de um derivado de peptideo insulinotrópico, [26] b. obter uma cepa de bactéria clonada após ligação a fragmentos de genes, construção de um plasmídeo recombinante, cultura de células bacterianas e transformação de plasmídeo recombinante, [27] c. extrair corpos de inclusão após fermentação da cepa de bactéria e colapso das paredes celulares, [28] d. obter o produto final através da lise de corpos de inclusão, separação do produto bruto, purificação por HPLC e etapa de liofilização. [29] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uso dos referidos derivados de peptideo insulinotrópicos e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos em um tratamento de diabete do tipo II. [30] A presente invenção proporciona novos derivados do composto peptideo Exendina-4, que se encontra na faixa dos derivados de Exendina-4. Os derivados da presente invenção apresentam atividades biológicas de estimulação de secreção de insulina e de redução da concentração de glucose sanguinea. Os mesmos podem ser usados para o tratamento da diabete mellitus do tipo II. Os referidos derivados podem ser preparados por síntese química e mais facilmente por técnicas recombinantes, que tornam possíveis a redução dos custos de produção. Ademais, as atividades biológicas dos referidos derivados foram provadas por estudos farmacodinâmicos entre camundongos diabéticos não obesos (NOD), quando 0,1 Gg de derivados da presente invenção foram injetados por via abdominal no camundongo, os derivados de peptideo insulinotrópicos apresentaram efeitos óbvios em aumentar a secreção de insulina e reduzem o nível de glucose sanguínea. Descrição das Figuras [31] A presente descrição será agora adicionalmente ilustrada com referência às seguintes Figuras e exemplos. [32] A Figura 1 mostra os resultados dos estudos farmacodinâmicos para os derivados de peptideo insulinotrópico da presente invenção. [33] A Figura 2 mostra os resultados da análise de espectro de massa para o produto preparado no Exemplo 1, com o seu peso molecular teórico de 4300,6 e o seu peso molecular determinado de 4316,7. [34] A Figura 3 ilustra de forma esquemática os resultados experimentais dos efeitos de glucose sanguínea decrescentes da Exendina 4 {Lys20, Arg40) e Exendina 4 (Leul4, Lys20, Arg40). [35J A Figura 4 ilustra de forma, esquemática os resultados da experiência do efeito estimulatório da Exendina 4 (Lys2Ó, Arg40] na secreção de insulina. [36J A Figura 5 ilustra de forma esquemática os resultados da experiência do efeito estimulatório da secreção de peptideo-C para Exendina 4 [iys20, Arg40j, Descrição da Invenção [37] Os seguintes exemplos são ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção de forma alguma. Exemplo 1 [38] Preparação de um derivado de peptideo insulinotrópico onde X é Arg, Y é Lys, e Z é -OH por síntese de fase sólida. (1) Monômeros de amino ácido [39] no qual: [40] Fmoc representa 9-fluorofenil metoxicarbonila [41] BOC representa terc-butiloxicarbonila [42] Trt representa tritila [43] OtBu representa éster de butila terciário, e [44] tBu representa terc-butila. (2) Aparelhos e Reagentes [45] Aparelho: sintetizador de peptideo Modelo 433A (Applied Biosystem, US) [46] Reagentes: N-metil cetopirrolidina, cloreto de metileno, hexahidropiridina, metanol, dimetilaminopiridina, DMF N,N-diisopropiletilamina/NMP, 100 mmole HBTU/0,5 Μ HOBT em DMF, N,N-diciclohexilcarbodiimida/NMP [47] Nos quais: [48] DMF representa Ν,Ν-dimetilformamida [49] NMP representa N-metilpirrolidona [50] HOBT representa 1-Hidroxibenzotriazola, e [51] HBTU representa hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazola-il-1,1,3,3-tetrametil-urônio). (3) Procedimentos: a. Síntese [52] Considerando a escala de síntese de 0,25 por exemplo, o processo de síntese foi descrito como se segue. 0,25 g de resina HMP foi pesada e disposta em um recipiente reator de todo o sintetizador. 1 mmol de diversos resíduos, cada um dos quais acoplados com grupos de proteção, foram pesados e estruturados no sintetizador pela seqüência de amino ácido do derivado de peptideo insulinotrópico, a partir do terminal carbóxi para o terminal amino. A temperatura ambiente de 25°C, as reações para a remoção da proteção Fmoc, que ativam o resíduo e fixam o resíduo ativado á resina HMP, foram automaticamente realizados sob o controle de um programa de computador. As referidas reações foram circuladas até que todo o peptídeo foi sintetizado. Após a conclusão da síntese, a resina fixada ao resíduo, com cada resíduo acoplado com os grupos de proteção de cadeia lateral, foi seca a ar em um sintetizador de peptídeo e então pesados. b. Remoção dos grupos de proteção e retirada da resina: [53J A resina fixada ao resíduo, com cada resíduo do derivado de peptídeo insulínotrópico acoplado com os grupos de proteção, foi disposta em um frasco Erlen Meyer tampado·, e seguido pela adição de reagentes de divagem mostrados como abaixo. [54] A reação de agitação eletromagnética foi realizada a uma temperatura constante de 30°C por 6 horas. Após a etapa de filtragem, o filtrado aquoso foi coletado. A resina foi lavada com pequena quantidade de ácido trifluoroacético. Então, o filtrado aquoso coletado e a solução de lavagem, foram misturados juntos, e éter foi adicionado â precipitação. A mistura foi filtrada, e o precipitado resultante foi lavado com uma pequena quantidade de éter. Após a evaporação em um desumidificador, o produto bruto foi obtido. c. Purificação por HPLC e liofilizaçâo [55] A separação e a purificação do produto bruto foi alcançada ao se usar HPLC preparatória. O produto final foi obtido após a etapa de congelamento e de liof ilizaçâo. 0 peso molecular do produto foi determinado ao se usar análise de junção de espectrograma e cromatografía de massa. Observou-se que o derivado de peptídeo era dotado de um peso molecular de *3316,7, o peso molecular teórico do qual foi 4300,6.

Exemplo 2 [56J Preparação de um derivado de peptídeo insulinotrópico onde X é Leu, Y é Lys e 2 é Arg-OH por técnicas de bio-engenharia. [57] Sintetização de fragmentos de gene por seqüência de amino ácido de derivado de peptídeo insulinotrópico (1) 5' AAT TCC ATG CAC GGC GAA GGC ACC TTC ACC AGC

GAT CTG AGC AAA CAG CTG GAA GAA GAA GCG GTT AA

{2) 5* ACTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGC GGC CCG

AGC AGC GGC GCG CCG CCG CCG AGC CGT TAG A

(3) 5’ AGCTT CTA ACG GCT CGG CGG CGG CGC GCC GCT GCT CGG GCC GCC GTT TTT CAG CCA TTC GAT GA

(4) 5' AC AG TTT AAC CGC TTC TTC TTC CAG CTG TTT GCT CAG ATC GCT GGT GAA GGT GCC TTC GCC GTG CAT GG B. Clonagem Ligação: [58] Dois tubos foram obtidos, e fragmento (1) e fragmento (4) com seus OD260 nm = 0,1 [densidade ótica a 260 nm), foram colocados em um tubo, enquanto o fragmento (1) e fragmento (4) com a mesma densidade ótica foram colocados em outro tubo. Então, o tampão polinucleotídeo quinase, polinucleotideo quinase e ATPs foram adicionados aos dois tubos respectivamente. As misturas de reação foram incubadas a 37 °C por 60 minutos para constituir o terminal 5'' do- fragmento de gene fosforilado. Então os dois tubos foram dispostos em um banho de água a 95°C e foram incubados por 10 minutos. Foi interrompido o aquecimento do banho de água e foi naturalmente esfriado à temperatura ambiente, enquanto a reação de recozimento foi realizada durante o processo. Ligase T4 e tampão de ligase T4, foram adicionados aos dois tubos respectivamente, e as misturas foram incubadas durante a noite a 16°C para a ligação dos fragmentos de genes.

Plasmideo [59] Um plasmideo que contém promotor tal Lac, PL ou Tac, foi posto em um tubo e digerido com endonucleases de restrição EcoRI e HindIII. O plasmideo digerido foi extraído com hidróxibenzeno: solvente clorofórmio e coletado por centrifugação. A fase aquosa foi mantida e lavada três vezes com solvente clorofórmio. A centrifugação foi continuada, e a fase aquosa resultante foi precipitada com solvente isopropanol, seguido por centrifugação e etapa de secagem a ar. [60] O plasmideo digerido e o fragmento ligado foram misturados juntos. Ligase T4 e tampão ligase T4 foram adicionados à mistura. A reação de ligação foi realizada à temperatura ambiente por 3-4 horas.

Cultura de células bacterianas hospedeiras: [61] Células bacterianas de E. coli JM 103 foram incubadas com agitação a 37°C em meio líquido LB (1000 ml de meio líquido LB que contém 10 g de peptona, 5 g de extratos de levedura e 5 g de cloreto de sódio) por 4 horas. Após, as culturas bacterianas foram centrifugadas, as células bacterianas coletadas foram tratadas com solução de cloreto de cálcio e mantidas a -4°C para uso posterior.

Transformação [62] O plasmideo clonado foi transformado em. células hospedeiras E. coli IM 103. As células bacterianas ^transformadas foram incubadas em um banho de gelo por 30 minutos, e então incubadas a 42°C por 2 minutos. As células bacterianas foram espalhadas em uma placa de Agar que contém antibiótico ampicilina, e foram incubadas durante a noite a 37 °C. A triagenst das colônias foi conduzida posteriormente, e as colônias que continham o plasmideo recombinante foram mantidas como colônias .positivas. [63] C. Fermentação [64] Uma colônia selecionada que estava dotada de um plasmideo recombinante que porta o gene derivado foi incubado com agitação de meio liquido LB. 0,5 mM de isopropil beta-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) foi adicionado com o objetivo de indução protéica. As células bacterianas foram incubadas durante a noite e coletadas por centrifugação. A proteína expressa foi identificada através de eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) que contém dodecanosulfonato de sódio a 12%. D. Corpos de Inclusão [65] Dez garrafas, cada uma das quais contendo 300 ml de culturas bacterianas, foram incubadas com agitação sob as condições mencionadas acima. Após a etapa de incubação protéica, a solução de lise (20 mM de tampão de ácido fosfórico contendo cloreto de sódio a 1%, pH 7,5) e lisozima foram adicionados. As culturas bacterianas foram incubadas a 30°C por 30 minutos e a centrifugação foi seguida. O precipitado coletado foi tratado com 6M de hidrocloreto de guanidina (Gu.HCl) para extração dos corpos de inclusão. A centrifugação foi continuada e o sobrenadante que resultou, foi dialisado de modo a remover o hidrocloreto de guanidina. O dialisado foi lavado três vezes com 20 mM de tampão de ácido fosfônico (que contém cloreto de sódio a 1% e 0,1 % de Tween 80, pH 7,5), e os corpos de inclusão foram obtidos posteriormente. E. Lise [66] Os corpos de inclusão foram dissolvidos em solução de 8M carbamida. Ácido hidrocloridrico foi adicionado a uma concentração de 50 mM. Após a adição de brometo de cianogênio, a solução foi agitada sob proteção contra luz e com proteção de nitrogênio. A reação de lise foi conduzida por 2 horas, seguida por análise de HPLC. F. Purificação [67] Após a conclusão da reação de lise, o produto bruto foi obtido através de uma divisão de cromatograf ia em Sephadex G-25 e o produto final foi adquirido através de purificação de HPLC. Da mesma forma que o resultado da síntese de fase sólida, foi mostrado por análise de espectrografia de massa que o peso molecular determinado do derivado de peptídeo é consistente com o peso teórico.

Exemplo 3 Estudos Farmacodinâmicos [68] Estudos foram conduzidos em camundongos diabéticos não obesos com duas horas de jejum (camundongo NOD) que pesavam 17 ± 2 kg. Os camundongos no grupo de controle 1 receberam uma injeção abdominal de 2 Dg de insulina, e os camundongos no grupo de controle 2 receberam uma injeção abdominal de 4 Dg de insulina, enquanto aqueles no grupo experimental receberam uma injeção abdominal de 0,1 Dg de derivado de peptídeo insulinotrópico obtido de acordo com o descrito no Exemplo 1. [69] Amostras de sangue foram coletadas em diferentes minutos. As concentrações de glucose plasmática foram determinadas ao se usar um kit de teste de glucose plasmática (Shanghai Institute of Biological Products Ministry of Health). Os resultados foram mostrados nas Figuras. Pode ser observado que o efeito decrescente do derivado de peptideo insulinotrópico na glucose sanguínea é relativamente óbvio.

Exemplo 4 [70] Os efeitos decrescentes de Exendina 4 (Lys20, Arg40) e Exendina 4 (Leul4, Lys20, Arg40) em glucose sanguínea em camundongos NOD.

Materiais e Métodos: [71] Camundongos NOD foram proporcionados por Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences. Solução de cloreto de sódio a 0, 9 %, peptídeos Exendina 4 (Lys20, Arg40) e Exendina 4 (Leul4, Lys20, Arg40), foram usados no teste. O kit de teste de glucose plasmática foi comprado por Shanghai Institute of Biological Products Ministry of Health. [72] Os camundongos NOD em jejum durante a noite foram divididos em três grupos. Os camundongos do primeiro grupo foram injetados por via abdominal com 200 Dl de solução que continha 40% de glucose e 1 Qg de Exendina 4 (Lys20, Arg40) . Os camundongos do segundo grupo foram injetados por via abdominal com 200 Dl de solução que continha 40% de glucose e 2 Qg de Exendina 4 (Leul4, Lys20, Arg40). Enquanto no terceiro grupo, também o grupo de controle, os camundongos foram injetados por via abdominal com a solução de glucose. [73] 30 G1 de amostra de sangue foram obtidos a partir do sinus zeinous retro-orbital, usando imediatamente um capilar calibrado que foi anteriormente tratado com heparina. A amostra foi posta em 300 Gl de salina normal e misturado com a salina. Eritrócitos foram removidos por centrifugação a 3000 rpm, enquanto o soro sanguíneo foi mantido para determinação de glucose. Diferentes amostras de sangue foram obtidas como descrito acima a 30 minutos, 60 minutos e 120 minutos, respectivamente, então os soros sanguíneos foram separados. As concentrações de glucose das três amostras de plasma foram determinadas de acordo com o método descrito pelo kit de teste, e o efeito de GLP-l(7-36) na concentração de glucose sanguínea foi detectado. [74] Como mostrado na Figura 1, após um dramático aumento, a concentração de glucose sanguínea no grupo de controle retornou a um nível normal gradualmente; enquanto as concentrações de glucose nos grupos de experiência nunca mostraram um aumento notável e manteve um nível normal todo o tempo. A razão é que a administração de derivado de Exendina 4 estimula a secreção de insulina e portanto evita a flutuação dramática da concentração de glucose. Assim, os efeitos de redução da Exendina 4(Lys20, Arg40) e Exendina 4 (Leul4, Lys20, Arg40) na glucose sanguínea são suportados pelos resultados da experiência.

Exemplo 5 Efeito estimulatório da Exendina 4 (Lys2o, Arg^o) na secreção de insulina Materiais e Métodos [75] Camundongos NOD foram proporcionados por Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences. 40% de solução de glucose, 0,9% de solução de cloreto de sódio e Exendina 4 (Lys20, Arg40) foram usados no kit de radio imunoteste de insulina, foi comprado por Shanghai Institute of Biological Products Ministry of Health. [76] Camundongos NOD foram divididos em dois grupos. 5 0 Gl de amostra de sangue foi obtido a partir do plexo venoso do olho com o uso de um capilar calibrado, a parede interna do qual foi enxaguado com lmg/ml de heparina e foi seco a ar anteriormente. Os camundongos nos dois grupos foram injetados por Via abdominal com 200 Gl de solução salina normal que contém 5 Gg de Exendina 4 (Lys20, Arg40), respectivamente, e este momento foi registrado como 0 minuto. Diferentes amostras de sangue foram obtidas como descrito acima em 5 min, 10 min, 20 min e 30 min, respectivamente. Após a amostragem, cada amostra de sangue foi posta imediatamente em um tubo de centrifuga que contém 5 0 Dl de salina normal e foi misturado com salina. Os eritrócitos foram removidos por centrifugação a 3000 rpm. As concentrações de insulina das diferentes amostras foram determinadas ao se seguir os métodos descritos pelo kit de radio imunoteste, e então o efeito estimulatório da Exendina 4 (Lys20, Arg40) na secreção de insulina foi detectado. [77] Como mostrado na Figura 2, a injeção abdominal com Exendina 4 (Lys20, Arg40) pode estimular a secreção de insulina de forma significativa.

Exemplo 6 Efeito estimulatório da Exendina 4 (Lys2of Arg40) na secreção de peptideo-C

Materiais e Métodos [78] Camundongos C57/BL saudáveis foram proporcionados por Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences. 40% de solução de glucose, 0,9% de solução de cloreto de sódio e Exendina 4 (Lys20, Arg40) foram usados na experiência. 0 kit de radio imunoteste de insulina, e kit de radio imunoteste de peptideo-C foram comprados por Shanghai Institute of Biological Products Ministry of Health. [79] Camundongos C57/BL foram divididos em dois grupos. 50 Dl de amostra de sangue foi obtido a partir do plexo venoso do olho com o uso de um capilar calibrado, a parede interna do qual foi enxaguado com lmg/ml de heparina e foi seco a ar anteriormente. Os camundongos nos dois grupos foram injetados por via abdominal com 200 01 de solução salina normal que contém 5 Dg de Exendina 4 (Lys20, Arg40), respectivamente, e este momento foi registrado como 0 minuto. Diferentes amostras de sangue foram obtidas como descrito acima em 5 min, 10 min, 20 min e 30 min, respectivamente. Após a amostragem, cada amostra de sangue foi posta imediatamente em um tubo de centrifuga que contém 50 Dl de salina normal e foi misturado com salina. Os eritrócitos foram removidos por centrifugação a 3000 rpm. As concentrações de peptideo-C das diferentes amostras foram determinadas ao se seguir os métodos descritos pelo kit de radio imunoteste, e então o efeito estimulatório da Exendina 4 (Lys20, Arg40) na secreção de peptideo-C foi detectado. [80] Como mostrado na Figura 3, a injeção abdominal com Exendina 4 (Lys20, Arg40) pode estimular a secreção de peptideo-C de forma significativa.

Claims (4)

1. Derivado de peptideo insulinotrópico, e sais farmaceuticamente aceitáveis produzidos a partir do mesmo, caracterizado pelo fato què referido derivado tem a seqüência de aminoácido abaixo: His-Gly-Glu-Gly-Thr-phe-Thr“Ser“Asp“Leu“Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Y-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn^Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-$er-2, na qual X representa Leu, Y representa Lys, e 2 representa Arg-QH.

2. Derivado de peptideo insulinotrópico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido derivado tem a seqüência de amino ácido abaixo: Hxs“Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-GIu-Glu- Ala-Val-Y-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Fro-Ser-Ser-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z, na qual X representa Met, Y representa Lys, e 2 representa Arg-QH»

3. Método para a produção de um derivado de peptideo insulinotrópico conforme descrito nas reivindicações 1 ou 2, por síntese de fase sólida, caracterizado pelo fato que compreende o uso de uma resina de HMP como um transportador de fase sólida, a proteção de alfa-amino de um amino ácido com 9-fluorenila metôxiearfaoniia {Fmoc), a sintetização de um resíduo em um sintetizador peptideo pela seqüência de amino ácido de um derivado de um insulinotrópico péptido, e a obtenção de produtos depois das etapas de separação, purificação e liofilização.

4. Método de produção de um derivado de peptideo insulinotrópico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato que compreende: (a) a sintetização de fragmentos de genes pela seqüência de amino ácido do derivado de insulinotrópico peptideo, (b) a obtenção de uma estirpe de bactéria clonada depois da ligação dos fragmentos de genes, a construção de um plasmideo recombinante, a cultura de células bacterianas e a transformação do plasmideo recombinante, (c) a extração de corpos de inclusão depois da fermentação da estirpe de bactérias e do colapso das paredes das células, (d) a obtenção do produto final depois da lise dos corpos de inclusão, da separação do produto bruto, da purificação por HPLC e da etapa de liofilização.