KR20180014754A - 페길화된 옥신토모둘린 변이체 - Google Patents

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KR20180014754A
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우디 이얄 피마
오렌 헤르쉬코비츠
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옵코 바이오로직스 리미티드
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Abstract

가역적 링커 예컨대 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 연결된 옥신토모둘린 및 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하는 조성물이 개시된다. 역 페길화된 옥신토모둘린을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

페길화된 옥신토모둘린 변이체
가역적 링커 예컨대 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 연결된 옥신토모둘린 및 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하는 조성물이 개시된다. 역 페길화된 옥신토모둘린을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하는 방법이 또한 개시된다.
위장관은 췌장 단백질 (PP), 글루카곤-유사 펩타이드 1 (GLP-1), 펩타이드 YY (PYY) 및 옥신토모둘린 (OXM)을 포함하는 섭식 행동을 조절하는 많은 펩타이드 호르몬의 합성 및 방출을 담당한다. OXM은 장과 CNS에서 프로글루카곤의 조직-특이적인 후-과도기적 처리과정으로부터 발생한다. 이것은 시험관내 및 생체내 모두에서 OXM의 특성에 기여하는 것으로 나타났지만 펩타이드의 효과에 대해서 만으로는 충분하지 않은 C-말단 염기성 옥타펩타이드 확장을 갖는 완전한 글루카곤 서열을 포함하여, 37개 아미노산을 함유한다. 음식 소화에 대한 반응에서, OXM은 장 L 세포에 의해 식사 칼로리 함량에 비례하여 혈류로 분비된다.
OXM은 경구 및 복강내 양자의 투여 후에 인슐린 분비의 자극을 통해 글루코스 청소능을 향상한다. 이것은 또한 음식 섭취의 제어를 조절한다. 시상하부의 방실과 아치형 핵 (ARC)에 OXM의 뇌심실내 (ICV) 및 핵내 주입은 공복 랫드에서 재-급식을 억제한다. 이 억제는 암기의 시작시 자유롭게 급식된 랫트에서 또한 실증되었다. 또한, OXM의 말초 투여는 단식-유도 및 암기 음식 섭취 양자를 용량-의존적으로 억제하였다.
짧은 혈청 반감기와 같은 바람직하지 않은 약동학은 대부분의 그렇지 않은 유망한 약물 후보물질의 약제학적 개발을 방지할 수 있다. 혈청 반감기는 분자의 경험적 특징이며, 각각의 신규한 잠재적인 약물에 대해 실험적으로 결정되어야 한다. 예를 들면, 더 낮은 분자량 단백질 약물로는, 생리적 청소능 기전 예컨대 신장 여과는 요구된 투여 레지멘의 비용 또는 빈도 때문에 약물의 치료 수준의 유지를 실현불가능하게 할 수 있다.
단백질 및 특히 짧은 펩타이드는 혈액, 간 또는 신장에서 변성 또는 효소 분해에 민감하다. 따라서, 단백질은 전형적으로 수 시간의 짧은 순환 반감기를 갖는다. 그것의 낮은 안정성 때문에, 펩타이드 약물은 활성 펩타이드의 효과적인 혈장 농도를 유지하기 위해 지속된 빈도로 일반적으로 전달된다. 또한, 펩타이드 약물은 일반적으로 주입에 의해 투여되기 때문에, 펩타이드 약물의 빈번한 주입은 대상체에 상당한 불편을 야기한다. 따라서, 치료 단백질 및 펩타이드의 반감기를 연장시키면서 이들의 높은 약리적 효능을 유지할 기술에 대한 필요성이 있다. 그와 같은 요망된 펩타이드 약물은 또한 대상체에 주입될 때 향상된 혈청 안정성, 높은 활성 및 요망되지 않는 면역 반응을 유도할 낮은 개연성의 요건을 또한 충족하여야 한다.
본 발명은 펩타이드의 반감기가 가역적 페길화 기술을 이용하여 연장된 OXM 유도체에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)로 구성되는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노 말단에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)로 구성되는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 (Lys12)에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)로 구성되는 조성물에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 (Lys30)에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명은 식 II의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00001
여기서 R2는 SO3H이고;
상기 방법은 하기를 포함한다:
하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
Figure pct00002
여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
에 의해 식 II의 구조를 생성하는 것으로, 여기서 상기 OXM의 His1의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 식 III의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00003
여기서 R2는 SO3H이고;
상기 방법은 하기를 포함한다:
하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
Figure pct00004
,
여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되고 His1의 α-아미노가 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
에 의해 식 III의 구조를 생성하는 것으로, 여기서 상기 OXM의 Lys30의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 식 IV의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법을 제공한다:
Figure pct00005
여기서 R2는 SO3H이고;
상기 방법은 하기를 포함한다:
하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
Figure pct00006
,
여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되고 His1의 α-아미노가 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
에 의해 식 III의 구조를 생성하는 것으로, 여기서 상기 OXM의 Lys12의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS의 제조 방법을 제공하는 것으로:
Figure pct00007
,
상기 방법은 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합하는 것을 포함하고, 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 2 내지 10 사이 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 실시예 및 도면으로부터 분명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 분명하게 될 것이므로 단지 설명으로써 주어진 것임을 이해해야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 본 발명은 본 명세서에서 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합한 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 특허 또는 출원 파일은 색상으로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 색상 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청시 및 필요한 수수료 지불시에 청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 생산된 PEG-S-MAL-FMS-OXM 콘주게이트의 상이한 변이체를 도시한다.
도 2는 CHO-K1 세포 과발현 GLP-1 수용체와 인큐베이션될 때 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 시험관내 활성 (cAMP 정량화)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 IPGTT 모델에서 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 생체내 활성을 나타내는 그래프이다. 모든 화합물은 비히클 그룹에 비교하여 내당능을 유도했다.
도 4는 수컷 ob/ob 마우스에서 체중에 대한 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 5는 수컷 ob/ob 마우스에서 음식 섭취에 대한 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 6은 수컷 ob/ob 마우스에서 비-공복 (A) 및 공복 혈당 (B)에 대한 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 7은 수컷 ob/ob 마우스에서 누적 음식 섭취에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 8은 수컷 ob/ob 마우스에서 체중에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 9는 수컷 ob/ob 마우스에서 자유롭게 급식한 (A) 및 절식된 혈장 글루코스 (B)에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 10은 수컷 ob/ob 마우스에서 연구의 2일째에 내당능에 대한 MOD-6031 및 쌍이 공급된 그룹 (2g/kg po)의 효과를 나타낸다.
도 11은 수컷 ob/ob 마우스에서 연구의 30일째에 내당능에 대한 MOD-6031 및 쌍으로 공급된 그룹 (2g/kg po)의 효과를 나타낸다.
도 12는 수컷 ob/ob 마우스에서 말단 혈장 콜레스테롤에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 13은 수컷 ob/ob 마우스에서 체중에 대한 PEG-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM의 효과를 나타낸다.
도 14는 수컷 ob/ob 마우스에서 누적 음식 섭취에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM의 효과를 나타낸다.
도 15는 수컷 ob/ob 마우스에서 혈장 글루코스에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM의 반복된 투여의 효과를 나타낸다.
도 16은 수컷 ob/ob 마우스에서 내당능에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM (2g/kg po)의 효과를 나타낸다.
도 17은 수컷 ob/ob 마우스에서 내당능에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM (2g/kg po)의 반복된 투여의 효과를 나타낸다.
도 18은 수컷 ob/ob 마우스에서 비절식된 말단 혈장 지질에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM의 반복된 투여의 효과를 나타낸다.
도 19는 수컷 ob/ob 마우스에서 비절식된 말단 혈장 프룩토스아민에 대한 PEG30-S-MAL-Fmoc--OXM, MOD-6031, 및 PEG-EMCS-OXM의 반복된 투여의 효과를 나타낸다.
도 20A-20C는 상이한 pH 수준에서 인산염 버퍼 내에서의 시간에 대한 평균 MOD-6031 (도 20A), OXM (도 20C), 및 PEG30-S-MAL-FMS-NHS (도 20B) 농도를 나타낸다. 도면에 도시된 수지 부착된 PEG-FMS-OXM은 MOD-6031이고 도 28A에 도시된 구조를 갖는다. 도면에서 PEG-FMS는 도 28B에 제시된 바와 같은 PEG30-S-MAL-FMS-NHS를 지칭한다.
도 21A-21C는 상이한 온도에서 랫트 혈장 내에서의 시간에 대한 평균 MOD-6031 (도 21A), OXM (도 21C), 및 PEG30-S-MAL-FMS-NHS (도 21B) 농도를 나타낸다. 도면에 도시된 수지 부착된 PEG-FMS-OXM은 MOD-6031이고 도 28A에 도시된 구조를 갖는다. 도면에서 PEG-FMS는 도 28B에 제시된 바와 같은 PEG30-S-MAL-FMS-NHS를 지칭한다.
도 22A-22C는 상이한 혈장 유형 내에서의 시간에 대한 평균 MOD-6031 (도 22A), OXM (도 22C), 및 PEG30-S-MAL-FMS-NHS (도 22B) 농도를 나타낸다. 도면에 도시된 수지 부착된 PEG-FMS-OXM은 MOD-6031이고 도 28A에 도시된 구조를 갖는다. 도면에서 PEG-FMS는 도 28B에 제시된 바와 같은 PEG30-S-MAL-FMS-NHS를 지칭한다.
도 23은 pH=6에서 OXM 및 OXM+ DPPIV의 분해 검정을 나타낸다.
도 24는 pH=7에서 OXM 및 OXM+ DPPIV의 분해 검정을 나타낸다.
도 25는 pH=6에서 MOD-6031, MOD-6031+ DPPIV (1X [DPPIV 농도] 및 10X [DPPIV 농도])의 분해 검정을 나타낸다.
도 26은 pH=6에서 PEG-EMCS-OXM 및 PEG-EMCS-OXM + DPPIV의 분해 검정을 나타낸다.
도 27은 MOD-6031 용량- 의존적으로 감소된 말단 글루코스 및 현저하게 감소된 인슐린을 나타낸다.
도 28A 및 28B는 PEG가 PEG30이고 R2가 위치 C2 상에 SO3H인 MOD-6031 구조의 구조 (도 28A), 및 PEG30-S-MAL-FMS-NHS의 구조 (도 28B)를 나타낸다.
지속성 옥신토모둘린과 이를 생산하고 사용하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 일 측면에서, 본 발명은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 가요성 링커를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 (Lys12)에 부착된다. 일 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 (Lys12)에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다.
또 다른 구현예에서, 펩타이드의 혈청 반감기를 연장하는 신규한 방법이 본 명세서에서 제공된다. 이 방법은 혈류안으로 원상태 펩타이드의 서방형 방출을 초래하는 화학 링커 (소위 FMS 또는 Fmoc)를 통해 펩타이드에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬의 가역적 부착을 포함하는 콘주게이트의 사용에 기초된다. 방출된 펩타이드는 그런 다음 또한 중추신경계 (CNS) 또는 임의의 다른 표적 장기로 들어가기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다. 일 구현예에서, FMS 링커의 특유의 화학 구조는 펩타이드 방출의 특이적인 속도로 이어진다.
그러므로, 또 다른 구현예에서, OXM 펩타이드의 생물학적 반감기를 연장하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, OXM의 생체액에서 순환하는 시간을 연장하는 방법이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 상기 순환하는 시간은 온전한 OXM 펩타이드의 서방형 방출에 의해 확장된다. 또 다른 구현예에서, 상기 생물학적 반감기 또는 상기 OXM 펩타이드의 상기 순환하는 시간은 연장하는 것은 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 통과하여 CNS를 표적화할 수 있도록 한다. 상기 생체액은 혈액, 혈청, 뇌척수액 (CSF), 및 기타 동종의 것일 수 있다는 것은 숙련가에 의해 쉽게 인정될 것이다.
일 구현예에서, 대상체에 본 발명의 페길화된 옥신토모둘린 콘주게이트의 투여시, 상기 콘주게이트로부터 상기 FMS 또는 상기 Fmoc 링커의 화학적 가수분해이 결과로서 옥신토모둘린은 상기 대상체 내 생체액 안으로 방출된다. 또 다른 구현예에서, 방출된 옥신토모둘린은 손상되지 않고 완전한 GLP-1 및 글루카곤 수용체 결합 활성을 회복한다. 또 다른 구현예에서, 상기 FMS 또는 상기 Fmoc를 화학적으로 가수분해하는 것은 상기 생체액에서 상기 OXM 펩타이드의 순환하는 시간을 연장한다. 또 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환하는 시간을 연장하는 것은 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 통과하여 CNS를 표적화할 수 있도록 한다. 또 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환하는 시간을 연장하는 것은 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 통과하여 시상하부를 표적화할 수 있도록 한다. 또 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환하는 시간을 연장하는 것은 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 통과하여 궁상 핵을 표적화할 수 있도록 한다.
일 측면에서, PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 OXM 및 이-작용성 링커 (FMS 또는 Fmoc)를 통해 연결된 mPEG(30)-SH를 포함하는 부위 지향된 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, OXM 펩타이드는 일 측면으로부터 링커 상의 N-석신이미드 에스테르 (NHS) 기와 반응하는 N-말단 측의 그것의 말단 아민을 통해 연결되는 반면 mPEG(30)-SH는 그것의 티올기에 의해 FMS 링커의 말레이미드 모이어티에 연결된다 (본 명세서에서의 실시예 참조). Lys12 및 Lys30 변이체는 Lys 잔기의 그것의 아민 기를 통해 FMS 링커에 접합된다. 일 구현예에서, 가역적-페길화 방법은 본 명세서에서 제공된 오래 지속되는 옥신토모둘린 (OXM) 펩타이드 (예를 들면 PEG30-FMS-OXM)를 생성하기 위해 본 명세서에서 이용된다.
일 구현예에서, 용어들 이중 "GLP-1/글루카곤 수용체 효능제" 및 "효능제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 용어들은 또한 당해 기술에서 공지된 임의의 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 자연 발생 이중 효능제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 비-자연 발생 이중 효능제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비-자연 발생 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 옥신토모둘린보다 이들 수용체에 상이한 친화도로 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 바람직한 효능제는 옥신토모둘린 또는 OXM 또는 이들의 기능적 변이체이다.
일 구현예에서, 용어 "작용성"은 비제한적으로, 본 명세서에서 추가로 제공되는 바와 같이, 중량 감소, 인슐린 감수성 증가, 인슐린 내성 감소, 내당능을 유도하는 에너지 소비 증가, 혈당 조절 유도, 콜레스테롤 수준 개선 등을 포함하는, 생물학적 활성을 갖도록 본 명세서에서 제공된 효능제 또는 OXM의 능력을 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 포함하는 콘주게이트를 제공하고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 (Lys30)에 부착된다. 일 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 서열의 위치 번호 십이 상의 라이신 잔기 (Lys30)에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커로 구성된 콘주게이트를 제공하고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 (Lys30)에 부착된다. 일 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 서열의 위치 번호 십이 상의 라이신 잔기 (Lys30)에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 포함하는 콘주게이트를 제공하고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 말단에 부착된다. 일 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 조성물이다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커로 구성된 콘주게이트를 제공하고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 아미노산 말단에 부착된다. 일 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 위치 12 (Lys12) 또는 위치 30 (Lys30) 또는 아미노 말단 상의 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머를 포함하는 콘주게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 위치 12 (Lys12) 또는 위치 30 (Lys30) 또는 아미노 말단 상의 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머로 구성되는 변형된 옥신토모둘린 펩타이드를 제공한다. 또 다른 구현예에서, PEG가 Lys12, Lys30에서 또는 아미노 말단에서 옥신토모둘린에 부착된 콘주게이트는 각각 옥신토모둘린의 "Lys12 변이체", "Lys30 변이체" 또는 "아미노 변이체"로 지칭된다. 일 구현예에서, 용어들 "아미노 변이체" 또는 "아미노-말단 변이체"는 "N-말단 변이체", "N' 변이체" 또는 "N-말단 변이체"와 동의어이다. 숙련가는 본 명세서에서 제공되는 링커 (Fmoc 또는 FMS)/PEG 콘주게이트를 이들 라이신 잔기에 부착시키기 위해 OXM 서열 전반을 통해 부위-특이적인 또는 랜덤 방식으로 라이신 잔기를 용이하게 삽입하는 것을 본 발명에 의해 안내받을 수 있음을 이해해야 한다. 일 구현예에서, 1종 이상의 라이신 잔기가 OXM 서열을 통해 상이한 위치에 위치하고, OXM을 PEG 및 절단가능 링커 (예를 들면 FMS 또는 Fmoc)에 접합하기 위해 사용되는 변이체도 또한 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 통해 위치 12 (Lys12) 또는 위치 30 (Lys30) 상의 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머를 포함하는 콘주게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 통해 위치 12 (Lys12) 상 및 아미노 말단 상의 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머를 포함하는 콘주게이트를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS) 링커를 통해 위치 30 (Lys30) 상 및 아미노 말단 상의 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머를 포함하는 콘주게이트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 페길화된 옥신토모둘린이다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 역전된 페길화된 옥신토모둘린이다. 또 다른 구현예에서, 어구 "지속성 옥신토모둘린", "역전된 페길화된 옥신토모둘린", "가역적 페길화된 OXM" 또는 "옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트"는 상호교환적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS 링커를 통해 PEG에 연결된 OXM이다. 또 다른 구현예에서, 지속성 OXM은 그것의 Lys12 잔기, 또는 그것의 Lys30 잔기 또는 그것의 아미노 (N') 말단을 통해 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명의 지속성 옥신토모둘린은 PEG 폴리머를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 옥신토모둘린은 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 아미노 말단에 접합된 PEG 폴리머를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 잔기 12 또는 30에 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS을 통해 접합된 PEG 폴리머를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 펩타이드의 아미노 말단 및 옥신토모둘린의 라이신 잔기 12 및 30 모두에 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS을 통해 접합된 PEG 폴리머를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 1:0.2-10:0.2-10의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 1:0.5-2:0.5-2의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 1:1:1의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 포함하거나 또는 이들로 구성된 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린의 아미노 말단에 접합된 PEG 폴리머를 포함한다. 또 다른 구현예에서, OXM-PEG-및 링커의 몰비는 1:1:1-1:1:3.5이다. 또 다른 구현예에서, 몰비는 1:1:1-1:1:10.0이다. 또 다른 구현예에서, 링커의 더 높은 비는 콘주게이트의 최적화된 생성을 허용한다.
또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 가역적 링커 예컨대, 비제한적으로, 선택적으로 치환된 Fmoc 및 FMS를 통해 PEG에 연결된다. 또 다른 구현예에서, Fmoc 및 FMS는 염기에 대해 민감성이고 생리적 조건하에서 제거 가능하다. 또 다른 구현예에서, 가역적 링커는 염기에 대해 민감하고 생리적 조건하에서 제거 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 가역적 링커는 염기에 대해 민감하고 혈액, 혈장, 또는 림프 내 생리적 조건하에서 제거 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 가역적 링커는 염기에 대해 민감하고 체액 내 생리적 조건하에서 제거 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 가역적 링커는 염기성 pH를 갖는 체액에서 제거 가능한 링커이다. 또 다른 구현예에서, 염기에 대해 민감한 링커는 염기성 환경에 노출시 절단되고 따라서 링커 및 PEG로부터 OXM을 방출한다. 또 다른 구현예에서, 온도에 대해 민감한 링커는 이러한 절단이 일어나도록 하는 특정한 온도에 노출시 절단된다. 또 다른 구현예에서, 링커의 절단을 가능하게 하는 온도는 생리적 범위 이내이다. 또 다른 구현예에서, 가역적 링커는 당해 기술에서 공지된 임의의 가역적 링커이다.
또 다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은 OXM이 가역적 링커를 통해 PEG에 연결된 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은 염기성 환경에 노출시 유리 OXM을 방출한다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은 혈액 또는 혈장에 노출시 유리 OXM을 방출한다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 표준 페길화 절차에서와 같이, 서로에 대해서 직접적으로 연결되지 않고, 그보다는 양자 잔기가 염기에 고도로 감수성이고 정상의 생리적 조건하에서 제거가능한 Fmoc 또는 FMS의 상이한 위치에 연결된 PEG 및 옥신토모둘린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 정상의 생리적 조건은 생리적 환경 예컨대 혈액 또는 혈장을 포함한다.
또 다른 구현예에서, Fmoc 및 FMS을 제조하는 공정과 그 구조는 미국 특허 번호 7585837에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 7585837의 개시내용은 그 전문이 참고로 여기에 편입된다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식 I:
(X)n―Y,
여기서 Y는 유리 아미노, 카복실, 또는 하이드록실을 담지하는 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제이고;
X는 식 (i)의 라디칼이고:
Figure pct00008
여기서 R1은 단백질 또는 폴리머 캐리어 모이어티; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 함유하는 라디칼이고;
R2는 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알크아릴, 아르알킬, 할로겐, 니트로, --SO3H, --SO2NHR, 아미노, 암모늄, 카복실, PO3H2, 및 OPO3H2로 구성된 군으로부터 선택되고;
R은 수소, 알킬 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
R3 및 R4는 동일 또는 상이하여, 각각은 수소, 알킬 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택되고;
A는 라디칼이 OXM-Y의 아미노 또는 하이드록실기에 연결될 때 공유결합이고; 및
n은 적어도 1의 정수임, 및 약제학적으로 허용가능한 그것의 염에 의해 제시된다.
일 구현예에서, R1은 단백질 또는 폴리머 캐리어 모이어티; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티를 함유하는 라디칼이다. 또 다른 구현예에서, PEG 모이어티는 -NH-C(O)-(CH2)p-말레이미드-S-PEG이고, 여기서 p는 1-6 사이의 정수이다. 또 다른 구현예에서, p는 2이다.
또 다른 구현예에서, 식 I의 n은 적어도 1의 정수이다. 또 다른 구현예에서, n은 1이다. 또 다른 구현예에서, n은 2이다. 또 다른 구현예에서, n은 1 내지 5 사이이다. 또 다른 구현예에서, n은 2 내지 5 사이이다.
또 다른 구현예에서, GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 옥신토모둘린 (OXM)이다.
또 다른 구현예에서, 용어들 "알킬", "알콕시", "알콕시알킬", "아릴", "알크아릴" 및 "아르알킬"은 1-8, 바람직하게는 1-4개의 탄소 원자의 알킬 라디칼, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 부틸, 및 6-10개의 탄소 원자의 아릴 라디칼, 예를 들면 페닐 및 나프틸을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "할로겐"은 브로모, 플루오로, 클로로 및 아이오도를 포함한다.
또 다른 구현예에서, R2, R3 및 R4 각각은 수소이다.
또 다른 구현예에서 R2는 수소이고, A는 --OCO― [-OC(=O)-]이고, R3 및 R4 각각은 수소, 즉 9-플루오레닐메톡시카보닐 라디칼 (이하에서 "Fmoc")이다.
또 다른 구현예에서, R2는 플루오렌 고리의 위치 2에서 --SO3H이고, R3 및 R4 각각은 수소이고, 그리고 A는 --OCO-- [-OC(=O)-]이다. 또 다른 구현예에서, R2는 플루오렌 고리의 위치 1에서 --SO3H이고, R3 및 R4 각각은 수소이고, 그리고 A는 --OCO-- [-OC(=O)]이다. 또 다른 구현예에서, R2는 플루오렌 고리의 위치 3에서 --SO3H이고, R3 및 R4 각각은 수소이고, 그리고 A는 --OCO-- [-OC(=O)]이다. 또 다른 구현예에서, R2는 플루오렌 고리의 위치 4에서 --SO3H이고, R3 및 R4 각각은 수소이고, 그리고 A는 --OCO-- [-OC(=O)]이다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식 II의 구조에 의해 제시되고, 여기서 OXM은 상기 OXM의 아미노-말단을 통해 링커에 연결된다:
Figure pct00009
여기서 R2는 수소 또는 SO3H이다. 일 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 조합에 있다. 일 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 2에 있고 그리고 PEG는 PEG30이다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 불소의 위치 1에 있고 그리고 PEG는 PEG30이다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 불소의 위치 3에 있고 그리고 PEG는 PEG30이다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 불소의 위치 4에 있고 그리고 PEG는 PEG30이다.
일 구현예에서, MOD-6031은 식 IIa의 구조에 의해 제시되고, 여기서 PEG는 PEG30이고 그리고 R2는 플루오렌의 위치 2에 있는 SO3H이다:
Figure pct00010
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식 III의 구조에 의해 제시되고, 여기서 OXM은 상기 OXM의 Lys30의 아미노 잔기를 통해 링커에 연결된다:
Figure pct00011
여기서 R2는 수소 또는 SO3H이다. 일 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식 IV의 구조에 의해 제시되고, 여기서 OXM은 상기 OXM의 Lys12의 아미노 잔기를 통해 링커에 연결된다:
Figure pct00012
여기서 R2는 수소 또는 SO3H이다. 일 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식: PEG-S-MAL-Fmoc-OXM, PEG-S-MAL-FMS-OXM, (PEG-S-MAL-FMS)n-OXM 또는 (PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM에 의해 제시되고; 여기서은 적어도 1의 정수이다. 또 다른 구현예에서, OXM의 아미노 말단 또는 OXM 아미노산 중 하나의 아미노 잔기를 통해 FMS 또는 Fmoc에 연결된 OXM. 또 다른 구현예에서, PEG는 -NH-C(O)-(CH2)p-말레이미드-S- 를 통해 Fmoc 또는 FMS에 연결되고 여기서 p는 1-6 사이의 정수이고, 그리고 여기서 상기 PEG는 설파이드 기에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명의 Fmoc는 하기 구조에 의해 제시된다:
Figure pct00013
일 구현예에서, 본 발명의 FMS는 하기 구조에 의해 제시된다:
Figure pct00014
일 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, R2는 SO3H이고 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
또 다른 구현예에서, OXM은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, OXM은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 서열식별번호: 1은 하기 아미노산 (AA) 서열: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열식별번호: 1)를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, OXM은 CAS No. 62340-29-8에 묘사된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
또 다른 구현예에서, OXM은 인간 OXM 또는 임의의 포유동물 OXM이다. 또 다른 구현예에서, OXM은 또한 일명 글루카곤-37 또는 생물활성 엔테로글루카곤이다. 또 다른 구현예에서, OXM은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제이다. 또 다른 구현예에서, OXM은 OXM의 생물학적 활성 단편이다. 또 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성 OXM은 서열식별번호: 1의 아미노산 30에서부터 아미노산 37로 신장한다. 또 다른 구현예에서, 생물학적 활성 OXM은 서열식별번호: 1의 아미노산 19에서부터 아미노산 37로 신장한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 2개의 C-말단 아미노산이 이로부터 결실된 옥타펩타이드에 상응한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 OXM 활성을 보유하는 서열식별번호: 1의 임의의 단편에 상응한다.
일 구현예에서, OXM은 서열식별번호: 1의 펩타이드의 펩타이드 동족체를 지칭한다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 50% 상동성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 60% 상동성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 70% 상동성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 80% 상동성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 90% 상동성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같이 서열식별번호: 1에 제시된 OXM 서열에 적어도 95% 상동성이다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은 OXM이 가용성 형태로 되는 것을 요하는 치료제에 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은, 비제한적으로, 그것의 하이드록실-함유 측쇄에 기인하여 단백질 용해도를 증가할 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하는 1종 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은 예컨대 표준 고상 기술을 사용함에 의해 생화학적으로 합성된다. 또 다른 구현예에서, 이들 생화학적 방법은 배타적인 고상 합성, 부분적인 고상 합성, 단편 응축, 또는 고전적 용액 합성을 포함한다.
일 구현예에서, 고상 OXM 합성 절차는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고 그리고 문헌 [John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Protein Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)]에 추가로 기재되어 있다. 또 다른 구현예에서, 합성 단백질은 예비 고성능 액체 크로마토 그래피에 의해 정제되고 [문헌 [Creighton T. (1983) Proteins, structure and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.]] 그리고 그의 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의한 아미노산 서열분석을 통해 확인될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM을 생성하기 위해 재조합 단백질 기술이 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 기술은 다량의 본 발명의 OXM의 생성을 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서, 재조합 기술은 문헌 [Bitter 등, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544], 문헌 [Studier 등 (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89], 문헌 [Brisson 등 (1984) Nature 310:511-514], 문헌 [Takamatsu 등 (1987) EMBO J. 6:307-311], 문헌 [Coruzzi 등 (1984) EMBO J. 3:1671-1680] 및 문헌 [Brogli 등, (1984) Science 224:838-843], 문헌 [Gurley 등 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565] 그리고 문헌 [Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 본 발명의 OXM을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 합성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 OXM을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 시스-조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열)의 전사 조절을 포함하는 발현 벡터 내로 결찰된다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본 발명의 OXM의 구성적 발현을 유도하는데 적합하다.
일 구현예에서, 어구 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 서열, 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열 (cDNA), 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합체 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들면, 상기의 조합)의 형태로 단리되고 제공된 단일 또는 이중가닥 핵산 서열을 지칭한다.
일 구현예에서, "상보적 폴리뉴클레오타이드 서열"은 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA 의존적 DNA 폴리머라제를 사용하여 메신저 RNA의 역전사로부터 유래하는 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열은 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 후속적으로 증폭될 수 있다.
일 구현예에서, "게놈 폴리뉴클레오타이드 서열"은 염색체로부터 유래된 (단리된) 서열을 지칭하고 따라서 이것은 염색체의 인접 부분을 나타낸다.
일 구현예에서, "복합체 폴리뉴클레오타이드 서열"은 적어도 부분적으로 상보적 및 적어도 부분적으로 게놈인 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 복합체 서열은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는데 요구된 일부 외래성 서열뿐만 아니라 그 중간에 삽입된 일부 인트론 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 다른 유전자를 포함하여 임의의 공급원일 수 있으며, 전형적으로 보존된 스플라이싱 신호 서열을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 인트론 서열은 시스 작용 발현 조절 인자를 포함할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 방법 또는 절차를 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 절차는 2개의 상이한 DNA 서열의 결찰을 포함한다 (예를 들면, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons, 1992] 참조). 일 구현예에서, 다양한 원핵 또는 진핵 세포가 본 발명의 OXM을 발현하는 숙주 발현 시스템으로 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이들은, 비제한적으로, 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터 함유 단백질 코딩 서열로 전환된 미생물, 예컨대 박테리아; 재조합 효모 발현 벡터 함유 단백질 코딩 서열로 전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터, 예컨대 Ti 플라스미드, 함유 단백질 코딩 서열로 전환된 식물 세포 시스템을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM을 발현하기 위해 비-박테리아 발현 시스템이 사용된다 (예를 들면 포유동물 발현 시스템 예컨대 CHO 세포). 일 구현예에서, 포유동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하기 위해 사용된 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 저항 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 박테리아 시스템에서, 발현된 단백질에 대한 의도된 사용에 의존하여 수많은 발현 벡터가 유익하게는 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 큰 양의 OXM이 바람직하다. 일 구현예에서, 발현된 생성물을 박테리아의 페리플라즘 또는 단백질 생성물이 쉽게 정제되는 배양 배지로 향하게 하는, 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 가능하게는 소수성 신호 서열과의 융합으로 유도하는 벡터가 바람직하다. 일 구현예에서, 특정 융합 단백질은 특정한 절단 부위와 조작되어 단백질의 회수를 돕는다. 일 구현예에서, 이러한 조작에 적응할 수 있는 벡터는 비제한적으로, E. 콜리 발현 벡터의 pET 시리즈를 포함한다 [문헌 [Studier 등, Methods in Enzymol. 185 : 60-89 (1990)]].
일 구현예에서, 효모 발현 시스템이 사용된다. 일 구현예에서, 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 수많은 벡터가 미국 특허 출원 번호: 5,932,447에 개시된 바와 같이 효모에 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 효모 염색체에 외래 DNa 서열의 편입을 증진하는 벡터가 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는, 예를 들면, 프로모터-키메라성 단백질의 게놈 통합을 위한 서열과 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)와 같은 단일 mRNA로부터 몇 개의 단백질의 번역을 허용하는 추가 폴리뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는, 비제한적으로, Invitrogen으로부터 이용가능한 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, Promega로부터 이용가능한 pCI, Strategene으로부터 이용가능한 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, Clontech으로부터 이용가능한 pTRES, 및 그것의 유도체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 진핵 바이러스 예컨대 레트로바이러스로부터 조절 인자를 함유하는 발현 벡터가 본 발명에 사용된다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 그리고 엡슈타인 Bar 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAM네오-5, 배큘로바이러스 pDSVE, 및 임의의 다른 벡터를 포함하여, SV-40 초기 프로모터, SV-40 후발 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥣과 유선 종양 바이러스 프로모터, 루 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적으로 나타난 다른 프로모터의 지령하에 단백질의 발현을 허용한다.
일 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 일 구현예에서, OXM 코딩 서열의 발현은 수많은 프로모터에 의해 유도된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스성 프로모터 예컨대 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 [문헌 [Brisson 등, Nature 310 : 511-514 (1984)]], 또는 TMV에 대한 코트 단백질 프로모터 [문헌 [Takamatsu 등, EMBO J. 6 : 307-311 (1987)]]이 사용된다. 또 다른 구현예에서, 식물 프로모터, 예컨대, 예를 들면 RUBISCO의 작은 소단위 [문헌 [Coruzzi 등, EMBO J. 3:1671-1680 (1984)]; 및 문헌 [Brogli 등, Science 224:838-843 (1984)]] 또는 열충격 프로모터, 예를 들면 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B [문헌 [Gurley 등, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]]가 사용된다. 일 구현예에서, 작제물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 전환, 미세주입, 전기천공 및 숙련가에게 잘 알려진 다른 기술을 사용하여 식물 세포 내로 도입된다. 예를 들면, 문헌 [Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]] 참조. 당해 기술에서 잘 알려진 다른 발현 시스템 예컨대 곤충 및 포유동물 숙주세포 시스템이 또한 본 발명에 의해 사용될 수 있다.
(단백질을 코딩하는) 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 것 이외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 단백질의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하도록 조작된 서열을 포함할 수 있다는 것이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 숙주세포 시스템 안으로 본 발명의 발현 벡터를 도입하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 그와 같은 방법은 일반적으로 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)], 문헌 [Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)], 문헌 [Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)], 문헌 [Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)], 문헌 [Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)] 및 문헌 [Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]]에 기재되어 있고 그리고, 예를 들면, 재조합 바이러스 벡터로 안정적인 또는 일시적 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법에 대해 미국 특허 번호 5,464,764 및 5,487,992를 참조한다.
일 구현예에서, 전환된 세포는 효과적인 조건하에서 배양되어, 다량의 재조합 OXM의 발현을 허용한다. 또 다른 구현예에서, 효과적인 배양 조건은, 비제한적으로, 단백질 생성을 허용하는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함한다. 일 구현예에서, 효과적인 배지는 세포가 배양되어 본 발명의 재조합 OXM을 생산하는 임의의 배지를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 배지는 전형적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원, 및 적절한 염, 무기질, 금속 및 다른 영양소, 예컨대 비타민을 갖는 수용액을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포는 통상적인 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 미세적정 접시 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 또 다른 구현예에서, 배양 조건은 당해 분야의 숙련가의 전문 기술 내에 있다.
일 구현예에서, 생산에 사용된 벡터 및 숙주 시스템에 따라, 얻어진 본 발명의 OXM은 재조합 세포 내에 남아 있거나, 발효 배지로 분비되거나, 세포 막 사이의 공간, 예컨대 E. 콜리 내의 페리플라즘 공간으로 분비되거나; 또는 세포 또는 바이러스성 막의 외면 상에 유지된다.
일 구현예에서, 배양물에서의 예정된 시간 후에, 재조합 OXM의 회수가 영향을 받는다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 어구 "재조합 OXM을 회수"는 OXM을 함유하는 전체의 발효 배지를 수집하는 것을 지칭하며, 분리 또는 정제의 추가 단계를 암시할 필요는 없다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 OXM은 화학적으로 변형될 수 있다. 특히, OXM의 아미노산 측쇄, 아미노 말단 및/또는 카복시 산 말단이 변형될 수 있다. 예를 들면, OXM은 알킬화, 디설파이드 형성, 금속 착물화, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 질화, 산으로 처리, 염기로 처리, 산화 또는 환원 중 하나 이상을 당할 수 있다. 이들 공정을 수행하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 특히 OXM은 더 낮은 알킬 에스테르, 더 낮은 알킬 아미드, 더 낮은 디알킬 아미드, 산 부가 염, 카복실레이트 염 또는 그것의 알칼리 첨가 염으로 제공된다. 특히, OXM의 아미노 또는 카복실 말단은 예를 들면, 에스테르화, 아미드화, 아실화, 산화 또는 환원에 의해 유도체화될 수 있다. 특히, OXM의 카복실 말단은 유도체화되어 아미드 모이어티를 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 변형은, 비제한적으로 N 말단 변형, C 말단 변형, 비제한적으로, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH를 포함한 펩타이드 결합 변형, 골격 변형, 및 잔기 변형을 포함한다. 펩타이드모사체 화합물을 제조하는 방법이 당해 기술에서 잘 알려져 있고, 그리고 예를 들면, 문헌 [Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)]에 특정되어 있고, 이것은 마치 완전히 제시된 것처럼 본 명세서에 참고로 편입된다. 이런 점에서 추가의 세부사항은 이하에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 펩타이드 내의 펩타이드 결합 (-CO-NH-) 치환된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 결합은 N-메틸레이트화된 결합 (-N(CH3)-CO-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 에스테르 결합 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 케토메틸렌 결합 (-CO-CH2-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 R이 임의의 알킬, 예를 들면, 메틸인 α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-), 카바 결합 (-CH2-NH-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 하이드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 티오아미드 결합 (-CS-NH-)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 결합은 올레핀성 이중 결합 (-CH=CH-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 레트로 아미드 결합 (-NH-CO-)에 의해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 펩타이드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)에 의해 치환되고, 여기서 R은 탄소 원자 상에 천연적으로 존재하는 "정상적" 측쇄이다. 일부 구현예에서, 이들 변형은 펩타이드 사슬을 따른 임의의 결합에서 그리고 심지어 동시에 몇 개 (2-3개의 결합)에서 발생한다.
일 구현예에서, 단백질의 천연 방향족 아미노산 예컨대 Trp, Tyr 및 Phe은 페닐글리신, TIC, 나프틸렐라닌 (Nol), Phe의 고리-메틸레이트화된 유도체, Phe 또는 o-메틸-Tyr의 할로겐화된 유도체와 같은 합성 비-천연 산에 대해 치환된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 1종 이상의 변형된 아미노산 또는 1종 이상의 비-아미노산 모노머 (예를 들면 지방산, 복합 탄수화물 등)를 포함한다.
야생형 OXM과 비교하여, 본 발명의 OXM 유도체 또는 변이체는 몇 개의 아미노산 치환체를 함유하고 및/또는 페길화될 수 있거나 또는 달리는 (예를 들면 재조합으로 또는 화학적으로) 변형될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 OXM은 또한 상기 OXM 서열의 임의의 유사체를 포함한다. 서열 중 임의의 1종 이상의 아미노산 잔기는 당해 기술에서 잘 알려진 바와 같이 보존적 치환체로 독립적으로 대체될 수 있는데, 즉 하나의 소수성 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것과 같은 유사한 화학 유형 중 하나로 아미노산을 대체한다. 대안적으로, OXM의 향상된 효과 또는 생물학적 활성을 초래하는 비-보존적 아미노산 돌연변이가 만들어질 수 있다. 일 구현예에서, OXM은 디펩티딜 펩티다아제 IV (DPP-IV)에 의한 절단 및 불활성화에 대해 저항성인 것으로 변형된다. OXM의 유도체 및 변이체 및 이를 생성하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0152182, 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0034374, 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0144617에 개시되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에서 참조로 편입된다.
일 구현예에서, "아미노산" 또는 "아미노산"은 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다; 예를 들면, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하여, 생체내에서 번역후 종종 변형된 이들 아미노산; 및 비제한적으로, 2-아미노아디프산, 하이드록실라이신, 이소데스모신, nor-발린, nor-류신 및 오르니틴을 포함하는 다른 흔치않은 아미노산. 일 구현예에서, "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 모두를 포함한다. 다른 합성 또는 변형된 아미노산도 또한 사용될 수 있다고 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 본 발명의 옥신토모둘린 (OXM)은 다양한 표준 단백질 정제 기술, 예컨대, 비제한적으로, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 차별적인 가용화를 사용하여 정제된다.
일 구현예에서, 회수를 용이하게 하기 위해, 발현된 코딩 서열은 본 발명의 단백질을 암호화하도록 조작될 수 있고 그리고 절단가능한 모이어티에 융합될 수 있다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해; 예를 들면, 절단가능 모이어티에 특이적인 컬럼 상에 고정시킴으로써 단백질이 쉽게 단리될 수 있도록 설계될 수 있다. 일 구현예에서, 절단 부위는 단백질과 절단가능 모이어티 사이에서 조작되고, 단백질은 이 부위에서 융합 단백질을 구체적으로 절단하는 적절한 효소 또는 제제로 처리함으로써 크로마토그래피 칼럼으로부터 방출될 수 있다 [예를 들면, 문헌 [Booth 등, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)]; 및 문헌 [Gardella 등, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)] 참고]. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 "실질적으로 순수한" 형태로 회수된다. 또 다른 구현예에서, 어구 "실질적으로 순수한"은 본 명세서에서 기재된 적용에서 OXM의 효과적인 사용을 허용하는 순도를 지칭한다.
일 구현예에서, 본 발명의 OXM은 또한 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당해 기술에서 잘 알려져 있고 시스템의 성분은 상업적으로 입수가능하다.
또 다른 구현예에서, 시험관내 결합 활성은 질환 또는 병태 예컨대 비제한적으로: 진성 당뇨병, 비만, 섭식 장애, 대사 장애, 등을 치료 또는 완화시키는, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 원상태, 재조합 및/또는 역 페길화된 OXM뿐만 아니라 이것을 포함하는 약제학적 조성물의 능력을 측정함에 의해 확인된다. 또 다른 구현예에서, 생체내 활성은 치료되어 지는 질환의 공지된 측정에 의해 추론된다.
또 다른 구현예에서, OXM-PEG-및 링커의 몰비는 1:1:1-1:1:3.5이다. 또 다른 구현예에서, 몰비는 1:1:1-1:1:10.0이다. 또 다른 구현예에서, 링커의 더 높은 비는 조성물의 생성을 최적화하도록 한다.
또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 부착된다. 또 다른 구현예에서, 용어들 "부착된" 및 "연결된"은 상호교환적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 α-아미노 측쇄에 연결된다. 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 OXM의 1종 이상의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 설프하이드릴 모이어티를 포함한다.
또 다른 구현예에서, PEG는 선형이다. 또 다른 구현예에서, PEG는 분지형이다. 또 다른 구현예에서, PEG는 200 내지 200,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PEG는 5,000 내지 80,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PEG는 5,000 내지 40,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다. 또 다른 구현예에서, PEG는 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위인 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, PEG30은 30,000 Da의 평균 분자량을 갖는 PEG를 지칭한다. PEG40은 40,000 Da의 평균 분자량을 갖는 PEG를 지칭한다.
생물학적 활성
또 다른 구현예에서, 본 발명의 역 페길화 OXM은 OXM에 지속성 OXM을 부여한다. 또 다른 구현예에서, 지속성 옥신토모둘린은 확장된 생물학적 반감기를 갖는 옥신토모둘린이다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 분해에 대한 보호를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 DPPIV에 의한 OXM의 분해에 대한 보호를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 Cmax에 영향을 미치고, 본 명세서에서 제공된 콘주게이트의 투여와 관련된 부작용을 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 Tmax를 연장시킨다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 순환성 반감기를 연장시킨다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM과 비교하여 개선된 생체 이용률을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM에 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 효능을 향상시킨다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 개선된 인슐린 감수성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 용량- 의존적으로 말단 글루코스를 감소시킨다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 용량- 의존적으로 인슐린을 감소시킨다.
다른 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 생화학적 측정에 관하여 비-변형된 OXM에 적어도 동등하다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 약리적 측정에 관하여 비-변형된 OXM에 적어도 동등하다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 결합능 (Kd)에 관하여 비-변형된 OXM에 적어도 동등하다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 소화계를 통한 흡수에 관하여 비-변형된 OXM에 적어도 동등하다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 비-변형된 OXM보다 소화계를 통한 흡수 동안 더 안정적이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 혈액 곡선하 면적 (AUC) 수준을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 곡선하 면적 (AUC) 수준을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 혈액 체류 시간 (t1 /2)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 체류 시간 (t1 /2)을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 혈액 Cmax 수준을 나타내고, 여기서 또 다른 구현예에서, 이것은 본 명세서에서 제공된 역 페길화된 조성물의 투여와 관련된 부작용을 감소하는 더 낮은 방출 과정을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM에 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 Cmax 수준을 나타낸다. 또 다른 구현예에서, 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하거나 또는 이들로 구성된 OXM의 AUC, Cmax, t1 /2, 생물학적 활성, 또는 이들의 임의의 조합을 개선하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합함에 의해 OXM의 AUC, Cmax, t1 /2, 생물학적 활성, 또는 이들의 임의의 조합의 개선은 OXM의 투여 빈도에서의 감소를 가능하게 한다. 또 다른 구현예에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 OXM의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계를 포함하거나 또는 이들로 구성된, OXM의 투여 빈도를 감소하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM의 역 페길화는 더 낮은 복용량이 사용되도록 허용하는데 유리하다. 일 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM은 비변형된 OXM의 생물학적 활성을 유지한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM은 OXM 생물학적 활성을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 소화의 분비를 감소하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 위 배출을 감소 및 지연하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 소장에서 섭취음식 운동 패턴의 억제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 펜타가스트린에 의해 자극된 산 분비의 억제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 위 소마토스타틴 방출의 증가를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 펩타이드 YY의 효과를 강화하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 그렐린 방출의 억제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 아미노피린 축적 및 cAMP 생산의 자극을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 GLP-1 수용체를 결합하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 글루카곤 수용체를 결합하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 아데닐레이트 사이클라제를 활성화함에 의해 H+ 생산을 자극하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 히스타민-자극된 위산 분비를 억제하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 음식 섭취를 억제하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 방출을 자극하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 외분비 췌장 분비를 억제하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 감수성을 증가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 글루코스 수준을 감소하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 말단 글루코스를 감소하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 인슐린을 감소하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 1:1:1의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 접합하는 단계로 구성되는, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법을 추가로 제공되고, 여기서, 또 다른 구현예에서, PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 또는 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 1:1:1의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 접합하는 단계로 구성되는, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 1:1:1의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 접합하는 단계로 구성되는, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 1:1:1의 몰비로 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 접합하는 단계로 구성되는, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 PEG 폴리머는 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 접합된다.
일 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 또는 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 곡선하 면적 (AUC)을 개선하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기 또는 위치 번호 30 상의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 12 상의 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 위치 번호 30 상의 라이신 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 선택적으로 치환된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 또는 설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMS)을 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 (PEG 폴리머)를 접합하는 단계로 구성된, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 음식 섭취를 감소하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 체중을 감소하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈당 조절을 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈당 및 지질 프로파일을 개선하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈당 프로파일을 개선하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 지질 프로파일을 개선하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
본 명세서에서 제공된 아미노 변이체, 예를 들면 FMS가 말단 아미노기를 통해 OXM에 연결된 변이체는 예상외로 본 명세서에서 예시된 바와 같이 감소된 음식 섭취, 중량 조절 및 혈당 조절을 달성한다 (실시예 5 참조). 일 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 OXM 펩타이드의 PEG 변형은 예상외로 OXM 기능을 방해하지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 콜레스테롤 수준을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.. 또 다른 구현예에서, 콜레스테롤 수준을 개선하는 것은 대상체에서 LDL 콜레스테롤을 감소하면서 HDL 콜레스테롤을 증가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 200mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준 약 100-129mg/dL로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 100mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 700mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 5.2mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 약 2.6 내지 3.3 mmol/L로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 2.6mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다. 또 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 1.8mg/dL 이하이지만, 0mg/dL 이상으로 감소된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 유효량의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인슐린 내성을 감소하는 방법을 추가로 제공한다. 또 다른 구현예에서, 콘주게이트는 식 I-IV의 구조에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 미주신경 간접적 기전을 통해 췌장 분비를 억제하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 소장을 통한 하이드로미네랄 전달을 감소하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 글루코스 흡수를 자극하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 소마토스타틴 분비를 조절/자극하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 음식 섭취 및 체중 증가 모두에서 감소를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 지방과다의 감소를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 식욕 억제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 혈당 및 지질 프로파일을 개선하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 식욕부진의 유도를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 과체중 및 비만인 대상체에서 체중을 감소하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 지방질 호르몬 렙틴 및 아디포넥틴의 수준에서 변화를 유도하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM의 생물학적 활성은 과체중 및 비만인 대상체에서 에너지 섭취를 감소하는 것에 부가하여 에너지 소모를 증가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM은 식 I-IV의 콘주게이트이다.
제조 방법
또 다른 구현예에서, 본 발명의 지속성 OXM은, Fmoc 또는 FMS 모이어티의 플루오렌 고리에 존재하는, 작용기 예컨대, 비제한적으로, NH2, OH, SH, COOH, CHO, --N=C=O, --N=C=S, --SO2Cl, --SO2CH=CH2, --PO2Cl, --(CH2)xHal와 반응할 수 있는 의미 임의의 PEG 유도체인 페길화 제제를 사용하여 제조된다. 또 다른 구현예에서, 페길화 제제는 PEG 분자의 일 말단에서 단 하나의 하이드록실기가 콘주게이션에 이용가능한 그것의 모노-메톡실레이트화된 형태로 일반적으로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 양 말단이 콘주게이션에 이용가능한 PEG의 이중작용성 형태가, 예를 들면, 단일 PEG 모이어티에 공유결합된 2개의 펩타이드 또는 단백질 잔기를 갖는 콘주게이트를 얻는 것이 요망되는 경우에 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 분지형 PEG는 R(PEG-OH)m으로 표시되고 여기서 R은 중심 핵 모이어티 예컨대 펜타에리트리톨 또는 글리세롤을 나타내고, m이 분지 아암의 수를 나타낸다. 분지 아암의 수 (m)는 3에서 100 이상까지의 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 하이드록실기는 화학적 변형을 겪는다. 또 다른 구현예에서, 분지형 PEG 분자 하기에서 기재되어 있다: 미국 특허 번호 제6,113,906호, 제5,919,455호, 제5,643,575호 및 제5,681,567호로, 이들은 그 전문이 참고로 여기에 편입된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표준 페길화 절차에서와 같이 OXM에 직접적으로 부착되지 않는 PEG 모이어티를 갖는 OXM을 제공하지만, 오히려 PEG 모이어티는 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS와 같은 링커를 통해 부착된다. 또 다른 구현예에서, 링커는 염기에 매우 민감하고 온화한 염기성 조건하에서 제거 가능하다. 또 다른 구현예에서, 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM에 대해 동등하게 활성이다. 또 다른 구현예에서, 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM보다 더 활성이다. 또 다른 구현예에서, 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과 상이한 활성을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 자유 OXM과 달리 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 중추신경계 활성이 없다. 또 다른 구현예에서, 자유 OXM과 달리 선택적으로 치환된 Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 혈액 뇌 장벽을 통해 뇌에 진입할 수 없다. 또 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM에 비교해 확장된 순환 반감기를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 Fmoc 또는 FMS 모이어티와 함께 그것의 PEG 모이어티를 손실하여 유리 OXM을 회수한다.
또 다른 구현예에서, OXM의 페길화 및 (PEG-S-MAL-Fmoc)n- OXM 또는 (PEG-S-MAL-FMS)n-OXM 콘주게이트의 제조는 OXM의 아민 성분에 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 부착하는 단계, 따라서 MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM 콘주게이트를 얻는 단계, 그리고 그 다음 PEG-SH를 MAL-FMS-OXM 상의 말레이미드 모이어티와 반응시키는 단계, PEG-S-MAL-FMS-OXM 또는 PEG-S_MAL-Fmoc-OXM, (PEG-S-MAL-FMS)n- OXM 또는 (PEG-S-MAL-Fmoc)n- OXM 콘주게이트를 각각 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, MAL-Fmoc-NHS는 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00015
.
또 다른 구현예에서, MAL-FMS-NHS는 하기 구조에 의해 표시된다
Figure pct00016
일 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
또 다른 구현예에서, MAL-Fmoc-OXM은 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00017
.
또 다른 구현예에서, MAL-FMS-OXM은 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00018
일 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
또 다른 구현예에서, (PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM은 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00019
또 다른 구현예에서, (PEG-S-MAL-FMS)n-OXM은 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00020
일 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
또 다른 구현예에서, OXM의 페길화는 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 PEG-SH와 반응시키는 단계, 따라서 PEG-S-MAL-FMS-NHS 또는 PEG-S-MAL-Fmoc-NHS 콘주게이트를 형성하는 단계, 그리고 그 다음 이것은 OXM의 아민 성분과 반응시켜 요망된 (PEG-S-MAL-FMS)n- OXM 또는 (PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM 콘주게이트 각각을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 펩타이드/단백질 예컨대 OXM의 페길화는 미국 특허 번호 7585837에 기재되어 있고, 이것은 그 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다. 또 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS로 펩타이드/단백질 예컨대 OXM의 역-페길화는 미국 특허 번호 7585837에 기재되어 있다.
또 다른 구현예에서, PEG-S-MAL-Fmoc-NHS는 하기 구조에 의해 표시된다
Figure pct00021
.
또 다른 구현예에서, PEG-S-MAL-FMS-NHS는 하기 구조에 의해 표시된다:
Figure pct00022
일 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 2에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 3에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 4에 있다. 또 다른 구현예에서, SO3H는 플루오렌의 위치 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 임의의 조합에 있다.
또 다른 구현예에서, 어구 "지효성 OXM" 및 "역 페길화된 OXM"은 상호교환적으로 사용되고 본 발명의 콘주게이트를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 식: (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM에 의해 확인된 본 명세서에서의 PEG-FMS-OXM 및 PEG-Fmoc-OXM으로 구성되고, 여기서 n은 적어도 1의 정수이고, OXM은 적어도 1종의 아미노기를 통해 FMS 또는 Fmoc 라디칼에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 식: (PEG-S-MAL-FMS)n-OXM 또는 (PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM에 의해 확인된 본 명세서에서의 PEG-S-MAL-FMS-OXM 및 PEG-S-MAL-Fmoc-OXM으로 구성되고, 여기서 n은 적어도 1의 정수이고, OXM은 적어도 1종의 아미노기를 통해 FMS 또는 Fmoc 라디칼에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 PEG-S-MALFmoc-OXM 또는 PEG-S-MALFMS-OXM을 제조하는 공정을 제공하고 여기서 상기 OXM의 아미노 말단은 Fmoc 또는 FMS에 연결되고 그리고 여기서 상기 OXM은 서열식별번호: 1 [His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]로 제시된 아미노산 서열로 구성되고,
상기 공정은 MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM:
Figure pct00023
MAL-Fmoc-NHS
또는
Figure pct00024
MAL-FMS-NHS
를 옥신토모둘린 수지와 반응시키는 단계로, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기는 보호됨;
MAL-Fmoc-보호된 OXM 또는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻고, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기는 각각 보호됨,
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응하여, 여기서 상기 보호기 및 수지를 제거하는 것은 PEG-SH와 상기 반응 후 또는 전에 수행됨;
PEG-S-MAL-Fmoc-OXM 또는 PEG-S-MALFMS-OXM을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 상기 OXM의 아미노 말단은 Fmoc 또는 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 PEG-S-MAL-Fmoc-OXM 또는 PEG-S-MALFMS-OXM 콘주게이트를 제조하는 공정을 제공하고, 여기서 상기 OXM의 Lys12의 상기 아미노 잔기는 상기 Fmoc 또는 FMS에 연결되고 그리고 상기 옥신토모둘린 (OXM)은 서열식별번호: 1 [His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]로 제시된 아미노산 서열로 구성되고,
상기 공정은 MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM:
Figure pct00025
MAL-Fmoc-NHS
또는
Figure pct00026
MAL-FMS-NHS
를 옥신토모둘린 수지와 반응시키는 단계로, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기 (Lys12를 포함하지 않음) 및 His1의 아미노 말단은 보호됨;
MAL-Fmoc-보호된 OXM 또는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻고, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기 (Lys12를 포함하지 않음) 및 His1의 아미노 말단은 각각 보호됨,
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응하여, 여기서 상기 보호기 및 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
PEG-S-MAL-Fmoc-OXM 또는 PEG-S-MAL-FMS-OXM을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 상기 OXM의 Lys12의 상기 아미노 잔기는 상기 Fmoc 또는 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 PEG-S-MAL-Fmoc-OXM 또는 PEG-S-MALFMS-OXM 콘주게이트를 제조하는 공정을 제공하고, 여기서 상기 OXM의 Lys30의 상기 아미노 잔기는 상기 Fmoc 또는 FMS에 연결되고 그리고 상기 옥신토모둘린 (OXM)은 서열식별번호: 1 [His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]로 제시된 아미노산 서열로 구성되고,
상기 공정은 MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM:
Figure pct00027
MAL-Fmoc-NHS
또는
Figure pct00028
MAL-FMS-NHS
를 옥신토모둘린 수지와 반응시키는 단계로, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기 (Lys30을 포함하지 않음) 및 His1의 아미노 말단은 보호됨;
MAL-Fmoc-보호된 OXM 또는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻고, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노 잔기 (Lys30을 포함하지 않음) 및 His1의 아미노 말단은 각각 보호됨,
그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응하여, 여기서 상기 보호기 및 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
PEG-S-MALFmoc-OXM 또는 PEG-S-MALFMS-OXM을 얻는 단계를 포함하고, 여기서 상기 OXM의 Lys12의 상기 아미노 잔기는 상기 Fmoc 또는 FMS에 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS의 제조 방법을 제공하고:
Figure pct00029
,
상기 방법은 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가된다
일 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 2 내지 20 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 2 내지 10 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 2 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 3 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 4 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 5 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 7 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 8 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 9 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 10 당량의 클로로설폰산의 사용과 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 3 당량의 클로로설폰산의 사용을 포함한다.
일 구현예에서, 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 클로로설폰산의 사용을 포함하는 MAL-Fmoc-NHS로부터 TFA 염으로 MAL-FMS-NHS의 제조 방법은 80% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 순수한 중간체 MAL-FMS-NHS - TFA 염을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 85% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 순수한 중간체 MAL-FMS-NHS - TFA 염을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 90% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 순수한 중간체 MAL-FMS-NHS - TFA 염을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 95% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 순수한 중간체 MAL-FMS-NHS - TFA 염을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 98% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 순수한 중간체 MAL-FMS-NHS - TFA 염을 초래한다.
일 구현예에서, MAL-FMS-NHS - TFA 염은 식 I, II, IIa, III 및 IV의 콘주게이트를 제조하는 방법에 중간체로 사용되어, 85% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 콘주게이트를 초래한다. 또 다른 구현예에서, 90% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 콘주게이트를 초래한다. 또 다른 구현예에서, 95% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 콘주게이트를 초래한다. 또 다른 구현예에서, 98% 내지 100% 사이의 순도를 갖는 콘주게이트를 초래한다.
또 다른 구현예에서, OXM의 Lys12 또는 Lys30 또는 아미노 말단에 PEG-S-MALFmoc 또는 PEG-S-MALFMS의 콘주게이션은 OXM에 불활성을 부여하지 않는다.
일 구현예에서, Lys12 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 제공하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 Lys30 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 달성하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 달성하는데 더 효과적이다.
일 구현예에서, Lys12 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 만성 혈당 조절을 달성하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 Lys30 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 만성 혈당 조절을 달성하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 혈당 조절을 달성하는데 더 효과적이다.
추가 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 제공하는데 더 효과적이다. 추가 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 혈당 조절을 달성하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 체중 감소에 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 누적 음식 섭취의 감소에 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 혈장 글루코스 흡수의 감소에 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 내당능을 개선하는데 더 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 말단 혈장 콜레스테롤 수준의 감소에 더 효과적이다.
일 구현예에서, PEG-S-MAL-Fmoc-OXM은 말단 혈장 프룩토스아민 수준의 감소에 효과적이다. 또 다른 구현예에서, PEG-EMCS-OXM은 말단 혈장 프룩토스아민 수준의 감소에 효과적이다. 또 다른 구현예에서, PEG30-S-MAL-FMS-OXM의 아미노 변이체는 말단 혈장 프룩토스아민 수준의 감소에 효과적이다. 또 다른 구현예에서 PEG30-S-MAL-FMS-OXM의 아미노 변이체는 본 명세서에서 제공된 다른 변이체보다 말단 혈장 프룩토스아민 수준의 감소에 더 효과적이다.
약제학적 조성물 및 사용 방법
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 콘주게이트와 캐리어 및 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 콘주게이트는 식 I-IV에 의해 표시된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 (일 구현예에서, 2형 당뇨병), 인슐린-의존적 진성 당뇨병 (일 구현예에서, 1형 당뇨병), 및 임신성 진성 당뇨병, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 진성 당뇨병의 치료를 위해, 혈당 조절을 개선하기 위한 고혈당증의 예방에 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2형 당뇨병을 치료하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 인슐린에 대한 감수성을 증가하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 인슐린 내성을 감소하기 위해 이용된다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 식욕의 억제를 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 포만을 유도하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중의 감소를 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체지방의 감소를 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체질량 지수의 감소를 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 음식 소비의 감소를 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 비만을 치료하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 비만과 관련된 진성 당뇨병을 치료하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 심박수를 증가하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 기초대사율 (BMR)을 증가하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 에너지 소모를 증가하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 내당능을 유도하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 혈당 및 지질 프로파일을 개선하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 혈당 조절을 유도하기 위해 이용된다. 일 구현예에서, 혈당 조절은 높지 않고 및/또는 변동하지 않는 혈당 수준 및/또는 높지 않고 및/또는 변동하지 않는 당화된 헤모글로빈 수준을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 중량 증가를 억제하기 위해 이용되고, 여기서 또 다른 구현예에서, 중량 증가는 지방 증가에 기인한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 혈당 수준을 감소하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 칼로리 섭취를 감소하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 식욕을 감소하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 조절을 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 감소를 유도 또는 증진하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 요망된 체중, 요망된 체질량 지수, 요망된 외관 및 양호한 건강 중 임의의 하나 이상을 유지하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 프로파일을 제어하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 트리글리세라이드 수준을 감소하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 글리세롤 수준을 감소하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 아디포넥틴 수준을 증가하기 위해 이용된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 유리 지방산 수준을 감소하기 위해 이용된다.
일 구현예에서, 용어들 "수준을 감소하는 것"은 최초, 야생형, 정상 또는 대조군 수준에 비교하여 약 1-10%의 감소를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 11-20%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 21-30%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 31-40%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 41-50%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 51-60%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 61-70%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 71-80%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 81-90%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 91-95%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 감소는 약 96-100%의 것이다.
일 구현예에서, 용어들 "수준을 증가하는 것" 또는 "연장하는 것"은 최초, 야생형, 정상 또는 대조군 수준에 비교하여 약 1-10%의 증가를 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 11-20%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 21-30%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 31-40%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 41-50%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 51-60%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 61-70%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 71-80%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 81-90%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 91-95%의 것이다. 또 다른 구현예에서, 증가는 약 96-100%의 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 감소하기 위해 이용된다. 일 구현예에서, 콜레스테롤 수준에서의 감소는 원상태 OXM의 투여 후에 관측된 감소보다 더 크다. 일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 60-70% 낮춘다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 50-100% 낮춘다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 25-90% 낮춘다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 50-80% 낮춘다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 40-90% 낮춘다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 HDL 콜레스테롤 수준을 증가하기 위해 이용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 투여의 과정에 걸쳐 유효성에서 상당한 감소 없이 본 명세서에서 기재된 목적을 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1일 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2-6일 동안 유효하다. 일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1주 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2주 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 3주 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 4주 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 6주 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2개월 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 6개월 동안 유효하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 유효하다.
일 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 목적을 위해 사용될 수 있고 그리고 첫 번째 용량의 투여에 의해 즉시 효과적일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2회 이상 용량이 투여되어 진 후 효과적이다.
또 다른 구현예에서, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 OXM에 의해 경감, 억제, 및/또는 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 앓고 있는 인간 대상체에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 수의과 방법이다. 또 다른 구현예에서, 상기에 기재된 바와 같이 본 발명의 콘주게이트 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 동물 예컨대 농장 동물, 애완동물, 및 실험실 동물에 적용된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 대상체는 고양이, 갯과, 소, 돼지, 쥣과, 아퀸, 등이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 콘주게이트를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 OXM 또는 이를 포함하는 약제학적 제형에 의해 치료가능 또는 감소가능한 질환을 치료 또는 감소시키는 방법을 제공하고, 이로써 대상체에서 OXM에 의해 치료가능 또는 감소가능한 질환을 치료 또는 감소한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 OXM, "펩타이드" 또는 "단백질"은 원상태 펩타이드 (분해 생성물, 합성으로 합성된 단백질 또는 재조합 단백질의 어느 하나) 및 펩타이드모사체 (전형적으로, 합성으로 합성된 단백질)뿐만 아니라, 일부 구현예에서, 단백질을 신체 내에 있는 동안 더욱더 안정하게 하거나 세포 안으로 보다 많이 침투할 수 있는 변형을 갖는, 단백질 유사체인 펩토이드 및 세미펩토이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, "PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체"는 본 발명의 콘주게이트이다. 또 다른 구현예에서, "PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체"는 각각 PEG-S-MAL-Fmoc-OXM 또는 PEG-S-MAL-FMS-OXM을 지칭하고 본 발명의 콘주게이트이다.. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 식 I-IV에 의해 표시된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 FMS 또는 Fmoc의 어느 하나를 통해 PEG 연결 OXM이고, 여기서 상기 OXM은 OXM의 Lys12를 통해, 또는 OXM의 Lys30을 통해, 또는 OXM의 아미노 말단을 통해 FMS 또는 Fmoc의 어느 하나에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사가능 용액에 0.005 내지 0.1 밀리그램/kg 사이의 본 발명의 OXM 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 0.005 내지 0.5 밀리그램/kg OXM 펩타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 0.05 내지 0.1 마이크로그램 OXM 펩타이드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 1일 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 36시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 48시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 60시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 72시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 84시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 96시간 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 5일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 6일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 7일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 8-10일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 10-12일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 12-15일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트를 포함하는 약제학적 조성물은 매 15-25일 마다 한번 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 1주 1회 근육내 (IM) 주사, 피하 (SC) 주사, 또는 정맥내 (IV) 주사에 의해 투여된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 콘주게이트는 개체 그 자체에 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 이것이 약제학적으로 허용가능한 캐리어와 혼합된 약제학적 조성물의 일부로서 개체에 제공될 수 있다.
또 다른 구현예에서, "약제학적 조성물"은 다른 화학 성분 예컨대 생리적으로 적합한 캐리어 및 부형제와 본 명세서에서 기재된 바와 같은 지속성 OXN의 제제를 지칭한다. 약제학적 조성물의 목적은 화합물을 유기체에 투여하는 것을 용이하게 하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 생물학적 효과에 대해 책임 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 콘주게이트, 약제학적으로 허용가능한 캐리어 및 부형제를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 임의의 조성물은 적어도 역 페길화된 OXM을 포함할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 조합된 제제를 제공한다. 일 구현예에서, "조합된 제제"는 상기에서 정의된 바와 같이 조합 파트너가 독립적으로 또는 조합된 파트너의 현저한 양과 상이한 고정된 조합의 사용에 의해, 즉 동시에, 동반하여, 개별적으로 또는 순차적으로 복용될 수 있다는 점에서 특히 "부품들의 키트"를 정의한다. 일부 구현예에서, 부품들의 키트의 일부는 그런 다음, 예를 들면 동시에 또는 시간순으로 엇갈려서, 즉 상이한 시점에서 그리고 부품들의 키트의 임의의 일부에 대해 동등 또는 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조합 파트너의 총량의 비는 조합된 제제로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 조합된 제제는 예를 들면, 치료될 환자 하위집단의 필요 또는 상이한 필요가 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 이루어질 수 있는 바와 같은 특정한 질환, 질환의 중증도, 연령, 성별, 또는 체중에 기인할 수 있는 단일 환자의 필요에 대처하기 위해, 다변할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상호교환적으로 사용되는, 어구 "생리적으로 허용가능한 캐리어" 및 "약제학적으로 허용가능한 캐리어"는 유기체에 상당한 자극을 유발하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 캐리어 또는 희석제를 지칭한다. 아쥬반트가 이들 어구에 포함된다. 일 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 캐리어에 포함된 성분 중 하나는 예를 들면 유기 및 수성 매질 양자에서 광범위한 용해도를 갖는 생체적합성 폴리머인, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)일 수 있다 (문헌 [Mutter 등 (1979]).
또 다른 구현예에서, "부형제"는 지속성 OXN의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가된 불활성 물질을 지칭한다. 일 구현예에서, 부형제는 탈산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
제형을 위한 기술 및 약물의 투여는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판]에서 찾아볼 수 있고, 이것은 본 명세서에 참고로 편입된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드의 적합한 투여 경로는, 예를 들면, 경구, 직장, 경점막, 경비, 근육내, 피하 및 수질내 주사를 포함한, 장 또는 비경구 전달뿐만 아니라 척추강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안구내 주사를 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 기재된 임의의 치료 방법을 위해 뇌에 주변 경로에 의한 투여용 약제의 제조에 사용하기 위한 역 페길화된 OXM을 포함한다. 주변 경로의 예는 경구, 직장, 비경구 예를 들면 정맥내, 근육내, 또는 복강내, 점막 예를 들면 구강, 설하, 비강, 흡입에 의한 투여를 포함하는 피하 또는 경피 투여를 포함한다. 약제에 대한 OXM의 바람직한 용량은 아래에 제시된다.
본 발명은 경구, 직장, 비경구 예를 들면 정맥내, 근육내, 또는 복강내, 점막 예를 들면 구강, 설하, 비강, 흡입에 의한 투여를 포함하는 피하 또는 경피 투여에 적합한 형태로 역 페길화된 OXM 및 약제학적으로 적합한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 단위 복용 형태인 경우, 단위당 용량은, 예를 들면, 아래에 기재된 바와 같이 될 수 있거나 또는 아래에 주어진 kg당 용량에 기초하여 계산된 바와 같이 될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제제는 전신 방식보다는 국부로, 예를 들면, 환자의 신체의 특정 영역안으로 직접적으로 제제의 주입을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 비강내 복용 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 주사가능 복용 형태로 제형화된다.
복용 범위의 다양한 구현예가 본 발명에 의해 고려된다: 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 3일당 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다 (PEG의 크기가 실질적으로 상이할 수 있기 때문에, 역 페길화된 OXM 조성물 내의 OXM의 중량만이 제공됨). 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 7일당 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 10일당 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 14일당 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, 역 페길화된 OXM 조성물에서 유효량의 OXM은 유효량의 유리 OXM의 1/4-1/10이다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 50%로 제한할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 70%로 제한할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 75%로 제한할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 80%로 제한할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 예상외로, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 85%로 제한할 수 있다. 또 다른 구현예에서, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을, 유리 OXM과 비교하여 적어도 90%로 제한할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 매 3일 마다 한번 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다 (PEG의 크기가 실질적으로 상이할 수 있기 때문에, 역 페길화된 OXM 조성물 내의 OXM의 중량만이 제공됨). 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 매 7일 마다 한번 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 매 10일 마다 한번 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물의 내에 OXM 펩타이드 성분은 매 14일 마다 한번 0.01-0.5 밀리그램/체중 kg의 범위로 투여된다.
또 다른 구현예에서, 유리 OXM에 비교하여 역 페길화된 OXM은 적어도 2-배로 효과적인 투여 빈도를 감소하고 적어도 2-배로 효과적인 매주 용량을 모두 감소하고, 따라서 유해 사례의 위험을 제한하고 그리고 OXM 요법의 사용과 순응도를 증가한다. 또 다른 구현예에서, 유리 OXM에 비교하여 역 페길화된 OXM은 적어도 3-배로 효과적인 투여 빈도를 감소하고 적어도 3-배로 효과적인 매주 용량을 모두 감소하고, 따라서 유해 사례의 위험을 제한하고 그리고 OXM 요법의 사용과 순응도를 증가한다. 또 다른 구현예에서, 유리 OXM에 비교하여 역 페길화된 OXM은 적어도 4-배로 효과적인 투여 빈도를 감소하고 적어도 4-배로 효과적인 매주 용량을 모두 감소하고, 따라서 유해 사례의 위험을 제한하고 그리고 OXM 요법의 사용과 순응도를 증가한다. 또 다른 구현예에서, 유리 OXM에 비교하여 역 페길화된 OXM은 적어도 5-배로 효과적인 투여 빈도를 감소하고 적어도 5-배로 효과적인 매주 용량을 모두 감소하고, 따라서 유해 사례의 위험을 제한하고 그리고 OXM 요법의 사용과 순응도를 증가한다. 또 다른 구현예에서, 유리 OXM에 비교하여 역 페길화된 OXM은 적어도 6-배로 효과적인 투여 빈도를 감소하고 적어도 6-배로 효과적인 매주 용량을 모두 감소하고, 따라서 유해 사례의 위험을 제한하고 그리고 OXM 요법의 사용과 순응도를 증가한다. 또 다른 구현예에서, 효과적인 투여 빈도 및 효과적인 매주 용량은: (1) 역 페길화된 OXM 조성물 내의 투여된 OXM 성분의 중량; 및 (2) 유리 OXM (비변형된 OXM) 조성물 내의 투여된 OXM 성분의 중량에 기반한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM 요법을 필요로 하는 만성 병을 앓고 있는 환자의 순응도를 증가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기에 기재된 바와 같은 역 페길화 OXM에 의해 OXM의 투여 빈도에서의 감소를 가능하게 한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM의 투여 빈도를 감소함에 의해 OXM 요법의 필요가 있는 환자의 순응도를 증가하는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에서 감소는 OXM을 더 안정적이고 더 강하게 하는 역 페길화 덕분에 달성된다. 또 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에서의 감소는 OXM의 T1/2을 증가한 결과로 달성된다. 또 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에서의 감소는 OXM의 혈액 청소능을 감소한 결과로 달성된다. 또 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에서의 감소는 OXM의 T1/2을 증가한 결과로 달성된다. 또 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에서의 감소는 OXM의 AUC 척도를 증가한 결과로 달성된다.
또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 1일 1회 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 이틀마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 3일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 4일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 5일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 6일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매주 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 7-14일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 10-20일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 5-15일 마다 한번 투여된다. 또 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 대상체에 매 15-30일 마다 한번 투여된다.
일 구현예에서, 경구 투여는 정제, 캡슐, 로젠지, 씹을 수 있는 정제, 현탁액, 에멀젼 및 기타 동종의 것을 포함하는 단위 복용 형태를 포함한다. 그와 같은 단위 복용 형태는 안전한 및 유효량의 본 발명의 OXM을 포함하고, 이들 각각은 일 구현예에서, 약 0.7 또는 3.5mg 내지 약 280mg/70kg, 또는 또 다른 구현예에서, 약 0.5 또는 10mg 내지 약 210mg/70kg이다. 경구 투여용 단위 복용 형태의 제제에 적합한 약제학적으로-허용가능한 캐리어는 당해 기술에서 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 정제는 전형적으로 불활성 희석제, 예컨대 탈산칼슘, 탄산나트륨, 만니톨, 락토오스 및 셀룰로오스; 결합제 예컨대 전분, 젤라틴 및 수크로오스; 붕괴제 예컨대 전분, 알긴산 및 크로스카르멜로스; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 및 탈크와 같은 통상적인 약제학적으로-양립가능한 아쥬반트를 포함한다. 일 구현예에서, 분말-혼합물의 유동 특성을 개선하기 위해 활윤제 예컨대 실리콘 디옥사이드가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 착색제, 예컨대 FD&C 염료가 외관을 위해 첨가될 수 있다. 감미제 및 풍미제, 예컨대 아스파르탐, 사카린, 멘톨, 박하, 및 과일 풍미제는 씹을 수 있는 정제에 대해 유용한 아쥬반트이다. 캡슐은 전형적으로 상기에 개시된 1종 이상의 고형 희석제를 포함한다. 일부 구현예에서, 캐리어 성분의 선택은 본 발명의 목적에 결정적이지 않고 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 이루어질 수 있는 맛, 비용, 및 저장 안정성 같은 2차 고려사항들에 좌우된다.
일 구현예에서, 경구 복용 형태는 사전규정된 방출 프로파일을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 연장된 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 서방형 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 경구 복용 형태는 즉시 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹을 수 있는 정제를 포함한다. 일 구현예에서, 경구 복용 형태는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 지속성 OXN의 요망된 방출 프로파일에 따라 제형화된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 조성물은 용액 또는 에멀젼을 포함하고, 또 다른 구현예에서 이것은 안전한 및 유효량의 본 발명의 화합물 및 선택적으로, 국소 비강내 투여를 위해 의도된 다른 화합물을 포함하는 수용액 또는 에멀젼이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은, 비강내 경로에 의해 화합물의 전신 전달을 위해 사용되는, 약 0.001% 내지 약 10.0% w/v의 대상 화합물, 더 바람직하게는 약 00.1% 내지 약 2.0를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 액상 제제의 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 액체 제형은 용액, 현탁액, 분산물, 에멀젼, 오일 및 기타 동종의 것을 포함한다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내로 투여되고, 그리고 따라서 정맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 동맥내로 투여되고, 그리고 따라서 동맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 근육내로 투여되고, 그리고 따라서 근육내 투여에 적합한 형태로 제형화된다.
또한, 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 체표면에 국소로 투여되고, 그리고 따라서 국소 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형은 겔, 연고, 크림, 로션, 드롭스 및 기타 동종의 것을 포함한다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 추가 적절한 치료제 또는 제제와 조합되고, 약제학적 캐리어를 갖거나 갖지 않는 생리적으로 허용가능한 희석제에 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로 제조되고 적용된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 기술에서 잘 알려진 공정, 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제작, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 포획화 또는 동결화 공정의 수단에 의해 제조된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 제제로 OXM의 가공을 용이하게 하는, 약제학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조물을 포함하는 1종 이상의 생리적으로 허용가능한 캐리어를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화된다. 일 구현예에서, 제형은 선택된 투여 경로에 의존적이다.
일 구현예에서, 본 발명의 주사제는 수용액으로 제형화된다. 일 구현예에서, 본 발명의 주사제는 생리적으로 양립가능한 완충액 예컨대 한스 용액, 링거액, 또는 생리적 염 완충액으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 경점막 투여를 위해, 장벽을 침투하기에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 그와 같은 침투제는 일반적으로 당해 기술에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 제제는 비경구 투여용, 예를 들면, 볼러스 주사 또는 연속 주입으로 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 주사용 제형은, 선택적으로, 첨가된 보존제를 갖는 단위 복용 형태, 예를 들어, 앰풀 또는 다회용량 용기로 제공된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼이고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 또한, 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 염화물 및 티메로살 및 기타 동종의 것; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 및 다른 것; 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제 예컨대 염화나트륨, 칼륨 염화물, 글리세린, 만니톨 및 다른 것; 산화방지제 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 나트륨 메타비설포테 및 다른 것; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로오스 및 그것의 유도체를 포함한 폴리머; 및 폴리비닐 알코올과 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조정하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 또한 국부 마취제 또는 다른 활성물질을 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭스, 및 기타 동종의 것으로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 비경구 투여용 약제학적 조성물은 수용성 형태로 활성 제제의 수용액을 포함한다. 추가로, 일부 구현예에서, 지효성 OXM의 현탁액은 적절한 유성 또는 물 기반 주사 현탁액으로 제조된다. 일부 구현예에서, 적합한 친유성 용매 또는 비히클은, 지방 오일 예컨대 참께 오일, 또는 합성 지방산 에스테르 예컨대 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가하는 물질, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 가능하도록 지효성 OXM의 용해도를 증가하는 적합한 안정제 또는 제제를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 활성 화합물은 소포, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다 (문헌 [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]; 문헌 [Treat 등, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; 문헌 [Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327] 참조; 일반적으로 상기 문헌 참조).
또 다른 구현예에서, 조절 방출 시스템에 전달된 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 이식가능 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 위해 제형화된다. 일 구현예에서, 펌프가 사용된다 (문헌 [Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed . Eng . 14:201 (1987)]; 문헌 [Buchwald 등, Surgery 88:507 (1980); Saudek 등, N. Engl . J. Med . 321:574 (1989)]. 또 다른 구현예에서, 폴리머 재료가 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하여 위치될 수 있고, 따라서 전신 용량의 분획만을 필요로 한다 (예를 들면, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조. 다른 조절 방출 시스템은 Langer (문헌 [Science 249:1527-1533 (1990)]에 의한 검토에 논의되어 있다.
일 구현예에서, 지효성 OXM은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된, 무발열원 물 기반 용액으로 구성하기 위한 분말 형태로 된다. 일부 구현예에서, 조성물은 원자화 및 흡입 투여를 위해 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 부착된 분사 수단을 갖는 용기에 함유된다.
일 구현예에서, 본 발명의 제제는, 예를 들면, 통상적인 좌약 염기 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 사용하여, 직장 조성물 예컨대 좌약 또는 유지 관장제로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 발명의 맥락에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 지효성 OXM이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양은 질환의 증상을 예방, 경감 또는 완화시키거나 또는 치료될 대상체의 생존을 연장하는데 효과적인 지효성 OXM의 양을 의미한다.
일 구현예에서, 치료적으로 효과적인 양의 결정은 당해 분야의 숙련가의 능력 내에 있다.
조성물은 또한 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 염화물 및 티메로살 및 기타 동종의 것; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 및 다른 것; 완충액 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제 예컨대 염화나트륨, 칼륨 염화물, 글리세린, 만니톨 및 다른 것; 산화방지제 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 나트륨 메타비설포테 및 다른 것; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로오스 및 그것의 유도체를 포함한 폴리머; 및 폴리비닐 알코올과 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조정하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 또한 국부 마취제 또는 다른 활성물질을 포함한다. 조성물은 또한 국부 마취제 또는 다른 활성물질을 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭스, 및 기타 동종의 것으로서 사용될 수 있다.
약제학적으로-허용가능한 캐리어 또는 이들의 성분으로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토오스, 글루코스 및 수크로오스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 그것의 유도체, 예컨대 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 메틸 셀룰로오스; 분말화된 트라가칸쓰; 맥아; 젤라틴; 탈크; 고형 윤활제, 예컨대 스테아르산 및 마그네슘 스테아레이트; 황산칼슘; 식물성 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참께 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마 오일; 폴리올 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산; 유화제, 예컨대 Tween™ 브랜드 유화제; 나트륨 라우릴 설페이트 같은 습윤제; 착색제; 풍미제; 정제화 제제, 안정제; 산화방지제; 보존제; 무발열원 물; 등장의 염수; 및 포스페이트 완충 용액이다. 본 화합물과 조합하여 사용되는 약제학적으로-허용가능한 캐리어의 선택은 기본적으로 본 화합물이 투여되는 방법에 의해 결정된다. 대상 화합물이 주사되도록 되는 경우, 일 구현예에서, 약제학적으로-허용가능한 캐리어는 혈액-양립가능한 현탁화제를 갖는 멸균된, 생리적 염수이고, 이것의 pH는 약 7.4로 조정되어 진다.
또한, 조성물은 추가로 결합제 (예를 들면 아카시아, 옥수수녹말, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로오스, 구아르 검, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 포비돈), 붕해제 (예를 들면 옥수수녹말, 감자 전분, 알긴산, 실리콘 디옥사이드, 크로스카르멜로스 나트륨, 크로스포비돈, 구아르 검, 나트륨 전분 글라이콜레이트), 다양한 pH 및 이온 강도의 완충액 (예를 들면, 트리스-HCI., 아세테이트, 포스페이트), 표면에 흡수를 방지하기 위한 첨가제 예컨대 알부민 또는 젤라틴, 세제 (예를 들면, Tween 20, Tween 80, 플루론산 F68, 담즙산 염), 프로테아제 억제제, 계면활성제 (예를 들면 나트륨 라우릴 설페이트), 투과 증강제, 가용화제 (예를 들면, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 산화방지제 (예를 들면, 아스코르브산, 나트륨 메타바이설파이트, 부틸화된 하이드록시아니솔), 안정제 (예를 들면 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이록옥시프로필메틸 셀룰로오스), 점도 증가제(예를 들면 카보머, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 에틸 셀룰로오스, 구아르 검), 감미제 (예를 들면 아스파르탐, 시트르산), 보존제 (예를 들면, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제 (예를 들면 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트), 유동 조제 (예를 들면 콜로이드성 실리콘 디옥사이드), 가소제 (예를 들면 디에틸 프탈레이트, 트리에틸 시트레이트), 유화제 (예를 들면 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 나트륨 라우릴 설페이트), 폴리머 코팅물 (예를 들면, 폴록사머 또는 폴록사민), 코팅 및 막 형성 제제 (예를 들면 에틸 셀룰로오스, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 아쥬반트를 포함한다.
시럽, 엘릭시르, 에멀젼 및 현탁액용 캐리어의 전형적인 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 수크로오스, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁액에 대해, 전형적인 현탁화제는 메틸 셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 셀룰로오스 (예를 들면 Avicel™, RC-591), 트라가칸쓰 및 나트륨 알기네이트를 포함하고; 전형적인 습윤제는 레시틴 및 폴리에틸렌 옥사이드 소르비탄 (예를 들면 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 전형적인 보존제는 메틸 파라벤 및 나트륨 벤조에이트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 경구 액체 조성물은 또한 상기에 개시된 1종 이상의 성분 예컨대 감미제, 풍미제 및 착색제를 함유한다.
조성물은 또한 폴리머 화합물 예컨대 폴리락트산, 폴글리콜 산, 하이드로겔 등의 미립자 제제 안으로 또는 그 위로, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 교질입자, 단일라멜라 또는 다중층 소포, 적혈구 고스트, 또는 스페로플라스트 상으로 활성 물질의 편입을 포함한다.) 이러한 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체 내 방출의 속도 및 생체내 청소능의 속도에 영향을 미칠 것이다.
또한 폴리머 (예를 들면 폴록사머 또는 폴록사민)으로 코팅된 미립자 조성물 및 조직-특이적 수용체, 리간드 또는 항원에 대한 항체에 커플링되거나 또는 조직-특이적 수용체의 리간드에 커플링된 화합물이 본 발명에 포함된다.
일 구현예에서, 화합물은 수용성 폴리머 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린의 공유결합에 의해 변형된다. 또 다른 구현예에서, 변형된 화합물은 대응하는 비변형된 화합물보다 정맥내 주사에 따라 혈액 내에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타낸다. 일 구현예에서, 변형은 또한 수용액에서 화합물의 용해도를 증가하고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 고양하고, 그리고 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소한다. 또 다른 구현예에서, 요망된 생체내 생물학적 활성은 비변형된 화합물이 갖는 것보다 덜 빈번하게 또는 더 낮은 용량으로 이러한 폴리머-화합물 외전의 투여에 의해 달성된다.
또 다른 구현예에서, 효과적인 양 또는 용량의 제조는 초기에 시험관내 검정으로부터 추정될 수 있다. 일 구현예에서, 용량은 동물 모델에 제형화될 수 있으며, 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 지효성 OXM의 독성 및 치료 효능은 시험관내, 세포 배양물 또는 실험적 동물에서, 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 이들 시험관내 및 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에게 사용하기 위한 복용량의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 복용량은 이용된 복용 형태 및 이용된 투여 경로에 의존하여 다양하다. 일 구현예에서, 정확한 제형, 투여 경로 및 복용량은 환자의 상태의 관점에서 개별 의사에 의해 선택될 수 있다. [예를 들면, 문헌 [Fingl, 등, (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1] 참조].
일 구현예에서, 치료될 병태의 중증도 및 반응성에 의존하여, 투여는 며칠 내지 몇 주까지 또는 치료가 유효하게 되거나 또는 질병 상태의 축소가 달성될 때까지 지속하는 치료의 경로로, 단일 또는 복수의 투여의 것으로 될 수 있다.
일 구현예에서, 투여되어 지는 조성물의 양은 물론 치료될 대상체, 고통의 중증도, 투여의 방식, 처방의의 판단, 등에 의존적일 것이다.
일 구현예에서, 상용성 약제학적 캐리어로 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물이 또한 제조되고 적절한 용기에 위치되고, 그리고 표시된 증상의 치료에 대해 표지된다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM은 전신 투여를 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM은 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM은 복합체 유기 부형제 및 안정제 예컨대 비이온성 계면 활성제 (즉, 계면활성제), 다양한 당, 유기 폴리올 및/또는 인간 혈청 알부민과 조합하여 동결건조된 (즉, 냉동건조된) 제제이다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균수에 기재된 바와 같은 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균된 PBS에 기재된 바와 같은 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균된 0.9% NaCl에 기재된 바와 같은 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 복합체 캐리어 예컨대 인간 혈청 알부민, 폴리올, 당, 및 음이온성 표면 활성 안정제를 포함한다. 예를 들면, WO 89/10756 (Hara 등- 폴리올 및 p-하이드록시벤조에이트 함유) 참조. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 락토바이온산 및 아세테이트/글리신 완충액을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 물에서 인터페론 조성물의 용해도를 증가하는 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 글루타메이트를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 동결건조된 역 페길화된 OXM 및 글리신 또는 인간 혈청 알부민 (HSA), 완충액 (예를 들어, 아세테이트) 및 등장제 (예를 들어 NaCl)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 동결건조된 역 페길화된 OXM 및 인산염 버퍼, 글리신 및 HSA를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 페길화된 또는 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 약 4 내지 7.2 사이의 pH를 갖는 완충된 용액 내에 위치될 때 안정화된다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 안정제로서 아미노산 및 일부 경우에 염 (만일 아미노산이 하전된 측쇄를 함유하지 않는 경우)으로 안정화된다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 약 0.3 중량% 내지 5 중량% 사이로 아미노산인 안정제를 포함하는 액체 조성물이다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 정확도 및 생성물 안전성을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 주사가능한 적용에 사용하기 위한 생물학적으로 활성이고, 안정적인 액체 제형을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 비-동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 전에 저장 및 해상운송을 용이하게 하는 액체 상태로 장기간 저장을 허용하는 액체 제형을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고형 지질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고형 지질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 스프레이 응고에 의한 지질 극미립자의 생산은 Speiser (문헌 [Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54])에 의해 그 다음 경구 투여용 지질 나노펠렛 (문헌 [Speiser EP 0167825 (1990)])에 기재되어 졌다. 또 다른 구현예에서, 사용되는 지질은 신체에 잘 견딘다 (예를 들면, 비경구 영양을 위한 에멀젼 중에 존재하는 지방산으로 구성된 글리세라이드).
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀의 형태이다 (문헌 [J. E. Diederichs and al., Pharm. andnd. 56 (1994) 267-275)].
또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 폴리머 극미립자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 주사가능 약제학적 조성물은 폴리머 극미립자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 에멀젼을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 마이크로구형체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 양친매성 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 약물, 지질 매트릭스 및 계면활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 지질 매트릭스는 적어도 50% w/w인 모노글리세라이드 함량을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 지효성 OXM을 함유하는 하나 이상의 단위 복용 형태를 포함하는, 팩 또는 분배기 디바이스, 예컨대 FDA 승인된 키트에 존재된다. 일 구현예에서, 팩은 예를 들면 금속 또는 플라스틱 포일, 예컨대 수포 팩을 포함한다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배기 디바이스에는 투여를 위한 지침이 수반된다. 일 구현예에서, 팩 또는 분배기는 의약품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 관련된 통지가 수용되며, 이 통지는 조성물의 형태 또는 인간 또는 수의과 투여의 기관의 승인을 반영한다. 일 구현예에서, 그와 같은 통지는 미국 식품의약품안전청에 의해 처방전 약물 또는 승인된 제품내 삽입물에 대한 승인된 라벨링이다.
일 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 각각의 제제 그것만으로의 치료와 비교하여 개선된 치료 효과를 달성하기 위해 추가 활성제와 함께 개인에게 제공될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 또 다른 구현예에서, 병용 요법과 관련된 유해한 부작용에 대한 조치 (예를 들면, 상보적 제제의 투여 및 선택)가 취해진다.
본 발명의 추가 목적, 이점, 및 신규한 특징은 제한하려고 의도되지 않는 하기 실시예의 검토시 당해 기술에서 숙련된 통상인에게 명백할 것이다. 추가로, 위에서 기술되고 하기 청구항 부문에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 구현예 및 측면 각각은 하기 실시예에서 실험적 지지를 확인한다.
실시예
일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용된 실험실 절차는 분자, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 그와 같은 기술 문헌에 철저하게 설명되어 있다. 예를 들면, 이들 모두가 참고로 편입되는, 하기를 참조한다: 문헌 ["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989)]; 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)]; 문헌 [Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]; 문헌 [Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)]; 문헌 [Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; 문헌 [Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)]; 미국 특허번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 제시된 바와 같은 방법론; 문헌 ["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)]; 문헌 ["Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition]; 문헌 ["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)]; 문헌 [Stites 등 (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)]; 문헌 [Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)]; 이용가능한 면역검정은 특허 및 과학적 문헌에 광범위하게 기재되어 있는데, 예를 들면, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; 문헌 ["Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)]; 문헌 ["Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)]; 문헌 ["Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)]; 문헌 ["Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)]; 문헌 ["Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)]; 문헌 ["A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 문헌 ["Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press]; 문헌 ["PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)]; 문헌 [Marshak 등, "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)]. 다른 일반적인 참조가 본 문서 전반에 걸쳐 제공된다.
실시예 1
PEG30 -S- MAL -FMS- OXM의 제조
OXM의 합성
옥신토모둘린 아미노산 서열은 하기 펩타이드 서열로 제시된다: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열식별번호: 1)
본 펩타이드는 펩타이드 사슬 어셈블리 (Almac Sciences, 스코틀랜드 소재) 전체에 Fmoc-전략을 채용한 고상 방법에 의해 합성되었다.
본 펩타이드 서열은 하기 단계를 사용하여 조립되었다:
1. 캡핑
수지는 DMF (Rathburn) 내 0.5M 아세트산 무수물 (Fluka) 용액을 사용하여 캡핑되었다.
2. 탈보호
Fmoc-보호기는 DMF (Rathburn) 내 20% v/v 피페리딘 (Rathburn) 용액을 사용하여 성장하는 펩타이드 사슬로부터 제거하였다.
3. 아미노산 커플링
DMF (Rathburn) 내 0.5M 아미노산 (Novabiochem) 용액은 DMF (Rathburn) 내 1M HOBt (Carbosynth) 용액 및 DMF (Rathburn) 내 1M DIC (Carbosynth) 용액을 사용하여 활성화하였다. 커플링당 4 당량의 각각의 아미노산을 사용하였다.
조물질 펩타이드는 트리이소프로필실란 (Fluka), 물, 디메틸설파이드 (Aldrich), 암모늄 아이오다이드 (Aldrich) 및 TFA (Applied Biosystems)의 칵테일에서 4시간 동안 교반함에 의해 제거된 수지 및 보호기로부터 절단된다. 조물질 펩타이드는 차가운 디에틸 에테르로부터 침전에 의해 수집된다.
펩타이드 정제
조물질 펩타이드를 아세토니트릴 (Rathburn)/물 (MilliQ) (5:95)에 용해시키고 분취 HPLC 칼럼 상에 장입하였다. 크로마토그래피 파라미터는 아래와 같다:
칼럼: Phenomenex Luna C18 250mm x 30, 15μm, 300A
이동상 A: 물 + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems)
이동상 B: 아세토니트릴 (Rathburn) + 0.1% v/v TFA (Applied Biosystems)
UV 검출: 214 또는 220nm
구배: 4개의 칼럼 용적에 걸쳐 25%B 내지 31%B
유량 43mL/min
MAL -FMS- NHS의 합성
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반응식 1 - MAL-FMS-NHS 및 MAL-Fmoc-NHS 링커의 합성
화합물 2-5의 합성은 문헌 [Albericio 등 in Synthetic Communication, 2001, 31(2), 225-232]에 기재된 절차에 기초한다.
2-( Boc -아미노) 플루오렌 (2):
2- 아미노플루오렌 (18g, 99mmol)을 자석 교반으로 빙욕에서 디옥산:물 (2:1) (200ml) 및 2N NaOH (60ml)의 혼합물에 현탁시켰다. Boc2O(109mmol, 1.1eq)을 그런 다음 첨가하고 RT에서 교반을 계속하였다. 반응은 TLC (Rf= 0.5, Hex./아세트산에틸 2:1)로 모니터링하고 그리고 2N NaOH의 첨가로 pH를 9-10 사이로 유지하였다. 반응 완료시, 현탁액을 1M KHSO4로 pH=3으로 산성화하였다. 고형을 여과하고 냉수 (50ml), 디옥산-물 (2:1)로 세정하고 그리고 그 다음 톨루엔으로 2회 공비증류하여 이것을 다음 단계에서 사용하였다.
9- 포르밀 -2-( Boc -아미노) 플루오렌 (3):
3구 RBF 내에서, NaH (오일 내에 60%; 330mmol, 3.3eq)을 건조 THF (50ml)에 현탁시키고, 건조 THF (230ml) 내 단계 2에 기재된 -(Boc-아미노)불소의 용액 (28g; 100mmol)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 두꺼운 황색 슬러리가 관측되었고 혼합물은 RT에서 질소 하에서 10분 동안 교반하였다. 에틸 포르메이트 (20.1ml, 250mmol, 2.5eq)을 적가하였다 (주의: 가스 방출). 슬러리는 옅은 갈색 용액으로 변하였다. 용액을 20분 동안 교반하였다. 반응을 TLC (Rf=0.5, Hex./아세트산에틸 1:1)로 모니터링하고 단지 미량의 개시 물질이 관측될 때, 이것은 빙수 (300ml)로 켄칭하였다. 대부분의 THF가 제거될 때까지 혼합물을 감압하에서 증발하였다. 수득한 혼합물을 아세트산으로 pH=5로 처리하였다. 수득된 백색 침전물을 아세트산에틸에 용해시키고 유기층을 분리하였다. 수성층은 아세트산에틸로 추출하고 그리고 모든 유기층은 조합하고 포화된 중탄산나트륨, 염수로 세정하고 그리고 MgSO4 상에서 건조시켰다. 여과 및 용매 제거 후 황색 고형을 수득하였다. 이 물질은 다음 단계에서 사용하였다.
9- 하이드록시메틸 -2-( Boc -아미노) 플루오렌 (4):
상기로부터 화합물 3을 MeOH (200ml)에 현탁시키고 그리고 나트륨 보로하이드라이드를 15분에 걸쳐 나누어서 첨가하였다. 혼합물은 30분 동안 교반하였다 (주의: 발열 반응 및 가스 방출). 반응을 TLC (Rf=0.5, Hex./EtOAc 1:1)로 모니터링하고 완료하였다. 물 (500ml)을 첨가하고 pH를 아세트산으로 pH 5로 조정하였다. 후처리는 아세트산에틸로 2회 추출, 조합된 유기층을 중탄산나트륨 및 염수로 세척, MgSO4로 건조, 여과 및 농축 건조를 포함한다. 수득된 조 생성물을 헵탄/EtOAc (3:1)를 사용하여 플라스크 크로마토그래피로 정제하여 황색 포옴 (36g, 97.5% 순도, 1H-NMR에서 관측된 미량의 아세트산에틸 및 디에틸 에테르)을 수득하였다.
MAL - Fmoc - NHS (7):
오버헤드 교반으로 깨끗한 건조 500ml RBF에 건조 THF (55ml) 내 트리포스겐 (1.58g, 0.35eq.)을 충전하여 주위 온도에서 용액을 형성하였다. 이것을 얼음/수조로 0℃로 냉각시키고, 건조 THF (19ml) 내 NHS (0.67g, 0.38eq)의 용액을 0℃에서 질소하에 10분에 걸쳐 적가하였다. 얻어진 용액을 30분 동안 교반하였다. 건조 THF (36ml) 내 NHS (1.34g, 0.77eq)의 추가 분액을 10분에 걸쳐 0℃에서 적가하고 15분 동안 교반하였다.
화합물 6 (5.5g, 1eq), 건조 THF (55ml) 및 피리딘 (3.07ml, 2.5eq)을 함께 교반하여 현탁액을 형성하였다. 이것을 0-5℃에서 나누어서 NHS 용액에 첨가하고 그 다음 빙욕을 제거하여 RT로 되게 하였다.
20시간 후 반응을 멈추었다 (반응이 강제로 완료되는 경우, 여전히 개시 물질이 존재하고, 더 약한 불순물이 관측됨).
반응 혼합물을 여과하고 여액에 4% 염수 (200ml) 및 EtOAc (200ml)를 첨가하였다. 분리 후, 유기층을 5% 시트르산 (220ml) 및 물 (220ml)로 세정하였다. 유기층을 그런 다음 농축하여 7.67g의 MAL-Fmoc-NHS (순도는 93-97%임)를 얻었다. 물질을 구배 사이클로헥산/EtOAc 70:30 내지 40:60을 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 진공하에 농축시켜 3.47g (45%)의 MAL-Fmoc-NHS를 수득하였다.
MAL -FMS- NHS -(A)
트리플루오로아세트산 (10ml) 내 MAL-Fmoc-NHS (100mg, 0.2mmol)의 용액에 클로로설폰산 (0.5ml)을 첨가했다. 15분 후, 빙랭 디에틸 에테르 (90ml)를 첨가하고 생성물을 침전시켰다. 물질을 원심분리에 의해 수집하고, 디에틸 에테르로 세정하고 진공하에 건조시켰다. 41.3mg (35%)의 베이지색 고형을 수득하였다.
MAL -FMS- NHS ―(B)
개시 물질 Mal-Fmoc-NHS를 순수한 TFA (전형적으로 520mL)에 불활성 분위기하에 전형적으로 5분 동안 용해시켰다. 6 eq의 클로로설폰산을 순수한 TFA (전형적으로 106mL)에 용해시키고 반응 혼합물에 적가하였다 (전형적으로 45분). 설폰화 완료 후 (전형적으로 50분), 반응 혼합물을 침전을 위해 차가운 디에틸 에테르 (전형적으로 25.4L)에 부었다. 침전물을 여과하고 진공에서 건조 (전형적으로 90분)하여 Mal-FMS-NHS (순도는 93-97%임)를 수득하였으며, 이것을 직접적으로 커플링 단계로 되게 하였다. Mal-FMS-NHS는 93% - 97% 사이의 충분한 순도로 수득되었다.
실시예 1A
OXM + PEGSH + MAL -FMS- NHS -(A)의 콘주게이션 - PEG30 -S- MAL -FMS- OXM (MOD 6030) 의 이종 콘주게이트를 생성하기 위한 "원 포트 반응"
OXM 펩타이드 (Lys12, Lys30 및 아미노 말단) 내의 3개 아민 부위의 불균일 콘주게이션은 각각의 성분: OXM, mPEG-SH 및 FMS 링커로부터의 1 당량이 함께 pH 7.2에서 30분 동안 혼합되는 "원 포트 반응"으로서 수행했다. 아세트산을 첨가하여 PH를 4로 감소시켜 반응을 중단시켰다.
불균일 콘주게이트 (MOD-6030, 도 1, PEG30-FMS-OXM)의 합성을 아래와 같이 수행하였다: MAL-FMS-NHS-(A) [상기에 기재된 바와 같음]를 (원 포트 반응으로) OXM 및 PEG(30)-SH와 혼합하였다. MAL-FMS-NHS-(A) 스페이서는 그것의 NHS 활성화 에스테르에 의해 일 측면에서 OXM에 커플링되었으며, PEG-SH에 의해 다른 측면에서 말레이미드 기에 동시에 연결되었다. 이렇듯, PEG-S-MAL-FMS-OXM 콘주게이트의 이종 혼합물은 OXM 펩타이드의 3개 아민 (N-말단, Lys12 및 Lys30) 중 하나에 의해 연결된 3개 변이체로 구성된다.
이종 콘주게이션에서, 옥신토모둘린 합성이 완료되고 절단 동안 모든 보호기가 제거되고, 따라서 1차 아민을 갖는 것들이 NHS 기와 추가로 반응할 수 있다. 조물질 옥신토모둘린이 정제되고 일 포트 반응이 일어난다.
실시예 1B
OXM + PEGSH + MAL -FMS- NHS -(A)의 콘주게이션 - PEG30 -S- MAL -FMS- OXM의 동종 콘 주게이트를 생성하기 위한 두 단계 공정
콘주게이션 절차는 FMS 스페이서 (MAL-FMS-NHS)에 대한 부착이 제어되고 부위 지향적 방식으로 실행되는 2-단계 공정으로 추가로 전개되었다. 제1 단계에서, FMS 스페이서를 보호된 OXM* (바람직한 보호된 OXM으로서 Lys12 및 Lys30에서 보호된 N-말단 OXM으로 수지 부분적으로 보호된 OXM 상에)에 커플링시키고 그런 다음 절단하고 그 다음 탈-보호 및 (RP-HPLC에 의한) MAL-FMS-OXM의 정제를 한다.
* Fmoc-SPPS 방법론을 사용하여 OXM의 펩타이드 합성 동안, 아미노산은 TFA에 의해 수지로부터 절단되는 동안 탈보호되는 아미노산의 각각의 R 기에 대한 다양한 보호기에 의해 보호되었다. FMS의 Lys12 또는 Lys30 부위 지향된 커플링을 합성하기 위해, ivDde를 사용하여 라이신의 아민기를 보호하였는데, 예를 들면 OXM-Lys12-FMS의 경우, Lys12의 R기 내 NH2는 약산 조건에 의해 선택적으로 제거된 ivDde에 의해 첨가 보호되는 반면 다른 보호기가 사용된 다른 모든 아미노산은 여전히 보호되었다. 특정한 N-말단 커플링을 위해, 일상적인 SPPS가 사용되었다. 즉 OXM의 합성이 완료되면 그 다음 비보호된 N-말단기에만 커플링된 MAL-FMS-NHS의 첨가가 따랐다.
제2 단계는 정제된 동종 MAL-FMS-OXM에 PEG30-SH를 부착이었다. 최종 접합된 생성물 (PEG30-S-MAL-FMS-OXM)을 RP-HPLC로 추가로 정제하였다. 이온 교환 또는 SEC- HPLC 또는 임의의 다른 정제 단계와 같은 추가 정제 단계가 적용될 수 있다.
수지상의 3개 펩타이드를 Fmoc 고상 전략을 사용하여 합성하였다. OXM의 위치 12 또는 30에서 아미노산 라이신에 의해 연결된 동종 콘주게이트의 합성을 위해, ivDde (1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸])와 같은 선택적 보호기가 OXM의 Lys12 또는 Lys30 중 어느 하나에 적용되어, 나머지 펩타이드는 여전히 다른 보호기를 갖는 수지 상에 존재한다.
따라서, 3개의 수지-결합된 OXM이 합성되었다: N-말단 ―ivDde 보호기로 Lys12 또는 Lys30과 Fmoc 전략 (일반적으로 Boc 보호기는 ε 아민에 사용됨)으로 고상 합성에 적합한 보호기를 사용함. 이들 OXM 펩타이드는 FMS 링커와 추가 선택적 커플링에 대해 의도되었다.
동종 콘주게이트는 '수지상 합성'으로 수행했다. 콘주게이트는 2 단계로 합성했다:
1. OXM과 MAL-FMS-NHS 사이의 커플링, 절단 및 정제.
2. PEG30-SH로 MAL-FMS-OXM의 페길화. 이 절차에서, MAL-FMS-NHS 화합물의 커플링은 보호된 OXM 중 임의의 하나 (유리 N-말단-OXM, 유리 Lys12-OXM 또는 유리 Lys30-OXM)와 수행되어 진 반면, 이것은 수지에 결합된다. 보호된 OXM은 다른 유리 아민 부위에서 보호되어, OXM 상의 특이적인 비-보호된 요망된 아미노 부위가 MAL-FMS-NHS 상의 NHS 모이어티와 반응하도록 된다. 정제된 MAL-FMS-OXM은 PEG30-SH와 반응하여, HPLC (RP 또는 양이온 교환 또는 둘 모두)를 사용하여 정제되는 조물질 콘주게이트를 생성하였다.
Lys12 / Lys30 보호된 N-말단 OXM (MOD- 6031)에 MAL -FMS- NHS (A) 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커 용액 (0.746ml, DMF 내 10mg/ml, 2eq)을 Lys12/Lys30 보호된 N-말단 OXM 수지* (1eq, 200mg 수지, 31.998μmol/유리 아민 g)에 첨가하였다. 수지가 단지 자유롭게 움직일 때까지 DMF를 첨가하였고 그런 다음 19시간 동안 초음파처리하였다. 수지를 DMF 및 메탄올로 세정하고 진공 데시케이터에서 밤새 건조하였다. 절단 칵테일은 TFA/TIS/H2O를 함유하였다. 절단은 실온에서 3.5시간에 걸쳐 수행되었다. 수지의 여과 후, MAL-FMS-OXM을 차가운 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 42.1mg의 조물질 MAL-FMS-OXM (36% 순수)을 절단 단계의 마지막에서 수득하였다.
Lys 12 부위 지향된 OXM에 MAL -FMS- NHS (A) 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커 용액 (DMF 내 10mg/ml, 2.5 equiv.)을, DIEA (5 equiv.)를 첨가한 (Lys12)OXM 수지 (1 equiv.)에 첨가하였다. 수지가 단지 자유롭게 움직일 때까지 DMF를 첨가하였고 그런 다음 밤새 초음파처리하였다. 수지를 DMF 및 메탄올로 세정하고 진공 데시케이터에서 밤새 건조하였다. N-말단 부위 지향된 것에 대해 기술된 바와 같은 절단 및 침전.
Lys 30 부위 지향된 OXM에 MAL -FMS- NHS (A) 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커 (2.5 equiv.)을, DIEA (5 equiv.)를 첨가한 DCM에 용해하였다. 이 링커/DIEA 용액을 (Lys30)OXM 수지에 첨가하였고 그런 다음 밤새 초음파처리하였다. 수지를 DCM 및 메탄올로 세정하고 진공 데시케이터에서 밤새 건조하였다. N-말단 부위 지향된 것에 대해 기술된 바와 같은 절단 및 침전.
정제
상기에서 생산된 임의의 얻어진 이종 중간체로부터 얻어진 조물질 MAL-FMS-OXM을 하기 조건 하에서 한번에 정제하였다.
샘플 희석제: 물 내 10% 아세토니트릴
칼럼: Luna C18 (2), 100Å, 250 x 21.2mm
주입 유량: 9ml/min
실행 유량: 9ml/min
완충액 A: 물 (0.1% TFA)
완충액 B: 아세토니트릴 (0.1% TFA)
구배: 32분에 걸쳐 10-45%B
모니터링: 230nm
상기에 생산된 동종 중간체 중 임의의 하나가 하기 단계로 동종 콘주게이트를 형성하기 위해 사용되었다
MAL-FMS-OXM에 PEG30SH의 콘주게이션
MAL-FMS-OXM 용액 (1 equiv, 1.5ml DMF 내 15.1mg)을 준비하였다. PEG30SH (1 equiv, pH 6.5 인산염 버퍼 내 10mg/ml 중 9.2ml)을 MAL-FMS-OXM 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 그런 다음 실온에서 30분 동안 교반하였고 빙초산 (200μl)을 부가하여 pH를 낮추어 반응을 중단시켰다.
그런 다음 얻어진 생성물을 RP-HPLC를 사용하여 정제하여 요망된 동종 콘주게이트 PEG-S-MAL-FMS-OXM (PEG-FMS-OXM)을 얻었다.
칼럼: Luna C18 (2), 100Å, 250 x 21.2mm
주입 유량: 5ml/min
실행 유량: 20ml/min
완충액 A: 물 & 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴/물 (75:25) & 0.1% TFA
구배: 41분에 걸쳐 10-65%B
모니터링: 220, 240, 280nm
실시예 1C
OXM + PEGSH + MAL -FMS- NHS - -(B)의 콘주게이션 ― PEG30 -S- MAL -FMS- OXM의 동종 콘주게이트를 생성하기 위한 두 단계 공정
불활성 분위기하에서 순수한 DMF/DCM (1:1, v/v, 전형적으로 12g/L의 농도) 내 MAL-FMS-NHS (B)의 용액에 OXM 수지 (전형적으로 2 L DMF 내 236g (보호된 Lys12/Lys30 N-말단 OXM, 또는 보호된 Lys12/N-말단 OXM 또는 보호된 Lys30/N-말단 OXM을 사용함*)를 현탁하고, 후속적으로 반응 혼합물을 순수한 DIPEA (전형적으로 7.5 mL)로 6.0 - 6.5의 분명한 pH로 조정함에 의해 커플링을 수행하였다. 커플링은 RT에서 교반하면서 수행하였다. Mal-FMS-NHS 링커는 2번에 걸쳐 첨가하였다 (제1 부분: 1.5 eq; 제2 부분 0.5 eq Mal-FMS-NHS; 펩타이드 수지의 장입에 관해 계산된 eq; 제2 부분은 제1 부분을 소진한 후 첨가되었다). 각각의 커플링 단계는 22 내지 24시간 수행하였다. 이어지는 여과, DMF (전형적으로 8.5 mL/수지 g, 3회), MeOH (전형적으로 8.5 mL/수지 g, 3회) 및 이소프로필 에테르 (전형적으로 8.5 mL/수지 g, 3회)로 수지의 연속적인 세정 및 차후의 진공에서 건조 (69 내지 118시간 사이)로 완전히 보호된 MAL-FMS-OXM 수지를 얻었다. 최대 243g까지의 전형적으로 116g의 양의 MAL-FMS-OXM 수지를 수득하였다.
* Fmoc-SPPS 방법론을 사용하여 OXM의 펩타이드 합성 동안, 아미노산은 TFA에 의해 수지로부터 절단되는 동안 탈보호되는 아미노산의 각각의 R 기에 대한 다양한 보호기에 의해 보호되었다. FMS의 Lys12 또는 Lys30 부위 지향된 커플링을 합성하기 위해, ivDde를 사용하여 라이신의 아민기를 보호하였는데, 예를 들면 OXM-Lys12-FMS의 경우, Lys12의 R기 내 NH2는 약산 조건에 의해 선택적으로 제거된 ivDde에 의해 첨가 보호되는 반면 다른 보호기가 사용된 다른 모든 아미노산은 여전히 보호되었다. 특정한 N-말단 커플링을 위해, 일상적인 SPPS가 사용되었다. 즉 OXM의 합성이 완료되면 그 다음 비보호된 N-말단기에만 커플링된 MAL-FMS-NHS의 첨가가 따랐다.
.
절단:
조물질 MAL-FMS-OXM은 3.5시간 동안 RT에서 TFA/H2O/TIPS (84:8.5:7.5, v/v/v)로 펩타이드 수지의 처리에 의해 수득하였다. 3.5시간 후 1 eq 암모늄 아이오다이드를 Met(O)-환원을 위해 고형으로서 첨가하였다. 4.0시간 후 아스코르브산 (1.5 eq)을 고형물로서 첨가하였다. 절단 칵테일을 추가로 5분 동안 교반하고 이소프로필 에테르 (IPE) (전형적으로 절단 칵테일 mL당 5mL)에 침전시켰다. 단리는 여과 및 진공 건조 (전형적으로 41 내지 90시간)에 의해 수행하였다.
정제
이차원 정제 반응식이 (1 대신에) 적용되었다
고정상 및 구배는 변화되었다.
샘플 희석제: 50% 아세트산
칼럼: Luna C8 (10μm, 100Å), 30 cm × 25cm
주입 유량: 1500ml/min
실행 유량: 1500ml/min
완충계 및 구배: 제1 차원에 대해 0.1% H3PO4 (pH 2) (A: 3%, B: 60% ACN) (구배 프로파일: 0% B - 70 min - 100% B) 및 제2 차원에 대해 0.1% TFA 용리액 (pH 2) (A: 3%, B: 100% ACN) (구배 프로파일: 0% B - 97 min - 100% B).
검출된 파장: 220nm
MAL -FMS- OXM에 PEGSH의 콘주게이션
펩타이드 MAL-FMS-OXM (B) (12.3g, 1 eq) 및 PEG30-SH (1.1 eq., 67.8g (활성 SH-그룹))를 10% ACN (펩타이드에 대해 12g/L 및 PEG30-SH에 대해 10g/L)을 함유하는 20mM NaOAc 완충액 (pH 4.7)에 개별적으로 용해하였다. pH를 (aq. NaOAc, pH 9.3을 사용하여) 6.1로 조정한 후, 용액을 전형적으로 1시간 동안 RT에서 불활성 분위기 하에서 교반하였다. 그런 다음 pH를 AcOH (25% v/v)로 4.5 - 5.0으로 조정하고 그리고 수득된 반응 혼합물을 분취 HPLC 정제에 적용하였다.
샘플 희석제: 페길화 반응으로부터의 조물질
칼럼: Luna C18(2) (10μm, 100Å), 20cm x 28cm
주입 유량: 907ml/min
실행 유량: 907ml/min
완충계: 0.1% TFA 용리액 (pH 2.0) (A: 5% ACN, B: 90% ACN)
구배 프로파일: 5% B - 30분 - 5% B - 66분 - 78% B - 1분 - 90% B - 15분 - 90% B
검출된 파장: 220nm
정제된 분획을 모으고 동결건조하였다.
실시예 2
GLP-1 수용체 활성화의 시험관내 특성규명
GLP-1 수용체 활성화의 시험관내 특성규명
GLP-1 수용체의 활성화는 2개의 상이한 세포주; HTS163C2 (Millipore) 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R (Discoverx)를 사용하여 평가하였고, 둘 모두는 GLP-1 수용체를 지나치게 높게 발현한다. HTS163C2 (Millipore)를 100,000 세포/ml의 밀도로 96 웰 절반-영역 백색 플레이트 (Greiner)에 씨딩하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포는 상승하는 농도의 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3가지 동종 PEG30-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)와 함께 배양하였다. 세포 cAMP 농도를 HTRF 검정 (Cisbio 62AM4PEB)에 의해 정량하고 EC50 파라미터를 PRISM 소프트웨어로 분석하였다. cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R은 리간드가 수용체에 결합할 때 cAMP를 분비한다. 500,000 세포/ml의 밀도로 세포를 96 웰 플레이트에 씨딩하고 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 리간드는 IBMX를 함유하는 희석제에 희석하고 5% CO2로 37℃에서 30분 동안 배양 웰에 반복하여 첨가하였다. PEG30-FMS-OXM의 농도 범위는 1.5*10-10 내지 1.2*10-6M이었다. 세포용해 버퍼 및 검출기 시약을 웰에 첨가하고 cAMP 농도를 화학발광 신호를 사용하여 검출하였다. 용량 의존성 곡선을 확립하고 최적 용량 반응 모델 (4개 파라미터)을 적용함에 의해 PRISM 소프트웨어를 사용하여 다양한 리간드의 결합 친화도 (EC50)를 계산하였다.
PEG-S-MAL-FMS-OXM (MOD-6030; 이종성)과 PEG-S-MAL-FMS-OXM의 3개의 상이한 동종 변이체; 아미노 (MOD-6031), Lys12 및 Lys30의 GLP-1 수용체 결합 활성화를 GLP-1 수용체를 과발현하는 2개의 상이한 세포주; Millipore HTS163C2 세포주 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R를 사용하여 평가하였다. 효력은 각각의 변이체의 EC50을 계산하고 그 다음 이종성 (MOD-6030) 버전에 대한 각각의 변이체의 상대적 효력을 계산 (이종성 버전의 EC50에 의해 각각의 동종 변이체의 EC50을 나눈 값을 100으로 곱한 값)함에 의해 결정되었다. EC50 값 및 계산된 상대적 효력은 표 4에 제시되어 있다. 비교하기 위해, cAMP Hunter CHO-K1 GLP1R 세포주의 GLP-1 수용체에 대한 OXM 및 GLP-1의 결합 친화도를 측정하였다.
표 4. GLP-1 및 글루카곤 수용체 결합 활성화
Figure pct00031
동종 변이체의 상대적 효력을 이종 버전과 비교하여 표 4에 요약하였다. 아미노 변이체 및 이종 변이체의 비교할만한 생물활성은 각각 Millipore HTS163C2 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R을 사용하여 측정된 72.2% 및 99.1%의 상대적 효력을 나타냈다.
Lys12 및 Lys30 변이체는 Millipore HTS163C2 세포주를 사용한 GLP-1 수용체 결합 활성화의 2 및 4 배수 감소를 나타낸 반면 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R 세포주를 사용하여 각각 미세한 및 2 배수 감소 만을 나타낸다. OXM의 N-말단이 GLP-1 수용체에 OXM의 결합에 관여하는 것으로 보고되었기 때문에 (문헌 [Druce 등, 2008]) 아미노 변이체가 다른 변이체에 비교하여 우월한 결합 활성을 실증했다는 사실은 예기치 못한 것이다. 전반적으로 아미노 변이체와 이종 변이체에 대해 비교할만한 생물활성이 나타났다. OXM 및 GLP-1 펩타이드의 GLP-1 수용체 결합 활성화를 측정하였다. OXM 및 GLP-1은 이종 PEG30-FMS-OXM에 비해 수용체 결합 활성화가 5.9 및 508.7 배 더 높은 것으로 밝혀졌다.
실시예 3
글루카곤 수용체 활성화의 시험관내 특성규명
글루카곤 수용체 활성화의 시험관내 특성규명
글루카곤 수용체의 활성화는 글루카곤- 수용체를 과발현하는 cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR 세포주를 사용하여 평가하였다. 이 세포주는 리간드가 글루카곤 수용체에 결합할 때 cAMP를 분비한다. 500,000 세포/ml의 밀도로 세포를 96 웰 플레이트에 씨딩하고 5% CO2로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 리간드는 IBMX를 함유하는 희석제에 희석하고 5% CO2로 37℃에서 30분 동안 배양 웰에 반복하여 첨가하였다. MOD-6031의 농도 범위는 5.8*10-11 내지 2.7*10-7M이었다. 세포용해 버퍼 및 검출기 시약을 웰에 첨가하고 cAMP 농도를 화학발광 신호를 사용하여 검출하였다. 용량 의존성 곡선을 확립하고 최적 용량 반응 모델 (4개 파라미터)을 적용함에 의해 PRISM 소프트웨어를 사용하여 다양한 리간드의 결합 친화도 (EC50)를 계산하였다.
글루카곤 수용체에 대한 PEG-S-MAL-FMS-OXM 변이체의 결합 친화도는 글루카곤- 수용체를 과발현하는 cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR 세포주를 사용하여 결정되었다. 이 세포주는 이종 PEG-S-MAL-FMS-OXM (MOD-6030) 및 PEG-S-MAL-FMS-OXM의 3개 상이한 동종 변이체; 아미노 (MOD-6031), Lys12 및 Lys30을 특정하기 위해 사용되었다. 효력은 각각의 변이체의 EC50을 계산하고 그 다음 이종성 버전에 대한 각각의 변이체의 상대적 효력을 계산 (이종성 버전의 EC50에 의해 각각의 동종 변이체의 EC50을 나눈 값을 100으로 곱한 값)함에 의해 결정되었다. EC50 값 및 계산된 상대적 효력은 표 4에 제시되어 있다. 아미노 변이체는 이종 버전에 대해 비교할만한 결합 활성을 나타냈다. Lys30 변이체는 최고의 생물활성을 나타냈고 Lys12는 1.8 배수 감소를 나타냈다. OXM 및 글루카곤 펩타이드의 글루카곤 수용체 결합 활성화가 측정되었다. OXM 및 글루카곤은 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM에 비해 수용체 결합 활성화가 11.1 및 283 배 더 높은 것으로 밝혀졌다.
실시예 4
PEG30 - FMS - OXM 변이체에 의한 내당능의 유도
C57BL/6 수컷 마우스를 밤새 절식하고 그런 다음 계량하고 혈당 수준은 휴대용 혈당측정기를 사용하여 꼬리 정맥 샘플링에 의해 측정하였다. 마우스에 PEG-SH (비히클), PEG30-FMS-OXM (이종성) 및 PEG30-FMS-OXM (아미노, Lys12 및 Lys30)의 3가지 동종 변이체를 IP 주사하였다. 글루코스 (1.5gr/kg)를 시험 약물 투여 후 15분에 IP 투여하였다. 혈당 수준은 글루코오스 투여 전의 꼬리 정맥 샘플링과 휴대용 혈당측정기를 사용하여 글루코스 투여 후 10, 20, 30, 60, 90, 120 및 180분에 측정하였다.
이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-S-MAL-FMS-OXM 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30)의 생체내 활성을 평가하기 위해, IPGTT 모델을 적용하였다. 밤새도록 절식된 C57BL/6 마우스에 상이한 화합물 및 비히클 (PEG-SH)을 IP 주사하고 그 다음 글루코오스의 IP 주사와 혈당측정기를 사용하여 꼬리 정맥에서 혈당 수준의 측정을 했다. PEG-SH (238.10nmol/kg), 이종 및 동종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM, 100nmol/kg 펩타이드 함량)을 글루코오스 IP 주사 (1.5gr/kg) 15분 전에 투여하였다. 모든 화합물은 비히클 군에 비교해 내당능을 유도했다. 놀랍게도, 동종 아미노 변이체는 시험관내 활성 결과와는 대조적으로, 다른 변이체에 비교하여 약간 더 높은 글루코스 AUC에 의해 반영된 2개의 다른 변이체 및 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM (표 5, 도 3)에 비해 약간 덜 강력하였다. 그러나, 모든 변이체는 비히클 PEG-SH 대조군에 비교해 내당능을 상당히 개선시켰다.
표 5: C57BL /6 마우스에서 내당능
Figure pct00032
가역적 PEG30-S-MAL-FMS-OXM의 이종 및 동종 변이체는 시험관내 및 생체내 IPGTT 모델 모두에서 활성인 것으로 나타났다. 놀랍게도, 시험관내 결과는 원상태 OXM의 N-말단은 GLP-1 수용체에 결합하는 펩타이드에 관여한다는 문헌에 제시된 것과 일치하지 않았다; 따라서, 아미노 말단 변이체는 시험관내 및 생체내 양자에서 최저 효력을 나타낼 것으로 예상되었다. 그러나, PEG30-S-MAL-FMS-OXM의 동종 아미노 변이체는 2개의 상이한 세포주 (표 4)를 사용하는 2개의 다른 동종 변이체에 비교해 개선된 GLP-1 수용체 활성화를 실증하는 반면 IPGTT 생체내 모델에서 비교할만한 효능을 입증하였다. IPGTT 생체내 모델은 비교할만한 활성을 나타내는 것으로 보인다 (동물 간의 가변성을 고려함). 상이한 PEG30-FMS-OXM 변이체 간에 GLP-1R 및 GCGR에 대한 상이한 시험관내 결합 활성이 관찰되었지만, 내당능을 유도하는 비교할만한 능력이 나타났다 (표 4 및 5). 예상외로, cAMP 유도 검정에서 나타낸 바와 같이 동종 아미노 PEG30-S-MAL-FMS-OXM의 우월한 시험관내 활성은 생체내 IP 내당능 시험에 반영되지 않았다. 동종 아미노 변이체 PEG30-S-MAL-FMS-OXM은 2개 다른 변이체 및 이종 PEG30-S-MAL-FMS-OXM에 비교해 최저 내당능 프로파일을 나타냈다. 그러나, 이것은 비히클과 비교하여 여전히 상당한 내당능 효과를 나타냈다 (도 3).
실시예 5
ob / ob 마우스 모델에서 PEG30 -S- MAL - FMS - OXM 변이체에 의해 체중, 혈당 및 지질 프로파일의 개선
물질 및 방법
연구 1: 25마리 수컷 ob/ob 마우스 (수컷, B6. V-Lep^ob/OlaHsd, 5-6 주령, Harlan)를 시설에 순응시켰고 (10일), 그 다음 동물을 복용되었지만 실제로는 무게를 측정하지 않았거나 복용하지 않은 것처럼 취급하는 프로토콜로 취급하였다 (10일). 후속적으로, 동물들은 20ml/kg의 용적으로 피하 경로에 의해 적절한 비히클로 매주 2회 복용되는 7일 동안 기준선 기간을 겪었다. 체중, 음식 및 물 섭취량을 매일 기록하였고, 비-공복 및 공복 혈당 측정과 비-공복 및 공복 인슐린 측정을 위해 샘플을 채취했다. 동물을 후속적으로 체중과 혈당 프로파일을 기반으로 5개 처리 그룹 (N = 5)으로 나누었다. 동물은 표 1에서 기재된 바와 같이 매 4일마다 (일: 1, 5, 9, 13 및 16) 복용되었다. 치료 기간 동안, 음식 섭취, 물 섭취 및 체중이 투여 전에 측정되고 매일 기록되었다. 몇 개의 절차 및 샘플링이 수행되었다: 2, 6, 14 및 17일에 비-공복 및 공복 혈당 (17일에는 단지 비-공복 혈당만 측정됨), 공복 및 비-공복 인슐린 (2, 6 및 14일). 19일에 말단 샘플은 콜레스테롤에 대해 분석되었다.
표 1: 연구 설계
Figure pct00033
연구 2:
100마리 수컷 ob/ob 마우스 (5-6 주령, Charles River)을 시설에 순응시켰고 (3일), 그 다음 동물을 복용되었지만 실제로는 무게를 측정하지 않았거나 복용하지 않은 것처럼 취급하는 프로토콜로 취급하였다 (7일). 후속적으로, 동물들은 20ml/kg의 용적으로 피하 경로에 의해 PEG30-SH 비히클 (146mg/ml)로 매주 2회 복용되는 7일 동안 기준선 기간을 겪었다. 체중, 음식 및 물 섭취량을 매일 기록하였다. 후속적으로 동물을 8 처리, 대조 및 쌍으로 공급된 그룹 (그룹 A-H, N=8)으로 배정하였다 (표 2). 쌍으로 공급된 그룹은 MOD-6031의 고용량 (6000nmol/kg) 그룹에 쌍으로 공급되었고 이것은 이전의 일에 D 그룹에 그것의 쌍으로 된 대응물에 의해 먹인 것과 동일한 양의 매일 음식 배급을 제공받았다. 3 추가 그룹 (그룹 I-K, N=12)에 1000, 3000 및 6000nmol/kg에서 MOD-6031을 투여하고 PK 분석을 위한 샘플링에 사용하였다. PEG-SH 비히클 (292 mg/ml), 1000, 3000 및 6000nmol/kg에서 MOD-6031, 및 쌍으로 공급된 그룹이 32일 동안 매주 2회 투여된 반면 OXM, 리라글루타이드® 및 PBS는 bid 투여하였다. 체중, 음식 및 물 섭취는 매일 측정하였다. 비-공복 및 공복 혈당은 1주 1회 측정하였고, OGTT는 2 및 30일에 수행하였다. 말단 혈액 샘플 (일 33)을 글루코스, 인슐린, 콜레스테롤, 및 MOD-6031, PEG-S-MAL-FMS-NHS 및 OXM 농도에 대해 분석하였다. PK 그룹의 마우스는 MOD-6031의 단일 용량을 투여받았고, PK 분석을 위해 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 및 120시간 (시점당 n=3)에서 혈액 샘플을 채취하여 MOD-6031 및 그것의 화합물 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 정량하였다.
표 2: 연구 설계
Figure pct00034
연구 3:
42마리 수컷 ob/ob 마우스 (7 주령, Charles River, Italy)을 시설에 순응시켰고 (10일), 그 다음 동물을 복용되었지만 실제로는 무게를 측정하지 않았거나 복용하지 않은 것처럼 취급하는 프로토콜로 취급하였다. 후속적으로, 동물들은 각각의 동물이 20ml/kg의 용적으로 피하 경로에 의해 PEG30-SH로 2회 복용되는 1주일 동안 기준선 기간을 겪었다. 체중, 음식 및 물 섭취량을 매일 기록하였고, 비-공복 및 공복 혈당 측정과 비-공복 및 공복 인슐린 측정을 위해 샘플을 채취했다. 동물을 후속적으로 혈장 글루코스, 체중 및 매일 음식 및 물 섭취를 기반으로 3개 처리, 대조군, 및 쌍으로 공급된 그룹 (그룹 A, N=10, 그룹 B-E, N=8)으로 나누었다. 쌍으로 공급된 그룹은 그룹 B (PEG-S-MAL-FMOC-OXM)에 쌍으로 공급되었지만 PEG-SH (204.5 mg/kg)로 처리되었다. 이것은 이전의 일에 B 그룹에 그것의 쌍으로 된 대응물에 의해 먹인 것과 동일한 양의 매일 음식 배급을 제공받았다. 이와 같이, E 그룹 내 동물들은 모든 연구 절차 및 측정에서 그룹 B와 1일의 단계가 뒤떨어질 것이다. 연구 동안, 동물들은 매 4일마다 (일: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25 및 29) 복용되었다. 처리 기간 동안, 음식 섭취, 물 섭취 및 체중이 투여 전에 측정되고 매일 기록되었다. 몇 개의 절차 및 샘플링이 수행되었다: 1, 6, 14, 22 및 29일에 비-공복 혈당, 10, 18 및 26일에 공복 혈당. 2 및 30일에 공복 혈당 샘플이, 인슐린이 글루코스에 병행하여 측정되는 OGTT 절차의 일부로 채취되었다. 33일에 말단 샘플은 콜레스테롤, 트리글리세라이드 및 프룩토스아민에 대해 분석되었다.
표 3: 연구 설계
Figure pct00035
결과
ob / ob 마우스 모델은 ob 유전자의 돌연변이를 나타내어 이들이 렙틴을 생산할 수 없고 그리고 고인슐린혈증, 비만증, 과다증, 인슐린 내성 및 후속적으로 고혈당증을 특징으로 하는 표현형을 전개할 수 없다. 이들 마우스는 PEG30-FMS-OXM (이종성) 및 PEG30-S-MAL-FMS-OXM (아미노, Lys12 및 Lys30)의 3개 동종 변이체의 효능을 평가하기 위해 2개의 상이한 연구에서 당뇨병의 유전적 모델로 사용되었다.
연구 1: 이 연구는 2000nmol/kg으로 투여시 동종 변이체 (아미노, Lys12 및 Lys30) 및 이종 MOD-6030의 효능을 비교했다. 체중의 감소는 비히클 (PEG-SH)과 비교하여 모든 시험된 물품에 대해 Lys12, MOD-6030, 아미노 및 Lys30 변이체에 대해 각각 3.1%, 4.7%, 4.9% 및 6.5%의 최종 감소 (18일째)로 수득되었다 (도 4). 체중 감소는 약물 주사에 따른 1, 5, 13 및 16일째에 관측되었다 (도 4). 약물 투여 후 (9일을 제외하고) 모든 처리된 그룹에서 음식 섭취의 감소가 관측되었다 (도 5). 본 연구에 따른 혈당 파라미터의 측정은 아미노 및 Lys12 처리된 그룹에 대해 비-공복 혈당의 개선 (도 6A) 및 모든 처리된 그룹에 대해 공복 혈당의 개선 (도 6B)을 나타냈다. 모든 처리된 그룹은 대조군에 비교하여 상당히 더 낮은 수준의 인슐린을 나타냈다. 주목할 것은, 이 연구에서 투여된 용량은 MOD-6030의 더 낮은 효과적인 용량인 2000nmol/kg이었고 및 따라서 체중, 음식 섭취 및 혈당 프로파일의 개선은 상대적으로 완만했다. 예상외로 아미노 변이체는 체중을 감소하고, 음식물 섭취를 억제하고 그리고 혈당 조절을 개선하는 능력에서 우월한 효능을 나타내는 유일한 변이체이었다. 제조하는 관점으로부터, 아미노 변이체의 수지상에 합성은 고상 합성에서의 펩타이드가 아미노 말단으로부터 확장된다는 것을 고려하면 가장 직설적인 진행 절차이다. 말단 아민은 위치 12 및 30에서 라이신의 내부 아민 기보다 커플링에 대해 바람직한 이용가능성을 갖는다. 이 접근성은 Lys12 및 Lys30 변이체와 비교하여 아미노 변이체의 더 높은 제조 수율에 반영된다. 추가 이점은 Lys12 및 Lys30 변이체의 합성은 펩타이드 합성에 사용된 Lys를 변화시키고 선택적 절단 단계 (선택적으로 Lys의 보호기를 제거함)의 첨가에 의해 변형되어 지는 반면, 아미노 변이체에 대한 합성은 이종 변이체에 대한 OXM 합성과 비교하여 변함없다는 것이다. 이전에 이종에 대해 개발된 바와 같은 OXM 합성은 이미 더 나은 수율과 강건성을 달성하기 위해 최적화되었다. 전반적으로, 제조하는 관점에서, 수지-상에 아미노 변이체의 합성은 직설적 진행이며 대안적인 변이체보다 이점을 갖는다. 동종 변이체이기 때문에, 이것은 약물 개발 및 약물 치료에 더 적합하다는 점에서 이종 변이체에 비해 이점을 또한 갖는다.
연구 2: 이 연구는 ob / ob 마우스 모델에서 약리적 및 약력학적 파라미터에 대해 1000, 3000 및 6000nmol/kg로 MOD-6031 (아미노 변이체)의 매주 2회 투여의 만성 효과를 조사하였고, 반면에 OXM 및 리라글루타이드 (지속성 GLP-1 수용체 효능제)는 참조 화합물로서 평가되었다. 측정된 약리적 파라미터는 체중, 음식 및 물 섭취, 글루코스 조절 및 지질 프로파일이였다. MOD6031의 고용량 (6000nmol/kg)의 매주 2회 투여는 음식 섭취 및 체중을 상당히 감소하였고 (도 7; 도 8), 반면 더 낮은 용량 (3000 및 1000nmol/kg)은 더 낮은 효과를 나타냈다. 연구 (33일)의 결론으로 1000, 3000 및 6000nmol/kg의 동물은 각각 5.2%, 12.3% 및 28.3%의 체중 감소를 나타냈다. 고용량 그룹이고 동등량의 음식을 먹인 (공복 일 제외) 쌍으로 된, 쌍으로 공급된 그룹은 유사한 음식 섭취를 하면서 12.7%의 체중 감소를 가졌다. 이 현상은 에너지 소모를 증가하는 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체의 능력에 기인할 수 있고 따라서 6000nmol/kg의 아미노 변이체로 처리된 동물은 그것의 쌍으로 공급된 그룹의 체중 감소에 비해 증가된 체중 감소를 가졌다. 연구 동안 OXM 및 리라글루타이드 양자는 각각 10.3% 및 8.3%로 상당히 체중을 감소했다. 1, 5, 12, 19, 26 및 29일째에 비-공복 혈당 및 2, 9, 16, 23 및 30일째에 공복 혈당을 모니터링한 혈당 프로파일의 측정은, 특히 6000nmol/kg에 대해 이들 파라미터의 상당한 개선을 나타냈다 (도 9A; 도 9B). 경구 내당능 시험 (OGTT) 연구는 2일 및 30일째 수행되었다 (각각 도 10 및 도 11). 이 결과는 MOD-6031 (아미노 변이체)이 1000, 3000 및 6000nmoles/kg 그룹에서 상당히 감소된 혈장 글루코스로 내당능을 상당히 그리고 용량-의존적으로 개선했다는 것을 나타냈다. 최고 MOD-6031 용량으로 쌍으로 공급된 동물은 시험된 임의의 시점에서 대조군에 상당히 상이하지 않은 글루코스 용량 후 글루코스 편위를 나타냈다. OGTT 연구의 2일째에, 개선된 글루코스 프로파일은 약간 지연되고 그리고 AUC 0-120분에 대해 더 높은 자극을 제공하는, 인슐린 반응의 지연과 관련되었다 (도 10). 이것은 혈액 안으로 글루코스 방출의 지연을 초래하는 MOD-6031의 약리적 활성에 의해 유도된 위 배출의 억제 및 제2 인슐린 분비 상태에 기인할 수 있다. OGTT 연구의 30일째는 대조군에 비교하여 감소된 인슐린 반응과 관련되어, 화합물이 인슐린 감수성을 개선했다는 것을 나타낸다 (도 11). 또한, MOD-6031은 말단 콜레스테롤을 용량- 의존적으로 감소했다; MOD6031의 6000 nmoles/kg 용량으로 관측된 감소는 쌍으로 공급된 대응물의 것보다 상당히 더 컸다 (도 12). 체중, 음식 섭취, 혈당 및 지질 프로파일에서 모든 이들 약리적 개선은 OXM 또는 리라글루타이드로 하루 2회 처리된 동물보다 더 클 뿐만 아니라 쌍으로 공급된 대응물에서 관측된 효과보다 또한 상당히 더 컸다.
MOD-6031(PEG--S-MAL-FMS-OXM) 및 그것의 가수분해된 화합물 (PEG--S-MAL-FMS 및 OXM)의 말단 혈중 농도는 LC-MS/MS 자격이 있는 방법을 사용하여 측정하였다. 결과는 MOD-6031 처리된 그룹에 대해 용량 의존적 농도를 나타냈다 (표 6). (단일 투여에 따른) 2일째 화합물 수준에 대해 이 데이터의 비교는 OXM 펩타이드가 매주 2회 투여될 때 연구 기간 축적되지 않았다는 것을 나타냈다. PEG--S-MAL-FMS 및 PEG-S-MAL-FMS-OXM은 연구 동안 중간 정도의 축적을 나타냈다 (표 6). 마지막 주사 (33일) 후 24h에서 MOD-6031의 최상 용량에 대한 MOD-6031 및 OXM 펩타이드의 실제 농도는 각각 490μg/ml 및 0.37μg/ml였다. 대조군 동물로부터의 모든 샘플은 검정의 하한 아래였다.
표 6: 단일 용량 (2일) 및 반복 MOD-6031 투여 레지멘의 마지막 주사 (33일) 후 24시간에 혈장 농도의 비교
Figure pct00036
* 불순물을 포함한 용량은 1515, 4545, 및 9090nmol/kg이다.
실시예 6
ob/ob 마우스 모델에서 MOD-6031 변이체에 의한 약력학적 파라미터의 개선
결과
ob/ob 마우스의 3 그룹 (n=12)에 1000, 3000 및 6000nmol/kg의 MOD-6031로 단독으로 투여하고 MOD-6031의 PK 분석 및 양과 그것의 화합물 농도를 LC-MS/MS 방법으로 결정하기 위해 투여후 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 및 120시간에 채혈하였다 (시점당 n=3). MOD-6031 (PEG-S-MAL-FMS-OXM) 및 그것의 가수분해된 생성물; PEG-S-MAL-FMS-NHS 및 OXM에 대해 약력학적 파라미터 예컨대 Cmax, Tmax, AUC, T1/2Cl 및 Vz을 계산하였고, 이들 파라미터는 각각 표 7a, 7b 및 7c에 나타내었다. AUC 0-∞는 모든 용량에서 모든 성분에 대해 AUC 0-t의 15% 이내로, 각각의 성분의 약력학적 프로파일을 특징화하기에 샘플링 스케줄이 적절하였다는 것을 나타냈다. 3 성분에 대해, 노출은 용량- 비례하는 것으로 나타났다. 일반적으로, Cmax 및 AUC0-t는 용량에 비례하고 그리고 용량의 증가와 대략 동일한 비율로 증가했다.
각각의 성분에 대한 파라미터는 표 8에 몰 농도로 표시되었다. Cmax 값은 PEG-S-MAL-FMS-OXM 및 PEG-S-MAL-FMS-NHS에 대해 대략 동등하였고 OXM에 대해서는 더 낮았다. PEG-S-MAL-FMS-OXM 및 OXM에 대해 관측된 T1/ 2은 각각 대략 9 및 12시간이었다. PEG-S-MAL-FMS-NHS에 대해 말단 T1/ 2은 매우 더 길어, 대략 30시간이었다. 대조군 동물로부터의 모든 샘플과 투여전에 수집된 모든 샘플은 검정의 하한 아래였다.
약력학적 및 약리적 데이터는 MOD6031의 지효성 특성을 확인한다. 3000nmoles/kg의 MOD6031의 매주 2회 용량은 체중 및 음식 소비를 상당히 감소했으며 이는 6000nmoles/kg 용량으로 투여된 OXM 펩타이드 처리군의 1일 2회에 비교할 만하여 또한 약물 부하에서 상당한 감소를 유도했다.
표 7a: 1000, 3000, 또는 6000nmoles/kg의 SC 주사에 따른 PEG-S-MAL-FMS-OXM 약력학적 파라미터
Figure pct00037
표 7b: 1000, 3000, 또는 6000nmoles/kg의 MOD-6031의 SC 주사에 따른 PEG-S-MAL-FMS-NHS 약력학적 파라미터
Figure pct00038
주석: 투여 용액 내 PEG-S-MAL-FMS-NHS 불순물에 기인하여, PEG-S-MAL-FMS-NHS (MOD-6031 플러스 PEG-S-MAL-FMS-NHS 불순물)의 투여된 용량은 각각 1000, 3000 및 6000nmol/kg 대신에 1515, 4545, 및 9090nmol/kg였다.
표 7c: 1000, 3000, 또는 6000nmoles/kg의 MOD-6031의 SC 주사에 따른 OXM 약력학적 파라미터
Figure pct00039
NC= 농도 대 시간 프로파일 형상에 기인하여, 파라미터는 계산될 수 없었다.
표 8: 몰 기준으로 3 성분을 비교한 약력학적 파라미터
Figure pct00040
a PEG-S-MAL-FMS-NHS의 용량은 불순물을 고려한다 (MOD-6031 플러스 PEG-S-MAL-FMS-NHS 불순물).
MOD-6031은 말단 글루코스를 용량-의존적으로 감소하였고 그리고 동물에서 인슐린을 현저하게 감소하여 (p<0.01 도 27), MOD-6031 처리는 인슐린 감수성을 개선했다는 것을 나타냈다. 양자 변수에 대해 6000nmoles/kg 용량의 MOD6031로 관측된 감소는 쌍으로 공급된 대응물의 것보다 상당히 더 컸다 (p<0.001). 리라글루타이드 had no 통계적으로 상당한 효과 on 혈장 인슐린 또는 글루코스 at the 연구 종료. 그에 반해서, 옥신토모둘린 상당히 reduced both 파라미터 (p<0.05 for 글루코스, p<0.001 for 인슐린).
실시예 7
ob/ob 마우스 모델에서 PEG30 - Fmoc - OXM 및 PEG30 - EMCS - OXM에 비교된 PEG30-FMS-OXM에 의한 체중, 혈당 및 지질 프로파일의 개선
MOD-6031 (PEG30-S-MAL-FMS-OXM) 대 그것의 느린 속도 가수분해 변이체 (PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM)와 N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)석신이미드 (EMCS)가 링커로 Fmoc을 대체하는 그것의 비-가역적 형태 (PEG30-EMCS-OXM)의 약리학 효능을 평가하기 위해 이 연구에서 당뇨병의 유전적 모델로 ob/ob 마우스 모델을 사용하였다. 이들 모든 3개 페길화된 콘주게이트에서, 링커는 OXM 펩타이드의 N 아미노 말단으로 측면 지향된다.
이 연구는 6000nmol/kg으로 매 4일마다 투여될 때, MOD-6031, PEG30-Fmoc-OXM 및 PEG30-EMCS-OXM의 약리학 효능를 비교하였고, 반면 PEG-SH는 연구 대조군으로 사용되었다. 측정된 약리적 파라미터는 체중, 음식 및 물 섭취, 글루코스 및 인슐린 조절 및 지질 프로파일이었다. 3개 콘주게이트의 투여 모두는 연구의 처음 2 또는 3주 동안 비히클 (PEG-SH) 그룹에 비교하여 체중 및 음식 섭취를 상당히 감소하였고 (도 13; 도 14), 반면 단지 MOD-6031만이 연구 종료까지 그리고 더 큰 정도로 이 추세를 나타냈다. 대조군 (PEG-SH)에 비교된 체중에서의 최종 감소 변화 (33일째)는 MOD-6031, PEG30-Fmoc-OXM 및 PEG30-EMCS-OXM에 대해 각각 25.4%, 5.1%, 2.4%였다. 단지 MOD-6031만이 대조군에 비교하여 상당히 더 낮은 체중 값을 나타냈다. 그것의 쌍으로 공급된 그룹에 비교하여 PEG30-Fmoc-OXM의 체중에서의 감소 변화는 무의미하였다 (2.6%). 체중 감소는 MOD-6031 및 PEG30-Fmoc-OXM에 대한 각각의 약물 주사에 따라 관측된 반면, PEG30-EMCS-OXM에 대해서, 체중 감소는 투여가 밤새 절식에 이어진 날에만 발생했다. 동일한 프로파일이 음식 섭취의 감소에 대해 관측되었다. 이 연구에 따른 혈당 파라미터의 측정은 MOD-6031 그룹에 대해 비-공복 혈당의 상당한 개선 (도 15A) 및 MOD-6031 및 PEG30-Fmoc-OXM 그룹에 대한 공복 혈당의 상당한 개선 (도 15B)을 나타냈다. OGTT 절차는 2 및 30일에 수행되었다 (각각 도 16 및 17). 2일 OGTT에서, MOD-6031 및 PEG30-Fmoc-OXM은 혈장 글루코스가 상당히 감소됨으로 내당능을 상당히 개선하고, 그리고 인슐린 분비는 병행하여 상당히 증가했다 (도 16). 쌍으로 공급된 그룹 동물은 시험된 임의의 시점에서 대조군과 상당히 상이하지 않은 글루코스 용량 후 글루코스 편위를 나타냈다. 30일 OGTT에서, MOD-6031 및 PEG30-Fmoc-OXM 양자에 대해 상당하게 개선된 글루코스 프로파일이 관측되었으나, 후자에 대해서는 보다 낮은 정도로 관측되었다. 또한, 대조군에 비교하여 감소된 인슐린 반응이 양자 그룹에서 관측되어, 화합물이 인슐린 감수성을 개선했다는 것을 시사한다 (도 17). 지질 프로파일 및 프룩토스아민에 대해 분석된 말단 혈장 샘플은 MOD-6031 및 PEG30-Fmoc-OXM 양자에 의한 두 시험에 대해 상당한 감소를 보였다 (도 18; 도 19). 모든 다른 연구 결과에서와 같이, 두 사례 모두에서, MOD-6031은 PEG30-Fmoc-OXM에 비해 우위를 나타냈다.
실시예 8
MOD-6031의 생체외 가수분해 속도의 시험관내 특성규명
이 연구는 상이한 조건: 상이한 pH, 온도, 및 상이한 종의 혈장 하에서 MOD-6031의 생체외 가수분해 속도를 특성규명하고 비교하기 위해 수행하였다.
물질 및 방법
생물학적 분석 방법은 액체 크로마토그래피 대기압 이온화 탠덤 질량 분광분석법 (LC-MS/MS)에 의해 K2EDTA 랫트 및 원숭이 혈장에서 PEG-S-MAL-FMS-OXM, PEG-S-MAL-FMS-NHS, 및 OXM의 결정에 대해 입증되었다. PEG- S-MAL-FMS-OXM, PEG-S-MAL-FMS 및 OXM 각각에 대한 내부 표준으로 안정적인 표지된 PEG-S-MAL-FMS-OXM, 안정적인 표지된 PEG-S-MAL-FMS-NHS, 및 13C24, 15N4-OXM을 사용하였다. PEG-S-MAL-FMS-OXM, PEG-S-MAL-FMS- NHS, 및 OXM과 그것의 내부 표준은 아세토니트릴을 사용한 낮은 pH에서 단백질 침전 추출에 의해 시험된 혈장 샘플로부터 추출되었다. 건조 및 재구성을 위한 증발 후, 추출물은 LC-MS/MS로 분석되었다. PEG- S-MAL-FMS-OXM, PEG-S-MAL-FMS-NHS 및 OXM에 대한 보정 곡선은 모든 데이터 세트에 대해 새롭게 준비되었고 분석된 성분을 정량하기 위해 사용되었다.
상이한 pH 값은 pH 6.8, 7.4 및 7.8로 인산염 버퍼를 사용하여 달성되었다. 35℃, 37℃ 및 41℃의 온도에서 인큐베이션은 랫트 혈장에서 검사되었다. 랫트, 사이노몰구스 원숭이 또는 인간 혈장에서 인큐베이션된 MOD-6031의 가수분해 속도의 비교는 37℃에서 평가되었다. 인간 혈장에 대해, 모아진 및 개별적인 샘플 양자는 남성 및 여성 대상체로부터 유래된 혈장을 사용하여 측정되었다. MOD-6031 (총 물질 중 400μg/ml)을 관련된 혈장 또는 완충액을 함유하는 튜브에 첨가하였고 (N=3), 및 샘플을 상기 상이한 조건하에서 0 (물질 부가 후 즉시), 4, 8, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 가수분해는 지정된 시점에서 -70℃로 샘플을 동결함에 의해 중단시켰다. 단백분해 효소에 의해 관련없고 비-특이적인 절단을 피하기 위해, DPPIV 억제제 (1%) 및 아프로티닌 (500KIU/ml)을 MOD-6031의 첨가 전에 혈장 샘플에 첨가하였다. 각각의 조건에 대해, 3개 독립적인 샘플을 조제하였다. 샘플은 35℃, 37℃ 및 41℃ 중 어느 하나의 소정의 온도에서 배양하였다. 모든 샘플은 분석 전에 -70℃에서 저장하였다. MOD-6031 (PEG- S-MAL-FMS-OXM), OXM 및 PEG-S-MAL-FMS-NHS 농도는 LC-MS/MS 방법을 이용하여 정량화하였다. MOD-6031 가수분해 프로파일을 확립하고 상이한 혈장 매트릭스에서 가수분해 속도를 계산하였다.
탐구된 조건은 다음과 같다:
a. pH, 여기서 가수분해는 pH 6.8, 7.4 및 7.8에서 시험되었다;
b. 온도, 여기서 가수분해는 35℃, 37℃ 및 41℃의 온도에서 시험되었다; 및
c. 혈장 공급원, 여기서 가수분해는 랫트, 사이노몰구스 원숭이 및 인간으로부터 수득된 혈장 샘플에서 시험되었다. 인간 혈장에 대해, 모아진 및 개별적인 샘플 양자가 사용되었고, 그리고 가수분해 속도는 남성 및 여성으로부터의 혈장에 대해 개별적으로 측정되었다.
MOD-6031 (총 물질 중 400μg/ml)을 최대 72시간의 상이한 조건하에서 배양하였다. 지정된 시점에서, LC-MS/MS 분석을 위해 샘플을 취했다. MOD-6031, 및 그것의 분해 생성물 OXM 및 PEG-S-MAL-FMS-NHS를 정량화하고, 그리고 따라서 약력학적 분석을 수행하였다.
결과는 pH 수준이 MOD-6031 가수분해 속도에 효과가 있다는 것을 나타냈다; 더 높은 pH (pH 7.8)에서 가수분해 속도는 더 낮은 pH (pH 6.8)에서의 가수분해 속도에 비교하여 더 높았다 (표 9, 도 20A-20C). 온도에 관해, 41℃에서 배양은 35℃ 또는 37℃에서 배양에 대한 가수분해 속도와 비교하여 더 높은 가수분해 속도를 초래했다 (표 10, 도 21A-21C). MOD-6031은 측정된 매트릭스에서 OXM 및 PEG-S-MAL-FMS-NHS 농도의 유사한 증가와 유사한 청소율에 의해 반영된 바와 같이 대부분의 혈장 샘플에서 비교할만한 가수분해 속도를 가졌다 (표 11, 도 22A-22C). 종 사이 및 동일한 종의 상이한 롯트에서 OXM의 청소율에서 가변성이 있었다. PEG-S-MAL-FMS-NHS 청소율은 상이한 혈장 종에서 매우 유사했다.
결론: 랫트, 원숭이 및 인간 매트릭스로부터의 혈장에서 배양된 MOD-6031의 가수분해 속도 및 가수분해 패턴은 매우 유사하였고 각각의 종 당 상이한 개체로부터 관측된 것보다 많은 유의차를 나타내지 않았다.
표 9: 상이한 pH에서 PEG-S-MAL-FMS-OXM, OXM 및 PEG-S-MAL-FMS-NHS의 PK 분석
Figure pct00041
표 10: 상이한 온도에서 PEG-S-MAL-FMS-OXM, OXM 및 PEG- S-MAL-FMS-NHS의 PK 분석
Figure pct00042
표 11: OXM, PEG- S-MAL-FMS 및 PEG- S-MAL-FMS-OXM에 대한 PK 값
Figure pct00043
실시예 9
디펩티딜 펩티다아제 IV ( DPPIV ) 소화로부터 MOD-6031의 PEG 모이어티에 의해 제공된 보호의 시험관내 평가
MOD-6031, OXM 펩타이드 및 PEG-EMCS-OXM을 DPPIV로 배양하고 각각의 소화를 RP-HPLC로 시험하였다. 소화된 및 비-소화된 형태를 확인하고 측정하였다.
먼저, 10mM Tris 완충액 내에서 2개의 상이한 pH 수준 (pH=6 및 pH=7)에서 OXM 펩타이드 분해의 예비 시험을 평가하였다. 각각의 반응물은 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 50μl의 반응물을 DDW 내 100μl의 0.1% TFA로 희석하였다. 10μl의 이 용액을 그런 다음 RP-HPLC Intrada WP-RP 2 x 50mm, 3μm, 300Å 칼럼 (총 3.3μg)에 장입하였다.
OXM 및 MOD-6031의 비-소화된 및 소화된 형태를 RP-HPLC 칼럼을 사용하여 확인하였다. OXM의 활성 형태로 절단된 OXM 3-37의 용출 시간은 0.2분으로 OXM 펩타이드와 다르다. 소화 백분율은 상대적인 영역 백분율을 측정함에 의해 평가하였다. 각각의 반응물에 대해, DPPIV가 없는 대조군 샘플을 제조하고 측정하였다.
MOD-6031 및 PEG-EMCS-OXM을 DPPIV와 함께 배양하고 소화 백분율을 측정하였다. 반응 조건은 상기 OXM 펩타이드에 대해 기재된 바와 동일하였다.
효소 디펩티딜 펩티다아제 IV (DPPIV)는 대부분 세포 유형에서 발현되고 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 디펩타이드를 단리하는 고유 막 당단백질이다. DPPIV에 의한 OXM 소화는 시험관내 및 생체내에서 실증되었고, 혈류에서 펩타이드의 짧은 반감기에 대한 주요 원인으로 간주된다. OXM은 아미노산 위치 2와 3 사이에서 절단되어, 비-활성 형태 OXM 3-37을 초래한다. 이 연구에서, 가역적 및 비-가역적 콘주게이션, MOD-6031 및 PEG-EMCS-OXM 각각에서 PEG에 연결된 OXM 펩타이드의 DPPIV에 의한 소화가 검사되었다.
pH=6 대 pH=7에서 DPPIV 효소에 의한 OXM 펩타이드 분해 속도의 예비 평가는, pH=6에서 DPPIV 효소가 37℃에서 1시간 배양 후 pH=7에서 26.52에 비교하여, pH=6에서 OXM 3-37에 대한 46.12의 상대적인 영역 %로 더 효과적이었다는 것을 나타냈다 (도 23-24, 표 12-15). 따라서 MOD-6031의 소화 연구는 MOD-6031 가수분해 예방에 또한 바람직한 조건인 pH=6에서 수행하였다.
DPPIV에 의한 MOD-6031 및 PEG-EMCS-OXM의 소화 퍼센트를 측정하였다. MOD-6031 콘주게이트의 분해는 DPPIV로 배양 후 평가하였고 (도 25, 표 17) OXM 펩타이드에 대해 사용된 동일한 조건을 사용하여 RP-HPLC 칼럼에 의해 분석한다. 음성 대조군으로, 다양한 pH 및/또는 온도로 되지만 첨가된 DPPIV가 없는 반응은 OXM이 가수분해되지 않았다는 것을 확인하기 위해 수행되었다. 양성 대조군으로, 콘주게이트의 일부가 아닌 OXM의 가수분해를 평가하는 반응이 측정되었다. (도 25, 표 16).
효소 DPPIV의 부재에서 MOD-6031의 배양 후 MOD-6031의 분해는 관측되지 않았고, 따라서 OXM이 가수분해는 없다, 상대적인 영역의 백분율은 98.28이었다. DPPIV 1X [DPPIV 농도](표 17) 및 10X [DPPIV 농도 (표 18)로 두 반응을 수행하였다 양자 반응에서 OXM의 분해는 관측되지 않았고 MOD-6031의 상대적인 영역 백분율은 각각 98.49 및 98.24이었다.
비-가역적 페길화된 PEG-EMCS-OXM을 또한 동일한 방식으로 DPPIV에 의한 OXM 분해에 대해 시험하였다 (도 26, 표 20). 대조군으로, DPPIV가 없는 반응을 준비하였다 (도 26, 표 19). 양자 반응에서, 콘주게이트의 분해는 관측되지 않았다. PEG-EMCS-OXM의 상대적인 영역 백분율은 각각 98.48 및 99.09이었다.
여기에 제시된 결과에 기초하여, 가수분해성 또는 비-가수분해성 링커를 통해 PEG 모이어티에 접합된 OXM은 DPPIV에 의한 분해로부터 보호된다고 귀결되어 질 수 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
본 발명의 특정 특징이 본 명세서에 예시되고 기재되었지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 등가물이 이제 당해 분야의 숙련가에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 그러한 모든 변형 및 변경을 포함하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Opko Biologics Ltd FIMA, Udi Eyal HERSHKOVITZ, Oren <120> PEGYLATED OXYNTOMODULIN VARIANTS <130> P-76093-PC2 <140> PCT/IL2016/050557 <141> 2016-05-29 <150> 14/725,883 <151> 2015-05-29 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35

Claims (25)

  1. 식 II:
    Figure pct00047

    여기서 R2는 SO3H임;
    의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 제조방법:
    하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
    Figure pct00048

    여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
    를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
    그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
    에 의해 식 II의 구조를 생성하는 단계로, 여기서 상기 OXM의 His1의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결됨.
  2. 제1항에 있어서, 상기 과잉은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Lys12 및 Lys30의 상기 아미노 잔기의 상기 보호기는 1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸]) , (ivDde)인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와의 상기 반응은 6 내지 6.5 사이 pH의 완충액 조건하에서 수행되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PEG는 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위인 분자량을 갖는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 PEG는 30,000 Da의 평균 분자량을 갖는 분자량을 갖는 방법.
  7. 식 III:
    Figure pct00049

    여기서 R2는 SO3H임;
    의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 제조방법:
    하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
    Figure pct00050

    여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
    를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되고 His1의 α-아미노가 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
    그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
    에 의해 식 III의 구조를 생성하는 단계로, 여기서 상기 OXM의 Lys30의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결됨.
  8. 제7항에 있어서, 상기 과잉은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산을 포함하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 Lys12의 상기 아미노 잔기의 상기 보호기는 1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸]) , (ivDde)인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 His1의 상기 아미노 잔기의 상기 보호기는 Boc 기인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와의 상기 반응은 6 내지 6.5 사이 pH의 완충액 조건하에서 수행되는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 PEG는 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위인 분자량을 갖는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PEG는 30,000 Da의 평균 분자량을 갖는 분자량을 갖는 방법.
  14. 식 IV:
    Figure pct00051

    여기서 R2는 SO3H임;
    의 구조에 의해 표시되는 옥신토모둘린 콘주게이트의 제조 방법으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 제조방법:
    하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS (R2=SO3H):
    Figure pct00052

    여기서 상기 MAL-FMS-NHS는 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합함에 의해 제조되고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가됨;
    를 옥신토모둘린 수지와 반응하는 단계, 여기서 상기 옥신토모둘린의 아미노산의 측쇄는 보호되고 His1의 α-아미노가 보호되어, 대응하는 MAL-FMS-보호된 OXM을 얻음;
    그 다음 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응, 여기서 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하는 것은 상기 PEG-SH와 반응 후 또는 전에 수행됨;
    에 의해 식 III의 구조를 생성하는 단계로, 여기서 상기 OXM의 Lys12의 상기 아미노 잔기는 상기 FMS에 연결됨.
  15. 제14항에 있어서, 상기 과잉은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 Lys30의 상기 아미노 잔기의 상기 보호기는 1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸]) , (ivDde)인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 His1의 상기 아미노 잔기의 상기 보호기는 Boc 기인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 상기 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와의 상기 반응은 6 내지 6.5 사이 pH의 완충액 조건하에서 수행되는 방법.
  19. 제14항에 있어서, 상기 PEG는 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위인 분자량을 갖는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 PEG는 30,000 Da의 평균 분자량을 갖는 분자량을 갖는 방법.
  21. 하기 구조에 의해 표시되는 MAL-FMS-NHS의 제조 방법으로:
    Figure pct00053

    상기 방법은 MAL-Fmoc-NHS를 트리플루오로아세트산 및 클로로설폰산과 혼합하는 것을 포함하고, 여기서 상기 MAL-Fmoc-NHS는 순수한 트리플루오로아세트산에 용해되고, 그리고 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 과잉의 상기 클로로설폰산은 반응 혼합물에 첨가되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 과잉은 순수한 트리플루오로아세트산에 용해된 6 당량의 클로로설폰산을 포함하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 제조는 상기 MAL-FMS-NHS를 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 정제하는 단계는 침전 및 여과를 포함하고, 그리고 상기 MAL-FMS-NHS는 적어도 약 50% 순도를 갖는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 순도 적어도 90%인 방법.
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