CN107847546A - 聚乙二醇化的胃泌酸调节素变体 - Google Patents

聚乙二醇化的胃泌酸调节素变体 Download PDF

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Abstract

公开了包括经由可逆连接体比如9‑芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基‑9‑芴基甲氧羰基(FMS)连接的胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)的组合物。还公开了包括可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素的药物组合物和其使用方法。

Description

聚乙二醇化的胃泌酸调节素变体
技术领域
公开了一种组合物，其包括经由可逆连接体比如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接的胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)。还公开了包括可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素的药物组合物和其使用方法。
背景技术
胃肠道负责合成和释放许多调控进食行为的肽激素，包括胰蛋白(PP)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、肽YY(PYY)和胃泌酸调节素(OXM)。OXM由肠和CNS中的胰高血糖素原的组织特异性翻译后(post-transitional)加工产生。它包含37个氨基酸，包括具有C端碱性八肽延伸——其显示在体外和体内二者均有助于OXM的性质，但是对于肽的作用而言，并不是单独足够的——的完整的胰高血糖素序列。响应于食物摄取，OXM由肠L细胞与膳食热含量成比例地分泌入血流。
OXM在口服和腹膜内施用二者后经由刺激胰岛素分泌增强葡萄糖清除率。它还调控食物摄取的控制。将OXM脑室内(ICV)和核内注入下丘脑的室旁核和弓状核(ARC)抑制禁食大鼠的再摄食。此抑制在黑暗期开始时在自由摄食的大鼠中也已经被证实。而且，外周施用的OXM剂量依赖性地抑制禁食诱导的和黑暗期的食物摄取。
不利的药物动力学，比如短血清半衰期，可能妨碍许多在其它方面有希望的药物候选的制药研发。血清半衰期是分子的经验特性，并且对于每种新的潜在药物必须实验测定。例如，在较低分子量蛋白药物的情况下，生理学清除机制比如肾过滤可能使得维持药物的治疗性水平由于需要的给药方案的成本或频率而不可行。
蛋白质并且尤其是短肽在血液、肝或肾中易于变性或酶促降解。因此，蛋白质通常具有数小时的短循环半衰期。由于其低稳定性，经常以持续频率递送肽药物，以便于维持活性肽的有效血浆浓度。而且，由于经常通过输注施用肽药物，频繁注射肽药物引起对象相当大的不适。因而，对将延长治疗性蛋白和肽的半衰期同时维持其高药理学功效的技术存在需要。这样期望的肽药物还应当满足如下要求：增强的血清稳定性、高活性和当注入对象时诱导不期望的免疫反应的低可能性。
本发明涉及OXM衍生物，其中利用可逆聚乙二醇化技术来延长肽的半衰期。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)构成的组合物，其中所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS被附连至所述胃泌酸调节素的氨基端。
在一个实施方式中，本发明涉及由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)构成的组合物，其中所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS被附连至所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的第十二位上的赖氨酸残基(Lys12)。
在另一个实施方式中，本发明涉及由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)构成的组合物，其中所述PEG聚合物经由Fmoc或FMS被附连至所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的第三十位上的赖氨酸残基(Lys30)。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备由式II的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除所述保护基和所述树脂；
以产生式II的结构，其中所述OXM的His1的所述氨基残基被连接至所述FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备由式III的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护并且His1的α-氨基被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除所述保护基和所述树脂；
以产生式III的结构，其中所述OXM的Lys30的所述氨基残基被连接至所述FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备由式IV的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护并且His1的α-氨基被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除所述保护基和所述树脂；
以产生式III的结构，其中所述OXM的Lys12的所述氨基残基被连接至所述FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备由下列结构表示的MAL-FMS-NHS的方法：
所述方法包括混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物。
在一个实施方式中，方法包括使用溶解于纯的三氟乙酸的2至10当量之间的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用溶解于纯的三氟乙酸的6当量的氯磺酸。
根据下列详细描述实例和附图，本发明的其它特征和优势将变得明显。然而，应当理解在指示本发明的优选实施方式时，仅以说明的方式给出详细描述和具体实例，这是由于根据此详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改对本领域技术人员将是明显的。
附图说明
下列附图形成本说明书的一部分并且被包括以进一步证明本公开内容的某些方面，结合本文呈现的具体实施方式的详细描述参考这些附图中的一幅或多幅可以更好地理解其发明。专利或申请文件包含至少一幅以颜色着笔的附图。在请求和支付必要费用之后，专利局将提供具有彩色附图(一幅或多幅)的本专利或专利申请出版物的副本。
图1显示了产生的PEG-S-MAL-FMS-OXM缀合物的不同变体。
图2是显示当与过表达GLP-1受体的CHO-K1细胞培育时非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)的体外活性(cAMP定量)的图表。
图3是显示非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)在IPGTT模型中的体内活性的图表。与媒介组比较，所有化合物均诱导葡萄糖耐量。
图4显示了非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)对雄性ob/ob小鼠的体重的作用。
图5显示了非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)对雄性ob/ob小鼠的食物摄取的作用。
图6A-图6B显示了非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)对雄性ob/ob小鼠的非禁食(图6A)和禁食葡萄糖(图6B)的作用。
图7显示了MOD-6031、OXM和利拉鲁肽(liraglutide)对雄性ob/ob小鼠的累积性食物摄取的作用。
图8显示了MOD-6031、OXM和利拉鲁肽对雄性ob/ob小鼠的体重的作用。
图9A-图9B显示了MOD-6031、OXM和利拉鲁肽对雄性ob/ob小鼠的自由摄食(图9A)和禁食血浆葡萄糖(图9B)的作用。
图10显示了MOD-6031和配对喂养(pair fed)组在研究的第2天对雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐量(2g/kg po)的作用。
图11显示了MOD-6031和配对喂养组在研究的第30天对雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐量(2g/kg po)的作用。
图12显示了MOD-6031、OXM和利拉鲁肽对雄性ob/ob小鼠的终末(terminal)血浆胆固醇的作用。
图13显示了PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的体重的作用。
图14显示了PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的累积性食物摄取的作用。
图15A-图15B显示了重复施用的PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的自由摄食(图15A)和禁食血浆葡萄糖(图15B)的作用。
图16显示了PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐量(2g/kg po)的作用。
图17显示了重复施用的PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的葡萄糖耐量(2g/kg po)的作用。
图18显示了重复施用的PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的未禁食终末血浆脂质的作用。
图19显示了重复施用的PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、MOD-6031、和PEG-EMCS-OXM对雄性ob/ob小鼠的未禁食终末血浆果糖胺的作用。
图20A-图20C显示了在不同pH水平下的磷酸盐缓冲剂中，平均MOD-6031(图20A)、OXM(图20C)、和PEG30-S-MAL-FMS-NHS(图20B)浓度对时间。图中显示的附连树脂的PEG-FMS-OXM是MOD-6031并且具有图28A中显示的结构。图中的PEG-FMS指的是如图28B中呈现的PEG30-S-MAL-FMS-NHS。
图21A-图21C显示了在不同温度下的大鼠血浆中，平均MOD-6031(图21A)、OXM(图21C)、和PEG30-S-MAL-FMS-NHS(图21B)浓度对时间。图中显示的附连树脂的PEG-FMS-OXM是MOD-6031并且具有图28A中显示的结构。图中的PEG-FMS指的是如图28B中呈现的PEG30-S-MAL-FMS-NHS。
图22A-图22C显示了在不同的血浆类型中，平均MOD-6031(图22A)、OXM(图22C)、和PEG30-S-MAL-FMS-NHS(图22B)浓度对时间。图中显示的附连树脂的PEG-FMS-OXM是MOD-6031并且具有图28A中显示的结构。图中的PEG-FMS指的是如图28B中呈现的PEG30-S-MAL-FMS-NHS。
图23显示了OXM和OXM+DPPIV在pH＝6下的降解试验。
图24显示了OXM和OXM+DPPIV在pH＝7下的降解试验。
图25显示了MOD-6031、MOD-6031+DPPIV(1×[DPPIV浓度]和10×[DPPIV浓度])在pH＝6下的降解试验。
图26显示了PEG-EMCS-OXM和PEG-EMCS-OXM+DPPIV在pH＝6下的降解试验。
图27显示MOD-6031剂量依赖性地降低终末葡萄糖并且显著地降低胰岛素。
图28A和图28B显示了MOD-6031结构的结构，其中PEG是PEG30并且R2是C2位置上的SO3H(图28A)，以及PEG30-S-MAL-FMS-NHS的结构(图28B)。
具体实施方式
本文提供了长效胃泌酸调节素和其生产和使用方法。在一方面，本发明提供了包括双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和柔性连接体或由它们构成的缀合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体或由它们构成的缀合物。在另一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体或由它们构成的缀合物。在另一个实施方式中，PEG聚合物经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体被附连至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第十二位上的赖氨酸残基(Lys12)。在一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是包括胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)——其经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体被附连至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第十二位上的赖氨酸残基(Lys12)——或由它们构成的缀合物。
在另一个实施方式中，本文提供了用于延长肽的血清半衰期的新型方法。此方法基于使用缀合物，其包括聚乙二醇(PEG)链通过化学连接体(称为FMS或Fmoc)与肽的可逆附连，这导致天然肽缓慢地释放入血流。释放的肽然后还可以穿越血脑屏障以进入中枢神经系统(CNS)或任何其它靶器官。在一个实施方式中，FMS连接体的独特化学结构导致特定的肽释放速率。
因此，在另一个实施方式中，本文提供了用于延长OXM肽的生物学半衰期的方法。在另一个实施方式中，本文提供了用于延长OXM在生物学流体中的循环时间的方法，其中通过缓慢释放完整的OXM肽来延长所述循环时间。在另一个实施方式中，延长所述OXM肽的所述生物学半衰期或所述循环时间使得所述OXM穿越血脑屏障并且靶向CNS。技术人员将领会所述生物学流体可以是血液、血清、脑脊液(CSF)等。
在一个实施方式中，在将本发明的聚乙二醇化的胃泌酸调节素缀合物施用入对象之后，作为由所述缀合物化学化学水解所述FMS或所述Fmoc连接体的结果，胃泌酸调节素被释放入对象中的生物学流体。在另一个实施方式中，释放的胃泌酸调节素是完整的并且恢复完全的GLP-1和胰高血糖素受体结合活性。在另一个实施方式中，使所述FMS或所述Fmoc化学水解延长了所述OXM肽在所述生物学流体中的循环时间。在另一个实施方式中，延长所述OXM的循环时间使得所述OXM穿越血脑屏障并且靶向CNS。在另一个实施方式中，延长所述OXM的循环时间使得所述OXM穿越血脑屏障并且靶向下丘脑。在另一个实施方式中，延长所述OXM的循环时间使得所述OXM穿越血脑屏障并且靶向弓状核。
在一方面，PEG30-FMS-OXM的氨基变体是定点缀合物，其包括通过双官能连接体(FMS或Fmoc)连接的OXM和mPEG(30)-SH。在另一个实施方式中，OXM肽通过其N端侧的端胺接合，所述端胺从一侧与连接体上的N-琥珀酰亚胺酯(NHS)基团反应，而mPEG(30)-SH通过其硫醇基团与FMS连接体的马来酰亚胺部分接合(参见本文的实施例)。Lys12和Lys30变体通过其Lys残基的胺基团被缀合至FMS连接体。在一个实施方式中，在本文利用可逆聚乙二醇化方法以生成在本文提供的长效胃泌酸调节素(OXM)肽(例如PEG30-FMS-OXM)。
在一个实施方式中，术语双重“GLP-1/胰高血糖素受体激动剂”和“激动剂”在本文可互换地使用。在另一个实施方式中，该术语还包括本领域已知的任何GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施方式中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂包括天然存在的双重激动剂。在另一个实施方式中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂包括非天然存在的双重激动剂。在另一个实施方式中，非天然存在的GLP-1/胰高血糖素受体激动剂以不同于胃泌酸调节素的对这些受体的亲和力结合至GLP-1和胰高血糖素受体。在另一个实施方式中，优选的激动剂是胃泌酸调节素或OXM或其功能性变体。
在一个实施方式中，术语“功能性”指的是在本文提供的激动剂或OXM具有生物学活性的能力，如在本文进一步提供的，其包括但不限于降低重量、增加胰岛素敏感度、降低胰岛素抗性、增加诱导葡萄糖耐量的能量消耗、诱导血糖控制、改进胆固醇水平等。
在一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体的缀合物，其中PEG聚合物经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体被附连至所述胃泌酸调节素氨基酸序列的第三十位上的赖氨酸残基(Lys30)。在一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是包括胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)——其经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体附连至胃泌酸调节素氨基酸序列的第十二位上的赖氨酸残基(Lys30)——或由它们构成的缀合物。
在一个实施方式中，本发明提供了由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体构成的缀合物，其中PEG聚合物经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体被附连至所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的第三十位上的赖氨酸残基(Lys30)。在一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是包括胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)——其经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体附连至胃泌酸调节素氨基酸序列的第十二位上的赖氨酸残基(Lys30)——或由它们构成的缀合物。
在一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体的缀合物，其中PEG聚合物经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体被附连至所述胃泌酸调节素的氨基端。在一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是包括胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)——其经由Fmoc或FMS连接体附连至胃泌酸调节素的氨基酸序列的氨基端——或由它们构成的组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了由胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体构成的缀合物，其中PEG聚合物经由Fmoc或FMS连接体被附连至所述胃泌酸调节素的氨基端。在一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是包括胃泌酸调节素和聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)——其经由Fmoc或FMS连接体附连至胃泌酸调节素的氨基酸序列的氨基端——或由它们构成的缀合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素肽和聚乙二醇(PEG)聚合物的缀合物，所述聚乙二醇(PEG)聚合物经由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体缀合至胃泌酸调节素肽的第十二位(Lys12)或第30位(Lys30)上的赖氨酸氨基酸或缀合在胃泌酸调节素肽的氨基端上。在另一个实施方式中，本发明提供了由胃泌酸调节素肽和聚乙二醇(PEG)聚合物构成的修饰的胃泌酸调节素肽，所述聚乙二醇(PEG)聚合物经由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体缀合至胃泌酸调节素肽的第十二位(Lys12)或第30位(Lys30)上的赖氨酸氨基酸或缀合在胃泌酸调节素肽的氨基端上。在另一个实施方式中，PEG在Lys12、Lys30处或在氨基端处被附连至胃泌酸调节素的缀合物分别称为胃泌酸调节素的“Lys12变体”、“Lys30变体”或“氨基变体”。在一个实施方式中，术语“氨基变体”或“氨基端变体”与“N末端变体”、“N’变体”或“N端变体”同义。应理解技术人员可以由本发明指导而容易地以位点特异性或随机方式遍及OXM序列插入赖氨酸残基，以便在这些赖氨酸残基处附连在本文提供的连接体(Fmoc或FMS)/PEG缀合物。在一个实施方式中，一个或多个赖氨酸残基位于遍及OXM序列的不同位置并且被用于将OXM缀合至PEG和可裂解的连接体(例如FMS或Fmoc)的变体也被涵盖在本发明中。
在一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素肽和聚乙二醇(PEG)聚合物的缀合物，所述聚乙二醇(PEG)聚合物经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体缀合至胃泌酸调节素肽的第十二位(Lys12)和第30位(Lys30)上的赖氨酸氨基酸。在另一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素肽和聚乙二醇(PEG)聚合物的缀合物，所述聚乙二醇(PEG)聚合物经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体缀合至胃泌酸调节素肽的第十二位上的赖氨酸氨基酸(Lys12)和缀合在氨基端上。在另一个实施方式中，本发明提供了包括胃泌酸调节素肽和聚乙二醇(PEG)聚合物的缀合物，所述聚乙二醇(PEG)聚合物经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)连接体缀合至胃泌酸调节素肽的第三十位上的赖氨酸氨基酸(Lys30)和缀合在氨基端上。
在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是聚乙二醇化的胃泌酸调节素。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素。在另一个实施方式中，短语“长效胃泌酸调节素”、“可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素”、“可逆聚乙二醇化的OXM”、或“包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)或由它们构成的缀合物”可交换地使用。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是经由任选地取代的Fmoc或FMS连接体连接至PEG的OXM。在另一个实施方式中，长效OXM经由其Lys12残基、或其Lys30残基或其氨基(N’)端被连接至任选地取代的Fmoc或FMS。
在一个实施方式中，本发明的长效胃泌酸调节素包括PEG聚合物。在另一个实施方式中，本发明的长效胃泌酸调节素包括经由任选地取代的Fmoc或FMS缀合至胃泌酸调节素肽的氨基端的PEG聚合物。在另一个实施方式中，本发明的长效胃泌酸调节素包括经由任选地取代的Fmoc或FMS缀合至胃泌酸调节素肽的赖氨酸残基12或30的PEG聚合物。在另一个实施方式中，本发明的长效胃泌酸调节素包括经由任选地取代的Fmoc或FMS缀合至胃泌酸调节素肽的氨基端与胃泌酸调节素的赖氨酸残基12和30二者的PEG聚合物。
在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是以1:0.2-10:0.2-10的摩尔比包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)或由它们构成的缀合物。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是以1:0.5-2:0.5-2的摩尔比包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)或由它们构成的缀合物。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是以1:1:1的摩尔比包括胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)或由它们构成的缀合物。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素包括经由任选地取代的Fmoc或FMS缀合至胃泌酸调节素的氨基端的PEG聚合物。在另一个实施方式中，OXM-PEG-连接体的摩尔比是1:1:1-1:1:3.5。在另一个实施方式中，摩尔比是1:1:1-1:1:10.0。在另一个实施方式中，较高比率的连接体允许优化产率的缀合物。
在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素经由可逆连接体——比如，但不限于任选地取代的Fmoc和FMS——被连接至PEG。在另一个实施方式中，Fmoc和FMS对碱敏感并且在生理学条件下可去除。在另一个实施方式中，可逆连接体是对碱敏感并且在生理学条件下可去除的连接体。在另一个实施方式中，可逆连接体是对碱敏感并且在血液、血浆、或淋巴液中的生理学条件下可去除的连接体。在另一个实施方式中，可逆连接体是对碱敏感并且在体液中的生理学条件下可去除的连接体。在另一个实施方式中，可逆连接体是在具有碱性pH的体液中可去除的连接体。在另一个实施方式中，对碱敏感的连接体在暴露于碱性环境之后裂解，因而从连接体和PEG释放OXM。在另一个实施方式中，对温度敏感的连接体在暴露于允许发生这样的裂解的特定温度之后裂解。在另一个实施方式中，使得连接体能够裂解的温度在生理学范围内。在另一个实施方式中，可逆连接体是本领域已知的任何可逆连接体。
在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素是缀合物，其中OXM经由可逆连接体被连接至PEG。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素在暴露于碱性环境之后释放游离的OXM。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的胃泌酸调节素在暴露于血液或血浆之后释放游离的OXM。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素包括PEG和胃泌酸调节素，其不像在标准聚乙二醇化程序中一样彼此直接连接，而是两个残基被连接至Fmoc或FMS——其对碱是高度敏感的并且在常规生理学条件下可去除——的不同位置。在另一个实施方式中，常规生理学条件包括生理环境，比如血液或血浆。
在另一个实施方式中，Fmoc和FMS的结构和制造方法在美国专利号7585837中被描述。美国专利号7585837的公开内容由此通过引用以其全部并入。
在一个实施方式中，本发明的缀合物由式I的结构呈现：
(X)n—Y，
其中Y是带有游离的氨基、羧基、或羟基的双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂；
X是式(i)的自由基：
其中R1是包含蛋白质或聚合物运载体部分；聚乙二醇(PEG)部分的自由基；
R2选自氢、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤素、硝基、--SO3H、--SO2NHR、氨基、铵、羧基、PO3H2、和OPO3H2；
R选自氢、烷基和芳基；
R3和R4——相同的或不同的——各自选自氢、烷基和芳基；
当自由基被连接至OXM-Y的氨基或羟基时，A是共价键；并且
n是至少1的整数，和其药学上可接受的盐。
在一个实施方式中，R1是包含蛋白质或聚合物运载体部分；聚乙二醇(PEG)部分的自由基。在另一个实施方式中，PEG部分是-NH-C(O)-(CH2)p-马来酰亚胺-S-PEG，其中p是1-6之间的整数。在另一个实施方式中，p是2。
在另一个实施方式中，式I的n是至少1的整数。在另一个实施方式中，n是1。在另一个实施方式中，n是2。在另一个实施方式中，n在1至5之间。在另一个实施方式中，n在2至5之间。
在另一个实施方式中，GLP-1/胰高血糖素受体激动剂是胃泌酸调节素(OXM)。
在另一个实施方式中，术语“烷基”、“烷氧基”、“烷氧基烷基”、“芳基”、“烷芳基”和“芳烷基”被用于表示1-8个，优选地1-4个碳原子的烷基自由基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基，以及6-10个碳原子的芳基自由基，例如苯基和萘基。术语“卤素”包括溴、氟、氯和碘。
在另一个实施方式中，R2、R3和R4各自是氢。
在另一个实施方式中R2是-氢，A是--OCO--[-OC(＝O)-]，R3和R4各自是氢，即9-芴基甲氧羰基自由基(下文称“Fmoc”)。
在另一个实施方式中，R2是在芴环的第2位处的--SO3H，R3和R4各自是氢，并且A是--OCO--[-OC(＝O)-]。在另一个实施方式中，R2是在芴环的第1位处的--SO3H，R3和R4各自是氢，并且A是--OCO--[-OC(＝O)]。在另一个实施方式中，R2是在芴环的第3位处的--SO3H，R3和R4各自是氢，并且A是--OCO--[-OC(＝O)]。在另一个实施方式中，R2是在芴环的第4位处的--SO3H，R3和R4各自是氢，并且A是--OCO--[-OC(＝O)]。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在一个实施方式中，本发明的缀合物由式II的结构呈现，其中OXM经由所述OXM的氨基端被连接至连接体：
其中R2是氢或SO3H。在一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第2位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第1位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第3位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。在一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第2位处，并且PEG是PEG30。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第1位处，并且PEG是PEG30。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第3位处，并且PEG是PEG30。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第4位处，并且PEG是PEG30。
在一个实施方式中，MOD-6031由式IIa的结构呈现，其中PEG是PEG30并且R2是在芴的第2位处的SO3H：
在一个实施方式中，本发明的缀合物由式III的结构呈现，其中OXM经由所述OXM的Lys30的氨基残基被连接至连接体：
其中R2是氢或SO3H。在一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第2位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第1位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第3位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在一个实施方式中本发明的缀合物由式IV的结构呈现，其中OXM经由所述OXM的Lys12的氨基残基被连接至连接体：
其中R2是氢或SO3H。在一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第2位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第1位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第3位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在一个实施方式中，本发明的缀合物由下式呈现：PEG-S-MAL-Fmoc-OXM、PEG-S-MAL-FMS-OXM、(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM；其中n是至少1的整数。在另一个实施方式中，OXM经由OXM的氨基端或OXM氨基酸中的一个的氨基残基被连接至FMS或Fmoc。在另一个实施方式中，PEG经由–NH-C(O)-(CH2)p-马来酰亚胺-S-被连接至Fmoc或FMS，其中p是1-6之间的整数，并且其中PEG被连接至硫化物基团。
在一个实施方式中，本发明的Fmoc由下列结构呈现：
在一个实施方式中，本发明的FMS由下列结构呈现：
在一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第2位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第1位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第3位处。在另一个实施方式中，R2是SO3H并且在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在另一个实施方式中，OXM包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，OXM由SEQ ID NO:1的氨基酸序列构成。在另一个实施方式中，SEQ ID NO:1包括下列氨基酸(AA)序列：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO:1)或由其构成。在另一个实施方式中，OXM包括在CAS号62340-29-8中描绘的氨基酸序列或由其构成。
在另一个实施方式中，OXM是人OXM或任何哺乳动物OXM。在另一个实施方式中，OXM也被称为胰高血糖素-37或生物活性肠胰高血糖素。在另一个实施方式中，OXM是双重GLP-1/胰高血糖素受体激动剂。在另一个实施方式中，OXM是OXM的生物活性片段。在另一个实施方式中，生物活性的OXM从SEQ ID NO:1的氨基酸30延伸至氨基酸37。在另一个实施方式中，生物活性的OXM从SEQ ID NO:1的氨基酸19延伸至氨基酸37。在另一个实施方式中，本发明的OXM对应于由其缺失两个C端氨基酸的八肽。在另一个实施方式中，本发明的OXM对应于SEQ ID NO:1的保留如在本文提供的OXM活性的任何片段。
在一个实施方式中，OXM指的是SEQ ID NO:1的肽的肽同源物。在一个实施方式中，如使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中陈述的OXM序列至少50％同源。在一个实施方式中，如使用NCBI的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中陈述的OXM序列至少60％同源。在一个实施方式中，如使用NCBI的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中陈述的OXM序列至少70％同源。在一个实施方式中，如使用NCBI的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ IDNO:1中陈述的OXM序列至少80％同源。在一个实施方式中，如使用NCBI的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中陈述的OXM序列至少90％同源。在一个实施方式中，如使用NCBI的BlastP软件以默认参数测定的，本发明的OXM氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中陈述的OXM序列至少95％同源。
在一个实施方式中，本发明的OXM被用于需要OXM为可溶形式的疗法。在另一个实施方式中，本发明的OXM包括由于其含羟基侧链能够增加蛋白质溶解度的一或多种非天然或天然极性氨基酸，包括但不限于丝氨酸和苏氨酸。
在一个实施方式中，本发明的OXM是生物化学合成的，比如通过使用标准固相技术。在另一个实施方式中，这些生物化学方法包括排他性固相合成、部分固相合成、片段缩合、或经典的溶液合成。
在一个实施方式中，固相OXM合成程序是本领域技术人员熟知的并且由JohnMorrow Stewart and Janis Dillaha Young,Solid Phase Protein Syntheses(2nd Ed.,Pierce Chemical Company,1984)进一步描述。在另一个实施方式中，合成的蛋白质通过制备型高效液相色谱法纯化[Creighton T.(1983)Proteins,structures and molecularprinciples.WH Freeman and Co.N.Y.]并且其组成可以通过本领域技术人员已知的方法经由氨基酸测序进行确认。
在另一个实施方式中，重组蛋白技术被用于生成本发明的OXM。在一些实施方式中，重组蛋白技术被用于生成大量本发明的OXM。在另一个实施方式中，重组技术由Bitteret al.,(1987)Methods in Enzymol.153:516-544,Studier et al.(1990)Methods inEnzymol.185:60-89,Brisson et al.(1984)Nature 310:511-514,Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-1680 and Brogli etal.,(1984)Science 224:838-843,Gurley et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565 andWeissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463描述。
在另一个实施方式中，使用编码本发明的OXM的多核苷酸合成本发明的OXM。在一些实施方式中，编码本发明的OXM的多核苷酸被连入表达载体，其包括顺式调控序列(例如启动子序列)的转录控制。在一些实施方式中，顺式调控序列适用于指导本发明的OXM的组成型表达。
在一个实施方式中，短语“多核苷酸”指的是以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如上面的组合)的形式分离和提供的单链或双链核酸序列。
在一个实施方式中，“互补多核苷酸序列”指的是使用逆转录酶或任何其它RNA依赖性DNA聚合酶由逆转录信使RNA产生的序列。在一个实施方式中，序列可以随后使用DNA聚合酶体内或体外扩增。
在一个实施方式中，“基因组多核苷酸序列”指的是由染色体衍生(分离)的序列，并且因而其表示染色体的连续部分。
在一个实施方式中，“复合多核苷酸序列”指的是如此序列：其是至少部分互补的和至少部分基因组的。在一个实施方式中，复合序列可以包括编码本发明的肽所需的一些外显子序列，以及在其间插入的一些内含子序列。在一个实施方式中，内含子序列可以具有任何来源，包括其它基因的，并且通常将包括保守的拼接信号序列。在一个实施方式中，内含子序列包括顺式作用表达调控元件。
在一个实施方式中，使用PCR技术，或本领域技术人员已知的任何其它方法或程序制备本发明的多核苷酸。在一些实施方式中，程序包含使两个不同的DNA序列相连(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”,eds.Ausubel et al.,John Wiley&Sons,1992)。在一个实施方式中，各种原核或真核细胞可以被用作宿主表达系统以表达本发明的OXM。在另一个实施方式中，这些包括但不限于微生物，比如使用包含蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；使用包含蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；使用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或使用包含蛋白编码序列的重组质粒表达载体比如Ti质粒转化的植物细胞系统。
在一个实施方式中，非细菌表达系统被用于(例如哺乳动物表达系统比如CHO细胞)表达本发明的OXM。在一个实施方式中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体是包括CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。
在另一个实施方式中，在本发明的细菌系统中，可以取决于表达的蛋白质的预期用途有利地选择大量表达载体。在一个实施方式中，期望大数量的OXM。在一个实施方式中，期望指导高水平的蛋白产物的表达的载体，其可能作为与疏水性信号序列——其将表达的产物引导入细菌的周质或培养基，其中容易纯化蛋白产物——的融合。在一个实施方式中，某一融合蛋白使用特异性裂解位点改造以帮助回收蛋白质。在一个实施方式中，适于这样的操纵的载体包括但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier et al.,Methods inEnzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施方式中，使用酵母表达系统。在一个实施方式中，如美国专利申请号：5,932,447中公开的，可以在酵母中使用包含组成型或诱导型启动子的大量载体。在另一个实施方式中，使用促进外源DNA序列整合入酵母染色体的载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括另外的多核苷酸序列，其允许例如从单一mRNA翻译数种蛋白质，比如内部核糖体进入位点(IRES)和用于启动子-嵌合蛋白的基因组整合的序列。
在一个实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于可由Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可由Promega获得的pCI，可由Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可由Clontech获得的pTRES，和其衍生物。
在另一个实施方式中，本发明使用包含来自真核病毒比如逆转录病毒的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在另一个实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且衍生自EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它例示性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许蛋白质在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或显示对真核细胞中的表达有效的其它启动子的指导下表达的任何其它载体。
在一个实施方式中，使用植物表达载体。在一个实施方式中，OXM编码序列的表达由大量启动子驱动。在另一个实施方式中，使用病毒启动子比如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson et al.,Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu et al.,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施方式中，使用植物启动子，比如，例如，RUBISCO的小亚基[Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984)；and Brogliet al.,Science 224:838-843(1984)]或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley et al.,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和技术人员熟知的其它技术将构建体引入植物细胞。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant MolecularBiology,Academic Press,NY,Section VIII,pp421-463(1988)]。本发明还可以使用本领域熟知的其它表达系统，比如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
将领会除包含用于转录和翻译插入的编码序列(编码蛋白质)的必需元件以外，本发明的表达构建体还可以包括改造以优化表达的蛋白质的稳定性、产生、纯化、产率或活性的序列。
在一些实施方式中，多种方法可以被用于将本发明的表达载体引入宿主细胞系统。在一些实施方式中，这样的方法一般在Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Surveyof Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)and Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]中被描述，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和感染重组病毒载体。此外，关于正-负选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
在一个实施方式中，在允许表达大量的重组OXM的有效条件下培养转化的细胞。在另一个实施方式中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基指的是细胞被培养以产生本发明的重组OXM的任何培养基。在另一个实施方式中，培养基通常包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物比如维生素的水溶液。在一个实施方式中，可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养本发明的细胞。在另一个实施方式中，在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下实施培养。在另一个实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识内。
在一个实施方式中，取决于根据用于生产的载体和宿主系统，生成的本发明的OXM保留在重组细胞内、分泌入发酵培养基、分泌入两层细胞膜之间的空间比如大肠杆菌中的周质空间；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
在一个实施方式中，在培养预定时间之后，进行重组OXM的回收。
在一个实施方式中，在本文使用的短语“回收重组OXM”指的是收集包含OXM的全部发酵培养基并且不需要隐含额外的分离或纯化步骤。
在另一个实施方式中，在本文提供的OXM可以被化学修饰。具体而言，OXM的氨基酸侧链、氨基端和/或羧酸端可以被修饰。例如，OXM可以经历烷基化、二硫化物形成、金属络合、酰化、酯化、酰胺化、硝化、酸处理、碱处理、氧化或还原中的一种或多种。用于实施这些过程的方法是本领域熟知的。具体而言，OXM被提供为其低级烷基酯、低级烷基酰胺、低级二烷基酰胺、酸加成盐、羧酸盐或碱加成盐形式提供。具体而言，OXM的氨基或羧基端可以通过例如酯化、酰胺化、酰化、氧化或还原被衍生。具体而言，OXM的羧基端可以被衍生以形成酰胺部分。
在另一个实施方式中，修饰包括但不限于N端修饰，C端修饰，肽键修饰——包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH，骨架修饰，和残基修饰。用于制备肽模拟化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在QuantitativeDrug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin Pergamon Press(1992)中被说明，其通过引用并入，如同在本文中充分陈述一样。下文提供了在此方面的进一步细节。
在另一个实施方式中，肽内的肽键(-CO-NH-)被取代。在一些实施方式中，肽键被N-甲基化的键(-N(CH3)-CO-)取代。在另一个实施方式中，肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在另一个实施方式中，肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)取代。在另一个实施方式中，肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)、卡巴键(-CH2-NH-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基。在另一个实施方式中，肽键被羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)取代。在另一个实施方式中，肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在一些实施方式中，肽键被烯烃双键(-CH＝CH-)取代。在另一个实施方式中，肽键被逆酰胺键(-NH-CO-)取代。在另一个实施方式中，肽键被肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R是在碳原子上天然存在的“正常”侧链。在一些实施方式中，这些修饰在沿着肽链的键中的任一个处并且甚至同时在数个(2-3个键)处发生。
在一个实施方式中，蛋白质的天然芳香族氨基酸比如Trp、Tyr和Phe被取代为合成的非天然酸，比如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(naphthylelanine)(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或邻甲基-Tyr。在另一个实施方式中，本发明的肽包括一种或多种修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
与野生型OXM比较，本发明的OXM衍生物或变体包含数种氨基酸取代，和/或可以是聚乙二醇化的或另外修饰的(例如重组地或化学地)。
在本文提供的OXM还覆盖上面的OXM序列的任何类似物。序列中的任一个或多个氨基酸残基可以使用如本领域熟知的保守置换被独立地置换，即将氨基酸置换为类似化学类型的一种，比如将一种疏水性氨基酸置换为另一种。可选地，可以完成非保守氨基酸突变，其导致OXM的作用或生物学活性增强。在一个实施方式中，OXM被修饰为对通过二肽基肽酶IV(DPP-IV)的裂解和失活具有抗性。OXM的衍生物和变体以及其生成方法在美国专利申请公布号2011/0152182、美国专利申请公布号2011/0034374、美国专利申请公布号2010/0144617中被公开，其全部通过引用并入本文。
在一个实施方式中，“氨基酸”被理解包括20种天然存在的氨基酸；经常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如，羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方式中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸二者。理解还可以使用其它合成的或修饰的氨基酸。
在一个实施方式中，使用各种标准蛋白纯化技术纯化本发明的胃泌酸调节素(OXM)，比如，但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱聚焦和差别溶解(differentialsolubilization)。
在一个实施方式中，为了促进回收，表达的编码序列可以被改造以编码本发明的蛋白质和融合的可裂解部分。在一个实施方式中，融合蛋白可以被设计，使得可以通过亲和色谱法容易地分离蛋白质；例如通过固定化在特异于可裂解部分的柱上。在一个实施方式中，在蛋白质与可裂解部分之间改造裂解位点，并且可以通过使用在此位点处特异性地裂解融合蛋白的适当的酶或试剂处理来从色谱柱释放蛋白质[例如，参见Booth et al.,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；and Gardella et al.,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。在另一个实施方式中，以“基本上纯的”形式回收本发明的OXM。在另一个实施方式中，短语“基本上纯的”指的是允许在本文描述的应用中有效地使用OXM的纯度。
在一个实施方式中，还可以使用体外表达系统合成本发明的OXM。在一个实施方式中，体外合成方法是本领域熟知的，并且系统的组分是可商购的。
在另一个实施方式中，通过测量如在本文描述的天然、重组和/或可逆聚乙二醇化的OXM以及包括其的药物组合物治疗或改善疾病或病症——比如，但不限于：糖尿病、肥胖、进食障碍、代谢障碍等——的能力确定体外结合活性。在另一个实施方式中，通过正在治疗的疾病的已知量度推断体内活性。
在另一个实施方式中，OXM-PEG-连接体的摩尔比是1:1:1-1:1:3.5。在另一个实施方式中，摩尔比是1:1:1-1:1:10.0。在另一个实施方式中，较高比率的连接体允许优化产率的组合物。
在另一个实施方式中，PEG聚合物经由任选地取代的Fmoc或FMS被附连至胃泌酸调节素的氨基端或赖氨酸残基。在另一个实施方式中，术语“附连”和“连接”可互换地使用。在另一个实施方式中，PEG聚合物被连接至OXM的α-氨基侧链。在另一个实施方式中，PEG聚合物被连接至OXM的ε-氨基侧链。在另一个实施方式中，PEG聚合物被连接至OXM的一或多个ε-氨基侧链。在另一种实施方式中，PEG聚合物包括巯基部分。
在另一个实施方式中，PEG是线性的。在另一个实施方式中，PEG是支化的。在另一个实施方式中，PEG具有200至200,000Da的范围中的分子量。在另一个实施方式中，PEG具有5,000至80,000Da的范围中的分子量。在另一个实施方式中，PEG具有5,000至40,000Da的范围中的分子量。在另一个实施方式中，PEG具有20,000Da至40,000Da的范围中的分子量。在一个实施方式中，PEG30指的是具有30,000Da的平均分子量的PEG。PEG40指的是具有40,000Da的平均分子量的PEG。
生物学活性
在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化本发明的OXM致使OXM成为长效OXM。在另一个实施方式中，长效胃泌酸调节素是具有延长的生物学半衰期的胃泌酸调节素。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化提供了针对OXM的降解的防护。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化提供了针对OXM通过DPPIV降解的防护。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化实现了OXM的Cmax并且减少与施用在本文提供的缀合物相关联的副作用。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化延长了OXM的Tmax。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化延长了OXM的循环半衰期。在另一个实施方式中，与未修饰的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM具有改进的生物利用度。在另一个实施方式中，与未修饰的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM具有改进的生物学活性。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化增强了OXM的效能。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM具有改进的胰岛素敏感度。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM剂量依赖性地降低终末葡萄糖。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM剂量依赖性地降低胰岛素。
在其它实施方式中，在生物化学量度的方面，本发明的可逆聚乙二醇化的OXM至少等效于未修饰的OXM。在其它实施方式中，在药理学量度的方面，可逆聚乙二醇化的OXM至少等效于未修饰的OXM。在其它实施方式中，在结合能力(Kd)的方面，可逆聚乙二醇化的OXM至少等效于未修饰的OXM。在其它实施方式中，在通过消化系统吸收的方面，可逆聚乙二醇化的OXM至少等效于未修饰的OXM。在其它实施方式中，在通过消化系统吸收期间，可逆聚乙二醇化的OXM比未修饰的OXM更稳定。
在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，本发明的可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的血液曲线下面积(AUC)水平。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的生物学活性和血液曲线下面积(AUC)水平。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的血液保留时间(t1/2)。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的生物学活性和血液保留时间(t1/2)。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的血液Cmax水平，其中在另一个实施方式中，其导致较慢的释放过程，所述较慢的释放过程减少与施用在本文提供的可逆聚乙二醇化的组合物相关联的副作用。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，可逆聚乙二醇化的OXM展现改进的生物学活性和血液Cmax水平。在另一个实施方式中，本文提供了改进OXM的AUC、Cmax、t1/2、生物学活性、或其任意组合的方法，其包括经由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至游离的OXM的氨基端的步骤或由其构成。
在另一个实施方式中，通过经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至游离的OXM的氨基端来改进OXM的AUC、Cmax、t1/2、生物学活性、或其任意组合使得能够降低OXM的给药频率。在另一个实施方式中，本文提供了用于降低OXM的给药频率的方法，其包括经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至OXM的赖氨酸残基的氨基端的步骤或由其构成。在另一个实施方式中，本发明的OXM的可逆聚乙二醇化对允许使用较低的剂量是有利的。在一个实施方式中，本发明的长效OXM维持未修饰的OXM的生物学活性。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM包含OXM生物学活性。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括减少消化分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括减少和延迟胃排空。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制小肠中的摄食运动模式(fed motility pattern)。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制由五肽胃泌素刺激的酸分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括增加胃生长抑素释放。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括增强肽YY的作用。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制生长素释放肽释放。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括刺激氨基比林积聚和cAMP产生。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括结合GLP-1受体。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括结合胰高血糖素受体。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括通过激活腺苷酸环化酶刺激H+产生。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制组胺刺激的胃酸分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制食物摄取。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括刺激胰岛素释放。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括抑制胰腺外分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括增加胰岛素敏感度。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括降低葡萄糖水平。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括降低终末葡萄糖。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括降低胰岛素。
在一个实施方式中，本发明进一步提供了用于延长胃泌酸调节素的生物学半衰期的方法，其由将胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)以1:1:1的摩尔比缀合的步骤构成，其中，在另一个实施方式中，PEG聚合物经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)被缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基或第30位上的赖氨酸残基或氨基端。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于延长胃泌酸调节素的生物学半衰期的方法，其由将胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)以1:1:1的摩尔比缀合的步骤构成，其中所述PEG聚合物经由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)被缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于延长胃泌酸调节素的生物学半衰期的方法，其由将胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)以1:1:1的摩尔比缀合的步骤构成，其中所述PEG聚合物经由9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)被缀合至所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的第30位上的赖氨酸残基。
在另一个实施方式中，本发明涉及用于延长胃泌酸调节素的生物学半衰期的方法，其由将胃泌酸调节素、聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)以1:1:1的摩尔比缀合的步骤构成，其中所述PEG聚合物经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)被缀合至所述胃泌酸调节素的氨基酸序列的氨基端。
在一个实施方式中，本发明涉及改进胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基或第30位上的赖氨酸残基或氨基端的步骤构成。
在另一个实施方式中，本发明涉及改进胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基的步骤构成。
在一个实施方式中，本发明涉及改进胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第30位上的赖氨酸残基的步骤构成。
在一个实施方式中，本发明涉及改进胃泌酸调节素的曲线下面积(AUC)的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的氨基端的步骤构成。
在一方面，本文提供了降低胃泌酸调节素的给药频率的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基或第30位上的赖氨酸残基或氨基端的步骤构成。
在另一方面，本文提供了降低胃泌酸调节素的给药频率的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第12位上的赖氨酸残基的步骤构成。
在另一方面，本文提供了降低胃泌酸调节素的给药频率的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的第30位上的赖氨酸残基的步骤构成。
在另一方面，本文提供了降低胃泌酸调节素的给药频率的方法，其由经由任选地取代的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)或磺基-9-芴基甲氧羰基(FMS)将聚乙二醇聚合物(PEG聚合物)缀合至胃泌酸调节素的氨基酸序列的氨基端的步骤构成。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了用于减少对象的食物摄取的方法，其包括施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了用于降低对象的体重的方法，其包括给对象施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了用于诱导对象的血糖控制的方法，其包括施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了用于改进对象的血糖和脂质概况的方法，其包括给对象施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在又另一个实施方式中，本发明进一步提供了用于改进对象的血糖概况的方法，其包括给对象施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在另外的实施方式中，本发明进一步提供了用于改进对象的脂质概况的方法，其包括给对象施用本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
如本文示例的(参见实施例5)，在本文提供的氨基变体——例如FMS经由端氨基被连接至OXM的变体——出人意料地实现了减少的食物摄取、重量控制和血糖控制。在一个实施方式中，在本文提供的OXM肽的PEG修饰出人意料地不干扰OXM功能。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于改进对象的胆固醇水平的方法，其包括给对象施用有效量的本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。在另一个实施方式中，改进胆固醇水平包括在对象中降低LDL胆固醇同时增加HDL胆固醇。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至200mg/dL以下，但是0mg/dL以上。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至大约100-129mg/dL。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至100mg/dL以下，但是0mg/dL以上。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至70mg/dL以下，但是0mg/dL以上。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至5.2mmol/L以下，但是0mmol/L以上。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至大约2.6至3.3mmol/L。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至2.6mmol/L以下，但是0mmol/L以上。在另一个实施方式中，LDL胆固醇水平被降低至1.8mmol/L以下，但是0mmol/L以上。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供用于降低对象的胰岛素抗性的方法，其包括给对象施用有效量的本发明的缀合物的步骤。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV的结构表示。
在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括通过迷走神经间接机制抑制胰腺分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括减少通过小肠的水溶矿物质(hydromineral)输送。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括刺激葡萄糖摄取。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括控制/刺激生长抑素分泌。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括降低食物摄取和体重增加二者。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括减少肥胖。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括食欲抑制。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括还进血糖和脂质概况。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括诱导厌食。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括降低超重和肥胖对象的体重。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM的生物学活性包括诱导脂肪激素瘦蛋白和脂连蛋白的水平改变。在另一个实施方式中，除减少超重和肥胖对象的能量摄取之外，本发明的长效OXM的生物学活性还包括增加能量消耗。在另一个实施方式中，本发明的长效OXM是式I-IV的缀合物。
制备方法
在另一个实施方式中，使用聚乙二醇化剂制备本发明的长效OXM，所述聚乙二醇化剂意思是能够与在Fmoc或FMS部分的芴环处存在的官能团——比如，但不限于NH2、OH、SH、COOH、CHO、--N＝C＝O、--N＝C＝S、--SO2Cl、--SO2CH＝CH2、--PO2Cl、--(CH2)xHal——反应的任何PEG衍生物。在另一个实施方式中，聚乙二醇化剂经常以其单甲氧基化形式使用，其中仅PEG分子的一端处的一个羟基可用于缀合。在另一个实施方式中，如果例如期望获得两个肽或蛋白质残基共价地附连至单一PEG部分的缀合物，可以使用两端均可用于缀合的PEG的双官能形式。
在另一个实施方式中，支化的PEG被表示为R(PEG-OH)m，其中R表示中心核心部分比如季戊四醇或甘油，并且m表示支化臂的数目。支化臂的数目(m)可以在三至一百或更多的范围内。在另一个实施方式中，羟基经受化学修饰。在另一个实施方式中，支化的PEG分子在美国专利号6,113,906、5,919,455、5,643,575、和5,681,567中被描述，其由此通过以其全部并入。
在另一个实施方式中，本发明提供了具有PEG部分的OXM，所述PEG部分不如标准聚乙二醇化程序中一样被直接地附连至OXM，而是PEG部分通过连接体比如任选地取代的Fmoc或FMS被附连。在另一个实施方式中，连接体对碱高度敏感并且在弱碱性条件下可去除。在另一个实施方式中，经由任选地取代的Fmoc或FMS与PEG接合的OXM与游离的OXM是等效活性的。在另一个实施方式中，经由任选地取代的Fmoc或FMS与PEG接合的OXM比游离的OXM更有活性。在另一个实施方式中，经由任选地取代的Fmoc或FMS与PEG接合的OXM包含与游离的OXM不同的活性。在另一个实施方式中，经由任选地取代的Fmoc或FMS与PEG接合的OXM不同于游离的OXM，不具有中枢神经系统活性。在另一个实施方式中，经由任选地取代的Fmoc或FMS与PEG接合的OXM不同于游离的OXM，不能通过血脑屏障进入脑。在另一个实施方式中，与游离的OXM比较，经由Fmoc或FMS与PEG接合的OXM包括延长的循环半衰期。在另一个实施方式中，经由Fmoc或FMS与PEG接合的OXM连同Fmoc或FMS部分失去其PEG部分，因而恢复游离的OXM。
在另一个实施方式中，OXM的聚乙二醇化和(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM或(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM缀合物的制备包括将MAL-FMS-NHS或MAL-Fmoc-NHS附连至OXM的胺组分，因而获得MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM缀合物，并且然后使PEG-SH与MAL-FMS-OXM上的马来酰亚胺部分反应，分别产生PEG-S-MAL-FMS-OXM或PEG-S_MAL-Fmoc-OXM、(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM缀合物。
在另一个实施方式中，MAL-Fmoc-NHS由下列结构表示：
在另一个实施方式中，MAL-FMS-NHS由下列结构表示：
在一个实施方式中，SO3H在芴的第2位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第3位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在另一个实施方式中，MAL-Fmoc-OXM由下列结构表示：
在另一个实施方式中，MAL-FMS-OXM由下列结构表示：
在一个实施方式中，SO3H在芴的第2位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第3位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在另一个实施方式中，(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM由下列结构表示：
在另一个实施方式中，(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM由下列结构表示：
在一个实施方式中，SO3H在芴的第2位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第3位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在另一个实施方式中，OXM的聚乙二醇化包括使MAL-FMS-NHS或MAL-Fmoc-NHS与PEG-SH反应，因而形成PEG-S-MAL-FMS-NHS或PEG-S-MAL-Fmoc-NHS缀合物，并且然后使其与OXM的胺组分反应，分别产生期望的(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM缀合物。在另一个实施方式中，肽/蛋白质比如OXM的聚乙二醇化在美国专利号7585837中被描述，其通过引用以其全部并入本文中。在另一个实施方式中，肽/蛋白质——比如具有Fmoc或FMS的OXM——的可逆聚乙二醇化在美国专利号7585837中被描述。
在另一个实施方式中，PEG-S-MAL-Fmoc-NHS由下列结构表示：
在另一个实施方式中，PEG-S-MAL-FMS-NHS由下列结构表示：
在一个实施方式中，SO3H在芴的第2位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第3位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第4位处。在另一个实施方式中，SO3H在芴的第1、2、3或4位或其任意组合处。
在另一个实施方式中，短语“长效OXM”和“可逆聚乙二醇化的OXM”可交换地使用并且指的是本发明的缀合物。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM由PEG-FMS-OXM和PEG-Fmoc-OXM组成，其在本文由下式标识：(PEG-FMS)n-OXM或(PEG-Fmoc)n-OXM，其中n是至少一的整数，并且OXM通过至少一个氨基被连接至FMS或Fmoc自由基。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM由PEG-S-MAL-FMS-OXM和PEG-S-MAL-Fmoc-OXM组成，其在本文由下式标识：(PEG-S-MAL-FMS)n-OXM或(PEG-S-MAL-Fmoc)n-OXM，其中n是至少一的整数，并且OXM通过至少一个氨基被连接至FMS或Fmoc自由基。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备PEG-S-MALFmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM的方法，其中所述OXM的氨基端被连接至Fmoc或FMS并且其中所述OXM由在SEQ ID NO:1[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]中陈述的氨基酸序列构成，
所述方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述胃泌酸调节素的氨基残基被保护；
以分别获得MAL-Fmoc-保护的OXM或MAL-FMS-保护的OXM，其中所述胃泌酸调节素的氨基残基被保护，
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与PEG-SH所述的反应之后或之前实施去除所述保护基和树脂；
以获得PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM，其中所述OXM的氨基端被连接至Fmoc或FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM缀合物的方法，其中所述OXM的Lys12的所述氨基残基被连接至所述Fmoc或FMS并且所述胃泌酸调节素(OXM)由在SEQ ID NO:1[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]中陈述的氨基酸序列构成，
所述方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述胃泌酸调节素的氨基残基(不包括Lys12)和His1的氨基端被保护；以分别获得MAL-Fmoc-保护的OXM或MAL-FMS-保护的OXM，其中所述胃泌酸调节素的氨基残基(不包括Lys12)和His1的氨基端被保护；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除所述保护基和所述树脂；
以产生PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MAL-FMS-OXM，其中所述OXM的Lys12的所述氨基残基被连接至所述Fmoc或FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM缀合物的方法，其中所述OXM的Lys30的所述氨基残基被连接至所述Fmoc或FMS并且所述胃泌酸调节素(OXM)由在SEQ ID NO:1[His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-OH]中陈述的氨基酸序列构成，
所述方法包括使MAL-FMS-OXM或MAL-Fmoc-OXM与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述胃泌酸调节素的氨基残基(不包括Lys30)和His1的氨基端被保护；以分别获得MAL-Fmoc-保护的OXM或MAL-FMS-保护的OXM，其中所述胃泌酸调节素的氨基残基(不包括Lys30)和His1的氨基端被保护；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除所述保护基和所述树脂；
以产生PEG-S-MALFmoc-OXM或PEG-S-MALFMS-OXM，其中所述OXM的Lys12的所述氨基残基被连接至所述Fmoc或FMS。
在一个实施方式中，本发明提供了用于制备由下列结构表示的MAL-FMS-NHS的方法：
所述方法包括混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物。
在一个实施方式中，方法包括使用2至20当量之间的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用2至10当量之间的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用2当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用3当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用4当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用5当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用6当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用7当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用8当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用9当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。在另一个实施方式中，方法包括使用10当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。
在一个实施方式中，用于从MAL-Fmoc-NHS制备作为TFA盐的MAL-FMS-NHS的方法包括使用过量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸，其产生纯度在80％至100％之间的纯的中间体MAL-FMS-NHS-TFA盐。在另一个实施方式中，方法产生纯度在85％至100％之间的纯的中间体MAL-FMS-NHS-TFA盐。在另一个实施方式中，方法产生纯度在90％至100％之间的纯的中间体MAL-FMS-NHS-TFA盐。在另一个实施方式中，方法产生纯度在95％至100％之间的纯的中间体MAL-FMS-NHS-TFA盐。在另一个实施方式中，方法产生纯度在98％至100％之间的纯的中间体MAL-FMS-NHS-TFA盐。
在一个实施方式中，MAL-FMS-NHS-TFA盐被用作制备式I、II、IIa、III和IV的缀合物的方法的中间体，其产生具有85％至100％之间的纯度的缀合物。在另一个实施方式中，产生具有90％至100％之间的纯度的缀合物。在另一个实施方式中，产生具有95％至100％之间的纯度的缀合物。在另一个实施方式中，产生具有98％至100％之间的纯度的缀合物。
在另一个实施方式中，PEG-S-MALFmoc或PEG-S-MALFMS与OXM的Lys12或Lys30或氨基端的缀合不致使OXM失活。
在一个实施方式中，Lys12变体在提供重量控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，在本文提供的Lys30变体在实现重量控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，在本文提供的氨基变体在实现重量控制方面比在本文提供的其它变体更有效。
在一个实施方式中，Lys12变体在实现长期血糖控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，在本文提供的Lys30变体在实现长期血糖控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，在本文提供的氨基变体在实现长期血糖控制方面比在本文提供的其它变体更有效。
在另外的实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在提供重量控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另外的实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在实现血糖控制方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在重量减小方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在减少累积性食物摄取方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在减少血浆葡萄糖摄取方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在改进葡萄糖耐量方面比在本文提供的其它变体更有效。在另一个实施方式中，PEG30-FMS-OXM的氨基变体在降低终末血浆胆固醇水平方面比在本文提供的其它变体更有效。
在一个实施方式中，PEG-S-MAL-Fmoc-OXM在降低终末血浆果糖胺水平方面有效。在另一个实施方式中，PEG-EMCS-OXM在降低终末血浆果糖胺水平方面有效。在另一个实施方式中，PEG30-S-MAL-FMS-OXM的氨基变体在降低终末血浆果糖胺水平方面有效。在另一个实施方式中，PEG30-S-MAL-FMS-OXM的氨基变体在降低终末血浆果糖胺水平方面比在本文提供的其它变体更有效。
药物组合物和使用方法
在一个实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的缀合物以及运载体和赋形剂。在另一个实施方式中，缀合物由式I-IV表示。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于预防高血糖症，改进血糖控制，治疗糖尿病——其选自非胰岛素依赖性糖尿病(在一个实施方式中，2型糖尿病)、胰岛素依赖性糖尿病(在一个实施方式中，1型糖尿病)、和妊娠期糖尿病，或其任意组合。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于治疗2型糖尿病。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加对胰岛素的敏感度。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低胰岛素抗性。
在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于抑制食欲。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于诱发饱腹感。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低体重。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低体脂。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低身体质量指数。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于减少食物消耗。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于治疗肥胖。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于治疗与肥胖相关联的糖尿病。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加心率。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加基础代谢率(BMR)。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加能量消耗。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于诱导葡萄糖耐量。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于改进血糖和脂质概况。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于诱导血糖控制。在一个实施方式中，血糖控制指的是非高的和/或非波动的血糖水平和/或非高的和/或非波动的糖基化的血红蛋白水平。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于抑制重量增加，其中在另一个实施方式中，重量增加是由于脂肪增加。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低血糖水平。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于减少热量摄取。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低食欲。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于重量控制。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于诱导或促进重量减轻。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于维持期望的体重、期望的身体质量指数、期望的外貌和良好的健康中的任一种或多种。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于控制脂质概况。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于减低甘油三酯水平。在另一个实施方式中，本文的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于减低甘油水平。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加脂连蛋白水平。在另一个实施方式中，在本文提供的本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低游离脂肪酸水平。
在一个实施方式中，术语“降低……的水平”指的是相对于初始、野生型、正常或对照水平降低大约1-10％。在另一个实施方式中，降低大约11-20％。在另一个实施方式中，降低大约21-30％。在另一个实施方式中，降低大约31-40％。在另一个实施方式中，降低大约41-50％。在另一个实施方式中，降低大约51-60％。在另一个实施方式中，降低大约61-70％。在另一个实施方式中，降低大约71-80％。在另一个实施方式中，降低大约81-90％。在另一个实施方式中，降低大约91-95％。在另一个实施方式中，降低大约96-100％。
在一个实施方式中，术语“增加……的水平”或“延长”指的是相对于初始、野生型、正常或对照水平增加大约1-10％。在另一个实施方式中，增加大约11-20％。在另一个实施方式中，增加大约21-30％。在另一个实施方式中，增加大约31-40％。在另一个实施方式中，增加大约41-50％。在另一个实施方式中，增加大约51-60％。在另一个实施方式中，增加大约61-70％。在另一个实施方式中，增加大约71-80％。在另一个实施方式中，增加大约81-90％。在另一个实施方式中，增加大约91-95％。在另一个实施方式中，增加大约96-100％。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于降低胆固醇水平。在一个实施方式中，胆固醇水平的降低大于在施用天然OXM后观察到的降低。在一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物使胆固醇水平降低60-70％。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物使胆固醇水平降低50-100％。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物使胆固醇水平降低25-90％。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物使胆固醇水平降低50-80％。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物使胆固醇水平降低40-90％。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物被用于增加HDL胆固醇水平。
在一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物可以被用于在本文描述的目的而不显著地降低施用过程内的效力。在一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效1天。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效2-6天。在一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效1周。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效2周。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效3周。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效4周。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效6周。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效2个月。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效4个月。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效6个月。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物保持有效1年或更久。
在一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物可以被用于在本文描述的目的并且可以在施用第一剂量之后立即有效。在另一个实施方式中，本发明的缀合物和包括它们的药物组合物在已经施用两个或更多个剂量后有效。
在另一个实施方式中，将如上文描述的利用本发明的缀合物和包括它们的药物组合物的方法应用于遭受疾病或病症的人对象，所述疾病或病症可以由OXM缓解、抑制和/或治疗。在另一个实施方式中，如上文描述的利用本发明的缀合物和包括它们的药物组合物的方法是兽医学方法。在另一个实施方式中，将如上文描述的利用本发明的缀合物和包括它们的药物组合物的方法应用于动物，比如家畜、宠物、和实验室动物。因而，在一个实施方式中，本发明的对象是猫、犬、牛、猪、鼠、马(aquine)等。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗或减轻对象的通过OXM或包括其的药物制剂可治疗或可减轻的疾病的方法，其包括给对象施用治疗有效量的本发明的缀合物的步骤，从而治疗或减轻对象的通过OXM可治疗或可减轻的疾病。
在另一个实施方式中，如本文使用的OXM、“肽”或“蛋白质”涵盖天然肽(降解产物、合成地合成蛋白或重组蛋白)和肽模拟物(通常是合成地合成蛋白)，以及是蛋白质类似物的拟肽和半拟肽(semipeptoid)，其在一些实施方式中具有致使蛋白质在体内时甚至更稳定或更能够穿透入细胞的修饰。
在另一个实施方式中，“PEG-Fmoc-OXM和/或PEG-FMS-OXM变体”是本发明的缀合物。在另一个实施方式中，“PEG-Fmoc-OXM和/或PEG-FMS-OXM变体”分别指的是PEG-S-MAL-Fmoc-OXM或PEG-S-MAL-FMS-OXM并且是本发明的缀合物。在另一个实施方式中，本发明的缀合物由式I-IV表示。在另一个实施方式中，本发明的缀合物是经由FMS或Fmoc连接PEG的OXM，其中OXM经由OXM的Lys12、或经由OXM的Lys30或经由OXM的氨基端被连接至FMS或Fmoc。在另一个实施方式中，药物组合物在可注射溶液中包括0.005至0.1毫克/kg之间的本发明的OXM肽。在另一个实施方式中，药物组合物包括0.005至0.5毫克/kg OXM肽。在另一个实施方式中，药物组合物包括0.05至0.1毫克OXM肽。
在另一个实施方式中，每天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每36小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每48小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每60小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每72小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每84小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每96小时一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每5天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每6天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每7天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每8-10天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每10-12天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每12-15天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。在另一个实施方式中，每15-25天一次施用包括本发明的缀合物的药物组合物。
在另一个实施方式中，通过肌肉内(IM)注射、皮下(SC)注射、或静脉内(IV)注射每周一次施用本发明的缀合物。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物自身可以被提供给个体。在一个实施方式中，本发明的可逆聚乙二醇化的OXM可以作为药物组合物的一部分被提供给个体，在所述药物组合物中，它与药学上可接受的运载体混合。
在另一个实施方式中，“药物组合物”指的是如本文描述的长效OXM与其它化学组分——比如生理学上合适的运载体和赋形剂——的制剂。药物组合物的目的是帮助给生物体施用化合物。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM可导致生物学效应。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物包括本发明的缀合物、药学上可接受的运载体和赋形剂。
在另一个实施方式中，本发明的任何组合物将包括至少可逆聚乙二醇化的OXM。在一个实施方式中，本发明提供了组合制剂。在一个实施方式中，“组合制剂”尤其定义“部分的试剂盒(kit of parts)”，其含义在于如上面定义的组合配合体(combination partner)可以被独立地给药或通过使用与区别量的组合配合体的不同固定组合——即，同步地、同时地、单独地或顺序地——进行给药。在一些实施方式中，例如，部分的试剂盒的部分然后可以被同步地或按时间交错地施用，即对于部分的试剂盒的任何部分，在不同的时间点和相等或不同的时间间隔的情况下施用。在一些实施方式中，组合配合体的总量的比率可以在组合制剂中施用。在一个实施方式中，如本领域技术人员可以容易完成的，组合制剂可以变化，例如，以便应对待治疗的患者亚群的需要或单一患者的需要，不同的需要可以是由于具体的疾病、疾病的严重度、年龄、性别、或体重。
在另一个实施方式中，可互换地使用的短语“生理学上可接受的运载体”和“药学上可接受的运载体”指的是不会对生物体引起显著刺激并且不会废除施用的化合物的生物学活性和性质的运载体或稀释剂。佐剂被包括在这些短语下。在一个实施方式中，例如，在药学上可接受的运载体中包括的成分之一可以是聚乙二醇(PEG)——在有机和水性介质二者中均具有大范围的溶解度的一种生物相容性聚合物(Mutter et al.(1979))。
在另一个实施方式中，“赋形剂”指的是添加至药物组合物以进一步促进长效OXN的施用的惰性物质。在一个实施方式中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和施用药物的技术在“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”MackPublishing Co.,Easton,PA，最新版中被发现，其通过引并入本文。
在另一个实施方式中，本发明的肽的合适的施用途径例如包括口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
本发明还包括可逆聚乙二醇化的OXM，其用于制造通过脑外围的途径施用来进行上面描述的任何治疗方法的药物。外围途径的实例包括口服、直肠、肠胃外(例如静脉内、肌肉内、或腹膜内)、粘膜(例如含服、舌下、鼻部、皮下或经皮)施用，包括通过吸入施用。下面给出了OXM用于药物的优选剂量。
本发明提供了药物组合物，其包括可逆聚乙二醇化的OXM和药学上合适的运载体，其以适于口服、直肠、肠胃外(例如静脉内、肌肉内或腹膜内)、粘膜(例如含服、舌下、鼻部、皮下或经皮)施用的形式，包括通过吸入施用。如果以单位剂型，则每单位的剂量可以例如是下面描述的或如基于下面给出的每千克剂量计算的。
在另一个实施方式中，以局部而不是全身方式施用制剂，例如，经由将制剂直接注入患者身体的特定区域。在另一个实施方式中，以鼻内剂型配制可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，以可注射剂型配制可逆聚乙二醇化的OXM。
本发明考虑剂量范围的多种实施方式：以每3天0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分(由于PEG的大小可以实质上不同，所以仅提供可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM的重量)。在另一个实施方式中，以每7天0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。在另一个实施方式中，以每10天0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。在另一个实施方式中，以每14天0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。在另一个实施方式中，出人意料地，可逆聚乙二醇化的OXM组合物中OXM的有效量是游离的OXM的有效量的1/4-1/10。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少50％的开处方给患者的OXM的量。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少70％的开处方给患者的OXM的量。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少75％的开处方给患者的OXM的量。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少80％的开处方给患者的OXM的量。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少85％的开处方给患者的OXM的量。在另一个实施方式中，出人意料地，OXM的可逆聚乙二醇化使得与游离的OXM比较能够限制至少90％的开处方给患者的OXM的量。
在另一个实施方式中，以每3天一次0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分(由于PEG的大小可以实质上不同，所以仅提供可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM的重量)。在另一个实施方式中，以每7天一次0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。在另一个实施方式中，以每10天一次0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。在另一个实施方式中，以每14天一次0.01-0.5毫克/kg体重的范围施用可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM肽组分。
在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM与游离的OXM比较降低有效给药频率至少2倍并且减少有效每周剂量至少2倍，因而限制不良事件的风险和增加与使用OXM疗法的顺应性。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM与游离的OXM比较降低有效给药频率至少3倍并且减少有效每周剂量至少3倍，因而限制不良事件的风险和增加与使用OXM疗法的顺应性。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM与游离的OXM比较降低有效给药频率至少4倍并且减少有效每周剂量至少4倍，因而限制不良事件的风险和增加与使用OXM疗法的顺应性。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM与游离的OXM比较降低有效给药频率至少5倍并且减少有效每周剂量至少5倍，因而限制不良事件的风险和增加与使用OXM疗法的顺应性。在另一个实施方式中，可逆聚乙二醇化的OXM与游离的OXM比较降低有效给药频率至少6倍并且减少有效每周剂量至少6倍，因而限制不良事件的风险和增加与使用OXM疗法的顺应性。在另一个实施方式中，有效给药频率和有效每周剂量基于：(1)施用的可逆聚乙二醇化的OXM组合物内的OXM组分的重量；和(2)施用的游离的OXM(未修饰的OXM)组合物内的OXM组分的重量。
在另一个实施方式中，本发明的方法包括增加遭受慢性病的、需要OXM疗法的患者的顺应性。在另一个实施方式中，本发明的方法能够通过如上文描述的使OXM可逆聚乙二醇化来降低OXM的给药频率。在另一个实施方式中，本发明的方法包括通过降低OXM的施用频率来增加需要OXM疗法的患者的顺应性。在另一个实施方式中，降低OXM的施用频率由于可逆聚乙二醇化——其致使OXM更稳定并且更强力——实现。在另一个实施方式中，降低OXM的施用频率由于增加OXM的T1/2被实现。在另一个实施方式中，降低OXM的施用频率由于降低OXM的血液清除率被实现。在另一个实施方式中，降低OXM的施用频率由于增加OXM的T1/2被实现。在另一个实施方式中，降低OXM的施用频率由于增加OXM的AUC量度被实现。
在另一个实施方式中，每天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每两天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每三天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每四天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每五天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每六天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每周一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每7-14天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每10-20天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每5-15天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，每15-30天一次给对象施用可逆聚乙二醇化的OXM。
在一个实施方式中，口服施用包括单位剂型，其包括片剂、胶囊、锭剂、咀嚼片剂、悬浮液、乳液等。这样的单位剂型包括安全和有效量的本发明的OXM，其每个在一个实施方式中是大约0.7或3.5mg至大约280mg/70kg，或在另一个实施方式中，是大约0.5或10mg至大约210mg/70kg。适于制备用于经口施用的单位剂型的药学上可接受的运载体是本领域熟知的。在一些实施方式中，片剂通常包括常规的药学上相容的佐剂作为惰性稀释剂，比如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂比如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂比如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素(croscarmelose)；润滑剂比如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施方式中，助流剂比如二氧化硅可以被用于改进粉末混合物的流动特性。在一个实施方式中，可以为了外观添加着色剂，比如FD&C染料。甜味剂和调味剂，比如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、胡椒薄荷、和水果调味剂是用于咀嚼片剂的有用的佐剂。胶囊通常包括一种或多种上面公开的固体稀释剂。在一些实施方式中，运载体组分的选择取决于次要考量，如味道、成本、和储存稳定性，其对本发明的目的不是关键的，并且可以由本领域技术人员容易地完成。
在一个实施方式中，口服剂型包括预定的释放概况。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括延长释放的片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括缓慢释放的片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括立即释放的片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方式中，如本领域技术人员已知的，根据长效OXN的期望的释放概况配制口服剂型。
在另一个实施方式中，用于本发明的方法的组合物包括溶液或乳液，其在另一个实施方式中是水溶液或乳液，其包括安全和有效量的本发明的化合物，以及任选地意欲外用鼻内施用的其它化合物。在一些实施方式中，组合物包括大约0.001％至大约10.0％w/v的对象化合物，更优选地大约00.1％到约2.0％，其被用于通过鼻内途径全身递送该化合物。
在另一个实施方式中，通过静脉内、动脉内、皮下或肌肉内注射液体制剂施用药物组合物。在另一个实施方式中，液体配制品包括溶液、悬浮液、分散体、乳液、油等。在一个实施方式中，静脉内施用药物组合物，并且因而以适于静脉内施用的形式配制。在另一个实施方式中，动脉内施用药物组合物，并且因而以适于动脉内施用的形式配制。在另一个实施方式中，肌肉内施用药物组合物，并且因此以适于肌肉内施用的形式配制。
进一步，在另一个实施方式中，药物组合物被外用地施用至身体表面，并且因而以适于外用施用的形式配制。合适的外用制剂包括凝胶、膏剂、霜剂、洗剂、滴剂等。为了外用施用，本发明的化合物与一种或多种另外适当的治疗剂组合，在具有或不具有药物运载体的情况下制备和应用为生理学上可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液、或乳液。
在一个实施方式中，通过本领域熟知的方法制造本发明的药物组合物，例如，借助常规的混合、溶解、粒化、糖衣药丸制造、粉碎、乳化、封装、包埋或冻干方法。
在一个实施方式中，使用一种或多种生理学上可接受的运载体以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物，所述运载体包括赋形剂和助剂，其促进将OXM加工为可以在药学上使用的制剂。在一个实施方式中，配制取决于选择的施用途径。
在一个实施方式中，以水溶液配制本发明的可注射剂。在一个实施方式中，在生理学上相容的缓冲剂——比如Hank溶液、林格溶液、或生理盐缓冲剂——中配制本发明的可注射剂。在一些实施方式中，为了经粘膜施用，适合待渗透的屏障的渗透剂被用于制剂。这样的渗透剂是本领域公知的。
在一个实施方式中，本文描述的制剂被配制用于肠胃外施用，例如，通过弹丸注射或连续输注。在另一个实施方式中，用于注射的制剂以单位剂型，例如以安瓿或以具有任选地添加的防腐剂的多剂量容器呈现。在另一个实施方式中，组合物是油性或水性媒介中的悬浮液、溶液或乳液，并且包含配制剂比如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在另一个实施方式中，组合物还包括防腐剂，比如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，比如乙二胺四乙酸钠等；缓冲剂比如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂比如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂比如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠(sodiummetabisulfote)等；芳香族试剂；粘度调节剂，比如聚合物，包括纤维素和其衍生物；和聚乙烯醇，以及根据需要调节这些水性组合物的pH的酸和碱。在一些实施方式中，组合物还包括局部麻醉剂或其它活性物。组合物可以被用作喷雾、雾剂、滴剂等。
在一个实施方式中，用于肠胃外施用的药物组合物包括呈水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，在一些实施方式中，长效OXM的悬浮液被制备为适当的油性或水基注射悬浮液。在一些实施方式中，合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油比如芝麻油，或合成脂肪酸酯比如油酸乙酯，甘油三酯或脂质体。在一些实施方式中，水性注射悬浮液包含增加悬浮液的粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在另一个实施方式中，悬浮液还包含合适的稳定剂或增加长效OXM的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。
在另一个实施方式中，活性化合物可以在囊泡——特别是脂质体——中被递送(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；一般参见同上)。
在另一个实施方式中，在控制释放系统中递送的药物组合物被配制用于静脉输注、可植入的渗透泵、透皮贴片、脂质体、或其它施用模式。在一个实施方式中，使用泵(参见Langer,supra；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方式中，可以使用聚合物材料。在又另一个实施方式中，控制释放系统可以靠近治疗靶标——即，脑——被放置，因而仅需要部分全身剂量(参见，例如，Goodson,in MedicalApplications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。其它控制释放系统在Langer的综述(Science 249:1527-1533(1990))中被讨论。
在一个实施方式中，长效OXM是粉末形式，以便在使用前与合适的媒介——例如，无菌的无热原水基溶液——进行构成。在一些实施方式中，组合物被配制用于雾化和吸入施用。在另一个实施方式中，组合物被包含在具有雾化工具的容器中。
在一个实施方式中，例如，使用常规的栓剂基质比如可可脂或其它甘油酯以直肠组合物比如栓剂或保留灌肠法配制本发明的制剂。
在一个实施方式中，适于在本发明的背景下使用的药物组合物包括其中以实现预期目的的有效量包含长效OXM的组合物。在另一个实施方式中，治疗有效量意思是对预防、缓解或改善疾病的症状或延长正在治疗的对象的存活的长效OXM的量。
在一个实施方式中，治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内。
组合物还包括防腐剂，比如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，比如乙二胺四乙酸钠等；缓冲剂比如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂比如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂比如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香族试剂；粘度调节剂，比如聚合物，包括纤维素和其衍生物；和聚乙烯醇，以及根据需要调节这些水性组合物的pH的酸和碱。在一些实施方式中，组合物还包括局部麻醉剂或其它活性物。组合物可以被用作喷雾、雾剂、滴剂等。
可以充当药学上可接受的运载体或其组分的物质的一些实例是糖，比如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，比如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，比如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，比如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，比如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇比如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇、和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，比如TweenTM牌乳化剂；湿润剂比如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；制锭剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲溶液。连同化合物一起使用的药学上可接受的运载体的选择基本上通过化合物被施用的方式确定。在一个实施方式中，如果将要注射对象化合物，则药学上可接受的运载体是具有血液相容性悬浮剂的无菌的生理盐水，其pH已经被调节至大约7.4。
此外，组合物进一步包括粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、羟基乙酸淀粉钠)、多种pH和离子强度的缓冲剂(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸收至表面的添加剂比如白蛋白或明胶、清洁剂(例如，Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如卡波姆、胶态二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、流动助剂(例如胶态二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物涂料(例如，泊洛沙姆(poloxamer)或泊洛沙胺(poloxamine))、涂层和膜形成剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
用于糖浆、酏剂、乳液和悬浮液的运载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨醇和水。对于悬浮液，典型的悬浮剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM、RC-591)、黄蓍胶和海藻酸钠；典型的湿润剂包括卵磷脂和聚氧化乙烯脱水山梨醇(例如聚山梨酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施方式中，经口液体组合物还包含一种或多种组分，比如上面公开的甜味剂、调味剂和着色剂。
组合物还包括将活性材料掺入聚合物化合物——比如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等——的微粒制剂或掺到其上，或掺到脂质体、微乳液、胶团、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放的速率、和体内清除的速率。
本发明还包括微粒组合物，其涂覆有聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)，并且化合物偶联至与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体或偶联至组织特异性受体的配体。
在一个实施方式中，通过共价连接水溶性聚合物——比如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸——修饰化合物。在另一个实施方式中，修饰的化合物在静脉内注射之后展现出比相应的未修饰的化合物基本上更长的血液中半衰期。在一个实施方式中，修饰还增加化合物在水溶液中的溶解度，消除聚集，增强化合物的物理和化学稳定性，和极大地降低化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方式中，通过与使用未修饰的化合物相比更不频繁地或以更低剂量施用这样的聚合物-化合物诱导物(abduct)来实现期望的体内生物学活性。
在另一个实施方式中，最初可以由体外试验估算有效量或剂量的制备。在一个实施方式中，可以在动物模型中配制剂量并且这样的信息可以被用于更准确地确定在人中有用的剂量。
在一个实施方式中，可以在细胞培养物或实验动物中通过标准的体外药学程序测定如本文描述的长效OXM的毒性和疗效。在一个实施方式中，由这些体外和细胞培养试验和动物研究获得的数据可以被用于配制用于人的剂量范围。在一个实施方式中，剂量取决于采用的剂型和利用的施用途径变化。在一个实施方式中，可以由单个医师鉴于患者的状况选择准确的制剂、施用途径和剂量。[参见例如，Fingl,et al.,(1975)"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1]。
在一个实施方式中，取决于待治疗的病症的严重度和反应性，给药可以具有单次或多次施用，其中疗程持续数天至数周或直到实现治愈或实现疾病状态减弱。
在一个实施方式中，当然，待施用的组合物的量将取决于正在治疗的对象、病痛的严重度、施用方式、处方医师的判断等。
在一个实施方式中，还制备了包括在相容性药物运载体中配制的本发明的制剂的组合物，其被放置于适当的容器中，并且被标记用于治疗指的是的病症。
在另一个实施方式中，如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM经由全身施用被施用。在另一个实施方式中，如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM通过静脉内、肌肉内或皮下注射被施用。在另一个实施方式中，如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM是与复杂的有机赋形剂和稳定剂——比如非离子型表面活性物(即，表面活性剂)、多种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白——组合的冻干的(即，冷冻干燥的)制剂。在另一个实施方式中，药物组合物在无菌注射用水中包括如描述的冻干的可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，药物组合物在无菌注射用PBS中包括如描述的冻干的可逆聚乙二醇化的OXM。在另一个实施方式中，药物组合物在无菌注射用0.9％NaCl中包括如描述的冻干的可逆聚乙二醇化的OXM。
在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM和复杂的运载体，比如人血清白蛋白、多元醇、糖、和阴离子型表面活性稳定剂。参见，例如，WO89/10756(Hara et al.-containing polyol and p-hydroxybenzoate)。在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM和乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲剂。在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM和增加干扰素组合物在水中的溶解度的氨基酸，比如精氨酸或谷氨酸盐。在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的冻干的可逆聚乙二醇化的OXM和甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲剂(例如乙酸盐)和等渗剂(例如NaCl)。在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的冻干的可逆聚乙二醇化的OXM以及磷酸盐缓冲剂、甘氨酸和HSA。
在另一个实施方式中，当放置在具有大约4和7.2之间的pH的缓冲溶液中时，包括如本文描述的聚乙二醇化的或可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物是稳定的。在另一个实施方式中，使用氨基酸作为稳定剂并且在一些情况下使用盐(如果氨基酸不包含带电侧链)，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物是稳定的。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物是液体组合物，其包括按重量计大约0.3％和5％之间的为氨基酸的稳定剂。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物提供了给药准确性和产品安全性。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物提供了具生物学活性的、稳定的液体制剂以便用于可注射的应用。在另一个实施方式中，药物组合物包括如本文描述的未冻干的可逆聚乙二醇化的OXM。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物提供了液体制剂，其允许在液体状态中储存持续长时段，这有助于施用之前的储存和运送。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括固体脂质作为基体材料。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的可注射的药物组合物包括固体脂质作为基体材料。在另一个实施方式中，脂质微粒通过喷雾凝结产生由Speiser(Speiser and al.,Pharm.Res.8(1991)47-54)描述，接着描述了用于经口施用的脂质纳米丸剂(nanopellet)(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施方式中，使用的脂质是身体良好耐受的(例如由存在于乳液中的脂肪酸组成的用于肠胃外营养的甘油酯)。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物是脂质体的形式(J.E.Diederichs and al.,Pharm./nd.56(1994)267-275)。
在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括聚合物微粒。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的可注射的药物组合物包括聚合物微粒。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括纳米颗粒。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括脂质体。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括脂质乳液。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括微球。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括含有两亲的脂质的脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，包括如本文描述的可逆聚乙二醇化的OXM的药物组合物包括含有药物、脂质基体和表面活性剂的脂质纳米颗粒。在另一个实施方式中，脂质基体具有至少50％w/w的单甘油酯含量。
在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的试剂盒，其包含一个或多个含有长效OXM的单位剂型。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，比如泡罩包装。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施方式中，包装或分配器装有与容器相关联的公告，其以由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该公告反映该机构批准组合物的形式或人医或兽医施用。在一个实施方式中，这样的公告是由美国食品和药品管理局批准用于处方药或批准的产品说明书的标签。
在一个实施方式中，将领会本发明的可逆聚乙二醇化的OXM可以与另外的活性剂一起被提供给个体以实现与单独使用每种药剂治疗比较改进的治疗效果。在另一个实施方式中，对与组合疗法相关联的不利副作用采取措施(例如，给药和选择补充药剂)。
在查阅下列实施例之后，本发明的其它目标、优势和新颖特征对本领域普通技术人员将变得明显，其不意欲是限制性的。此外，如上文描绘和如所附权利要求部分中要求保护的本发明的多种实施方式和方面中的每个在下列实施例中发现了实验支持。
实施例
通常，在本文使用的术语和在本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中被彻底地说明。参见，例如，"MolecularCloning:A laboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols inMolecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R。M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific AmericanBooks,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中陈述的方法；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III ColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"SelectedMethods in Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫试验在专利和科学文献中被广泛地描述，参见，例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide toMolecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology"Vol.1-317,Academic Press；"PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak et al.,"Strategies for ProteinPurificationand Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入。遍及本文档提供了其它一般参考文献。
实施例1
制备PEG30-S-MAL-FMS-OXM
合成OXM
胃泌酸调节素氨基酸序列被陈述在下列肽序列中：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO:1)
遍及肽链组装中采用Fmoc策略通过固相方法合成肽(Almac Sciences,Scotland)。
使用下列步骤组装肽序列：
1.加帽
使用DMF(Rathburn)中的0.5M乙酸酐(Fluka)溶液对树脂进行加帽。
2.脱保护
使用DMF(Rathburn)中的20％v/v哌啶(Rathburn)溶液从生长的肽链去除Fmoc-保护基。
3.氨基酸偶联
使用DMF(Rathburn)中的1M HOBt(Carbosynth)溶液和DMF(Rathburn)中的1M DIC(Carbosynth)溶液活化DMF(Rathburn)中的0.5M氨基酸(Novabiochem)溶液。每次偶联使用4当量的每种氨基酸。
从树脂裂解粗肽(crude peptide)，并且通过在三异丙基硅烷(Fluka)、水、二甲基硫化物(Aldrich)、碘化铵(Aldrich)和TFA(Applied Biosystems)的混合物中搅拌4小时来去除保护基。通过由冷乙醚沉淀收集粗肽。
肽纯化
将粗肽溶解于乙腈(Rathburn)/水(MilliQ)(5:95)，并且装载至制备型HPLC柱上。色谱参数如下：
柱：Phenomenex Luna C18 250mm×30，15μm，300A
流动相A：水+0.1％v/v TFA(Applied Biosystems)
流动相B：乙腈(Rathburn)+0.1％v/v TFA(Applied Biosystems)
UV检测：214或220nm
梯度：25％B至31％B，经过4个柱体积
流率43mL/min
合成MAL-FMS-NHS
方案1–合成MAL-FMS-NHS和MAL-Fmoc-NHS连接体
化合物2-5的合成基于由Albericio等在Synthetic Communication,2001,31(2),225-232中描述的程序。
2-(Boc-氨基)芴(2)：
使2-氨基芴(18g，99mmol)在磁力搅拌的情况下悬浮于冰浴中的二烷:水(2:1)(200ml)和2N NaOH(60ml)的混合物。然后添加Boc2O(109mmol，1.1当量)并且在RT下继续搅拌。通过TLC(Rf＝0.5，己烷/乙酸乙酯2:1)监测反应，并且通过添加2N NaOH将pH维持在9-10之间。在反应完成时，使用1M KHSO4将悬浮液酸化至pH＝3。将固体滤出并且使用冷水(50ml)、二烷-水(2:1)洗涤，并且然后与甲苯共沸两次，然后将其用于下个步骤。
9-甲酰基-2-(Boc-氨基)芴(3)：
在3颈RBF中，使NaH(油中60％；330mmol，3.3当量)悬浮于无水THF(50ml)，在20分钟内逐滴添加在步骤2中描述的-(Boc-氨基)氟(28g；100mmol)在无水THF(230ml)中的溶液。观察到稠黄色浆料，并且混合物在氮下在RT下搅拌10分钟。逐滴添加甲酸乙酯(20.1ml，250mmol，2.5当量)(注意：气体逸出)。浆料变为浅棕色溶液。溶液被搅拌20分钟。通过TLC(Rf＝0.5，己烷/乙酸乙酯1:1)监测反应，并且当观察到仅痕量的起始材料时，使用冰水(300ml)将其猝灭。混合物在减压下蒸发直到大部分THF已经被去除。使用乙酸将得到的混合物处理至pH＝5。使获得的白色沉淀物溶解于乙酸乙酯，并且分离有机层。使用乙酸乙酯提取水层，并且合并所有有机层和使用饱和碳酸氢钠、盐水进行洗涤，并且在MgSO4之上进行干燥。在过滤和溶剂去除后，获得黄色固体。将此材料用于下个步骤。
9-羟甲基-2-(Boc-氨基)芴(4)：
使来自上面的化合物3悬浮于MeOH(200ml)，并且在15分钟内逐份添加硼氢化钠。混合物被搅拌30分钟(注意：放热反应和气体逸出)。通过TLC(Rf＝0.5，己烷/EtOAc 1:1)监测并且完成反应。添加水(500ml)，并且使用乙酸将pH调节至5。处理(work-up)包括使用乙酸乙酯提取两次，使用碳酸氢钠和盐水洗涤经合并有机层，在MgSO4之上进行干燥，过滤，和浓缩至干燥。使用庚烷/EtOAc(3:1)通过急骤色谱法(flask chromatography)纯化获得的粗产物以得到黄色泡沫(36g，97.5％纯度，在1H-NMR中观察到痕量的乙酸乙酯和乙醚)。
MAL-Fmoc-NHS(7)：
在周围环境下向具有架空的搅拌的清洁干燥的500ml RBF进料无水THF(55ml)中的三光气(1.58g，0.35当量)以形成溶液。使用冰/水浴将其冷却至0℃，并且在0℃下在氮下在10分钟内逐滴添加NHS(0.67g，0.38当量)在无水THF(19ml)中的溶液。生成的溶液被搅拌30分钟。在0℃下在10分钟内逐滴添加无水THF(36ml)中进一步部分的NHS(1.34g，0.77当量)，并且搅拌15分钟。
一起搅拌化合物6(5.5g，1当量)、无水THF(55ml)和吡啶(3.07ml，2.5当量)以形成悬浮液。在0-5℃下将其按份添加至NHS溶液，并且然后通过移除冰浴使其回到室温。
在20小时后，反应停止(起始材料仍存在，如果推动反应至完全，则观察到较模糊的杂质)。
过滤反应混合物并且向滤液添加4％盐水(200ml)和EtOAc(200ml)。在分离后，使用5％柠檬酸(220ml)和水(220ml)洗涤有机层。有机层然后被浓缩以得到7.67g的MAL-Fmoc-NHS(纯度是93-97％)。通过柱色谱法使用梯度环己烷/EtOAc 70:30至40:60纯化材料。在真空下浓缩包含有产物的级分以得到3.47g(45％)的MAL-Fmoc-NHS。
MAL-FMS-NHS–(A)
向MAL-Fmoc-NHS(100mg，0.2mmol)在三氟乙酸(10ml)中的溶液添加氯磺酸(0.5ml)。在15分钟后，添加冰冷乙醚(90ml)并且使产物沉淀。通过离心收集材料，使用乙醚洗涤并且在真空下进行干燥。获得41.3mg(35％)的米色固体。
MAL-FMS-NHS–(B)
使初始材料Mal-Fmoc-NHS在惰性气氛下溶解于纯的TFA(通常520mL)持续通常5分钟。使6当量氯磺酸溶解于纯的TFA(通常106mL)并且逐滴添加至反应混合物(通常45分钟)。在完成磺化后(通常50分钟)，反应混合物被倒在冷乙醚(通常25.4L)上进行沉淀。过滤沉淀物和在真空中干燥(通常90分钟)得到Mal-FMS-NHS(纯度是93-97％)，其直接经受偶联阶段。Mal-FMS-NHS以93％-97％之间的足够纯度被获得。
实施例1A
缀合OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS-(A)——“一锅反应”，以产生PEG30-S-MAL-FMS-OXM(MOD 6030)的非均质缀合物
OXM肽中的3个胺位点(Lys12、Lys30和氨基端)的非均质缀合作为“一锅反应”进行，其中来自每种组分的1当量在pH 7.2下混合在一起持续30min：OXM、mPEG-SH和FMS连接体。通过添加乙酸将pH降低至4来终止反应。
非均质缀合物(MOD-6030，图1，PEG30-FMS-OXM)的合成如下进行：MAL-FMS-NHS-(A)[如上面描述的]与OXM和PEG(30)-SH混合(作为一锅反应)。MAL-FMS-NHS-(A)间隔体在一侧上通过其NHS活化的酯与OXM偶联并且同时在另一侧上通过PEG-SH与马来酰亚胺基团接合。以此方式，PEG-S-MAL-FMS-OXM缀合物的非均质混合物由通过OXM肽的3种胺(N端、Lys12和Lys30)中的一种接合的三种变体组成。
在非均质缀合中，完成胃泌酸调节素合成并且在裂解期间去除所有保护基，并且因此具有伯胺的那个可以进一步与NHS基团反应。纯化粗胃泌酸调节素并且发生一锅反应。
实施例1B
缀合OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS-(A)——两步法，以产生PEG30-S-MAL-FMS-OXM的均质缀合物
缀合程序被进一步发展为两步法，其中与FMS间隔体(MAL-FMS-NHS)的连接以受控和定点的方式执行。在第一步中，FMS间隔体被与保护的OXM*偶联(在树脂部分保护的OXM上，其中在Lys12和Lys30处受保护的N端OXM作为优选的保护的OXM)，然后裂解，接着脱保护和纯化MAL-FMS-OXM(通过RP-HPLC)。
*在使用Fmoc-SPPS方法肽合成OXM期间，氨基酸通过用于氨基酸的每个R基团的多种保护基被保护，其在通过TFA从树脂裂解期间被脱保护。为了合成Lys12或Lys30定点偶联的FMS，ivDde被用于保护赖氨酸的胺基团，例如对于OXM-Lys12-FMS，Lys12的R基团中的NH2通过ivDde被添加保护，其通过弱酸条件被选择性地去除，同时使用其它保护基的所有其它氨基酸仍被保护。对于具体的N端偶联，使用常规的SPPS。即完成OXM的合成，接着添加仅被偶联至未保护的N端基团的MAL-FMS-NHS。
第二步是将PEG30-SH附连至纯化的均质MAL-FMS-OXM。通过RP-HPLC进一步纯化最终缀合产物(PEG30-S-MAL-FMS-OXM)。可以应用另外的纯化步骤，比如离子交换或SEC-HPLC或任何其它纯化步骤。
使用Fmoc固相策略合成树脂上的三种肽。为了合成通过OXM的第12或30位处的氨基酸赖氨酸接合的均质缀合物，对OXM的Lys12或Lys30应用作为ivDde(1-[(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-次基)乙基])的选择性保护基，它可以在碱性条件下被去除，而其余的肽仍与其它保护基一起在树脂上。
因此，合成三种树脂结合的OXM：N端——使用适于使用Fmoc策略固相合成的保护基(Boc保护基经常被用于ε胺)，并且Lys12或Lys30使用ivDde保护基。这些OXM肽意欲与FMS连接体进一步选择性地偶联。
均质缀合物作为‘树脂上合成’进行。缀合物在两个步骤中合成：
1.在OXM和FMS之间偶联，裂解和纯化。
2.使用PEG30-SH使MAL-FMS-OXM聚乙二醇化。在此程序中，使用保护的OXM(游离的N端-OXM、游离的Lys12-OXM或游离的Lys30-OXM)中的任一种进行MAL-FMS-NHS的偶联，同时其被接合至树脂。保护的OXM在其它游离的胺位点处被保护，使得OXM上特定的未保护的期望的氨基位点与MAL-FMS-NHS上的NHS部分反应。纯化的MAL-FMS-OXM与PEG30-SH反应以产生粗缀合物，使用HPLC(RP或阳离子交换或二者)对其进行纯化。
将MAL-FMS-NHS(A)偶联至Lys12/Lys30保护的N端OXM(MOD-6031)：
MAL-FMS-NHS连接体溶液(0.746ml，DMF中10mg/ml，2当量)被添加至Lys12/Lys30保护的N端OXM树脂*(1当量，200mg树脂，31.998μmol/g游离的胺)中。添加DMF直到树脂刚好自由地移动，并且然后超声处理19小时。在真空干燥器中干燥过夜前，使用DMF和甲醇洗涤树脂。裂解混合物包含TFA/TIS/H2O。裂解在室温下进行3.5小时。在过滤树脂后，在冷乙醚中沉淀MAL-FMS-OXM。在裂解阶段结束时获得42.1mg的粗MAL-FMS-OXM(36％纯)。
将MAL-FMS-NHS(A)偶联至Lys12定点的OXM：
MAL-FMS-NHS连接体溶液(DMF中10mg/ml，2.5当量)被添加至(Lys12)OXM树脂(1当量)，而且添加DIEA(5当量)。添加DMF直到树脂刚好自由地移动，并且然后超声处理过夜。在真空干燥器中干燥过夜前，使用DMF和甲醇洗涤树脂。如关于N端定点描述的进行裂解和沉淀。
将MAL-FMS-NHS(A)偶联至Lys30定点的OXM：
使MAL-FMS-NHS连接体(2.5当量)溶解于DCM，而且添加DIEA(5当量)。此连接体/DIEA溶液被添加至(Lys30)OXM树脂，然后超声处理过夜。在真空干燥器中干燥过夜前，使用DCM和甲醇洗涤树脂。如关于N端定点描述的进行裂解和沉淀。
纯化
在下列条件下以一份纯化生成的粗MAL-FMS-OXM，其来自上面产生的任何生成的均质中间体。
样品稀释剂：水中的10％乙腈
柱：Luna C18(2)，250×21.2mm
注入流率：9ml/min
运行流率：9ml/min
缓冲剂A：水(0.1％TFA)
缓冲剂B：乙腈(0.1％TFA)
梯度：10-45％B，经过32min
监测：230nm
上面产生的均质中间体中的任一种被用于在下列步骤中形成均质缀合物：
将PEG30SH缀合至MAL-FMS-OXM
制备MAL-FMS-OXM溶液(1当量，1.5ml DMF中15.1mg)。PEG30SH(1当量，pH 6.5磷酸盐缓冲剂中9.2ml的10mg/ml)被添加至MAL-FMS-OXM溶液。然后在室温下搅拌反应混合物30min，接着添加冰乙酸(200μl)以通过降低pH来猝灭反应。
然后使用RP-HPLC纯化生成的产物以提供期望的均质缀合物PEG-S-MAL-FMS-OXM(PEG-FMS-OXM)。
柱：Luna C18(2)，250×21.2mm
注入流率：5ml/min
运行流率：20ml/min
缓冲剂A：水&0.1％TFA
缓冲剂B：乙腈/水(75:25)&0.1％TFA
梯度：10-65％B，经过41min
监测：220、240、280nm
实施例1C
缀合OXM+PEGSH+MAL-FMS-NHS--(B)——两步法，以产生PEG30-S-MAL-FMS-OXM的均质缀合物
通过如下进行偶联：使OXM树脂(通常2L DMF中236g(使用保护的Lys12/Lys30N端OXM，或保护的Lys12/N端OXM或保护的Lys30/N端OXM*))在惰性气氛下悬浮于MAL-FMS-NHS(B)在纯的DMF/DCM(1:1，v/v，通常12g/L的浓度)中的溶液，随后使用纯的DIPEA(通常7.5mL)将反应混合物调节至6.0-6.5的表观pH。在RT下伴随搅拌实施偶联。以两份添加Mal-FMS-NHS连接体(第一份：1.5当量；第二份0.5当量Mal-FMS-NHS；关于装载的肽树脂计算当量；在撤去第一份后添加第二份)。每个偶联步骤实施22和24h之间。下列过滤，使用DMF(通常8.5mL/g树脂，3次)、MeOH(通常8.5mL/g树脂，3次)和异丙基醚(通常8.5mL/g树脂，3次)连续洗涤树脂，以及随后真空干燥(69和118h之间)得到完全保护的MAL-FMS-OXM树脂。通常获得116g高至243g的量的MAL-FMS-OXM树脂。
*在使用Fmoc-SPPS方法肽合成OXM期间，氨基酸通过用于氨基酸的每个R基团的多种保护基被保护，其在通过TFA从树脂裂解期间被脱保护。为了合成Lys12或Lys30定点偶联的FMS，ivDde被用于保护赖氨酸的胺基团，例如对于OXM-Lys12-FMS，Lys12的R基团中的NH2通过ivDde被添加保护，其通过弱酸条件被选择性地去除，同时使用其它保护基的所有其它氨基酸仍被保护。对于具体的N端偶联，使用常规的SPPS。即完成OXM的合成，接着添加仅被偶联至未保护的N端基团的MAL-FMS-NHS。
裂解：
通过在RT下使用TFA/H2O/TIPS(84:8.5:7.5，v/v/v)处理肽树脂3.5h获得粗MAL-FMS-OXM。在3.5h后，1当量碘化铵作为固体被添加用于Met(O)-还原。在4.0h后，抗坏血酸(1.5当量)作为固体被添加。裂解混合物被搅拌另一个5分钟和在异丙基醚(IPE)(通常5mL/mL的裂解混合物)中进行沉淀。通过过滤进行分离和真空干燥(通常41和90h之间)。
纯化
应用二维纯化方案(而不是一个)
固定相和梯度被改变。
样品稀释剂：50％乙酸
柱：Luna C8(10μm，)，30cm×25cm
注入流率：1500ml/min
运行流率：1500ml/min
缓冲体系和梯度：对于第一维度，0.1％H3PO4(pH 2)(A：3％，B：60％ACN)(梯度概况：0％B-70min-100％B)，并且对于第二维度，0.1％TFA洗脱液(pH 2)(A：3％，B：100％ACN)(梯度概况：0％B-97min-100％B)。
检测的波长：220nm
将PEGSH缀合至MAL-FMS-OXM
肽MAL-FMS-OXM(B)(12.3g，1当量)和PEG30-SH(1.1当量，67.8g(活性SH基团))被单独地溶解于包含10％ACN的20mM NaOAc缓冲剂(pH 4.7)(肽12g/L并且PEG30-SH 10g/L)。在将pH调节至6.1后(通过使用aq.NaOAc，pH 9.3)，通常在RT下在惰性气氛下搅拌溶液1h。然后，使用AcOH(25％v/v)将pH调节至4.5-5.0并且获得的反应混合物被应用于制备型HPLC纯化。
样品稀释剂：来自聚乙二醇化反应的粗制品(crude)
柱：Luna C18(2)(10μm，)，20cm×28cm
注入流率：907ml/min
运行流率：907ml/min
缓冲体系：0.1％TFA洗脱液(pH 2.0)(A：5％ACN，B：90％ACN)
梯度概况：5％B–30min–5％B–66min–78％B–1min–90％B–15min–90％B
检测的波长：220nm
纯化的级分被合并和冻干。
实施例2
GLP-1受体活化的体外表征
GLP-1受体活化的体外表征
使用两种不同的细胞系评估GLP-1受体的活化；HTS163C2(Millipore)和cAMPHunterTM CHO-K1GLP1R(Discoverx)，二者均过表达GLP-1受体。将HTS163C2(Millipore)以100,000个细胞/ml的密度接种在96孔半区白板(half-area white plate)(Greiner)中，并且在37℃下培育24小时。将细胞与递增浓度的非均质PEG30-FMS-OXM和3种均质PEG30-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)一起培育。通过HTRF试验(Cisbio 62AM4PEB)定量细胞cAMP浓度，并且通过PRISM软件分析EC50参数。cAMP HunterTM CHO-K1GLP1R在配体与受体结合之后分泌cAMP。将细胞以500000个细胞/ml的密度接种在96孔板中，并且在37℃下使用5％CO2培育24h。将配体在包含IBMX的稀释剂中稀释，并且在37℃下使用5％CO2一式两份地添加至培养孔持续30min。PEG30-FMS-OXM的浓度范围是1.5*10-10至1.2*10-6M。添加裂解缓冲剂和检测试剂至孔，并且使用化学发光信号检测cAMP浓度。建立剂量依赖性曲线，并且使用PRISM软件通过应用最佳拟合剂量反应模型(四种参数)计算多种配体的结合亲和力(EC50)。
使用两种过表达GLP-1受体的不同细胞系——Millipore HTS163C2细胞系和cAMPHunterTM CHO-K1GLP1R——评估PEG-S-MAL-FMS-OXM(MOD-6030；非均质)以及PEG-S-MAL-FMS-OXM的3种不同的均质变体——氨基(MOD-6031)、Lys12和Lys30——的GLP-1受体结合活化。通过如下测定效能：计算每种变体的EC50，接着计算每种变体与非均质(MOD-6030)版本的相对效能(使每种均质变体的EC50除以非均质版本的EC50并且使其乘以100)。EC50值和计算的相对效能在表4中被呈现。为了比较，测量OXM和GLP-1与cAMP Hunter CHO-K1GLP1R细胞系的GLP-1受体的结合亲和力。
表4：GLP-1和胰高血糖素受体结合活化
均质变体的相对效能与非均质版本比较，并且在表4中被概述。使用MilliporeHTS163C2和cAMP HunterTM CHO-K1 GLP1R进行测量，氨基变体和非均质变体的比得上的生物学活性分别展现出72.2％和99.1％的相对效能。
Lys12和Lys30变体使用Millipore HTS163C2细胞系分别显示了GLP-1受体结合活化的2倍和4倍降低，而使用cAMP HunterTM CHO-K1 GLP1R细胞系分别仅显示了小的和2倍降低。氨基变体与其它变体比较展现出优越的结合活性的事实是出人意料的，因为OXM的N端被报道参与OXM与GLP-1受体的结合(Druce et al.,2008)。总的来说，氨基变体和非均质变体显示了比得上的生物学活性。测量OXM和GLP-1肽的GLP-1受体结合活化。发现OXM和GLP-1已经显示了与非均质PEG30-FMS-OXM比较高5.9和508.7倍的受体结合活化。
实施例3
胰高血糖素受体活化的体外表征
胰高血糖素受体活化的体外表征
使用过表达胰高血糖素-受体的cAMP HunterTM CHO-K1 GCGR细胞系评估胰高血糖素受体的活化。此细胞系在配体与胰高血糖素受体结合之后分泌cAMP。将细胞以500000个细胞/ml的密度接种在96孔板中，并且在37℃下使用5％CO2培育24h。将配体在包含IBMX的稀释剂中稀释，并且在37℃下使用5％CO2一式两份地添加至培养孔持续30min。MOD-6031的浓度范围是5.8*10-11至2.7*10-7M。添加裂解缓冲剂和检测试剂至孔，并且使用化学发光信号检测cAMP浓度。建立剂量依赖性曲线，并且使用PRISM软件通过应用最佳拟合剂量反应模型(四种参数)计算多种配体的结合亲和力(EC50)。
使用过表达胰高血糖素-受体的cAMP HunterTM CHO-K1GCGR细胞系测定PEG-S-MAL-FMS-OXM变体与胰高血糖素受体的结合亲和力。此细胞系被用于表征非均质PEG-S-MAL-FMS-OXM(MOD-6030)以及PEG-S-MAL-FMS-OXM的3种不同的均质变体氨基(MOD-6031)、Lys12和Lys30。效能通过如下测定：计算每种变体的EC50，接着计算每种变体与非均质版本的相对效能(使每种均质变体的EC50除以非均质版本的EC50并且使该值乘以100)。EC50值和计算的相对效能在表4中被呈现。氨基变体显示了比得上非均质版本的结合活性。Lys30变体显示了最高生物学活性并且Lys12显示了1.8倍降低。测量OXM和胰高血糖素肽的胰高血糖素受体结合活化。发现OXM和胰高血糖素显示了与非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM比较高11.1和283倍的受体结合活化。
实施例4
通过PEG30-FMS-OXM变体诱导葡萄糖耐量
C57BL/6雄性小鼠禁食过夜然后称重，并且使用手持血糖仪通过尾静脉取样测量血糖水平。小鼠IP注射有PEG-SH(媒介)、PEG30-FMS-OXM(非均质)和PEG30-FMS-OXM的三种均质变体(氨基、Lys12和Lys30)。在测试品施用后15min，IP施用葡萄糖(1.5gr/kg)。在葡萄糖施用之前和在葡萄糖施用后10、20、30、60、90、120和180min，使用手持血糖仪通过尾静脉取样测量血糖水平。
为了评价非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM和三种PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体(氨基、Lys12和Lys30)的体内活性，应用IPGTT模型。给过夜禁食的C57BL/6小鼠IP注射不同的化合物和媒介(PEG-SH)，接着IP注射葡萄糖和使用血糖仪从尾静脉测量血糖水平。在葡萄糖IP注射(1.5gr/kg)之前15min，IP施用PEG-SH(238.10nmol/kg)、非均质和均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM(100nmol/kg肽含量)。所有化合物与媒介组比较均诱导葡萄糖耐量。令人惊讶地，由与其它变体比较稍高的葡萄糖AUC反映的，均质氨基变体与两种其它变体和非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM比较效能稍小(表5，图3)，这与体外活性结果相反。然而，所有变体与媒介PEG-SH对照比较均显著地改进葡萄糖耐量。
表5：C57BL/6小鼠的葡萄糖耐量
可逆的PEG30-S-MAL-FMS-OXM的非均质和均质变体显示在体外和在IPGTT模型体内均是活性的。令人惊讶地，体外结果与文献中表明的内容不一致：天然OXM的N端参与GLP-1受体的肽结合；因此预期氨基端变体将在体外和体内均显示最低效能。然而，PEG30-S-MAL-FMS-OXM的均质氨基变体与两种其它均质变体比较在使用两种不同的细胞系时展现出改进的GLP-1受体活化(表4)，而在IPGTT体内模型中展现出比得上的功效。IPGTT体内模型似乎呈现比得上的活性(考虑动物之间的变化性)。虽然在不同的PEG30-FMS-OXM变体之间观测到与GLP-1R和GCGR不同的体外结合活化，但是显示了比得上的诱导葡萄糖耐量的能力(表4和5)。出人意料地，如cAMP诱导试验中显示的均质氨基PEG30-S-MAL-FMS-OXM的优越的体外活性在体内IP葡萄糖耐量测试中没有反映。均质氨基变体PEG30-S-MAL-FMS-OXM与两种其它变体和非均质PEG30-S-MAL-FMS-OXM比较显示了最低葡萄糖耐量概况。然而，其与媒介较仍显示了显著的葡萄糖耐量效应(图3)。
实施例5
ob/ob小鼠模型中体重、血糖和脂质概况通过PEG30-S-MAL-FMS-OXM变体的改进
材料和方法
研究1：使二十五只雄性ob/ob小鼠(雄性，B6.V-Lep^ob/OlaHsd，:5-6周龄，Harlan)适应设施(10天)，接着进行处置方案，由此处置动物如同被给药但是实际上不称重或给药(10天)。随后，动物经历7天的基线期，其中它们每周两次通过皮下途径以20ml/kg的体积被给药适当媒介。每天记录体重、食物和水摄取，并且获取样品用于非禁食和禁食葡萄糖测量以及非禁食和禁食胰岛素测量。随后基于体重和血糖概况将动物分配为五个处理组(N＝5)。如表1中描述的，每四天(第1、5、9、13和16天)向动物给药。在处理期期间，在给药前，每天测量和记录食物摄取、水摄取和体重。已经进行数个程序和取样：第2、6、14和17天的非禁食和禁食葡萄糖(在第17天仅测量非禁食葡萄糖)，禁食和非禁食胰岛素(第2、6和14天)。分析第19天的终末样品的胆固醇。
表1：研究设计
研究2：
使一百只雄性ob/ob小鼠(5-6周龄，Charles River)适应设施(3天)，接着进行处置方案，由此处置动物如同被给药但是实际上不称重或给药(7天)。随后，动物经历7天的基线期，其中它们每周两次通过皮下途径以20ml/kg的体积被给药PEG30-SH媒介(146mg/ml)。每天记录体重、食物和水摄取。随后将动物分配为8个处理、对照和配对喂养组(A-H组，N＝8)(表2)。将配对喂养组与MOD-6031的高剂量(6000nmol/kg)组配对喂养，并且向其给予的每日食物定量与前一天D组中的其配对对应体食用的食物定量相等。以1000、3000和6000nmol/kg给3个另外的组(I-K组，N＝12)施用MOD-6031，并且对其取样用于PK分析。每周两次向PEG-SH媒介(292mg/ml)组，1000、3000和6000nmol/kg下的MOD-6031组，和配对喂养组给药持续32天，同时每天两次施用OXM、和PBS。每天测量体重、食物和水摄取。每周一次测量非禁食和禁食葡萄糖，在第2和30天进行OGTT。分析终末血液样品(第33天)的葡萄糖、胰岛素、胆固醇、和MOD-6031、PEG-S-MAL-FMS-NHS和OXM浓度。PK组中的小鼠接受单一剂量的MOD-6031，并且在4、8、24、36、48、72、96和120小时(每个时间点n＝3)获取血液样品用于PK分析，其允许通过LC-MS/MS方法定量MOD-6031和其化合物浓度。
研究2：研究设计
研究3：
使四十二只雄性ob/ob小鼠(7周龄，Charles River,Italy)适应设施(10天)，接着进行处置方案，由此处置动物如同被给药但是实际上不称重或给药(7天)。随后，动物经历1周的基线期，其中每只动物通过皮下途径以20ml/kg的体积已经被给药PEG30-SH两次。每天记录体重、食物和水摄取，并且获取样品用于非禁食和禁食葡萄糖测量以及非禁食和禁食胰岛素测量。随后基于血浆葡萄糖、体重和每日食物与水摄取将动物分配为三个处理、对照和配对喂养组(A组，N＝10，B-E组，N＝8)。将配对喂养组与B组(PEG-S-MAL-FMOC-OXM)配对喂养但是使用PEG-SH(204.5mg/kg)进行处理。向其给予的每日食物定量与前一天B组中的其配对对应体食用的食物定量相等。正因如此，在所有研究程序和测量中，E组中的动物将与B组不协调地差一天。在研究期间，如表3中描述的，每四天(第1、5、9、13、17、21、25和29天)向动物给药。在处理期期间，在给药前，每天测量和记录食物摄取、水摄取和体重。已经进行数个程序和取样：第1、6、14、22和29天的非禁食葡萄糖，第10、18和26天的禁食葡萄糖。在第2和30天，禁食葡萄糖样品已经被获取为OGTT程序的一部分，其中并行于葡萄糖测量胰岛素。分析第33天的终末样品的胆固醇、甘油三酯和果糖胺。
表3：研究设计
结果
ob/ob小鼠模型展现出ob基因的突变，以便它们不能产生瘦蛋白和发展以高胰岛素血症、肥胖、摄食过量、胰岛素抗性和随后的高血糖症为特征的表型。这些小鼠在两个不同的研究中被用作糖尿病的遗传模型，以便评价PEG30-FMS-OXM(非均质)和PEG30-S-MAL-FMS-OXM的三种均质变体(氨基、Lys12和Lys30)的功效。
研究1：此研究比较了当以2000nmol/kg施用时，均质变体(氨基、Lys12和Lys30)和非均质MOD-6030的功效。所有测试物品与媒介(PEG-SH)组比较均获得体重降低，其中Lys12、MOD-6030、氨基和Lys30变体分别最终降低(在第18天)3.1％、4.7％、4.9％和6.5％(图4)。在药物注射之后的第1、5、13和16天观察到体重降低(图4)。所有处理组在药物施用之后(除第9天之外)均被观察到食物摄取减少(图5)。在研究期间对血糖参数的测量已经显示了氨基和Lys12处理组的非禁食葡萄糖的改进(图6A)以及所有处理组的禁食葡萄糖的改进(图6B)。所有处理组与对照比较均显示了显著更低的胰岛素水平。注意，此研究中的施用剂量是2000nmol/kg，这是MOD-6030的较低有效剂量，并且因而体重、食物摄取和血糖概况的改进是相对中等的。出乎意料地，氨基变体是在降低重量、抑制食物摄取和改进血糖控制的能力中显示优越功效的唯一变体。从制造角度而言，考虑到肽在固相合成中从氨基端延伸，氨基变体的树脂上合成是最直接的程序。端胺与第12和30位处的赖氨酸的内部胺基团相比具有优选的偶联可用性。此可行性反映在氨基变体与Lys12和Lys30变体比较更高的制造产率中。另一个益处在于，朝向氨基变体的合成相对于非均质变体的OXM合成保持不变，而Lys12和Lys30变体的合成通过改变用于肽合成的Lys和通过添加选择性裂解步骤(选择性地去除Lys的保护基)而被修改。如先前关于非均质研发的OXM合成已经被优化以实现更好的产率和稳健性。总的来说，从制造角度而言，氨基变体的树脂上合成是直接的并且与替代变体相比具备优势。作为均质变体，其与非均质变体相比还具有的优势在于其更适于药物研发和药物处理。
研究2：此研究调查了每周两次以1000、3000和6000nmol/kg施用MOD-6031(氨基变体)对ob/ob小鼠模型的药理学和药物动力学参数的长期作用，同时评价作为参考化合物的OXM和利拉鲁肽(长效GLP-1受体激动剂)。测量的药理学参数是体重、食物和水摄取、葡萄糖控制和脂质概况。每周两次施用高剂量的MOD-6031(6000nmol/kg)显著地减少食物摄取和体重(图7；图8)，而较低的剂量(3000和1000nmol/kg)显示了较低的作用。在研究结束(第33天)时，1000、3000和6000nmol/kg的动物分别显示了5.2％、12.3％和28.3％的体重降低。与高剂量组配对并且食用等量食物(除禁食日之外)的配对喂养组具有12.7％的体重降低，但是经历类似的食物摄取。此现象可以归因于PEG30-FMS-OXM的氨基变体增加能量消耗的能力，因而使用6000nmol/kg的氨基变体处理的动物相对于其配对喂养组的体重降低具有增加的体重降低。在研究中，OXM和利拉鲁肽二者分别显著地降低体重10.3％和8.3％。在第1、5、12、19、26和29天监测非禁食葡萄糖和在第2、9、16、23和30天监测禁食葡萄糖的血糖概况的测量显示了这些参数的显著改进，尤其是对于6000nmol/kg(图9A；图9B)。在第2天和第30天进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT)研究(分别地，图10和图11)。结果显示MOD-6031(氨基变体)显著地和剂量依赖性地改进葡萄糖耐量，在1000、3000和6000nmol/kg组中血浆葡萄糖显著地降低。与最高MOD-6031剂量配对喂养的动物在葡萄糖给药之后展现出葡萄糖漂移，这在测试的任何时间点处均未与对照显著不同。在OGTT研究的第2天，改进的葡萄糖概况与胰岛素应答的延迟相关联，其对于AUC 0-120min轻微地延迟并且给予更高的刺激(图10)。这可能是由于由MOD-6031的药理学活性诱导的对胃排空的抑制，其导致延迟葡萄糖释放入血液和第二胰岛素分泌期。OGTT研究的第30天与和对照比较减少的胰岛素应答相关联，这显示该化合物改进胰岛素敏感度(图11)。此外，MOD-6031剂量依赖性地降低终末胆固醇；在6000nmol/kg剂量的MOD-6031的情况下观察到的降低显著地大于配对喂养的对应体的降低(图12)。体重、食物摄取、血糖和脂质概况的所有这些药理学改进不仅大于使用OXM或利拉鲁肽每天处理两次的动物，而且它们还显著地大于在配对喂养的对应体中观察到的效果。
使用LC-MS/MS定性方法(qualified method)测量MOD-6031(PEG--S-MAL-FMS-OXM)和其水解化合物(PEG--S-MAL-FMS和OXM)的终末血液水平。结果显示了MOD-6031处理组的剂量依赖性浓度(表6)。此数据与第2天(单次施用之后)的化合物水平比较显示了当每周施用两次时OXM肽在研究期期间不积聚。在研究中，PEG--S-MAL-FMS和PEG-S-MAL-FMS-OXM显示了中等积聚(表6)。在最后一次注射之后24h(第33天)处，最高剂量的MOD-6031的MOD-6031和OXM肽的实际浓度分别是490μg/ml和0.37μg/ml。来自对照动物的所有样品均低于试验的下限。
表6：单次剂量之后24小时(第2天)与重复MOD-6031给药方案的最后一次注射之后24小时(第33天)的血浆浓度的比较。
*包括杂质的剂量是1515、4545、和9090nmol/kg
实施例6
ob/ob小鼠模型中药物动力学参数通过MOD-6031变体的改进
结果
给三组(n＝12)ob/ob小鼠单次施用1000、3000和6000nmol/kg的MOD-6031，并且在施用之后4、8、24、36、48、72、96和120h(每个时间点，n＝3)抽血用于PK分析，并且通过LC-MS/MS方法测定MOD-6031的数量和其化合物浓度。计算MOD-6031(PEG-S-MAL-FMS-OXM)和其水解产物PEG-S-MAL-FMS-NHS与OXM的药物动力学参数，比如Cmax、Tmax、AUC、T1/2Cl和Vz，这些参数在表7a、7b和7c中被分别呈现。对于所有剂量下的所有组分，AUC 0-∞均在AUC 0-t的15％内，其指示取样方案足以表征每种组分的药物动力学概况。对于所有三种组分，暴露似乎均是与剂量成比例的。一般而言，Cmax和AUC 0-t随着剂量增加并且与剂量增加大致成相同比例。
在表8中每种组分的参数均以摩尔浓度表示。Cmax值对于PEG-S-MAL-FMS-OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS大致相等并且对于OXM较低。PEG-S-MAL-FMS-OXM和OXM的观察的T1/2分别是大约9和12小时。PEG-S-MAL-FMS-NHS的终末T1/2长得多，是大约30小时。来自对照动物的所有样品和在给药之前收集的所有样品均低于试验的下限。
药物动力学和药理学数据证实了MOD-6031的长效性质。每周两次给药3000nmol/kg的MOD-6031显著地降低体重和食物消耗，这比得上每天两次以6000nmol/kg剂量施用的OXM肽处理组群，还导致载药量显著减小。
表7a：SC注射1000、3000、或6000nmol/kg之后的PEG-S-MAL-FMS-OXM药物动力学参数
表7b：SC注射1000、3000、或6000nmol/kg的MOD-6031之后的PEG-S-MAL-FMS-NHS药物动力学参数
注意：由于给药溶液中的PEG-S-MAL-FMS-NHS杂质，施用的PEG-S-MAL-FMS-NHS(MOD-6031加PEG-S-MAL-FMS-NHS杂质)的剂量分别是1515、4545、和9090nmol/kg而非1000、3000和6000nmol/kg。
表7c：SC注射1000、3000、或6000nmol/kg的MOD-6031之后的OXM药物动力学参数
NC＝由于浓度对时间概况的形状，可以不计算参数
表8：在摩尔基础上比较三种组分的药物动力学参数
PEG-S-MAL-FMS-NHS的a剂量考虑杂质(MOD-6031加PEG-S-MAL-FMS-NHS杂质)。
MOD-6031剂量依赖性地降低终末葡萄糖并且显著地降低动物中的胰岛素(p<0.01，图27)，这指示MOD-6031处理改进胰岛素敏感度。对于两种变量，在6000nmol/kg剂量的MOD-6031的情况下观察到的降低显著地大于配对喂养的对应体的降低(p<0.001)。利拉鲁肽对研究终末处的血浆胰岛素或葡萄糖没有统计学上显著的作用。相比之下，胃泌酸调节素显著地降低两种参数(对于葡萄糖p<0.05，对于胰岛素p<0.001)。
实施例7
与PEG30-Fmoc-OXM和PEG30-EMCS-OXM比较，ob/ob小鼠模型中体重、血糖和脂质概况通过PEG30-FMS-OXM的改进
ob/ob小鼠模型在此研究中被用作糖尿病的遗传模型，以便评价MOD-6031(PEG30-S-MAL-FMS-OXM)对其慢速水解变体(PEG30-S-MAL-Fmoc-OXM)和其不可逆形式——其中N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS)替换Fmoc作为连接体(PEG30-EMCS-OXM)——的药理学功效。在所有那些三种聚乙二醇化的缀合物中，连接体被定向至OXM肽的N氨基端。
当以6000nmol/kg每四天施用同时PEG-SH被用作研究对照时，此研究比较了MOD-6031、PEG30-Fmoc-OXM和PEG30-EMCS-OXM的药理学功效。测量的药理学参数是体重、食物和水摄取、葡萄糖和胰岛素控制以及脂质概况。在研究的前两或三周期间，施用所有三种缀合物与媒介(PEG-SH)组比较显著地降低体重和食物摄取(图13；图14)，而仅MOD-6031直到研究终末和以较大程度展现出此趋势。体重与对照(PEG-SH)比较的最终降低改变(在第33天)对于MOD-6031、PEG30-Fmoc-OXM和PEG30-EMCS-OXM分别是25.4％、5.1％、2.4％。仅MOD-6031展现出与对照比较显著更低的体重值。PEG30-Fmoc-OXM的体重与其配对喂养组比较的降低改变是显著的(2.6％)。在MOD-6031和PEG30-Fmoc-OXM的每次药物注射之后观察到体重降低，而对于PEG30-EMCS-OXM，仅在过夜禁食之后给药的天数发生重量降低。对于食物摄取减少观察到相同的概况。血糖参数在研究期间的测量已经显示了MOD-6031组的非禁食葡萄糖的显著改进(图15A)，以及MOD-6031和PEG30-Fmoc-OXM组的禁食葡萄糖的显著改进(图15B)。在第2和30天进行OGTT程序(分别地，图16和图17)。在第2天的OGTT，MOD-6031和PEG30-Fmoc-OXM显著地改进葡萄糖耐量，其中血浆葡萄糖被显著地降低并且胰岛素分泌并行地显著增加(图16)。配对喂养组动物在葡萄糖给药之后展现出葡萄糖漂移，这在测试的任何时间点处均未与对照显著不同。在第30天的OGTT，对于MOD-6031和PEG30-Fmoc-OXM二者观察到显著改进的葡萄糖概况，然而后者的程度较小。此外，在两组中观察到与对照比较减少的胰岛素应答，这表明化合物改进胰岛素敏感度(图17)。用于分析脂质概况和果糖胺的终末血浆样品显示了通过MOD-6031和PEG30-Fmoc-OXM二者检查的显著降低(图18；图19)。在两种情况下，如在所有其它研究结果中，MOD-6031相对于PEG30-Fmoc-OXM展现出最高地位(supremacy)。
实施例8
MOD-6031的离体水解速率的体外表征
实施此研究以便表征和比较MOD-6031在不同条件——不同的pH、温度、和不同物种的血浆——下的离体水解速率。
材料和方法
通过液相色谱法大气压离子化串联质谱法(LC-MS/MS)，生物分析学方法被验证测定K2EDTA大鼠和猴血浆中的PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS、和OXM。稳定标记的PEG-S-MAL-FMS-OXM、稳定标记的PEG-S-MAL-FMS-NHS、13C24、15N4-OXM分别被用作PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS和OXM的内标。在低pH下使用乙腈通过蛋白质沉淀提取从测试的血浆样品提取PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS、和OXM以及它们的内标。在蒸发至干燥和重构后，通过LC-MS/MS分析提取物。PEG-S-MAL-FMS-OXM、PEG-S-MAL-FMS-NHS和OXM的校正曲线被新近制备用于所有数据集和被用于定量分析的组分。
通过使用pH 6.8、7.4和7.8下的磷酸盐缓冲剂实现不同的pH值。在大鼠血浆中检查35℃、37℃和41℃的温度下的培育。在大鼠、食蟹猕猴(cynomolgus monkey)或人血浆中培育的MOD-6031的水解速率的比较在37℃下进行评价。对于人血浆，使用源自雄性和雌性对象的血浆测量合并的和单个的样品二者。MOD-6031(400μg/ml的总体材料)被添加至包含相关的血浆或缓冲剂(N＝3)的管，并且样品在上面不同的条件下被培育0(在添加材料后立刻)、4、8、24、48和72h。通过使样品在-70℃下冷冻来在指定的时间点处停止水解。DPPIV抑制剂(1％)和抑酞酶(500KIU/ml)在添加MOD-6031之前被添加至血浆样品，以便避免通过蛋白水解酶的不相关的和非特异性的裂解。对于每种条件，制备三个独立的样品。在35℃、37℃或41℃的给定温度下培育样品。所有样品在分析之前被储存在-70℃下。利用LC-MS/MS方法定量MOD-6031(PEG-S-MAL-FMS-OXM)、OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS浓度。建立MOD-6031水解概况并且计算不同血浆矩阵中的水解速率。
探究的条件是：
a. pH，其中水解在pH 6.8、7.4和7.8下进行测试；
b.温度，其中其中水解在35℃、37℃、和41℃下进行测试；和
c.血浆来源，其中在从大鼠、食蟹猕猴和人获得的血浆样品中测试水解。对于人血浆，使用合并的和单个的样品二者，并且对于来自雄性和雌性的血浆单独地测量水解速率。
在不同的条件下培育MOD-6031(400μg/ml的总体材料)多至72h。在指定的时间点，获取样品用于LC-MS/MS分析。MOD-6031以及其降解产物OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS被定量，并且相应地进行药物动力学分析。
结果指示pH水平对MOD-6031水解速率具有作用；在较高的pH(pH 7.8)下，水解速率与较低的pH(pH 6.8)下的水解速率比较是更高的(表9，图20A-图20C)。关于温度，41℃下的培育导致与35℃或37℃下的培育的水解速率比较更高的水解速率(表10，图21A-图21C)。MOD-6031在大多数血浆样品中具有比得上的水解速率，如由类似的清除速率和测量的矩阵中OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS浓度的类似增加反映的(表11，图22A-图22C)。在不同批次的相同物种和物种之间存在OXM的清除速率的变化性。PEG-S-MAL-FMS-NHS清除速率在不同的血浆物种中是非常类似的。
浓度：在来自大鼠、猴和人矩阵的血浆中培育的MOD-6031的水解的水解速率和模式是非常类似的，并且不展现比由每种物质的不同个体观察到的差异更大的显著差异。
表9：PEG-S-MAL-FMS-OXM、OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS在不同的pH中的PK分析
表10：PEG-S-MAL-FMS-OXM、OXM和PEG-S-MAL-FMS-NHS在不同的温度中的PK分析
表11：OXM、PEG-S-MAL-FMS和PEG-S-MAL-FMS-OXM的PK值
实施例9
体外评价由二肽基肽酶IV(DPPIV)消化的MOD-6031的PEG部分提供的保护
使用DPPIV培育MOD-6031、OXM肽和PEG-EMCS-OXM并且通过RP-HPLC测试每个的消化。鉴定和测量消化的和未消化的形式。
首先，评价OXM肽降解在10mM Tris缓冲剂中在两种不同的pH水平(pH＝6和pH＝7)下的初步检查。每个反应在37℃下培育1小时。在培育后，使用100μl的DDW中0.1％TFA稀释50μl的反应。10μl的溶液然后被装载在RP-HPLC Intrada WP-RP 2×50mm，3μm，柱(总计3.3μg)上。
使用RP-HPLC柱鉴定OXM和MOD-6031的未消化的和消化的形式。裂解的活性形式的OXM——OXM 3-37——的洗脱时间与OXM肽相差0.2min。通过测量百分数相对面积评价百分数消化。对于每个反应，制备和测量不具有DPPIV的对照样品。
MOD-6031和PEG-EMCS-OXM与DPPIV一起培育并且测量百分数消化。反应条件与上面关于OXM肽描述的相同。
酶二肽基肽酶IV(DPPIV)是在大多数细胞类型中表达并且裂解来自多肽的N端的二肽的内在膜糖蛋白。通过DPPIV的OXM消化已经在体外和体内被证明，并且被认为是肽在血流中的短半衰期的主要原因。OXM在第2和3位处的氨基酸之间被裂解，其产生非活性形式OXM 3-37。在此研究中，检查通过DPPIV消化以可逆的和不可逆的缀合物——分别是MOD-6031和PEG-EMCS-OXM——连接至PEG的OXM肽。
通过DPPIV酶的OXM肽降解速率在pH＝6对pH＝7下的初步评价指示DPPIV酶在pH＝6下更有效，其中在37℃下培育1小时后，OXM 3-37在pH＝6下％相对面积为46.12，在pH＝7下为26.52(图23-图24，表12-15)。因此，在pH＝6下进行MOD-6031的消化研究，这对于MOD-6031水解预防同样是优选的条件。
测量MOD-6031和PEG-EMCS-OXM通过DPPIV的百分比消化。在使用DPPIV培育之后评价MOD-6031缀合物的降解(图25，表17)并且使用用于OXM肽的相同条件通过RP-HPLC柱进行分析。作为阴性对照，运行具有变化的pH和/或温度但是不添加DPPIV的反应，以便确认OXM不被水解。作为阳性对照，测量评价如下的反应：不是缀合物的一部分的OXM的水解。(图25，表16)。
在不存在DPPIV酶的情况下，在培育MOD-6031之后没有观察到MOD-6031的降解，并且因此，不存在OXM的水解。相对面积的百分数是98.28。进行具有DPPIV1×[DPPIV浓度](表17)和10×[DPPIV浓度](表18)的两个反义。在两个反应中，没有观察到OXM的降解并且MOD-6031的百分数相对面积分别是98.49和98.24。
还以相同的方式通过DPPIV测试了不可逆聚乙二醇化的PEG-EMCS-OXM的OXM降解(图26，表20)。作为对照，制备不具有DPPIV的反应(图26，表19)。在两个反应中，没有观察到缀合物的降解。PEG-EMCS-OXM的百分数相对面积分别是98.48和99.09。
基于本文呈现的结果，可以推断出OXM经由可水解的或不可水解的连接体缀合至PEG部分被保护免于通过DPPIV的降解。
表12：OXM在pH＝6下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min 相对面积％
1 6.823 0.177 0.44
2 OXM 7.227 38.996 96.62
3 7.417 0.924 2.29
4 8.340 0.265 0.66
总计： 40.362 100.00
表13：OXM+DPPIV在pH＝6下的降解试验
表14：OXM在pH＝7下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min ％相对面积
1 6.820 0.201 0.39
2 OXM 7.223 49.397 96.65
3 7.417 1.266 2.48
4 8.340 0.245 0.48
总计： 51.109 100.00
表15：OXM+DPPIV在pH＝7下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min ％相对面积
1 6.823 0.166 0.30
2 OXM 7.223 39.441 72.28
3 OXM 3-37 7.417 14.469 26.52
4 7.610 0.318 0.58
5 7.770 0.174 0.32
总计： 54.568 100.00
表16：MOD-6031在pH＝6下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min 相对面积％
1 7.240 0.284 0.56
2 8.280 0.234 0.46
3 9.830 0.045 0.09
4 MOD-6031 17.930 49.565 98.28
5 18.917 0.029 0.06
6 19.203 0.036 0.07
7 19.403 0.240 0.48
50.433 100.00
表17：MOD-6031+DPPIV(1×DPPIV浓度)在pH＝6下的降解试验
表18：MOD-6031+DPPIV(10×DPPIV浓度)在pH＝6下的降解试验
表19：PEG-EMCS-OXM在pH＝6下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min 相对面积％
1 8.317 0.238 0.56
2 9.860 0.031 0.07
3 17.547 0.306 0.72
4 PEG-EMCS-OXM 17.847 41.557 98.48
5 18.857 0.046 0.11
6 19.100 0.022 0.05
总计： 42.200 100.00
表20：PEG-EMCS-OXM+DPPIV在pH＝6下的降解试验
编号 峰名称 保留时间min 面积mAU*min 相对面积％
1 8.317 0.280 0.69
2 10.020 0.024 0.06
3 PEG-EMCS-OXM 17.850 39.952 99.09
4 18.827 0.041 0.10
5 19.140 0.022 0.06
总计： 40.318 100.00
虽然已经在本文说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、置换、改变和等效物。因此，应理解所附权利要求书意欲覆盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和改变。

Claims (25)

1.用于制备由式II的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-Lys30-Arg31-Asn32-Arg33-Asn34-Asn35-Ile36-Ala37
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除保护基和树脂；
以产生式II的结构，其中所述OXM的His1的氨基残基被连接至FMS。
2.权利要求1所述的方法，其中所述过量包括6当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。
3.权利要求1所述的方法，其中Lys12和Lys30的氨基残基的保护基是1-[(4，4-二甲基-2，6-二氧环己-1-次基)乙基])，(ivDde)。
4.权利要求1所述的方法，其中与所述巯基PEG聚合物(PEG-SH)的所述反应在6至6.5之间的pH的缓冲剂条件下实施。
5.权利要求1所述的方法，其中PEG具有20,000Da至40,000Da的范围中的分子量。
6.权利要求5所述的方法，其中PEG具有平均分子量为30,000Da的分子量。
7.用于制备由式III的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-Lys30-Arg31-Asn32-Arg33-Asn34-Asn35-Ile36-Ala37
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护并且His1的α-氨基被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除保护基和树脂；
以产生式III的结构，其中OXM的Lys30的氨基残基被连接至FMS。
8.权利要求7所述的方法，其中所述过量包括6当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。
9.权利要求7所述的方法，其中Lys12的氨基残基的保护基是1-[(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-次基)乙基])，(ivDde)。
10.权利要求7所述的方法，其中His1的氨基残基的保护基是Boc基团。
11.权利要求7所述的方法，其中与所述巯基PEG聚合物(PEG-SH)的所述反应在6至6.5之间的pH的缓冲剂条件下实施。
12.权利要求7所述的方法，其中PEG具有20,000Da至40,000Da的范围中的分子量。
13.权利要求12所述的方法，其中PEG具有平均分子量为30,000Da的分子量。
14.用于制备由式IV的结构表示的胃泌酸调节素缀合物的方法：
His1-Ser2-Gln3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Lys12-Tyr13-Leu14-Asp15-Ser16-Arg17-Arg18-Ala19-Gln20-Asp21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Met27-Asn28-Thr29-Lys30-Arg31-Asn32-Arg33-Asn34-Asn35-Ile36-Ala37
其中R2是SO3H；
所述方法包括：
使由下列结构表示的MAL-FMS-NHS(R2＝SO3H)与胃泌酸调节素树脂反应：
其中所述MAL-FMS-NHS通过混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸被制备，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物；
其中所述胃泌酸调节素的氨基酸的侧链被保护并且His1的α-氨基被保护，获得相应的MAL-FMS-保护的OXM；
接着与巯基PEG聚合物(PEG-SH)反应，其中在与所述PEG-SH反应之后或之前实施去除保护基和树脂；
以产生式III的结构，其中OXM的Lys12的氨基残基被连接至FMS。
15.权利要求14所述的方法，其中所述过量包括6当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。
16.权利要求14所述的方法，其中Lys30的氨基残基的保护基是1-[(4,4-二甲基-2,6-二氧环己-1-次基)乙基])，(ivDde)。
17.权利要求14所述的方法，其中His1的氨基残基的保护基是Boc基团。
18.权利要求14所述的方法，其中与所述巯基PEG聚合物(PEG-SH)的所述反应在6至6.5之间的pH的缓冲剂条件下实施。
19.权利要求14所述的方法，其中PEG具有20,000Da至40,000Da的范围中的分子量。
20.权利要求19所述的方法，其中PEG具有平均分子量为30,000Da的分子量。
21.用于制备由下列结构表示的MAL-FMS-NHS的方法：
所述方法包括混合MAL-Fmoc-NHS与三氟乙酸和氯磺酸，其中所述MAL-Fmoc-NHS被溶解于纯的三氟乙酸，并且溶解于纯的三氟乙酸的过量的所述氯磺酸被添加至反应混合物。
22.权利要求21所述的方法，其中所述过量包括6当量的溶解于纯的三氟乙酸的氯磺酸。
23.权利要求21所述的方法，其中所述制备进一步包括纯化所述MAL-FMS-NHS。
24.权利要求23所述的方法，其中所述纯化包括沉淀和过滤，并且所述MAL-FMS-NHS具有至少大约50％纯度。
25.权利要求24所述的方法，其中所述纯度是至少90％。
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