BR112013024706B1 - Método para preparar análogos de exendina peguilada e análogo de exendina peguilada - Google Patents

Método para preparar análogos de exendina peguilada e análogo de exendina peguilada Download PDF

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Abstract

ANÁLOGOS DE EXENDINA MONO-PEGUILADA EM SÍTIO ESPECÍFICO E RESPECTIVO MÉTODO DE PREPARO. A invenção revela análogos de exendina mono-peguilada em sítio específico em que quaisquer grupo amina podem ser mono-PEGuilados, bem como seu método de preparo e uso. O método da presente invenção adota um grupo de proteção mais estável Dde (N-(Alfa)-1(4,4-dimetil-2, 6-dioxo-ciclohexileno)) para evitar reações colaterais de multi-PEGuilação causada por grupos de proteção instáveis, obtendo assim análogos de Exendina mono-PEGuilada de alta recuperação com uma proporção molar de reação baixa.

Description

Sumário
[001] A presente invenção refere-se aos análogos de exendina mono-peguilada em sítio específico, respectivo método de preparo e seu uso farmacêutico.
Estado da técnica
[002] Nos anos 1960, McIntyre and Elrick et al. Descobriram o “efeito incretina” em que a administração oral de glicose induzia uma resposta de insulina muito mais alta do que a administração intravenosa. Adicionalmente, estudos conduzidos por Perley et al. demonstraram que o “efeito incretina” compreendia mais de 50% da liberação de insulina pós-prandial. Em 1986, Nauk et al. descobriu a redução do “efeito incretina” em pacientes com diabetes mellitus do tipo 2 (T2DM), o que indicou que a anormalidade do sistema de incretina poderia ser uma das patogenias da T2DM.
[003] As incretinas são hormônios que se originam no intestino e são dependentes do nível de glicose, incluindo o GLP-1 e o peptídio insulinotrópico glicose- dependente (GIP), elas podem estimular a secreção de insulina após as refeições. O GLP-1 parece executar um papel mais importante no desenvolvimento de estratégias terapêuticas contra a T2DM. O GLP-1 promove a secreção de insulina para controlar o açúcar no sangue e, simultaneamente, estimula a proliferação de células β dos ilhéus, previne a apoptose das células β, inibe a liberação de glucagon, a motilidade gastrointestinal e secreção gástrica, atrasa o esvaziamento gástrico, produz saciedade e suprime o apetite. Entretanto, o GLP-1 é rapidamente degradado por DPP-IV in vivo, tendo uma meia-vida curta de 1 a 2 minutos. Consequentemente, sua aplicação e desenvolvimento são limitados.
[004] A exendina-4, isolada da saliva do lagarto Heloderma suspectum, é um análogo do GLP-1 com 39 aminoácidos, que compartilha 53% de homologia com o GLP-1. Similar ao GLP-1, a exendina-4 pode se ligar ao receptor de GLP-1, estimulando a secreção de insulina, reduzindo a glicose no sangue durante o jejum e pós-prandial com o objetivo de tratar a T2DM. O resíduo do segundo aminoácido N-terminal do GLP-1 é a alanina, que é substituída pela glicina na Exendina-4. Isso resulta na resistência à degradação pela dipeptidase (DPP-IV) in vivo, prolongando a meia- vida de 1 a 2 minutos para 2 a 4 minutos. Assim, a exendina-4 foi desenvolvida em produtos comercializados, administrados duas vezes ao dia (Byetta, da Amylin Corporation).
[005] Contudo, as frequentes injeções resultam na baixa aderência por parte dos pacientes, o que estimula os contínuos estudos sobre a dosagem de liberação permanente. Por exemplo, o liraglutideo (NN-2211) é desenvolvido pela Novo Nordisk e é administrado uma vez ao dia; a Exenatida LAR (microesferas PLGA) é desenvolvida pela empresa Amylin e é administrada uma vez por semana. Desse modo, fórmulas de longa-ação e não injetáveis têm se tornado a última palavra em pesquisa e desenvolvimento.
[006] A técnica de formulação farmacêutica mais largamente pesquisada e usada para proteína/peptídeo terapêutico de longa-ação é a PEGuilação. Derivados do polietilenoglicol (PEG) ativados reagem com resíduos específicos de aminoácidos acessíveis em proteínas terapêuticas para formar novas moléculas. A tecnologia médica de proteína de peptídeo de longa-ação mais profundamente estudada e utilizada á a tecnologia de peguilação, por meio da qual novas moléculas podem ser formadas pela reação entre o reagente de polietilenoglicol ativado e resíduos de aminoácidos específicos no peptídeo ou na proteína, o polietilenoglicol, sendo um tipo de macromolécula solúvel em água, pode ter conferido as seguintes características à proteína/peptídeo: (1) uma melhora na solubilidade do medicamento; (2) uma diminuição na imunogenicidade; (3) uma extensão da meia- vida no sangue devido à reduzida depuração plasmática renal. Tais características contribuem para o prolongamento da ação do medicamento e para a aderência do paciente.
[007] A tecnologia de PEGuilação geralmente permite que derivados de PEG ativados reajam com resíduos ativos (na ordem de atividade, mercapto, amina, carboxi, etc.) em peptídeo ou proteína, formando um produto PEGuilado com uma ligação química estável. Contudo, a existência de múltiplos resíduos reativos resulta em uma mistura de vários produtos mono-PEGuilados com diferentes resíduos PEGuilados. Adicionalmente, em condições de alta proporção molar de PEG e reação contínua, compostos multi-PEGuilados podem ser formados e que podem afetar significativamente a atividade e eficácia do medicamento in vivo. Ademais, é difícil fazer o controle de qualidade dos produtos multi-PEGuilados. Portanto, os medicamentos PEGuilados comercializados são basicamente mono-PEGuilados.
[008] Uma vez que o local da mono-PEGuilação afeta a atividade do medicamento de peptídeo ou proteína de modo significativo, preparar um produto mono- PEGuilado com o local de atividade mais ideal possível faz-se necessário.
[009] A tecnologia atual de PEGuilação em sítio específico compreende dois tipos: - A primeira é a de controlar o número de resíduos reativos na estrutura. A abordagem mais amplamente empregada é a de fazer a mutação no local mais ideal ou adicionar uma cisteína num processo sintético, seguido pelo derivado de PEG marcapto-reativo (tal como a amina de maleimido PEGuilada) ligando com a cisteína. Contudo, i) esse método altera a estrutura do medicamento, causando incerteza na eficácia e toxidade do medicamento; ii) a introdução de cisteína pode afetar a estabilidade da proteína uma vez que a cisteína pode oxidar facilmente. Outras abordagens consideram o grupo amina de lisina com um local de PEGuilação, substituindo a lisina com arginina alcalina com exceção daquela específica que dever reagir. Essa abordagem também afeta de modo significativo a eficácia e a toxidade do medicamento por contas das alterações estruturais. O inventor da presente invenção demonstrou com os experimentos que tal alteração estrutural alterou consideravelmente o efeito terapêutico do peptídeo. - A segunda é a de modificar o grupo amina N-terminal usando um derivado de propionaldeído de polietilenoglicol em ambiente ácido. Alguns pesquisadores descobriram que o pKa do grupo amina N-terminal é menor do que no grupo amina de resíduos de lisina, i.e., tem uma natureza alcalina mais forte. Assim, a PEGuilação com o grupo amina de resíduos de lisina precisa ser conduzida em ambiente alcalino (pH de 7 a 8) enquanto que o grupo amina N-terminal deve ser conduzida em ambiente ácido (pH de 5 a 6) sem grupos amina de lisinas reagidas. Correspondentemente, alguns pesquisadores propuseram PEGuilação em sítio específico nos grupos amina N-terminal em ambiente ácido. Entretanto, essa abordagem apresenta duas desvantagens, em primeiro lugar, não pode ser aplicada se o local ativo estiver no N-terminal; em segundo lugar, considerando uma proporção molar do derivado de PEG entre 5 e 10, a recuperação é de apenas 50% a 60%, resultando em altos custos e impossibilidade de produção.
[0010] Por não possuir cisteína, o maleimido de PEG não pode ser usado para modificar o análogo de Exendina-4 usando PEGilação em sítio específico; e o local ativo do N-terminal (vide British Journal of Pharmacology, 2003, 140, 339-346) não consegue dar suporte a uma PEGuilação de N-terminal em sítio específico usando um propionaldeído de polietilenoglicol.
[0011] Os análogos da Exendina-4 contêm no máximo quatro lisinas, no total, cinco locais de reação em potencial se incluirmos o grupo amina N-terminal. Por conseguinte, quando o derivado de succinimidil de polietilenoglicol é usado para modificar os grupos amina dos análogos da Exendina-4 na cadeia lateral, o processo irá, inevitavelmente, produzir uma mistura de produtos multi-PEGuilados e mono- PEGuilados. Em tal mistura, apenas um composto é o melhor produto-alvo ativo.
[0012] Youn et al. propôs um método para proteger os grupos amina, que não são desejáveis na reação, usando o Fmoc (9-fluorenil-metóxicarbonil) (Biocomjugate Chem, 2007, 18, 500-506). Entretanto, essa abordagem possui uma desvantagem considerável, qual seja o grupo de proteção Fmoc pode facilmente cair num ambiente alcalino. Na verdade, muitos experimentos em sínteses de peptídeos usam uma base (piperidina 20%) para remover os grupos de proteção Fmoc. A PEGuilação do grupo amina nos análogos da Exendina-4 pode ocorrer em uma alcalina específica. Tais situações contraditórias fazem com que o Fmoc caia facilmente quando peptídeos, que são protegidos por Fmoc, são modificados por PEGuilação em condições alcalinas, e inevitavelmente uma quantidade significativa de subprodutos multi-PEGuilados são produzidos.
[0013] Assim sendo, faz-se necessário prover um processo para preparar análogos de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico.
Descrição detalhada
[0014] A presente invenção se destina a prover um método preparar análogos de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico e os análogos de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico preparados pelo método mencionado.
[0015] A fim de alcançar o referido objetivo da invenção, a presente invenção provê um processo para preparar um análogo de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico, que compreende as seguintes etapas: (1) A síntese de matérias primas de peptídeos de análogos de Exendina-4. Alguns resíduos de lisina do peptídeo são protegidos pelo grupo de proteção de Dde, em que Dde é N-a-1-(4,4-dimetil-2, 6-dioxo-ciclohexil-ilidena); (2) A reação entre o material de peptídeo e o reagente de polietilenoglicol é realizada em um solvente orgânico alcalino, fazendo resíduos de Lys sem o Dde se ligar ao grupo de polietilenoglicol; (3) Remover o grupo de proteção do produto produzido na etapa (2). Após se separado e purificado, o análogo da Exendina PEGuilada é obtido.
[0016] O método revelado na presente invenção utiliza o Dde como um grupo de proteção que tem mais resistência a um ambiente alcalino do que o Fmoc, e que evita a multi-PEGuilação e uma variedade de subprodutos devido à instabilidade (tendência a cair) do Fmoc. Consequentemente, os subprodutos ficam consideravelmente reduzidos, possibilitando o preparo em larga-escala.
[0017] Em consonância com o método revelado, a matéria prima de peptídeo dever possuir ao menos um local no resíduo de Lys sem a proteção do Dde para permitir a conexão do grupo de polietilenoglicol; preferencialmente, apenas um local no resíduo de Lys sem a proteção do Dde para facilitar o preparo do análogo de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico.
[0018] De acordo com o método revelado, o N-terminal do peptídeo pode ser protegido por um grupo de proteção Dde ou grupo de proteção Fmoc. Do ponto de vista de pureza farmacêutica, o N-terminal com proteção Dde é melhor; contudo, em termos de custo, o N-terminal com proteção Fmoc tem bem maior possibilidade de ser selecionado uma vez que a reação demonstrou que o N-terminal protegido por Fmoc não traz muitos análogo de Exendina-4 multi-PEGuilada.
[0019] Por exemplo, de acordo com o método revelado, a matéria-prima do peptídeo específico pode ter a seguinte estrutura: (X)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2- Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Y4, em que X é Fmoc ou Dde; Z é leu ou ile; Y1-Y4 is Lys ou (Dde) Lys, e ao menos um Y1-Y4 é lys; preferencialmente, entre Y1-Y4 apenas um dos Y1-Y4 é lys, os outros são (Dde) lys; mais preferencialmente, Y2 é lys, Y1, Y3 e Y4 são Lys (Dde).
[0020] Não obstante, a presente invenção não está limitada ao preparo de análogos de Exendina PEGuilada a partir da sequência acima; entre todos os análogos de Exendina incluindo as análogos de Exendina-4, contanto que haja mais de um resíduo de Lys na sequência de aminoácido (pelo menos dois resíduos de Lys), o método da presente invenção é apropriado para preparar uma análogo de Exendina mono-PEGuilada. A presente invenção utiliza um peptídeo que possui quatro resíduos de Lys para preparar análogos de Exendina mono-PEGuilada, posto que a estrutura dos análogos de Exendina com quatro resíduos Lys é relativamente complexa. O método da presente invenção é apropriado para preparar todos os análogos de Exendina mono-PEGuilada que o depositante revelou no seu pedido de patente chinês CN 10112520A. O conteúdo revelado no pedido CN 10112520A está integramente contido no presente pedido de patente.
[0021] De acordo com o método de produção da presente invenção, o peso molecular (MW) do derivado de PEG (derivado da PEGuilação) é de 20.000 a 60.000 Da. Adicionalmente, o polietilenoglicol que tem estruturas ramificadas revelado no pedido CN 10112520A pode também ser usado com o método da presente invenção.
[0022] Por exemplo, um modo de execução é como a seguir:
[0023] Preparar e purificar um análogo de Exendina-4 mono-PEGuilada em sítio específico por meio dos seguintes procedimentos:
[0024] 1. Síntese do análogo de Exendina-4 com grupos de proteção
[0025] Se a PEGuilação ocorrer no grupo amina N-terminal, o análogo de Exendina-4 contendo a seguinte estrutura com grupos de proteção é sintetizado: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val- (Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro- Pro-Pro-Ser-(Dde) Lys
[0026] Se a PEGuilação ocorrer na cadeia lateral do grupo amina de Lys12, o análogo de Exendina-4 contendo a seguinte estrutura com grupos de proteção é sintetizado: (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys ou (Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val- (Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro- Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
[0027] Se a PEGuilação ocorrer na cadeia lateral do grupo amina de Lys20, o análogo de Exendina-4 contendo a seguinte estrutura com grupos de proteção é sintetizado: (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys ou (Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
[0028] Se a PEGuilação ocorrer na cadeia lateral do grupo amina de Lys27, o análogo de Exendina-4 contendo a seguinte estrutura com grupos de proteção é sintetizado: (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys ou (Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala- Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
[0029] Se a PEGuilação ocorrer na cadeia lateral do grupo amina de Lys40, o análogo de Exendina-4 contendo a seguinte estrutura com grupos de proteção é sintetizado: (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys, ou (Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu- Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly- Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys;
[0030] 2. Os análogos de Exendina-4 contendo grupos de proteção e o derivado de PEG com um MW de 20.000 a 60.000 Da com uma dada proporção molar (preferencialmente um Ester PEG-NHS com formato em Y de 40KD) são dissolvidos em uma quantidade apropriada de solvente orgânico (preferencialmente DMSO). Após estarem totalmente dissolvidos, uma base orgânica que não é reagente com o derivado de PEG é adicionada para se obter um ambiente alcalino. Os reagentes opcionais são o trietilamina (TEA), o diiopropiletilamina (DIEA), o 4- dimetilaminopiridina (DMAP), o 2,4,6-trimetil piridina (colidina), a lutidina (lutidina), e a piridina (piridina), etc.
[0031] 3. A reação de PEGuilação é realizada ao se manter o sistema de solução a uma certa temperatura (não excedendo os 40°C) por um determinado período. Subsequentemente, quantidades suficientes de reagentes (preferencialmente hidrato de hidrazina) são adicionadas para remover os grupos de proteção Fmoc e Dde. Todos os grupos de proteção são removidos a uma dada temperatura (menos do que 40°C) por um dado período.
[0032] 4. A solução final da reação é diluída 10 vezes com água pura e o pH é imediatamente ajustado de 5,0 a 6,0 usando HCL ou ácido acético para garantir a estabilidade da amostra. Em seguida, preenchimento de SOURCE 30 RPC e água contendo 20 mM de ácido acético: acetonitrila ou água: um sistema de etanol é utilizado para obter o isolamento e a purificação do análogo de Exendina-4 PEGuilada alvo usando o método de eluição por gradiente linear.
[0033] 5. Adicionalmente, purificar os compostos-alvo (que contêm um pouco de solvente orgânico, acetonitrila ou etanol) obtidos da etapa anterior usando uma resina de troca de cátion, 10mM de citrato de sódio tamponador, 1,5M de NaCl, para remover o solvente orgânico com o método de eluição gradiente.
[0034] 6. Conduzir uma ultrafiltração do análogo de Exendina-4 PEGuilada obtido da etapa 5 usando uma membrana de ultrafiltração de 10KD. A cromatografia em peneira molecular é usada para remover o sal com água pura. Após liofilizar a solução aquosa resultante de análogos de Exendina-4 PEGuilada, as matérias primas de análogos de Exendina-4 PEGuilada são obtidas.
[0035] Para alcançar o objetivo da presente invenção, o análogo de Exendina- 4 PEGuilada preparado por meio do método acima descrito é provido.
[0036] Para alcançar o objetivo da presente invenção, a presente invenção também provê um análogo de Exendina-4 PEGuilada, em que o análogo de Exendina tem a seguinte sequência: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys- Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys, em que, Z é Leu (SEQ ID N°. 1) ou Ile (SEQ ID N°. 2 ), e um grupo amina do resíduo Lys é conectado ao polietilenoglicol.
[0037] Preferencialmente, na sequência acima descrita, o grupo amina de resíduo de Lys20 ou de resíduo de Lys27 é ligado ao polietilenoglicol.
[0038] Para alcançar o objetivo da presente invenção, a presente invenção também provê o uso dos análogos de Exendina PEGuilada no tratamento de diabetes ou obesidade.
[0039] De acordo com o método da presente invenção, o Dde como um grupo de proteção de maior estabilidade é usado para evitar a ocorrência de multi- PEGuilação por conta da instabilidade do Fmoc, alcançando assim um análogo de Exendina PEGuilada de baixo custo e alta recuperação e com uma baixa proporção molar de reagentes. Os análogos de Exendina PEGuilada da presente invenção são análogos de Exendina mono-PEGuilada em sítio específico, e possuem poucos subprodutos, o que ajuda evitar diversos efeitos colaterais causados por subprodutos.
[0040] Para uma descrição mais detalhada da invenção, os desenhos em anexo são usados para descrever o modo de execução específico por meio de métodos específicos de implementação. Descrição das figuras - A figura 1 é um espectro MALDI-TOF da massa do análogo de Exendina-4 protegida em sítio específico; - A figura 2 é um cromatograma HPLC antes e depois da PEGuilação do análogo de Exendina-4 protegido em sítio específico; - A figura 3 é um cromatograma de purificação SOURCE do análogo de Exendina PEGuilada; - A figura 4 é um cromatograma de purificação de troca de cátions SP do análogo de Exendina PEGuilada; - A figura 5 é um cromatograma da remoção de sal em peneira molecular do análogo de Exendina PEGuilada; e - A figura 6 mostra o efeito do HYBR-003-PEG mono-PEGuilado em camundongos C57 BL/6 no teste de tolerância à glicose intraperitoneal (n=8), em que, a- P <0.01 V.S em branco (blank), b- P <0.01 V.S controle.
Métodos de implementação específicos Exemplo 1
[0041] Monômeros de aminoácidos usados na síntese
[0042] Fmoc-His (Trt)-OH, Dde-His (Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Thr (tBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Lys (Dde)-OH, Fmoc-Gln ( Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-ILe-OH, Fmoc-Trp (Boc)-OH,, Fmoc-Asn (Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH
[0043] A abreviação do acima é: 9-fluorenil-metóxicarbonil (Fmoc); grupo tert-butóxicarbonil (Boc); tert-butóxido (OtBu); tert-butil (tBu); N-[1-(4,4-dimetil- 2,6- dioxo-ciclohexileno) (Dde).
[0044] (2) Reagentes: N,N-diisoprpiletilamina, diisopropilcarbodiimida (DIC), N,N- Dimetilformamida (DMF), diclorometano, hexahidropiridina, 1- hidróxibenzotriazol triazole, resina Rink Amida, ninidrina, metanol, triisopropilsilano, ácido trifluoroacético.
[0045] (3) Procedimentos A. síntese: conforme ilustrado pela escala de 0,25 mmol, a sequência foi sintetizada de C- a N-terminal em um reagente na presença de 0,5g de resina Rink Amida e 1 mmol de aminoácido que foram ativados com o método DIC/HOBt. A reação foi conduzida em uma temperatura ambiente de 25°C, e o processo foi executado como a seguir:
[0046] O grupo de proteção Fmoc foi removido usando uma solução DMF de 20% de piperidina, por 10 minutos cada processo;
[0047] Lavar três vezes usando 10mL de DMF, escorrer;
[0048] Aminoácido protegido (1 mmol) e HOBt (1 mmol) foram dissolvidos em 10 Ml de DMF, DIC (1 mmol) foi adicionado para ativação por 10 minutos;
[0049] A solução de aminoácido ativada foi adicionada ao reagente, e agitada por uma hora;
[0050] Lavar três vezes com DMF, e escorrer;
[0051] Se a reação de ninidrina for negativa, proceder à repetição das etapas 1 a 5.
[0052] Se for positiva, repetir as etapas 3 a 5.
[0053] Após completar a síntese da cadeia peptídica, lavar a resina com metanol e secá-la.
[0054] B. Remover o grupo de proteção e cortar o peptídeo em excesso.
[0055] 1g de resina associada com peptídeo foi adicionado em um reagente, e em seguida uma solução de lise (proporção: 2ml de anisol, 2ml de metanol, 2ml de triisopropilsilano e 6ml de ácido trifluoroacético) foi adicionada.
[0056] A amostra foi agitada por 2 horas em temperatura ambiente. Após a filtragem, o filtrado foi coletado. A resina foi lavada com uma pequena quantidade de ácido acético. As amostras coletadas foram combinadas e concentradas. Éter dietílico foi adicionado para a precipitação, após filtrar o precipitado, a amostra foi lavada com uma pequena quantidade de éter dietílico, e então o produto bruto foi obtido.
[0057] C. As amostras foram separadas e purificadas por um HPLC preparativo, e liofilizadas.
[0058] O produto bruto resultante foi dissolvido em uma pequena quantidade de solução de 10% de ácido acético, inserido na coluna, purificado pelo HPLC preparativo, e em seguida liofilizado. Os peptídeos resultantes provaram ser o composto desejado por espectrometria de massa.
[0059] Coluna de cromatograma: Boston C18, 5um, 100A, comprimento de onda de 214nm, HPLC preparativo Waters
[0060] Gradiente: 10% 0,05% TFA/CAN-45% 0,05% TFA/CAN 20min, 45% 0,05% TFA/CAN 10 min.
[0061] A figura 1 é um espectro MALDI-TOF da massa do análogo de Exendina-4 protegida em sítio específico
Exemplo 2
[0062] Método para PEGuilação de análogo de Exendina-4 protegida em sítio específico
[0063] O presente modo de execução usou derivados de PEG de amina convencionais tais como (SC-PEG, SS-PEG, NHS-PEG, etc.) para ligar e modificar o grupo amida de cadeia-lateral livre exclusivo, que pode ser PEGuilado no análogo de Exendina-4, em que, o derivado de PEG é preferencialmente selecionado de um PEG-NHS do tipo Y de 40KD e um análogo de Exendina-4 protegido em sítio específico é:
[0064] (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser- Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys ou
[0065] (Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z- Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro- Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys.
[0066] 2g de análogo de Exendina-4 protegida em sítio específico e 26g de PEG-NHS do tipo Y de 40KD (com uma proporção molar versus peptídeo de aproximadamente 1,5:1) foram dissolvidos em 400 mL de DMSO, em seguida mexidos continuamente a 40°C. Após completamente dissolvidos, 200uL (0,05%) de trietilamina (TEA) foi adicionada para ativar a reação de PEGuilação a uma temperatura de 40°C e a PEGuilação foi substancialmente completada (mais de 90%, calculada por análogo de Exendina-4 protegida) ao ser mexida por 2 horas. Em seguida, 8ml (2%) de hidrazina foi adicionada a 40°C e a solução foi mexida por 1 hora para remover os grupos de proteção até o fim da reação. A solução final da reação foi diluída 10 vezes usando água pura e o pH foi imediatamente ajustado para 0,6 usando 6M HCL, e então refrigerada a 4° C.
[0067] A figura 2 é um cromatograma HPLC antes e depois da PEGuilação do análogo de Exendina-4 protegido em sítio específico;
Exemplo 3
[0068] Método para isolar e purificar o análogo de Exendina-4 PEGuilada
[0069] Matéria prima pura de análogo de Exendina-4 PEGuilada pode ser obtida por meio de HPLC em fase inversa, troca iônica, ultrafiltração, peneira molecular e liofilização da solução final da reação dos análogos de Exendina-4 protegida em sítio específico.
[0070] Purificação via HPLC de fase inversa SOURCE Fase móvel: fase A: 20mM HAc, 5% de acetonitrila; fase B: 20mM HAc, 50% de acetonitrila Coluna: GE Fineline Pilot 35 Preenchimento: 175mL de 30RPC SOURCE Fluxo: 30mL/min Gradiente de eluição: após a entrega da amostra, equilibrar por volumes de 2 colunas, 0 a 30% por 5mins, 30% a 100% por 5 mins
[0071] A figura 3 é cromatograma de purificação SOURCE do análogo de Exendina PEGuilada;
[0072] Purificação de troca de cátions SP Fase móvel: fase A: 10mM pH3,5 CBS Fase B1: 10mM pH 3,5 CBS + 0,15 M Na CL Fase B2: 10mM pH 3,5 CBS + 1,5 M NaCL Coluna cromatográfica: GE XK 50 Preenchimento: 600mL de SP Sepharose de fluxo rápido Fluxo: 30mL/min Gradiente de eluição: 0% a 100% fase B1 20mins, 100% fase B1 à fase B2 100% 0 min
[0073] A figura 4 é um cromatograma de purificação de troca de cátions SP do análogo de Exendina PEGuilada.
[0074] Ultrafiltração Dispositivo: 10KD de ultrafiltração shear PALL
[0075] O volume de carregamento pré-filtração foi de 2400mL e 400 mL após a filtração a. A ultrafiltração (1000mL a 400mL) foi repetida 3 vezes
[0076] Remoção de sal G25 Fase móvel: água Coluna cromatográfica: GE XK 50 Preenchimento: G25; 900mL Fluxo: 30mL/min, Quantidade de carregamento de amostra: 200mL
[0077] A figura 5 é um cromatograma da remoção de sal em peneira molecular do análogo de Exendina PEGuilada.
[0078] Liofilização
[0079] O ponto de co-fusão da solução aquosa pura do análogo de Exendina- 4 PEGuilada é de aproximadamente -5°C, assim, a primeira temperatura de liofilização é configurada em -10°C. Outros parâmetros (tempo de congelamento e temperatura do forno, etc.) são configurados de acordo com a quantidade da amostra, o desempenho da liofilização e condições climáticas específicas.
Exemplo 4
[0080] Teste intraperitoneal de tolerância à glicose em camundongos C57 normais (IPTT)
[0081] Materiais Animais: camundongos C57 foram adquiridos do Shanghai SLACCAS Laboratory Animal Co., nível SPF. Os animais foram criados no criadouro temporário de animais da empresa, classe CL. Quantidade: 60; Gênero: machos Reagentes: análogo de Exendina-4 (0,125 ug/ml); análogo de Exendina-4 PEGuilado (3,125 ug/ml, calculado por peptídeo nu (bare peptide)); kit de glicose; injeção de glicose de 20%; e injeção de soro fisiológico.
[0082] Métodos experimentais
[0083] Equipe de Administração de Medicamento: cada camundongo recebeu um análogo de Exendina-4 PEGuilada (3,125 ug/ml, calculado por peptídeo nu); grupo eiankma uma dosagem de 0,2mL/20g; cada camundongo foi injetado com soro fisiológico normal com uma dosagem de 0,2mL/20g; grupo CD/7ÍTÜ/ cada camundongo recebeu um análogo de Exendina-4 PEGuilada (0,125 ug/ml) com uma dosagem de 0,2mL/20g. O carregamento de glicose no sangue foi alcançado por meio de injeção intraperitoneal de uma solução 20% glicose 0,2mL/20g b.w. meia hora antes de testar o nível de glicose no sangue. 24 horas e 72 horas após a administração, a duração do efeito hipoglicêmico nos animais testados foi observada.
Resultados dos experimentos
[0084] A figura 6 mostra as durações do efeito hipoglicêmico dos análogos individuais de Exendina-4 PEGuilada.

Claims (6)

1. Método para preparar análogos de Exendina PEGuilada, caracterizado por incluir as etapas que seguem: (1) sintetizar matérias primas de peptídeo de análogos da Exendina em que um, dois, três ou quatro dos resíduos de Lisina do peptídeo foram protegidos por Dde, em que Dde é N-a-1-(4,4-dimetil-6-dioxo-ddohexileno), em que o material de peptídeo tem a seguinte estrutura: (X)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser-Y4, em que X é Fmoc ou Dde; Z é Leu ou Ile; Y1-Y4 é Lys ou (Dde)Lys, sendo que pelo menos um dentre Y1-Y4 é Lys; (2) as matérias de peptídeo mencionadas na etapa (1) reagem com os derivados de PEG em solvente orgânico alcalino, permitindo que resíduos de Lys sem o grupo de proteção Dde se liguem ao grupo polietilenoglicol; (3) remover os grupos de proteção do produto produzido na etapa (2), isolar e purificar o produto, obtendo -se os análogos de Exendina PEGuilada.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por somente um dentre Y1-Y4 ser Lys sem a proteção por Dde.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado poro N-terminal de dito material de peptídeo ser protegido por Dde ou Fmoc, em que Fmoc é 9- fluorenil-metoxicarbonil.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por em Y1-Y4 somente um dentre Y2-Y4 ser Lys, sendo o restante Lys (Dde).
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por Y2 ser Lys, e Y1, Y3 e Y4 serem Lys (Dde).
6. Análogo de Exendina PEGuilada, obtido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por apresentar a seguinte estrutura de sequência: His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala- Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser-Lys, em que Z é Leu ou lle, e em dita estrutura, o grupo amina de um dos resíduos de Lys está ligado a polietilenoglicol.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 05/03/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.