CN101559041B - 粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及其制备方法和用途。所述的微球或微囊制剂的平均粒径为50nm-100μm，粒径分布系数CV值小于20％。所述的多肽药物结构明确，对2型糖尿病具有治疗或辅助治疗作用，优选为GLP-1、Exenatide、Exendin-4及其衍生物、类似物中的一种或几种。本发明以粒径均一的微球或微囊为基质，将所述多肽药物通过包埋的方式制成缓释制剂，通过改变微球或微囊的粒径大小，缓释周期在1周到1月间可控调节，可以用于2型糖尿病的治疗或辅助治疗以及控制体重。而且本发明的制备工艺简单，制备过程温和，能保护所包埋多肽药物的生物活性。

Description

粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术的药物制剂领域，是一种粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及其制备方法和用途，更具体地说，是一种以粒径均一的聚合物微球或微囊材料，包埋胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)、Exendin-4、Exenatide及其衍生物、类似物等多肽药物的缓释微球制剂及其制备方法和所述多肽药物缓释微球或微囊制剂在治疗或辅助治疗糖尿病或控制体重方面的用途。

背景技术

2型糖尿病是一种严重威胁人类健康与生命的疾病。长期以来，人们主要是通过磺酰脲类和双胍类等药物来治疗2型糖尿病，但这些药物副作用较大，长期使用会导致胰脏β细胞衰竭。20世纪中后期，有研究者发现，人体内分泌的一种胰高血糖素样肽-1(Glucogan-likepeptide-1，GLP-1)在血糖浓度较高的情况下能促进胰岛素分泌，而在血糖正常时则无此作用。但由于GLP-1非常不稳定，在人体内会迅速降解，半衰期仅为2分钟，因而无法直接作为临床药物使用。1996年，Jean-Pierre Ranfman通过对GLP-1与其他多种多肽序列的比较，发现一种从墨西哥巨蜥蜴beaded lizard(Heloderma horridum)的毒液中分离得到的含39个氨基酸的多肽化合物——Exendin-4与GLP-1有一定的同源性。进一步的研究表明，该多肽与GLP-1有同样的促进胰岛素分泌的功能，但稳定性却明显高于GLP-1，体内半衰期达到9.57小时。

Exendin-4的分子式为C₁₈₄H₂₈₂N₅₀O₆₀S，相对分子质量为4186.57，与哺乳动物GLP-1在氨基酸序列上有53％的同源性，是胰腺GLP-1受体上的一种有效的激活剂，与GLP-1受体具有高度亲和性，并具有相似的生物学作用。天然Exendin-4在毒蜥唾液中的含量非常低，因此靠提取天然Exendin-4的方法是不可能实现其临床应用的。目前制备Exendin-4的方法主要有化学合成法和基因工程生产法。

尽管与胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)相比，Exendin-4能够抵抗DPP-IV水解而具有较长的半衰期，但对其进行修饰改造以获得更有价值模拟肽仍是治疗II型糖尿病药物领域研究的热点，并已经取得了一定的进展。很多研究表明，由β-或γ-氨基酸取代部分α-氨基酸的肽类分子能在保持生物活性基础上提高其抗酶解能力。通过对Exendin-4的活性和构效关系的了解，研究者在原肽的基础上进行了各种结构改造及对肽链的修饰，以提高产量、增加稳定性和生物活性以及便于制剂。

截短型Exendin-4：从Exendin-4的c端缩短肽链长度可使其保持降血糖活性，并易于满足化学合成和基因工程方法生产的要求，提高产量、降低成本。在德国曼海姆灵格公司申请的专利中，报道了一系列截短型的Exendin-4多肽片段，包括Exendin-4(1-30)的氨基酸序列。对这些缩短的Exendin片段还可做进一步的结构修饰，如将末端氨基酸的羧基成盐、酯化或N-烷基化等。

改变肽链中某些氨基酸的种类：通过改变肽链中某些氨基酸，可得到一系列的Exendin-4类似物，这些类似物有可能具有与Exendin-4相似的促胰岛素分泌作用，同时也易于用基因工程方法制备，从而为降低生产成本并为患者提供低价格促胰岛素分泌肽药品提供了可能。

修饰的Exendin-4类似物：美国Amylin公司将一个或多个聚乙二醇聚合物与Exendin-4赖氨酸上的ε-氨基相连，用于延长半衰期，降低免疫原性，抵抗蛋白酶水解，增加生物利用度，降低毒性并提高稳定性。

Exenatide：Exenatide(商品名为Byetta)是美国Amylin公司和Lilly公司研制的首个化学全合成的肠促胰岛素类似物，与天然Exendin-4有50％以上的结构同源性。动物实验表明，该化合物的生物利用度约为65％-75％，可降低高血糖动物的血糖水平；临床研究表明，本品可降低2型糖尿病患者的空腹和餐后血糖，可有效控制血糖水平并能降低大部分患者体重，其血药浓度达峰时间为皮下注射后2.1小时，半衰期为2-4小时。

由于GLP-1、Exendin-4、Exenatide、截短型Exendin-4、酯化Exendin-4、N-烷基化Exendin-4、PEG修饰的Exendin-4和Exendin-4的衍生物或类似物具有在高血糖时刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，故人们试图将其用作治疗糖尿病的药物。此外，由于上述多肽药物还可以抑制食欲，减缓胃排空，因此，也有将其作为控制体重的药物的相关报道。

虽然Exenatide、Exendin-4及其类似物被认为是潜在的治疗2型糖尿病的理想药物，但要真正实现其临床应用价值，尚存在不少有待解决和进一步完善的工作。如目前Exenatide的体内半衰期仍较短，临床使用的Exenatide为皮下注射制剂，需每日两次使用。为使用方便，研究者一直在努力开发长效且顺应性更好的药物剂型。

如Lilly公司所开发的Exenatide的长效缓释皮下注射剂(Exenatide LAR)，其采用了Alkermes公司所拥有的Medisorb注射缓释给药技术，即制备包埋Exenatide的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球，其目的是一方面保护Exenatide的生物活性，另一方面使Exenatide在体内被缓慢释放，从而保持更长的活性时间，给药一次后有效时间可达到28天。

Lilly公司制备包埋Exenatide的PLGA微球的方法为制备油包油包水(w/o/o)，即采用高速搅拌(21300 rpm)的方式制备初乳液，然后经w/o/o复乳-液中干燥法，加入大量硅油以萃取溶解有PLGA的油相，使PLGA液滴固化成球(中国专利申请号200580019229.9)。在该专利的优化方案中所制备微球的粒径分布在1-100μm之间，平均粒径在50-60μm之间。专利中也提到，通过控制粒径和粒径分布可以提供和有助于得到优异的期需释放曲线和批与批之间更一致的曲线。专利中是采用了过筛(150微米筛)的方法来控制粒径，但粒径分布仍不均一。并且制备中需要使用大量的有机溶剂，如硅油、庚烷等，容易使药物变性，并且提高了后处理的难度(需检测残留有机溶剂量，避免对人体造成伤害)。

国内也有机构对类似药物的缓释技术进行了研究，如第二军医大学的钟延强等采用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物制备了包埋GLP-1的缓释微球制剂，使药物的缓释效果达四周以上(中国专利ZL03151059.0)。但第二军医大学所采用的微球制备方法为复乳(w/o/w)溶剂挥发法，采用高速搅拌(800-1200r/min)来制备复乳。所采用的高速搅拌会降低被包埋药物的生物活性，且所制备微球的粒径并不均匀。

此外，在PLA或PLGA纳米球及纳米载药聚合物微球的制备方面，有文献报道采用复乳(w/o/w)溶剂挥发/萃取法制备包埋胰岛素的PLGA纳米颗粒，以均质法(均质速率分别为10000rpm和8000rpm)制备初乳和复乳。所制备的纳米颗粒的粒径非常不均一，并且团聚严重。

纳米载药聚合物微球的制备方法还包括乳液聚合法、聚合物沉聚法、乳化扩散法，例如：加拿大华裔科学家张明瑞教授申请专利US 5,670,170和CN 1564680A，分别用上述三种方法，以聚异丁基丙烯氰酯或聚乳酸或聚乳酸-聚乙二醇共聚物为膜组分包埋血红蛋白制备了粒径为0.05μm-1μm的血红蛋白纳米微球。然而，三种方法都选用大量有机溶剂，易使药物变性。

总的来说，在治疗2型糖尿病的多肽药物缓释微球制剂方面，目前国内外相关载体的制备仍采用传统方法，如采用机械搅拌、均质、超声破碎、喷雾等方法制备乳液，这些方法的工艺条件虽然简单，但是制备重复性很差，不同批次的产品在性能上存在较大差别，在放大生产时存在困难。而且制备得到的微球粒径均一性很差，药物包埋率低，粒径大小很难控制。药物载体的粒径不均一还会导致以下问题：1)由于粒径不同的药物载体在体内的吸收部位和吸收机理各不相同，如果粒径不均一，就不能对药物载体粒径和吸收部位、吸收机理之间的关系进行有效地研究；2)在进行体内外药理实验时，由于药物载体粒径大小直接影响到所包药物的释放速率，如果药物载体粒径不均一，将导致实验的重复性差，直接影响药物载体的缓控释效果；3)由于粒径不同的药物载体在体内的吸收部位不同，因此会造成药物载体被体内的多个部位所吸收，引起一定的毒副作用。

为了解决这些问题，本发明将开发微孔膜膜乳化技术取代传统的机械搅拌法、均质乳化法制备单分散的载药复乳液滴，并在此基础上固化复乳液滴制备粒径均一的聚合物微米级或纳米级的微球或微囊，所包埋的药物为治疗或辅助治疗2型糖尿病及控制体重的多肽药物，更具体地说，多肽药物选自GLP-1、Exenatide、Exendin-4及其衍生物、类似物中的一种或几种。本发明不但能制备粒径均一的载药微球或微囊，并且可以通过改变制备条件，制备平均粒径在50nm至100μm之间的载药微球或微囊，而且由于乳化条件温和，能有效保持所包埋多肽药物的活性。采用本发明所公开的技术可制备出平均粒径在50nm至100μm之间均一、可控调节的载药微球或微囊，通过采用不同平均粒径的载药微球或微囊，可以调节药物的释放速率，以适应不同患者的治疗需求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术存在的不足，提供一种粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂，该多肽药物缓释微球或微囊制剂基本上由生物相容性聚合物、生物活性多肽组成，特征在于多肽药物被包埋于粒径均一的聚合物微球或微囊中，避免或降低了外界环境对药物的损害，延长了药物在体内的释放时间，从而达到延长疗效，降低给药次数的作用。

本发明的目的还在于提供一种粒径均一的多肽药物微球或微囊缓释制剂的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种粒径均一的多肽药物微球或微囊缓释制剂在治疗或辅助治疗2型糖尿病或控制体重中的应用。

本发明提供的粒径均一的多肽药物微球或微囊缓释制剂，包括粒径分布在微米级的载药微球或微囊以及粒径分布在纳米级的载药微球或微囊。该微球或微囊的粒径均一、可控，粒径分布系数(CV值)在20％以内，更优选的在15％以内；所述载药微球或微囊的平均粒径范围为50nm-100μm，更优选的为200nm-70μm。

粒径分布系数(Coefficient of Variation，CV)通过下式得出：

$\mathrm{CV}={\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(d_i-\stackrel{\‾}{d})}^2}{N}\right)}^{\frac{1}{2}}/\stackrel{\‾}{d}\×100\%$

上式中，d_i为单个微球或微囊的粒径，d为数均粒径，N为用于计算粒径的微球或微囊的数量，N＞300个。

本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂包括平均粒径范围为50nm-100μm的包埋有多肽药物的微球或微囊，缓释制剂的剂型包括包埋多肽药物的微球或微囊的冻干粉或将上述冻干粉分散于水或生理盐水中的悬浮液。

本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂中，所包埋的多肽药物对2型糖尿病具有治疗或辅助治疗的效果，所述的多肽药物可选自于GLP-1、Exenatide、Exendin-4、截短型Exendin-4、酯化Exendin-4、N-烷基化Exendin-4、PEG修饰的Exendin-4中的一种或者几种。

本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂中，所包埋的多肽药物还具有控制体重的作用。

本发明还提供粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂的两种制备方法：直接膜乳化法和快速膜乳化法。其中直接膜乳化法的制备原理为：分散相在气体压力作用下被缓慢压入膜孔，在膜另一侧出口处，当所形成的乳液滴达到一定大小后便在各种力的作用下脱离膜孔表面进入到连续相，形成液滴。操作压力即为液滴从膜表面脱落所需的临界压力，所得到的液滴粒径往往是膜孔径的2～6倍，因此，一般用于制备微米级的微球或微囊。而快速膜乳化法的制备原理为：将分散相与连续相混合，先用搅拌法或均相乳化法制备液滴较大的预乳液，然后用较高的压力(大于液滴从膜表面脱落所需的临界压力)将其快速压过膜孔，使大液滴均匀地破损成小液滴。快速膜乳化法的制备过程较快，所得到的液滴粒径一般小于膜孔径，因此适宜于制备纳米级的微球或微囊。但在制备微米级微球或微囊时，由于快速膜乳化法中预乳液里不可避免有小粒径液滴的存在，所以所得到的微球或微囊的粒径均一性不如直接膜乳化法所得到的产品好。因此，在本发明中对于粒径在微米级(1μm-100μm)的多肽药物缓释微球或微囊制剂优选采用直接膜乳化法制备，粒径在纳米级(50nm-1000nm)的多肽药物缓释微球或微囊制剂优选采用快速膜乳化法制备。

两种制备方法的具体制备步骤如下：

1.直接膜乳化法：

(1)制备油相

将聚合物材料溶于至少一种有机溶剂中制成油相(o)。

(2)制备初乳

将含多肽药物的水或缓冲溶液(内水相，w₁)或者多肽药物冻干粉(s)加入步骤(1)中所得到的油相(o)中乳化制备w₁/o初乳或者s/o初乳。

(3)制备复乳

将一种或一种以上的水溶性悬浮稳定剂和/或乳化剂溶解于水中，作为外水相(w₂)。在压力下使步骤(2)中得到的w₁/o或s/o初乳通过微孔膜进入外水相(w₂)，得到w₁/o/w₂或s/o/w₂复乳液。

(4)固化洗涤

将步骤(3)中得到的w₁/o/w₂或s/o/w₂复乳液去除有机溶剂使液滴固化，再经离心洗涤和冷冻干燥，即得到所述的多肽药物缓释微球或微囊制剂。

2.快速膜乳化法

(1)制备油相

将聚合物材料溶于至少一种有机溶剂中制成油相(o)。

(2)制备初乳

将含多肽药物的水或缓冲溶液(内水相，w₁)或者多肽药物冻干粉(s)加入步骤(1)中所得到的油相(o)中乳化制备w₁/o或者s/o初乳。

(3)制备预复乳

将一种或一种以上的水溶性悬浮稳定剂和/或乳化剂溶解于水中，作为外水相(w₂)。将步骤(2)中所得到的w₁/o或者s/o初乳加入到外水相(w₂)中，乳化制备w₁/o/w₂或s/o/w₂预复乳。

(4)制备复乳

在压力下使步骤(3)中得到的w₁/o/w₂或s/o/w₂预复乳通过微孔膜，得到w₁/o/w₂或s/o/w₂复乳液。

(5)固化洗涤

将步骤(4)中得到的w₁/o/w₂或s/o/w₂复乳液去除有机溶剂使液滴固化，再经离心洗涤和冷冻干燥，即得到所述的多肽药物缓释微球或微囊制剂。

上述制备方法中，所述的聚合物材料的选择面很广，不仅可以选择常用的一些疏水性聚合物材料，如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚原酸酯、聚己内酯、聚酸酐、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯等中的任意一种或几种；也可选自于聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈与聚乙二醇共聚所得的两亲性聚合物材料中的一种或者几种，以提高对多肽药物的包埋效率，并且采用两亲性的聚合物材料有利于亲水性多肽药物的生物活性保持；还可选自疏水性聚合物材料与两亲性聚合物材料的任意复配。其中聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸的共聚物(PLGA)和聚乙二醇-聚乳酸的共聚物(PLEA)是比较优选的微球或微囊材料。本领域技术人员可根据需要来选择作为药物缓释微球或微囊制剂的材料的分子量。过高的分子量，作为药物载体的材料的降解周期过长，不利于机体的长期使用。对于本发明的优选实施方式中，PLA、PLGA和PLEA的分子量大小的选择范围优选在3k-100k道尔顿，更优选的是5k-20k。

上述制备方法中，所述的聚合物材料在油相(o)中的质量浓度影响所制备微球或微囊的结构，也影响微球或微囊的降解时间，也影响药物从微球或微囊中向外的释放曲线。本领域技术人员可根据需要来选择作为药物缓释微球或微囊制剂的聚合物材料在油相(o)中的质量浓度。对于本发明的优选实施方式中，PLA、PLGA和PLEA在油相(o)中的质量浓度范围优选在1mg/mL-1000mg/mL，更优选的是5mg/mL-500mg/mL。

上述制备方法中，所述的有机溶剂可选自水中的溶解度低于2％的有机溶剂，如二氯甲烷、甲苯、氯仿等有机溶剂中的任意一种或多种；也可选自在水中的溶解度高于2％的有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮等有机溶剂的任意一种或多种，以提高药物在制备过程中的生物活性保持；还可选自上述不同有机溶剂之间的任意复配，具体种类或体积需视所用膜材等制备参数而定。本发明的优选的实施方式中，优选的有机溶剂为二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或两者的混合物。

上述制备方法中，所述的油相(o)中还可加入HLB值在3-9之间的乳化剂，油相乳化剂可选自失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel 83)、PO-500、PO-310、单硬脂酸甘油酯(Atmul 67)、失水山梨醇单油酸酯(Arlacel 80)、失水山梨醇单硬脂酸酯(Arlacel 60)、失水山梨醇单棕榈酸酯(Arlacel 40)、失水山梨醇月桂酸酯(Arlacel 20)中的一种或者几种。因为本发明是采用制备水包油包水的复乳来得到最后的微囊或微球剂型，必须加入一定浓度且具有适宜HLB值的油相乳化剂，使内水相-油相以及油相-外水相界面间都可形成较为稳定的膜状结构，从而避免或降低多肽药物向外水相泄漏，以提高多肽药物的包埋率和活性。并且，油相-外水相间的界面还不能过于稳定，以免影响后面的油相扩散和液滴的固化。在本发明的优选的实施方式中，油相中乳化剂的质量百分比为0.01wt.％-10wt％，更优选的是0.05wt.％-5wt.％。

上述制备方法中，所述的多肽药物对2型糖尿病具有治疗或辅助治疗的效果，可选自于GLP-1、Exenatide、Exendin-4、截短型Exendin-4、酯化Exendin-4、N-烷基化Exendin-4、PEG修饰的Exendin-4中的一种或者几种。

上述制备方法中，所述的多肽药物Exendin-4包括从毒蜥唾液中提取的天然Exendin-4以及由化学合成法和基因工程生产法制备的合成Exendin-4。

上述制备方法中，多肽药物在内水相(w₁)中的质量浓度影响多肽药物的包埋率，也影响微球或微囊的粒径分布，也影响药物从微球或微囊中向外的释放曲线，也影响得到的药物缓释制剂的治疗效果。在本发明的一个实施例中，当多肽药物在内水相(w₁)中的浓度高于50mg/mL时，所得到的微球或微囊粒径分布很宽，粒径分布系数(CV值)大于50％，不能得到粒径均一的微球或微囊。在本发明的优选的实施方式中，多肽药物在内水相(w₁)中的质量浓度范围为0.0001mg/mL-45mg/mL，更优选的为0.001mg/mL-40mg/mL。

上述制备方法中，所述的内水相(w₁)中还可加入保护剂，有利于多肽药物活性的保持。保护剂可选自醋酸锌、碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖、甘氨酸、赖氨酸、环糊精、明胶、甘露醇和蔗糖等中的一种或者几种，在本发明的优选的实施方式中，保护剂在内水相(w₁)中的质量浓度范围为0-10mg/mL，更优选的为0.5mg/mL-8mg/mL。在本发明的一个实施例中，在内水相中加入保护剂蔗糖可以显著提高包埋后的多肽药物活性。

上述制备方法中，所述的缓冲溶液为pH缓冲溶液，可选自含有弱酸和该酸有关盐或者弱碱和该碱有关盐的溶液。在本发明的优选的实施方式中，缓冲液可选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸氢铵缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液中的一种或几种。

上述制备方法中，内水相(w₁)与油相(o)的体积比优选为1∶1-1∶10，多肽药物冻干粉(s)在油相(o)的质量浓度优选为0.0001mg/mL-30mg/mL。

上述制备方法中，初乳的制备方法，可采用普通的乳化方式如机械搅拌、磁力搅拌、均质乳化、超声破碎等方法中的一种或几种。

上述制备方法中，所述外水相(w₂)中的水溶性悬浮稳定剂可选自聚乙烯醇、聚吡咯烷酮、聚乙二醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80)、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯(Tween 20)、亲油-亲水嵌段共聚物中的一种或者几种，外水相中(w₂)稳定剂的质量百分比范围优选为0.1wt.％-20wt.％。

上述制备方法中，所述外水相(w₂)中的水溶性乳化剂可选自十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基苯磺酸钠等阴离子表面活性剂、烷基铵盐、烷基苄基铵盐等阳离子表面活性剂、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚乙二醇硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇硬脂酸酯等非离子型表面活性剂中的一种或者几种，外水相(w₂)中乳化剂的质量百分比范围优选为0.1wt.％-10wt.％。

上述制备方法中，所述外水相(w₂)中还可加入无机盐或有机盐，调节内水相(w₁)与外水相(w₂)间渗透压，有利于提高多肽药物的包埋率。在本发明的优选的实施方式中，所述盐优选为无机盐，更优选为氯化钠，外水相(w₁)中氯化钠的质量百分比范围为0-10wt.％，更优选的为0.1wt.％-5wt.％。

上述制备方法中，所述的油相(O)与外水相(w₂)的体积比优选为1∶1-1∶100，更优选的为1∶3-1∶50。

上述制备方法2中，所述的步骤(3)中的预复乳的制备方法，可采用普通的乳化方式如机械搅拌、磁力搅拌、均质乳化、超声破碎等方法中的一种或几种。对于活性的多肽药物，应该采用较为温和的制备方式，以尽量减少剪切力对药物活性的伤害。并且，所制备的预复乳液滴应尽量大于所用膜的孔径，粒径小于膜孔径的液滴会直接穿过膜孔，造成所得到的最终乳液中有很多小粒径的液滴，影响产品粒径的均一性。在本发明的实施例中，采用不同转速的磁力搅拌制备预复乳，发现在较低转速时，所得到微球的粒径均一性较好，多肽药物活性保留较高。

上述制备方法2中，所述的步骤(4)可重复多次，即将步骤(4)所得的复乳液作为预复乳在压力再次压过微孔膜，直至得到的复乳液的粒径大小与均一性满足要求。

上述制备方法中，所述的w₁/o/w₂或s/o/w₂复乳液中的有机溶剂的去除可采用减压蒸发、常温常压搅拌挥发、错流扩散透析或溶剂萃取等方法中的一种或者几种。

上述制备方法中，所述的压力可在0.001kPa-2000kPa之间调节，这主要由制备过程中使用的微孔膜的孔径大小及目标微球或微囊大小的制备要求所决定，在制备粒径均一的微米级载药微球或微囊时，所述的压力优选为0.01kPa-100kPa，更优选为0.1kPa-50kPa，在制备粒径均一的纳米级载药微球或微囊时，所述的压力优选为50kPa-1500kPa，更优选为500kPa-1500kPa。

上述制备方法中，所述的微孔膜优选亲水性的膜，如采用亲水性的SPG膜，该SPG膜为商品化产品，在制备过程中，可通过选择不同膜孔径的SPG膜来控制产品的粒径大小，常用的微孔膜的孔径为0.1-30μm。在制备微米级载药微球或微囊时，所述的微孔膜的孔径为1-30μm，优选的为1-20μm；在制备纳米级载药微球或微囊时，所述的微孔膜的孔径为0.1-20μm，优选的为1-10μm。所制得的微米级载药微球或微囊的平均粒径范围为1-100μm，优选为10-70μm，所制得的纳米级载药微球或微囊的平均粒径范围为50-1000nm，更优选的为200-1000nm。

在本发明中，聚合物颗粒的平均粒径大小影响制备聚合物颗粒的降解速度，也影响多肽药物从微球或微囊中向外的释放曲线，也影响2型糖尿病的治疗效果。本领域技术人员可根据需要来选择作为药物缓释微球或微囊制剂的粒径大小。随着微球或微囊制剂的粒径的增大，多肽药物的释放速度逐渐减慢，多肽药物的起效时间也随之延长。此外，不同粒径大小的聚合物颗粒被体内巨噬细胞吞噬的情况各不相同，聚合物颗粒的粒径越小越容易被吞噬，也越容易被从体内清除，但聚合物颗粒的粒径较大时，容易堵塞注射针，不利于临床注射。在本发明的优选的实施方式中，优选的聚合物颗粒的平均粒径大小为50nm-100μm，更优选的为200nm-70μm。

本发明提供的粒径均一的多肽药物微球或微囊缓释制剂，微球或微囊的粒径分布极为均一，粒径分布系数(CV值)在20％以内，更优选的在15％以内；且采用本发明中所述的制备方法，可以很方便地通过选用不同孔径的微孔膜，制备出平均粒径在50nm-100μm之间的微米级或纳米级微球或微囊。

在本发明中，通过选用不同平均粒径的粒径均一的多肽药物微球或微囊缓释制剂，可以调节药物的释放速率，以适应不同患者的治疗需求。在本发明的一个实施例中，所包埋多肽药物的释放速率随微囊的平均粒径增大而减慢。

本发明的多肽药物缓释微球或微囊制剂的作用机制可能为，多肽药物被包埋于粒径均一的聚合物微球或微囊中，避免或降低了外界环境对药物的损害。多肽药物伴随聚合物微球或微囊的降解，向外缓慢释放，延长了药物在体内的释放时间，从而达到延长疗效，降低给药次数的作用。

本发明的多肽药物微球缓释制剂解决了以往采用机械搅拌乳化法、均质乳化法、超声破碎法制备的多肽微球或微囊制剂载体粒径不均一、包埋率低、药物活性低的问题，解决了多肽药物单独用药时易被降解、容易失活、体内半衰期短等难题。同时载体以固体粉末状形式存在，有利于其运输和贮存，通过对载体粒径的控制，可实现药物释放速率的改变。并且本发明的多肽药物微球缓释制剂的制备工艺简单，制备过程温和，多肽药物的生物活性保持好。

本发明公开的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及其制备方法还具有以下优势：

1.本发明提供了粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂及其制备方法，并可通过控制制备过程中的微孔膜孔径大小和操作压力来控制产品的粒径大小。

2.本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂，由于粒径均一并且可控，使用本微球或微囊制剂可以开展粒径和其治疗效果的关系研究。这是因为微球或微囊制剂的粒径大小与其在体内的吸收和分布位置以及代谢时间可能有较大关系，如果微球或微囊制剂的粒径不均一，则无法开展这方面的研究。

3.本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂，由于粒径均一并且可控，使用不同平均粒径的本微球或微囊制剂可以实现药物释放速率的调节，以适应不同患者的用药需求。这是因为微球或微囊制剂的粒径大小影响微球或微囊的比表面积和降解速率，从而影响药物的释放速率。如果微球或微囊制剂的粒径不均一，则无法实现这方面的应用。

4.本发明提供的粒径均一的多肽药物缓释微球或微囊制剂的制备方法，由于所制备的复乳液滴极为均一，可以避免液滴间因大小不一所发生的合并或破裂，有利于提高多肽药物在微球或微囊中的包埋率。

5.本发明方法操作简单、条件温和并且易于工业化放大生产。

附图说明

图1包埋GLP-1的PLA微囊电镜照片

图2载GLP-1的PLGA及PLA微囊的药物体外释放曲线

图3载Exenatide的PLGA微囊的药物体外释放曲线

图4载Exendin-4及PEG修饰的Exendin-4的PLGA微囊的药物体外释放曲线

图5载Exenatide的PLGA微囊的药物体外释放曲线

图6对糖尿病模型大鼠腹腔注射载Exenatide的PLGA微囊及PLA微囊的血糖浓度曲线

图7对糖尿病模型大鼠腹腔注射载GLP-1或Exendin-4的PLGA微囊的血糖浓度曲线

图8对糖尿病模型大鼠腹腔注射载Exenadide的PLA微囊的血糖浓度曲线

图9对糖尿病模型大鼠腹腔注射载Exendin-4的PLGA微囊的血糖浓度曲线

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明并不仅仅限制于该实施例中。

GLP-1购于成都凯捷生物医药科技发展有限公司；Exendin-4、Exenatide、PEG修饰的Exendin-4、N-烷基化Exendin-4及酯化Exendin-4冻干粉，均由浙江贝达药业有限公司惠赠。

微球或微囊的粒径分布测定：

微米级微球或微囊的粒径分布采用激光粒度仪进行测定，具体测定步骤为：称量50mg微米级微球或微囊冻干粉，加入500mL去离子水中，超声5min使其均匀分散，采用激光粒度仪(Malvern Instruments，United Kingdom Coulter Co.，USA)进行测定。

纳米级微球或微囊的粒径分布采用Zeta电位仪进行测定，具体测定步骤为：称量1mg纳米级微球或微囊冻干粉，加入10mL去离子水中，超声5min使其均匀分散，取2mL悬浮液加入到样品池中，放入Zeta电位仪(Zeta Potential Analyzer，Brookhaven InstrumentsCorporation)中进行测定。

微球或微囊的均一性由粒径分布系数(Coefficient of Variation，CV)来表示，该系数越小说明粒径分布越窄，粒径均一性越好。

粒径分布系数(Coefficient of Variation，CV)通过下式得出：

$\mathrm{CV}={\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(d_i-\stackrel{\‾}{d})}^2}{N}\right)}^{\frac{1}{2}}/\stackrel{\‾}{d}\×100\%$

上式中，d_i为单个微球或微囊的粒径，d为数均粒径，N为用于计算粒径的微球或微囊的数量，N＞300个。

电镜观察微球或微囊的表面形貌：

称量1mg微球或微囊冻干粉，加入10mL去离子水中，超声5min使其均匀分散。吸取1mL悬浮液，将其滴在铝箔上，使其在铝箔上均匀摊开，自然晾干。将铝箔用导电胶贴于样品台上，在真空条件下喷金(20mV，120s)后，用扫描电子显微镜(JEOL JSM-6700F，Japan)进行观察。

药物包埋率测定：

准确称量10mg载药微球或微囊冻干粉，加入1.0mL含5％(w/v)SDS、pH＝10的NaOH溶液中，室温下振荡24小时。待微球或微囊完全水解后，用浓盐酸滴定中和降解液，使其pH＝7，再定容至2mL。多肽药物含量采用BCA试剂盒和micro-BCA试剂盒测定。微球或微囊中多肽药物包埋率(Encapsulation Efficiency，EE)按以下公式计算：

药物包埋率＝(实测微球或微囊中药物量/实际制备时药物加入量)×100％

药物活性测定：

通过ELISA法测定多肽药物的生物活性，在450nm波长下，用酶标仪测定反应的吸光度，然后以多肽药物标准品的吸光度作为对照，计算包埋后药物的相对生物活性保留率。以ELISA试剂盒测定多肽的生物活性的操作步骤可参照试剂盒中的说明书进行。

药物体外释放测定：

准确称量15mg载药微球或微囊的冻干粉，将其加入至1.5mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。将样品管置于37℃水浴恒温振荡器中振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0mL上清液，同时补入1.0mL新鲜磷酸盐缓冲液。上清液中药物含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒测定。

动物实验测定：

实验所采用的糖尿病模型大鼠(SD大鼠)由北医三院提供，采用血糖浓度测定试剂盒以葡萄糖氧化酶法进行血糖浓度的测定。实验步骤具体步骤为：大鼠分为对照组和实验组，每组采用六只模型大鼠进行实验，对照组大鼠不给予药物，对每只实验组大鼠通过腹腔注射的方式给药(20mg载药微球或微囊)。在对模型大鼠给药前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定血糖浓度，以此时的血糖浓度值作为初始值。然后将20mg载药微球或微囊通过腹腔注射的方式对模型大鼠给药。给药后，定时从大鼠眼角取血，每次取血200μL，并测定血糖浓度。

实施例1：

将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将10mg GLP-1溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.25g聚乳酸(PLA，分子量10万道尔顿)溶于5mL二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备40mL 1wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用50kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测定粒径分布状况，平均粒径为13.2μm，CV值为14.9％，药物包埋率为83.2％，活性保持为76.5％。

实施例2：

将孔径为1.4μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将0.001mg Exendin-4溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将10g聚乳酸(PLA，分子量3千道尔顿)溶于10mL乙酸乙酯中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用机械搅拌器800rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备10mL含有0.1wt.％的聚乙烯醇和0.1wt.％NaCl的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用100kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，减压蒸发4h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exendin-4的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为4.8μm，CV值为12.2％，药物包埋率为75.2％，活性保持为74.1％。

实施例3：

将孔径为2.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将45mg Exenatide溶于1mLTris缓冲液中，作为内水相(w₁)。将0.15g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝25∶75，分子量5千道尔顿)溶于1mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液中(体积比为1∶1)，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用超声破碎仪10w乳化1min，得到w₁/o初乳。制备50mL含有10wt.％的聚乙烯醇和0.1wt.％SDS的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用75.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，错流扩散透析24h以去除二氯甲烷和乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为7.2μm，CV值为15.2％，药物包埋率为77.3％，活性保持为74.1％。

实施例4：

将孔径为7.5μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将30mg GLP-1和2mg环糊精溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.25g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝75∶25，分子量1万道尔顿)溶于2mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液中(体积比为1∶3)中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用机械搅拌器500rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备200mL含有20wt.％的聚乙烯醇和0.9wt.％SLS的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用25.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷和乙酸乙酯，离心后得到包埋有GLP-1的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为22.8μm，CV值为14.2％，药物包埋率为87.0％，活性保持为79.1％。

实施例5：

将孔径为10.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将20mg PEG修饰的Exendin-4溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.50g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝75∶25，分子量2万道尔顿)溶于5mL二氯甲烷中和乙酸乙酯的混合溶液中(体积比为3∶1)，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器2000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备100mL 1wt.％的聚吡咯烷酮水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用30.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，采用溶剂萃取法以去除二氯甲烷和乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exendin-4的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为29.1μm，CV值为17.2％，药物包埋率为83.2％，活性保持为77.7％。

实施例6：

将孔径为2.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将50mg GLP-1溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.75g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量1万5千道尔顿)溶于10mL含有0.01wt.％的PO-310的二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用磁力搅拌器600rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备500mL含有2wt.％的Tween 20和10wt.％聚乙二醇硬脂肪酸酯水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用45.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为62.1μm，CV值为55.1％，药物包埋率为14.16％，活性保持为33.2％。

实施例7：

将孔径为25.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将0.0001mgExenatide和8mg赖氨酸溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将1.50g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝25∶75，分子量10万道尔顿)溶于5mL含有10wt.％的失水山梨醇倍半油酸酯的乙酸乙酯中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器2000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备200mL含有4wt.％的Tween 80和10wt.％NaCl的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用5.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为71.2μm，CV值为14.2％，药物包埋率为83.2％，活性保持为85.4％。

实施例8：

将孔径为29.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将0.002g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝75∶25，分子量5万道尔顿)溶于2mL含有10wt.％的PO-500的二氯甲烷中，作为油相(o)。将0.0005mg GLP-1与油相直接混合，在冰水浴中采用超声破碎仪10w乳化1min，得到s/o初乳。制备60mL 10wt.％的聚乙二醇6000水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的s/o初乳用0.01kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到s/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLGA微球。将所得的微球用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微球。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为97.2μm，CV值为14.5％，药物包埋率为84.3％，活性保持为82.1％。

实施例9：

将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将5mg PEG修饰的Exenatide和0.5mg海藻糖溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.10g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝75∶25，分子量3千道尔顿)溶于5mL含有0.01wt.％的单硬脂酸甘油酯的二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备120mL 20wt.％的聚甘油脂肪酸酯水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用15.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有PEG修饰的Exenatide的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为17.2μm，CV值为13.6％，药物包埋率为79.4％，活性保持为84.1％。

实施例10：

将孔径为2.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将35mg Exenatide和10mg甘氨酸溶于1mL磷酸盐缓冲溶液中，作为内水相(w₁)。将0.25g聚乳酸(PLA，分子量5千道尔顿)溶于8mL含有0.2wt.％的失水山梨醇单油酸酯的乙酸乙酯中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用机械搅拌器500rpm乳化1min(60rpm，120rpm，180rpm，240rpm)，得到w₁/o初乳。制备400mL 1.7wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用50.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为6.5μm，CV值为12.2％，药物包埋率为77.1％，活性保持为83.3％。

实施例11：

将孔径为9.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将25mg Exenatide和5mg明胶溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.025g聚乳酸(PLA，分子量5万道尔顿)溶于5mL含有0.1wt.％的失水山梨醇单棕榈酸酯的二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用磁力搅拌器500rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备80mL 0.7wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用15.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有Exenatide的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为20.7μm，CV值为15.2％，药物包埋率为85.4％，活性保持为87.7％。

实施例12：

将孔径为19.9μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将10mg Exenatide和5mg醋酸锌溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.005g聚乙二醇-聚乳酸共聚物(PLEA，PEG∶PLA＝25∶75，分子量1万道尔顿)溶于5mL含有5wt.％的失水山梨醇单硬脂酸酯的乙酸乙酯中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备160mL 0.5wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用5.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为64.2μm，CV值为15.3，药物包埋率为86.3％，活性保持为86.7％。

实施例13：

将孔径为25.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将10mg PEG修饰的Exenatide和5mg蔗糖溶于1mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将4.0g聚乳酸(PLA，分子量1万道尔顿)溶于4mL含有0.2wt.％的失水山梨醇月桂酸酯的乙酸乙酯中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备40mL含有1wt.％聚乙烯醇和0.9wt.％NaCl的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用0.5kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exenatide的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为81.2μm，CV值为13.7％，药物包埋率为87.1％，活性保持为93.1％。

实施例14：

将孔径为29.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将15mg GLP-1和5mg甘露醇溶于1.5mL去离子水中，作为内水相(w₁)。将0.25g聚乳酸(PLA，分子量8万道尔顿)溶于10mL二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备200mL含有1wt.％聚乙烯醇和0.9wt.％NaCl的水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用0.1kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为97.3μm，CV值为15.4，药物包埋率为79.2％，活性保持为86.3％。

实施例15：

将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将0.01mg GLP-1和5mg人血清白蛋白溶于1.5mL醋酸盐缓冲溶液中，作为内水相(w₁)。将1.25g聚乳酸(PLA，分子量5千道尔顿)溶于8mL二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器2000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备600mL1wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用5.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLA微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为15.5μm，CV值为12.2，药物包埋率为84.2％，活性保持为86.5％。

实施例16：

将孔径为2.8μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将0.05mg GLP-1和5mg甘氨酸溶于1.5mL碳酸盐缓冲溶液中，作为内水相(w₁)。将2.5g聚乳酸-聚羟基乙酸与聚乙二醇的共聚物(分子量1万5千道尔顿，聚乳酸和聚羟基乙酸的比例为50∶50，聚乙二醇所占的质量分数为20％)溶于5mL二氯甲烷中，作为油相(o)。将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器2000rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。制备200mL1wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的w₁/o初乳用5.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到w₁/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，减压干燥8h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLGA与聚乙二醇的共聚物微囊。将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为6.4μm，CV值为14.3，药物包埋率为82.5％，活性保持为84.2％。

实施例17：

将孔径为19.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿。将3.0g聚乳酸与聚乙二醇的共聚物(分子量4万道尔顿，聚乙二醇所占的质量分数为10％)溶于5mL二氯甲烷中，作为油相(o)。将150mg Exenatide与油相直接混合，在冰水浴中采用均质乳化器2000rpm乳化1min，得到s/o初乳。制备300mL1wt.％的聚乙烯醇水溶液作为外水相(w₂)。将制备得到的s/o初乳用1.0kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到s/o/w₂复乳液。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有Exenatide的PLA与聚乙二醇的共聚物微球。将所得的微球用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微球。用激光粒度仪测试粒径分布状况，平均粒径为63.1μm，CV值为14.3，药物包埋率为87.4％，活性保持为84.2％。

实施例18：

将孔径为1.4μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将10mg的GLP-1和5mg甘氨酸溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将0.20g聚乳酸(PLA，分子量3千道尔顿)溶于1mL二氯甲烷中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用均质乳化器2000rpm均质乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到40mL的1wt.％的聚乙烯醇水溶液(w₂)中，机械搅拌1000rpm 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在1000kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。继续搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有GLP-1的PLA微囊。用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为632nm，CV值为14.5，扫描电镜照片如图1所示，药物包埋率为82.4％，活性保持为73.2％。

实施例19：

将孔径为2.8μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将20mg的Exendin-4和10mg赖氨酸溶于1mL磷酸盐缓冲溶液作为内水相(w₁)，将0.01g聚乳酸(PLA，分子量5万道尔顿)溶于10mL乙酸乙酯中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用超声破碎仪10w乳化30s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到1000mL含有0.7wt.％聚乙烯醇和0.1wt.％SDS的水溶液(w₂)中，磁力搅拌600rpm 3min制备预复乳液。再将该预复乳液在500kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exendin-4的PLA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为780nm，CV值为16.2，药物包埋率为85.2％，活性保持为79.9％。

实施例20：

将孔径为5.2μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将40mg的Exenatide和2mg蔗糖溶于1mL碳酸盐缓冲溶液作为内水相(w₁)，将0.50g聚乳酸(PLA，分子量5千道尔顿)溶于5mL二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶1)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用机械搅拌器600rpm乳化1min，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到500mL含有10wt.％聚乙二醇和0.5wt.％SLS的水溶液(w₂)中，均质乳化1500rpm 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在200kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复5次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，减压蒸发4h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为834nm，CV值为15.3，药物包埋率为75.4％，活性保持为79.1％。

实施例21：

将孔径为10.2μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将45mg的PEG修饰的Exendin-4溶于1mL醋酸盐缓冲溶液作为内水相(w₁)，将10g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量5万道尔顿)溶于10mL含有0.2wt.％的PO 500的二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶3)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用机械搅拌器600rpm乳化3min，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到400mL含有20wt.％Tween20和1wt.％聚乙二醇硬脂酸酯的水溶液(w₂)中，超声破碎10w 30s制备预复乳液。再将该预复乳液在50kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，减压蒸发4h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exendin-4的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为982nm，CV值为16.7，药物包埋率为84.4％，活性保持为88.2％。

实施例22：

将孔径为0.8μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将1mg的N-烷基化Exendin-4和10mg醋酸锌溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将5g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量5千道尔顿)溶于10mL含有1.5wt.％的PO 310的二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比3∶1)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用超声破碎仪10w乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到400mL含有10wt.％Tween 80和10wt.％SDS的水溶液(w₂)中，机械搅拌(200rpm，500rpm，700rpm，900rpm)3min制备预复乳液。再将该预复乳液在1200kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复5次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有N-烷基化Exendin-4的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，结果如表1所示。

表1制备预复乳时机械搅拌转速对产品性质的影响

实施例23：

将孔径为0.2μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.5mg的酯化Exendin-4和10mg碳酸锌溶于1mL Tris缓冲溶液作为内水相(w₁)，将3g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量10万道尔顿)溶于10mL含有0.01wt.％的失水山梨醇倍半油酸酯的乙酸乙酯中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用磁力搅拌器500rpm乳化5min，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到10mL含有0.1wt.％聚乙烯醇和5wt.％SLS的水溶液(w₂)中，机械搅拌600rpm 5min制备预复乳液。再将该预复乳液在1400kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复2次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，错流扩散透析以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有酯化Exendin-4的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为62nm，CV值为17.3，药物包埋率为52.4％，活性保持为65.2％。

实施例24：

将孔径为1.4μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.05mg的Exenatide和0.5mg人血清白蛋白溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将1g聚乳酸与聚乙二醇的共聚物(分子量4万道尔顿，聚乙二醇所占的质量分数为10％)溶于10mL含有5wt.％的单硬脂酸甘油酯的乙酸乙酯中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用超声破碎仪10w乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到40mL含有0.5wt.％聚乙烯吡咯烷酮的水溶液(w₂)中，磁力搅拌500rpm 10min制备预复乳液。再将该预复乳液在700kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复1次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLA与聚乙二醇的共聚物微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为597nm，CV值为13.2，药物包埋率为81.1％，活性保持为87.2％。

实施例25：

将孔径为2.8μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.001mg的Exenatide和3mg海藻糖溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将0.50g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量1万道尔顿)溶于10mL含有1wt.％的失水山梨醇单油酸酯的二氯甲烷中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用均质乳化器1000rpm乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到100mL含有5wt.％聚乙二醇和0.9wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，均质乳化1500rpm 3min制备预复乳液。再将该预复乳液在1200kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，溶剂萃取以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为747nm，CV值为12.1，药物包埋率为83.4％，活性保持为81.2％。

实施例26：

将孔径为2.8μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.0001mg的PEG修饰的Exendin-4和5mg环糊精溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将0.25g聚乳酸-聚羟基乙酸与聚乙二醇的共聚物(分子量1万5千道尔顿，聚乳酸和聚羟基乙酸的比例为50∶50，聚乙二醇所占的质量分数为20％)溶于10mL含有10wt.％的失水山梨醇单油酸酯的二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶1)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用超声破碎仪10w乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到500mL含有1wt.％聚乙烯醇和5wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，机械搅拌500rpm 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在1000kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exendin-4的PLGA与聚乙二醇共聚物微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为743nm，CV值为13.3，药物包埋率为84.7％，活性保持为82.1％。

实施例27：

将孔径为0.1μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将0.0005mg的PEG修饰的Exendin-4和2mg甘露醇溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将0.05g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝50∶50，分子量7万道尔顿)溶于10mL含有5wt.％的失水山梨醇单棕榈酸酯的二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比3∶1)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用磁力搅拌器500rpm乳化10min，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到700mL含有3wt.％聚乙烯醇和10wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，超声破碎10w 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在1500kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exendin-4的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为54nm，CV值为18.3，药物包埋率为41.4％，活性保持为53.2％。

实施例28：

将孔径为2.8μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将5mg的Exenatide和1mg明胶溶于1mL去离子水作为内水相(w₁)，将0.15g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝25∶75，分子量5万道尔顿)溶于10mL含有10wt.％的失水山梨醇月桂酸酯的二氯甲烷与乙酸乙酯的混合溶液(体积比1∶3)中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用超声破碎仪10w乳化10s，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到200mL含有5wt.％聚乙烯醇和5wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，机械搅拌500rpm 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在800KPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除二氯甲烷与乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为821nm，CV值为15.3，药物包埋率为85.4％，活性保持为84.3％。

实施例29：

将孔径为1.4μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将1.50g聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA，PLA∶PGA＝75∶25，分子量5万道尔顿)溶于10mL含有0.05wt.％的失水山梨醇月桂酸酯的二氯甲烷中作为油相(O)。将300mg Exenatide与油相直接混合，用机械搅拌器700rpm乳化5min，得到s/o初乳。将s/o初乳加入到20mL含有1wt.％Tween 20和2wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，磁力搅拌500rpm 5min制备预复乳液。再将该预复乳液在1400kPa的操作压力下压过微孔膜，得到s/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的s/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有Exenatide的PLGA微球。固化后的微球用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为521nm，CV值为12.3，药物包埋率为86.7％，活性保持为83.2％。

实施例30：

将孔径为5.2μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将2.50g聚乳酸(PLA，分子量2万道尔顿)溶于10mL含有10wt.％的失水山梨醇单油酸酯的乙酸乙酯中作为油相(O)。将0.001mg Exenatide与油相直接混合，用超声破碎仪10w乳化30s，得到s/o初乳。将s/o初乳加入到80mL含有3wt.％聚甘油脂肪酸酯和0.1wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，均质乳化1000rpm 3min制备预复乳液。再将该预复乳液在1000kPa的操作压力下压过微孔膜，得到s/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的s/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，室温下搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有Exenatide的PLA微球，固化后的微球用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为864nm，CV值为17.5，药物包埋率为86.8％，活性保持为88.2％。

实施例31：

将孔径为5.2μm的亲水性SPG膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将30mg的Exenatide和3mg蔗糖溶于1mL磷酸盐缓冲溶液作为内水相(w₁)，将5g聚乳酸(PLA，分子量10万道尔顿)溶于10mL含有1wt.％的失水山梨醇单油酸酯的二氯甲烷中作为油相(O)。将内水相与油相混合，用均质乳化器1000rpm乳化3min，得到w₁/o初乳。将w₁/o初乳加入到150mL含有7wt.％聚乙烯醇和3wt.％NaCl的水溶液(w₂)中，超声破碎10w 1min制备预复乳液。再将该预复乳液在1200kPa的操作压力下压过微孔膜，得到w₁/o/w₂复乳液。该复乳液制备过程重复3次，即将得到的w₁/o/w₂复乳液作为预复乳液再次压过微孔膜。膜乳化完毕后，减压蒸发4h以去除二氯甲烷，离心后得到包埋有Exenatide的PLA微囊。固化后的微囊用去离子水离心洗涤5次，最后冷冻干燥制成成品。用Zeta电位仪测试粒径分布状况，平均粒径为742μm，CV值为13.6，药物包埋率为86.1％，活性保持为89.6％。

实施例32：

分别准确称量15mg载有GLP-1的PLGA(分子量1万道尔顿)及PLA(分子量1万道尔顿)微囊冻干粉(平均粒径532.1nm，微囊中药物质量浓度0.5mg药物/10mg微囊)，将其加入至1.5mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。将盛有上述样品的样品管置于37℃水浴恒温振荡器中振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0mL上清液，同时补入1.0mL新鲜磷酸盐缓冲液。上清液中药物含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒测定，药物的体外释放曲线见图2。

实施例33：

分别准确称量15mg载有Exenatide的PLGA微囊冻干粉(PLA∶PGA＝75∶25，分子量分别为5千道尔顿、1万道尔顿、1万5千道尔顿，平均粒径为2.1μm，微囊中药物质量浓度0.4mg药物/10mg微囊)，将其加入至1.5mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。将盛有上述样品的样品管置于37℃水浴恒温振荡器中振摇(120rpm)。定期离心分离，取出1.0mL上清液，同时补入1.0mL新鲜磷酸盐缓冲液。上清液中药物含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒测定，药物的体外释放曲线见图3。

实施例34：

分别准确称量15mg载有Exendin-4及PEG修饰的Exendin-4的PLGA微囊冻干粉(PLA∶PGA＝50∶50，分子量为2万道尔顿，平均粒径为300nm，微囊中药物质量浓度1mg药物/10mg微囊)，将其加入至1.5mLpH 7.4的磷酸盐PBS缓冲液中。将盛有上述样品的样品管置于37℃水浴恒温振荡器中振摇(120rpm)，定期离心分离，取出1.0mL上清液，同时补入1.0mL新鲜磷酸盐缓冲液。上清液中药物含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒测定，药物的体外释放曲线见图4。

实施例35：

分别准确称量15mg载有Exenatide的PLGA微囊冻干粉(PLA∶PGA＝25∶75，分子量为2万道尔顿，平均粒径为341.4nm，1935.2nm及51.7μm，微囊中药物质量浓度5mg药物/10mg微囊)，将其加入至1.5mLpH 7.4的磷酸盐缓冲液中。将盛有上述样品的样品管置于37℃水浴恒温振荡器中振摇(120rpm)，定期离心分离，取出1.0mL上清液，同时补入1.0mL新鲜磷酸盐缓冲液。上清液中药物含量以BCA试剂和micro-BCA试剂盒测定，药物的体外释放曲线见图5。

实施例36：

实验所采用的糖尿病模型大鼠(SD大鼠)由北医三院提供，采用血糖浓度测定试剂盒以葡萄糖氧化酶法进行血糖浓度的测定。实验步骤具体步骤为：将大鼠分为对照组和实验组，每组采用六只模型大鼠进行实验，对照组大鼠不给予药物，对每只实验组大鼠通过腹腔注射的方式给药(20mg载有Exenatide的PLGA微囊(PLA∶PGA＝50∶50，分子量为1万道尔顿，平均粒径为731.2nm，微囊中药物质量浓度2mg药物/10mg微囊)或PLA微囊冻干粉(分子量为1万道尔顿，平均粒径为720.5nm，微囊中药物质量浓度2mg药物/10mg微囊))。在对模型大鼠给药前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定血糖浓度，以此时的血糖浓度值作为初始值。给药后，定时从大鼠眼角取血，每次取血200μL，并测定血糖浓度，大鼠的血糖浓度曲线见图6。

实施例37：

实验所采用的糖尿病模型大鼠(SD大鼠)由北医三院提供，采用血糖浓度测定试剂盒以葡萄糖氧化酶法进行血糖浓度的测定。实验步骤具体步骤为：将大鼠分为对照组和实验组，每组采用六只模型大鼠进行实验，对照组大鼠不给予药物，对每只实验组大鼠通过腹腔注射的方式给药(20mg载有GLP-1或Exendin-4的PLGA微囊(PLA∶PGA＝25∶75，分子量分别为5万道尔顿，平均粒径为5.4μm，微囊中药物质量浓度1.5mg药物/10mg微囊))。在对模型大鼠给药前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定血糖浓度，以此时的血糖浓度值作为初始值。给药后，定时从大鼠眼角取血，每次取血200μL，并测定血糖浓度，大鼠的血糖浓度曲线见图7。

实施例38：

实验所采用的糖尿病模型大鼠(SD大鼠)由北医三院提供，采用血糖浓度测定试剂盒以葡萄糖氧化酶法进行血糖浓度的测定。实验步骤具体步骤为：将大鼠分为对照组和实验组，每组采用六只模型大鼠进行实验，对照组大鼠不给予药物，对每只实验组大鼠通过腹腔注射的方式给药(20mg载有Exentide的PLA微囊(分子量为1万道尔顿，平均粒径为5.1μm，微囊中药物质量浓度分别为1mg药物/10mg微囊、5mg药物/10mg微囊及10mg药物/10mg微囊))。在对模型大鼠给药前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定血糖浓度，以此时的血糖浓度值作为初始值。给药后，定时从大鼠眼角取血，每次取血200μL，并测定血糖浓度，大鼠的血糖浓度曲线见图8。

实施例39：

实验所采用的糖尿病模型大鼠(SD大鼠)由北医三院提供，采用血糖浓度测定试剂盒以葡萄糖氧化酶法进行血糖浓度的测定。实验步骤具体步骤为：将大鼠分为对照组和实验组，每组采用六只模型大鼠进行实验，对照组大鼠不给予药物，对每只实验组大鼠通过腹腔注射的方式给药(20mg载有Exendin-4的PLGA微囊(PLA∶PGA＝25∶75，分子量为1万道尔顿，平均粒径分别为341.4nm，1935.2nm及51.7μm，微囊中药物质量浓度分别为5mg药物/10mg微囊))。在对模型大鼠给药前，先取血200μL，立即在12000rpm下离心5min，分离出血清，测定血糖浓度，以此时的血糖浓度值作为初始值。给药后，定时从大鼠眼角取血，每次取血200μL，并测定血糖浓度，大鼠的血糖浓度曲线见图9。

Claims (1)

1.一种粒径均一的多肽药物微囊缓释制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将孔径为25.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使膜孔充分润湿；将10mg PEG修饰的Exenatide和5mg蔗糖溶于1mL去离子水中，作为内水相；将4.0g分子量1万道尔顿的聚乳酸溶于4mL含有0.2wt.％的失水山梨醇月桂酸酯的乙酸乙酯中，作为油相；将内水相与油相混合，在冰水浴中采用均质乳化器3000rpm乳化1min，得到内水相/油相初乳；制备40mL含有1wt.％聚乙烯醇和0.9wt.％NaCl的水溶液作为外水相；将制备得到的内水相/油相初乳用0.5kPa的恒定压力，通过微孔膜压入外水相，得到内水相/油相/外水相复乳液；膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除乙酸乙酯，离心后得到包埋有PEG修饰的Exenatide的PLA微囊；将所得的微囊用去离子水洗涤三次后，冷冻干燥48h得到成品微囊。

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