CN113952316B - 一种脂肽型hiv膜融合抑制剂缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球及其制备方法，所述方法包括以下步骤：以脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，以聚合物的有机溶液为油相，将内水相和油相混合，均质化得到W1/O型初乳；将初乳加入至含有稳定剂的外水相中，乳化形成W1/O/W2预复乳液；将预复乳液过微孔膜、去除有机溶剂、固化成球得到所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。本发明方法实现了两亲性脂肽药物包埋，克服了包埋过程存在的微球粒径不均一、包埋率低、突释率高等问题，使得制备得到的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球具有尺寸均一、高包封率、低突释率的优势。

Description

一种脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球及其制备方法。
背景技术
艾滋病，也称获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的慢性传染病。根据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)的报道，截止2018年全球HIV感染者已有3790万，其中新发感染人数180万，同年约100万人死于艾滋病相关疾病。艾滋病已发展成为全球范围内一个不容忽视的严重传染性疾病。然而目前既无有效的HIV预防疫苗，也无可以根治感染的药物，使得艾滋病的防控受到严重挑战。因此，急需研制一种能够有效治疗或者预防艾滋病的药物。
HIV病毒通过与细胞的CD4受体和辅助受体结合，附着在细胞膜表面，然后启动病毒和细胞的磷脂双分子层的融合。病毒进入以后，病毒的核心脱壳，随后逆转录。新形成的预整合复合体转入并整合到宿主的基因组中，从而产生多重剪接的病毒mRNAs，早期蛋白质优化未剪切的病毒RNAs的翻译和核输出过程，剪切的nRNAs翻译出病毒糖蛋白和gag-(pol)前体蛋白。病毒蛋白和未剪接的病毒基因组转移到细胞膜上后，gag-(pol)前体定向锚定在细胞内膜上，向外鼓出球形颗粒，病毒的蛋白酶处理gag和gag-pol蛋白产生衣壳、核衣壳和病毒酶，最终产生能感染新细胞的成熟病毒题颗粒。根据病毒复制成熟的过程，可将抗HIV药物分为以下几类：逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和进入抑制剂，其中进入抑制剂包括吸附抑制剂、CCR5拮抗剂和膜融合抑制剂。其中膜融合抑制剂是在病毒与细胞膜融合过程中发挥抑制作用，相当于“拒敌人于国门之外”，在HIV的预防及治疗中具有更好的应用优势，是既逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂之后的新型抗逆转录病毒药物，解决了前期药物耐药性问题，同时具有良好的抗病毒活性。
目前唯一被FDA批准的HIV融合抑制剂恩夫韦肽(T-20)，是由36个氨基酸组成的多肽，能够有效阻断病毒侵入，显著减少活化细胞的丧失，但是其用量较大，药效时间较短(90mg，每天两次注射)，需要频繁给药，使用不便，极大的限制了它的临床应用。T-1249是一种具有代表性的第二代膜融合抑制剂，含有39个氨基酸，体外研究表明，T-1249比T-20的抗病毒活性强，且对大多数T-20的耐药病毒株也具有很强的活性，能够有效增强融合抑制剂的稳定性和抗病毒活性。然而，由于药物配方的困难，体积大，生产成本高，临床发展受到了影响。CN108727475A和CN106749558A中公开了一系列广谱强效脂肽型HIV膜融合抑制剂，都表现出较强的抗病毒活性；加入疏水的脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等构成的脂肪肽类融合抑制剂(Lipopeptide)，明显提高了HIV融合抑制剂的稳定性和抗病毒活性，同时，不仅具有抗HIV-1病毒活性，对HIV-2、SIV也表现出较强活性，具有很好的应用前景。
但是，上述HIV膜融合抑制剂均为多肽类药物，在体内容易被酶降解，失去活性，药效时间较短，需要多次注射，临床上对于预防药物期望能够有几周，或者几个月，甚至更长时间的药效，所以单次注射HIV膜融合抑制剂很难满足临床需求。为了达到理想的预防效果，临床上常通过加大浓度或剂量、重复多次给药来延长药物作用时间，但频繁的给药次数不仅给患者带来极大不便，还可导致药物蓄积，注射间期感染的风险。而手术植入不仅给患者造成更大的心理压力，而且一些植入物是不可降解的，需要后期取出，不便于使用，且手术费用较高。如果将HIV膜融合抑制剂制备成缓释制剂，不仅可以缓慢释放药物，达到减少给药次数、降低药物浓度波动的目的，而且可以减少药物进入全身循环系统的剂量，进一步降低毒副反应，从而提高HIV膜融合抑制剂的生物利用度并改善其临床应用。
目前，在众多缓释制剂的研究中，微球制剂因其释放周期长，稳定性高以及易于放大生产等特点，具有广阔的市场应用前景。通过可降解的高分子聚合物材料作为骨架，将药物包裹到微球中，制备成长效缓释微球制剂，是近年来研究的热门。
Rothstein等使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，采用W/O/W复乳法包埋恩夫韦肽，所制备微球粒径为10-60μm，可体外持续释药18天，但粒径分布相对较宽。
CN101810583A公开了一种HIV融合抑制剂缓释微球，在HIV融合抑制剂上选择恩夫韦肽、西夫韦肽、艾博卫泰；在载体材料上，该方法选择了可生物降解的聚酯、聚酐等聚合物作为微球基质，在体内可缓释0.5-3个月或更长时间。但是微球制备采用的是传统的机械搅拌、喷雾干燥等方式，微球粒径分布相对较宽，释放难控制；且微球制备时需要在内水相中加入添加剂，为能吸附HIV融合抑制剂的吸附剂和能增加HIV融合抑制剂的助溶剂，微球生物相容性和体内安全性降低。
综上，脂肽型HIV膜融合抑制剂在艾滋病预防和治疗应用中存在以下问题：
(1)药物虽然抗病毒活性高，但是本身的半衰期较短，无法满足几周甚至几个月的长效用药需求。
(2)目前尚无两亲性脂肽药物微球包埋研究报道，没有可以参考的工艺条件，制备过程中既要保证药物结构的稳定，又要保证药物成功转载，包埋难度较大。
(3)由于制备技术的限制(搅拌、喷雾等)，得到的HIV膜融合抑制剂微球的粒径不均一，从而造成不同批次间重复性差，对后续研究和药效产生干扰，释放周期难以总结规律，精准调控；
因此，如何开发一种载脂肽型HIV融合抑制剂缓释微球制备方法，特别是开发一种两亲性脂肽型HIV融合抑制剂缓释微球制备方法，解决微球粒径不均一，同时保证药物成功装载，高载药量，高包埋率，低突释率，是一个亟待解决的难题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球及其制备方法。本发明方法实现了两亲性脂肽药物包埋，克服了包埋过程存在的微球粒径不均一、包埋率低、突释率高等问题，使得制备得到的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球具有尺寸均一、高包封率、低突释率的优势。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，以聚合物的有机溶液为油相，将内水相和油相混合，均质化得到W1/O型初乳；
(2)将步骤(1)得到的W1/O型初乳加入至含有稳定剂的外水相中，乳化形成W1/O/W2预复乳液；
(3)将步骤(2)得到的W1/O/W2预复乳液过微孔膜、去除有机溶剂、固化成球得到所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。
本发明使用复乳法实现了两亲性脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的制备，填补了现有技术无法实现两亲性脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球制备的技术空白。
本发明的复乳法制备过程中，内水相和油相中均无需额外添加表面活性剂，即可达到稳定初乳的目的，并能够保证制备得到的微球能够具有缓释的效果。免去了后期测定残留带来的困难，增加生物安全性，同时降低了生产成本。
优选地，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂为由多肽链和脂肪链组成的两亲性脂肽LP-98。所述脂肽型HIV膜融合抑制剂与膜结构具有更好的亲和性，同时抗病毒活性强。
在本发明中，两亲性脂肽可降低油水界面张力，药物本身具有乳化性，可增强乳液的稳定性，有利于高载药、高包埋微球的制备，在微球制备过程中内水相不用添加表面活性剂。
在本发明制备的缓释微球中，HIV膜融合抑制剂能够抑制HIV病毒与细胞膜融合过程，从而在病毒复制的早期阶段发挥抑制活性，在艾滋病预防和治疗中具有更好的应用优势。
优选地，步骤(1)所述脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液中脂肽型HIV膜融合抑制剂的浓度为1-500mg/mL，浓度过小时载药量低，注射剂量过大，患者顺应性差；浓度过大，药物泄漏较多，包埋率较低。例如1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、130mg/mL、150mg/mL、180mg/mL、200mg/mL、230mg/mL、250mg/mL、280mg/mL、300mg/mL、350mg/mL、400mg/mL、450mg/mL、500mg/mL，更优选30-300mg/mL。
在本发明中，将脂肽型膜融合抑制剂溶解在内水相中，可以保证药物充分溶解，同时使其稳定内部油水界面，降低药物泄漏，避免药物高突释。
优选地，步骤(1)所述聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐或聚磷腈中的一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)所述有机溶液中的有机溶剂为在水中的溶解度低于10％的有机溶剂，优选在水中的溶解度低于2％的有机溶剂，最优选不溶于水的有机溶剂。
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酸乙酯或乙酸丙酯的一种或至少两种的组合，更优选二氯甲烷或乙酸乙酯，最优选二氯甲烷。
优选地，步骤(1)所述聚合物的有机溶液的浓度为50-500mg/mL，浓度过小不利于乳液的稳定，药物易泄漏；浓度过大，聚合物不易溶解，油相粘度大，物料损失较多。
优选地，步骤(1)所述均质化的时间为30-120s，例如30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s或120s。
优选地，步骤(2)所述外水相中稳定剂选自聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸钠中的任意一种或至少两种的组合，更优选聚乙烯醇。
优选地，所述外水相中稳定剂的浓度为1-10wt％，浓度过小时，不利于微球粒径的均一；浓度过大不利于微球制备及清洗，残留较多。例如1wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％、8wt％、8.5wt％、9wt％、9.5wt％或10wt％。
优选地，步骤(2)所述乳化的方式为均质、超声或机械搅拌。
在本发明中，将初乳液加入外水相中乳化得到预复乳溶液。初乳液乳化制备预复乳溶液的乳化过程可选用普通的乳化方式如均质、超声、机械搅拌等。通过所述常规的乳化方法制得的预复乳溶液的悬浮颗粒的粒径一般大于微孔膜的膜孔径，在膜压力的作用下这些粒径大于膜孔径的预复乳悬浮颗粒通过微孔膜，便可得到复乳溶液，多次重复微孔膜过滤操作，即可得到粒径大小与均一性满足要求的复乳溶液。
通过选择不同膜孔径的微孔膜可以达到控制产品粒径大小和均一性的目的。
优选地，步骤(3)所述微孔膜为亲水性膜，孔径为2-200μm，例如2μm、5μm、8μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、80μm、100μm、120μm、150μm、180μm或200μm。
优选地，步骤(3)所述过微孔膜的操作压力为1-500kPa，压力过小，乳液在过膜缓慢，形成的微球粒径较大或者圆柱形，容易破裂；压力过大，乳液喷射，不利于微球粒径的均一。例如1kPa、5kPa、8kPa、10kPa、15kPa、20kPa、25kPa、30kPa、40kPa、50kPa、70kPa、90kPa、100kPa、130kPa、150kPa、200kPa、230kPa、250kPa、280kPa、300kPa、350kPa、380kPa、400kPa、450kPa、480kPa或500kPa。
优选地，步骤(3)所述过微孔膜至少进行1次，优选至少进行3次。
优选地，步骤(3)所述固化在室温下进行。
优选地，步骤(3)所述固化的时间为3-8h，例如3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h或8h。
优选地，步骤(3)在固化后经过清洗和干燥得到脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。
在本发明所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的制备过程中对初乳乳化条件，油相浓度，内水相浓度进行考察，从而增强初乳稳定性，减少药物从内水相到外水相的扩散，从而保证高包埋率；对过膜压力及外水相稳定剂浓度进行调整，以保证所制备微球粒径均一。
本发明中设计了“内水相/油相/外水相”复乳法，保证相对亲水性脂肽在内水相充分溶解，良好分散；同时复乳法保证药物分散在内部油水界面，可以稳定初乳，同时减少药物在外层油水界面的分布，降低突释，从而制备高包埋，低突释长效缓释微球。
另一方面，本发明提供了如上所述的制备方法制备得到的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。
在本发明中，所述制备方法制备得到的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球尺寸均一可控。所述微球的平均粒径在0.5-100μm(例如0.5μm、1μm、3μm、5μm、8μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm或100μm)范围可控，优选为5-50μm。
优选地，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的粒径分布系数span值在1.2以内，例如1.2、1.1、1.0、0.9、0.8等，优选粒径分布系数span值在1.0以内。
在本发明中，微球粒径分布跨度span是粒径分布的一个参数，是对样品粒径分布宽度的一种度量，定义如下式所见：
span＝(D90-D10)/D50，其中D10：一个样品的累计粒度分布数达到10％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占10％。D10常用来表示微粒细端的粒度指标。D50：一个样品的累计粒度分布百分数达到50％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径大于它的颗粒占50％，小于它的颗粒也占50％，D50也叫中位径或中值粒径。D50常用来表示微粒的平均粒度。D90：一个样品的累计粒度分布数达到90％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占90％。D90常用来表示微粒粗端的粒度指标。
优选地，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率(即微球实际载药量与理论载药量的百分比)高于80％，例如83％、85％、88％、90％等。
优选地，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球37℃下在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中0.5h突释在30％以下(例如30％、28％、25％、23％、20％、18％、15％、10％、8％、5％等)，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球能持续释放20天至90天(例如20天、22天、25天、30天、35天、40天、43天、45天、48天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天或90天)。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)针对脂肽型HIV膜融合抑制剂两亲特性，本发明设计了“内水相/油相/外水相”复乳法，保证相对亲水性脂肽在内水相充分溶解，良好分散；同时复乳法保证药物分散在内部油水界面，可以稳定初乳，同时减少药物在外层油水界面的分布，降低突释，从而制备高包埋，低突释长效缓释微球。
(2)本发明不需要在内水相和油相额外添加添加剂，即可达到稳定初乳和持续释放的效果，免去了后期测定残留带来的困难，增加生物安全性，同时降低了生产成本。本发明方法操作简单、条件温和并且易于工业化放大生产。
(3)本发明利用快速膜乳化法制备粒径均一的载HIV膜融合抑制剂缓释微球，解决了批次间重复性不好的问题，在相对均一的粒径基础上，为后期的研究提供了保障，在相同尺寸上更准确地总结释放行为的规律，从而调控释放行为。
(4)本发明提供的尺寸均一的载HIV膜融合抑制剂微球，该微球尺寸均一可控，粒径分布系数(span)在1.2以内，药物包埋率在80％以上，0.5h内突释在30％以下，能持续释放20至90天，具有广泛的医药领域应用前景。
附图说明
图1为本发明所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的制备流程示意图。
图2为实施例1制备的微球的电镜照片，标尺为1μm。
图3为实施例1制备的微球的粒径分布图。
图4为实施例2制备的微球的电镜照片，标尺为1μm。
图5为实施例2制备的微球的粒径分布图。
图6为实施例3制备的微球的电镜照片，标尺为10μm。
图7为实施例3制备的微球的粒径分布图。
图8为实施例6制备的微球的电镜照片，标尺为10μm。
图9为实施例6制备的微球的粒径分布图。
图10为对比例1制备的微球的电镜照片，标尺为10μm。
图11为对比例1制备的微球的粒径分布图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
将孔径为8μm的亲水性微孔膜置于水中侵润，使孔膜充分湿润。将0.5mL浓度为30mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将500mg的分子量为2万的(聚乳酸：聚羟基乙酸＝50:50)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物溶于10mL二氯甲烷中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化30s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到100mL的5％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌1000rpm搅拌1min制备预复乳，再将该预复乳液在450kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜1次，得到复乳液，再将复乳液在室温下磁力搅拌4h，去除油相中的有机溶剂，固化形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。
性能表征：
(1)扫描电镜
将制备得到的包埋膜融合抑制剂缓释微球重新分散在水中，利用冷场发射扫描电镜(日本JEOL SEM公司)观察微球的表面形貌(如图2)。经测定实施例1制备得到的载膜融合抑制剂微球的球形度良好，粒度均一。
(2)平均粒径和粒度分布
将离心好的包埋膜融合抑制剂缓释微球滴加到激光粒度仪中，进行平均粒径和粒径分布系数span值的测定，测试结果如图3所示经测定，微球的平均粒径为3.571μm，粒度分布系数span值为0.843。
(3)包封率的测定方法为，准确称量20mg冻干微球，置10mL离心管中，加入2mL乙腈溶液，室温下超声5min，振摇使分散，精密加入0.03％氨水溶液3mL，涡旋振荡30秒，充分混匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，高效液相色谱法测定。色谱条件：色谱柱为AgilentZORBAX 300Extend-C18(250×4.6mm,5μm)，流动相A为含0.05％(v/v)三氟乙酸的水溶液，流动相B为含0.05％(v/v)三氟乙酸的乙腈，梯度洗脱方法如表1，流速1mL/min，二极管阵列检测器，检测波长220nm，柱温30℃，进样体积20μL。
表1 HPLC流动相梯度
Figure BDA0002564898820000111
Figure BDA0002564898820000121
根据包封率公式：膜融合抑制剂包埋率(EE)＝(实测药物装载率/理论药物装载率)×100％，经测定，微球的包封率为86.10％。
实施例2
将孔径为20μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将5mL浓度为40mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将500mg的分子量为7万(聚乳酸：聚羟基乙酸＝75:25)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于20mL乙酸乙酯中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化60s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到200mL的1.5％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌500rpm搅拌30s制备预复乳，再将该预复乳液在250kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜2次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用冷场发射扫描电镜(JEOL SEM Company,Japan)观察微球的表面形貌(如图4)。微球的平均粒径为9.914μm，粒度分布系数span值为0.880(如图5)。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为93.03％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中0.5h的释放量为23.9％，30天的释放量达到91.3％，释放基本完全。
实施例3
将孔径为40μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将0.5mL浓度为100mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将100mg的分子量为2万的聚乳酸溶于5mL三氯甲烷中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化90s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到40mL的10％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌300rpm搅拌1min制备预复乳，再将该预复乳液在100kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜3次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用冷场发射扫描电镜(JEOL SEM Company,Japan)观察微球的表面形貌(如图6)。微球的平均粒径为18.676μm，粒度分布系数span值为0.991(如图7)。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为90.56％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中0.5h的释放量为18.6％，45天的释放量达到93.7％，释放基本完全。
实施例4
将孔径为80μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将3mL浓度为300mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将1g的分子量为10万的聚己内酯溶于15mL三氯甲烷中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化60s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到100mL的1％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌200rpm搅拌30s制备预复乳，再将该预复乳液在50kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜2次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。微球的平均粒径为48.726μm，粒度分布系数span值为0.972。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为88.79％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中0.5h的释放量为12.2％，63天的释放量达到89.8％，释放基本完全。
实施例5
将孔径为199μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将0.5mL浓度为500mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将1.2g的分子量为10万(聚乳酸：聚羟基乙酸＝85:15)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于5mL二氯甲烷中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化120s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到40mL的2.5％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌100rpm搅拌30s制备预复乳，再将该预复乳液在100kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜3次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。微球的平均粒径为96.472μm，粒度分布系数span值为1.011。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为93.27％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中0.5h的释放量为3.4％，90天的释放量达到95.3％，释放基本完全。
实施例6
将孔径为30μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将2mL浓度为100mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将2g的分子量为2万(聚乳酸：聚羟基乙酸＝50:50)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于20mL乙酸乙酯中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化90s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到200mL的1.5％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌300rpm搅拌50s制备预复乳，再将该预复乳液在35kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜3次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。干燥后的微球重新分散在水中，利用冷场发射扫描电镜(JEOL SEM Company,Japan)观察微球的表面形貌(如图8)。微球的平均粒径为13.835μm，粒度分布系数span值为0.763(如图9)。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为97.04％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4)中0.5h的释放量为20.5％，39天的释放量达到91.2％，释放基本完全。
实施例7
将孔径为150μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将0.5mL浓度为200mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将800mg的分子量为7万聚乳酸溶于5mL丙酸乙酯中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化60s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到40mL的1.5％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌600rpm搅拌90s制备预复乳，再将该预复乳液在10kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜3次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。微球的平均粒径为72.639μm，粒度分布系数span值为0.871。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为87.35％。
实施例8
将孔径为2.8μm的亲水性孔径均一的多孔膜置于水中浸润，使孔膜充分润湿。将0.5mL浓度为10mg/mL HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，将800mg的分子量为5万聚乳酸溶于5mL二氯甲烷中，作为油相。将内水相和油相混合，均质乳化120s，得到W1/O型初乳。将该初乳加入到40mL的1.2％wt的PVA水溶液中，磁力搅拌800rpm搅拌30s制备预复乳，再将该预复乳液在500kPa的操作压力下压过微孔膜装置，过膜2次，得到复乳液，再将复乳液在室温下固化4h后，形成包埋膜融合抑制剂缓释微球，再经离心洗涤即得到载药微球(如图1)。将所得的微球真空干燥72h得到成品微球。微球的平均粒径为0.649μm，粒度分布系数span值为0.835。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为86.29％。在0.01M的磷酸盐缓冲液(pH7.2-7.4)中0.5h的释放量为28.5％，23天的释放量达到89.3％，释放基本完全。
对比例1
本对比例与实施例3不同之处仅在于，外水相中PVA的浓度为0.3％wt，其余制备方法均与实施例3相同。利用冷场发射扫描电镜(JEOL SEM Company,Japan)观察制备得到的微球的表面形貌(如图10)。微球的平均粒径为18.213μm，粒度分布系数span值为1.359(如图11)。HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率为82.95％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (29)

1.一种脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液作为内水相，以聚合物的有机溶液为油相，将内水相和油相混合，均质化得到W1/O型初乳；
(2)将步骤(1)得到的W1/O型初乳加入至含有稳定剂的外水相中，乳化形成W1/O/W2预复乳液；
(3)将步骤(2)得到的W1/O/W2预复乳液过微孔膜、去除有机溶剂、固化成球得到所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球；
所述外水相中稳定剂的浓度为1-10wt％；
所述脂肽型HIV膜融合抑制剂为由多肽链和脂肪链组成的两亲性脂肽LP-98。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液中脂肽型HIV膜融合抑制剂的浓度为1-500mg/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述脂肽型HIV膜融合抑制剂水溶液中脂肽型HIV膜融合抑制剂的浓度为30-300mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐或聚磷腈中的一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶液中的有机溶剂为在水中的溶解度低于10％的有机溶剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶液中的有机溶剂为在水中的溶解度低于2％的有机溶剂。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶液中的有机溶剂为不溶于水的有机溶剂。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酸乙酯或乙酸丙酯的一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚合物的有机溶液的浓度为50-500mg/mL。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述均质化的时间为30-120s。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述外水相中稳定剂选自聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸钠中的任意一种或至少两种的组合，更优选聚乙烯醇。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述乳化的方式为均质、超声或机械搅拌。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述微孔膜为亲水性膜，孔径为2-200μm。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过微孔膜的操作压力为1-500kPa。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过微孔膜至少进行1次。
18.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过微孔膜至少进行3次。
19.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述固化在室温下进行。
20.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述固化的时间为3-8h。
21.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)在固化后经过清洗和干燥得到脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的制备方法制备得到的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球。
23.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述微球的平均粒径为0.5-100μm。
24.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述微球的平均粒径为5-50μm。
25.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的粒径分布系数span值在1.2以内。
26.根据权利要求25所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的粒径分布系数span值在1.0以内。
27.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球的包埋率高于80％。
28.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球37℃下在0.01M的磷酸盐缓冲液中0.5h突释在30％以下。
29.根据权利要求22所述的脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球，其特征在于，所述脂肽型HIV膜融合抑制剂缓释微球37℃下在0.01M的磷酸盐缓冲液中持续释放20天至90天。
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