KR20200127964A - 난용성 약물 서방출용 미립구의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 난용성 약물을 함유하는 생분해성 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구에 관한 것으로, 상기 제조방법은 (a) 생분해성 고분자 화합물 및 약물을 유기산에 용해시켜 약물 함유 생분해성 고분자 용액을 형성하는 단계; (b) 상기 약물 함유 생분해성 고분자 용액을 폴리비닐알코올 수용액에 분사하여 코어-쉘 미립구를 제조 및 잔류용매를 수용액 내로 용출시켜 제거하는 단계; (c) 상기 현탁액으로부터 미립구를 회수하는 단계를 포함하는 고분자 미립구의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 제조된 미립구는 비독성 유기산을 사용하여 종래의 제조과정에서 나타났던 잔류 독성 용매 문제가 전혀 없으며, 단순제조공정에 의한 높은 수율, 그리고 높은 약물 봉입효율을 나타내며, 주사하기에 용이한 적당한 크기의 미립구를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 제조된 미립구는 입자크기에 따라 약물의 방출속도 조절이 가능하여 서방성 약물의 제어 방출로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

난용성 약물 서방출용 미립구의 제조방법 {Method for Preparing Microspheres for Sustained Release of Drugs with Low Solubility}

본 발명은 난용성 약물을 포함하는 난용성 약물의 서방출용 미립구의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 신규한 미립구 제조방법인 마이크로침전법(microprecipitation)을 이용하며, 제조된 미립구의 입자 크기에 따라 약물 방출 프로파일이 조절 가능한 미립구를 제조하는 것을 특징으로 한다.

종래 주사제의 제형으로는 수액제, 현탁액제 또는 유제가 있다. 이 들 주사제형은 근육이나 피하경로로 투여 시 체내에서 재빨리 제거되기 때문에 만성질환의 치료를 위해서는 빈번한 주사투여가 필수적이다. 따라서, 투여 회수를 감소시키고 체내에서 안정적인 약물 농도를 유지하기 위하여 약물이 미립구(microsphere)에 봉입된 형태의 마이크로캅셀화(microencapsulation)를 통한 서방성 제제가 연구되고 있다. 미립구들은 직경이 대략 1 내지 1000 μm로서 근육 또는 피하주사로 투여 가능하다. 또한 약물방출 속도의 조절이 가능하여, 단 한번의 투여만으로 장시간 동안 유효한 치료 약물농도를 나타낼 수 있다. 따라서, 치료에 필요한 약물의 총 투여량을 최소화함으로써 환자의 안전 및 약물치료에 대한 순응도를 향상시킬 수 있다. 마이크로캅셀화 된 약물은 생분해성 고분자 네트워크 내 수용되어 있으며, 상기 생분해성 고분자 네트워크가 체내에서 분해됨에 따라 약물이 서서히 방출된다. 생분해성 고분자 네트워크를 이용한 서방성 제제에 가장 흔하게 사용되는 생분해성 고분자는 폴리-d,l-락타이드-코-글리콜라이드(poly-d,l-lactideco-glycolide, PLGA)이다.

PLGA는 생체 내에서 가수분해되어 무독성의 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)으로 변환되는 생체 친화적인 고분자 화합물이다. PLGA를 이용한서방성 미립구는통상적으로 상 분리법 (phase separation), 스프레이-건조법(spray drying), 및 단일 또는 이중 에멀젼/용매 증발법 등에 의해 제조된다.

상 분리법(phase separation)은 코아세르베이션(coacervation)이라고도 알려져 있다. 상 분리법은 고분자를 적절한 용매에 용해시킨 용액을 제조한 다음 비-용매(non-solvent; e.g. 보통 실리콘 오일)를 첨가함으로써 용액중의 고분자의 용해도를 감소시킨다. 일반적인 미립자 제조방법에서는, 생분해성 고분자를 디클로로메탄 같은 유기 용매에 녹인다. 지용성 약물들도 상기 생분해성 고분자를 용해시킨 용액에 용해시킨다. 여기에 실리콘 오일을 서서히 첨가하면 고분자 농후상(rich phase, 실리콘 오일상)와 고분자 희박상(lean phase, 유기용매상), 두 개의 상이 형성된다. 이어서 상기 유기 용매상에서 유기용매를 추출하거나 증발시키면, 지용성 약물을 함유한 생분해성 고분자 미립자들이 실리콘 오일 상에서 고형화 된다. 상기 프로세스는 사용되는 고분자의 종류 및 특성에 매우 민감하고, 제조 과정에서 디클로로메탄 (메틸렌클로라이드)과 같은 독성 용매가 과량으로 사용되므로, 최종 미립구 제형에 상당량이 잔존하여 인체에 투여 시 치명적인 위해를 가할 수 있다.

스프레이-건조법은, 생분해성 고분자를 디클로로메탄과 같은 휘발성 유기 용매에 용해시키고, 지용성 약물도 상기 생분해성 고분자 용액에 용해시키거나 분산시킨다. 상기 용액 또는 분산액은 가열된 공기 중에 분사되고, 용매가 증발되면서 고형의 미립자가 형성된다. 그러나 수득한고분자 미립구의 초기 구조는 스프레이 건조 전의 생분해성 고분자 용액 중에서의 지용성 약물의 용해성에 의존적이며, 특히 단백질의 경우 건조과정에서 변성이 일어날 수 있으므로 적용가능한 약물의 종류에도 한계가 있다. 또한 스프레이-건조법 역시 제조과정 중 독성 유기 용매 (디클로로메탄, 메탄올 등)를 사용하므로 잔류 독성 용매에 의한 문제점을 피할 수 없다.

이중 에멀젼/용매 증발법은 미립자 제조에 가장 흔하게 사용되는 방법이다. 수중유법 (oil in water, o/w) 수중유중수법(water in oil in water, w/o/w)은 2가지의 대표적인 수화기술이며, 미립구가 제조되는 동안 각각 단일 에멀젼및 이중 에멀젼을 형성한다. 수중유(o/w) 법에서는, 약물은 디클로로메탄 또는 메탄올/디클로로메탄 혼합물과 같은 유기용매중에 용해되거나, 수상 용액중에 용해되고, 이어서 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시킨 용액 (물과 비혼화성)과 혼합되거나 에멀젼화 되어 용액 또는 유중수(w/o) 에멀젼을 각각 형성한다. 수상에서 유기 용매 액적(droplet)이 형성되도록 계면활성제가 수상에 가해지고, 교반을 통해 유기용매를 증발시키고 나면, 액적이 봉입약물과 함께 고분자 미립자로 고형화 된다. 수중유중수(w/o/w) 법에서, 약물 및 유기용매를 포함하는 유중수(w/o) 유제를 만들기 위해서 수용성 약물 용액을 준비한 후 이를 유기 용매 내의 고분자 용액으로 분산시킨다. 수중유중수(w/o/w) 유제를 형성하기 위해서, 상기 유중수(w/o) 고분자-약물 유제를 수상 용매에 유화시킨다. 상기 용액을 교반하면서 유기용매를 증발시키고, 유제 내 고분자-약물 액적을 미립자로 고형화시킨다. 그러나, 상기한 이중 에멀젼/용매 증발법 또한 유기용매로 디클로로메탄을 주로 사용하므로 생분해성 고분자 및 약물로 이루어진 미립구 내에 유기 용매가 잔류할 수 있고, 잔류 용매의 제거가 용이하지 않다.

이처럼, 디클로로메탄은 강한 휘발성을 지니고 물과 잘 섞이지 않으며 물보다 훨씬 낮은 비점을 갖는 등 유제를 만들기 위한 최적의 유기용매이다. 그러나 디클로로메탄은 발암물질이며, 대기의 오존층을 파괴시키며 인체 피부암 발생을 증가시킨다. 또한 물에 대한 용해도가 약 1.32 중량%로 낮아, 사용된 총량의 디클로로메탄 중 극히 일부만이 물에 용해되어 증발된다. 따라서, 유기용매 액적에 있는 디클로로메탄이 완전히 제거되려면 상당한 시간이 소요된다. 한편, 미립구에 상당량의 유기용매가 잔류할 경우 건조 도중 발생하는 미립구들 간의 응집(aggregation) 현상이 일어난다. 미립구들의 응집이 일어나면, 건조 후 미립구가 개별적으로 분산되지 않아 주사를 통해 투여할 경우 문제가 되고, 약물방출 재현성이 떨어진다. 또한 잔류용매 양이 허가 한계치를 초과하면 규제당국으로부터 제품허가를 받기가 어렵다. 뿐만 아니라 제조 과정 중에 발생하는 응집현상은 약물의 봉입효율에도 영향을 미치므로, 응집현상이 일어나지 않으면서도 유기용매 사용을 최소화할 수 있는 서방성 미립구의 새로운 제조 방법이 절실히 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0566573호는 LHRH 동족체와 생분해성 고분자를 초산, 개미산에 용해하여 스프레이-건조법으로 서방성 미립구를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 구체적으로 상기 특허문헌은 초산 또는 개미산에 용해된 생분해성 고분자 및 LHRH 동족체 혼합물을 60 내지 90℃의 온도 및 300 내지 500 NI/h의 압축 공기량으로 분무 건조시키는 공정; 및 7 내지 10 mTorr의 감압하에 10 내지 12시간동안 건조시키는 공정을 포함하고 있다. 상기 제조방법은 잔류용매에 따른 문제는 해소할 수 있으나 건조시간에 따른 약물 봉입율이 상이하며 코어-쉘 미립구 형태가 아닌 구형의 형태로 제조 방법에 따른 초기 방출 조절도 용이하지 않을 뿐만 아니라, 48시간 이상의 장기 방출율은 확인된 바가 없다.

이처럼, 기존 제조방법에 의한 미립구는 많은 경우에 높은 초기 방출 (initial burst)가 일어난다. 이러한 초기 방출은 미립구의 표면 및 내부에 존재하는 물이 채워진 공극 (water-filled pores)와 이들을 연결하는 수 채널 (water channel)을 통해 약물이 빠르게 확산하는 것이 원인이다. 초기 방출은 독성반응을 비롯한 부작용을 일으킬 수 있기 때문에, 미립구 기반 약물전달시스템을 개발함에 있어 초기방출을 최소화하는 것은 대단히 중요하다.

대한민국 특허 제10-0566573호

Jamalzadeh et al., Avicenna J Med Biochem. 2016 June; 4(1):e33453.

본 발명자들은 기존의 미립구 제조방식의 한계인 독성 유기용매를 사용하지 않고, 높은 초기 방출률을 최소화하기 위한 새로운 미립구 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 독성 유기용매 대신 유기산을 사용하고, 고분자로 폴리락트산 유도체 및 양친매성 공중합체를 사용하는 경우 잔류 독성용매 문제를 해결하고, 미립구의 크기 및 약물 방출을 제어할 수 있다는 점을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 난용성 약물 함유 서방성 코어-쉘 미립구를 제조함에 있어서, 보다 단순한 제조공정 및 유기산을 사용을 통해 종래의 난용성 약물 함유 미립구 제형에서 나타났던 잔류 독성 용매 문제를 해결하고, 주사하기에 적당한 균일한 크기의 미립구를 제공하며, 코어-쉘 구조를 통해 미립구 안정성을 높임으로써 난용성 약물을 유효농도로 장기간 동안 지속적으로 방출할 뿐만 아니라, 미립구의 입자크기에 따라 약물 방출 제어가 가능한 서방성 미립자의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 난용성 약물의 서방출용 미립구의 제조방법을 제공한다:

(a) 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자, 및 난용성 약물을 유기산에 용해시켜 미립구 제조용 고분자 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용매에 분사하여 미립구가 분산된 현탁액을 제조하는 단계;

(c) 상기 미립구가 포함하는 유기산을 증발시키고 미립구를 경화시키는 단계; 및

(d) 잔여 현탁액으로부터 미립구를 분리 및 회수하는 단계.

이하, 상기 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 (a): 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자, 및 난용성 약물을 유기산에 용해시켜 미립구 제조용 고분자 용액을 제조하는 단계

본 단계는 본 발명의 미립구 제조에 필요한 생분해성 고분자인 폴리락트산 유도체와 양친매성 고분자를 난용성의 약물과 함께 유기산에 용해시켜 미립구 제조용 고분자 용액을 제조하는 단계이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리락트산 유도체는 고분자 미립구의 제조와 관련된 당업계에서 사용되는 생체적합성 및 생분해성의 폴리락트산 유도체를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리락트산 유도체는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA), 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 락트산과 아미노산의 공중합체, 또는 이들의 혼합물이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 상기 용어 "양친매성 고분자"는 친수성 기능기와 소수성 기능기를 모두 가지는 고분자와 공중합체를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 양친매성 고분자는 고분자 미립구의 제조와 관련된 당업계에서 사용되는 생체적합성 및 생분해성 양친매성 고분자(공중합체)이면 제한없이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "공중합체(copolymer)"는 둘 이상의 서로 다른 단량체(monomer)들로부터 만들어진 고분자를 말한다. 예를 들어, 스타이렌과 아크릴로나이트릴을 같은 반응 용기 안에서 반응을 시키면, 두 단량체를 동시에 갖는 공중합체가 형성된다. "블록 공중합체(block copolymer)"는 한 단량체의 블록이 다른 단량체의 블록으로 연결되는 형태를 취하는 공중합체를 말한다. A 물질 블록 후 B 물질 블록이 이어지는 경우를 -[-AB-]- 라고 표현한다. 사슬이 오직 각각의 단량체의 한 개 가닥으로 구성되어 있으면 AB형이 되고, 중앙에 B블록이 있고 양 끝에 A블록이 존재하면 ABA형, 주사슬에 3가지의 다른 블록이 존재하면 ABC 형이라고 한다. 블록 공중합체는 주로 이온 중합에 의해 형성된다. 다른 공중합체와 다르게 이 블록 공중합체는 두 단량체로부터 만들어진 동종 중합체의 물리적 성질들을 많이 가진다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 입자를 구성하는 상기 양친매성 블록 공중합체는 A-B 또는 A-B-A 블록으로 이루어져 있다. 여기에서 상기 A는 친수성 고분자로 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 디메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 모노메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산 등으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 B는 소수성 고분자로 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콘산, 폴리글리콜라이드, 폴리락트산-글리콘산 공중합체, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 폴리오르니틴, 폴리오르토에스터, 이들의 유도체, 또는 이로부터 선택된 2 이상의 화합물의 공중합체이나, 이에 한정되는 것은 아니고 당업계에서 사용될 수 있는 양친매성 블록 공중합체를 이룰 수 있는 화합물이라면 제한 없이 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

보다 구체적으로는 상기 양친매성 고분자(공중합체)는 메톡시-폴리(에틸렌글라이콜)폴리(D, L-락타이드) 공중합체 [mPEG-PDLLA], 또는 폴리(에틸렌글라이콜)-폴리(프로필렌글라이콜)-폴리(에틸렌글라이콜) 삼중블록 공중합체 [PEG-PPG-PEG] (Pluronic^® F-127), 폴리에틸렌이민-g-폴리(락틱-코-글라이콜산)[PEI-g-PLGA], 폴리(에틸렌글리콜)-g-폴리카프로락톤[PCL-g-PEG], 다이헥사노일포스파티딜콜린 (DHPC) 리피드 마이셀, PEG-알부민, 또는 이들의 혼합물이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 상기 용어 "유기산"은 산성을 띄는 유기화합물을 총칭하며, 카복실기와 설폰기를 포함하는 유기화합물이 대표적이다. 상기 "유기산"은 단순히 염소, 황, 질소, 인 등 비금속을 포함하는 산기가 수소와 결합하여 생긴 산(예컨대, 염산(HCl), 황산(H₂SO₄), 질산(HNO₃), 인산(H₃PO₄))인 "무기산"이 아닌 산을 제외한다는 의미일 뿐 특정 범위의 유기산을 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유기산은 개미산, 초산, 젖산, 주석산, 사과산, 구연산, 호박산, 푸마르산, 또는 이들의 혼합물이며, 바람직하게는 개미산, 초산, 또는 이들의 혼합물이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 사용되는 난용성 약물은 수성 용매에 잘 용해되지 않는 약물을 의미하며, 고분자 미립자에 봉입될 수 있으면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 약물은 예를 들어, 비스테로이드성 항 염증제로서 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 펜부프로펜, 페노프로펜, 플루비프로펜, 인도메타신, 나프록센, 에토로락, 케토프로펜, 덱시부프로펜, 피록시캄, 아세클로페낙을 포함하고; 면역억제제 또는 아토피성 피부염 치료제로서 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신, 미코페닐레이트, 피메크롤리무스를 포함한다. 또한, 칼슘통로 차단제로서 니페디핀, 니모디핀, 니트렌디핀, 닐바디핀, 펠로디핀, 암로디핀, 이스라디핀; 콜레스테롤 합성 억제형 고지혈증 치료제로서 발사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 칸데르사르탄, 텔미사르탄, 올메사르탄, 로사르탄을 포함하는 안지오텐신 II 길항제; 아토르바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴; 콜레스테롤 대사 및 분비 촉진형 고 지혈증 치료제로서 겜피브로질, 페노피브레이트, 에토피브레이트, 베자피브레이트; 당뇨병 치료제로서 피오글리타존, 로지글리타존, 메트포민, 항진균제로서 이트라코나졸, 암포테리신 비, 테르비나핀, 나이스타틴, 글리세오풀빈, 플루코나졸, 케토코나졸; 소화기계 질환 치료제로서 비페닐 디메틸 디카복실레이트, 실리마린, 우루소데옥시콜린산을 포함하는 간보호제; 소팔콘, 오메프라졸, 판토프라졸, 파모티딘, 이토프라이드, 메살라진; 골다공증 치료제로서 실로스타졸 클로피도그렐을 포함하는 혈소판응집 억제제; 랄록시펜, 항생제로서 아시클로버, 팜시클로버, 라미부딘, 오셀타미비르를 포함하는 항바이러스제, 클라리스로마이신, 씨플로플록사신, 세푸록심; 호르몬제로서 테스토스테론, 프레드니솔론, 에스트로겐, 코티손, 하이드로코티손, 덱사메타손; 항종양제로서 파클리탁셀, 도세탁셀, 파클리탁셀 유도체, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노마이신, 켐포테신, 에토포시드, 테니포사이드, 부설판 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (b): 상기 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용매에 분사하여 미립구가 분산된 현탁액을 제조하는 단계

본 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 미립구 제조용 고분자 용액을 이용하여 미립구가 분산된 형태의 현탁액을 제조하는 단계이다.

상기 미립구는 분산용매를 교반하면서 상기 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용매에 분사시킴으로써 제조된다. 본 단계에서 제조된 미립구는 아직 경화되지 않은 상태이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 분사는 주사기 또는 이와 유사한 형태의 노즐을 가진 분사도구에 의해 이루어지고, 분사의 방식은 용매내 주입, 점적 등의 제한없이 수행된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 분사는 주사기를 이용하여 분산용매상에 이루어지되, 주사바늘 굵기는 19, 21, 23, 25, 30G (게이지) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 단계 (b)는 분산용매를 150 내지 -400의 rpm으로 교반하면서 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용액에 분사된다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 교반은 150 내지 400 rpm, 150 내지 350 rpm, 150 내지 300 rpm, 200 내지 400 rpm, 200 내지 350 rpm, 200 내지 300 rpm, 250 내지 400 rpm, 250 내지 350 rpm, 250 내지 300 rpm, 300 내지 400 rpm, 300 내지 350 rpm, 또는 350 내지 400 rpm으로 이루어진다. 상기 교반 속도가 100 rpm 이하이면 미립구가 잘 형성되지 않으며, 400 rpm 보다 더 높아지면 분산용액 내 미립구의 분산이 잘 이루어지지 않는다.

본 발명의 분산용매는 친수성 유화제를 함유하는 수성 용매 또는 소수성 유화제를 포함하는 비수성 용매를 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 친수성 유화제는 폴리비닐 알코올, 폴리옥시에틸렌 하이드로제네이트 캐스터 오일, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(예를 들면 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 60, 폴리소베이트 65, 폴리소베이트 80, 폴리소베이트 85), 또는 이들의 혼합물이고, 가장 구체적으로는 폴리비닐 알코올이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 소수성 유화제는 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 디에틸렌글리콜 모노에틸 에테르, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴(lecithin), 또는 이들의 혼합물이나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 상기 수성용매는 멸균정제수, 생리식염수, 주사용수 등 의약용도 및 생체 내 적용에 적합한 수성용매를 제한없이 포함한다.

한편, 본 발명의 상기 비수성 용매는 비수성 용매는 식물성 오일류, 탄소수 14 내지 20으로 이루어진 지방산 에스테르류, 탄소수 6 내지 12 로 이루어진 지방산 에스테르 글리세라이드류, 또는 이들의 혼합물이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (c): 상기 미립구가 포함하는 유기산을 증발시키고 미립구를 경화시키는 단계

본 단계는 상기 (b)단계의 현탁액 내에 분산되어 있는 경화되지 않은 미립구를 경화시키고, 동시에 미립구 내에 포함된 유기산을 증발시킴으로써 실질적으로 미립구가 형성되는 단계이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 (c) 단계는 현탁액을 10 내지 35℃에서 6 내지 18 시간 동안 교반함으로써 수행된다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 교반 시간은 6 내지 18 시간, 6 내지 16시간, 6 내지 14시간, 6 내지 12시간, 6 내지 10 시간, 6 내지 8시간, 8 내지 18시간, 8 내지 16시간, 8 내지 14시간, 8 내지 12시간, 8 내지 10시간, 10 내지 16시간, 10 내지 14시간, 10 내지 12시간, 12 내지 18시간, 12 내지 16시간, 12 내지 14시간, 14 내지 18시간, 14 내지 16 시간, 또는 16 내지 18시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 교반 시간의 상한(18시간)은 교반이 18시간 이상 수행되더라도 미립구의 경화가 더 진행되는 것은 아니므로 18시간 이상 교반은 경제적인 가치가 낮음을 의미할 뿐, 18시간 이상 교반하여 제조되더라도 본 발명의 범위에서 제외됨을 의미하는 것은 아니다.

상기 교반 온도는 10 내지 35℃, 15 내지 35℃, 20 내지 35℃, 25 내지 35℃, 30 내지 35℃, 10 내지 30℃, 15 내지 30℃, 20 내지 30℃, 25 내지 30℃, 10 내지 25℃, 15 내지 25℃, 20 내지 25℃, 10 내지 20℃, 또는 15 내지 20℃일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

단계 (d): 잔여 현탁액으로부터 미립구를 분리 및 회수하는 단계

본 단계는 상기 (c) 단계에서 미립구의 경화가 완료된 이후, 남아있는 현탁액의 용매를 제거하고, 이로부터 미립구를 분리 및 회수하는 단계이다. 상기 용매의 제거 방법은 흡입, 증발, 배출, 여과 등 제한 없이 사용될 수 있다.

단계 (e): 상기 회수된 미립구를 세척하여 잔류 유기산을 제거하는 단계

본 단계는 분리 및 회수된 미립구의 후처리 공정에 관한 것으로, 수성용매, 예컨대 증류수 등으로 수회 세척하여 미립구 내부에 잔류할 수 있는 유기산을 제거하는 단계이다. 본 발명의 유기산은 수용성이 우수하므로 수성 용매로 세척시, 유기산이 용매 내로 쉽게 용출되어 잔류하지 않는다.

본 단계가 끝나면, 보존을 위한 동결 건조, 입자의 크기 별로 체과하여 분류하는 등의 후속 과정이 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자 및 난용성 약물을 포함하는, 난용성 약물의 서방출용 미립구를 제공한다. 상기 미립구의 구성성분인 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자, 및 난용성 약물은 상기 미립구의 제조방법에서 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 폴리락트산 유도체:양친매성 고분자의 중량비는 1:1 내지 1:5이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리락트산 유도체:양친매성 고분자의 중량비는 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4.5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3, 1:1 내지 1:2.5, 또는 1:1 내지 1:2이고, 가장 바람직하게는 1:2.5 내지 1:3이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 폴리락트산 유도체:양친매성 고분자의 중량비가 1:1 이하, 즉, 1:0.5, 1:0.3 등에서는 응집체만이 형성되고 본 발명의 미립구가 형성되지 않는다. 또한, 상기 폴리락트산 유도체:양친매성 고분자의 중량비가 1:5를 초과하게 되면 보다 높아지면 미립구의 제조 수율이 급격하게 저하된다.

본 발명의 상기 미립구는 상술한 미립구의 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 안니다.

한편, 본 발명의 미립구는 코어/쉘 구조를 갖는 구형체이며 미립구 내 난용성 약물을 안정적으로 봉입할 수 있다 (도 5 참조). 본 발명의 미립구에서는 양친매성 고분자(공중합체)의 친수성기가 표면(쉘)에 위치하고, 소수성기 및 난용성 약물이 중심부(코어)에 위치할 것으로 추측된다.

또한, 본 발명의 미립구는 미립구 내 봉입된 난용성 약물을 서방적으로 방출하므로, 종래 생체이용율이 낮고 투여 횟수가 많은 난용성 약물을 유효농도로 장기간에 걸쳐 지속적으로 방출할 수 있으므로 서방성 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 일양태에 따르면, 본 발명은 상기 미립구를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 미립구, 또는 이를 포함하는 약물전달용 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글리세린, 트레할로스, 폴리에틸렌글리콜류의 부형제, 및 사이클로덱스트린류(알파, 베타, 감마-사이클로덱스트린, 히드록시 사이클로덱스트린 내지 사이클로덱스트린의 유도체 등)의 부형제를 추가적으로 포함한다. 상기 부형제는 본 약제학적 조성물의 유효성분인 입자에 첨가되어 동결보호제 또는 삼투압조절제로 기능하며, 동결건조, 용매증발법 등으로 인해 제형화 된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 점막내 투여, 경막 내 투여, 복강내 투여, 안구내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥내 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 디클로로메탄과 같은 할로겐화 알칸 용매를 사용하는 제조방법과는 달리 유기산을 사용함으로써 종래의 미립구 제형에서 나타났던 잔류독성용매 문제의 해결방안을 제공한다.

(b) 본 발명은 스프레이 건조법이나 이중 에멀젼/용매 증발법과 같은 복잡한 제조공정이 아닌 단순 분사를 통해 주사에 적당한 균일한 크기의 미립구를 제공한다.

(i) 본 발명의 마이크로침전법을 이용하여 미립구를 제조할 경우, 미립구 표면에 양친매성 유화제 층이 더해저 코어-쉘 구조를 형성함으로써 미립구 안정성에 기여하여 난용성 약물을 유효농도로 장기간 동안 지속적으로 방출하는 우수한 서방성을 지닌 약물 함유 서방성 미립자를 제조하는 데에 사용할 수 있다.

도 1은 도 1은 발명에 따른 실시예 1에서 11까지의 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a) 실시예 1, (b) 실시예 2, (c) 실시예 3, (d) 실시예 4, (e) 실시예 5, (f) 실시예 6, (g) 실시예 7, (h) 실시예 8, (i) 실시예 9, (j) 실시예 11.
도 2는 도 2는 발명에 따른 실시예 12에서 22까지의 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a) 실시예 12, (b) 실시예 13, (c) 실시예 14, (d) 실시예 15, (e) 실시예 16, (f) 실시예 17, (g) 실시예 18, (h) 실시예 19, (i) 실시예 20, (j) 실시예 21, (k) 실시예 22.
도 3은 도 3은 발명에 따른 실시예 23에서 27, 그리고 비교예 1까지의 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a) 비교예 1, (b) 실시예 23, (c) 실시예 24, (d) 실시예 25, (e) 실시예 26, (f) 실시예 27.
도 4는 도4는 발명에 따른 실시예 25에서 제조한 미립구 수득된 미립구의 체과 과정을 통한 입도 분포 및 크기를 실체 현미경 사진을 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 25에서 얻어진 덱사메타손 함유 미립구를 TEM(Transmission electron microscope)로 촬영한 사진을 나타낸 도면이다.
도 6은 덱사메타손 함유 미립구와 아파티닙 함유 미립구의 농도에 따른 세포독성 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 덱사메타손 함유 미립구의 입자크기에 따른 덱사메타손 방출 프로파일을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 내지 11: 양친매성 고분자 종류별 생분해성 PLGA 코어-쉘 미립구의 제조(개미산 사용)

생분해성 코어-쉘 미립자를 제조하기 위한 방법으로서 잔류독성용매를 대체하고 단순한 제조 공정을 제시할 수 있는 신규한 제조방법인 Microprecipitation (마이크로침전) 기법을 사용하였다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조건 및 용량으로 생분해성 폴리락트산 유도체(PLGA)와 양친매성 고분자를 준비하고 1 mL의 개미산에 용해시켜 제1 용액(미립구 제조용 용액)을 준비하였다. 분산용매로는 1 %(w/v) 폴리비닐 알코올(PVA) 9 mL을 사용하였다. 상기 분산용매를 300 rpm으로 빠르게 교반하면서 상기 제조된 제1 용액을 주사기에 흡인하여 분산용매 상에 1분 이내에 분사하였다. 제1용액과 분산용매의 혼합용액을 제2용액이라고 명명하였다. 제2용액 내에는 구형의 다수의 미립구가 형성되었다. 미립구가 형성된 제2용액을 후드에서 8시간 동안 서서히 교반하면서 미립구를 경화(hardening) 및 유기산을 증발시켰다. 다음으로 제2용액을 1500 rpm에서 10분간 원심 분리하여 경화된 미립구를 회수하였다. 증류수로 3회 이상 세척하여 남아있는 유기산을 제거하였으며 침전물을 동결 건조하였다. 상기 동결 건조된 분말을 소량 취하여 증류수 100 μL에 현탁 후 슬라이드 글라스에 올려 놓고 현미경 (iMegascope, SOMETECH)을 통해 미립구의 형성 여부 및 형태를 확인하였다(도 1).

양친매성 고분자의 종류 및 중량 등 실시예 별 제조 조건 및 미립구의 형성 여부를 표 1에 나타내었다.

	양친매성 고분자			PLGA 중량 (mg)	개미산 (mL)	미립구 형성 유무1 )	형태
	종류	분자량 (Dalton)	중량 (mg)
실시예 1	PLCL-PEG-PLCL	1700:1500: 1700	250	100	1	X	응집체
실시예 2	PLA-PEG-PLA	1500:1500: 1500	250	100	1	X	응집체
실시예 3	PLA-PEG-PLA	1000:1000:1000	250	100	1	X	응집체
실시예 4	PCL-PEG-PCL	1000:1000: 1000	250	100	1	X	무정형 입자
실시예 5	PLGA-PEG-PLGA	100:1000: 1000	250	100	1	X	무정형 입자
실시예 6	PLLA-PEG-PLLA	2400:2400:2400	250	100	1	X	무정형 입자
실시예 7	mPEG-PDLLA	2000:2000	250	100	1	X	무정형 입자
실시예 8	mPEG-PDLLA	5000:5000	250	100	1	O	미립구
실시예 9	mPEG-PLGA	2000:2000	250	100	1	X	스폰지
실시예 10	Pluronic F-68	8400	250	100	1	X	제조 불가2 )
실시예 11	Pluronic F-127	12600	250	100	1	O	미립구

1) X: 미립구 형성 안됨, O: 미립구 형성 2) 1 mL 개미산에서 Pluronic F-68의 용해도가 낮아 제조 불가

도 1의 (a) 내지 (j)는 상기 표 1에 나타낸 실시예 1 내지 11의 조건으로 제조된 결과물의 현미경 사진이다. (a) 실시예 1, (b) 실시예 2, (c) 실시예 3, (d) 실시예 4, (e) 실시예 5, (f) 실시예 6, (g) 실시예 7, (h) 실시예 8, (i) 실시예 9, (j) 실시예 11.

도 1에 나타낸 바와 같이, 개미산을 이용한 마이크로침전법(Microprecipitation)에서 양친매성 고분자로서 mPEG-PDLLA(5000:5000)와 플루로닉 F-127를 사용하였을 경우에만 미립구가 제조됨을 확인하였다.

실시예 12 내지 22: 양친매성 고분자 종류별 생분해성 PLGA 코어- 쉘미립구의 제조(초산 사용)

유기산으로서 개미산이 아닌 초산을 이용하여 제1 용액을 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1 내 11과 동일한 방법으로 미립구를 제조하고, 현미경으로 미립구의 형성 여부 및 형태를 확인하였다(도 2). 각 실시예 별 제조 조건 및 미립구 형성 여부를 표 2에 정리하였다.

	양친매성 고분자			PLGA 중량 (mg)	초산 (mL)	미립구 형성 유무1 )	형태
	종류	분자량 (Dalton)	중량 (mg)
실시예 12	PLCL-PEG-PLCL	1700:1500: 1700	250	100	1	X	응집체
실시예 13	PLA-PEG-PLA	1500:1500: 1500	250	100	1	X	응집체
실시예 14	PLA-PEG-PLA	1000:1000:1000	250	100	1	X	응집체
실시예 15	PCL-PEG-PCL	1000:1000: 1000	250	100	1	X	스폰지
실시예 16	PLGA-PEG-PLGA	100:1000: 1000	250	100	1	X	응집체
실시예 17	PLLA-PEG-PLLA	2400:2400:2400	250	100	1	X	스폰지
실시예 18	mPEG-PDLLA	2000:2000	250	100	1	X	응집체
실시예 19	mPEG-PDLLA	5000:5000	250	100	1	X	응집체
실시예 20	mPEG-PLGA	2000:2000	250	100	1	X	스폰지
실시예 21	Pluronic F-68	8400	250	100	1	△	미립구
실시예 22	Pluronic F-127	12600	250	100	1	O	미립구

1) X: 미립구 형성 안됨, △: 불안정한 형태의 미립구, O: 미립구 형성

도 2의 (a) 내지 (k)는 상기 표 2에 나타낸 실시예 12 내지 22의 조건으로 제조된 결과물의 현미경 사진이다. (a) 실시예 12, (b) 실시예 13, (c) 실시예 14, (d) 실시예 15, (e) 실시예 16, (f) 실시예 17, (g) 실시예 18, (h) 실시예 19, (i) 실시예 20, (j) 실시예 21, (k) 실시예 22.

도 2에 나타낸 바와 같이, 초산을 이용한 마이크로침전법(Microprecipitation)에서 양친매성 고분자로서 플루로닉 F-127을 사용하였을 경우에만 미립구가 제조됨을 확인하였다.

비교예 1 및 실시예 23 내지 25: 양친매성 고분자( 플루로닉 F- 127)의 함량에 따른 난용성 약물(덱사메타손) 함유 생분해성 PLGA 코어-쉘 미립구의 제조

본 발명자는 양친매성 고분자(플루로닉 F-127)의 함량에 따른 난용성 약물 함유 생분해성 PLGA 코어-쉘미립구의 제조 여부를 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

하기 표 3과 같이, PLGA 100 mg, 플루로닉 F-127 (0 mg, 50 mg, 150 mg, 250 mg; 각각 비교예 1, 실시예 23, 24, 25), 및 추가적으로 난용성 약물인 덱사메타손 10 mg을 1 mL의 개미산에 용해시켜 제1 용액을 준비한 것을 제외하고는 상기 실시예와 동일한 방법으로 미립구를 제조하였다. 수득된 미립구는 동결건조 후 체과 과정을 거쳐 입자 크기를 1-20 um, 20-50 um, 50-70 um, 70-100 um, 100-150 um, 150-300 um 로 분리하였다. 제조된 미립구의 현미경 사진은 도 3의 (a) 내지 (d)에 나타내었다. (도 3, (a) 비교예 1, (b) 실시예 23, (c) 실시예 24, (d) 실시예 25)

	PLGA 함량 (mg)	플루로닉 F-127 함량 (mg)	덱사메타손 함량 (mg)	RPM	봉입 효율 (%)	수율 (%)	비고
비교예 1	100	0	10	300	-	0	100 % 응집체 형성
실시예 23	100	50	10	300	-	0	100 % 응집체 형성
실시예 24	100	150	10	300	63	41	59 % 응집체 형성
실시예 25	100	250	10	300	81	88	12 % 나노 입자 형성

상기 표 3 및 도 3의 (a) 내지 (c)에 나타낸 바와 같이, 비교예 1과 실시예 23내지 25를 비교하였을 때, PLGA에 대한 양친매성 고분자인 플루로닉 F-127의 함량이 2:1 이상 포함되어야 미립구가 제조되며, 플루로닉 F-127의 함량이 50, 150, 250 mg으로 증가할수록 미립구의 제조 수율이 개선되는 것을 확인하였다.

실시예 25 내지 27: 교반 속도에 따른 덱사메타손 함유 생분해성 PLGA 코어-쉘 미립구의 제조

본 발명자는 분산 용매의 교반 속도에 따른 따른 덱사메타손 함유 생분해성 PLGA 코어-쉘미립구의 제조 여부를 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

표 4와 같이, 분산 용매인 1% PVA 용액의 교반 속도를 각각 300 rpm, 150 rpm, 100 rpm (각각 실시예 25, 26, 27)로 달리한 것을 제외하고는 상기 실시예 25와 동일한 방법으로 미립구를 제조하였다. 제조된 미립구의 현미경 사진은 도 3의 (d) 내지 (f)에 나타내었다. (도 3, (d) 실시예 25, (e) 실시예 26, (f) 실시예 27)

	PLGA 함량 (mg)	플루로닉 F-127 함량 (mg)	덱사메타손 함량 (mg)	RPM	봉입 효율 (%)	수율 (%)	비고
실시예 25	100	250	10	300	81	88	12 % 나노 입자 형성
실시예 26	100	250	10	150	60	34	66 % 응집체 및 나노 입자
실시예 27	100	250	10	100	57	34	66 % 응집체 및 나노 입자

상기 표 4 및 도 3의 (d) 내지 (f)에 나타낸 바와 같이, 분산 용매의 교반 속도가 100, 150, 300 rpm으로 증가할수록 미립구의 제조 수율 및 입자의 균질성이 개선됨을 확인하였다.

실시예 28 내지 30: 난용성 약물( 아파티닙 )의 함량에 따른 생분해성 PLGA 코어-쉘 미립구의 제조

본 발명자들은 난용성 약물의 종류 및 함량에 따른 미립구의 제조 여부 및 봉입효율을 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

표 5와 같이, 난용성 약물로서 덱사메타손 대신 아파티닙 메실레이트를 사용하였으며, 아파티닙 메실레이트의 함량을 10 mg, 20 mg, 30 mg(각각 실시예 28, 29, 30)으로 달리한 것을 제외하고는 상기 실시예 25와 동일한 방법으로 미립구를 제조하였다. 최종 결과물을 동결 건조하여 아파티닙 함유 코어-쉘 PLGA 미립구를 제조하였으며 제조 결과를 표 5에 나타내었다.

	PLGA 함량 (mg)	플루로닉 F-127 함량 (mg)	아파티닙 (mg)	RPM	봉입 효율 (%)	수율 (%)
실시예 28	100	250	10	300	97.24	33.86
실시예 29	100	250	20	300	97.28	73.66
실시예 30	100	250	30	300	97.45	73.54

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손이 아닌 다른 난용성 약물인 아파티닙 메실레이트도 본 발명의 미립구 내 봉입 효율이 우수하며, 아파티닙의 함량이 증가할수록 미립구의 제조 수율이 개선됨을 확인하였다.

실험예

실험예 1: 생분해성 PLGA 코어-쉘 미립구의 형태 및 입도 분포 확인

본 발명의 미립구의 형태를 확인하기 위하여, 실시예 25에서 제조한 난용성 약물을 함유하는 미립구를 동결 건조 후 체과 과정을 거쳐, 입자 크기를 각각 1-20 μm, 20-50 μm, 50-70 μm, 70-100 μm, 100-150 μm, 150-300 μm 로 분류하였다. 체과 후의 입도 분포 및 크기를 실체 현미경을 통해 확인하였다(도 4).

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미립구의 체과 후 입도 분포는 균질하였으며, 입자 크기는 각각 25.5 ± 4.6 μm, 45.1 ± 8.6 μm, 66.2 ± 8.9 μm, 85.1 ± 13.8 μm, 113.6 ± 22.7 μm, 150.2 ± 73.5 μm 였다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따르면, 균질한 크기 및 형태를 가진 난용성 약물을 함유하는 미립구를 제조할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2: 미립구의 덱사메타손 및 아파티닙의 봉입효율 및 수율 측정

실시예 23 내지 30에서 제조한 덱사메타손 또는 아파티닙을 함유하는 미립구 일부를 정확하게 칭량한 후, 10 mL의 DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Sigma Aldrich)에 완전히 녹여 이동상으로 10 배 희석한 후 0.45 μm 주사기 필터로 여과한 여액 10 μL를 HPLC (Agilent 1260 Infinity)에 주입하여 정량하였다. 본 실험을 위해 분석칼럼으로서는 C18 (100 mm x 4.6 mm I.D., 5 μm) 컬럼을 사용하였으며 다음의 식 1을 사용하여 약물의 봉입효율 (%)을 구하였다.

식 1

약물 봉입 효율 (%) = (약물 봉입량 (mg) /약물 투입량 (mg)) X 100

또한, 고분자 미립구의 제조 수율을 측정하기 위하여, 미리 무게를 측정한 접시 위에 회수한 고분자 미립구를 놓고 진공 건조 후의 무게(회수한 고분자 미립구의 무게)를 측정하였으며, 다음의 식 2를 사용하여 미립구의 제조 수율 (%)을 측정하였다.

식 2

수율 (%): (회수한 고분자 미립구의 무게)/(제조 시 사용한 고분자와 약물의 무게 합) X 100

상기 식 1 및 2에 따른 각 약물의 봉입 효율 및 미립구의 제조 수율은 표 3 내지 5에 나타내었다.

실험예 3: 투과전자현미경 ( TEM ) 이미지 측정

상기 실시예 25에서 얻어진 덱사메타손 함유 미립구를 TEM(Transmission electron microscope)로 촬영하여 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 25의 미립구는 코어/쉘 구조를 갖는 구형체임을 알 수 있을 뿐만 아니라 미립구 내 약물이 봉입되어 있는 형태도 확인 가능하였다.

실험예 4: 세포 배양 및 세포독성 시험

본 발명의 난용성 약물을 함유하는 미립구의 세포독성을 측정하기 위하여 NIH3T3 섬유모세포를 배양하고 미립구를 처리한 후 세포 생존율을 평가하였다.

NIH3T3 섬유모세포의 배양은 배양용기 (75 cm² T flask, Nunc)에 넣어 계대배양하여 사용하였다. 세포배양을 위한 배양액은 10% FBS, penicillin G (25 U/mL), 및 Strepto-Mycin(25 μg/mL)을 첨가한 RPMI1640 배지를 사용하였다. 세포배양은 상기 배지에 세포를 넣고 37 ℃, 5% CO₂로 조절된 습윤 정온기 내에서 배양하였으며, 3일 간격으로 계대배양하였다.

세포독성을 측정하기 위하여 NIH3T3 섬유모세포를 1 X 10⁵ cells/well 로 배양 후 2종의 입자크기(1-40 μm 또는 40-100 μm)를 갖는 덱사메타손 함유 미립구(PLGA-DEX MPs) 또는 아파티닙 함유 미립구(PLGA-APT MPs)를 농도별(5, 10, 100, 200, 500 μg/mL)로 각각 24시간 동안 처리하였다. 마지막으로 WST-1 분석법 (EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit, Daeillab Service Co., LTD)으로 세포생존율을 평가하였으며, 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6의 a)는 덱사메타손 함유 미립구(PLGA-DEX MPs)의 세포 생존율을 나타내는 것으로 고농도인 500 μg/mL 농도의 미립구로 처리된 세포를 1일 후에 관찰하였을 때도 우수한 세포 생존율을 나타내었다.

도 6의 b)는 아파티닙 함유 미립구(PLGA-APT MPs)의 세포 생존율을 나타낸 것으로, 모든 범위의 농도에서 80 % 이상의 높은 세포 생존율을 나타내었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 미립구는 잔류 독성 용매에 의한 세포독성 문제를 해결하고 우수한 생체적합성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 미립구의 in vitro 약물 방출 거동 측정

덱사메타손 함유 미립구의 서방형 안과용제로서의 약물 방출거동을 측정하기 위하여 상기 실시예 25에서 제조된 각각의 서로 다른 크기별 (25, 45, 66, 85, 113 μm ) 미립구 50 mg을 각각 10 mL의 안내 관류액인BSS Plus 수용액 (Alcon Laboratories, Inc.) 에 넣고 37 ℃ 수욕조에서 100 rpm의 속도로 용출 시험을 진행하였다. 3일 간격으로 10 mL의 용액을 전부 회수하고 새로운 BSS Plus 용액 10 mL 로 교체하였으며 회수한 용액을 HPLC 이동상으로 10배 희석한 후 0.45 μm 주사기 필터로 여과한 여액 10 μL를 HPLC (Agilent 1260 Infinity)에 주입하여 정량하였다. 본 실험을 위한 분석칼럼으로는 C18 (100mm x 4.6 mm I.D., 5μm) 컬럼을 사용하였다. 각 입자 샘플의 전체 약물 양 대비 각 시간대별 방출된 약물의 양을 누적 백분율로 계산하여 나타내었으며, 상기 측정결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 실시에 25에 의해 제조된 미립구는 30일 동안 입자크기가 25 μm 일 때 가장 낮은 방출율을 보였으며, 45 μm 크기의 미립구는 초기 방출율은 다른 크기의 미립구에 비해 높았으나 25일차 이후부터 약물방출 정체기(lag phase)를 보였다. 66 μm, 85 μm, 113 μm 크기의 미립구는 30일 동안 점차적으로 약물 방출이 증가하였으며 입자크기가 작을수록 낮은 약물 방출율을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 제조한 모든 미립구에서 덱사메타손의 초기 방출이 크지 않았으며, 일정한 양으로 오랜시간 동안 지속 방출됨을 확인할 수 있었다.

Claims (19)

1. 다음 단계를 포함하는 난용성 약물의 서방출용 미립구의 제조방법:
   (a) 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자, 및 난용성 약물을 유기산에 용해시켜 미립구 제조용 고분자 용액을 제조하는 단계;
   (b) 상기 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용매에 분사하여 미립구가 분산된 현탁액을 제조하는 단계;
   (c) 상기 미립구가 포함하는 유기산을 증발시키고 미립구를 경화시키는 단계; 및
   (d) 잔여 현탁액으로부터 미립구를 분리 및 회수하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리락트산 유도체는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA), 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 락트산과 아미노산의 공중합체, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 메톡시-폴리(에틸렌글라이콜)폴리(D, L-락타이드) 공중합체 [mPEG-PDLLA], 또는 폴리(에틸렌글라이콜)-폴리(프로필렌글라이콜)-폴리(에틸렌글라이콜) 삼중블록 공중합체 [PEG-PPG-PEG], 폴리에틸렌이민-g-폴리(락틱-코-글라이콜산)[PEI-g-PLGA], 폴리(에틸렌글리콜)-g-폴리카프로락톤[PCL-g-PEG], 다이헥사노일포스파티딜콜린 (DHPC) 리피드 마이셀, PEG-알부민, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 유기산은 개미산, 초산, 젖산, 주석산, 사과산, 구연산, 호박산, 푸마르산, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 분산용매를 150 내지 400의 rpm으로 교반하면서 미립구 제조용 고분자 용액을 분산용액에 분사하는 단계인, 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 분산용매는 친수성 유화제를 함유하는 수성 용매 또는 소수성 유화제를 포함하는 비수성 용매인, 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 친수성 유화제는 폴리비닐 알코올, 폴리옥시에틸렌 하이드로제네이트 캐스터 오일, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 소수성 유화제는 글리세린 지방산 에스터(Glycerin Esters of Fatty Acids), 소르비탄 지방산 에스테르, 디에틸렌 글리 콜 모노에틸 에테르, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴(lecithin), 또는 이들의 혼합물인, 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 수성 용매는 멸균정제수, 생리식염수, 또는 주사용수인, 방법.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 비수성 용매는 식물성 오일류, 탄소수 14 내지 20으로 이루어진 지방산 에스테르류, 탄소수 6 내지 12 로 이루어진 지방산 에스테르 글리세라이드류, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 현탁액을 6 내지 18시간 동안 교반함으로써 수행되는 단계인, 방법.
    
12. 제1항에 있어서, (e) 상기 회수된 미립구를 세척하여 잔류 유기산을 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.
    
13. 폴리락트산 유도체, 양친매성 고분자, 및 난용성 약물을 포함하는, 난용성 약물의 서방출용 미립구.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 폴리락트산 유도체는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA), 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 락트산과 아미노산의 공중합체, 또는 이들의 혼합물인, 미립구.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 메톡시-폴리(에틸렌글라이콜)폴리(D, L-락타이드) 공중합체 [mPEG-PDLLA], 또는 폴리(에틸렌글라이콜)-폴리(프로필렌글라이콜)-폴리(에틸렌글라이콜) 삼중블록 공중합체 [PEG-PPG-PEG], 폴리에틸렌이민-g-폴리(락틱-코-글라이콜산)[PEI-g-PLGA], 폴리(에틸렌글리콜)-g-폴리카프로락톤[PCL-g-PEG], 다이헥사노일포스파티딜콜린 (DHPC) 리피드 마이셀, PEG-알부민, 또는 이들의 혼합물인, 미립구.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 미립구의 입자 크기는 1-20 μm, 20-50 μm, 50-70 μm, 70-100 μm, 100-150 μm, 또는 150-300 μm 인 것인, 미립구.
    
17. 제13항에 있어서, 폴리락트산 유도체:양친매성 고분자의 중량비는 1:1 내지 1:5인, 미립구.
    
18. 제13항에 있어서, 상기 미립구는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 것인, 미립구.
    
19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항의 미립구를 포함하는, 약물전달용 조성물.
    

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