KR20190000325A - 이중 코어-쉘 구조를 가지는 난용성 캄토테신 화합물을 포함하는 입자, 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

이중 코어-쉘 구조를 가지는 난용성 캄토테신 화합물을 포함하는 입자, 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중 코어-쉘 구조를 가지는 약물전달체에 관한 것으로, 상세하게는 내부에 난용성 캄토테신 화합물과 수용성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부에 코어-쉘과, 양친매성 고분자 쉘을 가지는 이중 나노 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 이중 코어-쉘 구조의 입자는 매우 안정한 미셀을 형성하고. 동결건조 전후에도 단일분포의 입자분포를 나타낸다. 본 발명의 입자는 동물 효력시험 및 약동학시험에서 기존 단일층 미셀보다 우수한 결과를 나타내며, 과민반응을 유발하는 계면활성제를 사용하지 않으므로, 본 발명의 입자를 이용하면 인체에 안전한 약제학적 조성물 또는 약물전달 플랫폼을 제공할 수 있다.

Description

이중 코어-쉘 구조를 가지는 난용성 캄토테신 화합물을 포함하는 입자, 약제학적 조성물 및 이의 제조방법{PARTICLE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING AN INSOLUBLE CAMPTOTHECIN COMPOUND WITH DOUBLE CORE-SHELL STRUCTURE AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}
본 특허출원은 2017년 6월 22일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2017-0079354호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 이중 코어-쉘 구조를 가지는 약물전달체에 관한 것으로, 상세하게는 내부에 난용성 캄토테신 화합물과 수용성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부에 코어-쉘과, 양친매성 고분자 쉘을 가지는 이중 나노 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
난용성 약물을 주사용으로 개발하기 위해서는 반드시 가용화 단계가 필요하며, 이러한 문제를 극복하기 위하여 계면활성제를 포함하는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포좀(liposome), 미셀(micelle), 페길화(PEGylation), 프로드러그(Prodrug)화 등이 사용되어 왔다. 캄토테신계 항암제로서 가장 강한 활성을 가지는 약물 중 하나인 7-ethyl 10-hydroxy camptothecin (SN-38)은 프로드러그 형태인 이리노테칸 (상품명: CAMTOSAR®, 노바티스 제조)으로 공급되고 있으며, 생체내의 카르복시에스터레이즈 II (CESII)에 의해서 주로 가수분해되어 활성형인 SN-38로 변환된다. 그러나, 변환되는 비율이 2-8%로 매우 적을 뿐만 아니라 그 편차 또한 매우 커서 정확한 투여용량 조절이 필요한 암환자에게 적절하게 투여하기 어렵고, 이에 따라 효과와 부작용을 예측하기 힘든 단점이 있다.
난용성 약물의 가용화를 위한 다른 효율적인 방법으로는 나노 크기의 입경을가지도록 약물을 미셀화시키는 방법이 사용되고 있다. 일반적으로 나노 미셀 주사제는 무균성(sterility)과 안정성(stability)을 확보하기 위하여 제조 과정 중에 나노 미셀 수용액을 0.22 μm 필터로 무균여과 후 동결건조를 통하여 고체분말화하는 과정을 거친다. 이 과정에서 미셀 자체의 응집으로 인하여 동결건조물을 주사용 용매(생리식염수 등)에 재용해 하였을 때 다량의 거대입자(200 nm 이상~수십 μm)가 생성되는 문제점이 있다. 특히 입경이 5 μm보다 큰 입자의 경우, 체내에 주입되었을 경우 심각한 부작용을 초래할 수 있으므로, 미국약전(US Pharmacpoeia), 유럽약전, 대한약전 등에서 불용성미립자시험(particulate matter)을 통하여 엄격히 관리되고 있다. 따라서 미셀화를 하더라도 동결건조 전후에 입자크기의 변화가 적고, 입자의 분포가 단일분포(mono-distribution)를 나타내며, 특히 수 μm이상의 입자가 없는 가용화 방법의 개발이 필요하다.
한편, 주사제를 제조하기 위해서는 활성성분을 적절한 용매에 용해하는 과정이 필수적이나, 소수성 캄토테신계 화합물인 캄토테신, SN-38은 물 뿐만 아니라 약제학적 제조과정에 사용되는 대부분의 휘발성 극성유기용매(메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 에틸아세테이트 등)에 잘 용해되지 않는다. 이들을 용해할 수 있는 용매는 디메칠설폭시드(dimethylsulfoxide, DMSO), 디메칠포름아미드 (dimethylformamide), 톨루엔 (toluene), 다이옥산 (dioxane)등 비휘발성 용매들로 제한된다. 그러나 이러한 용매들을 제거하기 위해서는 투석(dialysis) 과정이 필요하고, 투석을 하더라도 완전히 제거하기 어렵기 때문에 잔류시 독성 문제에 대한 우려가 있다.
따라서, 본 발명자들은 극도의 난용성 항암활성성분인 캄토테신 및 SN-38을 프로드러그 형태가 아닌 활성형으로 직접 투여할 수 있으면서, 제조과정 중에 잔류용매의 문제를 일으키지 않으며, 동결건조 전후에 입자크기의 변화가 거의 없으며, 수 μm 이상의 거대응집입자가 생성되지 않는 안정적인 입자 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 다음을 포함하는 입자를 제공하는 것이다:
i) 소수성 캄토테신계 화합물, ii) 친수성 캄토테신계 화합물, 및 iii) 소수성 블록 및 친수성 블록으로 이루어진 양친매성 블록 공중합체.
본 발명의 다른 목적은 상기 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 입자의 제조방법을 제공하는 것이다:
(a) 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘을 형성하는 단계; 및 (b) 양친매성 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘을 형성하는 단계.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 하기 1 내지 35의 발명을 제공한다:
1. 다음을 포함하는 입자:
i) 소수성 캄토테신계 화합물, ii) 친수성 캄토테신계 화합물, 및 iii) 소수성 블록 및 친수성 블록으로 이루어진 양친매성 블록 공중합체.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물은 SN-38(7-에틸-10-히드록시캄토테신), 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 입자.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 친수성 캄토테신계 화합물은 이리노테칸, 토포테칸, 벨로테칸, 엑사테칸, 루르토테칸, 시노테칸, 루비테칸, 9-니트로캄토테신, 9-아미노캄토테신, 지마테칸, BNP-1530, DB-67, BN-80915, BN-80927, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 글루쿠로나이드 대사체, 및 상기 소수성 캄토테신계 화합물의 글루쿠로나이드 대사체로부터 선택되는 1종 이상인, 입자.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 양친매성 블록 공중합체는 A-B 또는 A-B-A 블록으로 구성된, 입자:
(a) 상기 A는 친수성 고분자로 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 디메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 모노메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산 또는 이들의 중합체이고;
(b) 상기 B는 소수성 고분자로 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콘산, 폴리글리콜라이드, 폴리락트산-글리콘산 공중합체, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 폴리오르니틴, 폴리오르토에스터, 이들의 유도체, 또는 이로부터 선택된 2 이상의 화합물의 공중합체.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 친수성 고분자 A의 수평균 분자량은 500 내지 10,000 Da인, 입자.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 소수성 고분자 B의 수평균 분자량은 500 내지 10,000 Da 인, 입자.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 상기 친수성 캄토테신계 화합물의 중량비는 1:10 내지 10:1 인, 입자.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 합과, 양친성 블록 공중합체의 중량비는 1:200 내지 10:1인, 입자.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 입자의 수평균 입자크기는 10 nm 내지 500 nm 인, 입자.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 다음을 포함하는 이중 코어-쉘(core-shell) 구조인, 입자:
(a) 상기 친수성 캄토테신계 화합물과 소수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘; 및
(b) 상기 양친매성 블록 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 이중층 미셀(micelle) 구조를 갖는 것인, 입자.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료용 약제학적 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 암은 위암, 난소암, 자궁암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장암, 유방암, 식도암, 구강암, 직장암, 결장암, 대장암, 신장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 담낭 및 기타 담도암, 갑상선암, 방광암, 뇌 및 중추신경계암, 골종양, 피부암, 비호지킨성 및 호지킨성 림프종 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
14. 제 12 항에 있어서, 상기 조성물은 다른 종류의 항암제를 추가적으로 포함하는 것인, 조성물.
15. 제 12 항에 있어서, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글리세린, 트레할로스, 폴리에틸렌글리콜류의 부형제, 및 사이클로덱스트린류의 부형제를 추가적으로 포함하는, 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비(baboon) 또는 붉은털 원숭이인, 방법.
18. 다음의 단계를 포함하는 입자의 제조방법:
(a) 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘을 형성하는 단계; 및
(b) 양친매성 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘을 형성하는 단계.
19. 제 18 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고;
상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 18 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 염기성 수용액과, 친수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 수용액을 혼합하는 단계를 포함하고;
상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 친수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 수용액은 염기성, 중성, 또는 산성 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 20 항에 있어서, 상기 (a) 단계는 (a1) 소수성 캄토테신계 화합물을 용해시킨 염기성 수용액 및 친수성 캄토테신계 화합물을 용해시킨 염기성, 중성, 또는 산성 수용액과 혼합하는 단계; 및 (a2) 혼합된 수용액의 pH를 7 이하로 낮추는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 18 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고;
상기 (b) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 혼합물을 양친매성 블록 공중합체와 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함한다.
24. 제 18 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 소수성 캄토테신계 화합물은 SN-38(7-에틸-10-히드록시캄토테신), 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 방법.
25. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친수성 캄토테신계 화합물은 이리노테칸, 토포테칸, 벨로테칸, 엑사테칸, 루르토테칸, 시노테칸, 루비테칸, 9-니트로캄토테신, 9-아미노캄토테신, 지마테칸, BNP-1530, DB-67, BN-80915, BN-80927, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 글루쿠로나이드 대사체, 및 상기 소수성 캄토테신계 화합물의 글루쿠로나이드 대사체로부터 선택되는 1종 이상인, 방법.
26. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양친매성 블록 공중합체는 A-B 또는 A-B-A 블록으로 구성되며,
(a) 상기 A는 친수성 고분자로 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 디메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 모노메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산 또는 이들의 중합체이고;
(b) 상기 B는 소수성 고분자로 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콘산, 폴리글리콜라이드, 폴리락트산-글리콘산 공중합체, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 폴리오르니틴, 폴리오르토에스터, 이들의 유도체, 또는 이로부터 선택된 2 이상의 화합물의 공중합체.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 친수성 고분자 A의분자량은 500 내지 10,000 Da인, 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 상기 소수성 고분자 B의 분자량은 500 내지 10,000 Da 인, 방법.
29. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 상기 친수성 캄토테신계 화합물의 중량비는 1:10 내지 10:1 인, 방법.
30. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 합과, 양친성 블록 공중합체의 중량비는 1:200 내지 10:1인, 방법.
31. 제 18 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기용매는 C1 내지 C5의 알코올, (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, n-부탄올, 이소-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 이소부틸알콜 등) 알킬아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 클로르포름, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 아세톤, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, THF(Tetrahydrofuran) 또는 이들의 혼합용매인, 방법.
32. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
상기 산성 수용액은 염산, 질산, 황산, 인산 등 약제학적으로 허용 가능한 무기산 또는 시트르산, 말산, 락트산, 아세트산, 및 타르타르산으로 이루어진 유기산 중 선택되는 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
33. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 산성 수용액의 pH는 1.0 내지 6인, 방법.
34. 제 20 항에 있어서, 상기 염기성 수용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 및 탄산수소나트륨으로 이루어진 무기알칼리, 유기산의 알칼리염, 및 알킬아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
35. 제 20 항에 있어서, 상기 염기성 수용액의 pH는 8 내지 13인, 방법.
본 발명자들은 강력한 항암활성을 가짐에도 불구하고, 극도의 난용성으로 인해 적용이 제한되는 소수성 캄토테신계 화합물의 용해도 및 안정성을 향상시키고자 예의 연구 노력한 결과, 소수성 캄토테신계 화합물에 친수성 캄토테신계 화합물을 수성 용매 또는 유기 용매 중에서 혼합하면 소수성 및 친수성 캄토테신계 화합물이 각각 코어와 쉘구조를 이루는 코어-쉘(core-shell) 입자(미셀, micelle)가 형성됨을 확인하였다. 나아가 상기 코어-쉘 입자에 양친매성 블록 공중합체를 가하면 양친매성 블록 공중합체가 상기 입자를 둘러싸, 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)이 형성됨을 확인하였다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성캄토테신계 화합물을 모두 포함하는 이중 코어-쉘 입자는 프로드러그 형태로 투여하지 않아도 기존의 난용성 캄토테신과 비교하여 용해도가 현저히 개선된다. 따라서 생체내의 카르복시에스터레이즈 II (CESII) 의 활성도와 관계 없이 활성형 캄토테신(SN-38)의 약효를 발휘할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 입자는 동결건조 이후 다시 수용성 용매에 재용해시키더라도 입자의 응집이나 침전이 발생하지 않아 안정성이 매우 우수한 제형임을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 기존의 단일층 나노미셀에서 진보하여, 난용성 약물의 낮은 용해도 문제를 해결한 안정적인 이중 코어-쉘 구조의 입자 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 입자를 제공한다:
i) 소수성 캄토테신계 화합물, ii) 친수성 캄토테신계 화합물, 및 iii) 소수성 블록 및 친수성 블록으로 이루어진 양친매성 블록 공중합체.
본 명세서에서 캄토테신(camptothecin)은 행운목(Camptotheca, Happay tree)의 껍질과 줄기에서 발견된 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제로서 전임상 단계에서는 매우 우수한 항암 효과를 나타내었으나, 낮은 용해도 때문에 사용할 수 없었다. 따라서 많은 연구자들이 이의 용해도를 높이기 위한 캄토테신 유사체를 개발해 왔으며, 현재 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 벨로테칸(belotecan) 3 종류의 캄토테신 유도체가 승인되어 암에 대한 화학치료에 사용되고 있다.
본 명세서에서 용어, "소수성(hydrophobicity)"은 비극성 물질에서 나타나는 경향으로 물 분자에서 배제되어 응집되는 것을 말한다. 소수성 물질이 친수성 액체 내에 있을 때 마치 물을 두려워하듯 소수성 결합을 증가시키면서 소수성 물질들이 응집한다
본 명세서에서 용어, "친수성(hydrophilicity)"은 주로 극성 물질에서 나타나는 경향으로 물과 강한 친화력을 가지고 물에 용해되는 성질을 의미한다. 예컨대 친수성 고분자 화합물이나 계면활성제의 미셀 콜로이드의 표면은 친수성이 강하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 소수성 소수성 캄토테신계 화합물은 SN-38(7-에틸-10-히드록시캄토테신), 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 친수성 캄토테신계 화합물은 이리노테칸, 토포테칸, 벨로테칸, 엑사테칸, 루르토테칸, 시노테칸, 루비테칸, 9-니트로캄토테신, 9-아미노캄토테신, 지마테칸, BNP-1530, DB-67, BN-80915, BN-80927, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 글루쿠로나이드 대사체, 및 상기 소수성 캄토테신계 화합물의 글루쿠로나이드 대사체로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 입자를 이루는 상기 소수성 캄토테신계 화합물은 캄토테신, SN-38, 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 상기 친수성 캄토테신계 화합물은 이리노테칸의 염산염, 토포테칸의 염산염, SN-38의 글루쿠로나이드 유사체이다.
본 명세서에서 용어, "공중합체(copolymer)"는 둘 이상의 서로 다른 단량체(monomer)들로부터 만들어진 고분자를 말한다. 예를 들어, 스타이렌과 아크릴로나이트릴을 같은 반응 용기 안에서 반응을 시키면, 두 단량체를 동시에 갖는 공중합체가 형성된다. "블록 공중합체(block copolymer)"는 한 단량체의 블록이 다른 단량체의 블록으로 연결되는 형태를 취하는 공중합체를 말한다. A 물질 블록 후 B 물질 블록이 이어지는 경우를 -[-AB-]- 라고 표현한다. 사슬이 오직 각각의 단량체의 한 개 가닥으로 구성되어 있으면 AB형이 되고, 중앙에 B블록이 있고 양 끝에 A블록이 존재하면 ABA형, 주사슬에 3가지의 다른 블록이 존재하면 ABC 형이라고 한다. 블록 공중합체는 주로 이온 중합에 의해 형성된다. 다른 공중합체와 다르게 이 블록 공중합체는 두 단량체로부터 만들어진 동종 중합체의 물리적 성질들을 많이 가진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 입자를 구성하는 상기 양친매성 블록 공중합체는 A-B 또는 A-B-A 블록으로 이루어져 있다. 여기에서 상기 A는 친수성 고분자로 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 디메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 모노메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산 등으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 B는 소수성 고분자로 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콘산, 폴리글리콜라이드, 폴리락트산-글리콘산 공중합체, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 폴리오르니틴, 폴리오르토에스터, 이들의 유도체, 또는 이로부터 선택된 2 이상의 화합물의 공중합체이나, 이에 한정되는 것은 아니고 당업계에서 사용될 수 있는 양친매성 블록 공중합체를 이룰 수 있는 화합물이라면 제한 없이 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 양친매성 블록 공중합체는 PEG-PCL [poly(ethylene glycol)-b-poly(carprolactone)]; PEG-PLA [poly(ethylene glycol)-b-poly(lactic acid)]; mPEG-PGA [monomethoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(glycolic acid)]; mPEG-PLGA [monomethoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(lactide-co-glycolide)]; PEG-PBLA [poly(ethylene glycol)-b-poly(β-benzyl-L-aspartic acid)]; PEG-p(Glu) [poly(ethylene glycol)-b-poly(glutamic acid)]; PEG-p(Asp) [poly(ethylene glycol)-b-poly(aspartic acid)]; 및/또는 PEG-PLA-PEG [poly(ethylene glycol)-b-poly(lactic acid)-b-poly(ethylene glycol)]이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 친수성 고분자 A 및 소수성 고분자 B의 수평균 분자량은 500 내지 10,000 Da이고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 7,000 Da이다. 상기 친수성 고분자 A 및 소수성 고분자 B의 수평균 분자량이 500 Da 미만 또는 10,000 Da를 초과하는 경우에는 제조된 입자의 평균크기가 200 nm 이상이며 다중입자분포를 나타내어 미국 FDA에서 규정하고 있는 나노 입자 의약품이 되기 어렵다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 입자를 구성하는 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 상기 친수성 캄토테신계 화합물의 중량비는 1-10:1-10, 1-10:1-5, 1-10:1-3, 1-10:1, 1-5:1-10, 1-3:1-10, 1:1-10 이고, 구체적으로는 1-5:1-5, 1-5:1-3, 1-5:1, 1-3:1-5, 1:1-5 이며, 보다 구체적으로는 1-3:1-3, 1-3:1, 1:1-3 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (a) 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 합과, (b) 양친성 블록 공중합체의 중량비는 1:0.1-200, 1:0.5-200 1:1-200, 1:2-200, 1:5-200, 1:10-200, 1:50-200, 1:100-200, 1:150-200, 1:0.1-100, 1:0.5-100, 1:1-100, 1:2-100, 1:5-100, 1:10-100, 1:20-100, 1:50-100, 1:0.1-50, 1:0.5-50, 1:1-50, 1:5-50, 1:10-50, 1:20-50, 1:0.1-20, 1:0.5-20, 1:1-20, 1:5-20, 1:10-20, 1:0.1-10, 1:0.5-10, 또는 1:1-10 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바로서, 두 수치 사이에 기재된 용어 '내지' 또는 '-'는 앞뒤에 기재된 수치를 포함하는 상기 수치 사이 구간을 의미한다.
한편, 본 발명의 입자는 다음을 포함하는 이중 코어-쉘(core-shell) 구조인 것을 특징으로 한다:
(a) 상기 친수성 캄토테신계 화합물과 소수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘; 및 (b) 상기 양친매성 블록 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘.
또는, 본 발명의 입자는 이중층 미셀(micelle) 구조를 갖는다.
친수성 블록과 소수성 블록이 특정 비율로 결합된 양친매성 블록 공중합체는 수용액 상에서 자가 조립하여 미셀을 형성하는 것으로 알려져 있다. 미셀 내부는 소수성 성질을 가지고 있어 양친매성 블록 공중합체는 난용성 제제의 약물 운반체로 응용되고 있다. 폴리스티렌-폴리에틸렌 옥사이드 이중블록공중합체(PS-b-PEO)는 물에서 불용해성의 코어(PS)와 용해성 쉘(PEO)을 가지는 구형의 미셀을 형성하는 것으로 잘 알려져 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 입자는 (a) 친수성 캄토테신계 화합물과 소수성 캄토테신계 화합물과, (b) 양친매성 블록 공중합체를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 친수성 캄토테신계 화합물과 소수성 캄토테신계 화합물을 혼합하면 수성 용매에서의 용해도가 현저하게 증가하고, 입자를 형성한다. 여기에서 친수성 캄토테신계 화합물은 양친매성 공중합체의 친수성 블록의 역할을 하고, 소수성 캄토테신계 화합물은 양친매성 공중합체의 소수성 블록의 역할을 하여 코어-쉘 구조(미셀)를 이루는 것으로 보인다.
따라서 본 발명의 입자는 친수성 캄토테신계 화합물 및 소수성 캄토테신계 화합물이 코어-쉘 구조를 이루는 단일층 미셀을 내부에 포함하고, 양친매성 블록 공중합체가 이들을 내부에 포함하는 이중 미셀(이중 코어-쉘)을 이룬다. 보다 구체적으로 상기 양친매성 블록 공중합체 중 소수성 블록은 비교적 소수성인, 캄토테신계 화합물들이 이루는 상기 단일층 미셀 쪽을 향하여 불용성의 코어를 이루고, 친수성 블록은 외부의 수성용매 쪽을 향하여 용해성 쉘을 이루는 결과, 이중 코어-쉘 구조의 이중 미셀이 형성된다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 이중 코어-쉘 구조의 입자는 수용액에 분산하였을 때 자발적으로 입자를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 입자의 수평균 입자크기는 10-500 nm, 10-400 nm, 10-300 nm, 10-200 nm 이고, 보다 구체적으로는 20-500 nm, 20-400 nm, 20-300 nm, 20-200 nm이다. 본 발명의 입자의 상기 수평균 입자크기는 입자의 동결 건조 전후에도 거의 변화가 없다. 그 이유는 소수성 및 친수성 캄토테신계 화합물이 1차적으로 내부 코어-쉘 구조의 미셀을 구성하고, 양친매성 블록 공중합체가 2차적으로 상기 미셀을 둘러싸는 외곽 쉘을 구성함으로써, 동결건조시에 2차 외곽쉘이 1차 내부 코어-쉘의 급격한 결정화, 응집, 입자의 붕괴를 방지하는 동결보호제 역할을 하기 때문인 것으로 보인다. 그 결과 본 발명의 입자는 동결건조 후 수용성 용매에 재용해시키더라도 응집이나 침전이 발생하지 않는다. 따라서 본 발명은 기존의 단일층 나노 미셀에서 진보하여, 극도의 난용성 약물의 용해도 문제점을 해결한 안정적인 이중 코어-쉘 구조의 입자 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 위암, 난소암, 자궁암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 췌장암, 유방암, 식도암, 구강암, 직장암, 결장암, 대장암, 신장암, 전립선암, 흑색종, 간암, 담낭 및 기타 담도암, 갑상선암, 방광암, 뇌 및 중추신경계암, 골종양, 피부암, 비호지킨성 및 호지킨성 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 입자, 또는 이를 포함하는 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글리세린, 트레할로스, 폴리에틸렌글리콜류의 부형제, 및 사이클로덱스트린류(알파, 베타, 감마-사이클로덱스트린, 히드록시 사이클로덱스트린 내지 사이클로덱스트린의 유도체 등)의 부형제를 추가적으로 포함한다. 상기 부형제는 본 약제학적 조성물의 유효성분인 입자에 첨가되어 동결보호제 또는 삼투압조절제로 기능하며, 동결건조, 용매증발법 등으로 인해 제형화 된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 점막내 투여, 경막 내 투여, 복강내 투여, 안구내 투여 등으로 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥내 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암의 치료 효과를 가지는 공지의 화합물 또는 약제학적 조성물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 다른 종류의 항암제를 추가적으로 포함한다. 구체적으로는 파클리탁셀, 도세탁셀과 같은 난용성의 항암제를 추가적으로 포함한다.
파클리탁셀, 도세탁셀로 대표되는 난용성의 항암제의 경우 상술한 캄토테신과 같이 난용성으로 인해 활용도가 낮지만, 본 발명의 이중 미셀 입자에 포함되는 경우에는 용해도가 현저히 개선된다. 따라서 본 발명의 입자는 그 자체가 캄토테신 계열의 항암제이자, 난용성의 항암제, 또는 낮은 용해도가 문제되는 신규한 후보약물들을 로딩하여 용해도를 개선할 수 있는 약물전달체 플랫폼으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 암이 발병한 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
상기 조성물의 "치료적 유효량"은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 제한 없이 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비(baboon) 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 상기 암의 치료방법은, 본 발명의 일 양태인 암의 치료용 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 입자의 제조방법을 제공한다:
(a) 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘을 형성하는 단계; 및
(b) 양친매성 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘을 형성하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고; 상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 소수성 캄토테신계 화합물은 극도로 난용성이기 때문에 특별한 가용화 기술 또는 제조방법이 필요하다. 본 발명의 일 실시예에서는 이러한 난용성을 극복하기 위해서 1차로 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에 동시에 용해 후 회전식 감압증발건조기를 활용하여 유기용매를 완전히 제거하여 필름형태의 캄토테신계 화합물의 혼합물을 수득하였다. 여기에 수성용매(e.g. 증류수)를 소량씩 첨가하면서 vortex-mixer로 강하게 혼합하거나 초음파 처리를 통하여 나노크기의 1차 코어-쉘 복합체를 수득하였다.
다음으로 미리 수성용매(e.g. 증류수)에 용해한 양친매성 고분자를 1차 코어-쉘 복합체에 첨가하고 균질하게 vortex-mixer로 강하게 혼합하거나 초음파 처리를 통하여 나노 크기의 이중 코어-쉘 입자를 수득하였다. 여기에 최종적으로 동결건조보호제, 등장화제 등을 넣어 완전히 용해 후, 이 용액을 0.22 μm 멸균필터로 여과하고 동결건조하였다. 최종 동결건조물은 0.9% 염화나트륨주사액, 5% 포도당주사액 또는 주사용수를 넣었을 때 자기-조립되어 20 내지 200 nm의 수평균 입자 크기의 이중 코어-쉘 입자를 형성한다.
본 발명과 같이 제조된 입자의 크기가 200 nm 이하인 경우 체내의 세망내피계(RES system)의 비선택적 제거를 회피할 수 있으므로 200 nm 이하의 균질한 입자크기를 가진 입자를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 염기성 수용액과, 친수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 수용액을 혼합하는 단계를 포함하고; 상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함한다.
여기에서 상기 친수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 수용액은 염기성, 중성, 또는 산성 수용액일 수 있다.
상기 1차 내부 코어-쉘은 유기 용매에서 제조하는 방법 이외에도 다음의 방법으로 제조할 수 있다. 소수성 캄토테신계 화합물(예컨대 캄토테신, SN-38)은 pH 7이하의 산성 또는 중성 수용액에서는 용해도가 매우 낮지만, 염기성 수용액에서는 락톤링(lactone ring)이 열리면서 카르복시산의 형태를 갖게 되어 수용액에 대한 용해도가 급격히 상승한다. 따라서, 소수성 캄토테신계 화합물을 염기성 수용액에서 용해한 후 친수성 캄토테신계 화합물을 용해시킨 수용액을 넣으면서 pH를 7이하로 낮추면 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물이 미셀을 형성하며, 산성이 중화됨과 동시에 락톤링이 닫히면서 원래의 화학 구조로 회복된다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 (a) 단계는 (a1) 소수성 캄토테신계 화합물을 용해시킨 염기성 수용액 및 친수성 캄토테신계 화합물을 용해시킨 염기성, 중성, 또는 산성 수용액과 혼합하는 단계; 및 (a2) 혼합된 수용액의 pH를 7 이하로 낮추는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 캄토테신 또는 SN-38을 염기성 수용액에 용해하고, 이 염기성 수용액을 미리 수용액에 용해시킨 친수성 캄토테신계 화합물을 초음파 또는 vortex-mixer로 강하게 혼합하면서 첨가하고, 추가로 산성수용액을 첨가하여 pH를 7이하로 조절하여 1차 코어-쉘 입자를 수득하였다. 이렇게 생성된 1차 코어-쉘 입자의 혼합물에, 미리 수성용매(e.g. 증류수)에 용해된 양친매성 고분자를 vortex-mixing하거나 초음파를 처리하여 이중 코어-쉘 혼합물을 제조하였다. 여기에 추가적으로 동결건조보호제 내지 등장화제를 넣고 용해하여 0.22 μm 필터로 멸균여과 후 동결건조하였다.
본 발명의 제조방법에서 상기 산성 수용액은 염산, 질산, 황산, 인산 등 약제학적으로 허용 가능한 무기산 또는 시트르산, 말산, 락트산, 아세트산, 및 타르타르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유기산을 포함하고, 상기 산성 수용액의 pH는 1 내지 6이다. 또한, 본 발명의 제조방법에서 상기 염기성 수용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 및 탄산수소나트륨으로 이루어진 무기알칼리, 유기산의 알칼리염, 및 알킬아민, 또는 이들의 혼합물을 포함하며, 상기 염기성 수용액의 pH는 8 내지 13이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 (a) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고; 상기 (b) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 혼합물을 양친매성 블록 공중합체와 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계(내부 코어-쉘의 제조)와 (b) 단계(외부 코어-쉘의 제조)는 한 단계에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 1차 내부 코어-쉘과 2차 외부 코어-쉘 입자를 동시에 제조하는 방법을 개시하였다. 소수성 캄토테신(e.g. 10-히드록시캄토테신, SN-38)을 각각 친수성 캄토테신(e.g. 염산 이리노테칸)과 함께 유기용매에 넣고 교반하여 완전히 용해하고, 여기에 미리 유기용매에 용해시킨 양친매성 블록 공중합체(e.g. mPEG-PLA)를 첨가하면서 교반하였다. 이 혼합액을 회전증발 감압건조기로 건조하고, 잔류물에 수성용매(e.g. 증류수)를 넣어 초음파세척기에 10분간 초음파를 가하여 이중 나노미셀 입자를 제조하였다.
본 발명의 상기 입자의 제조방법에 있어서, 입자를 구성하는 소수성 캄토테신계 화합물, 친수성 캄토테신계 화합물, 양친매성 블록 공중합체에 관한 정의는 본 발명의 입자에 관하여 상술한 바와 같다.
본 발명의 제조방법에서 상기 유기용매는 C1 내지 C5의 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, n-부탄올, 이소-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 이소부틸알콜 등), 알킬아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 클로르포름, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 아세톤, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, THF(Tetrahydrofuran) 또는 이들의 혼합용매이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의해 제조된 이중 코어-쉘 구조의 입자는 수용액 중에서 충분히 낮은 농도로 희석되어도 결정으로 석출되지 않고, 매우 안정한 입자를 형성한다. 본 발명의 입자는 동결건조 전후에도 주사용 용매상에서 단일분포의 입자분포를 나타내며, 200 nm 이상 입자는 10% 이하이며, 500 nm 이상은 존재하지 않는다. 본 발명은 또한 동물 효력시험 및 약동학시험에서 기존 단일층 미셀보다 우수한 결과를 나타내며, 과민반응을 유발하는 계면활성제(Cremophore EL, 플루로닉 등)을 사용하지 않으므로, 본 발명의 입자를 이용하면 인체에 안전한 약제학적 조성물 또는 약물전달 플랫폼을 제공할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일실시예에 따른 SN-38과 이리노테칸으로 구성된 코어-쉘 입자(단일층 미셀)에 대하여, 동결건조 후 수용액상에서 형성하는 입자의 크기를 광산란입자분석기(dynamic light scattering, DLS)로 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 1c는 본 발명의 일실시예에 따른 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)에 대하여, 동결건조 후 수용액상에서 형성하는 입자의 크기를 광산란입자분석기(DLS)로 측정한 그래프이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 마우스 직장결장암 모델에서 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와 2중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 종양억제효과를 비교하기 위한 그래프 및 적출된 종양 사진이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 마우스 췌장암 모델(AsPc-1, Xenograft)에서 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와 2중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 종양억제효과를 비교하기 위한 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일실시예에 따라 마우스 췌장암 모델(MiaPaca-2, Orthotopic)에서 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와 2중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 종양억제효과를 비교하기 위한 그래프 및 적출된 종양 사진이다.
도 6은 본 발명의 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와 2중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 약동학적 특성을 비교하기 위한 SN-38 Glucuronide의 혈중 농도 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실험재료
본 발명에 사용한 화합물 중 소수성 및 친수성 캄토테신계 화합물, 트레할로스 등 다당류, 사이클로덱스트린류, 폴리에틸렌글리콜 등은 시그마알드리치(Sigma-Aldrich), AbCem, Toronto Research Chemical(캐나다) 또는 Tocris(미국) 제품을 사용하였고, 고분자는 Akina Inc(미국), Advanced Polymer Materials(캐나다), Shanghai Liang Chemical Co., LTD (중국), NanoSoft Polymer (미국), 삼양바이오팜(대한민국) 제품을 사용하였다.
실시예 1: 소수성 캄토테신 화합물 단독 또는 소수성 캄토테신 화합물과 친수성 캄토테신 화합물을 혼합 용해시, 용매별 용해도
소수성 캄토테신계 화합물인 캄토테신(camptothecin), SN-38(7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin) 단독, 및 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물인 이리노테칸(irinotecan, CPT-11), 토포테칸(topotecan) 또는 벨로테칸(beltotecan, CKD-602)을 함께 용해하였을 때 용매에 따른 용해도 변화를 측정하였다.
1) 소수성 캄토테신 화합물 단독 용해시, 용매별 용해도
소수성 캄토테신 화합물(캄토테신 또는 SN-38) 20 mg을 5 ml의 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 디메틸설폭시드 또는 증류수에 각각 넣고 초음파로 30분간 처리하여 과포화 용액을 제조하였다. 제조한 과포화 용액을 0.45 μm 필터로 여과하고, 여액을 적절히 희석하여 HPLC로 분석하였다.
2) 소수성 캄토테신 화합물 및 친수성 캄토테신 화합물 혼합 용해시, 용매별 용해도
또한, 본 발명자들은 친수성 캄토테신 화합물(이리노테칸 염산염, 토포테칸 염산염 또는 벨로테칸) 20 mg을 5 ml의 에탄올, 아세토니트릴, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디메틸설폭시드 또는 증류수에 각각 넣고, 여기에 소수성 캄토테신 화합물인 SN-38 또는 캄토테신 각 20 mg을 첨가하여 초음파로 30분간 처리하여 과포화 용액을 만들었다. 제조한 과포화 용액을 0.45 μm 필터로 여과하고, 여액을 적절히 희석하여 HPLC로 분석하였다.
HPLC(Agilent 1200 Series, USA) 조건은 다음과 같았다. 컬럼은 CapcellPak C8 (5 m, 4.6 mm Х 25 cm, Shiseido), 이동상은 메탄올: 아세토니트릴: 완충액(2.8 g/L 인산이수소나트륨, 1.8 g/L 1-옥탄설폰산염 수용액) = 17: 24: 59 (v/v)의 혼합용매를, 유속은 1.5 mL/min, 측정파장은 UV 255 nm, 시료주입량은 15 μL였다. 용해도 실험결과는 하기 표 1에 나타내었다.
극성유기용매에 대한 소수성 캄토테신계 화합물의 용해도 변화 (단위: mg/mL)
용매 종류 비교예 시험예 비교예 시험예 시험예 시험예
캄토테신
20mg		 캄토테신
20mg 		SN-38
20mg		 SN-38
20mg		 SN-38
20mg		 SN-38
20mg
- 이리노테칸 20mg - 이리노테칸 20mg 토포테칸
20mg		 벨로테칸
20mg
에탄올 0.149 1.414 0.779 2.885 2.205 2.047
아세토니트릴 0.101 1.090 0.402 1.972 1.694 1.338
클로로포름 0.002 0.051 0.009 0.025 0.088 0.104
에틸아세테이트 0.134 0.295 0.078 0.425 0.239 0.221
디메틸설폭시드 3.291 >4 2.263 3.816 2.949 2.685
증류수 0.009 0.011 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 난용성 화합물인 캄토테신 또는 SN-38은 단독으로는 물을 포함한 대부분의 용매에 거의 용해되지 않았고, 유일하게 비휘발성 용매인 디메틸설폭시드(DMSO)에만 2.26~3.29 mg/mL로 용해되었다. 그러나, 상대적으로 친수성 약물인 이리노테칸, 토포테칸, 또는 벨로테칸과 함께 용해하였을 때에는, 용해도가 최대 15배까지 증가하였으며, 이는 의약품의 제조과정에 필요한 적절한 수준의 용해도이다. 따라서, 상기 결과로부터 휘발성 유기용매에 소수성 캄토테신 화합물과 친수성 캄토테신 화합물을 혼합하여 용해시 용해도가 현저하게 상승한다는 것을 확인하였다.
실시예 2: 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물의 유기용매 하에 1차 코어-쉘(단일층 미셀) 및 2차 코어-쉘(이중코어-쉘입자)의 제조 및 입자크기 평가
본 실시예에서는 소수성 캄토테신계 화합물인 캄토테신, 또는 SN-38과 친수성 캄토테신계 화합물인 이리노테칸 염산염, 토포테칸 염산염, 벨로테칸, SN-38-글루쿠로나이드 또는 양친매성 고분자(PEG-PBLA)를 가지고 유기용매에 용해하여 1차 코어-쉘(단일층 미셀)을 제조하고, 여기에 양친매성 고분자를 추가하여 2차 코어-쉘(이중층 미셀) 입자를을 제조하였다.
1) 1차 코어-쉘(단일층 미셀)의 제조 (비교예 1 내지 6)
단일층 미셀인 1차 코어-쉘 입자는 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 소수성 캄토테신(캄토테신 또는 SN-38)을 주성분으로 포함하고, 미셀 형성을 위한 양친성 화합물로 수용성 캄토테신(이리노테칸 염산염, 토포테칸 염산염 또는 SN-38 글루쿠로나이드) 또는 양친매성 고분자(poly (ethylene glycol)-poly (β-butyrolactone-co-lactic acid); PEG-PBLA)를 사용하여 제조하였다.
구체적으로, 소수성 캄토테신 20 mg에 수용성 캄토테신(이리노테칸 염산염, 토포테칸 염산염, 또는 SN-38 글루쿠로나이드) 또는 PEG-PBLA를 20 mg 넣고, 유기용매(에탄올과 아세토니트릴의 50:50 혼합액) 100 mL을 추가하여 완전히 용해시킨 다음, 회전증발건조기(rotary vacuum evaporator)에서 건조하였다. 건조된 상기 결과물에 증류수 20 mL를 가하고 초음파 세척기(UC-20, 20Hz, 400W, 제이오텍, 한국)로 20~30 ℃에서 20분간 초음파를 처리하여 수용액 내 분산된 상태의 나노 크기의 입자(단일층 미셀)를 얻었다. 상기 나노 크기 입자가 포함된 수용액에 600 mg의 D-트레할로스를 첨가하여 완전히 용해하고, 0.22 μm 멸균필터로 여과한 후 여액을 동결건조 하였다. 동결건조는 -45℃ →?-20℃? →?0℃? →? 20℃? 의 온도 사이클로 총 62시간 동안, 진공압력 100 mTorr 이하에서 진행되었으며, 오페론사(대한민국)의 동결건조기를 사용하였다. 제조된 동결건조물 일정량을 취하여 주사용 증류수에 재용해하고 동적광산란입자측정법(DLS)으로 입자크기를 측정(ZetasizerTM, Malvern, UK)하였다.
2) 이중 코어-쉘(이중층 미셀)의 제조 (시험예 1 내지 4)
본 발명자들은 이중 코어-쉘 구조를 가진 이중층 입자 조성물을 제조하기 위하여, 각 20 mg의 소수성 캄토테신 및 친수성 캄토테신을 유기용매(에탄올-아세토니트릴의 50:50 혼합액) 100 mL를 넣어 용해하고, 회전증발건조기(rotary vacuum evaporator, Buchi사)로 건조하였다. 건조된 상기 결과물에 증류수 20 mL를 가하고 초음파세척기로 20~30 ℃에서 20분간 초음파를 처리하여 수용액 내 분산된 상태의 나노 크기의 코어-쉘 입자(단일층 미셀)를 얻었다. 상기 코어-쉘 입자가 혼합된 수용액을 교반하면서, 증류수 10 mL에 미리 용해한 양친매성 블록고분자인 90 mg의 methoxy poly(ethylene glycol)-poly(lactide) (mPEG-PLA) (mPEG 분자량:PLA 분자량 = 2,000:1,500)을 천천히 첨가하면서 20~30 ℃에서 약 6시간 동안 교반하여 수용액내 분산된 상태의 이중 코어-쉘 입자를 제조하였다. 상기 이중 코어-쉘 입자가 포함된 수용액에 동결보호제로서 600 mg의 D-트레할로스를 첨가하여 용해하고 0.22 μm 멸균필터로 여과한 후, 1차 코어-쉘 입자의 제조방법과 동일한 방법으로 동결건조하여 백색 분말의 동결건조물을 얻었다. 동결건조물 일정량을 주사용수에 재용해하고 입자크기를 측정하였다. 또한 동결건조 전/후의 평균입자크기를 측정하였으며, 200 nm 이상 비율, 분포형태(단일 또는 다중분포)를 비교하였다.
단일층 미셀과 이중층 입자의 제조비율 (단위: mg)
구분 미셀
구분		 난용성캄토테신 수용성캄토테신 PEG-PBLA
(5k:6.5k)		 mPEG-PLA
(2k:1.5k)
캄토테신 SN-38 이리노테칸
염산염		 토포테칸
염산염		 SN-38 glucuronide
비교예1 단일 20 - 20 - - - -
비교예2 단일 20 - - - 20 - -
시험예1 이중 20 - 20 - - - 90
비교예3 단일 - 20 20 - - - -
비교예4 단일 - 20 - 20 - - -
비교예5 단일 - 20 - - 20 - -
비교예6 단일 - 20 - - - 20 -
시험예2 이중 - 20 20 - - - 90
시험예3 이중 - 20 - 20 - - 90
시험예4 이중 - 20 - - 20 - 90
*PEG-PBLA: poly(ethylene glycol)-b-poly(β-benzyl-L-aspartic acid)
*mPEG-PLA: methoxypoly(ethylene glycol)-b-poly(lactic acid)
단일층 미셀과 이중층 입자의 동결건조 전/후 입자크기 비교 결과
구분 미셀구분 동결건조 전(n=3) 입자크기 동결건조 후(n=3) 입자크기
평균입자
크기(nm)		 >200nm
비율(%)		 평균입자
크기(nm)		 >200nm
비율(%)		 >1μm 미셀분포
비교예1 단일 123.9 5.9 156.1 40.1 O 다중
비교예2 단일 133.6 7.1 152.8 38.6 O 다중
시험예1 이중 135.8 3.6 148.9 4.8 ND 단일
비교예3 단일 76.2 0.0 108.4 16.4 O 다중
비교예4 단일 78.5 0.1 115.4 28.5 O 다중
비교예5 단일 92.1 2.7 131.2 30.4 O 다중
비교예6 단일 102.8 5.9 138.4 34.2 O 다중
시험예2 이중 83.3 0.0 93.8 2.4 ND 단일
시험예3 이중 88.2 0.1 99.8 2.8 ND 단일
시험예4 이중 93.3 0.2 105.4 3.1 ND 단일
*ND: 불검출 (Not detected)
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 난용성 캄토테신과 수용성 캄토테신으로 이루어진 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀), 또는 난용성 캄토테신과 양친매성 고분자로 이루어진 1차 코어-쉘 입자는 동결건조 후 평균입자크기가 약 1.2배~1.5배 증가하였으나, 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)는 약 1.1배 증가하는데 그쳤다.
1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)의 경우, 동결건조 후 200 nm 이상의 입자가 약 16~40%로서 다량 생성되었고, 특히 인체에 투여되었을 때 안전성에 영향을 미칠 수 있는 수 마이크로미터(μm) 이상의 입자가 생성되었다(표 3의 비교예 1 내지 6, 도 1a 및 도 1b 참조). 반면, 이중 코어-쉘 입자에서는 200 nm 이상의 입자가 SN-38의 경우 약 2.4~3.1%, 캄토테신의 경우 약 4.8% 검출되어 모두 5% 미만으로써, 매우 양호한 결과를 나타내었으며, 500 nm 이상의 입자는 검출되지 않았다(표 3의 시험예 1 내지 4, 도 1c 참조).
입자의 분포는 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)의 경우 다중피크를 나타내는 분포를 보였으나(도 1a 및 도 1b), 이중 코어-쉘 입자의 경우 단일분포를 나타내어, 매우 안정한 구조임을 확인할 수 있었다(도 1c). 또한, 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)가 동결건조 전 단계에서는 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)보다 평균 입자크기가 약 10 nm 정도 작았으나, 동결건조 전후의 입자크기의 변화가 매우 커서 결과적으로 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 입자가 물리적으로 매우 안정한 것으로 판단되었다.
실시예 3: 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)과 이중 코어-쉘 입자( 이중층 미셀)의 안정성 평가
본 실시예에서는 단일층 미셀(비교예 1, 3, 6)과 이중 코어-쉘 입자(시험예 1, 2)에 대하여 의약품의 안정성시험기준에 따라서 제조된 시제품을 가속시험조건(40℃, 75%상대습도)에서 6개월간 보관하여 입자크기 변화를 비교하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었다.
1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 안정성 시험결과
구분 미셀구분 0 개월 3개월 6개월
평균입자
크기(nm)		 >200nm
비율(%)		 평균입자
크기(nm)		 >200nm
비율(%)		 평균입자
크기(nm)		 >200nm
비율(%)
비교예1 단일 156.1 40.1 172.1 47.6 196.6 58.1
시험예1 이중 148.9 4.8 155.0 5.6 168.3 7.4
비교예3 단일 108.4 16.4 126.7 28.1 151.9 31.6
비교예6 단일 138.4 34.2 149.9 44.6 174.2 48.4
시험예2 이중 93.8 2.4 99.5 3.5 112.9 3.8
캄토테신 또는 SN-38을 주성분으로 하는 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)와, 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 안정성시험 결과, 단일층 미셀의 경우 가속시험 조건에서 평균 입자크기는 약 50%이상 증가하였고, 200 nm 이상의 입자비율이 58%까지 급격히 증가하였다. 반면, 이중층 입자의 경우 평균 입자크기는 약 20% 증가하였고, 200 nm 이상의 입자비율은 SN-38의 경우 3.8%, 캄토테신의 경우 7.4% 이내에서 제한되었다. 따라서, 단일층 미셀보다 본 발명의 이중층 입자 구조가 안정성에서 획기적으로 개선된 것임을 알 수 있었다.
실시예 5: 양친매성 고분자의 종류 및 양친매성 고분자의 분자량에 따른 이중 코어-쉘 입자의 제조
본 실시예에서는 다양한 양친매성 고분자(블록공중합체)를 이용하여 이중 코어-쉘 입자를 제조하였다. 표 5와 같이 소수성 및 친수성 캄토테신 화합물로서 SN-38 및 이리노테칸 염산염을 각각 20 mg, 동결보호제로서 트레할로스 500 mg을 사용하였으며, 각 양친매성 고분자는 90 mg을 사용하였다. 제조방법은 상기 실시예 2의 이중 코어-쉘 입자 제조방법과 동일한 방법으로 실시하였으며, 동결건조 후에 주사용수에 재용해하여 입자크기를 측정하였다.
양친매성 고분자의 종류 및 평균 분자량에 따른 동결건조 후 이중층 입자의 입자크기 비교
번호 고분자의 종류
(평균분자량)		 입자크기
(nm)		 >200nm
비율(%)		 >1μm유무 입자분포
(단일/다중)		 PDI
시험예5 PEG-PCL (5k:2.5k) 133.8 5.0 ND 단일 0.271
시험예6 PEG-PCL(2k:1.5k) 102.0 3.1 ND 단일 0.209
시험예7 PEG-PLA(2.5k:1k) 99.2 2.9 ND 단일 0.225
시험예8 mPEG-PGA(2k:1.5k) 99.7 2.6 ND 단일 0.213
시험예9 mPEG-PLGA(1k:1k) 101.5 3.4 ND 단일 0.247
시험예10 PEG-PBLA(5k:6.5k) 137.9 9.8 ND 단일 0.287
시험예11 PEG-p(Glu)(5k:2.5k) 122.1 6.5 ND 단일 0.245
시험예12 mPEG-p(Asp)(5k:2.5k) 128.2 7.6 ND 단일 0.231
시험예13 PEG-PLA-PEG
(2.5k-1k-2.5k)		 156.4 11.8 ND 단일 0.298
*PEG-PCL: poly(ethylene glycol)-b-poly(caprolactone)
*PEG-PLA: poly(ethylene glycol)-b-poly(lactic acid)
*mPEG-PGA: monomethoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(glycolic acid)
*mPEG-PLGA: monomethoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(lactide-co-glycolide)
*PEG-PBLA: poly(ethylene glycol)-b-poly(β-benzyl-L-aspartic acid)
*PEG-p(Glu): poly(ethylene glycol)-b-poly(glutamic acid)
*PEG-p(Asp): poly(ethylene glycol)-b-poly(aspartic acid)
*PEG-PLA-PEG: poly(ethylene glycol)-b-poly(lactic acid)-b-poly(ethylene glycol)
*PDI: Polydiversity index (분포계수)
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중층 입자는 다양한 양친매성 고분자(블록공중합체) 및 다양한 평균분자량을 갖는 양친매성 고분자를 이용하여 제조될 수 있으며, 입자의 안정성도 우수함을 알 수 있다.
실시예 6: 동결보호제 종류에 따른 입자크기 평가
본 실시예에서는 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀) 및 이중 코어-쉘 입자를 제조함에 있어서 동결보호제의 영향을 관찰하였다. 소수성 캄토테신 화합물로서 10-히드록시캄토테신 및 SN-38을 선정하였고, 친수성 캄토테신으로서 이리노테칸 염산염을 선정하였으며, 양친매성 고분자로는 mPEG-PLA (2k:1.5k)를 사용하였다. 동결보호제는 D-트레할로스, D-만니톨, PEG2000, hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-b-CD)을 각각 500 mg 씩 사용하였다. 이중 코어-쉘 입자를 표 6와 같은 조성으로 제조하였으며, 제조방법은 상기 실시예 2와 동일한 제조방법을 사용하였다.
동결보호제 종류에 따른 이중 코어-쉘 입자의 크기
구분 10-OH 캄토테신
(mg)		 SN-38
(mg)		 이리노테칸
(mg)		 mPEG-
PLA		 동결보호제
(500mg)		 입자크기
(nm)		 >200nm
비율(%)		 >1μm유무
시험예13 20 - 20 90 만니톨 121.8 4.4 ND
시험예14 - 20 20 90 만니톨 101.1 2.9 ND
시험예15 20 - 20 90 트레할로스 118.6 5.8 ND
시험예16 - 20 20 90 트레할로스 99.6 3.1 ND
시험예17 - 20 20 90 PEG2000 133.2 19.6 O
시험예18 - 20 20 - PEG2000 164.9 32.8 O
시험예19 - 20 20 90 HP-b-CD 126.8 9.3 O
시험예20 - 20 20 - HP-b-CD 151.7 26.2 O
*PEG2000: Polyethyleneglycol 2000
*HP-b-CD: hydroxypropyl-β-cyclodextrin
*ND: 불검출(Not detected)
표 6에 나타낸 바와 같이, 동결보호제로 다당류인 만니톨, 트레할로스를 사용하였을 때에는 입자 크기 면에서 양호한 결과를 나타내었다. 반면, PEG2000, HP-b-CD는 1 μm 이상의 크기를 가진 입자가 검출되는 등 입자 크기가 다소 큰 것으로 나타났다. 단일층 미셀인 시험예 18, 및 시험예 20에서는 동결보호제를 폴리에틸렌글리콜류, 및 사이클로덱스트린류을 사용하였을 때, 상대적으로 큰 입자크기와 200 nm 이상 및 1 μm 이상의 거대입자가 관찰되었다.
실시예 7: 수용성 용매 조건에서 1차 코어-쉘 입자 및 이중 코어-쉘 입자의 제조
1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)은 실시예 2와 같이 유기용매에서 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 수용액에서도 제조할 수 있다. 하기 표 7과 같이, SN-38 10 mg을 0.5 M의 수산화나트륨 수용액 0.1 mL에 완전히 용해하고, 이 용액을 미리 0.5 mM의 염산 수용액 15 mL에 용해된 염산 이리노테칸(1mg/mL) 수용액에 점적 및 중화하면서 추가로 염산수용액을 넣어 pH를 5 근처로 조절하고, 초음파처리를 진행하여 1차 코어-쉘 입자(단일층 미셀)를 얻었다. 여기에 양친매성 고분자인 mPEG-PLA 40 mg을 첨가하여 6시간 동안 실온에서 교반하고, D-트레할로스 300 mg을 추가로 첨가하여 용해하였다. 이 혼합액을 0.22 μm 멸균필터로 여과하여 동결건조하고, 주사용수에 재용해하여 입자크기를 측정하였다(시험예 21). 상기와 같은 방법으로 염기성 수용액은 유기알칼리인 에탄올아민을 사용하거나, 또는 산성 수용액으로 유기산인 구연산을 사용하여 SN-38과 염산 이리노테칸을 용해하고 동일한 방법으로 이중층 입자를 제조하여 입자크기를 각각 측정하였다(시험예 22 및 23).
염기성 및 산성 수용액하에서 이중층 입자의 제조
구분 SN-38
(mg)		 이리노테칸
(mg)		 트레할로스 mPEG-PLA
(2k:1.5k)		 산,염기용매의 종류 및 입자크기(nm)
NaOH/HCl Ethanolamine/HCl NaOH/
Citric acid
시험예21 10 10 300 40 120.1 - -
시험예22 10 10 300 40 - 122.3 -
시험예23 10 10 300 40 - - 119.5
표 7에 나타낸 바와 같이, 염기성 및 산성 수용액하에서 소수성 캄토테신 및 친수 및 캄토테신을 용해하여 제조한 이중 코어-쉘 입자는 약 120 nm 내외의 입자크기를 나타내었으며, 성공적으로 제조되었다.
실시예 8: 이중 코어-쉘 입자의 혼합 제조
본 실시예에서는 소수성 캄토테신과 친수성 캄토테신, 및 양친매성 블록공중합체를 한 단계에서 모두 혼합하여 이중 코어-쉘 입자를 제조하는 방법을 개시하였다. 소수성 캄토테신(10-히드록시캄토테신, SN-38)을 각각 염산 이리노테칸 20 mg과 함께 유기용매(에탄올:아세토니트릴의 50:50 혼합액) 100 mL에 넣고 교반하여 완전히 용해하고, 여기에 유기용매(에탄올:아세토니트릴의 50:50 혼합액) 10 mL에 용해된 mPEG-PLA (2k:1.5k) 90 mg을 첨가하면서 교반하였다. 이 혼합액을 회전증발건조기로 건조하고, 잔류물에 증류수 20 mL를 넣어 초음파세척기로 10분간 초음파를 처리하여 본 발명의 이중 코어-쉘 입자를 제조하였다. 동결보호제로서 D-만니톨 400 mg을 넣어 용해하고, 이 액을 0.22 μm 무균필터로 여과 후 동결건조 하였다. 동결건조물 적당량을 주사용수로 재용해하여 입자의 크기를 측정하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.
혼합 제조법으로 제조한 이중 코어-쉘 입자(이중층 미셀)의 입자크기
구분 SN-38
(mg)		 10-OH 캄토테신
(mg)		 이리노테칸
(mg)		 mPEG-PLA
(mg)		 D-만니톨
(mg)		 입자크기
(nm)		 >200nm
비율(%)		 >1μm
유무
시험예24 20 - 20 90 400 125.4 4.2 ND
시험예25 - 20 20 90 400 129.3 4.8 ND
*ND: 불검출 (Not detected)
표 8에 나타낸 바와 같이, 유기용매에 소수성, 친수성 캄토테신, 양친매성 고분자를 동시에 혼합 용해하여 제조한 이중 코어-쉘 입자는 약 120~130 nm의 단일한 입자크기 분포를 나타내었으며, 200 nm 이상 입자가 5% 미만으로 소량 검출되었으나, 1 μm 이상의 입자는 검출되지 않아 전반적으로 양호한 안정성을 가진 것으로 확인되었다.
실시예 9: 마우스 종양모델( 직장결장암 )에서의 1차 코어-쉘 입자( 단일층 미셀)와 이중 코어-쉘 입자( 이중층 미셀)의 종양억제 효력 비교시험
마우스 직장결장암 모델에서 단일층 미셀조성물(비교예 3 및 6), 이중층 입자 조성물(시험예 2)의 다음과 같은 방법으로 항암효과를 측정하였다.
Balb/c 누드마우스에 미리 배양한 대장암 세포주(HT-29)를 5×106 cells/0.2 mL씩 마우스 오른쪽 옆구리에 접종하고 약 7일 후에 종양의 크기가 150~200 mm3 에 도달한 것만 선별하였다. 각 군별로 9마리 씩 배정하고, 각각 위약(비처리군), 비교예 3(단일층 미셀), 비교예 6(단일층 미셀), 시험예 2(이중층 입자)를 3일에 1번, 총 3번 정맥주사로 투여하였다. 투약량은 SN-38을 기준으로 10 mg/kg이었다. 시험 조성물의 투여 후 3일마다 측정한 종양의 부피를 항암효과의 측정지표로 하였으며, 총 18일간 관찰하였다. 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.
종양억제 효과 측정 결과, 단일층 미셀 조성물(비교예 3, 6)은 음성대조군과 비교하여 약 50~60%의 종양억제효과를 나타냈으며, 이중층 입자조성물(시험예 2)은 음성대조군과 비교하여 약 80% 이상의 종양억제효과를 나타내어 매우 우수한 결과를 나타내었다. 이는 본 발명의 안정화된 미셀 구조 및 200 nm 이하의 크기가 작은 미셀 구조가 체내에 안정적으로 체류하면서 암조직에 효율적으로 전달되어 나타난 결과로 판단되었다.
실시예 10: 췌장암 마우스 모델( AsPc - 1)에서 단일층 미셀, 이중층 입자의 종양억제 효력 비교시험
마우스 췌장암모델에서 단일층 미셀 조성물(비교예 3)과 이중층 입자조성물(시험예 2)의 종양억제 효과를 비교하였다. 수컷 BALB/c-nu/nu 마우스에 미리 배양한 췌장암세포주 (AsPc-1 cell line)를 5×106 cells/0.2 mL씩 마우스 오른쪽 옆구리에 접종하고 약 10일 후에 종양의 크기가 100~150 mm3 에 도달한 것만 선별하였다. 각 군별로 10마리 씩 배정하고, 각각 위약(비처리군), 비교예 3, 시험예 2를 7일에 1번, 총 3번 투여하였다. 투약량은 SN-38을 기준으로 10 mg/kg이었다. 시험 조성물의 투여 후 3일마다 측정한 종양의 부피를 항암효과의 측정지표로 하였으며, 총 24일간 관찰하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.
종양억제 효과 측정 결과, 단일층 미셀 조성물(비교예 3)에서는 음성대조군과 비교하였을 때 약 27%의 종양억제효과를 나타내었으나, 이중층 입자 조성물(시험예 2)에서는 음성대조군과 비교하여 약 47%의 우수한 종양억제효과를 나타내었다. 전체적으로 직장결장암모델(실시예 9)과 유사한 결과를 나타내어 본 발명의 이중층 입자 조성물이 단일층 미셀에 비하여 종양억제 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 11: 췌장암 마우스 모델( MiaPaca - 2)에서 단일층 미셀, 이중층 입자조성물의 종양억제 효력 비교시험
SN-38의 마우스 췌장암모델(Orthotopic)에서 단일층 미셀 조성물(비교예 3)과 이중층 입자 조성물(시험예 2)의 종양억제 효과를 비교하였다. 수컷 BALB/c-nu/nu 마우스의 왼쪽 옆구리 부분을 0.7~1 cm 절개한 후 췌장 전체부위와 비장을 밖으로 노출시킨 뒤, 주사기를 이용하여 미리 배양한 췌장암세포주 (MiaPaca-2 cell line)를 1×107 cells/0.1 mL씩을 주사하였다. 종양세포 현탁액이 유출되지 않는 것을 확인하고 밖으로 노출된 장기를 다시 재 위치 시킨 뒤, 절개부위를 수술실로 봉합하였다. 상기 췌장암세포주 접종 후 약 10일 뒤 체중을 근거로 군분리를 실시하였으며, 각 군별로 10마리 씩 배정하고, 각각 위약(비처리군), 비교예 3, 시험예 2를 7일에 1번, 총 3번 투여하였다. 투약량은 SN-38을 기준으로 20 mg/kg이었다. 총 28일간 관찰하였으며, 28일차에 부검하여 종양의 크기와 무게를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.
종양억제 효과 측정 결과, 비처리군(음성대조군)의 종양무게는 평균 0.46±0.17 g, 단일층 미셀 조성물(비교예 3) 처리군의 종양무게는 0.37±0.09 g, 이중층 입자 조성물(시험예 2) 처리군의 종양무게는 0.21±0.05 g으로서 이중층 입자 조성물은 단일층 미셀 대비 55% 이상의 종양억제효과를 나타내어 매우 우수한 종양억제 효과를 나타내었다.
실시예 12: 비글견에서 약동학 시험
비글견에서 단일층 미셀 조성물(비교예 3)과 이중층 입자 조성물(시험예 2)의 약동학적 특성을 비교하였다. 체중 7~10kg인 수컷 비글견을 군당 3마리 총 2군으로 체중에 따라 분리하고, 단일층 미셀 조성물(비교예 3)과 이중층 입자 조성물(시험예 2)을 각각 SN-38를 기준으로 0.5 mg/kg을 10분간 정맥주사하였다. 투여 종료 후 각각 0.33, 0.67, 1, 1.5, 2, 4, 8, 12, 24, 36시간 후 채혈하였고, 혈액을 원심분리하여 얻은 혈장을 다음과 같은 방법으로 전처리하여 혈장 중 약물농도를 측정하였다. 시료전처리는 먼저 혈장 100 μL에 내부표준물질로서 S-(+)-캄토테신 (500 ng/mL, 아세토니트릴에 용해)를 20 μL 첨가하고 아세토니트릴 500 μL를 추가로 첨가한 후 30초간 볼텍싱(vortex-mixing)하였다. 이 혼합물을 12,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상등액을 취하여 LC-MS/MS 시스템(API-5,000모델, AB Sciex)에 2 μL 주입하였다. 컬럼은 Gemini C18 (3 μm, 2.0x50 mm, Phenomenex, 미국), 이동상은 0.1% 포름산을 포함하는 50% 아세토니트릴액, 유속은 0.25 mL/min에서 분리하였다. MS/MS 검출조건은 positive ion mode, SN-38 glucuronide는 m/z 569.3 → 393.2, 내부표준물질은 m/z 349.2 → 305.2에서 각각 검출하였다.
투여 후 시간에 따른 혈중 약물 농도는 도 6에 나타내었고, 이의 약동학적 파라미터는 표 9에 나타내었다.
단일층 미셀 및 이중층 입자 조성물의 약동학적 파라미터 비교
번호 미셀구분 투여량
(mg/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax(hr) AUCt
(ng.hr/mL)		 Relative BA(%)
비교예3 단일층미셀 0.5 25.30±5.12 0.33±0.00 131.84±34.94 -
시험예2 2중코어-쉘 0.5 66.25±16.34 0.44±0.20 361.29±96.25 275.6
*평균±표준편차(n=3)
비글견에서, 본 발명의 입자에서 가용화된 SN-38로부터 직접 생성되는 SN-38 글루쿠로나이드를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 이중층 입자가 단일층 미셀에 비하여 약 2.75배의 생체이용율 증가를 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 이중층 입자는 생체 내에서 난용성 약물인 SN-38의 용해도를 극대화하는 것으로 판단되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (19)

  1. 다음을 포함하는 입자:
    i) 소수성 캄토테신계 화합물, ii) 친수성 캄토테신계 화합물, 및 iii) 소수성 블록 및 친수성 블록으로 이루어진 양친매성 블록 공중합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물은 SN-38(7-에틸-10-히드록시캄토테신), 캄토테신, 10-히드록시캄토테신 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 친수성 캄토테신계 화합물은 이리노테칸, 토포테칸, 벨로테칸, 엑사테칸, 루르토테칸, 시노테칸, 루비테칸, 9-니트로캄토테신, 9-아미노캄토테신, 지마테칸, BNP-1530, DB-67, BN-80915, BN-80927, 이들의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 글루쿠로나이드 대사체, 및 상기 소수성 캄토테신계 화합물의 글루쿠로나이드 대사체로부터 선택되는 1종 이상인, 입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 양친매성 블록 공중합체는 A-B 또는 A-B-A 블록으로 구성된, 입자:,
    (a) 상기 A는 친수성 고분자로 모노메톡시폴리에틸렌글리콜, 디메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 모노메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리아크릴산 또는 이들의 중합체이고;
    (b) 상기 B는 소수성 고분자로 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리글리콘산, 폴리글리콜라이드, 폴리락트산-글리콘산 공중합체, 폴리만델릭산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리글루탐산, 폴리아스파라긴산, 폴리오르니틴, 폴리오르토에스터, 이들의 유도체, 또는 이로부터 선택된 2 이상의 화합물의 공중합체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 친수성 고분자 A의 수평균 분자량은 500 내지 10,000 Da인, 입자.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 소수성 고분자 B의 수평균 분자량은 500 내지 10,000 Da 인, 입자.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 상기 친수성 캄토테신계 화합물의 중량비는 1:10 내지 10:1 인, 입자.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 합과, 양친성 블록 공중합체의 중량비는 1:200 내지 10:1인, 입자.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 입자의 수평균 입자크기는 10 nm 내지 500 nm 인, 입자.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 다음을 포함하는 이중 코어-쉘(core-shell) 구조인, 입자:
    (a) 상기 친수성 캄토테신계 화합물과 소수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘; 및
    (b) 상기 양친매성 블록 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 입자는 이중층 미셀(micelle) 구조를 갖는 것인, 입자.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제 12 항의 약제학적 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
  14. 다음의 단계를 포함하는 입자의 제조방법:
    (a) 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 포함하는 내부 코어-쉘을 형성하는 단계; 및
    (b) 양친매성 공중합체를 포함하는 외부 코어-쉘을 형성하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고;
    상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 소수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 염기성 수용액과, 친수성 캄토테신 화합물을 용해시킨 수용액을 혼합하는 단계를 포함하고;
    상기 (b) 단계는 상기 내부 코어-쉘과 양친매성 블록 공중합체를 수성 용매에서 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물과 친수성 캄토테신계 화합물을 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함하고;
    상기 (b) 단계는 상기 소수성 캄토테신계 화합물 및 친수성 캄토테신계 화합물의 혼합물을 양친매성 블록 공중합체와 유기용매에서 혼합하는 단계를 포함한다.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기용매는 C1 내지 C5의 알코올, 알킬아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 클로르포름, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 아세톤, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소, THF(Tetrahydrofuran),중 선택되는 1종 이상을 포함하는 혼합용매인, 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 염기성 수용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 인산이수소나트륨, 인산이수소칼륨, 수산화마그네슘, 탄산나트륨, 및 탄산수소나트륨으로 이루어진 무기알칼리, 유기산의 알칼리염, 및 알킬아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 방법.
KR1020180072357A 2017-06-22 2018-06-22 이중 코어-쉘 구조를 가지는 난용성 캄토테신 화합물을 포함하는 입자, 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 KR102094543B1 (ko)

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