CN110623944B

CN110623944B - 一种胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN110623944B
Application number: CN201810638420.0A
Authority: CN
Inventors: 刘忠
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-06-20
Also published as: CN110623944A

Abstract

本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及一种胰高血糖素样肽‑1类似物缓释微球制剂及其制备方法。所述微球重量组分包括10‑25份胰高血糖素样肽‑1类似物，1‑5份β‑环糊精衍生物，100份PLGA和聚己内酯混合物，15‑25份PEG，其中PLGA和聚己内酯的质量比为1：0.2‑1。采用复乳‑乳化溶剂挥发法制备包载胰高血糖素样肽‑1类似物的载药微球，本发明制备的微球释药周期长，药物稳定性良好，安全性高，具有广阔的应用前景。

Description

一种胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及了一种胰高血糖素样肽-1类似物的缓释微球制剂及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种全球性疾病，是人类健康的主要威胁之一。近年来，全球糖尿病病患人数急剧增加，估计到2030年，全球的患者数量将超过3亿，其中Ⅱ型糖尿病占据患者总数的90％以上。

胰高血糖素样肽1(glucagon likepeptide-1,GLP-1)是一种能够增加胰岛素分泌的葡萄糖依赖性促胰岛素激素，仅在高血糖浓度时增加胰岛素的分泌，而在正常血糖浓度时并无此作用；此外，GLP-1还能够减缓β细胞凋亡，促进其再生，为2型糖尿病的治疗提供了新选择。由于GLP-1在体内半衰期很短，被二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV) 的快速降解和肾脏代谢作用，使其临床应用受到了很大限制。因此，近年来人们不断致力于开发更稳定的新型GLP-1类似物，以抵抗其在体内的降解，延长GLP-1的生物半衰期。

GLP-1类似物作为一类多肽药物，目前只能注射给药，为了提高患者顺应性，缓释注射剂、非注射给药成为这一类药物研发的主要方向。通过结构修饰，掩盖DPP-Ⅳ酶位点，延长生物半衰期，是目前最主流的做法。这种结构修饰包括链接高分子蛋白和聚乙二醇修饰两种，一周一次的阿必鲁肽和杜拉鲁肽就属于典型的前一种。阿必鲁肽是将2个GLP-1 分子通过基因工程的方法和人血清白蛋白相连，构建成具有长效作用的GLP-1融合蛋白。由于阿比鲁肽分子既能抵抗DPP-Ⅳ对GLP-1的降解作用，同时也能与血浆白蛋白结合，使其在体内血清半衰期达到5-8天。杜拉鲁肽是将天然GLP-1(7-37)氨基酸序列中第8位的 Ala替换为Gly以抵抗DPP-Ⅳ酶的切除，还将第22位的Gly替换为Glu，36位的Arg替换为Gly。然后通过GGGGSGGGGSGGGGS将GLP-1分子和人IgG4抗体Fc片相连。通过与Fc片段链接，杜拉鲁肽可降低药物在体内的免疫原性以及延缓肾脏对药物的清除。

对GLP-1及其类似物进行PEG修饰可以使其稳定性增加，不易被DPP-Ⅳ水解，且PEG化的化合物分子量增加后能延缓肾脏对其的清除。尽管已有多个聚乙二醇修饰蛋白或多肽药物上市，但聚乙二醇修饰GLP-1类似物起步较晚，仅索玛鲁肽进入三期临床。当然也有的公司通过制剂的手段，制成缓释微球，实现一周一次给药，典型的产品就是艾塞那肽。也有的公司直接避开了注射给药的弊端，开发植入、口服、透皮和吸入之类的产品，其中口服给药是最理想的给药途径，但是需要解决GLP-1类似物在肠胃中被胃酸、酶破坏和吸收等诸多难题，以提高生物利用度，降低个体差异。

由于糖尿病是慢性病，需要长期治疗，而现有的GLP-1类似物制剂药物作用时间短，需要每日或每周注射给药，长期注射给患者带来了很大的痛苦和不便，致使患者的依从性很差，临床上急需一种长效且具有缓释作用的GLP-1类似物制剂以减轻患者的痛苦，提高患者的依从性。因此，为临床提供一种GLP-1类似物的长效缓释制剂具有重要的现实意义。

现有的GLP-1类似物缓释微球制剂一般使用PLGA作为载体。PLGA是FDA批准的可安全使用的药用高分子材料，其作为微球载体具有低免疫性，良好的生物相容性及可调控的降解性等优点，因此在药物(包括蛋白、多肽、基因等)缓释领域被广泛研究。PLGA 的体内降解通过聚合物连接单元的酯键水解完成，最终降解产物是乳酸(LA)和羟基乙酸 (GA)。由于聚合物降解为两种酸性物质，所以微球降解过程中内部微环境的pH值持续降低，所产生的酸环境可以引起药物活性的丧失，而GLP-1类似物作为一种多肽药物易受酸碱因素等条件的影响，进而影响药品质量，因此，因酸性降解产物的积累而导致的微球内部的酸化是PLGA微球的一个严重的弊端。

CN201110030083.5公开了一种利拉鲁肽长效微球注射剂及其制备方法，将利拉鲁肽、 PLGA、赋形剂和表面活性剂按一定比例通过复乳法制备长效微球，微球的释药周期达到 28天，但该微球的制备处方中并未加入保护剂，微球降解产生的酸性微环境可导致多肽的不稳定，增加了微球制剂的安全风险。

CN201410595322.5公开了一种利拉鲁肽缓释微球制剂及其制备方法，以PLGA作为微球的载体材料，将赖氨酸作为保护剂与利拉鲁肽加入内水相，采用W/O/W复乳法制备包载利拉鲁肽的载药微球，以防止PLGA降解过程引起的局部酸化的现象，避免利拉鲁肽失活。但碱性保护剂的加入增加了微球使用的风险，并且局部碱性环境同样会导致蛋白药物的失活和变；该方法制备的载药微球的累计释放周期<12天，作为长效制剂释放时间较短，需要进一步延长释放时间，改善释药周期。

CN201410595323.X公开了一种改进的艾塞那肽缓释微球制剂及其制备方法，将一定比例的PLGA-PCL的共聚物作为基质材料，通过复乳法制备包载艾塞那肽的缓释微球。该发明载体材料的PLGA用量较少，可以一定程度上缓解内部酸环境，但制备的载药微球释药时间较短，释药周期为15天。

CN201310364246.2公开了一种具有分层结构和海岛型形貌PLGA/PCL复合微球的制备方法，将PLGA和聚己内酯(PCL)以1：1-3的比例溶于二氯甲烷中制备双层微球，以减缓药物的快速释放，延长药物的释放时间，经验证该方案必须加入较多的PCL才能使其形成双层结构，由于PCL的降解周期长达20个月，较多的PCL将延长载体材料在体内降解的时间。且处方中并未加入保护剂，无法解决多肽不稳定的问题。

采用现有技术中的方法或常规方法制备的GLP-1类似物缓释制剂存在不稳定、突释、包封率和载药量不理想，释药周期短等诸多缺点，因此制备一种安全、有效、稳定的长效胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球十分必要。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种GLP-1类似物缓释微球及其制备方法，本发明在制备过程中，发明人意外发现GLP-1类似物的内水相中加入β-环糊精后可以起到保护多肽药物的作用，且在微球聚合物材料中加入少量PEG可以使微球表面产生孔洞，增加微球的渗透性，从而提高微球内部酸性物质排出的速度。同时，在PLGA中加入少量聚己内酯(PCL)后，在PEG的作用下，即可加速PLGA和PCL的相分离，形成PLGA/PCL双层微球结构。避免了微球的突释现象，改善了释药特性，又能延长微球的释药周期。

本发明采用的技术方案为：

一种胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂，含有以下重量份的成分：

所述胰高血糖素样肽-1类似物为艾塞那肽，利拉鲁肽，索玛鲁肽，阿必鲁肽，杜拉鲁肽，利司那肽中的一种。

所述聚合物共混物为PLGA和聚己内酯(PCL)的混合物。

所述PLGA和聚己内酯(PCL)的质量比为1:0.2-1。

所述PLGA为聚丙交脂-乙交酯共聚物，其中丙交酯与乙交酯单体的摩尔比为(90-60)： (10-40)。

所述释放调节剂为PEG-800，PEG-1000，PEG-1500，PEG-2000，PEG-3000，PEG-4000，PEG-6000中的一种。

所述PEG为PEG-1500，PEG-2000中的一种。

所述β-环糊精衍生物为羟丙基、羟乙基、甲基、乙基、磺丁基的β-环糊精取代物中的一种。

所述胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂采用复乳-乳化溶剂挥发法制备；具体包括如下步骤：

1)将胰高血糖素样肽-1类似物和β-环糊精衍生物溶于灭菌注射用水，作为内水相；

2)将PLGA、聚己内酯(PCL)和PEG加入二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液溶解，作为有机相；

3)将步骤1)的内水相在高速乳化条件下加入到步骤2)的有机相中，混合均匀，即得初乳；

4)将步骤3)所得初乳在高速搅拌条件下滴加到4℃聚乙烯醇溶液中，低速搅拌挥干有机溶剂，过1200目筛网收集微球；

5)将步骤4)所得微球用注射用水洗涤多次，冻干保存。

所述二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1:1。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)微球释药特性良好，无突释现象，释药周期长达30天，提高了患者的用药依从性。

(2)微球降解产生的酸性产物可及时释放，避免微球内部酸化现象的发生，保证了活性药物的稳定性，提高了用药安全性。

(3)微球制备方法只需简单乳化，挥发有机溶剂即可，简便易操作，便于工业化生产，应用前景广阔。

附图说明

图1：实施例1-6微球内环境I_640nm/I_580nm变化曲线；

图2：对比实施例1-9微球内环境I_640nm/I_580nm变化曲线；

图3：实施例1-6微球体外释放曲线；

图4：对比实施例1-9微球体外释放曲线。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明。应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明而给出，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。

实施例1

1)处方

2)制备工艺：

a)将利拉鲁肽和羟丙基-β-环糊精溶于灭菌注射用水，作为内水相，利拉鲁肽在内水相中的质量-体积浓度为200mg/mL；

b)将聚合物共混物和释放调节剂加入二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液(1:1，v/v)溶解，作为有机相，聚合物共混物在有机相的质量-体积浓度为300mg/ml；

c)将步骤a)的内水相在23000rpm高速搅拌下加入到步骤b)的有机相中，乳化时间30s，混合均匀，即得初乳；

d)将步骤c)所得初乳在1500rpm搅拌条件下滴加到4℃聚乙烯醇溶液中，600rpm低速搅拌挥干有机溶剂，过1200目筛网收集微球；

e)将步骤d)所得微球用注射用水洗涤5次；冻干保存。

实施例2

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

实施例3

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

实施例4

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

实施例5

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

实施例6

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例1

1)将30mg利拉鲁肽溶于lml注射用水中，同时加入3mg赖氨酸，制得内水相；利拉鲁肽在内水相中的质量-体积浓度为30mg/mL，赖氨酸在内水相中的溶度为3％；

2)将100mg聚乳酸羟基乙酸共聚物(其中聚乳酸羟基乙酸共聚物的聚乳酸与羟基乙酸的比例为1:1,Mw＝15000)溶于二氯甲烷2ml中，制得油相；聚乳酸羟基乙酸共聚物在油相中的质量-体积浓度为300mg/mL；

3)将步骤1)中的内水相和步骤2)中的油相混合，并在100w的超声破碎仪下混合超声 30s，得初乳W₁/O；内水相与油相的体积比为1:2-1:100；

4)将聚乙烯醇溶于水，制得5％PVA醇溶液60m1作为外水相，再将步骤3)中的初乳W₁/O迅速滴入外水相中，在10000rpm的转速下乳匀5分钟，制成W₁/O/W₂型复乳，初乳 W₁/O与外水相的体积比为1:5-1:500；

5)将步骤5)中的W₁/O/W₂复乳移入1％的聚乙烯醇溶液60m1中，在600rpm的转速下搅拌6h，乳液固化成微球。过滤收集得到的微球，依次用蒸馏水多次洗涤，再用适量50％的乙醇水溶液洗去微球表面吸附的游离药物，真空冷冻干燥。

对比实施例2

1)称取利拉鲁肽400mg，加入80m1注射用水中，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2)称取PLGA(75/25，分子量为10000道尔顿)4g，加入100m1丙酮，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3)将步骤2)的有机相加入到步骤1)的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在40℃水浴上加热，超声乳化，冷却至13℃，得初乳；

4)按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1:10，将初乳加入到已冷却至13℃的2％聚乙烯醇溶液(含聚乙烯醇与生理盐水的质量体积比2g/100m1，下同)中，高速(6000r/min)搅拌2分钟得复乳；

5)按照复乳与生理盐水的体积比为1:50，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(60r/min)搅拌3小时，挥干丙酮，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤3次，得微球。

对比实施例3

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例4

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例5

1)处方

2)制备工艺：

a)将利拉鲁肽溶于灭菌注射用水，作为内水相，利拉鲁肽在内水相中的质量-体积浓度为200mg/mL；

b)将聚合物共混物和释放调节剂加入二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液(1:4，v/v)溶解，作为有机相，聚合物共混物在有机相的质量-体积浓度为200mg/ml；

e)将步骤d)所得微球用注射用水洗涤5次；冻干保存。

对比实施例6

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例7

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例8

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

对比实施例9

1)处方

2)制备工艺：制备工艺同实施例1。

验证实施例

1.微球内部酸环境的测定

将GLP-1类似物和β-环糊精用pH敏感的荧光染料SNARF-1dextran(Mw＝10kD)替换，其他处方不变，将SNARF-1dextran装载进入微球，当染料所处环境为中性时，微球会发出黄色荧光，当染料所处环境为酸性时，微球发出红色荧光，所以检测微球荧光值变化即可判断微球内部pH微环境。采用共聚焦激光显微镜检测微球在580nm和640nm的荧光值，SNARF-1dextran染料在640nm与580nm的荧光强度比值与pH呈相关性，pH 越低，I₆₄₀nm/I₅₈₀nm越小，pH越高则该比值越大。

2.累计释放率的测定

准确称取微球50mg，置于10ml离心管中，加入1ml 0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，置于恒温水浴摇床中，100rpm、37℃条件下进行微球的体外释放测定。分别于2h，6h，12h， 1d，2d，4d，6d，8d，10d，12d，14d，16d，18d，20d，22d，24d，26d，28d，30d取出离心管，4000rpm离心10min，将全部释放溶剂取出并更换同体积同温度的新的释放溶剂，测定利拉鲁肽的含量，并计算累计释放率，绘制累计释放曲线。

取本发明实施例1-6和对比实施例1-9的样品，按上述方法分别测定微球内部微环境 I_640nm/I_580nm的比值及其体外释放度，并计算累计释放率，绘制体外释放曲线，见图1-图4。

从图1中可以看出，实施例1-6在微球未开始释放时，I_640nm/I_580nm为0.60左右，说明I_640nm/I_580nm比值为0.60时微环境为中性。实施例1-6随着时间的延长，比值在0.60上下波动，最低值为0.48。图3中实施例1-6体外释放曲线显示，实施例1-6微球释药平稳，周期约为30天，无突释现象。

对比实施例1和2为现有技术，对比实施例3中PEG分子量过高，对比实施例4中PEG加入过多，对比实施例5中PLGA型号为50:50，对比实施例6未加入PEG，对比实施例7未加入PCL。从图2中对比实施例1-9微球内环境I_640nm/I_580nm变化中可以看出，对比实施例1释放前15d 时，内部微环境为碱性，增加了微球内环境不稳定因素；对比实施例2-7随着微球降解时间的延长，I_640nm/I_580nm开始降低，最低值分别为0.30，0.40，0.42，0.40，0.39，0.40，低于实施例1-6，这表明微球内环境酸性显著增强。

图4中对比实施例1-9的体外释放曲线显示，对比实施例1释药周期为14d，时间较短；对比实施例3、4和7微球有突释现象，释药第1天，累积释放率即大于50％；对比实施例8中 PLGA:PCL为1:4，虽然I_640nm/I_580nm变化不明显，但由于PCL降解缓慢，导致药物无法达到有效释放，释放前4天累积释放率<10％，体内释放时难以达到有效血药浓度。对比实施例9中未加入β-环糊精衍生物，对多肽的保护作用减弱，微球最终累计释药量78％，低于实施例的 93％。

本发明制备的GLP-1类似物缓释微球释药稳定，周期较长，无突释现象，且能避免聚合物降解过程中局部酸化现象的发生，提高了患者的依从性和用药安全性。

Claims

1.一种胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂，其特征在于，含有以下重量份的成分：

其中，所述胰高血糖素样肽-1类似物为艾塞那肽，利拉鲁肽，索玛鲁肽，阿必鲁肽，杜拉鲁肽，利司那肽中的一种；所述β-环糊精衍生物为羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、甲基-β-环糊精、乙基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精中的一种；所述聚合物共混物为PLGA和聚己内酯的混合物，所述PLGA为聚丙交脂-乙交酯共聚物，其中丙交酯与乙交酯单体的摩尔比为90-60:10-40，PLGA和聚己内酯质量比为1：0.2-1；所述释放调节剂为PEG-800，PEG-1000，PEG-1500，PEG-2000，PEG-3000，PEG-4000，PEG-6000中的一种。

2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂，其特征在于，所述释放调节剂为PEG-1500或PEG-2000。

3.一种权利要求1~2任一项所述胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，制备方法为复乳-乳化溶剂挥发法；具体包括如下步骤：

2)将PLGA、聚己内酯、PEG加入二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液溶解，作为有机相；

5)将步骤4)所得微球用注射用水洗涤多次，冻干保存。

4.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-1类似物缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中二氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为1:1。