CN102085355B - 一种利拉鲁肽长效微球注射剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提到了一种降糖药的长效微球注射剂，该长效微球注射剂由利拉鲁肽、PLGA、赋形剂和表面活性剂组成，同时还涉及该注射剂的制备方法。本发明提供的利拉鲁肽长效缓释微球设计为28天皮下注射一次，极大减轻了患者的治疗负担，提高了用药依从性，降低了治疗成本，同时，在体外释放研究、动物实验等结果证实，所得到的缓释微球在体外、体内均能长期缓慢释放药物。

Description

一种利拉鲁肽长效微球注射剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种降糖药的长效制剂，具体涉及一种利拉鲁肽长效微球注射剂及其制备方法。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种全球性的高发病，据世界卫生组织最新公布数据显示，2007年全球糖尿病患者人数已达1.8亿，且发病率仍逐年增加，预测到2025年，全球糖尿病患者人数将达3亿。

随着我国经济的快速发展，我国糖尿病的发病率逐年增高，特别是近几年来，每年发病率增长达10％以上，据流行病学统计，我国目前糖尿病患者近5000万，由于糖尿病涉及全身各个系统，甚至诱发许多致使性并发症，严重影响人的劳动能力，并威胁人的生命安全，对人们的健康形成了极大的危害。

糖尿病主要分为I型和II型，后者占糖尿病患者总数的90％以上。II型糖尿病患者多存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足两方面异常，在发病的中晚期往往出现胰岛β细胞凋亡。

目前临床使用的口服降糖药主要包括磺脲类、双胍类、α糖苷酶抵制剂类、噻唑烷二酮类、促胰岛素分泌剂类等，上述品种的作用机理多为增强胰岛素敏感性或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法解决β细胞凋亡这一难题。

随着糖尿病治疗机理的深入研究，保护胰岛β细胞功能和降低血糖被认为具有同等重要的意义，自此，以肠促胰岛素为基础的降糖药物研究，包括人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物和二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂等具有潜在保护胰岛β细胞功能的药物进入了人们的视野，并成为研究的焦点。DPP-IV抑制剂西格列汀、维格列汀，以及GLP-1类似物利拉鲁肽陆续在获批上市，临床用于糖尿病的治疗。

利拉鲁肽(Liraglutide)是由诺和诺德公司研发的GLP-1类似物，结构如式1。该药物2010年1月25日在美国批准上市，剂型是皮下注射，每日只需皮下注射1次即可发挥良好的降糖作用。

式1

利拉鲁肽是通过对人体内天然GLP-1分子作了一定改变后获得的GLP-1类似物，它在天然GLP-1分子结构上更换了一个氨基酸，并增加了一个16碳棕榈酰侧链，与天然GLP-1高度同源。正是由于这个脂肪酸侧链的存在，使其不易被DDP-IV降解，并能与白蛋白结合从而增加代谢稳定性，延长半衰期至12～14小时，只需每日皮下注射1次。

由于糖尿病是慢性疾病，需要长期治疗，每日皮下注射利拉鲁肽，由于长期注射给药，患者苦不堪言，治疗的依从性很差，因此，临床亟待提供每月给药一次，工艺简单，易于推广应用的长效治疗药物，以提高患者的依从性并降低治疗费用，减轻患者负担。

可注射缓释控制给药系统具有如下优势：可延长药物作用时间，避免频繁注射，提高了患者的顺应性；血药浓度稳定，峰谷波动小，降低了不良反应；有些可具备注射，具有靶向的优点，减少药物可全身应用的系统毒性；可避免药物的肝首过效应；治疗效果高，减少了临床制剂配发、服药和监护的工作量，而使总的治疗费用降低。

可注射缓释控制给药系统根据粒径大小分为三种：溶液型、胶体型和混悬型，微球为可注射缓释控制给药系统中混悬剂的一种，它是一种将药物分散或包埋在多聚物中，形成粒径为微米级的球状载体给药系统，自1986年，法国易普森生物技术公司生产的长效达一个月之久的曲普瑞林PLGA微球上市以来，微球控制释放系统在医学领域得到广泛应用，除了具备其他生物可降解控释系统的优点外，还具有对特定器官、组织的靶向性。此后，亮丙瑞林、布舍瑞林的PLGA控释微球制剂也陆续上市。1989年，日本武田公司研制的醋酸亮丙瑞林注射微球，一种每月注射一次的强效促性腺激素释放激动剂，在美国、日本等国上市；1995年，3个月注射一次的微球制剂在美国批准用于临床。

上市的亮丙瑞林长效微球注射剂由亮丙瑞林、PLA(聚丙醇酸)、甘露醇、CMC-Na、聚山梨酯80组成，可以达到3个月的长效。

自上世纪80年代以来，生物降解材料在国内外得到了广泛应用和研究，包括聚酯类、聚α氨基酸类以及淀粉和壳聚糖等，其中最常用聚酯类有聚乳酸(PLA)、聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)等，具有良好的组织相容性、生物可降解性和可塑性。

近年来，国内也有上海丽珠公司和北京博思特公司的亮丙瑞林注射用微球获得了国家食品药品监督管理局的批准，但一直没有生产上市，主要技术难点在于释放度和包封率控制达不到工业化生产要求，导致无法正常工业化生产。

通过检索，现有技术中没有关于利用生物可降解材料制备长效降糖微球注射剂的报导，现有的降糖药物除胰岛素外均以口服给药为主。

聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物(又名为聚乳酸-羟基乙酸)(PLGA)等生物可降解高分子材料制备注射给药的长效微球是目前制药工业广泛认同并应用的制剂技术，其中PLGA为常用于制备微球的辅料，该聚合物有良好的生物相容性、无免疫反应、安全性高(最终降解为二氧化碳和水)，可通过调节两单体比例及聚合条件调节其降解速度。

胰岛素作为临床常用注射给药降糖药物，主要利用结构修饰进行长效改造，临床给药一日一次。中国专利CN1562356公开了一种载有胰岛素的可生物降解高分子微球，临床可用于口服或粘膜给药，未见有工业化生产的报道。

利拉鲁肽分子结构庞大，在皮下注射，注射部位形成胶态分子团样聚集体，导致吸收过程缓慢，利拉鲁肽分子内部联系牢固，化学稳定性强，不易被DPP-4降解，导致失活速度减慢，另外，利拉鲁肽与血浆白蛋白结合，形成可逆的药物-白蛋白复合体，不仅暂时避开DPP-4的降解，还因利拉鲁肽缓慢释放而导致分布过程缓慢。

针对利拉鲁肽半衰期为长的优势，如果将其制备成长效制剂，不能保证该药物能快速释放，并在药效期间内保持一定浓度，这也是目前国内外上市的长效微球注射剂少的原因之一。同时，是否可以改变现在临床上没有长效糖尿病治疗药物的现状，针对糖尿病是高发、常见的慢性病，病人需要长期注射给药，如何保证患者的依从性是个非常困难的事情，如果能将利拉鲁肽制备成长效制剂，将会为临床提供一种非常有效的糖尿病治疗手段。

发明人为了将利拉鲁肽制备成长效缓释微球注射剂，分别采用亮丙瑞林和丙氨瑞林的缓释微球CN200810138538.3的配方，发现制备的微球包封率很低，且突释现象严重，针对出现的问题，发明人重点以包封率和释放度两个指标，对利拉鲁肽的制备工艺进行了广泛的研究和筛选，重点对有机溶剂、连续相和乳化剂的种类和使用量进行了筛选，确定了利拉鲁肽长效微球的处方和工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种由生物可降解材料制成的利拉鲁肽长效微球注射剂，解决每日一次注射的繁琐。

本发明还提供了一种利拉鲁肽长效微球注射剂的制备方法。

本发明提供的一种利拉鲁肽长效微球注射剂，由以下重量份的成分组成：

利拉鲁肽             5-500份

PLGA                 50-5000份

赋形剂               100-5000份

表面活性剂            0.1-100份。

优选地，所述微球注射剂由以下重量份的成分组成：

利拉鲁肽              20-200份

PLGA                  200-2000份

赋形剂                500-3000份

表面活性剂            1-10份。

更优选地，所述微球注射剂由以下重量份的成分组成

利拉鲁肽              40-100份

PLGA                  400-1000份

赋形剂                750-2500份

表面活性剂            3-7份。

本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等医药领域公知的含量单位。

所述PLGA是聚乳酸-羟基乙酸，又名聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚丙交酯-乙交酯共聚物，其中丙交酯与乙交酯单体的摩尔比为40∶60-95∶5，优选的是50∶50-90∶10，更优选是65∶35-85∶15，PLGA分子量为5000-200000道尔顿，优选最合适的为分子量为10000-100000道尔顿。

所述赋形剂选自聚乙二醇、葡萄糖、氯化钠、蔗糖、木糖醇、山梨醇或甘露醇中的一种或几种。

所述表面活性剂选自吐温、泊洛沙姆或司盘中的一种或几种，其中吐温为吐温-80，泊洛沙姆为泊洛沙姆-188，司盘为司盘-20或司盘-80。

本发明所述的利拉鲁肽长效注射微球粒径20-100μm，优选的为40-80μm。

本发明所述的利拉鲁肽长效注射微球，是一种灌装在西林瓶中的冻干粉针，其制备方法如下：

1)将利拉鲁肽加入到注射用水中，水浴加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2)称取PLGA，加入有机溶剂，使PLGA完全溶解，作为有机相；

3)将步骤2)的有机相加入到步骤1)的内水相中，混合均匀，加热，超声乳化，冷却至12-16℃得初乳；

4)将初乳加入到已冷却至12-16℃的聚乙烯醇中，高速搅拌得复乳；

5)复乳投入到生理盐水中，低速搅拌，挥干有机溶剂，离心收集微球，用注射用水洗涤5次，得微球；

6)将赋形剂和表面活性剂溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀，得微球混悬液；

7)将微球混悬液冷冻干燥，真空干燥，在无菌条件下分装于5-10ml西林瓶中；

8)、将6)所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得。

本发明提供的利拉鲁肽长效微球注射剂中：

所述步骤2)和5)中的有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯。

所述步骤2)中有机溶剂的加入量：PLGA与有机溶剂的质量体积比为(4-10)g/(100-180)ml。

所述步骤4)中的聚乙烯醇溶液的浓度为1-5％，聚乙烯醇溶液是由聚乙烯醇与生理盐水按照重量(g)/体积(100ml)百分比配制；常规聚乙烯醇为室温，步骤4)中将之冷却的目的是保证微球的成形性和稳定性；

所述步骤4)中初乳与聚乙烯醇的体积配比为1∶10-15。

所述步骤4)中的高速为5000-7500r/min；

所述步骤5)中的复乳与生理盐水的体积比为1∶50-100。

所述步骤5)中的低速为500-100r/min。

本发明选用可降解的高分子材料聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)作为微球的载体材料，精选适合的工艺将利拉鲁肽包裹于该高分子聚合物中。PLGA是一种生物可降解聚合物，当被注射到给药部位后，在体液环境下，可逐步溶胀和降解，同时将包裹于其中的药物释放出来，产生控制释放作用。

本发明提供的利拉鲁肽长效缓释微球设计为28天皮下注射一次，极大减轻了患者的治疗负担，提高了用药依从性，降低了治疗成本，同时，在体外释放研究、动物实验等结果证实，所得到的缓释微球在体外、体内均能长期缓慢释放药物。

附图说明

图1  实施例1制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图2  实施例2制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图3  实施例3制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图4  实施例4制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图5  实施例5制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图6  对比例1制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线；

图7  对比例2制备的利拉鲁肽缓释微球体外释放-时间曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但是不应作为对本发明的限制。

除有特殊说明，本发明中的浓度是重量(g)/体积比(100ml)百分比。

实施例1：

1、称取利拉鲁肽400mg，加入80ml注射用水中，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2、称取PLGA(75/25，分子量为10000道尔顿)4g，加入100ml丙酮，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3、将步骤2的有机相加入到步骤1的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在40℃水浴上加热，超声乳化，冷却至13℃，得初乳；

4、按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1∶10，将初乳加入到已冷却至13℃的2％聚乙烯醇溶液(含聚乙烯醇与生理盐水的质量体积比2g/100ml，下同)中，高速(6000r/min)搅拌2分钟得复乳；

5、按照复乳与生理盐水的体积比为1∶50，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(60r/min)搅拌3小时，挥干丙酮，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤3次，得微球；

6、将7.5g甘露醇和30mg吐温-80溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀；

7、将步骤6所述微球混悬液冷冻干燥14个小时，再置于25℃真空干燥23小时，在无菌条件下分装于5ml西林瓶中；

8、将步骤7所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得25支利拉鲁肽长效微球注射剂。

实施例2

1、称取利拉鲁肽600mg，加入120ml注射用水中，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2、称取PLGA(75/25，分子量为50000道尔顿)6g，加入130ml乙酸乙酯，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3、将步骤2的有机相加入到步骤1的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在48℃水浴上加热，超声乳化，冷却至12℃，得初乳；

4、按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1∶15，将初乳加入到已冷却至12℃的1.5％聚乙烯醇溶液中，高速(5500r/min)搅拌2分钟得复乳；

5、按照复乳与生理盐水体积比为1∶100，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(50r/min)搅拌3小时，挥干乙酸乙酯，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤5次，得微球；

6、将15g葡萄糖和50mg吐温-80溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀；

7、将步骤6所述微球混悬液冷冻干燥16个小时，再置于25℃真空干燥24小时，在无菌条件下分装于7ml西林瓶中；

8、将步骤7所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得35支利拉鲁肽长效微球注射剂。

实施例3

1、称取利拉鲁肽500mg，加入100ml注射用水，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2、称取PLGA(75/25，分子量为50000道尔顿)5g，加入110ml二氯甲烷，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3、将步骤2的有机相加入到步骤1的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在45℃水浴上加热，超声乳化，冷却至14℃，得初乳；

4、按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1∶10，将初乳加入到已冷却至14℃的2.5％聚乙烯醇溶液中，高速(6500r/min)搅拌2分钟得复乳；

5、按照复乳与生理盐水体积比为1∶50，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(60r/min)搅拌3小时，挥干二氯甲烷，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤5次，得微球；

6、将10g木糖醇和40mg泊洛沙姆溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀；

7、将步骤6述微球混悬液冷冻干燥15个小时，再置于25℃真空干燥25小时，在无菌条件下分装于7ml西林瓶中；

8、将步骤7所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得30支利拉鲁肽长效微球注射剂。

实施例4

1、称取利拉鲁肽800mg，加入160ml注射用水中，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2、称取PLGA(75/25，分子量为100000道尔顿)8g，加入150ml丙酮，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3、将步骤2的有机相加入到步骤1的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在50℃水浴上加热，超声乳化，冷却至16℃，得初乳；

4、按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1∶15，将初乳加入到已冷却至16℃的3％聚乙烯醇溶液中，高速(7000r/min)搅拌2分钟得复乳；

5、按照复乳与生理盐水体积比为1∶80，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(80r/min)搅拌3小时，挥干丙酮，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤5次，得微球；

6、将16g山梨醇和50mg吐温-80溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀；

7、将步骤6所述微球混悬液冷冻干燥17个小时，再置于25℃真空干燥26小时，在无菌条件下分装于5ml西林瓶中；

8、将步骤7所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得40支长效利拉鲁肽微球注射剂。

实施例5

1、称取利拉鲁肽1g，加入200ml注射用水中，在45℃水浴上加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2、称取PLGA(75/25，分子量为50000道尔顿)10g，加入180ml二氯甲烷，使PLGA(75/25)完全溶解，作为有机相；

3、将步骤2的有机相加入到步骤1的内水相中，使内水相和有机相混合均匀，在60℃水浴上加热，超声乳化，却至14℃，得初乳；

4、按照初乳与聚乙烯醇溶液的体积配比为1∶10，将初乳加入到已冷却至14℃的4％聚乙烯醇溶液中，高速(7500r/min)搅拌2分钟得复乳；

5、按照复乳与生理盐水体积比为1∶90，将复乳投入到生理盐水中，30℃水浴加热，低速(100r/min)搅拌3小时，挥干丙酮，2500rpm离心收集微球，注射用水洗涤5次，得微球；

6、将25g甘露醇和70mg司盘-80溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀；

7、将步骤6所述微球混悬液冷冻干燥18个小时，再置于25℃真空干燥25小时，在无菌条件下分装于5ml西林瓶中；

8、将步骤7所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得50支利拉鲁肽长效微球注射剂。

对比例1：

根据CN1562356的实施例2，将胰岛素替换为利拉鲁肽，制备成利拉鲁肽的微球。具体方法为：

1)将分子量为50000的丙交酯-乙交酯共聚物(其中含丙交酯80％，乙交酯20％)50mg溶于5ml二氯甲烷，将两嵌段分量分别为30000和5000的聚丙交酯-聚乙二醇两嵌段共聚物(PLA-PEG)50mg溶于5ml二氯甲烷；

2)把两溶液共混在一起，并加入4滴司班80(山梨醇脂肪酸酯)，搅拌均匀；

3)把10mg利拉鲁肽(根据实际情况进行修改)颗粒加入到聚合物溶液中，在10000rpm下，高速搅拌乳化60秒，得到一悬乳液，把上述悬乳液加入到100ml含有2％聚乙烯醇的水溶液中，在8000r/min下，高速搅拌90秒，得到水包油固体粉末乳液，然后在室温搅拌4小时，挥发溶剂，然后高速度离心分离包裹有利拉鲁肽的微球，再用二次蒸馏水进行洗涤，将得到的微球进行冷冻干燥，得到包裹利拉鲁肽的微球。

对比例2：

将专利CN200810138538.3实施例2中的丙氨瑞林替换为利拉鲁肽：

1)称取重量百分比为3％的丙氨瑞林(W/W)，加入重量百分比为2％、浓度为16％的明胶溶液(W/W)中，60℃水浴加热，使药物溶解完全，经无菌过滤，作为内水相；

2)称取重量百分比为15％的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(W/W)，加入二氯甲烷，该共聚物与二氯甲烷的重量比为1∶4，使得聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解完全，经无菌过滤，作为油相；

3)将油相加至内水相中，涡旋混匀，用40℃水浴加热，超声乳化得到初乳；

4)初乳用水浴冷却至15-18℃，加至浓度为4％的聚乙烯醇中，初乳与聚乙烯醇的体积比为1∶400，6000r/min搅拌2分钟，得复乳；

5)复乳加至浓度为0.1％的聚乙烯醇中，复乳与聚乙烯醇的体积比为1∶2，30℃水浴加热，低速搅拌3小时，3000rpm离心收集微球，蒸馏水洗涤3次，得40-60μm的微球；

6)将重量百分比为70％的甘露醇(W/W)和重量百分比为10％的吐温-80(W/W)溶于注射用水中，并经过无菌过滤，与所得微球混悬均匀，甘露醇和聚山梨酯-80与注射用水的重量比为1∶5；

7)冷冻16小时后，真空干燥24小时，得到利拉鲁肽的缓释微球。

实验例1：包封率

包封率是考察药物包裹于高分子材料中的一个重要指标，是考察微球制备是否成功的一个重要检测指标，中国药典规定，包封率不低于80％。包封率的计算公如下：

根据实施例1-6制备了六批样品，包封在微球中的药物的含量测定方法采用HPLC法测定，测定的包封率结果如下：

表1：包封率测定结果

	包封率(％)
		实施例1	89.5
实施例2	90.1
		实施例3	88.2
实施例4	89.4
		实施例5	91.3
对比例1	55.1
		对比例2	53.8

结果表明：本发明实施例制备的长效微球注射液包封率均在80％以上，而根据对比例制备的注射液包封率仅为55.1％和53.8％。

实验例2：释放度测定

释放度是指在规定条件下，药物从缓释微球等缓控释制剂中释放的速率和程度。

1、测定方法：

精密称取利拉鲁肽注射微球(相当于利拉鲁肽50mg)，混悬在10mL具塞刻度试管中，加入0.15mol/L醋酸钠缓冲液10ml作为释放介质，于37℃±0.1℃的恒温摇床上进行释放实验，转速为100rpm，依法操作，在1、7、14、21、28、35天取出试管(n＝6)，2500r/min离心5min，吸去上清液，再加入上述溶液洗涤一次，用10ml乙腈-水(9∶1)转移至50ml量瓶中，以下同含量测定，照含量测定项下的液相色谱条件测定，依次注入液相色谱仪，记录色谱图，按标准曲线法以峰面积计算出每管在不同时间的释放度。

2、测定结果：

取本发明实施例1-5和对比例1和2的样品，按上法分别测定其释放度，结果见表2-8：

表2：实施例1利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表3：实施例2利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表4：实施例3利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表5：实施例4利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表6：实施例5利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表7：对比例1利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

表8：对比例2利拉鲁肽缓释微球体外释放度测定结果

结果显示：本发明的实施例的体外释放逐步释放，并能保证28天内恒定释放利拉鲁肽，而两个对比例在14天后，不再释放利拉鲁肽。

结论：与对比例相比，本发明利拉鲁肽长效微球注射剂制备工艺简单，重现性好，质量可控，包封率和释放度均满足工业化生产需要。

实验例3：稳定性实验

采用实施例1-5、对比例1、对比例2制备的药物，考察其稳定性。分别于高温40℃、相对湿度75％条件下加速实验6个月，分别在第0、1、2、3、6个月末取样，检测各项指标的变化。

检测指标：有关物，根据国家药典规定的方法进行检测。

表9：稳定性实验结果

结果显示：实施例制备的样品的有关物均无明显变化，而采用胰岛素的辅料和丙氨瑞林的处方的对比例1和2加速实验6个月后有关物明显增加，含量降低，复溶后澄清度不符合规定，说明本发明在增加产品稳定性方面的优越性。将制备的微球在稳定性实验的条件下放置6个月后，与实验前相比较，注射用微球的外观形态没有发生变化。

实验例4：

下面通过具体的药理实验进一步说明本发明长效降糖制剂的预防和治疗效果：

1、实验动物及分组：

Wistar大鼠，雄性，体重120-140g。

2、试验方法：

1)高热量饲料的配制(每5kg的成分)：基础饲料73％、猪油10％、白糖15％、胆固醇2％。

2)2型糖尿病模型制备方法，参考《新疆医学》2009年第39卷，朱虎虎等发表的“高热饲料与STZ诱发2型糖尿病动物模的建立”。

将STZ(链脲佐菌素)用0.1mol/L无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液新鲜配置成2％的溶液，调节pH值至4.5，过滤除菌；

随机选取8只Wistar大鼠作为正常对照组，即A组，其余大鼠采用参考文献的方法，喂以高热饲料，同时腹腔注射STZ30mg/kg，7天后禁食，第二天上午采集尾血，测定空腹血糖，血糖值超过16.7mmol/L的大鼠为糖尿病模型鼠，共得糖尿病模型66只。

3、分组：

将糖尿病模型随机分为：B组为模型对照组(9只)、C组为利拉鲁肽注射液组(9只，剂量为每天200μg/kg)、D组为利拉鲁肽长效微球注射剂低剂量组(10只，28天一次注射，给药剂量为3500μg/kg)、E组为利拉鲁肽长效微球注射剂中剂量组(9只，28天一次注射，给药剂量为5000μg/kg)、F组为利拉鲁肽长效微球注射剂高剂量组(10只，28天一次注射，给药剂量为6500)、G组为对比例1组(10只，剂量同E组)，H组为对比例2组(9只，剂量同E组)，同时正常对照组和模型对照组以1.5ml的注射用水灌胃，正常对照组以普通饲料喂养，除正常对照组外的其他各组依然每日喂以高热饲料，并腹腔注射STZ30mg/kg，分别于给药前，给药12小时，给药后第1、2、3周收集尾动脉血，检测血糖值，给药28天后，收集尿，检测尿蛋白值，摘除眼球取血测血糖和NO，同时处死大鼠收集胰腺组织，提出脂肪制成切片，显微镜下观察。

4、统计分析

本实验的数据均采用SPSS 11.0统计软件进行处理分析，各组件比较采用t检验。

5、结果

5.1一般观察

正常对照组，活动灵活，毛发光泽；模型组剂及其余各组毛发枯燥，精神萎靡。

实验7天时，B组死亡2只，实验14天时，B组又死亡3只，G组死亡2只，H组死亡3只。

5.2血糖值的变化(见表10)

在统计过程中，因为实验过程中出现大鼠死亡，14天后的血糖值为剩余大鼠的平均血糖值。

表10：血糖值(mmol/L)

与A相比，^※※p＜0.01；与B组相比，^△p＜0.05，^△△p＜0.01；与C组相比，^□p＜0.05，^□□p＜0.01；与G组比较，^◇◇p＜0.01；与H组相比，^☆☆p＜0.01

结果显示：

与正常对照组比较，模型组的血糖显著增加(p＜0.01)；

与模型组比较，利拉鲁肽注射液和利拉鲁肽长效微球注射液高、中、低剂量组的血糖均有明显改善(p＜0.01)，采用对比例制备的长效微球注射剂在注射12小时、注射后1周的血糖有明显改善(p＜0.05)，其余时间无明显差异；

与利拉鲁肽注射液相比，注射后2周、注射后3周、注射后4周，对比例制备的长效微球注射剂有显著性差异(p＜0.01)，利拉鲁肽长效微球注射液高、中、低剂量组没有明显差异(p＞0.05)；

分别与对比例相比，在注射12小时，注射后1周，利拉鲁肽注射液和利拉鲁肽长效微球注射剂高、中、低剂量组没有明显差异(p＞0.05)，注射后2周、注射后3周、注射后4周，利拉鲁肽长效微球注射剂高、中、低剂量组有显著差异(p＜0.01)。

5.3尿蛋白值(表11)

表11：尿蛋白及NO值

与A相比，^※※p＜0.01；与B组相比，^△p＜0.01，^△△p＜0.01；与C组相比，^□□p＜0.01；与G组比较，^◇◇p＜0.01；与H组相比，^☆☆p＜0.01

结果显示：

与正常对照组比较，模型组的尿蛋白显著增加(p＜0.01)；

与模型组比较，利拉鲁肽注射液和利拉鲁肽长效微球注射液高、中、低剂量组均有明显改善(p＜0.01)，采用对比例制备的长效微球注射剂有明显改善(p＜0.05)；

与利拉鲁肽注射液相比，对比例制备的长效微球注射剂有明显差异(p＜0.01)，利拉鲁肽长效微球注射液高、中、低剂量组没有明显差异(p＞0.05)；

分别与对比例相比，利拉鲁肽注射液和利拉鲁肽长效微球注射剂高、中、低剂量组有显著差异(p＜0.01)。

结论：本发明制备的利拉鲁肽长效微球注射液与利拉鲁肽注射液相比，具有类似的效果，但是本发明的长效微球注射剂具有注射次数少的优势；而采用现有技术的方法制备的利拉鲁肽长效微球注射剂，则不能达到普通注射液的效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种利拉鲁肽长效微球注射剂，由以下重量份的成分组成：

所述赋形剂选自聚乙二醇、葡萄糖、氯化钠、蔗糖、木糖醇、山梨醇或甘露醇中的一种或几种；所述PLGA是聚丙交酯-乙交酯共聚物，其中丙交酯与乙交酯单体的摩尔比为75：25，PLGA分子量为10000-100000道尔顿。

2.根据权利要求1所述的利拉鲁肽长效微球注射剂，其特征在于，该注射剂由以下重量份的成分组成：

3.根据权利要求1或2所述的利拉鲁肽长效微球注射剂，其特征在于，所述表面活性剂选自吐温、泊洛沙姆或司盘中的一种或几种。

4.根据权利要求3所述的利拉鲁肽长效微球注射剂，其特征在于，所述吐温为吐温-80，泊洛沙姆为泊洛沙姆-188，司盘为司盘-20或司盘-80。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述的利拉鲁肽长效微球注射剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将利拉鲁肽加入到注射用水中，水浴加热，使药物完全溶解，作为内水相；

2）称取PLGA，加入有机溶剂，使PLGA完全溶解，作为有机相，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯，所述PLGA与有机溶剂的质量体积比为(4-10)g/(100-180)ml；

3）将步骤2）的有机相加入到步骤1）的内水相中，混合均匀，加热，超声乳化，冷却至12-16℃得初乳；

4）将初乳加入到已冷却至12-16℃的聚乙烯醇溶液中，高速搅拌得复乳；

5）复乳投入到生理盐水中，低速搅拌，挥干有机溶剂，离心收集微球，用注射用水洗涤5次，得微球，所述有机溶剂选自二氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯；

6）将赋形剂和表面活性剂溶于适量注射用水中，并经无菌过滤，与上述微球混悬均匀，得微球混悬液；

7）将微球混悬液冷冻干燥，真空干燥，在无菌条件下分装于5-10ml西林瓶中；

8）将步骤7）所得产品封口、轧盖，灯检、包装，即得。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中的聚乙烯醇溶液是由聚乙烯醇与生理盐水按照重量体积比1-5g/100ml配制；所述初乳与聚乙烯醇的体积配比为1：10-15。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中复乳与生理盐水的体积配比为1：1-50。

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