CN115350264A - 一种载利拉鲁肽缓释微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载利拉鲁肽缓释微球及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：S1、以含有利拉鲁肽的水溶液或缓冲溶液作为内水相，将聚合物溶于有机溶剂中，作为油相，将内水相和油相混合均质得到W1/O型初乳；S2、将初乳加入含有稳定剂和渗透压调节剂的外水相，乳化形成W1/O/W2型的预复乳；S3、将预复乳通过快速膜乳化设备，用压力通过微孔膜，制备均一的乳液；S4、将乳液挥发固化，然后进行洗涤、干燥，得到载利拉鲁肽缓释微球。本发明所制备的微球粒径均一且大小可调，具有高载药量和包埋率，微球中有机溶剂可快速去除且残留度低，易于放大生产，且该微球的突释可控，能达到20～40天持续释放。

Description

一种载利拉鲁肽缓释微球及其制备方法
技术领域
本发明属于医药缓释制剂技术领域，具体涉及一种载利拉鲁肽缓释微球及其制备方法。
背景技术
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)目前已经成为全球性公共健康问题，根据国际糖尿 病联盟2021年公布的数据，近十年来，糖尿病患病人数从3.66亿快速增长至5.37亿，其发病率呈逐年上升趋势。
糖尿病主要是由遗传、环境、个人生活习惯等多种因素相互作用而引发的慢性疾病。 在糖尿病患者中，超过90％的患有二型糖尿病，其特征是胰腺B细胞胰岛素分泌不足或靶 细胞对胰岛素不敏感，导致体内葡萄糖浓度升高。如果不及时治疗，持续高血糖会导致一 系列并发症，包括心血管疾病、视网膜病变、糖尿病肾病以及动脉硬化等，这些并发症的直接后果是导致病人生活质量下降甚至危及患者生命。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由远端回肠和结肠中的肠L细胞产生的，在摄入葡萄糖或混合膳食后分泌，并在生理血浆浓度下增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌。GLP-1具有许多作用：增加胰岛素分泌、抑制胰高血糖素、保护胰腺B细胞、延缓胃排空、抑制食欲、 减少肝细胞内脂肪蓄积和降低心血管疾病的发生。但天然的GLP-1容易被人体内的蛋白水 解酶二肽基肽酶-4(DDP-4)切割而快速失活，因此GLP-1类似物和DDP-4抑制剂等成为 研究焦点。
利拉鲁肽是人工合成的长效GLP-1受体激动剂，与人体天然GLP-1有97％的氨基酸序列同源性。其结构与GLP-1相比，不同点主要表现为分子结构第34位赖氨酸被精氨酸 代替、第26位赖氨酸上增加了一个脂肪侧链，如图1所示。这种结构修饰保留了GLP-1 的生物活性，又避免了被DPP-4降解，使其半衰期达到13小时。其长效机制为：1)在皮 下注射部位由于脂肪侧链的疏水性自组装成为七聚体，减缓吸收；2)吸收入血后与白蛋白 结合，结合率为98％，延长作用时间，由此产生的药代动力学特征允许每日给药一次。
利拉鲁肽可与GLP-1受体结合，有效促进胰岛B细胞分泌胰岛素，降低过高胰高血糖 素。根据LEAD(Liraglutide Effect and Acting Diabetes)系列研究结果，利拉鲁肽是一种 长效且安全的GLP-1受体激动剂，可以有效降低糖化血红蛋白，使餐后和空腹血糖都得到 有效控制，且其降糖作用与葡萄糖浓度呈现良好的剂量依赖性关系，用药后低血糖情况很 少发生。目前研究显示利拉鲁肽除了降血糖作用以外，还可以改善胰岛B细胞功能、降低 饥饿感减轻体重、降低心血管疾病发生、保护肝脏、治疗阿尔兹海默症等。相比于其他治疗二型糖尿病药物，利拉鲁肽通常耐受性良好，最常见的不良事件是胃肠道事件，如恶心，但随时间推移而减少。因此，利拉鲁肽是用于二型糖尿病患者的有效治疗选择。
尽管经过对人体天然的GLP-1进行修饰，延长了半衰期，但由于利拉鲁肽本身属于多 肽类药物，口服易被破坏，因此仍然需要每日皮下注射一次。然而，糖尿病作为一种慢性病，对于需要终生治疗的患者来说，即使每天注射一次也是相当频繁的。因此为了解决以上关键问题，减少给药频率，提高患者的依从性，需要开发长效利拉鲁肽缓释制剂。
目前，在众多的缓释制剂类型中，微球制剂因其辅料安全可控、释放周期可调、稳定 性高且易于生产放大的特点，广泛应用于多种多肽和小分子药物中，可以延长药物作用时 间，具有广阔的市场应用前景。
微球制剂的大规模工业化生产一直是微球制剂产业化的难题，在实验室制备微球时， 主要通过匀浆器或机械搅拌成复乳微球，当等比例放大实验时，机械转速在大体系中受搅 拌面积等影响，微球受力不可控，易产生大小不同粒径微球，微球粒径分布跨度变大，导 致微球释放行为改变、载药量降低等。此外，微球制剂还会存在有机溶剂残留度高，易导致注射后毒性的问题。专利CN102429876A公开了一种利拉鲁肽缓释微球制剂及其制备方法，虽然包裹利拉鲁肽的缓释微球制剂的包封率很高，但是载药量偏低，现有技术也很难在提高载药量的同时，保证较高的包埋率(80％以上)。因此，急需开发一种新的载利拉鲁肽缓释微球制备方法，能够实现放大生产，且产品稳定、安全性好。
发明内容
针对上述存在的技术问题，本发明提供了一种载利拉鲁肽缓释微球及其制备方法，所 制得的微球具有高载药量、高包埋率、粒径均一、大小可控、安全性高、有机溶剂残留低、 产量高等特点，该制备方法还能够适应大规模工业化生产。
本发明的技术方案为：
本发明提供了一种载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，包括如下步骤：
S1、以含有利拉鲁肽的水溶液或缓冲溶液作为内水相，将聚合物溶于有机溶剂中，作 为油相，将内水相和油相混合均质得到W1/O型初乳；
S2、将初乳加入含有稳定剂和渗透压调节剂的外水相，乳化形成“W1/O/W2”的预复乳；
S3、将预复乳通过快速膜乳化设备，用压力通过微孔膜，制备均一的乳液；
S4、将乳液挥发固化，然后进行洗涤、干燥，得到载利拉鲁肽缓释微球。
优选地，S1步骤中获得内水相后，向内水相中添加稀释剂，稀释剂的添加可以避免药 物浓度过高而导致的粘度增大，若内水相粘度增加，会导致制备方法中过膜操作的膜管堵 塞，所述稀释剂为乙醇或多元醇，内水相中稀释剂的浓度为0～10wt％，由于利拉鲁肽的两 亲性结构特点，当药物浓度过高时，药物易团聚成胶束，溶液粘度增加，造成制备过程中膜管堵塞，导致微球粒径分布变宽且载药量、包埋率降低，而添加乙醇等作为稀释剂可以分散胶束团聚状态，降低相同药物浓度下的溶液粘度，过膜顺畅，得到载药量高、包埋率 高且粒径均一的微球；
优选地，S1步骤中含有利拉鲁肽的缓冲溶液为碱性缓冲溶液；
内水相中利拉鲁肽浓度为1～250mg/mL，优选50～250mg/mL；
S1步骤中的所述聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或两者的混合物； 油相中的聚合物浓度为50～500mg/mL；其中聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特性粘度为 0.15～0.80dL/g，重均分子量为8～120kDa，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的丙交酯和乙交酯摩 尔比为75:25～50:50；聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸粘度过大会导致整体乳液粘度增大，过膜易 堵塞膜孔，若粘度过小，导致油膜变薄，药物易逃逸，包埋率降低；
S1步骤中的所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酸乙酯和乙酸丙酯中 的至少一种；
S1步骤中的均质的时间为30～150s，均质速率为1000～24000rpm。
优选地，步骤S2中的所述稳定剂为聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐 单油酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸钠中至少一种；外水相中稳定剂 的浓度为0.1～10wt％，优选1～5wt％；
步骤S2中的所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢 二钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸钾等无机盐溶液，优选氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸 二氢钠、磷酸氢二钠中至少一种；外水相中渗透压调节剂的浓度为0.1～10wt％，优选 0.5～5wt％，渗透压调节剂的添加可以平衡内外水相间压力，防止药物因为压力差的原因从 内水相乳滴中逃逸到外水相，避免微球形成多孔结构，降低包埋率；
步骤S2中的乳化的方式选择均质或搅拌。
优选地，步骤S3中的所述微孔膜为亲水性膜，孔径为2～200μm，过微孔膜的操作压力 为1～100kPa，次数为1～5次，可以通过选择不同膜孔径的微孔膜达到控制产品粒径大小和 均一性的目的，同时还因为过膜次数和压力等操作参数设定，可以保证批次间重复性高， 增强产品生产放大的稳定性。
优选地，S4步骤中的挥发固化方式为常压搅拌、真空负压条件下搅拌或者增大挥发面 积，挥发固化方式的固化温度为25～38℃，固化时间为0.5～8h，真空负压条件的真空度为 -0.001至-0.1MPa。本发明可以通过控制固化方式及真空度调控微球表面形貌及粒径分布， 微球固化真空度和固化时间等会对微球的释放行为产生影响。
优选地，在真空负压条件下增大挥发面积的具体方式为：利用蠕动泵将乳液泵入温度 可控的真空环境管道，随后将乳液接出，反复通过蠕动泵输送至抽真空的管道内，由于乳 液以流体形式反复与真空负压环境接触，增大了乳液和真空环境的接触面积，使有机试剂 可以快速挥发，进一步提高固化效率，与之不同的是，传统方法去除有机试剂的挥发面积 多取决于乳液所在容器的截面积。
优选地，所述内水相和油相的体积比为1:5～1:20，优选1:5～1:15；所述油相和所述外 水相体积比为1:5～1:100，优选1:5～1:50，较小的内水相、油相、外水相的体积比可以保证 相同体系下，获得更多的载药微球，提高收率，进一步提高生产效率。此外，将利拉鲁肽 溶解在内水相中，保证药物充分溶解，同时因为利拉鲁肽含有一条棕榈酸侧链，能够相对 稳定内部油水界面，降低药物泄漏，避免药物高突释。
本发明还提供了一种载利拉鲁肽缓释微球，采用上述制备方法制得，所述载利拉鲁肽 缓释微球粒径分布跨度Span值小于1.5，包埋率高于80％，能持续释放20～40天。
优选地，所述载利拉鲁肽缓释微球中利拉鲁肽的重量含量为5～25％，聚合物的重量含 量为75～95％；
所述载利拉鲁肽缓释微球平均粒径为5-50μm；
所述载利拉鲁肽缓释微球在体外加速释放过程中0.5h释放低于20％。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过在内水相中添加稀释剂、在外水相中添加渗透压调节剂可以得到表面 光滑圆整的高载药量、高包埋率微球，且过膜操作可以保证生成微球的粒径均一度，在稳 定的过膜条件下，批次间重复性好，微球的粒径也可以调控，同时也可以将不同粒径的微 球进行复配，更好的调控释放周期和释放速度；
(2)本分明通过调整固化工艺，可以调控有机试剂挥发速率，大幅降低有机溶剂残留 度，同时在放大生产中，提高微球生产效率，缩短固化时间；
(3)本发明的制备方法可以实现20mL～500L制备体系生产，放大后仍然保证高载药 量和高包埋率；
(4)本发明所制备的微球具有多种粒径规格，不同粒径规格微球均一性较好，且都能 达到80％以上包埋率，可以使用23G号针头甚至25G针头注射，减轻患者疼痛感，提高患者依从性；本发明所制备的微球有机溶剂残留量低，毒副作用低，且该微球的突释可控， 能达到20～40天持续释放。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为GLP-1和利拉鲁肽结构示意图；
图2为实施例1制备的微球的电镜照片；
图3为实施例1制备的微球的粒径分布图；
图4为实施例2制备的微球48h内体外加速释放曲线；
图5为实施例5制备的微球48h内体外加速释放曲线；
图6为实施例7制备的微球的电镜照片；
图7为实施例9动物实验中给药后db/db小鼠0～35天内血糖变化曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附 图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明 的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明提供了一种载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，包括如下步骤：
S1、以含有利拉鲁肽的水溶液或碱性缓冲溶液作为内水相，内水相中利拉鲁肽浓度为 1～250mg/mL，优选50～250mg/mL；
将聚合物溶于有机溶剂中，作为油相，所述聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物 中的一种或两者的混合物；油相中的聚合物浓度为50～500mg/mL；其中聚乳酸或聚乳酸- 羟基乙酸共聚物的特性粘度为0.15～0.80dL/g，重均分子量为8～120kDa，聚乳酸-羟基乙酸 共聚物中的丙交酯和乙交酯摩尔比为75:25～50:50；所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、 乙酸乙酯、丙酸乙酯和乙酸丙酯中的至少一种，更优选二氯甲烷或乙酸乙酯；
将内水相和油相混合均质得到W1/O型初乳，均质的时间为30～150s，例如30s、40s、 50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s或120s，均质速率为1000～24000rpm，优选5000～24000rpm， 更优选10000～24000rpm；
S2、将初乳加入含有稳定剂和渗透压调节剂的外水相，乳化形成W1/O/W2型的预复乳， 其中乳化的方式选择均质或搅拌；
所述稳定剂为聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸脂、聚氧乙烯 山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸钠中至少一种；外水相中稳定剂的浓度为0.1～10wt％， 优选1～5wt％；
所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸钾等无机盐溶液，优选氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷 酸氢二钠中至少一种；外水相中渗透压调节剂的浓度为0.1～10wt％，优选0.5～5wt％；
S3、将预复乳通过快速膜乳化设备，用压力通过微孔膜，制备均一的乳液；
所述微孔膜为亲水性膜，孔径为2～200μm，例如2μm、20μm、40μm、50μm、100μm、 150μm、200μm，过微孔膜的操作压力为1～100kPa，例如5kPa、10kPa、30kPa、60kPa 或100kPa，次数为1～5次，优选2～4次；
S4、将乳液挥发固化，然后进行洗涤、干燥，得到载利拉鲁肽缓释微球；
挥发固化方式为常压搅拌、真空负压条件下搅拌或者增大挥发面积，挥发固化方式的 固化温度为25～38℃，固化时间为0.5～8h，优选4～8h，真空负压条件的真空度为-0.001至 -0.1MPa，其中真空负压条件下的增大挥发面积的具体方式为：利用蠕动泵将乳液泵入具有 温度可控的真空环境管道，随后将乳液接出，反复通过蠕动泵输送至抽真空的管道内。
优选地，S1步骤中获得内水相后，向内水相中添加稀释剂，所述稀释剂为乙醇或多元 醇，内水相中稀释剂的浓度为0～10wt％；
优选地，所述内水相和油相的体积比为1:5～1:20，优选1:5～1:15；所述油相和所述外 水相体积比为1:5～1:100，优选1:5～1:50。
上述制备方法所制得的载利拉鲁肽缓释微球粒径分布跨度Span值小于1.5，优选小于 1.2，更优选小于0.8，包埋率高于80％，优选高于85％，更优选高于90％，所述载利拉鲁 肽缓释微球中利拉鲁肽的重量含量为5～25％，优选7～20％，聚合物的重量含量为75～95％， 优选80～93％；所述载利拉鲁肽缓释微球平均粒径为5-50μm；所述载利拉鲁肽缓释微球能 持续释放20～40天，其在体外加速释放过程中0.5h释放低于20％，优选低于15％，更优 选低于10％。
本发明中微球各参数的测定方法如下。
利用激光粒度仪(Malvern Company,USA)测定制备的微球粒径，其中Span为粒径分布跨度，计算方法如下：
Figure BDA0003758954130000061
其中，DV,90％，DV,50％和DV,10％代表体积分数分别在90％，50％和10％时微球的粒径。Span值表示粒径均一性，其中Span值越小证明粒径的均一性越好。
微球载药量和包埋率的检测方法采用高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography,HPLC)，载药量和包埋率的计算公式如下所示：
Figure BDA0003758954130000071
Figure BDA0003758954130000072
微球有机试剂残留度检测方法采用气相色谱法。
实施例1
S1、称取1g粘度为0.15～0.25dL/g，重均分子量为19kDa的聚乳酸溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，将1mL浓度为150mg/mL的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质速率18000rpm，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到100mL的2wt％PVA(聚乙烯醇)、1wt％NaCl水溶液中，搅拌 制备W1/O/W2型预复乳；
S3、再将该预复乳液在20kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。
将本实施例1干燥后的微球重新分散在水中，利用冷场发射扫描电镜(JEOL SEMCompany,Japan)观察微球的表面形貌(如图2)。微球的平均粒径18.2μm，粒度分布系 数Span为0.7(如图3)。利拉鲁肽缓释微球包埋率为86.98％。
取实施例1制备的微球280mg，加入2mL含有羧甲基纤维素钠、甘露醇和聚山梨酯80的专用溶剂，配制成均匀的混悬液，用注射器和不同规格针头进行通针性检查，微球通针性实验结果见表1。
表1：微球通针性实验结果
Figure BDA0003758954130000073
实施例2：不同聚合物对微球的影响
S1、分别称取1g不同的聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，将1mL浓度为100mg/mL的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质速率18000rpm， 均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到100mL的2wt％PVA、1wt％NaCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在20kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。
不同的聚合物所制得的微球各参数如表2所示，其中PLA指的是聚乳酸，PLGA指的是聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物，各组对应的微球48h内体外加速释放曲线如图4所示。
表2：不同聚合物对微球的影响
组别 聚合物种类/粘度/重均分子量 实验结果
A组 PLA/0.15～0.25dL/g/19kDa 微球粒径21.5μm，Span 0.7，包埋率93.21％
B组 PLGA(50:50)/0.4～0.5dL/g/63kDa 微球粒径19.2μm，Span 0.7，包埋率92.10％
C组 PLGA(50:50)/0.2～0.3dL/g/25kDa 微球粒径21.4μm，Span 0.6，包埋率93.97％
从表2可看出，在合适的处方工艺下，不同的聚合物所制备的微球包埋率均能达到90％， 微球粒径及粒径分布也无显著差异。但从图4的释放曲线可看出，不同的聚合物种类会影 响药物释放行为，其中A和C组微球释放终点高于B组，更有利于达到长效释药。
实施例3：不同固化方式对微球中有机试剂残留度的影响
S1、称取10g粘度为0.15～0.25dL/g，重均分子量为19kDa的聚乳酸溶于100mL二氯甲烷中，作为油相，将含有10mL浓度150mg/mL的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质速 率18000rpm，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到1L的2wt％PVA、1wt％NaCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型 预复乳；
S3、将该预复乳液在15kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜2次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在不同的固化方式下进行固化，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓 释微球。结果如表3所示。
表3：不同固化方式对微球中有机试剂残留度的影响
Figure BDA0003758954130000091
从表3可看出，不同的固化方式对有机试剂残留度的去除程度不同，但不影响药物的 包埋率，其中调整固化真空度、温度和有机溶剂挥发面积可以缩短固化时间，提高微球生 产效率。
实施例4：不同粒径微球考察实验
S1、称取1g粘度为0.6～0.8dL/g，重均分子量为118kDa的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 (丙交酯:乙交酯＝75:25)溶于100mL二氯甲烷中，作为油相，将10mL浓度为50mg/mL 的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质18000rpm，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到1L的1wt％PVA、0.5wt％NaCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在不同的操作压力下压过不同孔径微孔膜装置，过膜3次，得到均 一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。实验结果如表4所示。
表4：不同操作条件对微球粒径影响
Figure BDA0003758954130000092
Figure BDA0003758954130000101
从表4可看出，合理范围内调整操作条件可以制备不同粒径的微球，微球均一性良好 且包埋率均在90％以上，但是若操作压力过大，乳滴过膜时剪切力增加会导致产生小粒径 微球导致粒径分布不均，且包埋率降低，如I组所示。
实施例5：不同均质速率对微球的影响
S1、称取1g粘度为0.2～0.3dL/g，重均分子量为25kDa的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(丙 交酯:乙交酯＝50:50)溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，将1mL浓度为100mg/mL的利拉鲁肽水溶液和油相混合，分别使用不同均质速率，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到100mL的2wt％PVA、1wt％NaCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在10kPa的操作压力下压过微孔膜装置(40μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。实验结果如表5所示，对应的释放曲线如图5所示，可见均质速率增加可以降低突释。
表5：不同均质速率对微球的影响
组别 均质速率 实验结果
L组 15000rpm 微球粒径20.3μm，Span 0.8，包埋率88.03％
M组 20000rpm 微球粒径19.8μm，Span 0.7，包埋率91.34％
实施例6：不同制备体系对微球的影响
S1、称取1g粘度为0.15～0.25dL/g，重均分子量为19kDa的聚乳酸溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，将含有1mL浓度为100mg/mL的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质速率18000rpm，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到100mL的2wt％PVA、1wt％KCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在20kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在-0.095MPa真空负压下，37℃增大挥发面积固化((即将含有微球的乳液 通过蠕动泵输送到37℃真空度-0.095MPa管道中，随后接出物料，固化时间10min，固化3次)，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微球。采用同样实验方法，内水相、油相、外水相浓度不变，将制备体系等比例放大，进行实验，实验结果如表6所示。
表6：不同制备体系对微球的影响
Figure BDA0003758954130000111
由此可见，本发明的制备方法可以实现放大生产，当增大制备体系，仍能保证较高的 包埋率及较好的粒径分布，同时有机溶剂去除效率高，毒副作用低。微球制剂的大规模工 业化生产一直是微球制剂产业化的难题，本发明提供了一种工艺稳定、质量可控并适用于 大规模工业化生产的方法。
实施例7：外水相添加渗透压调节剂对微球的影响
S1、称取1g粘度为0.15～0.25dL/g，重均分子量为19kDa聚乳酸溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，再将含有1mL浓度为225mg/mL的利拉鲁肽水溶液分别和油相混合，均质 速率18000rpm，均质时间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将制备的初乳加入到100mL的2wt％PVA、0或2wt％NaCl浓度的水溶液中，搅 拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在15kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。实验结果如表7所示，其中R组微球表面形貌如图6所示。
表7：不同NaCl浓度对微球的影响
组别 NaCl浓度 实验结果
Q组 2wt％ 微球载药量15.88％，包埋率86.46％
R组 0wt％ 微球载药量10.71％，包埋率58.33％
如果没有在外水相中添加渗透压调节剂，则会造成包含药物的内水相液滴由于渗透压 作用向外水相逃逸，造成微球形成多孔结构且载药量、包埋率下降，同时微球释放时0.5h 突释超过60％。
实施例8：内水相添加稀释剂对微球的影响
S1、称取1.2g粘度为0.15～0.25dL/g，重均分子量为19kDa聚乳酸溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，再分别将含有不同浓度的乙醇及1mL浓度为250mg/mL的利拉鲁肽水溶 液混合后，加入油相，均质20000rpm，均质时间120s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将制备的初乳加入到100mL的2wt％PVA、2wt％NaCl浓度的水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在20kPa的操作压力下压过微孔膜装置(40μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。实验结果如表9所示。
表9：不同乙醇浓度对微球的影响
Figure BDA0003758954130000121
利拉鲁肽浓度过高会造成内水相中具有两亲性的利拉鲁肽团聚成大量胶束，溶液粘度 增加，过膜过程中造成膜管堵塞，产生小球，粒径分布不均，载药量包埋率下降，同时影 响释放行为。添加乙醇作为稀释剂，能够调整胶束分布状态，降低溶液粘度，可以制备粒径、粒径分布较好，且具有高载药量和包埋率的载药微球。
实施例9：载利拉鲁肽缓释微球体内降糖效果
载药微球制备
S1、分别称取1g不同的聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物溶于10mL二氯甲烷中，作为油相，将1mL不同浓度的利拉鲁肽水溶液和油相混合，均质速率18000rpm，均质时 间60s，乳化得到W1/O型初乳；
S2、将该初乳加入到100mL的2wt％PVA、1wt％NaCl水溶液中，搅拌制备W1/O/W2型预复乳；
S3、将该预复乳液在20kPa的操作压力下压过微孔膜装置(50μm)，过膜3次，得到均一的乳液；
S4、将乳液在常温常压下搅拌固化6h，再经离心洗涤、冻干即得到载利拉鲁肽缓释微 球。
不同聚合物、内水相中不同浓度利拉鲁肽制备参数和制得的微球参数如表10所示。
表10：动物实验载药微球制备参数
组别 聚合物种类/粘度/重均分子量 利拉鲁肽浓度 实验结果
A组 PLA/0.15～0.25dL/g/19kDa 100mg/mL 微球载药量8.47％
U组 PLGA(75:25)/0.6～0.8dL/g/118kDa 223mg/mL 微球载药量16.11％
实验动物：雄性db/db小鼠18只，随机分为3组，每组6只小鼠。
于实验开始的0、3、7、10、13、17、21、24、28、31、35天早晨测定小鼠空腹血糖。 测量之前小鼠禁食6h，尾静脉取血，使用罗氏血糖仪进行血糖测定，观察小鼠血糖变化。 实验开始记为第1天，将禁食的小鼠使用1mg/mL葡萄糖进行灌胃，随后皮下注射给予对 照组pH为7.2～7.4的PBS，剩余2组皮下注射给予表10所示的微球组，各微球组给药剂 量相同，保证注射药物浓度为3.5mg/mL，注射体积为300μL/50g，并于给药后每周两次检 测其空腹血糖，0～35天内血糖变化如图7所示。
在35天内，A组和U组制备的利拉鲁肽载药微球均可以有效控制血糖。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理， 而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在 涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改 例。

Claims (10)

1.一种载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、以含有利拉鲁肽的水溶液或缓冲溶液作为内水相，将聚合物溶于有机溶剂中，作为油相，将内水相和油相混合均质得到W1/O型初乳；
S2、将初乳加入含有稳定剂和渗透压调节剂的外水相，乳化形成W1/O/W2型的预复乳；
S3、将预复乳通过快速膜乳化设备，用压力通过微孔膜，制备均一的乳液；
S4、将乳液挥发固化，然后进行洗涤、干燥，得到载利拉鲁肽缓释微球。
2.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，S1步骤中获得内水相后，向内水相中添加稀释剂，所述稀释剂为乙醇或多元醇，内水相中稀释剂的浓度为0～10wt％。
3.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，S1步骤中含有利拉鲁肽的缓冲溶液为碱性缓冲溶液；
内水相中利拉鲁肽浓度为1～250mg/mL；
S1步骤中的所述聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或两者的混合物；油相中的聚合物浓度为50～500mg/mL；其中聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特性粘度为0.15～0.80dL/g，重均分子量为8～120kDa，聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的丙交酯和乙交酯摩尔比为75:25～50:50；
S1步骤中的所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酸乙酯和乙酸丙酯中的至少一种；
S1步骤中的均质的时间为30～150s，均质速率为1000～24000rpm。
4.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，步骤S2中的所述稳定剂为聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸钠中至少一种；外水相中稳定剂的浓度为0.1～10wt％，优选1～5wt％；
步骤S2中的所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、醋酸钠、醋酸钾等无机盐溶液，优选氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中至少一种；外水相中渗透压调节剂的浓度为0.1～10wt％，优选0.5～5wt％；
步骤S2中的乳化方式选择均质或搅拌。
5.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，步骤S3中的所述微孔膜为亲水性膜，孔径为2～200μm，过微孔膜的操作压力为1～100kPa，次数为1～5次。
6.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，S4步骤中的挥发固化方式为常压搅拌、真空负压条件下搅拌或者增大挥发面积，挥发固化方式的固化温度为25～38℃，固化时间为0.5～8h，真空负压条件的真空度为-0.001至-0.1MPa。
7.根据权利要求6所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，在真空负压条件下增大挥发面积的具体方式为：利用蠕动泵将乳液泵入温度可控的真空环境管道，随后将乳液接出，反复通过蠕动泵输送至抽真空的管道内。
8.根据权利要求1所述的载利拉鲁肽缓释微球的制备方法，其特征在于，所述内水相和油相的体积比为1:5～1:20，优选1:5～1:15；所述油相和所述外水相体积比为1:5～1:100，优选1:5～1:50。
9.一种载利拉鲁肽缓释微球，其特征在于，采用如权利要求1-8任一项所述制备方法制得，所述载利拉鲁肽缓释微球粒径分布跨度Span值小于1.5，包埋率高于80％，能持续释放20～40天。
10.根据权利要求9所述的载利拉鲁肽缓释微球，其特征在于，所述载利拉鲁肽缓释微球中利拉鲁肽的重量含量为5～25％，聚合物的重量含量为75～95％；
所述载利拉鲁肽缓释微球平均粒径为5-50μm；
所述载利拉鲁肽缓释微球在体外加速释放过程中0.5h释放低于20％。
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