CN113018277B - 注射用缓释制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及注射用缓释制剂及其制备方法。该制备方法用于基于水包油包水(W1/O/W2)复乳法制备蛋白多肽类药物的注射用缓释微球,该方法还同时包括如下步骤:A)将含有赋形剂的内水相的pH值调节在使得蛋白多肽类药物活性成分具有稳定性且不会在制备过程中产生影响微球制剂质量的杂质的范围内;B)调节内水相与油相的体积比;C)调节外水相中含有的表面活性剂用量;D)调节初乳与所述外水相的体积比例。根据该方法一方面可以克服在使用W1/O/W2复乳法时面临的初乳制备工艺的选择难点,从而使其在产业化操作时相对简单易行,具有更好的普适性;另一方面,可以制备出微球粒度分布较窄的注射用缓释微球制剂,且其包封率提高、突释率减小、持续释放时间延长。
Description
技术领域
本发明涉及一种降糖药的注射用缓释制剂及其制备方法,尤其涉及一种索马鲁肽注射用缓释微球制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus)是一种全球性的代谢混乱疾病,主要特征是长期存在的高血糖。糖尿病伴随着慢性高血糖状态并引发一系列综合症,对心血管,肾脏,和眼等多器官都有损伤甚至引起功能衰竭。
糖尿病主要分为四大类:一型糖尿病,二型糖尿病,妊娠糖尿病,和其它特殊糖尿病。据国际糖尿病联盟(IDF)统计在2017年,全球约4.25亿人患有糖尿病,糖尿病直接导致3.2-5百万患者的死亡。据IDF预计,到2035年全球将接近5.92亿糖尿病患者。中国作为糖尿病的重灾区,据调查显示中国18岁以上的成人糖尿病患病率已经高达11.6%。其中二型糖尿病的患者占患糖尿病总人群的90%。随着全球经济不断稳步发展,人们物质生活水平不断提高,糖尿病的发病率会有增加的趋势。
目前用于治疗二型糖尿病的方法主要是联合使用胰岛素和/或降糖药物以维持血糖的控制。降糖药物主要分为:磺脲类、双胍类、噻唑烷二酮类、α糖苷酶抑制剂类、和胰高血糖肽-1(GLP-1)类似物。作为新型治疗糖尿病的药物,胰高血糖肽-1(GLP-1)类似物具有很好的降糖效果,并且能极大地减少传统治疗糖尿病药物引起的低血糖风险。GLP-1类似物有独特的作用机理:当葡萄糖浓度升高时,能激活GLP-1受体引起胰岛β细胞分泌胰岛素;通过葡萄糖依赖的模式抑制胰高血糖素的分泌;能延迟胃肠道排空的时间。因此在高血糖的情况下刺激胰岛素的分泌和抑制胰高血糖素的分泌,而在低血糖时减少胰岛素的分泌,从而避免低血糖风险的副作用。研究发现GLP-1类似物还具备潜在的保护胰岛β细胞功能,和通过控制饥饿感产生减脂肪减重作用。这些特别的功效和机理使GLP-1这类药物成为近年来治疗糖尿病研究的热门方向。
索马鲁肽(semaglutide)是由诺和诺德公司研发的GLP-1类似物(WO 2006/097537A2),用于治疗成年人的二型糖尿病。索马鲁肽注射剂于2017年12月5日在美国批准上市,在之后2年多的临床检验,已经被证实在治疗二型糖尿病具有良好的治疗效果。该注射剂型是皮下注射,每周注射给药一次,相比之前的GLP-1类似物,该索马鲁肽注射用制剂给患者带来了较好的顺应性。然而,为了能提供给患者更好的顺应性、更好的接受程度、以及更少的用药频率,有必要将索马鲁肽制备成具有更长的持续释放时间(理想情况下,如约一个月到三个月)的剂型,从而能让药物在体内获得更平稳和长时间的有效浓度,而且能减少总给药量,最终降低患者的总用药消费,为人类提供更好的医疗保障。
缓释微球注射给药系统已经在临床医学领域得到了广泛的应用。缓释微球是指由高分子材料形成的粒径尺寸大小分布在5~250μm的球状实体,能将药物分散或包埋在高分子材料中。然而,微粒制剂的载药量有限、生产工艺和质量标准较为复杂。此外,针对易溶于水的蛋白多肽类药物(例如索马鲁肽),通常采用水包油包水(W1/O/W2)复乳法制备微球,然而,在此复乳法中,初乳的制备方式(如均质法、超声法)以及初乳液的稳定性均对微球的载药量和释放行为产生较大影响,从而使得如何选择合适的初乳制备工艺成为复乳法中主要难点之一(李勋等,“缓释微球制剂的研究进展”,北京化工大学学报(自然科学版),第44卷第6期(2017):1-11)。因此,在将缓释微球注射给药系统应用于索马鲁肽注射用制剂以有效地延长其持续释放时间时,面临着如下必须克服的技术挑战:1)挑选聚合物载体材料,使其制剂能够有效地延长蛋白多肽类药物在体内的释放时间,并确保将API在体内释放的数据稳定在需要的血药浓度内;2)改进生产工艺,提高微粒制剂的包封率和载药量,以满足在延长的持续释放期间内所需的API释放总量,并避免明显突释现象的发生,以及实现较窄的微球粒度分布;3)克服现有的水包油包水(W1/O/W2)复乳法在初乳制备工艺方面的选择性困难,从而改善制备蛋白多肽类药物缓释微球制剂的生产工艺的产业化可行性并简化其复杂性。
发明内容
针对上述技术问题,发明人在研究中发现,在使用W1/O/W2复乳法制备包括了蛋白多肽类药物活性成分和生物相容性高分子材料的注射用缓释微球制剂时,通过对如下步骤的同时调控,即:1)内水相中含有赋形剂且该内水相pH值被调节在能够使得该蛋白多肽类药物活性成分具有稳定性、且不会在制备过程中产生影响微球制剂质量的杂质(例如,当该蛋白多肽类药物活性成分仅为索马鲁肽或其药学可接受的盐时,一般而言,单杂含量不超过1%,总杂含量不超过3%,则不会影响微球制剂质量)的范围内、2)调节初乳的水油相体积比、3)控制外水相中表面活性剂用量、以及4)调节初乳与外水相的体积比例,能够克服不同的初乳制备方式(如超声法、剪切法、均质法等)对微球制剂外观形貌及释放行为的影响;此外,发明人还发现,通过上述方法制备出的注射用缓释微球制剂不仅微球粒度分布窄(SPAN值(SPAN=(D90-D10)/D50)小于2),而且包封率显著地提高、突释率减小,且具有被延长的持续释放时间。
因此,本发明的目的在于提供一种注射用缓释制剂的制备方法,用于制备蛋白多肽类药物的注射用缓释微球制剂。根据该方法,一方面可以克服在使用W1/O/W2复乳法制备蛋白多肽类药物制剂时面临的初乳制备工艺的选择难点,从而使其在产业化操作时相对简单易行,具有更好的普适性;另一方面,可以根据该方法制备出微球粒度分布较窄的注射用缓释微球制剂,并且其包封率显著地提高、突释率减小、延缓释放(sustained-release)时间被延长。
本发明的目的还在于提供一种基于上述方法制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法。
本发明的目的还在于提供一种注射用缓释制剂,包括根据上述方法制备的索马鲁肽注射用缓释微球,该索马鲁肽注射用缓释微球的粒度分布较窄,并且包封率显著提高、突释率小。此外,与现有的需要每周进行注射的索马鲁肽注射用制剂相比,根据本发明的索马鲁肽注射用缓释微球制剂实现了更长的持续释放时间,在理想情况下,可以实现如大约一个月、两个月、三个月的持续释放时间,从而显著地减少了注射次数和药物耐受性,而且还使得索马鲁肽的释放速率稳定,提高了患者的顺应性和接受程度。
为了实现以上目的,本发明的技术方案如下:
本发明提供了一种注射用缓释制剂的制备方法,用于基于水包油包水(W1/O/W2)复乳法制备蛋白多肽类药物的注射用缓释微球,该注射用缓释微球包括蛋白多肽类药物活性成分和生物相容性高分子材料,该制备方法同时包括如下步骤,以使得该制备方法适用于不同的初乳制备方式,如:超声、剪切、均质方式:
A)将该蛋白多肽类药物活性成分溶于含有赋形剂的注射用水中,形成内水相,并将该内水相的pH值调节在使得该蛋白多肽类药物活性成分具有稳定性且不会在制备过程中产生影响微球制剂质量的杂质的范围内;
B)调节该内水相与溶有该生物相容性高分子材料的油相的体积比例;
C)将表面活性剂溶于水,制得外水相,并且调节该外水相中含有的该表面活性剂用量;
D)调节该初乳与该外水相的体积比例。
在根据本发明的实施例中,该蛋白多肽类药物活性成分为索马鲁肽药物活性成分,在根据该制备方法的步骤A)中,将该索马鲁肽药物活性成分溶于含有赋形剂的注射用水中,且该内水相的pH值为7~8.5;在步骤B)中,该内水相与溶有该生物相容性高分子材料的油相的体积比例为1:5~1:50;在步骤C)中,该外水相中含有0.1~5wt%该表面活性剂;以及在步骤D)中,该初乳与该外水相的体积比例为1:10~1:50。
在根据本发明的实施例中,该制备方法中的该生物相容性高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和/或聚乳酸(PLA)。
在根据本发明的实施例中,该制备方法中的该表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或其组合,尤其优选地,该表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)。
在根据本发明的一个优选实施例中,该制备方法还包括使用膜乳化技术制备复乳的步骤。
本发明还提供了一种基于上述方法制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法,具体包括如下步骤:
a)将索马鲁肽药物活性成分溶于含有赋形剂的注射用水中,形成索马鲁肽注射用水溶液,用pH调节剂调节pH值为7~8.5,作为内水相;
b)将生物相容性高分子材料溶于有机溶剂,形成有机溶液,作为油相;
c)将步骤a)中获得的该内水相与步骤b)中获得的该油相混合,其中,该内水相与该油相的体积比为1:5~1:50;并通过高剪切、超声仪和高压均质机的一种或几种初乳制备方式混合进行乳化,形成初乳;
d)将表面活性剂溶于水,制得外水相,其中,该外水相中含有0.1~5wt%表面活性剂;
e)将步骤c)中的该初乳加入在步骤d)中获得的该外水相中,并进行均匀搅拌形成复乳,或者将步骤c)中的该初乳倒入装有步骤d)中获得的作为该外水相的溶液的膜乳化器中进行膜乳化,形成复乳;其中,该初乳与该外水相的体积比为1:10~1:50;可选地,该膜乳化器可以为常规膜乳化器或快速膜乳化器;该膜乳化器的乳化压力可以为0.005MPa~1MPa;
f)将步骤e)中获得的该复乳搅拌、固化、过滤,形成微球湿品;
g)将步骤f)中获得的该微球湿品进行水洗、真空冷冻干燥,即得索马鲁肽注射用缓释微球。
根据本发明,该索马鲁肽药物活性成分可以是索马鲁肽或其药学可接受的盐,也可以是该索马鲁肽或其药学可接受的盐与一种或多种其他药物活性成分的混合物;优选地,该索马鲁肽药物活性成分是索马鲁肽或其药学可接受的盐,或者是该索马鲁肽或其药学可接受的盐与一种或多种不会与其产生协同作用的药物活性成分的混合物。根据本发明,在步骤a)中,内水相中的索马鲁肽药物活性成分的质量浓度可以为1.9%至15%之间,优选地,为2%~14%。
根据本发明,该索马鲁肽注射用水溶液的pH值应该被调节在能够使得索马鲁肽药物活性成分具有稳定性且不会在制备过程中产生影响微球制剂质量的杂质(例如当该索马鲁肽药物活性成分仅为索马鲁肽或其药学可接受的盐时,一般而言,单杂含量不超过1%,总杂含量不超过3%)的范围内,该pH值的范围为7~8.5,例如,该pH值可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或者8.5。该内水相pH值范围的调节可以通过pH调节剂实现。根据本发明,在步骤a)中,该pH调节剂可以为盐酸溶液、氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液、磷酸二氢钠溶液和磷酸氢二钠中的一种或其混合物。
根据本发明,在制备该索马鲁肽注射用缓释微球制剂的步骤a)中在注射用水中加入赋形剂。该赋形剂是溶入注射用水中的辅料,与索马鲁肽药物活性成分共同存在于内水相中,用以保护蛋白多肽类药物活性成分的稳定性,并且作用于药物的释放,调整药物释放行为。该赋形剂可以选自聚乙二醇(PEG)、明胶、甘油、甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、丙二醇、山梨糖醇、氯化锌、硫酸锌、醋酸锌和人血清蛋白中的一种或其混合物。在根据本发明的实施例中,赋形剂的质量浓度范围可以为0.1%~10%。此外,本领域技术人员能够知晓,赋形剂的有效范围可以根据所使用的赋形剂的不同而有所不同。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤b)中,该生物相容性高分子材料可以选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚乙酸内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、乳酸-羟基乙酸与聚乙二醇嵌段共聚物(PLGA-PEG)中一种或其混合物;优选地,该生物相容性高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和/或聚乳酸(PLA)。
在根据本发明的优选实施例中,该生物相容性高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),并且在PLGA中的乙交酯(LA)、丙交酯(GA)的摩尔比例为15:85~95:05,分子量为5~200千道尔顿;其中,PLGA的型号和分子量可以是:PLGA(LA:GA为50:50;Mw 10000~85000道尔顿)、PLGA(LA:GA为55:45;Mw 15000~55000道尔顿)、PLGA(LA:GA为65:35;Mw15000~55000道尔顿)、PLGA(LA:GA为75:25;Mw 10000~25000道尔顿)、PLGA(LA:GA为50:50;Mw 20000~100000道尔顿)、PLGA(LA:GA为75:25;Mw 45000~100000道尔顿)、PLGA(LA:GA为95:05;Mw 25000~45000道尔顿)、PLGA(LA:GA为75:25;Mw 50000~120000道尔顿)、PLGA(LA:GA为85:15;Mw 55000~85000道尔顿)、或者PLGA(LA:GA为95:05;Mw 30000~85000道尔顿)。在根据本发明的另外优选实施例中,该生物相容性高分子材料为聚乳酸(PLA),分子量为10~55千道尔顿。其中,PLGA的型号和分子量可以是:PLA(Mw 10000~25000道尔顿)、或者PLA(Mw 15000~55000道尔顿)。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤b)中,该有机溶剂可以为二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙醚、丙酮、二氧六环、乙腈或四氢呋喃中的一种或其混合物,优选地,该有机溶剂为二氯甲烷。
在根据本发明的实施例中,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤b)中,将PLGA溶入二氯甲烷溶液中,并且该PLGA的浓度可以为5~25%,进一步地,可以为7~15%。
在根据本发明的优选实施例中,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤c)中,该内水相与该油相的体积比为1:10~1:35,更优选地,该内水相与该油相的体积比为1:11~1:25。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤c)中,初乳制备方式可以为高剪切、超声仪、高压均质机、或其组合。其中,该高剪切的转速可以为3000rpm~20000rpm,剪切时间可以为0.5min~10min;该超声仪的功率可以为100W~650W,超声时间可以为0.5min~10min;该高压均质机的压力可以为150bar~1000bar,并且连续均质的次数可以为2次~10次。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤d)中,该表面活性剂可以选自聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)、羟乙基纤维素(HEC)、β-环糊精、泊洛沙姆188、普郎尼克F88、普郎尼克F127、明胶、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸司盘和吐温中的一种或其混合物;优选地,该表面活性剂为PVA、PVP或其组合,尤其优选地,该表面活性剂为PVA。在根据本发明的实施例中,在该外水相中含有0.1~5wt%PVA,优选地,该PVA的用量为0.4~4wt%。在根据本发明的另外实施例中,在该外水相中含有0.1~5wt%PVP,优选地,该PVP的用量为0.5~4wt%。
在根据本发明的实施例中,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤e)中,该初乳与该外水相的体积比为1:20~1:50。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤e)中,该搅拌速度可以为1500-5000rpm,搅拌时间可以为15-120min;
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤f)中,该固化温度可以为5℃~45℃,固化时间可以为2h~24h。
根据本发明,在制备索马鲁肽注射用缓释微球的方法的步骤g)中,可以在从步骤f)中获得的该微球湿品中加入保护剂。该保护剂是被加入微球湿品种中的辅料,以增加微球干粉的流动性和分散,并且调节微球的渗透压和保护蛋白多肽类药物的稳定性和活性。该保护剂可以为选自聚乙二醇(PEG)、明胶、甘油、甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、丙二醇、山梨糖醇、氯化锌、硫酸锌、醋酸锌和人血清蛋白的一种或其混合物;优选地,该保护剂为甘露醇。
本发明还提供了一种注射用缓释制剂,包括根据上述方法制备的索马鲁肽注射用缓释微球,该索马鲁肽注射用缓释微球包括索马鲁肽药物活性成分、生物相容性高分子载体材料、和药学上可以接受的其他辅料。
该索马鲁肽注射用缓释微球制剂的持续释放时间约为30~90天,即:可以为约四周~三个月,例如,大约四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、或者大约一个月、两个月、三个月。其中,“约”与“大约”代表的差值为“(±1~6天)”。
在根据本发明的优选实施例中,该索马鲁肽注射用缓释微球所包括的该生物相容性高分子载体材料为PLGA(LA:GA为50:50;Mw 10000~85000道尔顿)、PLGA(LA:GA为55:45;Mw 15000~55000道尔顿)、PLGA(LA:GA为65:35;Mw 15000~55000道尔顿)、或者PLGA(LA:GA为75:25;Mw 10000~25000道尔顿),其相应的注射用缓释制剂的持续释放时间为大约4周(或者大约一个月)。
在根据本发明的另外优选实施例中,该索马鲁肽注射用缓释微球所包括的该生物相容性高分子载体材料为PLGA(LA:GA为50:50;Mw 20000~100000道尔顿)、PLGA(LA:GA为75:25;Mw 45000~100000道尔顿)、PLGA(LA:GA为95:05;Mw 25000~45000道尔顿)、或者PLA(LA:GA为100:00;Mw 10000~25000道尔顿),其相应的注射用缓释制剂的持续释放时间为大约8周(或者大约两个月)。
在根据本发明的另外优选实施例中,该索马鲁肽注射用缓释微球所包括的该生物相容性高分子载体材料为PLGA(LA:GA为75:25;Mw 50000~120000道尔顿)、PLGA(LA:GA为85:15;Mw 55000~85000道尔顿);PLGA(LA:GA为95:05;Mw 30000~85000道尔顿);PLA(LA:GA为100:00;Mw 15000~55000道尔顿),其相应的注射用缓释制剂的持续释放时间为大约12周(或者大约三个月)。
该药学上可以接受的其他辅料,包括表面活性剂和赋形剂。此外,该药学上可以接受的其他辅料还可以包括保护剂。
在根据本发明的一个实施例中,索马鲁肽注射用缓释制剂中的索马鲁肽缓释微球包括占微球重量的0.1~10%(w/w)的索马鲁肽药物活性成分,占重量70~99.5%的生物相容性高分子材料,以及占有微球重量0.4~20%的药学上可以接受的其他辅料。
根据本发明,该索马鲁肽注射用缓释微球的微球粒径(D50)为5-200μm,尤其地,该索马鲁肽注射用缓释微球的微球粒度分布SPAN值小于2。
通过本发明的技术方案,达到了如下的有益效果:
1)根据本发明,通过同时控制水包油包水(W1/O/W2)复乳法中含有赋形剂的内水相的pH值、内水相与油相的体积比例、表面活性剂在外水相的用量、以及初乳与外水相的体积比例,克服了现有技术中基于复乳法制备蛋白多肽类微球制剂时在初乳制备方式(如:搅拌、超声或均质方式)方面的选择难点,从而简化了微球制剂工艺的复杂性,并有效地改善了该微球制剂生产工艺的产业化可行性;并且,经其制备的蛋白多肽类药物注射用微球制剂的微球粒度分布较窄(SPAN值小于2),且其包封率显著地提高、突释率减小、持续释放时间被延长。
2)根据本发明的制备方法,发明人成功地制备了索马鲁肽的注射用缓释微球制剂,其具有以下优点:该索马鲁肽注射用微球制剂的微球粒度分布较窄(SPAN值小于2),并且包封率显著提高、突释率小、持续释放时间较长(在理想的情况下,可以达到大约一个月、两个月或者三个月)。此外进一步地,通过使用根据本发明的膜乳化技术进行制备不仅能够使得所制得的微球粒度分布更窄,而且有助于进一步地提高包封率。上述优点使索马鲁肽在微球的释放速率稳定(基本实现了在体外释放测试中的线性的零级释放),很好地解决了常见的药物释放不稳定的问题。
附图说明
图1示出根据本发明实施例1制备的索马鲁肽注射用缓释微球扫描电镜图。
图2示出根据本发明实施例2制备的索马鲁肽注射用缓释微球扫描电镜图。
图3示出根据本发明实施例3制备的索马鲁肽注射用缓释微球扫描电镜图。
图4示出根据本发明实施例1、2、3制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体外释放-时间曲线。
图5示出根据本发明实施例5、6、8制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体外释放-时间曲线。
图6示出根据本发明实施例7制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体外释放-时间曲线。
图7示出根据本发明实施例2制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体内药代动力学曲线。
图8示出根据本发明实施例5制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体内药代动力学曲线。
图9示出根据本发明实施例7制备的索马鲁肽注射用缓释微球的体内药代动力学曲线。
图10示出根据比较制剂5制备的索马鲁肽注射用缓释微球扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明,但本发明不应受下面公开的具体实施的限制。
在下面的实施例中,将通过根据本发明的索马鲁肽注射用微球的制备方法,示例性地制备索马鲁肽注射用微球制剂,其中,使用的索马鲁肽的分子式为C187H291N45O59,摩尔质量为4113.58g/mol(东圆珍等,“索马鲁肽的制备”,中国医药工业杂志2018,49(6):742-747)。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为4.8%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为2.4wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=10000~15000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为7%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:11),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液500mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:25)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和30℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.0~2.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。图1示出了在本实施例中根据本发明制备的索马鲁肽注射用缓释微球的微球扫描电镜图。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径(D50)为41~57μm,SPAN值(SPAN=(D90-D10)/D50)为1.44。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为81.3~87.6%,收率为78~86%。
实施例2:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为3.0%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为3.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=10000~15000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为7%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:14),剪切14000rmp形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液500mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:25)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和30℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.0~2.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。图2示出了在本实施例中根据本发明制备的索马鲁肽注射用缓释微球的微球扫描电镜图。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为41~56μm,SPAN值为1.57。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为81.8~89.5%,收率为75~86%。
实施例3:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为2.0%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为6.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=10000~15000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为15%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:14),高压均质350bar形成初乳;配置浓度为1.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液240mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:25)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和30℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.0~2.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。图3示出了在本实施例中根据本发明制备的索马鲁肽注射用缓释微球的微球扫描电镜图。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为43~57μm,SPAN值为1.49。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为80.2~88.4%,收率为76~89%。
实施例4:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为2.0%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=10000~15000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为15%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:10),高压均质350bar形成初乳;配置浓度为0.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液300mL,作为外水相;将初乳加入到膜乳化器中,调整膜乳化器的乳化压力为0.35MPa在上述外水相中进行乳化,形成复乳,其中,初乳与外水相的体积比为1:30;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.9~2.0wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。图3示出了在本实施例中根据本发明制备的索马鲁肽注射用缓释微球的微球扫描电镜图。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为45~52μm,SPAN值为1.06。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为80.4~85.2%,收率为75~85%。
实施例5:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.6且含质量浓度为5.0%葡萄糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为10wt%内水相溶液;称取600mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=45000~100000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为10%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),剪切15000rpm形成初乳;配置浓度为0.5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液150mL,作为外水相;将初乳加入到膜乳化器中,调整膜乳化器的乳化压力为0.35MPa在上述外水相中进行乳化,形成复乳,其中,初乳与外水相的体积比为1:30;复乳在300rpm的搅拌转速下和30℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在5.6~5.9wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为44~50μm,SPAN值为1.08。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为78.5~89.0%,收率为75~86%。
实施例6:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为10.0%丙二醇的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为10.0wt%内水相溶液;称取450mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=45000~100000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为7%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液200mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在7.50~7.82wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为40~55μm,SPAN值为1.42。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为82.4~91.8%,收率为74~86%。
实施例7:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为2%海藻糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为6wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为95:05,Mw=30000~100000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:18),超声400W形成初乳;配置浓度为0.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液460mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.97~2.0wt%的索马鲁肽注射用制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为35~58μm,SPAN值为1.52。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为83.6~89.4%,收率为77~87%。
实施例8:
称取48mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为4.8%明胶的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.8wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为50:50,Mw=20000~100000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:15),剪切15000rpm形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液720mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:45)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.9~2.1wt%的索马鲁肽注射用制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为39~58μm,SPAN值为1.57。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为80.4~89.7%,收率为73~87%。
检测例1:体外释放率测试
在本检测例1中,以上述实施例1-8中制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂为例,进行体外释放率测试。其具体方法如下:
分别精密称取实施例1-3、实施例5、6和8、以及实施例7中所制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂30mg,将其加入至15mL离心管中,加入15mL预热好的释放介质,释放介质为0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液,然后放置在37℃保温箱中,在对应时间点取样1mL再补入1mL对应释放介质。图4(针对实施例1-3)、图5(针对实施例5、6和8)和图6(针对实施例7)示例性地示出了测试所得的累积释放率曲线图。关于测试所得的实施例1-8的24小时突释率、释放持续时间和总累积释放率参见表1:
表1:测试所得的实施例1-8的24小时突释率、体外释放持续时间和总累积释放率:
测试样品 | 24小时突释率(%) | 体外释放持续时间(天) | 总累积释放率(%) |
实施例1 | 3.16 | 30 | 96.7 |
实施例2 | 4.33 | 30 | 94.9 |
实施例3 | 2.95 | 30 | 93.2 |
实施例4 | 3.68 | 30 | 95.4 |
实施例5 | 1.62 | 60 | 94.7 |
实施例6 | 1.58 | 60 | 93.7 |
实施例7 | 1.12 | 90 | 89.7 |
实施例8 | 2.14 | 60 | 91.3 |
结合表1和图4、5、6的结果可以看出,根据本发明的方法所制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂的释放性能平稳;根据其所包含的生物相容性高分子载体的组成,该制剂能持续释放大约一个月至三个月左右,并且药物释放基本完全(至少大约90%),不会出现药物突释的现象,达到了延缓释放(sustained-release)的要求。
检测例2:大鼠体内的药代动力学实验
在本检测例2中,分别以上述实施例2、5、7中制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂为例,进行在大鼠体内的药代动力学实验。其具体方法如下:
选用2型糖尿病雄性成年SD大鼠动物模型作为研究对象,大鼠体重为220~250g,于大鼠腹部皮下注射方式给药根据本发明的实施例2、5、7制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂,给药量分别为0.66mg/kg(实施例2)、1.32mg/kg(实施例5)和1.98mg/kg(实施例7),并与给药后特定时间进行尾静脉取血0.3mL,并将样品置于含30μL抑肽酶的离心管中,室温临时保存,待血液凝固后离心制备得到血清样品。采用ELISA试剂盒,测定每个时间点血浆样品中索马鲁肽的血药浓度(pg/mL)。体内药代动力学曲线分别见图7(针对实施例2)、图8(针对实施例5)以及图9(针对实施例7)。
从图7-图9可以看出,根据本发明的方法所制备的索马鲁肽注射用缓释微球制剂在大鼠体内的释放性能与体外释放性能基本一致。根据本发明的注射用缓释微球制剂可以将药物浓度维持在药物稳定浓度范围(例如索马鲁肽在人体实验中稳定血药浓度约为25nmol/mL,参见:Petri,K.C.C.et.al.,“Semaglutide s.c.Once-Weekly in Type2Diabetes:A Population Pharmacokinetic Analysis”,Diabetetes Ther(2018)9:1533-1547)内,这不仅与药物的平稳释放性能相关,而且也说明了,在根据本发明的注射用缓释微球制剂中,作为药物活性成分的索马鲁肽药物活性成分与辅料之间具有稳定性,没有出现杂质、交叉反应等,并且也没有出现明显的药物或辅料的降解现象。
比较例1:生物相容性高分子材料组成的筛选
在本比较例1中,在根据本发明的上述实施例1-8的基础上,比较了其他的生物相容性高分子材料或不同的成分组成和分子量,其中包括选用了PLA 100(Mw=15000~18000道尔顿)(参见比较制剂1)、PLGA 85:15(Mw=55000~85000道尔顿)(参见比较制剂2)、PLGA和PEG的两嵌段共聚物(参见比较制剂3)、或者PLGA 50:50(Mw=15000~18000道尔顿)(参见比较制剂4)。
1、根据本发明的制备方法制备比较制剂1-4:
根据本发明的制备方法制备上述比较制剂1-4。不同比较制剂1-4的制备方法的主要区别在于添加的生物相容性高分子材料(或其成分组成和分子量)不同。其中,可以适当地调整其他的工艺参数,以制备出可以缓慢释放药物的缓释微球制剂。制备上述比较制剂1-4的方法具体如下:
1)制备比较制剂1:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为9.6%山梨醇的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.8wt%内水相溶液;称取1200mg PLA100(Mw=10000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLA100浓度为10%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLA100的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液350mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:35)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.8~3.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为46~53μm,SPAN值为1.60。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为81.7~89.8%,收率为76~86%。
2)制备比较制剂2:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为8.0%氧化锌的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为8.0wt%内水相溶液;称取900mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为85:15,Mw=86000~88000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液200mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:35)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在3.8~4.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为41~55μm,SPAN值为1.43。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为82.4~90.5%,收率为75~86%。
3)制备比较制剂3:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为2.4%硫酸锌的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.8wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA和PEG的两嵌段共聚物(PLGA:PEG为85:15,Mw=55000~85000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA-PEG共聚物浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA-PEG共聚物的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:15),超声500W形成初乳;配置浓度为0.8%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液540mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:45)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.9~2.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为45~52μm,SPAN值为1.49。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为80.1~86.3%,收率为75~85%。
4)制备比较制剂4:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为1.2%醋酸锌的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.8wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为50:50,Mw=5000~9000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为15%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液440mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:45)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.9~2.1wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为46~56μm,SPAN值为1.55。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为81.5~85.8%,收率为73~84%。
2、比较制剂1-4的体外释放率测试:
根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法,对比较制剂1-4进行体外释放率测试。比较制剂1-4的24小时突释率参见表2:
表2:根据体外释放率测试所得的比较制剂1-4的24小时突释率(%):
比较制剂1 | 比较制剂2 | 比较制剂3 | 比较制剂4 |
1.06 | 1.45 | 1.57 | 6.44 |
此外,在体外释放率测试中还可以观察到,比较制剂1(三个月剂型)和比较制剂2(三个月剂型)的微球出现API在前一周释放过于缓慢的现象,其中,比较制剂1的第一周的累积释放率少于4%;比较制剂2的第一周的累积释放率少于6%,两者的API浓度低于索马鲁肽的有效药物浓度,且其后期API释放不完全,其总累积释放率为70-80%,基本不足以维持药物的效果;在比较制剂3(一个月剂型)的体外释放测试中,同样观察到微球释放偏慢(累积释放率少于80%)的现象,且API释放剂量低于索马鲁肽的有效药物剂量;在比较制剂4(一个月剂型)的体外释放测试中,观察到该微球制剂在21天的累积释放率达到93%,可见其API释放过快,不能满足一个月的稳定释放,生物相容性高分子材料在体内过快降解。
综合本比较例1的结果,可以得出下列有关生物相容性高分子材料组成的筛选的结论:
在根据本发明的索马鲁肽注射用缓释微球制剂中,其可以所包含生物相容性高分子材料可以优选地为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),其中,PLGA中乙交酯(LA)、丙交酯(GA)的摩尔比例为15:85至85:15,分子量为5~200千道尔顿。
优选地,根据本发明的索马鲁肽注射用缓释微球制剂的持续释放时间约为一个月的辅料型号、组成及分子量具体如下:PLGA(LA:GA为50:50;Mw 10000~85000道尔顿);PLGA(LA:GA为55:45;Mw 15000~55000道尔顿);PLGA(LA:GA为65:35;Mw 15000~55000道尔顿);PLGA(LA:GA为75:25;Mw 10000~25000道尔顿);
优选地,根据本发明的索马鲁肽注射用缓释微球制剂的持续释放时间约为两个月的辅料型号及分子量具体如下:PLGA(LA:GA为50:50;Mw 20000~100000道尔顿);PLGA(LA:GA为75:25;Mw 45000~100000道尔顿);PLGA(LA:GA为95:05;Mw 25000~45000道尔顿);PLA(LA:GA为100:00;Mw 10000~25000道尔顿);
优选地,根据本发明的索马鲁肽注射用缓释微球制剂的持续释放时间约为三个月的辅料型号及分子量具体如下:PLGA(LA:GA为75:25;Mw 50000~120000道尔顿);PLGA(LA:GA为85:15;Mw 55000~85000道尔顿);PLGA(LA:GA为95:05;Mw 30000~85000道尔顿);PLA(LA:GA为100:00;Mw 15000~55000道尔顿)。
比较例2:
在本比较例2中,比较了通过三种不同的初乳制备方式制备的缓释微球。此三种初乳制备方式分别为超声(参见实施例1)、高剪切(参见实施例2)和高压均质(参见实施例3)。所制备的索马鲁肽注射用缓释微球的微球电镜扫描结果分别参见图1、图2和图3,其体外释放测试结果参见图4。结果表明,在根据本发明的方法中,三种初乳制备方式所制备的缓释微球在外观形貌上基本一致;此外,其基本一致的体外释放-时间曲线亦表明,在根据本发明的方法中,不同的初乳制备方式不会对制剂中药物的释放行为产生影响。
根据本发明的制备方法,可选地,该超声仪的功率为100W~650W,超声时间为0.5min~10min;该高剪切的转速为3000rpm~20000rpm,剪切时间为0.5min~10min;该高压均质机的压力为150bar~1000bar。
比较例3:
在本比较例3中,比较了通过两种不同的复乳制备工艺制备的缓释微球。该两种复乳制备工艺分别为搅拌(参见实施例3)和膜乳化(参见实施例4)。比较实施例3和实施例4的工艺参数和结果可以看出,虽然,根据实施例3和4所制备的索马鲁肽注射用缓释微球具有相似的性质(如包封率、收率、载药量、以及24小时突释率),然而,相比于实施例4(膜乳化复乳制备工艺),在实施例3(搅拌复乳制备工艺)中需要提高药物水浓度(至6.0%),并加入更多的表面活性剂(至1.5%PVA),以最终获得具有与实施例4相似性质的索马鲁肽注射用缓释微球。此外还可以从结果中看出,相比于实施例3所制备的微球粒度分布(43~57μm,SPAN值是1.49),在实施例4中所制备的微球粒度分布更窄(45~52μm,SPAN值是1.06)。类似的结果亦见于实施例5。
以上结果表明,通过使用膜乳化复乳制备工艺不仅能有助于提高缓释微球的包封率,而且还能够制得微球粒度分布更窄的缓释微球,从而进一步地稳定索马鲁肽在微球的释放速率。
比较例4:
在本比较例4中,比较了生物相容性高分子材料(尤其是PLGA)在油相中的浓度。在根据本发明的上述实施例1-8的基础上,本比较例3中还比较了油相中PLGA浓度分别为4.8%和22%的比较制剂5和比较制剂6。
制备上述比较制剂5、6的方法根据本发明的制备方法进行。不同比较制剂5、6的制备方法的主要区别在于油相中PLGA的浓度不同。其中,可以适当地调整其他的工艺参数,以最终生成可以用来进行比较的微球。制备上述比较制剂5、6的方法具体如下:
1)制备比较制剂5:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为3.6%聚乙二醇的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为1.2wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为50:50,Mw=20000~100000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为4.8%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:9),剪切15000rmp形成初乳;配置浓度为1.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液600mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:20)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和40℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.6~1.9wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为29~44μm,SPAN值为1.64。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为65.1~78.2%,收率为62~70%。在随后的体外释放率测试中(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法),其24小时突释率为5.84%。
2)制备比较制剂6:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为6%乳糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为6wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为22%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:10),剪切15000rmp形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液310mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:47)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和20℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.0~2.2wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为49~68μm,SPAN值为1.73。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为83.1~92.7%,收率为76~84%。在随后的体外释放率测试中(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法),其24小时突释率为3.61%。
此外,综合针对比较制剂5、6进行的体外释放率测试(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法)结果及微球粒径测试结果,可以看出,比较制剂5、6虽然具有SPAN值小于2的微球粒径分布(SPAN值分别为1.64、1.73),然而,比较制剂5的油相中辅料的浓度偏低,固化后形成的微球表面孔隙较大(见图10),微球在24小时内出现相比于实施例1-8较高的突释现象(其24小时突释率为5.84%);比较制剂6的油相中辅料的浓度略偏高,复乳后固化形成的微球粒径及其分布相比于实施例1-8偏大(为49~68μm,SPAN值为1.73)。
比较例5:
在本比较例5中,比较了内水相中作为药物活性成分的索马鲁肽的浓度。在根据本发明的上述实施例1-8的基础上,本比较例4中还比较了内水相中药物浓度分别为2.0%(初乳工艺超声600W)、2.0%(初乳工艺高剪切转速5000rmp)和15%的比较制剂7、比较制剂8和比较制剂9。
制备上述比较制剂7-9的方法根据本发明的制备方法进行。不同比较制剂的制备方法的主要区别在于内水相中的索马鲁肽的浓度不同。其中,可以适当地调整其他的工艺参数,以可以制备出用来进行比较的微球制剂。制备上述比较制剂7-9的方法具体如下:
1)制备比较制剂7:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为2%葡萄糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为1.9wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为4.8%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:15),超声600W形成初乳;配置浓度为0.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液580mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:20)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.0~1.3wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为43~58μm,SPAN值为1.60。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为42.9~53.7%,收率为75~85%。
2)制备比较制剂8:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为8%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为1,9wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=14000~25000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为15%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:5),剪切5000rmp形成初乳;配置浓度为3.5%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液500mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:47)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.4~1.7wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为46~59μm,SPAN值为1.58。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为60.3~69.7%,收率为69~78%。
3)制备比较制剂9:
称取72mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为7.5%甘油的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为15wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为10%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:56),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)注射用水溶液550mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:20)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和20℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.7~1.9wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为40~56μm,SPAN值为1.44。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为72.3~80.6%,收率为75~85%。
综上可见,相比于实施例1-8,比较制剂7和8由于内水相药物浓度偏低(为1.9%),导致内水相体积偏大,乳化制得的初乳不稳定,易破乳。并且,此问题无法通过调整制备工艺得以改善(参见比较制剂8)。这导致了微球的载药量偏低,并且包封率明显不足。与之相反,比较制剂9虽然具有较高(为15%)的内水相药物浓度,然而,微球制剂中的有关物质检查发现偏高。
比较例6:
在本比较例6中,比较了外水相中表面活性剂。在根据本发明的上述实施例1-8的基础上,本比较例6中还比较了外水相中表面活性剂分别为1%葡萄糖、1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)和2%吐温80的比较制剂10、比较制剂11和比较制剂12。
制备上述比较制剂10-12的方法根据本发明的制备方法进行。不同比较制剂10-12的制备方法的主要区别在于外水相中表面活性剂不同。其中,可以适当地调整其他的工艺参数,以可以制备出用来进行比较的微球制剂。制备上述比较制剂10-12的方法和结果具体如下:
1)制备比较制剂10:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为8.0%人血清蛋白的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为15%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:10),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的葡萄糖注射用水溶液400mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.1~1.8wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为41~62μm,SPAN值为2.10。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为79.5~86.2%,收率为67~77%。在随后的体外释放率测试中(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法),其24小时突释率为4.22%。
2)制备比较制剂11:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为8.0%海藻糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),超声500W形成初乳;配置浓度为1%的CMC-Na注射用水溶液490mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.3~1.7wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为40~58μm,SPAN值为1.53。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为78.8~84.5%,收率为67~77%。在随后的体外释放率测试中(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法),其24小时突释率为6.14%。
3)制备比较制剂12
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为10%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于二氯甲烷中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的二氯甲烷溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),超声500W形成初乳;配置浓度为2%的吐温80注射用水溶液490mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在2.1~2.2wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为37~59μm,SPAN值为1.46。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为88.9~89.7%,收率为65~76%。在随后的体外释放率测试中(根据本发明中检测例1所述的体外释放率测试的方法),其24小时突释率为7.23%。
经过对上述结果的比较可以发现,比较制剂10的微球粒度分布过宽(SPAN值大于2);此外,相比于实施例1-8,比较制剂11-12的微球制剂的突释率相对偏高(分别为6.14%、7.23%)。
比较例7:
在本比较例7中,比较了油相中的有机溶剂。在根据本发明的上述实施例1-8的基础上,本比较例7中还比较了分别以乙酸乙酯和四氢呋喃作为油相的有机溶剂的比较制剂13和比较制剂14。
制备上述比较制剂13、14的方法根据本发明的制备方法进行。不同比较制剂13、14的制备方法的主要区别在于油相中的有机溶剂不同。其中,可以适当地调整其他的工艺参数,以最终生成可以用来进行比较的微球。制备上述比较制剂13、14的方法和结果具体如下:
1)制备比较制剂13:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为10%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于乙酸乙酯中,制得PLGA浓度为10%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的乙酸乙酯溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:15),剪切15000rpm形成初乳;配置浓度为0.8%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液580mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和30℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.7~2.0wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为56~63μm,SPAN值为1.67。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为72.5~84.8%,收率为56~63%。
2)制备比较制剂14:
称取36mg索马鲁肽溶于pH=7.4且含质量浓度为10%蔗糖的注射用水溶液中,制得索马鲁肽质量浓度为4.0wt%内水相溶液;称取1800mg PLGA(其中乙交酯与丙交酯的摩尔比为75:25,Mw=5000~14000道尔顿),溶于四氢呋喃中,制得PLGA浓度为12%的溶液,作为油相;将索马鲁肽溶液移入PLGA的四氢呋喃溶液中,在室温将上述内水相和油相两种溶液混合(水:油体积比为1:12.5),剪切15000rpm形成初乳;配置浓度为1%的聚乙烯醇(PVA)注射用水溶液490mL,作为外水相;将水包油的初乳加入到上述外水相溶液(初乳与外水相的体积比为1:40)中,在3500rpm的转速下搅拌2分钟,混合均匀,形成复乳;复乳在300rpm的搅拌转速下和25℃温度下去除有机溶剂,挥发固化微球10小时;固化结束后的乳液用过滤器进行微球的过滤、收集,并用蒸馏水多次洗涤,然后收集,冷冻干燥,分装成实际载药剂量在1.7~2.0wt%的索马鲁肽缓释微球制剂。
该索马鲁肽注射用制剂的微球平均粒径为57~69μm,SPAN值为1.71。将制得的索马鲁肽缓释微球用HPLC进行定量测定,包封率为71.5~83.2%,收率为67~75%。
经过对结果的比较发现,相比于实施例1-8,比较制剂13和14的微球产率、包封率和载药量都偏低,由于微球中药物含量过低,使其不能满足一个月的长效持续释放所需要最少药量。
比较例8
在本比较例8中,比较了适用于根据本发明的方法制备索马鲁肽注射用缓释微球时步骤1中的内水相的pH值范围。在本比较例中,各比较制剂的制备方法如实施例1所述,其不同之处仅在于改变了内水相pH。随后,根据本领域的常规方法检测单杂和总杂的含量。其结果如下表3所示:
表3:内水相pH值与其所对应的制剂的单杂含量和总杂含量:
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种索马鲁肽注射用缓释微球的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
a)将索马鲁肽药物活性成分溶于含有赋形剂的注射用水中,形成索马鲁肽注射用水溶液,用pH调节剂调节pH值为7 ~ 8.5,作为内水相;所述内水相中的所述索马鲁肽药物活性成分的质量浓度为2% ~ 14%;
b)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于二氯甲烷,形成有机溶液,作为油相;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物在所述油相中的质量百分比浓度为7%~15%;所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯和丙交酯的摩尔比为75:25,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为45000~100000道尔顿或者50000~120000道尔顿;或者所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯和丙交酯的摩尔比为95:05,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为30000~85000道尔顿;或者所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯和丙交酯的摩尔比为50:50,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为20000~100000道尔顿;
c)将步骤a)中获得的所述内水相与步骤b)中获得的所述油相混合乳化,形成初乳;其中,所述内水相与所述油相的体积比为1:11~1:25;
d)将表面活性剂溶于水,制得外水相,其中,所述外水相中含有0.1~5 wt%表面活性剂;所述表面活性剂为聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮;
e)将步骤c)中的所述初乳倒入装有步骤d)中获得的作为所述外水相的溶液的膜乳化器中进行膜乳化,形成复乳;其中,所述初乳与所述外水相的体积比为1:10 ~ 1:50;
f)将步骤e)中获得的所述复乳进行搅拌、固化、过滤,形成微球湿品;
g)将步骤f)中获得的所述微球湿品进行水洗、真空冷冻干燥,得索马鲁肽注射用缓释微球。
2.根据权利要求1所述的索马鲁肽注射用缓释微球的制备方法,其特征在于,所述赋形剂包括聚乙二醇、明胶、甘油、甘露醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、丙二醇、山梨糖醇、氯化锌、硫酸锌、醋酸锌和人血清蛋白中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的索马鲁肽注射用缓释微球的制备方法,其特征在于,所述赋形剂在所述内水相中的质量百分比浓度为0.1%~10%。
4.根据权利要求1至3任一项所述的索马鲁肽注射用缓释微球的制备方法,其特征在于,所述步骤c)中所述初乳的制备方式包括剪切、超声和均质中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的索马鲁肽注射用缓释微球的制备方法,其特征在于,所述剪切的转速为3000rpm~20000rpm,所述剪切的时间为0.5min~10min;所述超声的功率为100W~650W,所述超声的时间为0.5min~10min;所述均质的压力为150bar~1000bar,所述均质的次数为2次~10次。
6.一种注射用缓释制剂,其特征在于,包括根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法所制备的索马鲁肽注射用缓释微球。
7.如权利要求6所述的注射用缓释制剂,其特征在于,所述索马鲁肽注射用缓释微球的持续释放时间为一个月、两个月或者三个月。
8.如权利要求6所述的注射用缓释制剂,其特征在于,所述索马鲁肽注射用缓释微球包括占微球质量的0.1%~10%的索马鲁肽药物活性成分。
9.如权利要求6所述的注射用缓释制剂,其特征在于,所述索马鲁肽注射用缓释微球的微球粒径D50为5μm-200μm。
10.如权利要求6-9中任意一项所述的注射用缓释制剂,其特征在于,所述索马鲁肽注射用缓释微球的微球粒度分布SPAN值小于2。
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