KR102005385B1 - 부위-특이적 모노-치환 페길화 엑센딘 유사체 및 그것의 제조방법 - Google Patents

부위-특이적 모노-치환 페길화 엑센딘 유사체 및 그것의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 임의의 아미노기가 모노-페길화 될 수 있는 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체 뿐만 아니라 그들의 제조 방법 및 용도를 개시한다. 본 명세서의 방법은 불안정한 보호기에 의해 생기는 다중-페길화 부반응(side reactions)을 피하기 위해 더 안정한 보호기 Dde (N-α-1-(4,4-디메틸-2, 6-디옥소-사이클로헥실렌))를 채택하고, 낮은 반응 몰 비율로 높은 회수율에서 모노-페길화 엑센딘 유사체를 달성한다.

Description

부위-특이적 모노-치환 페길화 엑센딘 유사체 및 그것의 제조방법{Site-directed mono-substituted PEGylated Exendin analog and preparation method therefor}
본 발명은 부위-특이적(site-specific) 모노-페길화 엑센딘 유사체(mono-PEGylated Exendin analogs), 그 제조방법 및 약제학적 용도에 관한 것이다.
1960년대에, 매킨타이어(McIntyre) 및 엘릭(Elrick) 등은 경구 글루코스 투여(administration)가 정맥내주입(intravenous infusion)보다 더 높은 인슐린 반응을 유도한다는 '인크레틴 효과(incretin effect)'를 발견하였다. 펄리(Perley) 등에 의해 수행된 더 나아간 연구들은 '인크레틴 효과'가 50% 넘는 식후 인슐린 방출을 포함했음을 증명하였다. 1986년에, 나우크(Nauck) 등은 제2형 당뇨병(T2DM)에 걸린 환자들에게서 '인크레틴 효과'의 감소를 발견하였으며 이는 인크레틴 시스템 이상(abnormality)이 T2DM의 발병기전(pathogenesis)의 하나 일 수 있다는 것을 나타냈다.
인크레틴은 창자-유래된 것이며 GLP-1 및 글루코스-의존 인슐린자극 펩티드(GIP)를 포함하는 글루코스 수준-의존성 호르몬이며, 식사 후에 인슐린 분비를 활성화 시킬 수 있다. GLP-1은 T2DM에 대한 치료적 전략의 개발에서 더 중요한 역할을 수행하는 것으로 보인다. GLP-1은 혈당을 조절하기 위해 인슐린 분비를 동시에 촉진하며, 이것은 섬 β 세포 증식을 활성화시키고, β 세포의 세포자멸사를 방지하고, 글루카곤 방출, 위장관운동(gastrointestinal motility) 및 위액 분비(gastric secretion)를 억제하고, 위 배출(gastric emptying)을 지연시키고, 포만감을 생성하고 식욕을 억제한다. 그러나, GLP-1은 1-2 분의 짧은 반감기를 가지면서 DPP-IV에 의해 생체 내에서 급격히 분해된다. 따라서, 그것의 적용 및 개발이 제한되었다.
아메리카 독 도마뱀(lizard Heloderma suspectum)의 타액으로부터 분리된 엑센딘-4는 39개의 아미노산을 가지고, GLP-1과 53%의 상동성을 갖는 GLP-1 유사체이다. GLP-1과 유사하게, 이것은 GLP-1 수용체에 결합하여 T2DM 치료의 목적으로 인슐린 분비를 활성화하고, 공복 및 식후 혈당을 감소시킬 수 있다. GLP-1의 N-말단 제2 아미노산 잔기는 엑센딘-4에서 글라이신으로 치환되는 알라닌이다. 이는 생체내에서 디펩티다아제(DPP-IV)에 의한 분해에 대해 저항하게 하고, 반감기를 1-2 분에서 2-4시간으로 연장시킨다. 그러므로, 매일 두 번 투여되는, 열거된 제품으로 개발되어왔다(Byetta, Amylin Corporation).
그러나, 잦은 주사(injections)는 환자가 수용하기 어려우므로(poor patient compliance) 많은 연구들이 서방형 투여(sustained release dosage)에 집중된다. 예를 들어, 리라글루타이드(NN-2211)은 노보 노르디스크사(Novo Nordisk)에 의해 개발되었고 하루에 한번 씩 투여되며; 엑세나타이드 LAR(PLGA 마이크로스피어즈)는 애밀린사에 의해 개발되었고 일주일에 한번 씩 투여된다. 그러므로, 장기간-작용성 제형(long-acting formulations) 또는 비-주사 제형은 연구 및 개발의 트렌드가 되었다.
장기간-작용성 치료적 펩티드/프로틴에 대해 가장 폭넓게 연구되고 사용된 제약학적 제형 기술은 페길레이션이다(PEGylation). 활성화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도체들은 새로운 분자를 형성하기 위해 치료적 프로틴 상의 특이적인 접근가능한 아미노산 잔기와 반응한다. 가장 충분히 연구되고 폭넓게 사용되는 의학적 장기간-작용성 펩티드 프로틴 기술은 페길레이션 기술로서, 이를 통해 새로운 분자들이 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 시약과 펩티드 또는 프로틴 상의 특이적인 아미노산 잔기간의 반응에 의해 형성될 수 있으며, 일종의 수용성 고분자로서 폴리에틸렌 글리콜이 프로틴/펩티드에 대해 하기의 특성을 가질 수 있다: (1) 약물 용해도(drug solubility)의 개선; (2) 면역원성의 감소; (3) 감소된 신장 청소(kidney clearance)로 인한 혈중 반감기의 연장. 이러한 특성들은 약물 작용을 연장 및 환자의 수용을 개선하는데 기여한다.
페길레이션 기술은 일반적으로 활성화된 PEG 유도체들이 펩티드 또는 프로틴 상의 활성 잔기(활성의 순서대로, 메르캅토기, 아미노기, 카르복시기, 등)와 반응하게 하고, 안정한 화학적 결합을 갖는 페길화 생성물을 형성한다. 그러나, 다중 반응성 잔기(multiple reactive residues)의 존재는 서로 다른 페길화 잔기를 갖는 다양한 모노-페길화 생성물의 혼합물을 야기한다. 게다가, PEG의 높은 몰 비율 상태 및 연속적인 반응에서, 다중-페길화(multi-PEGylated) 화합물이 생성될 수 있으며 이는 약물 활성 및 신체 내에서 효능에 현저하게 영향을 미칠 수 있다. 또한, 다중-페길화 생성물의 품질 조절도 어렵다. 따라서, 페길화 열거된 약물들은 기본적으로 모노-페길화된 것이다.
모노-페길레이션의 위치가 펩티드 또는 프로틴 약물에 현저하게 영향을 미치므로, 최상의 선택적인 활성 부위(optional active site)를 갖는 모노-페길화 생성물을 제조하는 것이 필요하다.
부위-특이적 페길레이션의 존재하는 기술은 두 가지 유형을 포함한다:
첫 번째는 구조상의 반응성 잔기의 숫자를 조절하는 것이다. 폭넓게 사용되는 접근법(approach)은 최상의 선택적 위치(location)에서 돌연변이시키거나 또는 합성 과정에서 시스테인을 첨가하고, 그 후에 메르캅토-반응성 PEG 유도체(페길화 말레이미도 아민과 같은)가 시스테인에 결합하는 것이다. 그러나, i) 이러한 방법은 약물 효능 및 독성의 불확실성을 발생시키면서 약물의 구조를 변화시키고; ii) 시스테인이 쉽게 산화될 수 있기 때문에 시스테인의 도입은 프로틴의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 다른 접근법들은 라이신의 아미노기를 반응해야 하는 특정한 하나를 제외한 알칼리성 아르기닌과 라이신을 치환하는 페길레이션 부위로 여긴다. 이러한 접근법은 또한 구조적 변화들 때문에 의약(medicine)의 효능 및 독성에 현저하게 영향을 미친다. 본 출원의 발명자는 이러한 구조적 변화가 치료적 펩티드의 효과를 현저하게 변화시킨다는 것을 실험에 의해 증명하였다.
두 번째는 산성 조건에서 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드 유도체를 사용하여 N-말단 아미노기를 바꾸는 것이다. 몇몇 연구자들은 N-말단 아미노기의 pKa가 라이신 잔기의 아미노기보다 작다는 것, 즉 더 강한 알칼리성 특성이라는 것을 발견하였다. 따라서, 라이신의 아미노기와의 페길레이션은 알칼리성 조건(pH7-8)에서 수행될 필요가 있는 반면 라이신 아미노기가 반응하지 않는 N-말단 아미노기는 산성 조건(pH 5-6)에서 수행되어야 한다. 따라서, 몇몇 연구자들은 산성 조건하에서 N-말단 아미노 그룹상의 부위-특이적 페길레이션을 제안하였다. 그러나, 이러한 접근은 두 가지 문제점을 가지며, 첫째로, 이는 활성 부위가 N-말단 상에 있으면 적용될 수 없으며; 둘째로, PEG 유도체의 몰 비율이 5 또는 10이하로 주어지면, 회복(recovery)이 겨우 50%-60%이고, 높은 비용과 생산의 불가능성을 야기한다는 것이다.
시스테인을 가지지 않는, PEG 말레이미드(maleimide)는 부위-특이적 페길레이션을 사용하는 엑센딘-4 유사체를 바꾸는데 사용될 수 없으며; N-말단 활성 부위(British Journal of Pharmacology, 2003, 140, 339-346를 인용)는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드를 사용하는 N-말단 부위-특이적 페길레이션을 지원할 수 없다.
엑센딘-4 유사체들은 N-말단 아미노기를 포함하면 총 5개의 잠재적 반응 부위에서 최대 4개의 라이신들을 함유한다. 이러한 이유로, 사이드 체인(side chain)상에서 폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜(succinimidyl) 유도체가 엑센딘-4 유사체의 아미노기를 바꾸는데 사용되었을 때, 그 과정은 필연적으로 다중-페길화 및 모노-페길화 생성물을 생산할 것이다. 혼합물 중에서, 오직 하나의 화합물만이 최상의 활성 표적(target) 생성물이다.
윤 등은 Fmoc(9-플루오레닐 메톡시카르보닐)을 사용하여, 원하지 않게 반응에 관여되는 아미노기를 보호하는 방법을 제공하였다(Biocomjugate Chem, 2007,18,500-506). 그러나, 이 접근은 현저한 불이익을 가지고 있으며, 그것은, Fmoc 보호기(protecting group)가 알칼리성 환경으로 떨어지기가 매우 쉽다는 것이다. 사실, 펩티드 합성에 대한 많은 실험들은 Fmoc 보호기를 제거하기 위해 염기(20% 피페리딘)을 사용한다. 엑센딘-4 유사체들에서 아미노기의 페길레이션은 특정한 알칼리성 조건에서 발생할 수 있다. 이러한 모순되는 상황들은 Fmoc에 의해 보호되는 펩티드들이 알칼리성 조건에서 바꿔진 페길레이션일 때 떨어지기가 매우 쉬우며, 그리고 필연적으로 현저한 양의 다중-페길화 부산물이 생성되는 것을 야기한다.
그러므로, 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 4 유사체를 제조하는 방법이 제공될 필요가 있다.
도 1은 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다;
도 2는 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 페길레이션 이전 및 이후의 HPLC 크로마토그램이다;
도 3은 페길화 엑센딘-4 유사체의 소스 정제 크로마토그램(SOURCE purification chromatogram)이다;
도 4는 페길화 엑센딘-4 유사체의 SP 양이온 교환 정제 크로마토그램이다;
도 5는 페길화 엑센딘-4 유사체의 분자체 탈염 크로마토그램(molecular sieve desalination chromatogram)이다;
도 6은 C57 BL/6 마우스들 복강 내 글루코스 부하 시험(intraperitoneal glucose tolerance test)(n = 8)에 대한 모노-페길화 HYBR-003-PEG의 효과를 나타낸 것이며, a는 블랭크(blank)에 대한 P <0.01, b는 대조군에 대한 P <0.01이다.
본 발명은 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체를 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체를 제공한다.
상기 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체를 제조하는 과정으로서 하기 단계를 포함하는 과정을 제공한다:
(1) 엑센딘-4 유사체들의 펩티드 원료 물질(raw materials)를 합성하는 단계로서, 펩티드의 몇몇 라이신 잔기들은 Dde의 보호기에 의해 보호된 것이며, 상기 Dde는 N-α-1-(4,4-디메틸-2, 6-디옥소-사이클로헥실-일리덴)인 단계;
(2) 펩티드 물질(materials)과 폴리에틸렌 글리콜 시약 간의 반응을 알칼리성 유기 용매에서 수행시켜, Dde가 없는 Lys 잔기가 폴리에틸렌 글리콜기에 결합하게 만드는 단계;
(3) 단계(2)에서 생성된 생성물의 보호기를 제거한다. 분리되고 정제된 뒤에, 페길화 엑센딘 유사체를 수득한다.
본 명세서에 개시된 방법은 Dde를 Fmoc 보다 알칼리성 조건에 대해 더 강한 저항성을 가지며, 다중-페길레이션 및 Fmoc의 불안정(떨어지는)으로 인한 부산물의 다양성을 피하게 하는 보호기로서 이용한다. 이러한 이유로, 부산물이 대단히 감소하고, 이는 대규모 제조를 가능하게 한다.
본 명세서에 개시된 방법에 따라, 펩티드 원료 물질은 폴리에틸렌 글리콜기에 연결하는 것을 허용하기 위해 Dde에 의해 보호되지 않는 Lys 잔기상에 적어도 하나 이상의 자리(locus)를 가져야 하며; 바람직하게는, 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체의 제조를 촉진하기 위해 Dde에 의해 보호되지 않는 Lys 잔기에서 오직 하나의 자리를 가져야한다.
본 명세서에 개시된 방법에 따르면, 펩티드의 N-말단은 Dde 보호기 또는 Fmoc 보호기에 의해 보호될 수 있다. 제약학적 순도(purity)의 측면에서, Dde 보호된 N-말단이 더 좋다; 그러나 비용 측면에서, Fmoc 보호된 N-말단은, Fmoc보호된 N-말단이 너무 많은 다중-페길화 엑센딘 유사체를 가져오지 않는지를 증명하는 반응으로서 선택될 많은 가능성을 가지고 있다.
예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법에 따르면, 특정한 펩티드 원료 물질은 하기 구조를 가질 수 있으며;
(X)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Y4, 상기 X는 Fmoc 또는 Dde이고; Z는 Leu 또는 Ile이고; Y1-Y4는 Lys 또는 (Dde)Lys이고, Y1-Y4중 하나 이상은 Lys이고; 바람직하게는 Y1-Y4 중에서, Y2-Y4 중 오직 하나만 Lys이고, 나머지는 (Dde) Lys이며; 더욱 바람직하게는, Y2 가 Lys, Y1, Y3 및 Y4 가 (Dde) Lys이다.
그렇지만, 본 발명은 상기 서열의 페길화 엑센딘 유사체들을 제조하는데 있어서 제한이 없으며; 엑센딘-4 유사체를 포함하는 모든 엑센딘 유사체를 중에서, 본 명세서는 아미노산 서열에서 하나 이상의 Lys 잔기(적어도 두 개의 Lys 잔기들)가 있는 것을 제공하며, 본 발명의 방법은 모노-페길화 엑센딘 유사체를 제조하는데 적절하다. 본 발명은 네 개의 Lys 잔기를 갖는 엑센딘 유사체의 구조가 상대적으로 복잡하므로 모노-페길화 엑센딘 유사체들을 제조하기 위해 네 개의 Lys 잔기를 갖는 펩티드를 사용한다. 본 발명의 방법은 출원인이 중국 특허 출원 CN 101125207 A에서 개시했던 모든 페길화 엑센딘 유사체들을 제조하는데 적합하다. CN 101125207 A에 개시된 내용들은 본 출원에 통합된다.
본 발명의 생산 방법에 따르면, PEG 유도체(페길레이션 유도체)의 분자량(MW)은 20,000-60,000 Da 이다. 게다가, CN 101125207A에 개시된 가지 구조(branch structure)를 갖는 폴리에틸렌 글리콜은 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구현예는 하기와 같다:
하기 과정에 따라 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘-4 유사체를 제조하고 정제한다:
1. 보호기를 갖는 엑센딘-4 유사체의 합성
페길레이션이 N-말단 아미노기에서 일어난다면, 보호기를 갖는 하기 구조의 엑센딘-4 유사체가 합성된다:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde) Lys
페길레이션이 Lys12의 사이드-체인 아미노기에서 일어난다면, 보호기를 갖는 하기 구조의 엑센딘-4 유사체가 합성된다:
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 또는
(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
페길레이션이 Lys20의 사이드-체인 아미노기에서 일어난다면, 보호기를 갖는 하기 구조의 엑센딘-4 유사체가 합성된다:
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 또는
(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
페길레이션이 Lys27의 사이드-체인 아미노기에서 일어난다면, 보호기를 갖는 하기 구조의 엑센딘-4 유사체가 합성된다:
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 또는
(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys;
페길레이션이 Lys40의 사이드-체인 아미노기에서 일어난다면, 보호기를 갖는 하기 구조의 엑센딘-4 유사체가 합성된다:
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys, 또는
(Dde)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys;
2. 보호기를 갖는 엑센딘-4 유사체 및 특정 몰 비율과 더불어 20,000-60,000 Da의 MW를 갖는 PEG 유도체(바람직하게 40KD Y-타입 PEG-NHS 에스테르)는 적절한 양의 유기 용매(바람직하게 DMSO)에 용해된다. 완전히 용해된 뒤에, PEG 유도체와 비-반응성인 유기 염기(organic base)를 알칼리성 환경을 달성하기 위해 첨가한다. 선택적 시약은 트리에틸아민(triethylamine, TEA), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine, DIEA), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, DMAP), 2,4,6-트리메틸 피리딘(2,4,6-trimethyl pyridine, colidine), 루티딘(lutidine), 피리딘(pyridine) 등이다.
3. 페길레이션 반응은 얼마 동안 특정한 온도(40℃를 넘지 않는)에서 용해 시스템(solution system)을 보존하는 것에 의해 수행된다. 그 뒤에, 충분한 양의 시약(바람직하게 하이드라진 하이드레이트)을 Fmoc 및 Dde 보호기를 제거하기 위해 첨가한다. 모든 보호기들은 얼마 동안 특정 온도(40℃ 미만)에서 제거된다.
4. 최종 반응 용액은 순수한 물로 10-배 희석되며 pH는 샘플의 안정성을 확보하기 위해 HCL 또는 아세트산을 사용하여 5.0-6.0으로 즉각적으로 조절된다. 그런 뒤 20mM의 아세트산이 함유된 물 및 소스 30RPC 필러(SOURCE 30RPC filler) : 아세토니트릴 또는 물: 에탄올 시스템은 선형 농도구배 용리 방법(linear gradient elution method)을 사용하여 표적 페길화 엑센딘-4 유사체의 정제 및 분리를 달성하기 위해 이용된다.
5. 게다가, 농도구배 용리 방법으로 유기 용매를 제거하기 위해 양이온 교환 수지(cation exchange resin), 10mM의 사이트레이트 버퍼 염(citrate buffer salt), 1.5M의 NaCl을 사용하여 이전 단계로부터 얻어진 표적 화합물(몇몇 유기 용매, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는)을 정제한다.
6. 단계 5에서 얻어진 페길화 엑센딘-4 유사체에 대해 10KD 한외여과막 필름을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)를 수행한다. 분자체 크로마토그래피(Molecular sieve chromatography)를 순수한 물로 탈염하기 위해 사용한다. 페길화 엑센딘-4 유사체의 생성된 액상 용액을 동결건조(lyophilized)한 뒤에, 페길화 엑센딘-4 유사체 원료 물질을 얻었다.
본 발명의 목적(object)을 달성하기 위해, 앞서 언급된 방법에 의해 제조된 페길화 엑센딘 유사체를 제공한다.
본 발명의 목적(purpose)을 달성하기 위해, 또한 본 발명은 페길화 엑센딘 유사체를 제공하며, 상기 엑센딘 유사체는 하기 서열을 가지며:
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys, 상기 Z는 Leu (SEQ ID NO. 1) 또는 Ile (SEQ ID No. 2)이고, 하나의 Lys 잔기의 아미노기가 폴리에틸렌 글리콜에 연결된다.
바람직하게, 앞서-기재된 서열에서, Lys20 잔기 또는 Lys27 잔기의 아미노기는 폴리에틸렌 글리콜에 연결된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 또한 페길화 엑센딘 유사체들을 사용하는 당뇨병 또는 비만의 치료에 대한 용도(usage)를 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면 높은 안정성의 보호기로서 Dde는 낮는 몰 비율의 반응물로 페길화 엑센딘 유사체의 높은 회수(recovery) 및 낮은 비용을 달성하게 하는, 불안정한 Fmoc에 의해 유발되는 다중-페길레이션을 피하기 위해 사용된다. 본 발명의 페길화 엑센딘 유사체들은 부위-특이적 모노-페길화 엑센딘 유사체들이며, 부산물을 거의 갖지 않고, 부산물에 의해 발생하는 다양한 부작용을 피하게 도와주는 것이다.
본 발명의 더욱 상세한 설명에서, 포함된 도면들은 특정한 구현 방법(specific implement methods)에 의해 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용되었다. 그러나, 본 발명은 특정한 구현예에 제한되지 않는다.
특정한 구현 방법
실시예 1
(1) 합성에서 사용되는 아미노산 모노머들(monomers)
Fmoc-His (Trt)-OH, Dde-His (Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Thr (tBu)-OH, Fmoc- Phe-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Lys (Dde)-OH, Fmoc-Gln ( Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-ILe-OH, Fmoc-Trp (Boc)-OH,, Fmoc-Asn (Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Cys (Trt)-OH
상기 약어는: Fmoc는 9-플루오레닐-메톡시카보닐(9-fluorenyl-methoxycarbonyl); Boc는 터트-부톡시카보닐기(tert-butoxycarbonyl group); Trt는 트리틸(trityl); OtBu는 터트-부톡시(tert-butoxy); tBu는 터트-부틸(tert-butyl); Dde는 N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소-사이클로헥실렌(N-[1-(4,4-dimethyl-2,6- dioxo-cyclohexylene))이다.
(2) 시약: N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine), 디이소프로필 카보디이미드(diisopropyl carbodiimide,DIC), N, N-디메틸포름아미드(N, N-dimethylformamide,DMF), 디클로로메탄(dichloromethane), 헥사하이드로피리딘(hexahydropyridine), 1-하이드록시벤조트리아졸 트리아졸(1-hydroxybenzotriazole triazole), 링크 아미드 수지(Rink Amide resin), 닌히드린(ninhydrin), 메탄올(methanol), 트리이소프로필실란(triisopropylsilane), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid).
(3) 공정(Operation)
A. 합성: 0.25m몰의 규모(scale)로 설명되듯이, 서열을 DIC/HOBt 방법으로 활성화 되었던 1m몰의 아미노산 및 0.5g의 링크 아미드 수지의 존재 하에서 반응기 내에서 C- 부터 N-말단 까지 합성하였다. 반응을 25℃의 설온(room temperature)에서 수행하였고, 과정을 하기에 따라 수행하였다:
1. 보호기 Fmoc를 각 과정에서 10분동안 20%의 피페라딘 DMF 용액을 사용하여 제거하였다;
2. 10mL DMF를 사용하여 3번 세척하고, 액체를 빼낸다;
3. 보호된 아미노산(1m몰) 및 HOBt(1m몰)를 10mL DMF에 용해시키고, DIC(1m몰)을 활성화하기 위해 10분 동안 첨가하였다;
4. 활성화된 아미노산 용액을 반응기에 첨가하고, 1시간 동안 진탕한다(shaking);
5. DMF로 3번 세척하고, 액체를 빼낸다;
6. 닌히드린 반응이 음성이면, 1-5 단계를 반복하여 수행해야 하며; 양성이면, 3-5 단계를 반복한다.
펩티드 체인의 합성 완료 후에 메?올로 수지를 씻고, 이를 말린다.
B. 보호기를 제거하고 초과된 펩티드를 잘라낸다
1g의 펩티드-부착 수지를 반응기에 첨가하고, 그런 뒤 용해 용액(lysis solution)(비율: 2ml의 아니솔, 2ml의 메탄올, 2ml의 트리이소프로필실란 및 6ml의 트리플루오로아세트산)을 첨가하였다.
샘플을 실온에서 2시간동안 진탕하였다. 여과한 뒤에, 여과물을 수거하였다. 수지를 작은 양의 아세트산으로 세척하였다. 수거된 샘플을 배합(combined)하고 농축하였다. 침전시키기 위해 디에틸 에테르를 첨가하였고, 침전물을 여과한 뒤에, 샘플을 적은 양의 디에틸 에테르로 세척하였으며, 그런 뒤 조생성물(crude product)을 수득하였다.
C. 제조적 HPLC(preparative HPLC)로 샘플을 정제하고 분리하였고, 동결건조 하였다.
생성된 조생성물을 작은 양의 10% 아세트산 용액에 용해시켰으며, 컬럼에 로드시키고, 제조적 HPLC로 정제하고, 그런 뒤 동결건조 하였다. 생성된 펩티드들을 질량 분석이에 의해 원하는 화합물인지 입증하였다.
크로마토그램 컬럼: 보스턴 C18(Boston C18), 5um, 100A, 214nm의 파장, 워터스 제조적 HPLC(Waters preparative HPLC)
농도 구배: 10% 0.05% TFA/CAN-45% 0.05% TFA/CAN 20분, 45% 0.05% TFA / CAN 10분.
도 1은 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다.
실시예 2
부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 페길레이션 방법
본 구현예는 엑센딘-4 유사체 상에서 페길화를 가능하게 하는 배타적 자유 사이드-체인(exclusive free side-chain) 아미노기를 바꾸거나 이에 결합하기 위해 (SC-PEG, SS-PEG, NHS-PEG, 등)과 같은 통상적인 아미노 PEG 유도체를 사용했고, 상기, PEG 유도체는 바람직하게 40KD Y 유형 NHS-PEG에서 선택된 것이며 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체는:
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Dde)Lys 또는
(Fmoc)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-(Dde)Lys-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-(Dde)Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-(Dde)Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys.
2g 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체 및 26g 40KD Y-type NHS-PEG(약 1.5:1의 펩타이드에 대한 몰 비율로)을 400mL의 DMSO에 용해시키고, 그런 뒤 40℃에서 연속적으로 교반하였다. 완전히 용해된 후에, 200uL(0.05%)의 트리에틸아민(TEA)을 40℃의 온도에서 페길레이션 반응을 활성화하기 위해 첨가하였고 페길레이션을 2시간 동안 교반하는 것에 의해 실질적으로 완료하였다(90% 플러스(plus), 보호된 엑센딘-4 유사체에 의해 계산됨). 그런 뒤, 8ml (2%)의 하이드라진을 40℃에서 첨가하였고, 보호기를 제거하기 위해 반응이 끝날 때 까지 1시간 동안 용액을 교반하였다. 최종 반응 용액을 순수한 물을 사용하여 10배 희석하였고 6M의 HCL을 사용하여 pH를 6.0으로 즉각적으로 조절하였고, 그런 뒤 4℃에서 냉장 저장하였다.
도 2는 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 페길레이션 이전 및 이후의 HPLC 크로마토그램이다.
실시예 3
페길화 엑센딘-4 유사체의 분리 및 정제 방법
순수한 페길화 엑센딘-4 유사체 원료 물질은 역상 HPLC(reverse-phase HPLC), 이온 교환, 한외 여과, 분자체(molecular sieve) 및 부위-특이적 보호된 엑센딘-4 유사체의 최종 반응 용액의 동결건조에 의해 수득될 수 있다.
A. 소스 역상 HPLC(SOURCE reverse phase HPLC)를 통한 정제
이동상: 상 A: 20mM HAc, 5% 아세토니트릴; 상 B: 20mM HAc, 50% 아세토니트릴
컬럼: GE Fineline Pilot 35
필러: SOURCE 30RPC 175mL.
유량: 30mL/분
용리 농도구배(Elution gradient): 샘플을 딜리버링(delivering)한 후에, 2 컬럼 부피, 0-30% 분, 30% - 100% 5분으로 균형맞춤
도 3은 페길화 엑센딘-4 유사체의 소스(SOURCE) 정제 크로마토그램이다.
B. SP 양이온 교환 정제
이동상: 상 A: 10mM pH3.5 CBS
상 B1: 10mM pH3.5 CBS +0.15 M NaCL
상 B2: 10mM pH3.5 CBS +1.5 M NaCL
크로마토그래피 컬럼(Chromatographic column): GE XK 50
필러: SP 세파로즈 패스트 플로우(sepharose Fast Flow) 600mL
유량: 30mL/분
농도구배 용리 : 0% -100% 상 B1 20분, 100% 상 B1 - 상 B2 100% 0분
도 4는 페길화 엑센딘-4 유사체의 SP 양이온 교환 정제 크로마토그램이다.
C. 한외여과
장치: 10KD 폴 전단 한외여과(PALL shear ultrafiltration)
여과 후에 프리-필터(Pre-filter) 로딩 부피(loading volume)는 2400mL 및 400mL이었다
한외여과(1000mL-400mL)를 3번 반복하였다.
D. G25 탈염
이동상: 물
크로마토그래피 컬럼: GE XK 50
필러: G25; 900mL
유량: 30mL/분,
샘플의 로딩양(Loading quantity of sample): 200mL
도 5는 페길화 엑센딘-4 유사체의 분자체 탈염 크로마토그램이다.
E. 동결건조(Lyophilization )
페길화 엑센딘-4 유사체 순수 물 용액의 공동-녹는점(Co-melting point) 은 약 -5℃이고, 그러므로 첫 번째 동결건조 온도는 -10℃로 설정되고, 두 번째는 5 ℃로 설정된다. 다른 파라미터들(동결 시간 및 오븐 온도 등)은 샘플, 동결 건조기 성능 및 특정한 기후 조건에 따라서 설정한다.
실시예 4
노말(normal) C57 마우스들(IPTT)에서 복강 내 글루코스 부하 시험
(1) 재료
동물: C57 마우스들을 Shanghai SLACCAS Laboratory Animal Co.에서 구매하였다, SPF 수준(level). 동물들을 회사의 임시 동물 하우스에서 길렀다, CL-클래스(class).
양: 60, 성별: 수컷
시약: 엑센딘-4 유사체 (0.125 ug/ml); 페길화 엑센딘-4 유사체 (3.125 ug/ml), 아무것도 없는 펩티드(bare peptide)로 계산됨); 글루코스 키트; 20% 글루코스 주사; 및 살린 주사.
(2) 실험 방법
약물 투여 팀(Medication Administration Team): 각 마우스를 페길화 엑센딘-4 유사체 (3.125 ug/ml, 아무것도 없는 펩티드로 계산됨)로 투여하였다; 블랭크 그룹은 0.2mL/20g의 투여량이고; 각 마우스를 0.2mL/20g의 투여량의 노말 살린으로 주사하였다; 대조군: 각 마우스를 0.2mL/20g의 투여량의 엑센딘-4 유사체 (0.125 ug/ml)로 투여하였다. 혈당 로드(Blood glucose load)를 혈당 실험 30분 전에 20% 글루코스 용액 0.2ml/20g b.w.의 복강 내 주사에 의해 달성하였다. 투여 후 24시간 및 72시간 뒤에, 실험 동물의 저혈당 효과 지속기간을 확인하였다.
(3) 실험 결과
도 6은 개별적인 페길화 엑센딘-4 유사체의 저혈당 효과 지속기간(durations)을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Huayi Bio-Lab Co., Ltd. <120> SITE-DIRECTED MONO-SUBSTITUTED PEGYLATED EXENDIN ANALOG AND PREPARATION METHOD THEREFOR <130> IF13P167/US <150> CN 201110078314.X <151> 2011-03-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 analog <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 2 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4 analog <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40

Claims (10)

  1. 페길화 엑센딘 유사체를 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 방법:
    (1) Dde로 보호된 하나 이상의 라이신(Lys) 잔기 및 적어도 하나의 비보호 Lys 잔기를 갖는 엑센딘 유사체의 펩티드 원료 물질(raw material)을 제조하는 단계로서, 상기 Dde는 N-α-1-(4,4-디메틸-2, 6-디옥소-사이클로헥실렌)인 단계;
    (2) 단계 (1)에서의 펩티드 원료 물질(raw material)과 PEG 유도체를 알칼리성 유기 용매에서 반응시켜, 적어도 하나의 비보호 Lys 잔기가 페길화된, 상기 단계 (1)의 펩티드 원료 물질의 페길화 유도체를 제조하는 단계; 및
    (3) 단계(2)의 페길화 유도체 생성물의 보호기를 제거하고, 수득된 생성물을 분리 및 정제하여, 페길화 엑센딘 유사체를 수득하는 단계로서, 상기 엑센딘 유사체는 하기의 구조를 갖는 단계:
    (X)His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Y1-Gln-Z-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y2-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Y3-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Y4, 상기, X 는 Fmoc 또는 Dde 이고; Z 는 Leu 또는 Ile 이고; Y1-Y4 는 Lys 또는 (Dde) Lys이고, Y1-Y4 중 하나 이상은 Lys이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드 원료 물질은 Dde에 의해 보호되지 않는 오직 하나의 자리의 Lys 잔기를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드 원료 물질에서, N-말단은 Dde 또는 Fmoc에 의해 보호되고 Fmoc는 9-플루오레닐-메톡시카보닐인 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    Y1-Y4에서, Y2-Y4 중 오직 하나만 Lys이고, 나머지는 (Dde) Lys인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    Y2 는 Lys이고, Y1, Y3 및 Y4 는 (Dde) Lys인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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