CN101125207B - 带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途 - Google Patents

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Abstract

一种带有聚乙二醇基团的Exendin或其类似物及其制剂，涉及一种由单个或多个聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物及其制剂技术领域。本发明所要解决的技术问题是单次给药后的时间间隔较短，经聚乙二醇修饰后生物活性严重下降，使给药剂量大大增加，而无法实际应用。本发明使用新型的聚乙二醇修饰Exendin或其类似物，修饰后的Exendin或其类似物具有半衰期长、活性高、免疫抗原性低的特点。

Description

带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物及其制剂和用途
技术领域
本发明涉及一种修饰的艾塞丁(Exendin)或其类似物，特别地涉及一种由单个或多个聚乙二醇修饰的艾塞丁(Exendin)或其类似物及其制剂、给药方法以及应用。 
背景技术
胰高血糖素样肽-1首次于1987年被研究人员认定为一种葡萄糖依赖的肠分泌激素肽。这种多肽通过细胞上G蛋白耦联受体传递信号，从而产生刺激β胰岛细胞分泌胰岛素，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空和胃酸分泌等生理作用。 
Exendin是一种在美国毒蜥和珠毒蜥唾液中发现的一类多肽(J.Biol.Chem.1990，265，20259-20262；J.Biol.Chem.1992，267，7402-7405)，以Exendin-4为代表的这类多肽与胰高血糖素样肽-1[7-36]具有高度同源性。研究发现，Exendin同样可以与胰高血糖素样肽-1受体结合，并在药理上表现出相类似的效果，如：促进胰岛素分泌，有效控制餐后血糖，降低糖化血红蛋白，抑制胃排空等。在动物体内的长期研究发现，长期使用这类胰高血糖素样肽-1受体多肽还能有效改善胰岛素抵制，从而逆转糖尿病的病程。此外，人们还发现，以胰高血糖素样肽-1和Exendin-4为代表的一系列促胰岛素分泌激动剂能促进β胰岛细胞再生(Nat.Biotech.2005，23，857-861)和改善非酒精性脂肪肝(Hepatology 2006，43，173-181)。这使得该类多肽一直成为糖尿病及肥胖制药领域的研究热点。伍登熙和孙玉昆等人(中国专利：ZL01112856)对Exendin-4进行了多肽改构，得到了一系列相同功能的多肽。尤其是在前不久，美国安米林(Amylin)和礼来(Eli Lilly)公司共同开发的一天注射两次的Exendin——Exendin-4( 
Figure DEST_PATH_GA20170133200710138718701D00011
)在美国上市，使得该类药物得到全世界糖尿病及肥胖治疗领域的广泛关注。但是经过临床研究发现，这种异源的多肽在给药30周后会使受试病人体内出现Exendin-4抗体，占总人数的41％(Diabetes Care.2004，27，2628-2635)。 
由于蛋白质/多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物通常需要在一天之内多次注射，这给病人带来了许多痛苦和诸多不便。如何延长这类药物的给药周期一直长期困扰人们，目前还没一种普遍适用的给药方式。 
上世纪70年代出现的聚乙二醇化技术被证明是当前蛋白质/多肽类给药领域一项较适用的技术。通常采用线性直链或分支状的聚乙二醇对蛋白质/多肽进行修饰，这样的修饰赋予蛋白质/多肽具有如下特点：1)物理和化学稳定性得到显著提高，2)免疫抗原性得到显著下降，3)抗蛋白酶降解能力显著提高，4)随着聚乙二醇分子量的增加，能明显降低肾清除作用对药物的代谢，从而药物的体内半衰期显著增加，5)药物溶解度提高，以及对细胞膜的穿透力增强。A·杨和K·普里克特的研究证明了Exendin-4主要是通过肾清除来代谢的，因此他们将分子量范围在500至20,000道尔顿(Dalton)的聚乙二醇对Exendin进行了修饰(中国专利：CN1372570A)，从而实现降低肾过滤对药物的清除。 
但是，修饰后药物的活性会普遍下降是该技术的一个缺陷。Haim Tsubery等人使用9羟甲基7硫代芴N羟基琥珀酰亚胺(9-hydroxymethyl-7-sulfofluorene-Nhydroxysuccinimide，FMS)活化聚乙二醇，在体内聚乙二醇可以从Exendin-4上水解下来，从而使未经修饰的Exendin-4发挥作用。这种方式虽然解决了聚乙二醇修饰后所导致的生物活性降低的问题，但是由于发挥作用的还是未经修饰的Exendin-4，因此长期注射而产生的免疫抗原性问题也依旧没能解决(J.Biol.Chem.2004，279，38118-38124)。 
我们使用新型的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物，取得了半衰期长、活性高、免疫抗原性低的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是Exendin或其类似物在体内使用单次给药后的时间间隔较短，长期注射会使体内产生抗体，现存的聚乙二醇修饰后的Exendin或其类似物生物活性严重下降，使给药剂量大大增加，而无法实际应用。本发明提供新型的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物，具有所述的半衰期长、活性高、免疫抗原性低的特点。 
聚乙二醇修饰 
本发明涉及新型的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物，其特征是Exendin或其类似物由一个或多个聚乙二醇修饰。 
聚乙二醇衍生物不同的化学结构对修饰后的多肽生物活性影响不同。本发明所述的聚乙二醇可以采用线性直链或分叉支链的结构。本发明所述的分叉支链(或称分支叉状)结构包括双臂支链的结构，也包括多臂支链的结构。本发明所述的聚乙二醇双臂支链结构包括但不限于如下列式I、式II、式III和式IV所示结构。 
本发明所述的聚乙二醇支链结构包括但不限于下列式I所示结构：
其中，X为H或保护基团。这里所说的保护基团可以是任何能够与自由羟基反应，并防止其进一步与其它基团反应的基团，包括但不限于低碳烷基如甲基、二甲基、乙基、丙基、异丙基等。 
另外，在上述结构中，PEG为-O(CH2CH2O)q-，q为正整数；n1为0-5的整数；m为0-5的整数；Y为O，S，SO，SO2或NR1，其中R1为H或C1-8经取代或未经取代的烷基或经取代或未经取代的环烷；k为0或1；p为0-6的整数。上述的带式I结构的聚乙二醇可使用常规的化学方法合成，美国专利U.S.6,566,506提供了一些带上述式I结构的聚乙二醇的合成方法。 
在本发明一优选的实施例中，本发明使用的带有式I所示支链结构的聚乙二醇带有如下式II所示具体结构： 
Figure S071D8718720070810D000032
其中，PEG为-O(CH2CH2O)q-，q为正整数，Me为甲基。 
本发明所述的聚乙二醇支链结构包括但不限于下列式III所示结构： 
Figure S071D8718720070810D000033
其中，X为H或保护基团；PEG为-O(CH2CH2O)q-，q为正整数；n2为0-10的整数；Z为选自于以下组中的基团：(CH2)i、(CH2)iOCO、(CH2)iNHCO、(CH2)iCO，i为0-10的整数；R2为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；j为1-12的整数。上述的带式III结构的聚乙二醇可使用常规的化学方法合成，中国专利ZL03801105.0提供了一些带上述式III结构的聚乙二醇的合成方法。 
在本发明一优选的实施例中，本发明使用的带有式III所示支链结构的聚乙二醇带有如下式IV所示具体结构：
Figure S071D8718720070810D000041
其中，PEG为-O(CH2CH2O)q-，q为正整数，Me为甲基。 
聚乙二醇的分子量大小对修饰后的多肽生物活性也有不同影响。本发明使用的直线型和支链型聚乙二醇的分子量范围优选为200道尔顿或其以上，更优选为5,000道尔顿或其以上，再优选为20,000道尔顿或其以上。在一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇分子量为5,000道尔顿至50,000道尔顿之间，包括5,000道尔顿和50,000道尔顿。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇分子量为20,000道尔顿至50,000道尔顿之间，包括20,000道尔顿和50,000道尔顿。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇分子量为20,000道尔顿至45,000道尔顿之间，包括20,000道尔顿和45,000道尔顿。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇分子量为20,000道尔顿至40,000道尔顿之间，包括20,000道尔顿和40,000道尔顿。本发明所述的聚乙二醇分子量除特别指出外均指通过凝胶渗透色谱法(Gel PermeationChromatography，GPC)(董炎明，《高分子分析手册》，北京：中国石化出版社2004，416-427)测定得到的数均分子量(Mn)。带不同分子量的聚乙二醇可以在市场上买到也可以使用本技术领域公知的技术合成。 
在本发明一优选的实施方案中，本发明所述的聚乙二醇采用分子量为20,000以上的支链结构。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇为分子量在20,000道尔顿以上至50,000道尔顿之间的支链结构，包括50,000道尔顿。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇为分子量在20,000道尔顿以上至45,000道尔顿之间的支链结构，包括45,000道尔顿。在另一个优选的实施例中，本发明使用的聚乙二醇为分子量在20,000道尔顿以上至40,000道尔顿之间的支链结构，包括40,000道尔顿。 
本发明所述的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物是通过活化的聚乙二醇与多肽氨基酸残基的侧链，N末端和C末端连接。使用带不同活化基团的聚乙二醇，可以实现对不同氨基酸侧链、N末端和C末端的化学结合，也可以针对某一氨基酸位点专一性结合。可以与活化的聚乙二醇化学结合的氨基酸基团包括但不限于多肽的N末端α氨基、赖氨酸侧链ε氨基、组氨酸侧链咪唑基上的亚氨基、多肽的C末端羧基、天冬氨酸和谷氨酸侧链羧基、丝氨酸和苏氨酸侧链羟基，半胱氨酸侧链巯基等。通常情况下，这种化学连接通过亲电亲核方式进行。例如，经N羟基琥珀 酰亚胺活化的聚乙二醇与多肽的N末端α氨基，赖氨酸侧链ε氨基以及组氨酸侧链咪唑基上的亚氨基等游离氨基连接。另外，还可以采用活化基团为醛基的聚乙二醇，通过还原烷基化定点结合到多肽分子的N末端。本发明包括通过不同活化基团使聚乙二醇与Exendin或其类似物结合，及其产生的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物。带不同活化基团的聚乙二醇可以在市场上买到也可以使用本技术领域公知的技术合成。 
本发明包括Exendin或其类似物上一种或多种氨基酸与聚乙二醇结合的Exendin或其类似物。本发明所述的Exendin或其类似物上能同时连接1个或数个聚乙二醇，所结合聚乙二醇的个数视Exendin或其类似物上游离反应基团的数量，聚乙二醇所带活化基团以及聚乙二醇的分子量大小而定。一般来说，游离反应基团的数量越多，就能结合更多的活化聚乙二醇；活化的聚乙二醇分子量越大，其能结合到多肽上的数量就越少。优选地，Exendin或其类似物由一个、二个、三个或四个聚乙二醇修饰。在一个优选的实施例中，Exendin或其类似物由一个聚乙二醇修饰。在另一个优选的实施例中，Exendin或其类似物由二个聚乙二醇修饰。 
聚乙二醇与Exendin或其类似物连接反应后的混合物可以通过常用的离子交换、凝胶过滤或反相色谱等方式实现对这些产物的有效分离。通常使用的离子交换色谱法有阴离子交换色谱和阳离子交换色谱两种，选择不同的离子交换基质可以影响到分离纯化的效果。由于不同的Exendin或其类似物在氨基酸个数和种类略有不同，而使各自的分子量略有不同，因此聚乙二醇单取代的Exendin或其类似物的最终分子量为聚乙二醇的分子量加上Exendin或其类似物的分子量。通过分离纯化、超滤浓缩和缓冲液置换等方法处理后，可以得到本发明所述的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物，并可以制成药用制剂。 
Exendin或其类似物 
本发明所述的Exendin或其类似物是指与Exendin全部或部分氨基酸结构序列相类似的，能与胰高血糖素样肽-1受体结合，并产生细胞信号级联传导的一类多肽。这些多肽可以通过化学固相合成或基因工程的宿主菌表达后，再经过一步或多步分离纯化得到。 
本发明所述的Exendin或其类似物包括但不限于天然的Exendin-3或Exendin-4。天然的Exendin-3的氨基酸序列结构如下： 
[His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-OH](SEQID NO:1) 
天然的Exendin-4的氨基酸序列结构如下：
[His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2](SEQID NO:2) 
本发明所述的Exendin或其类似物包括但不限于那些通过对天然的Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列进行氨基酸置换、增加和删减而得到的类似多肽。本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列进行天然氨基酸置换，同时也包括用非天然氨基酸对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列进行氨基酸置换。非天然氨基酸包括但不限于氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链赖氨素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。优选地，本发明所述Exendin类似物包含1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换。 
本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列增加和删减一个或多个氨基酸得到的类似多肽。在本发明一优选的实施方案中，本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列增加和删减1个至20个氨基酸得到的类似多肽。再优选地，本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列增加和删减1个至15个氨基酸得到的类似多肽。进一步优选地，本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列增加和删减1个至10个氨基酸得到的类似多肽。在本发明具体实施方案中，本发明所述的Exendin类似物包括那些对Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列增加和删减1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸得到的类似多肽。 
Exendin类似物包括在Exendin-3或Exendin-4的氨基酸序列的N末端氨基、C末端羧基或其侧链基团可逆或不可逆的化学封闭或修饰，例如C末端羧基的酰胺化。 
在本发明另一优选的实施方案中，本发明所述的Exendin或其类似物包括SEQ ID NOs:1-265的氨基酸序列。优选地，本发明所述的Exendin或其类似物包括SEQ ID NOs:1-2的氨基酸序列。另一优选地，本发明所述的Exendin或其类似物包括SEQ ID NOs:3-229的氨基酸序列。另一优选地，本发明所述的Exendin或其类似物包括SEQ ID NOs:230-265的氨基酸序列。 
聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物可以根据巩秋红等(中华内分泌代谢杂志2004，20， 559-560)发表的实验方法在细胞水平上进行活性测定。具体地，可以在INS-1细胞中分别加入不同浓度的葡萄糖和含本发明聚乙二醇修饰的Exendin及其类似物的溶液，孵育4小时，用放射免疫法测定上清液中胰岛素含量，并利用RT-PCR技术对INS-1细胞的胰岛素mRNA水平作半定量分析。通过这种方法可以在体外大量筛选聚乙二醇修饰的Exendin及其类似物的活性。另外，还可以通过测定小鼠(例如C57或db/db鼠)给药后在不同时间点的血糖变化情况来进行筛选。 
药用制剂及其使用方法 
本发明所述的聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物可以与各种无机和有机酸和碱形成盐。这类盐包括用有机酸和无机酸制备的盐，所述有机酸和无机酸包括但不限于盐酸、溴化氢、硫酸、磷酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸、甲磺酸、甲苯磺酸、马来酸、富马酸和樟脑磺酸。用碱制备的盐包括但不限于铵盐、碱金属盐(例如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)。优选乙酸盐、盐酸盐和三氟乙酸盐。通过常规方法，例如通过在所述盐不溶于其中的溶剂或介质、或在随后可真空除去或通过经冷冻干燥除去的溶剂(例如水)中，使所述产物的游离酸或碱形式与一种或更多种适当碱或酸的等同物反应，或通过在合适离子交换树脂上用另一种离子交换现有盐的离子，可以制备所述盐。 
所述要求保护的化合物也可以配制成药学上可接受的盐(例如酸加成盐)和/或它们的络合物。这类盐制剂，可以通过改变所述组合物的物理及化学特性而有助于药理学应用，但是不防碍所述组合物发挥其生理学效应。物理特性方面改变的实例包括降低熔点，以易于经粘膜给药；以及增加溶解度，以易于给予更高浓度的所述药物。 
药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环已氨基磺酸盐和奎尼酸盐的那些酸加成盐。药学上可接受的盐可以得自各种无机和有机酸例如盐酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环已氨基磺酸和奎尼酸。例如通过在所述盐不溶于其中的溶剂或介质、或在随后可真空除去或通过经冷冻干燥除去的溶剂(例如水)中，使所述产物的游离酸或碱形式与一种或更多种适当碱或酸的等同物反应，或通过在合适离子交换树脂上用另一种离子交换现有盐的离子，可以制备所述盐。 
也可以使用载体或赋形剂，以易于给予所述化合物。载体和赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)或各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油(例如芝麻油、花生油、橄榄油)、聚乙二醇和生理上相容的溶剂。可以通过不同的途径，包括静脉 内、腹膜内、皮下、和肌内、口服、局部或经粘膜途径，给予所述组合物或药用组合物。 
如有需要，上述组合物的溶液可以用增稠剂(例如甲基纤维素)增稠。它们可以乳化形式(比如油包水或者水包油)制备。可以使用各种各样的药学上可接受的乳化剂中的任一种，包括例如金合欢胶粉、非离子型表面活性剂(例如吐温)、或离子型表面活性剂(例如碱性聚醚醇硫酸酯或磺酸酯，例如Triton)。 
这些组合物可以通过常规灭菌技术灭茵或者可以过滤除茵。所述组合物可以含有需要的近似生理条件的药学上可接受的辅助物质，例如pH缓冲剂。有效的缓冲液包括例如乙酸钠/乙酸缓冲液。可以使用栓剂形式和“缓释型″慢释放制剂的形式，使得治疗有效量的制剂在经皮注射或传递后许多小时或许多天内被传递至血流中。 
可以用氯化钠或其它药学上可接受的试剂，例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露醇和山梨糖醇)或其它无机溶质或有机溶质，达到所需的等渗性。对于含钠离子的缓冲液特别优选氯化钠。 
对于一名体重为70kg患者而言，所述化合物的有效剂量通常的范围是0.01mg/天或0.03mg/天至约5mg/天，优选约0.01或0.5至2mg/天，更优选约0.01或0.1至1mg/天，以单剂量或分次剂量给予。将给予的精确剂量由主治医师确定，并且依赖于所述特定化合物是否在上述提供的范围内以及取决于个体的年龄、体重和病症。给药应在糖尿病刚出现症状时开始，或在诊断糖尿病后立即开始。 
虽然通常将所述化合物用于治疗人类患者，但也可以用它们治疗其它脊椎动物例如其它灵长类、家畜(例如猪、牛和家禽)以及运动用动物和宠物(例如马、狗和猫)中的相同或相似疾病。 
附图说明
附图1是带式I所示支链聚乙二醇结构。 
附图2是带式III所示支链聚乙二醇结构。 
附图3是分子量为40,000道尔顿的聚乙二醇(式IV)取代的Exendin-4类似物的分离纯化色谱图。其中标记1为上样时的吸收峰，标记2为聚乙二醇多取代Exendin-4类似物的洗脱吸收峰，标记3为聚乙二醇单取代Exendin-4类似物的洗脱吸收峰，标记4为未结合聚乙二醇Exendin-4类似物的洗脱吸收峰。 
附图4是分子量为40,000道尔顿的聚乙二醇(式IV)单取代Exendin-4类似物电泳图。其中标记1道显示聚乙二醇单取代的Exendin-4类似物的条带。 
附图5是经分子量为5,000道尔顿和21,000道尔顿直线型聚乙二醇单取代Exendin-4类似 物24小时动物药效试验结果。 
附图6是经分子量为21,000道尔顿直线型和分子量为40,000道尔顿聚乙二醇(式IV)单取代Exendin-4类似物72小时动物药效试验结果。 
附图7是经分子量分别为21,000道尔顿(U21K)、30,000道尔顿(U30K)和40,000道尔顿(U40K)聚乙二醇(式II)单取代的Exendin-4类似物72小时动物药效试验结果。 
附图8是经分子量分别为21,000道尔顿(Y21K)、30,000道尔顿(Y30K)和40,000道尔顿(Y40K)聚乙二醇(式IV)单取代Exendin-4类似物72小时动物药效试验结果。 
附图9是经分子量分别为21,000道尔顿(L21K)和30,000道尔顿(L30K)直线型聚乙二醇单取代Exendin-4类似物的72小时动物药效试验结果。 
附图10是分别经分子量为30,000道尔顿的聚乙二醇(式II)单取代和经分子量为40,000道尔顿的聚乙二醇(式IV)单取代的Exendin-4类似物72小时动物药代(血浆半衰期)试验结果。 
具体实施方式
本实验所用的聚乙二醇衍生物中，分子量为5,000道尔顿的直线型聚乙二醇购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，其它聚乙二醇衍生物均购自北京键凯科技有限公司。 
实验中的离子交换法所用A、B双泵AKTA purifier100分离纯化设备，其它预装柱及填料等均购自美国通用电器公司(General Electric)，其它相关化学试剂购自西格玛奥德里奇公司。实施例三到实施例九中所用的Exendin-4及其类似物购自成都圣诺科技发展有限公司。 
实施例一 Exendin-4类似物的固相化学合成 
本实施例介绍用固相化学的方法合成具有下列结构的Exendin-4类似物： 
[His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Arg-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-OH](SEQID NO：232)。 
(1)所采用的氨基酸单体 
Figure 2007101387187A00800011
上式中缩写表示： 
Fmoc：9—芴基甲氧羰基 
BOC：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl) 
Trt：三苯甲基(trityl) 
OtBu：叔丁基酯 
tBu：叔丁基(tert-butyl) 
(2)合成所采用的仪器设备及试剂： 
仪器为：Applied Biosystem多肽合成仪，433A型，美国 
试剂有：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethy laminopyridine)/DMF，N，N—二异丙基乙胺(N，N-diisopropy lethylamine)/NMP，HBTU100mmole/0.5MHOBT in DMF，N，N-二环乙基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP。 
其中：DMF为N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide)， 
NMP为N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone)， 
HOBT为1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole)， 
HBTU为2-(1氢-苯并三唑基)—四甲基脲六氟磷酸盐 
(2-1H-benzotriazole-y1-1，1，3，3-tetramethyl-Uronium hexafluorophosphate)。 
(3)操作： 
a.合成 
以0.25mmol规模为例，称取HMP树脂0.25g，置入多肽合成仪上的反应器中，将各种带保护基氨基酸称取1mmol装瓶，按该促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列从C-端向N-端排列在合成仪中，于25℃室温条件下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连结，然后再进 行下一轮循环，如此完成合成，合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂在多肽合成仪上吹干后称重即可。 
b.脱保护基及切断树脂： 
将带保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入裂解试剂如下表： 
Figure 2007101387187A00800031
然后在恒温30℃条件下，电磁搅拌反应6小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤；合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用少量乙醚洗涤后放入干燥器中干燥，得到粗品。 
c.HPLC分离纯化、冻干 
将得到的粗品用制备型HPLC进行分离、提纯，最后经冷冻干燥得到产品，经色质联用检测，该衍生物分子量理论值为4300.6，实测值为4316.7。 
同样地，本领域技术人员可以采用相同的方法合成其它Exendin或其类似物。 
实施例二Exendin-4类似物的基因工程法制备 
本实施例介绍用基因工程的方法合成具有下列结构的Exendin-4类似物： 
[His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Leu-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Arg-OH](SEQ ID NO：251)。 
A.按此Exendin-4类似物的氨基酸序列，合成基因片段： 
(1)5’AAT TCC ATG CAC GGC GAA ACC TTC ACC AGC GAT CTG AGC AAA CAG CTG GAA GAA GAAGCG GTT AA(SEQ ID NO：266)
(2)5’ACTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGC GGC CCG AGC AGC GGC CCG CCG CCG CCG AGCCGT TAG A(SEQ ID NO：267) 
(3)5’AGCTT CTA ACG GCT CGG CGG CGG CGC GCT GCT CGG GCC GCC GTT TTT CAG CCA TTC GATGA(SEQ ID NO：268) 
(4)5’ACAG TTT AAC CGC TTC TTC TTC CAG CTG TTT GCT CAG ATC GCT GGT GAA GGT GCC TTCGCC GTG CAT GG(SEQ ID NO：269) 
B、克隆 
连接：取二支试管，一支加入光密度值为0.1(A260nm)的片段(1)和片段(4)，另一支试管中加入光密度值为(A260nm)的片段(2)和片段(3)，再将聚核苷酸激酶缓冲液(PolynucleotideKinase Buffer)，聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)及三磷酸腺苷(ATP)分别加入该二支试管，于37℃保温60分钟，使基因片段5’端磷酸化。然后，将二支试管转移至95℃水浴中保温10分钟，停止加温，自然冷却退火降至室温。再将T4连接酶缓冲液和T4连接酶分别加入该二支试管中，16℃左右保温。过夜，使基团片段连接。 
质粒：另取一支试管将含有乳糖启动子Lac(或温控启动子PL，色氨酸-乳糖混合启动子Tac)的质粒用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶酶切后用酚/氯仿抽提，离心取水层部分，再用氯仿抽提，离心抽取水层部分，再用氯仿将水层洗涤3次，离心，将水层用异丙醇沉淀，离心，干燥。 
将上述酶切质粒与连接后的基因片段混合，加T4连接酶缓冲液和T4连接酶，室温连接3—4小时。 
受菌体的培养：克隆菌大肠杆菌(E.Coli)JM103于每升含蛋白胨10g、酵母抽提粉5g、氯化钠5g的培养液(LB培养液)中37℃振荡培养4小时，离心收集菌体，经CaCl2溶液处理后，4℃保存备用。 
转化：将克隆的质粒转化至受体菌大肠杆菌JM103细胞中，冰浴维持30分钟，升温至42℃，维持2分钟后，转移至含氨苄青霉素的琼脂糖平板，37℃过夜，进行菌落筛选，得克隆阳性质粒。
C、发酵 
将筛选得含该种衍生物质粒的寄主菌株于LB培养液中振荡培养，加0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，过夜后，离心收集菌体，以十二烷基磺酸钠＝12％的丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，鉴定表达的蛋白。 
D、包涵体 
按上述条件，300ml x10瓶，摇床培养，诱导，收集的菌体加裂解液(1％NaCl，磷酸缓冲液pH7.5，20mM)及溶菌酶，30℃保温30分钟，离心收集沉淀，加6M盐酸胍(Gu.HCl)抽提包涵体，离心，将上清液透析，除去Gu.HCL，再用组成为1％NaCl，0.1％吐温80(Tween80)的磷酸缓冲液(20mM，PH7.5)洗涤沉淀三次，即得包涵体。 
E、裂解 
将包涵体溶于8M尿素溶液，加盐酸至50mM，加溴化氰，避光，氮气保护条件下搅拌，裂解2小时，以HPLC跟踪分析。 
F、纯化 
裂解完成，通过琼脂糖凝胶分子筛G-25分离得粗品，再经HPLC纯化，得产品，与化学合成品相同，质谱分析结果表明所得衍生物分子量与理论值相吻合。 
实施例三直线型单甲氧基聚乙二醇(分子量＝5,000道尔顿)修饰Exendin-4 
每个试管中称取1.0mg Exendin-4，共三个试管。分别使用不同pH值的磷酸缓冲液溶解，再在每个试管中加入N羟基琥珀酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇(分子量＝5,000道尔顿)5.8mg，置于摇床，室温反应1小时。之后使用安捷伦1100系列色谱仪(Agilent1100)分析样品(分析条件为：采用0.1％磷酸流动相A和0.1％磷酸+80％乙腈流动相B，梯度为：35—70％流动相B/25分钟)，检测没有被单甲氧基聚乙二醇修饰的Exendin-4的量。结果如下表： 
表：不同pH对Exendin-4聚乙二醇化的影响 
Figure 2007101387187A00800041
Figure 2007101387187A00800051
使用旋转蒸发器对反相分离得到的收集液进行去除乙腈处理后，可以获得pH为3-4，溶解有单甲氧基聚乙二醇修饰的Exendin-4的溶液。 
实施例四直线型单甲氧基聚乙二醇(分子量＝21,000道尔顿)修饰Exendin-4类似物 
使用梅特勒(AG285，Mettler Toledo)天平先准确称量1.0mg Exendin—4类似物(SEQ INNO：251)，加入2.0ml溶解有氰硼氢化钠(NaBH3CN)磷酸缓冲液(pH4.5)，再准确称取经由醛基活化的分子量为21,000道尔顿的单甲氧基聚乙二醇衍生物5mg。将衍生物加入Exendin—4类似物，置于摇床，室温反应过夜。使用配有Zorbax SB—300半制备柱的安捷伦1100色谱仪对反应液进行纯化(分离条件为：采用0.1％磷酸流动相A和0.1％磷酸+80％乙腈流动相B，梯度为：35—70％流动相B/25分钟)，获得聚乙二醇N末端修饰的Exendin—4类似物。 
使用旋转蒸发器对反相分离得到的收集液进行去除乙腈处理后，使用脱盐柱对样品进行缓冲液置换，将得到的聚乙二醇修饰的Exendin-4类似物溶解于pH为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，并加入0.001-1.0％(w/v)间甲酚。 
实施例五带式IV结构单甲氧基聚乙二醇(分子量＝40,000道尔顿)修饰Exendin-4类似物 
使用梅特勒(AG285，Mettler Toledo)天平先准确称量2.0mg Exendin—4类似物(SEQ INNO：251)，加入4.0ml pH7.0磷酸缓冲液，再准确称取分子量为40,000道尔顿的N羟基琥珀酰亚胺活化的带式IV结构单甲氧基聚乙二醇衍生物280mg。将衍生物加入Exendin—4类似物，置于摇床，室温反应1小时。使用200mlBistris缓冲液(pH＝7.0)稀释反应溶液于250ml烧杯中，待用。 
使用Bistris缓冲液(pH＝7.0)平衡DEAE FF或ANX FF阴离子交换预装柱，将稀释后的反应液上样，使目标物质吸附到离子交换填料上。上样完成后采用线性梯度洗脱的方式，使用不同浓度的NaCl将多取代和单取代Exendin-4类似物分别洗脱下来，同时使用馏分收集器收集，最后使用1M NaCl将未修饰的Exendin-4多肽洗脱下来。整个分离纯化过程如图3所示，图上标记2、3和4分别显示多取代Exendin-4类似物、单取代Exendin-4类似物和未修饰的Exendin-4类似物的洗脱峰。将收集得到的聚乙二醇单取代Exendin-4类似物(理论分子量为44,300道尔顿)做SDS-PAGE凝胶电泳得到的实际分子量略大于43,000道尔顿的标准分子量(如图4所示)，说明分离获得的产品确实是聚乙二醇(分子量＝40,000道尔顿)单取代Exendin-4类似物。
使用超滤装置(超滤离心管或超滤设备)对收集到的聚乙二醇单取代Exendin—4类似物洗脱液进行浓缩，之后再将浓缩液过脱盐柱进行乙酸缓冲液置换，最后在溶解有样品的乙酸缓冲液中加入等渗调节剂(如：甘露醇和0.9％NaCl)和0.001-1.0％(w/v)抑菌剂(如：间甲酚)等。 
实施例六经5,000道尔顿和21，000道尔顿直线型单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物24小时动物药效试验 
实验动物：C57小鼠，体重20g±2g，每组8只动物，共4组。 
对照组1：每只皮下注射注射用水。 
对照组2：每只皮下注射Exendin-4类似物0.025μg。 
给药组1：每只皮下注射单甲氧基聚乙二醇(分子量＝5,000道尔顿)单取代Exendin-4类似物0.625μg。 
给药组2：每只皮下注射单甲氧基聚乙二醇(分子量＝21,000道尔顿)单取代Exendin-4类似物0.625μg。 
每组小鼠分别在给药后4、8、12、16和24小时取血，并在采血前30min给所有受试小鼠腹腔注射200μl的20％葡萄糖溶液。使用葡萄糖试剂盒(上海申索试剂有限公司)对血糖进行测定。结果如图5所示，经单甲氧基聚乙二醇(分子量＝21,000道尔顿)修饰的Exendin—4类似物单次给药后在16小时能保持药效；单甲氧基聚乙二醇(分子量＝5，000道尔顿)修饰的Exendin—4类似物单次给药后能保持药效的时间范围在12-16小时；而未经修饰的Exendin—4类似物的作用时间不超过12小时。实验结果显示，分子量为21,000道尔顿的直线型聚乙二醇修饰的Exendin-4类似物的降糖作用保持时间比分子量为5,000道尔顿的直线型聚乙二醇修饰的Exendin-4类似物长。 
实施例七经21,000道尔顿(直线型)和40,000道尔顿(式IV所示支链结构)单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物72小时动物药效试验 
实验动物：C57小鼠，体重20g±2g，每组8只动物，共5组。 
对照组1：每只皮下注射注射用水。 
对照组2：每只皮下注射Exendin-4多肽0.025μg。 
对照组3：每只皮下注射Exendin-4类似物0.025μg。 
给药组1：每只皮下注射单甲氧基聚乙二醇(分子量＝21,000道尔顿)取代Exendin—4类似物 0.625μg。 
给药组2：每只皮下注射单甲氧基聚乙二醇(分子量＝40,000道尔顿)取代Exendin—4类似物0.625μg。 
每组小鼠分别在给药后4、8、24、48和72小时取血，并在采血前30min给所有受试小鼠腹腔注射200μl的20％葡萄糖溶液。使用葡萄糖试剂盒对血糖进行测定。结果如图6所示，经支链型聚乙二醇(分子量＝40,000道尔顿)修饰的Exendin—4类似物单次给药后能保持至少72小时的药效；直线型聚乙二醇(分子量＝21,000道尔顿)修饰的Exendin—4类似物单次给药后能保持大约24小时的药效。 
实施例八单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物药效试验 
试验样品：总共8个样品，分别为：Exendin-4类似物(SEQ ID NO：251)上单取代有分子量为21,000道尔顿，30,000道尔顿和40,000道尔顿的单甲氧基聚乙二醇(式II)；Exendin-4类似物上单取代有分子量为21,000道尔顿，30,000道尔顿和40,000道尔顿的单甲氧基聚乙二醇(式IV)；Exendin-4类似物上单取代有分子量为21,000道尔顿和30,000道尔顿的直线型单甲氧基聚乙二醇。 
实验动物：C57小鼠，体重20g±2g，共72只，分为3个采血组，每组24只。 
由于动物不耐受多次采血，对三组动物分不同时间段采血，给药后对应的采血时间点如下： 
Figure 2007101387187A00800061
每个采血组再平均分为8个样品小组，每小组3只老鼠。每小组老鼠在试验开始时皮下注射含0.625μg Exendin-4类似物分子的不同类型单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物，研发代号为L21K、L30K(分子量分别为21,000、30,000道尔顿的直线型单甲氧基聚乙二醇单取代)，Y21K、Y30K、Y40K(分子量分别为21,000、30,000、40,000道尔顿的式IV结构单甲氧基聚乙二醇单取代)，U21K、U30K和U40K(分子量分别为21,000、30,000、40,000道尔顿的式II结构单甲氧基聚乙二醇单取代)。给药同时给所有受试小鼠腹腔注射200μl20％葡萄糖溶液，并在给药之后0.5小时对所有受试老鼠采血。然后再按上述分组分别在给药后2、4、8、16、24、36、48、60和72小时采血。每次采血前0.5小时对所有采血小鼠腹腔注射200μl20％葡萄糖溶液。结果如图7、图8和图9所示，显示聚乙二醇分子结构和分子量对聚乙二醇单取代Exendin-4类似物的降糖生物活性的影响很大。式II结构单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物在给药后的72小时中，降糖活性的稳定性要好于直线型及式IV结构单甲氧基聚乙二醇单 取代Exendin-4类似物；而同样结构的支链型单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物中，分子量越大，其在第72小时降糖活性越好。直线型单甲氧基聚乙二醇单取代Exendin-4类似物中L30K在给药后的72小时中均无明显降糖活性，说明直线型聚乙二醇分子量太大对其所修饰的Exendin-4类似物的降糖活性有负面影响。 
实施例九单甲氧基聚乙二醇单取代的Exendin-4类似物药代(血浆半衰期)试验 
实验动物：SD大鼠，雄性，体重250g-300g，每组4只，共两组。 
给药组1：每只皮下注射含4.375μg Exendin-4类似物分子的单甲氧基聚乙二醇(式II，分子量＝30,000道尔顿)单取代Exendin-4类似物(SEQ ID NO：251)，研发代号U30K。 
给药组2：每只皮下注射含4.375μg Exendin-4类似物分子的单甲氧基聚乙二醇(式IV，分子量＝40,000道尔顿)单取代Exendin-4类似物(SEQ ID NO：251)，研发代号Y40K。 
每组小鼠分别在给药后0、2、4、8、12、16、24、36、48、60和72小时采血。血药浓度检测使用美国康肽公司(Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，California，USA)Enzyme Immunoassaykit(EIA)试剂盒检测Exendin-4浓度。结果如图10所示，经使用上海宏能软件有限公司的计算机软件Pharmaceutical Kinetics Software(版本1.0.2)计算，U30K的吸收半衰期为10.78小时，消除半衰期为21.44小时，Y40K的吸收半衰期为5.53小时，消除半衰期为40.77小时，两个样品的达峰时间均为给药后第12小时左右，最大药峰浓度均为20ng/mL左右。
序列表 
<110> 上海华谊生物技术有限公司 
<120> 聚乙二醇修饰的Exendin或其类似物及其制剂 
<130> GHY001 
<160> 269 
<170> PatentIn version3.3 
<210> 1 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin-3 
<400> 1 
Figure S071D8718720070810D000181
<210> 2 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin-4 
<400> 2 
<210> 3 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物1 
<400> 3 
Figure S071D8718720070810D000183
Figure S071D8718720070810D000191
<210> 4 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物2 
<400> 4 
Figure S071D8718720070810D000192
<210> 5 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物3 
<400> 5 
Figure S071D8718720070810D000193
<210> 6 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物4 
<400> 6 
Figure S071D8718720070810D000194
<210> 7 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物5 
<400> 7 
Figure S071D8718720070810D000201
<210> 8 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物6 
<400> 8 
Figure S071D8718720070810D000202
<210> 9 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物7 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (9)..(9) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 9 
Figure S071D8718720070810D000203
<210> 10 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物8 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (10)..(10) 
<223> Xaa stands for naph 
<400> 10 
Figure S071D8718720070810D000204
<210> 11 
<211> 20 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物9
<400> 11 
Figure S071D8718720070810D000211
<210> 12 
<211> 20 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物10 
<400> 12 
Figure S071D8718720070810D000212
<210> 13 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物11 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (11)..(11) 
<223> Xaa stands for tBug 
<400> 13 
Figure S071D8718720070810D000213
<210> 14 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物12 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (11)..(11) 
<223> Xaa stands for tBug 
<400> 14 
<210> 15 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物13 
<400> 15 
<210> 16 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物14 
<400> 16 
Figure S071D8718720070810D000222
<210> 17 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物15 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(17) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 17 
Figure S071D8718720070810D000223
<210> 18 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物16 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (15)..(17) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 18
Figure S071D8718720070810D000231
<210> 19 
<211> 17 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物17 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(16) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 19 
Figure S071D8718720070810D000232
<210> 20 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物18 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (15)..(17) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 20 
Figure S071D8718720070810D000233
<210> 21 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物19 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(17) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 21 
Figure S071D8718720070810D000241
<210> 22 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物20 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(17) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 22 
Figure S071D8718720070810D000242
<210> 23 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物21 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(17) 
<223> Xaa stands for MeAla 
<400> 23 
Figure S071D8718720070810D000243
<210> 24 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物22 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (15)..(17) 
<223> Xaa stands for MeAla 
<400> 24 
Figure S071D8718720070810D000244
Figure S071D8718720070810D000251
<210> 25 
<211> 18 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物23 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(17) 
<223> Xaa stands for MeAla 
<400> 25 
Figure S071D8718720070810D000252
<210> 26 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物24 
<400> 26 
Figure S071D8718720070810D000253
<210> 27 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物25 
<400> 27 
Figure S071D8718720070810D000254
<210> 28 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物26 
<400> 28 
Figure S071D8718720070810D000255
Figure S071D8718720070810D000261
<210> 29 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物27 
<400> 29 
Figure S071D8718720070810D000262
<210> 30 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物28 
<400> 30 
Figure S071D8718720070810D000263
<210> 31 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物29 
<400> 31 
Figure S071D8718720070810D000264
<210> 32 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物30 
<400> 32 
Figure S071D8718720070810D000265
<210> 33
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物31 
<400> 33 
Figure S071D8718720070810D000271
<210> 34 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物32 
<400> 34 
Figure S071D8718720070810D000272
<210> 35 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物33 
<400> 35 
<210> 36 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物34 
<400> 36 
Figure S071D8718720070810D000274
<210> 37 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物35
<400> 37 
<210> 38 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物36 
<400> 38 
Figure S071D8718720070810D000282
<210> 39 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物37 
<400> 39 
Figure S071D8718720070810D000283
<210> 40 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物38 
<400> 40 
Figure S071D8718720070810D000284
<210> 41 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物39 
<400> 41 
Figure S071D8718720070810D000285
Figure S071D8718720070810D000291
<210> 42 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物40 
<400> 42 
Figure S071D8718720070810D000292
<210> 43 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物41 
<400> 43 
Figure S071D8718720070810D000293
<210> 44 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物42 
<400> 44 
Figure S071D8718720070810D000294
<210> 45 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物43 
<400> 45 
Figure S071D8718720070810D000295
<210> 46 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物44 
<400> 46 
Figure S071D8718720070810D000301
<210> 47 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物45 
<400> 47 
Figure S071D8718720070810D000302
<210> 48 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物46 
<400> 48 
Figure S071D8718720070810D000303
<210> 49 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物47 
<400> 49 
Figure S071D8718720070810D000304
<210> 50
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物48 
<400> 50 
Figure S071D8718720070810D000311
<210> 51 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物49 
<400> 51 
Figure S071D8718720070810D000312
<210> 52 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物50 
<400> 52 
Figure S071D8718720070810D000313
<210> 53 
<211> 36 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物51 
<400> 53 
Figure S071D8718720070810D000314
Figure S071D8718720070810D000321
<210> 54 
<211> 36 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物52 
<400> 54 
Figure S071D8718720070810D000322
<210> 55 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物53 
<400> 55 
Figure S071D8718720070810D000323
<210> 56 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物54 
<400> 56 
Figure S071D8718720070810D000324
<210> 57 
<211> 34
<212> PRT 
<213> Exendin类似物55 
<400> 57 
<210> 58 
<211> 34 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物56 
<400> 58 
Figure S071D8718720070810D000332
<210> 59 
<211> 33 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物57 
<400> 59 
Figure S071D8718720070810D000333
<210> 60 
<211> 33 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物58 
<400> 60 
Figure S071D8718720070810D000341
<210> 61 
<211> 32 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物59 
<400> 61 
Figure S071D8718720070810D000342
<210> 62 
<211> 32 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物60 
<400> 62 
Figure S071D8718720070810D000343
<210> 63 
<211> 31 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物61 
<400> 63 
Figure S071D8718720070810D000344
<210> 64 
<211> 31 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物62 
<400> 64 
Figure S071D8718720070810D000345
Figure S071D8718720070810D000351
<210> 65 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物63 
<400> 65 
Figure S071D8718720070810D000352
<210> 66 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物64 
<400> 66 
Figure S071D8718720070810D000353
<210> 67 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物65 
<400> 67 
Figure S071D8718720070810D000354
<210> 68 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物66 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for hPro 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(38) 
<223> Xaa stands for hPro
<400> 68 
Figure S071D8718720070810D000361
<210> 69 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物67 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(38) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 69 
Figure S071D8718720070810D000362
<210> 70 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物68 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for Nme 
<400> 70 
Figure S071D8718720070810D000363
<210> 71 
<211> 37 
<212> PRT
<213> Exendin类似物69 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for Nme 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(37) 
<223> Xaa stands for Nme 
<400> 71 
<210> 72 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物70 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for hPro 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(37) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 72 
Figure S071D8718720070810D000372
<210> 73 
<211> 36 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物71 
<220> 
<221> misc_feature
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for hPro 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(36) 
<223> Xaa stands for hPro 
<400> 73 
<210> 74 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物72 
<400> 74 
<210> 75 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物73 
<400> 75 
Figure S071D8718720070810D000383
<210> 76 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物74 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (6)..(6)
<223> Xaa stands for naph 
<400> 76 
Figure S071D8718720070810D000391
<210> 77 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物75 
<400> 77 
Figure S071D8718720070810D000392
<210> 78 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物76 
<400> 78 
Figure S071D8718720070810D000393
<210> 79 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物77 
<400> 79 
Figure S071D8718720070810D000394
<210> 80 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物78 
<220> 
<221> misc_feature
<222> (10)..(10) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 80 
Figure S071D8718720070810D000401
<210> 81 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物79 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (22)..(22) 
<223> Xaa stands for naph 
<400> 81 
Figure S071D8718720070810D000402
<210> 82 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物80 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (23)..(23) 
<223> Xaa stands for tBug 
<400> 82 
Figure S071D8718720070810D000403
<210> 83 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物81 
<400> 83 
Figure S071D8718720070810D000404
Figure S071D8718720070810D000411
<210> 84 
<211> 33 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物82 
<400> 84 
<210> 85 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物83 
<400> 85 
Figure S071D8718720070810D000413
<210> 86 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物84 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(37) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 86 
Figure S071D8718720070810D000414
Figure S071D8718720070810D000421
<210> 87 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物85 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 87 
Figure S071D8718720070810D000422
<210> 88 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物86 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 88 
Figure S071D8718720070810D000423
<210> 89 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物87 
<220> 
<221> misc_feature
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 89 
Figure S071D8718720070810D000431
<210> 90 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物88 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 90 
<210> 91 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物89 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 91
Figure S071D8718720070810D000441
<210> 92 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物90 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 92 
Figure S071D8718720070810D000442
<210> 93 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物91 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 93 
Figure S071D8718720070810D000443
<210> 94 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物92
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<400> 94 
Figure S071D8718720070810D000451
<210> 95 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物93 
<400> 95 
Figure S071D8718720070810D000452
<210> 96 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物94 
<400> 96 
Figure S071D8718720070810D000453
<210> 97 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物95 
<400> 97 
Figure S071D8718720070810D000454
Figure S071D8718720070810D000461
<210> 98 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物96 
<400> 98 
Figure S071D8718720070810D000462
<210> 99 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物97 
<400> 99 
Figure S071D8718720070810D000463
<210> 100 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物98 
<400> 100 
Figure S071D8718720070810D000464
<210> 101 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物99 
<400> 101 
Figure S071D8718720070810D000465
<210> 102 
<211> 28
<212> PRT 
<213> Exendin类似物100 
<400> 102 
Figure S071D8718720070810D000471
<210> 103 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物101 
<400> 103 
<210> 104 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物102 
<400> 104 
Figure S071D8718720070810D000473
<210> 105 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物103 
<400> 105 
<210> 106 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物104 
<400> 106
Figure S071D8718720070810D000481
<210> 107 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物105 
<400> 107 
Figure S071D8718720070810D000482
<210> 108 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物106 
<400> 108 
Figure S071D8718720070810D000483
<210> 109 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物107 
<400> 109 
Figure S071D8718720070810D000484
<210> 110 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物108 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (6)..(6) 
<223> Xaa stands for Nala
<400> 110 
Figure S071D8718720070810D000491
<210> 111 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物109 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (6)..(6) 
<223> Xaa stands for Nala 
<400> 111 
Figure S071D8718720070810D000492
<210> 112 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物110 
<400> 112 
<210> 113 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物111 
<400> 113 
<210> 114 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物112
<400> 114 
Figure S071D8718720070810D000501
<210> 115 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物113 
<400> 115 
Figure S071D8718720070810D000502
<210> 116 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物114 
<400> 116 
Figure S071D8718720070810D000503
<210> 117 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物115 
<400> 117 
Figure S071D8718720070810D000504
<210> 118 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物116 
<400> 118
Figure S071D8718720070810D000511
<210> 119 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物117 
<400> 119 
Figure S071D8718720070810D000512
<210> 120 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物118 
<400> 120 
Figure S071D8718720070810D000513
<210> 121 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物119 
<400> 121 
Figure S071D8718720070810D000514
<210> 122 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物120 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (10)..(10) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 122
Figure S071D8718720070810D000521
<210> 123 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物121 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (10)..(10) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 123 
Figure S071D8718720070810D000522
<210> 124 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物122 
<400> 124 
Figure S071D8718720070810D000523
<210> 125 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物123 
<400> 125 
Figure S071D8718720070810D000524
<210> 126 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物124
<400> 126 
<210> 127 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物125 
<400> 127 
Figure S071D8718720070810D000532
<210> 128 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物126 
<400> 128 
Figure S071D8718720070810D000533
<210> 129 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物127 
<400> 129 
Figure S071D8718720070810D000534
<210> 130 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物128 
<400> 130 
Figure S071D8718720070810D000535
<210> 131 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物129 
<400> 131 
<210> 132 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物130 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(14) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 132 
<210> 133 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物131 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (14)..(14) 
<223> Xaa stands for Pgly 
<400> 133 
Figure S071D8718720070810D000544
<210> 134 
<211> 28 
<212> PRT
<213> Exendin类似物132 
<400> 134 
Figure S071D8718720070810D000551
<210> 135 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物133 
<400> 135 
Figure S071D8718720070810D000552
<210> 136 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物134 
<400> 136 
Figure S071D8718720070810D000553
<210> 137 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物135 
<400> 137 
<210> 138 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物136 
<400> 138
Figure S071D8718720070810D000561
<210> 139 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物137 
<400> 139 
Figure S071D8718720070810D000562
<210> 140 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物138 
<400> 140 
Figure S071D8718720070810D000563
<210> 141 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物139 
<400> 141 
Figure S071D8718720070810D000564
<210> 142 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物140 
<400> 142 
Figure S071D8718720070810D000571
<210> 143 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物141 
<400> 143 
<210> 144 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物142 
<400> 144 
<210> 145 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物143 
<400> 145 
Figure S071D8718720070810D000574
<210> 146 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物144 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (22)..(22) 
<223> Xaa stands for Nala 
<400> 146 
Figure S071D8718720070810D000575
Figure S071D8718720070810D000581
<210> 147 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物145 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (22)..(22) 
<223> Xaa stands for Nala 
<400> 147 
Figure S071D8718720070810D000582
<210> 148 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物146 
<400> 148 
Figure S071D8718720070810D000583
<210> 149 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物147 
<400> 149 
Figure S071D8718720070810D000584
<210> 150 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物148 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (23)..(23) 
<223> Xaa stands for Tgly
<400> 150 
Figure S071D8718720070810D000591
<210> 151 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物149 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (23)..(23) 
<223> Xaa stands for Tgly 
<400> 151 
Figure S071D8718720070810D000592
<210> 152 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物150 
<400> 152 
Figure S071D8718720070810D000593
<210> 153 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物151 
<400> 153 
Figure S071D8718720070810D000594
<210> 154 
<211> 28 
<212> PRT
<213> Exendin类似物152 
<400> 154 
Figure S071D8718720070810D000601
<210> 155 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物153 
<400> 155 
Figure S071D8718720070810D000602
<210> 156 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物154 
<400> 156 
Figure S071D8718720070810D000603
<210> 157 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物155 
<400> 157 
Figure S071D8718720070810D000604
<210> 158 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物156 
<400> 158
Figure S071D8718720070810D000611
<210> 159 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物157 
<400> 159 
Figure S071D8718720070810D000612
<210> 160 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物158 
<400> 160 
Figure S071D8718720070810D000613
<210> 161 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物159 
<400> 161 
<210> 162 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物160 
<400> 162 
Figure S071D8718720070810D000615
Figure S071D8718720070810D000621
<210> 163 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物161 
<400> 163 
Figure S071D8718720070810D000622
<210> 164 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物162 
<400> 164 
<210> 165 
<211> 36 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物163 
<400> 165 
Figure S071D8718720070810D000624
<210> 166 
<211> 36 
<212> PRT
<213> Exendin类似物164 
<400> 166 
Figure S071D8718720070810D000631
<210> 167 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物165 
<400> 167 
Figure S071D8718720070810D000632
<210> 168 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物166 
<400> 168 
Figure S071D8718720070810D000633
<210> 169 
<211> 34 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物167 
<400> 169 
Figure S071D8718720070810D000634
<210> 170 
<211> 32 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物168 
<400> 170 
Figure S071D8718720070810D000642
<210> 171 
<211> 32 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物169 
<400> 171 
Figure S071D8718720070810D000643
<210> 172 
<211> 32 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物170 
<400> 172 
Figure S071D8718720070810D000644
<210> 173 
<211> 31 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物171 
<400> 173 
Figure S071D8718720070810D000645
<210> 174 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物172 
<400> 174 
<210> 175 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物173 
<400> 175 
Figure S071D8718720070810D000652
<210> 176 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物174 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for tPro 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(38) 
<223> Xaa stands for tPro 
<400> 176 
Figure S071D8718720070810D000653
<210> 177 
<211> 38 
<212> PRT
<213> Exendin类似物175 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(38) 
<223> Xaa stands for tPro 
<400> 177 
Figure S071D8718720070810D000661
<210> 178 
<211> 37 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物176 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for Nme 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (36)..(37) 
<223> Xaa stands for Nme 
<400> 178 
Figure S071D8718720070810D000662
<210> 179 
<211> 36 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物177 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (31)..(31) 
<223> Xaa stands for tPro 
<220> 
<221> misc_feature
<222> (36)..(36) 
<223> Xaa stands for tPro 
<400> 179 
Figure S071D8718720070810D000671
<210> 180 
<211> 35 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物178 
<400> 180 
<210> 181 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物179 
<400> 181 
Figure S071D8718720070810D000673
<210> 182 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物180 
<400> 182 
Figure S071D8718720070810D000674
Figure S071D8718720070810D000681
<210> 183 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物181 
<400> 183 
Figure S071D8718720070810D000682
<210> 184 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物182 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 184 
Figure S071D8718720070810D000683
<210> 185 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物183 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl
<400> 185 
Figure S071D8718720070810D000691
<210> 186 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物184 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 186 
Figure S071D8718720070810D000692
<210> 187 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物185 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (26)..(26) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 187 
<210> 188
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物186 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 188 
<210> 189 
<211> 27 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物187 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 189 
Figure S071D8718720070810D000702
<210> 190 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物188 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220>
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 190 
Figure S071D8718720070810D000711
<210> 191 
<211> 29 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物189 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> Xaa stands for4-ImidazolylPpionyl-G 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 191 
Figure S071D8718720070810D000712
<210> 192 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物190 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 192 
Figure S071D8718720070810D000713
<210> 193 
<211> 28 
<212> PRT
<213> Exendin类似物191 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 193 
Figure S071D8718720070810D000721
<210> 194 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物192 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 194 
<210> 195 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物193 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 195 
<210> 196 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物194
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (28)..(28) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 196 
Figure S071D8718720070810D000731
<210> 197 
<211> 28 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物195 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (28)..(28) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 197 
Figure S071D8718720070810D000732
<210> 198 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物196 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (28)..(28) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsi lon)octanoyl 
<400> 198 
<210> 199 
<211> 30 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物197 
<220> 
<221> misc_feature
<222> (28)..(28) 
<223> Xaa stands for Lys-NH(epsilon)octanoyl 
<400> 199 
Figure S071D8718720070810D000741
<210> 200 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物198 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (12)..(12) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 200 
Figure S071D8718720070810D000742
<210> 201 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物199 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 201 
Figure S071D8718720070810D000743
<210> 202 
<211> 39 
<212> PRT
<213> Exendin类似物200 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (2)..(2) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 202 
<210> 203 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物201 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (5)..(5) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 203 
Figure S071D8718720070810D000752
<210> 204 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物202 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (8)..(8) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 204 
Figure S071D8718720070810D000753
<210> 205 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物203 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (10)..(10) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 205 
Figure S071D8718720070810D000762
<210> 206 
<211> 38 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物204 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (11)..(11) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 206 
Figure S071D8718720070810D000763
<210> 207 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物205 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (13)..(13) 
<223> Lys is Pegylated
<400> 207 
Figure S071D8718720070810D000771
<210> 208 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物206 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (16)..(16) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 208 
Figure S071D8718720070810D000772
<210> 209 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物207 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (17)..(17) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 209 
Figure S071D8718720070810D000773
<210> 210 
<211> 39 
<212> PRT
<213> Exendin类似物208 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (19)..(19) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 210 
Figure S071D8718720070810D000781
<210> 211 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物209 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (21)..(21) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 211 
<210> 212 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物210 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (24)..(24) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 212 
Figure S071D8718720070810D000783
Figure S071D8718720070810D000791
<210> 213 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物211 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (25)..(25) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 213 
Figure S071D8718720070810D000792
<210> 214 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物212 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (28)..(28) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 214 
Figure S071D8718720070810D000793
<210> 215 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物213 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (29)..(29) 
<223> Lys is Pegylated
<400> 215 
Figure S071D8718720070810D000801
<210> 216 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物214 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (30)..(30) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 216 
Figure S071D8718720070810D000802
<210> 217 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物215 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> His is Acylated 
<400> 217 
Figure S071D8718720070810D000803
<210> 218 
<211> 39 
<212> PRT
<213> Exendin类似物216 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> His is Alkylated 
<400> 218 
Figure S071D8718720070810D000811
<210> 219 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物217 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 219 
Figure S071D8718720070810D000812
<210> 220 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物218 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (12)..(12) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 220 
Figure S071D8718720070810D000813
<210> 221 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物219 
<400> 221 
Figure S071D8718720070810D000822
<210> 222 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物220 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (29)..(29) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 222 
<210> 223 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物221 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (30)..(30) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 223 
Figure S071D8718720070810D000824
Figure S071D8718720070810D000831
<210> 224 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物222 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (27)..(27) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 224 
<210> 225 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物223 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (12)..(12) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 225 
Figure S071D8718720070810D000833
<210> 226 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物224 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1)
<223> His is Pegylated 
<400> 226 
Figure S071D8718720070810D000841
<210> 227 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物225 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (1)..(1) 
<223> His is Pegylated 
<400> 227 
<210> 228 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物226 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (39)..(39) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 228 
Figure S071D8718720070810D000843
<210> 229
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物227 
<220> 
<221> misc_feature 
<222> (30)..(30) 
<223> Lys is Pegylated 
<400> 229 
Figure S071D8718720070810D000851
<210> 230 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物228 
<400> 230 
Figure S071D8718720070810D000852
<210> 231 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物229 
<400> 231 
Figure S071D8718720070810D000853
<210> 232 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物230
<400> 232 
Figure S071D8718720070810D000861
<210> 233 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物231 
<400> 233 
Figure S071D8718720070810D000862
<210> 234 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物232 
<400> 234 
Figure S071D8718720070810D000863
<210> 235 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物233 
<400> 235 
Figure S071D8718720070810D000864
Figure S071D8718720070810D000871
<210> 236 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物234 
<400> 236 
Figure S071D8718720070810D000872
<210> 237 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物235 
<400> 237 
Figure S071D8718720070810D000873
<210> 238 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物236 
<400> 238 
Figure S071D8718720070810D000874
<210> 239 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物237
<400> 239 
Figure S071D8718720070810D000881
<210> 240 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物238 
<400> 240 
Figure S071D8718720070810D000882
<210> 241 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物239 
<400> 241 
<210> 242 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物240 
<400> 242 
Figure S071D8718720070810D000884
<210> 243 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物241 
<400> 243 
Figure S071D8718720070810D000892
<210> 244 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物242 
<400> 244 
Figure S071D8718720070810D000893
<210> 245 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物243 
<400> 245 
Figure S071D8718720070810D000894
<210> 246 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物244
<400> 246 
Figure S071D8718720070810D000901
<210> 247 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物245 
<400> 247 
Figure S071D8718720070810D000902
<210> 248 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物246 
<400> 248 
Figure S071D8718720070810D000903
<210> 249 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物247 
<400> 249 
Figure S071D8718720070810D000904
<210> 250 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物248 
<400> 250 
<210> 251 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物249 
<400> 251 
Figure S071D8718720070810D000913
<210> 252 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物250 
<400> 252 
Figure S071D8718720070810D000914
<210> 253 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物251
<400> 253 
Figure S071D8718720070810D000921
<210> 254 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物252 
<400> 254 
Figure S071D8718720070810D000922
<210> 255 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物253 
<400> 255 
<210> 256 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物254 
<400> 256 
Figure S071D8718720070810D000924
<210> 257 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物255 
<400> 257 
<210> 258 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物256 
<400> 258 
Figure S071D8718720070810D000933
<210> 259 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物257 
<400> 259 
Figure S071D8718720070810D000934
<210> 260 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物258
<400> 260 
Figure S071D8718720070810D000941
<210> 261 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物259 
<400> 261 
Figure S071D8718720070810D000942
<210> 262 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物260 
<400> 262 
Figure S071D8718720070810D000943
<210> 263 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物261 
<400> 263 
Figure S071D8718720070810D000944
<210> 264 
<211> 39 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物262 
<400> 264 
Figure S071D8718720070810D000952
<210> 265 
<211> 40 
<212> PRT 
<213> Exendin类似物263 
<400> 265 
Figure S071D8718720070810D000953
<210> 266 
<211> 65 
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence 
<220> 
<223> Chemically Synthesized 
<400> 266 
Figure S071D8718720070810D000954
<210> 267 
<211> 65 
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence 
<220> 
<223> Chemically Synthesized
<400> 267 
Figure S071D8718720070810D000961
<210> 268 
<211> 61 
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence 
<220> 
<223> Chemically Synthesized 
<400> 268 
Figure S071D8718720070810D000962
<210> 269 
<211> 69 
<212> DNA 
<213> Artificial Sequence 
<220> 
<223> Chemically Synthesized 
<400> 269 
Figure S071D8718720070810D000963

Claims (9)

1.一种带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的聚乙二醇具有如下式IV所示的支链结构：
Figure FDA0000111092490000011
其中，PEG为-O(CH2CH2O)q-，q为正整数，Me为甲基；所述聚乙二醇基团的分子量在5000-50000道尔顿之间；
其中，所述的聚乙二醇基团是通过将一个或一个以上的聚乙二醇与所述的艾塞丁或其类似物中的一个或一个以上的氨基酸相连接而连接到所述的艾塞丁或其类似物上；
所述的艾塞丁或其类似物为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：251所列的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的艾塞丁或其类似物为SEQ ID NO：2所列的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的艾塞丁或其类似物为SEQ ID NO：251所列的氨基酸序列。
4.如权利要求1或2所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的聚乙二醇基团的分子量为20,000道尔顿至50,000道尔顿之间。
5.如权利要求1所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的聚乙二醇基团是经N羟基琥珀酰亚胺活化而连接到所述的艾塞丁或其类似物上。
6.如权利要求1所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物中包含一个、两个、三个或四个带支链结构的聚乙二醇基团。
7.如权利要求6所述的带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物，其特征在于，所述的带有 聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物中包含一个带支链结构的聚乙二醇基团。
8.一种由带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物形成的制剂，其特征在于，该制剂包括如权利要求1-7之一所述的一种或多种带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物。
9.如权利要求1-7之一所述的一种或多种带有聚乙二醇基团的艾塞丁或其类似物在制备治疗糖尿病药物方面的用途。 
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