CN1162446C - 促胰岛素分泌肽衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗II型糖尿病的促进胰岛素分泌的多肽化合物Exendin-4的衍生物和其适用于药用的盐，其结构如下：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z其中：X是Arg，Leu或Ile，Y是His，Arg或Lys，Z是Arg-OH，-OH，-NH₂或Lys-OH。它们可以用化学合成方法制备，尤其易于用重组DNA方法制备，为商业化生产提供了可能。

Description

促胰岛素分泌肽衍生物

本发明涉及治疗II型糖尿病的活性多肽化合物，具体地说涉及促胰岛素分泌肽化合物Exendin-4的衍生物。

早期在对肠激研究时发现，同等数量的葡萄糖，口服比注射产生更多的胰岛素，究其原因，科研人员发现原来是肠道激素(Incretins)起的作用。肠道激素是一组多肽化合物，1985年人们了解了在肠道激素中有强力肠抑胃肽GIP(gastric inhibitory peptide)和胰高血糖素类多肽GLP-1(glucagon-likepeptide)。GLP-1又有二种，一种为GLP-1(7-36)-NH₂，由30个氨基酸残基组成，另一种为GLP-1(7-37)，由31个氨基酸残基组成，二者有相同的促胰岛素分泌作用。在对离体胰岛细胞(1×10^-10～1×10^-11mol/L)作用时，LP-1促进了胰岛素的分泌。DNA及氨基酸序列分析发现，这些促胰岛素分泌肽是由胰高血糖素原分子经肠道蛋白水解酶作用而产生，因而称为胰高血糖素类多肽。GLP-1的特点是能促进胰岛β-细胞合成胰岛素原信使RNA和胰岛素原，进而促进胰岛素的释放。GLP-1对胰岛β-细胞的作用依赖葡萄糖浓度，当血糖浓度高于6mmol/L时，其显著促进胰岛素分泌；而一旦血糖浓度恢复至正常值则不再继续作用，这一点对II型糖尿病的治疗十分有用。近年的临床实验也证明，GLP-I对II型糖尿病患者有促进胰岛素分泌和降低血糖浓度的作用。

GLP-1(7-36)-NH₂的化学结构如下：

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH₂

式中英文缩写表示：

His组氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr苏氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser丝氨酸，Asp天冬氨酸，Val缬氨酸，Tyr酪氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Lys赖氨酸，Ile异亮氨酸，Arg精氨酸

世界专利申请WO 91/11457号公开了用于治疗II型糖尿病的类胰高血糖素类多肽GLP-I(7-34)、(7-35)、(7-36)和(7-37)的类似物。

1996年Jean-Pierre Ranfman在《Regulatory Peptides》杂志上向人们介绍了一种从墨西哥巨蜥蜴beaded lizard(Heloderma horridum)的毒液中发现分离得到的含39个氨基酸的多肽化合物Exendin-4，其C末端为酰胺，化学结构如下：

                                    10                                      20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-

                                    30                                  39

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂

式中英文缩写表示：

Met甲硫氨酸，Asn天冬酰胺，Pro脯氨酸

Exendin-4在氨基酸序列上与GLP-1有53％的同源性，并且可与GLP-1的受体相结合，亦有促进胰岛素分泌的作用，因此也是一种促胰岛素分泌肽。

美国专利USP 05424286公开了Exendin-4与GLP-1促进胰岛素分泌作用的对比实验，实验证明其促进胰岛素的分泌作用比GLP-1强，产生促胰岛素分泌作用所需浓度比GLP-1低，而且在体内的半衰期比GLP-1长。鉴于这些特点，Exendin-4可能成为一种较为理想的治疗II型糖尿病的药物。

Exendin-4可采用化学合成方法，例如用多肽合成仪来制备，但用此种方法制备，产品成本高，导致售价高，无法使其成为一个商业化药品，为此人们试图采用基因工程方法来大规模低成本生产以达到商业化目的。

本发明目的在于提供一类多肽化合物Exendin-4的衍生物，它们具有促进胰岛素分泌的生物活性和降低血糖的作用，可用于治疗II型糖尿病。它们不仅可以用化学合成方法制备，还易于用重组DNA方法制备，从而为降低生产成本提供了可能。

本发明的内容涉及一种如下结构的促胰岛素分泌肽衍生物和其适用于药用的盐，

                                     10             14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                     30                                  39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X是Leu或Ile，

      Y是Lys，

      Z是Arg-OH。

本发明中所述的促胰岛素分泌肽衍生物结构式中的X为Ile，Y为Lys，Z为Arg-OH。

本发明中所述的促胰岛素分泌肽衍生物结构式中的X为Leu，Y为Lys，Z为Arg-OH。

本发明中所述如下结构的促胰岛素分泌肽衍生物的制备方法，

                                     10             14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                     30                                  39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X是Leu或Ile，

      Y是Lys，

      Z是Arg-OH。

此制备方法为固相化学合成法，其步骤包括：以HMP树脂为固相载体，氨基酸的α-氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团保护，用多肽合成仪按促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列进行合成，再经分离纯化，冻干即得产品。

本发明中所述如下结构的促胰岛素分泌肽衍生物的制备方法，

                                     10             14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                     30                                  39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X是Leu或Ile，

      Y是Lys，

      Z是Arg-OH。

此制备方法为基因工程制备法，其步骤包括：

a、按促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段；

b、基因片段经连接，质粒构建，受菌体的培养，转化，克隆得到菌株；

c、菌株经发酵，破壁，抽提得到包涵体；

d、包涵体裂解、分离得粗品，经高效液相层析仪HPLC纯化，最后经冻干得产品。

本发明中所述如下结构的促胰岛素分泌肽衍生物和其适用于药用的盐用作治疗II型糖尿病的药物。

                                     10             14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                     30                                  39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X是Leu或Ile，

      Y是Lys，

      Z是Arg-OH。

该药物中含有上述促胰岛素分泌肽衍生物及其适于药用的盐，或其组合物。

本发明提供了一类新的多肽化合物Exendin-4的衍生物，扩大了多肽化合物Exendin-4衍生物的种类，它们具有促进胰岛素分泌的生物活性和降血糖作用，可用于治疗II糖尿病。它们不仅可以用化学合成方法制备，还易于用重组DNA方法制备，从而为降低生产成本提供了可能。药效实验证明，在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD小鼠)腹腔内注射含0.1μg本发明的促胰岛素分泌肽衍生物，有明显的促进胰岛素分泌和降血糖作用。

现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步的说明。

附图1是本发明促胰岛素分泌肽衍生物的药效实验图。

附图2是实施例1所得产品的质谱图，该衍生物分子量理论值为4300.6，实测值为4316.7。

下面实施例是对本发明的进一步阐述，而不是对本发明的限制。

实施例1：固相化学合成法制备本发明结构的蛙皮抗菌促胰岛素分泌肽衍生物，其中X为Arg，Y为Lys，Z为-OH。

(1)所采用的氨基酸单体：

Fmoc-L-Ala-OH	Fmoc-L-Lys(Boc)-OH
		Fmoc-L-Asn(Trt)-OH	Fmoc-L-Met-OH
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH	Fmoc-L-Phe-OH
		Fmoc-L-Gln(Trt)-OH	Fmoc-L-Pro-OH
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH	Fmoc-L-Ser(tBu)-OH
		Fmoc-L-Gly-OH	Fmoc-L-Thr(tBu)-OH
Fmoc-L-His(Trt)-OH	Fmoc-L-Trp-OH
		Fmoc-L-Ile-OH	Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH
Fmoc-L-Leu-OH	Fmoc-L-Val-OH

上式中缩写表示：

Fmoc：9-芴基甲氧羰基

BOC：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)

Trt：三苯甲基(trityl)

OtBu：叔丁基酯

tBu：叔丁基(tert-butyl)

(2)合成所采用的仪器设备及试剂：

仪器为：Applied Biosystem多肽合成仪，433A型，美国

试剂有：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMF N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU 100mmole/0.5M HOBT inDMF，N，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP

其中：DMF为N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide)

NMP为N-甲基比咯烷酮(N-methylpyrrolidone)

HOBT为1-羟基苯并三唑(1-Hydroxybenzotriazole)

HBTU为2-(1氢-苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(1H-benzotriazole-y1-1，1，3，3-tetramethyl-Uroniumhexafluorophosphate)

(3)操作：

a、合成

以0.25mmol规模为例，称取HMP树脂0.25g，置入多肽合成仪上的反应器中，将各种带保护基氨基酸称取1mmol装瓶，按该促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列从C-端向N-端排列在合成仪中，于25℃室温条件下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连结，然后再进行下一轮循环，如此完成合成。合成结束后，将得到的带侧链保护基的多肽树脂在多肽合成仪上吹干后称重即可。

b、脱保护基及切断树脂：

将带保护基的该促胰岛素分泌肽衍生物多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入裂解试剂如下表：

            试剂          用量

            水            0.50ml

            苯甲醚        0.50ml

            苯酚          0.75g

            巯基乙醇      0.20ml

            三氟乙酸      10.0ml

然后在恒温30℃条件下，电磁搅拌反应6小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤；合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用少量乙醚洗涤后放入干燥器中干燥，得到粗品。

c、HPLC分离纯化、冻干

将得到的粗品用制备型HPLC进行分离、提纯，最后经冷冻干燥后得到产品。经色质联用检测，该衍生物分子量理论值为4300.6，实测值为4316.7。

实施例2：基因工程法制备本发明的促胰岛素分泌肽衍生物，其中X为Leu，Y为Lys，Z为Arg-OH。

A、按此促胰岛素分泌肽衍生物的氨基酸序列，合成基因片段：(1)5’AAT TCC ATG CAC GGC GAA GGC ACC TTC ACC AGC GAT CTG AGC AAA CAG CTG GAA

   GAA GAA GCG GTT AA

(2)5’ACTG TTC ATC GAA TGG CTG AAA AAC GGC GGC CCG AGC AGC GGC GCG CCG CCG CCG

   AGC CGT TAG A

(3)5’AGCTT CTA ACG GCT CGG CGG CGG CGC GCC GCT GCT CGG GCC GCC GTT TTT CAG CCA

   TTC GAT GA

(4)5’ACAG TTT AAC CGC TTC TTC TTC CAG CTG TTT GCT CAG ATC GCT GGT GAA GGT GCC

   TTC GCC GTG CAT GG

B、克隆

连接：取二支试管，一支加入光密度值为0.1(A_260nm)的片段(1)和片段(4)，另一支试管中加入光密度值为(A_260nm)的片段(2)和片段(3)，再将聚核苷酸激酶缓冲液(Polynucleotide Kinase Buffer)，聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)及三磷酸腺苷(ATP)分别加入该二支试管中，于37℃保温60分钟，使基因片段5’-端磷酸化。然后，将二支试管转移至95℃水浴中保温10分钟，停止加温，自然冷却退火降至室温。再将T4连接酶缓冲液和T4连接酶分别加入该二支试管中，16℃左右保温。过夜，使基因片段连接。

质粒：另取一支试管将含有乳糖启动子Lac(或温控启动子PX，色氨酸-乳糖混合启动子Tac)的质粒用限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶酶切后用酚/氯仿抽提，离心取水层部分，再用氯仿将水层洗涤3次，离心，将水层用异丙醇沉淀，离心，干燥。

将上述酶切质粒与连接后的基因片段混合，加T4连接酶缓冲液和T4连接酶，室温连接3-4小时。

受体菌的培养：克隆菌大肠杆菌(E.Coli)JM103于每升含蛋白胨10g、酵母抽提粉5g、氯化钠5g的培养液(LB培养液)中37℃振荡培养4小时，离心收集菌体，经CaCl₂溶液处理后，4℃保存备用。

转化：将克隆的质粒转化至受体菌大肠杆菌JM103细胞中，冰浴维持30分钟，升温至42℃，维持2分钟后，转移至含氨苄青霉素的琼脂糖平板，37℃过夜，进行集落筛选，得克隆阳性质粒。

C、发酵

将筛选的含该种衍生物质粒的寄主菌菌株于LB培养液中振荡培养，加0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，过夜后，离心收集菌体，以十二烷基磺酸钠＝12％的丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，鉴定表达的蛋白。

D、包涵体

按上述条件，300ml×10瓶，摇床培养，诱导，收集的菌体加裂解液(1％NaCl，磷酸缓冲液pH7.5，20mM)及溶菌酶，30℃保温30分钟，离心收集沉淀，加6M盐酸胍(Gu·HCl)抽提包涵体，离心，将上清液透析，除去Gu·HCl，再用组成为1％NaCl，0.1％吐温80(Tween 80)的磷酸缓冲液(20mM，pH7.5)洗涤沉淀三次，即得包涵体。

E、裂解

将包涵体溶于8M尿素溶液中，加盐酸至50mM，加溴化氰，避光，氮气保护条件下搅拌，裂解2小时，以HPLC跟踪分析。

F、纯化

裂解完成，通过琼脂糖凝胶分子筛G-25分离得粗品，再经HPLC纯化，得产品，与化学合成品相同，质谱分析结果表明所得衍生物分子量与理论值相吻合。

实施例3：药效实验

实验动物：非肥胖型糖尿病小鼠(NOD小鼠)，体重17g±2g，禁食2小时

对照组1：腹腔注射胰岛素2μg

对照组2：腹腔注射胰岛素4μg

实验组：腹腔注射含0.1μg实例一所得促胰岛素分泌肽衍生物

不同时间采集的血样，使用卫生部上海生物制品所出品的血糖测定试剂盒进行测定。实验结果如附图。此实验表明本发明所得促胰岛素分泌肽衍生物的降血糖作用十分明显。

Claims (4)

1.一种如下结构的多肽或其适于药用的盐：

                                    10              14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                      30                               39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X为选自Leu或Ile的氨基酸，Y为Lys，Z为Arg-OH。

2.根据权利要求1所述的多肽或其适于药用的盐，其特征在于：所述多肽的结构式中X为Leu，Y为Lys，Z为Arg-OH。

3.一种如下结构的多肽的制备方法：

                                     10             14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                      30                               39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X为选自Leu或Ile的氨基酸，Y为Lys，Z为Arg-OH；

该制备方法是基因工程制备法，其步骤包括：

a.按上述多肽的氨基酸序列合成基因片段；

b.基因片段经连接，质粒构建，受体菌的培养，转化，克隆得到菌株；

c.菌株经发酵，破壁，抽提得到包涵体；

d.包涵体裂解，分离得粗品，经高效液相层析仪HPLC纯化，最后冻干得产品。

4.一种如下结构的多肽或其适于药用的盐用作治疗II型糖尿病的药物：

                                    10              14                    20

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Y-

                                      30                               39 40

Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Z

其中：X为选自Leu或Ile的氨基酸，Y为Lys，Z为Arg-OH；该药物中含有上述多肽或其适于药用的盐，或其组合物。

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