CN1490333A - 促胰岛素分泌肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：NH2－HisAA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5 Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser－COOH，其中AA1：中性或疏水性氨基酸；AA2：侧链带有负电荷的酸性氨基酸；AA3：疏水性氨基酸；AA4：侧链带正电荷的碱性氨基酸；AA5：侧链带有苯环的氨基酸。本发明的促胰岛素分泌肽具有高于先有技术的伸展蛋白(EX－4)的促胰岛素分泌活性和稳定性，尤其是其稳定性远高于先有技术的胰高血糖类似肽(GLP－1)。本发明的促胰岛素分泌肽可以在提高药物有效性的同时，降低给药剂量并因此可降低毒副作用。因此可用于制备治疗糖尿病及肥胖症的药物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地说，涉及用于治疗糖尿病的促胰岛素分泌肽、其制备方法、包含该促胰岛素分泌肽的组合物及其用途。
背景技术
胰高血糖素类似肽(Glucogan Like Peptide 1，简称GLP-1，其氨基酸序列为：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG)是体内分泌的、具有在血糖浓度较高情况下促进胰岛素分泌的生物活性多肽。根据这一特点，GLP-1受到广泛重视，期望能开发成治疗糖尿病的新一代药物。但是大量的研究结果表明，GLP-1无法作为药物在临床使用，原因是GLP-1非常不稳定，在人体内会迅速降解，因此无法发挥其功能。研究表明，GLP-1的极端不稳定性来自两方面：1)其N-端的His-Ala很容易被体内的二肽酶特异性降解(Deacon等人，Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism，
临床内分泌学和代谢杂志，1995.80：p.952-57.)。2)其C-端的结构较松散，因此多肽分子很不稳定(Neidigh等人，Biochemistry，
生 物化学，2001.40(44)：p.13188-200.)。
通过比较GLP-1与其他多肽的序列，人们发现北美大毒蜥唾液中分泌的伸展蛋白4(Exendin-4，简称EX4，其氨基酸序列为：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)与GLP-1有一定的同源性。进一步的研究表明，伸展蛋白4具有与GLP-1同样的促胰岛素分泌的功能，但是其稳定性却明显高于GLP-1。基于这些优点，各国科学家对伸展蛋白4进行了广泛的研究，目前伸展蛋白4在美国正进行第三期临床试验，主要用于治疗II型(非胰岛素依赖型)糖尿病。
迄今为止的临床研究结果表明，伸展蛋白4具有明显的降血糖作用，对II型糖尿病有很好的疗效。同现有的治疗糖尿病的磺脲类、双胍类、胰岛素等药物相比，伸展蛋白4具有许多明显的优势。目前临床常用的磺脲类、双胍类药物主要是刺激胰岛细胞分泌胰岛素，但是不能改善胰岛细胞的功能。随着病情的发展，胰岛细胞产生胰岛素的功能逐渐丧失，这些药物会完全失效，病人需要改用注射胰岛素治疗，每年有10％的病人会转用胰岛素，病人需要每天注射胰岛素并不断增加剂量才有可能维持病情的稳定。当胰岛素使用到一定程度时，病人体内的胰岛素受体也会逐渐失去活性，导致胰岛素治疗的无效。伸展蛋白4不仅能促进胰岛细胞产生、分泌胰岛素，还能刺激胰岛细胞的分化、增殖，改善胰岛细胞的功能，从而从根本上达到治疗糖尿病的目的(Movassat等人，Journal of ClinicalEndocrinology&Metabolism，
临床内分泌学和代谢杂志，2002.87(10)：p.4775-81.)。除了作用于胰岛细胞，伸展蛋白4还能直接作用于肝脏和肌肉细胞，通过不依赖胰岛素的途径抑制糖元的降解和促进糖元的合成，达到降血糖的作用(Alcantara等人，Archives of Biochemistry&Biophysics，
生 物化学和生物物理档案，1997.341(1)：p.1-7.)。另外，外源注射的胰岛素在任何血糖浓度下均有降血糖的作用，因而在剂量不当的情况下会导致血糖过低，引起病人休克、昏迷等现象。但是伸展蛋白4只有在高血糖浓度时才具有降血糖的作用，而在正常血糖浓度下则不发挥作用，因而不会有胰岛素的副作用(Vella等人，Diabetologia，
糖尿病学杂志，2002.45(10)：p.1410-5.)。伸展蛋白4还能够通过抑制胃排空而抑制糖尿病病人的食欲，从而有助于治疗糖尿病(Edwards等人，American Journal of PhysiologicalEndocrinology&Metabolism，
美国生理内分泌学和代谢杂志，2001.281(1)：p.E155-61.)。伸展蛋白4这方面的优点也是其他糖尿病药物所不具备的。
但是，伸展蛋白4也有其缺点，主要是副作用较强，会导致恶心、呕吐、甚至休克等副作用。由于副作用较强，目前伸展蛋白4的临床剂量范围非常窄，剂量也很小，需要每天注射两次，很不方便。虽然导致伸展蛋白4副作用的原因目前还不十分明确，但是可以推测，这可能是由于伸展蛋白4是北美大毒蜥唾液中分泌的多肽，是人体的外源物质的缘故。
因此，人们迫切希望开发一种活性更高、稳定性更好而且副作用较低的用于治疗糖尿病的药物。
发明内容
本发明的目的在于开发一类具有高活性、高稳定性、低副作用的促胰岛素分泌肽，使之成为新一代治疗糖尿病的药物。
本发明人考虑到GLP-1具有较好生物活性和伸展蛋白4具有较好生物稳定性的特点，设计出一类促胰岛素分泌肽(Super-insulinotropic Peptide，简称SIP)，该类促胰岛素分泌肽中最具代表性的优选例子有下列4种：
SIP-1：HXEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SIP-2：HGEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SIP-3：HSQGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
SIP-4：Ac-HXEGTFTSDVSKYMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
本发明人对此进行了大量的实验研究，结果表明，该类促胰岛素分泌肽具有远高于GLP-1的稳定性和明显优于EX-4的生物活性，据此可以判断，本发明的促胰岛素分泌肽能够达到上述本发明的目的。由于这一研究成果，从而完成了本发明。
也就是说，本发明的技术方案如下：
一种促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：NH2-His AA1AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5 Met Glu Glu Glu AlaVal Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly AlaPro Pro Pro Ser-COOH，其中各符号的定义如下：His：组氨酸，Ala：丙氨酸，Glu：谷氨酸，Gly：甘氨酸，Thr：苏氨酸，Phe：苯丙氨酸，Ser：丝氨酸，Asp：天门冬氨酸，Val：缬氨酸，Tyr：酪氨酸，Leu：亮氨酸，Gln：谷氨酰胺，Lys：赖氨酸，Ile：异亮氨酸，Trp：色氨酸，Met：甲硫氨酸，Arg：精氨酸，Asn：天门冬酰胺，Pro：脯氨酸；AA1为中性或疏水性氨基酸，优选为选自D-丙氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸中的任一种，更优选是D-丙氨酸或甘氨酸，最优选是D-丙氨酸；AA2为侧链带有负电荷的酸性氨基酸，优选为选自谷氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸中的任一种，更优选是谷氨酸或谷氨酰胺，最优选是谷氨酸；AA3优选是选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的任一种，更优选是缬氨酸；AA4优选是赖氨酸或精氨酸，更优选是赖氨酸；AA5优选是酪氨酸或苯丙氨酸，更优选是酪氨酸。
上述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有选自氨基、疏水基团和大分子载体基团中的任一种基团作为保护基，其中优选是氨基。
上述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有选自乙酰基、疏水基团和大分子载体基团中的任一种基团作为保护基，其中优选是乙酰基。
上述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，上述的疏水基团为选自苄氧羰基、丹酰基、叔丁氧羰基中的任一种基团；上述的大分子载体基团为选自脂质-脂肪酸轭合物、聚乙二醇和碳水化合物中的任一种基团。
上述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为下述氨基酸序列的任何一种：
SIP-1：NH2-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2
SIP-2：NH2-His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2
SIP-3：NH2-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met
Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly
Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2
SIP-4：Ac-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2
一种药物组合物，其特征在于，它含有上述任一项所述的促胰岛素分泌肽和可药用的常规辅料。
一种药物制剂，其特征在于，它含有上述任一项所述的促胰岛素分泌肽或上述的药物组合物，其剂型为粉针剂、注射剂、喷雾剂和口服剂中的任一种。
本发明还提供了上述的促胰岛素分泌肽或药物组合物用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物制剂的用途。
另外，本发明还提供了促胰岛素分泌肽的制备方法，其特征在于，该方法为固相多肽化学合成法。
下面对本发明技术方案中的一些问题进行解释。
在上述技术方案中给出的氨基酸序列左端的NH2-为氨基酸(本发明中为组氨酸His)所固有的氨基，而氨基酸序列右端的-COOH为氨基酸(本发明中为丝氨酸Ser)所固有的羧基。上述左端的氨基和右端的羧基由于是氨基酸所固有的，因此也可以不写出，在此情况下也表示在该氨基酸序列的左端为氨基，右端为羧基，二者的次序不能颠倒。
另外，在上述氨基酸序列SIP-1～SIP-4的右端写明的酰氨基-CONH2是该氨基酸序列的羧基端的保护基，而上述技术方案中所说的羧基端具有氨基作为保护基是指在引入氨基后，通过氨基与羧基的反应生成的酰氨基-CONH2对该氨基酸序列的右端(即羧基端)起到保护作用。上述氨基酸序列SIP-1～SIP-4皆为这种情况。另外，上述技术方案中所说的氨基端具有乙酰基作为保护基是指在引入乙酰基后，通过乙酰基与氨基的反应生成的乙酰氨基(表示为Ac-)对该氨基酸序列的左端(即氨基端)起到保护作用。上述氨基酸序列SIP-4属于这种情况。
下面对本发明进行详细的描述。
促胰岛素分泌肽是GLP-1和伸展蛋白4的杂合体，其氨基端部分与GLP-1氨基端部分相同或相似；其羧基端部分与伸展蛋白4的羧基端部分相同或相似。因为GLP-1的N-端(氨基端)是其结合受体而发挥其生物学功能的重要部分，因此需要保留这段序列；但是为了避免二肽酶的降解，需要将第二位的L-丙氨酸(L-Ala)进行改变。为了尽可能地保持促胰岛素分泌肽的活性，改变后的氨基酸与L-丙氨酸相似，这些氨基酸包括D-丙氨酸(D-Ala)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)等侧链较短且不带电荷的氨基酸。
GLP-1第3位的氨基酸残基是谷氨酸(Glu)，是二肽酶识别位点的一部分，因此将此氨基酸残基改变成与谷氨酸相似的氨基酸，如谷氨酰胺(Gln)或天门冬氨酸(Asp)，这样会增强促胰岛素分泌肽的稳定性，而不影响其活性。
GLP-1第10位的氨基酸是缬氨酸，伸展蛋白4第10位的氨基酸是亮氨酸，都是侧链较大的疏水性氨基酸，对促胰岛素分泌肽的生物活性有重要影响，因此我们将该位点的氨基酸残基设计为缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)或异亮氨酸(Ile)等侧链较大的疏水性氨基酸。
伸展蛋白4结构分析结果表明，其第12位的赖氨酸参与形成离子键，有助于其稳定性，因此该位的氨基酸设计为侧链带正电荷的碱性氨基酸，如赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)。
伸展蛋白4和GLP-1在第13位的氨基酸残基有很大的不同，为了保持GLP-1的高活性，促胰岛素分泌肽的第13位氨基酸选用GLP-1中的氨基酸，即酪氨酸(Tyr)，或相似的带有苯环的氨基酸，如苯丙氨酸(Phe)。
结构分析结果表明，GLP-1的C-端(羧基端)结构非常松散，但是伸展蛋白4的C-端(羧基端)结构却非常紧密，能够大大增强多肽的稳定性，因此本发明中促胰岛素分泌肽的C-端(包括第14位至第39位氨基酸)选用伸展蛋白4的C-端序列。
根据多肽的特点，为了增加其稳定性，本发明人将某些促胰岛素分泌肽的氨基端用氨基保护基团保护，例如由引入的乙酰基与原有的氨基反应而生成的乙酰氨基；将某些促胰岛素分泌肽的羧基端用羧基保护基团保护，例如由引入的氨基与原有的羧基反应而生成的酰胺基。
本发明提供了促胰岛素分泌肽的制备方法，该方法为固相多肽化学合成。
根据促胰岛素分泌肽的氨基酸组成特点，本发明人选择Fmoc固相多肽合成的方法进行多肽的人工合成，然后利用高效液相色谱法(HPLC)对粗产品进行纯化。
固相多肽合成的基本原理可归纳如下：按照目标多肽的氨基酸序列，从羧基端开始，将氨基端和侧链均被保护的氨基酸依次连接在不溶性的高分子树脂上，从而形成相应的多肽分子。每连接一个氨基酸称为一个周期，每个周期简单的说包括三个组成部分：第一、去掉前一个氨基酸氨基端的保护基；第二、通过形成新的共价酰胺键(肽键)，将下一个氨基端带保护基的氨基酸的羧基端与前一个氨基酸的氨基端偶联；第三、前两部分之间的过滤清洗过程。在肽链的延伸完成后，将多肽从树脂上洗脱下来从而得到粗产品。
固相合成法将逐步延伸的肽链连接在不溶性的高分子树脂上，通过使用简单的过滤清洗的方法，将过量的试剂及反应中产生的副产物清除，从而简化了中间产物的分离纯化步骤，降低了中间过程中产品的损失，具有液相合成法无可比拟的优越性。而且过滤清洗的方法操作简单，整个合成过程完全程序化、自动化，大大提高了生产效率。促胰岛素分泌肽的氨基酸序列很长，在39个左右，远远超出了常规液相合成法的适应范围，因此，固相合成法是唯一的选择。
本发明提供了促胰岛素分泌肽的生物活性检测方法。
用GLP-1或伸展蛋白4刺激大鼠胰岛瘤细胞RIN会特异性激活细胞内胰岛素基因的启动子，产生胰岛素分泌到细胞培养液中，通过检测培养液中胰岛素的含量可以测量这些多肽的生物活性。但是，胰岛素含量的测定需要特殊的检测试剂盒，价格昂贵，操作复杂。为了建立一种操作简便、可靠、灵敏度高的检测方法，本发明人将报告基因荧光素酶克隆到大鼠胰岛素基因启动子下游，当用促胰岛素分泌肽刺激细胞时，胰岛素基因启动子被激活，导致荧光素酶的表达。这样，通过测定细胞裂解液中荧光素酶的活性就可以测定促胰岛素分泌肽的生物活性。
本发明提供了促胰岛素分泌肽的稳定性检测方法。
为了研究促胰岛素分泌肽在人体内的稳定性，本发明人利用人血浆模拟体内的条件，将促胰岛素分泌肽加入到血浆中，37℃温浴后，取样加入到上述活性检测细胞培养液中，通过分析刺激细胞荧光素酶活性的增加检测所保留的生物活性。
本发明提供了一种促胰岛素分泌肽的药物组合物。
为了研究促胰岛素分泌肽作为药物的可行性，本发明人在含有促胰岛素分泌肽的溶液中添加甘露醇和人血白蛋白，用磷酸缓冲液调节酸碱度至中性，制成药物组合物，冷冻干燥后，发现可明显增加促胰岛素分泌肽的保存期限，而不影响促胰岛素分泌肽的生物活性。
与本领域的同类现有技术相比，本发明涉及的促胰岛素分泌肽具有如下有益效果：促胰岛素分泌肽具有高于伸展蛋白4的促胰岛素分泌活性，具有远高于GLP-1的稳定性，促胰岛素分泌肽的稳定性也高于伸展蛋白4。因此，本发明的促胰岛素分泌肽能在提高药物有效性的同时，降低给药剂量，在治疗糖尿病和控制饮食方面既能提高疗效，又可降低毒副作用。
附图说明：
图1是促胰岛素分泌肽1、2、3、4与伸展蛋白4和GLP-1的序列比较图；
图2是促胰岛素分泌肽1高效液相纯度分析图；
图3是报告载体pGL3-RIP-Luc的构建图。
图4是促胰岛素分泌肽1、2、3、4与GLP-1和伸展蛋白4生物活性比较图。
图5是促胰岛素分泌肽1、2、3、4与GLP-1和伸展蛋白4稳定性比较图。
在图1中，SIP-1、2、3、4分别代表促胰岛素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。图中氨基酸代号如下：H：组氨酸(His)，A：丙氨酸(Ala)，E：谷氨酸(Glu)，G：甘氨酸(Gly)，T：苏氨酸(Thr)，F：苯丙氨酸(Phe)，S：丝氨酸(Ser)，D：天门冬氨酸(Asp)，V：缬氨酸(Val)，Y：酪氨酸(Tyr)，L：亮氨酸(Leu)，Q：谷氨酰胺(Gln)，K：赖氨酸(Lys)，I：异亮氨酸(Ile)，W：色氨酸(Trp)，X：D-丙氨酸(D-Ala)，M：甲硫氨酸(Met)，R：精氨酸(Arg)，N：天门冬酰胺(Asn)，P：脯氨酸(Pro)；Ac：乙酰基。
在图2中，促胰岛素分泌肽1纯化后，利用HPLC方法检测其纯度，检测方法见实施例1。
在图3中，大鼠胰岛素启动子(Rat Insulin Promoter，RIP)序列(-410至9)利用聚合酶链式反应(PCR)方法从大鼠基因组DNA中扩增出来，通过所用的寡聚核苷酸引物在两端引进BgIII的StuI酶切位点，经酶切后克隆到报告基因荧光素酶(Luciferase，Luc)上游。最终产物报告载体pGL3-RIP-Luc中的箭头代表转录起始。
在图4中，SIP-1、2、3、4分别代表促胰岛素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。报告细胞系RIN-RIP-Luc用10nM的促胰岛素分泌多肽刺激后，裂解细胞，测定细胞中荧光素酶的活性，分别用多肽刺激后细胞中荧光素酶活性除以未经多肽刺激的细胞中荧光素酶活性，计算出多肽所刺激的荧光素酶活性增加倍数，此值越大，表明多肽的活性越高。图中结果为三次试验结果的平均值。
在图5中，SIP-1、2、3、4分别代表促胰岛素分泌肽1、2、3、4，EX-4代表伸展蛋白4。多肽在人血浆中温浴2小时后，加入到报告细胞RIN-RIP-Luc培养液中，测定生物活性，分别用多肽刺激后细胞中荧光素酶活性除以未经多肽刺激的细胞中荧光素酶活性，计算出多肽所刺激的荧光素酶活性增加倍数。图中结果为三次试验结果的平均值。
下面通过本发明的几个优选实施例，对本发明做更详细的描述。
实施例1：
一、促胰岛素分泌肽1(SIP-1)的氨基酸序列：
SIP-1：NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中：AA1为D-Ala，AA2为Glu，AA3为Val，AA4为Lys，AA5
为Tyr。
二、利用固相多肽化学合成方法制备促胰岛素分泌肽1：
具体操作步骤如下：
1.选择Rink Amide树脂，准确称取1.0克树脂，置于与ACT90固相合成仪配套的反应器中，按每克树脂10毫升溶液的比例，用二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺分别清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。
2.根据树脂的取代常数(即每克树脂能连接的多肽分子的摩尔数)0.8mmol/g，按1∶3∶3∶7的比例，称取Fmoc保护的羧基端第一个氨基酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)、交联试剂HBTU和二异丙基乙基胺，溶于10ml二甲基甲酰胺中，加入固相合成仪的反应器中，室温振荡，反应2小时。抽滤除去反应液后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各清洗树脂两次，并抽滤除去溶剂。
3.加入10ml 20％六氢吡啶/二甲基甲酰胺，室温振荡，反应30分钟，去掉氨基端Fmoc保护基。抽滤除去溶剂后，再分别用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷各清洗树脂两次，抽滤除去溶剂。
4.重复第2、3步，除第3步中加入的Fmoc保护氨基酸根据肽链从羧基端到氨基端的序列而改变以外，其它条件不变，步骤相同。如此循环，直至完成在树脂上肽链的延伸。清洗完全的树脂真空干燥过夜。
5.将树脂转移到250ml圆底烧瓶中，按每克带肽链的树脂加20ml切割液(95％三氟乙酸/5％水)的比例加入切割液，室温搅拌1-3小时。抽滤将树脂与滤液分离，向滤液中加入2000ml、0℃的乙醚，离心将沉淀与乙醚分离，干燥后得促胰岛素分泌肽粗品。
促胰岛素分泌肽粗品的HPLC纯化方法：
干燥后的促胰岛素分泌肽粗品溶于1％乙酸，目标浓度为20mg/ml.用反相高效液相色谱系统，经梯度洗脱分离后，收集主峰流份，经合并再冷冻抽干后得促胰岛素分泌肽纯品。色谱条件如下：
色谱仪：Varian液相色谱仪ProStarSD-10及其操作分析软件；
色谱柱：Dynamax Analytical C18色谱柱(4.6×250毫米)；
流动相：A：0.1％三氟乙酸/10％乙腈/水；B：0.1％三氟乙酸/90％乙腈/水；
洗脱梯度：30-50％B流动相，30分钟；
流速：1.0毫升/分钟；
紫外检测波长：220纳米。
粗产物经HPLC纯化后纯度大于95％(分析结果见附图2)。
为了确证所合成、纯化产物的正确性，对纯化后的促胰岛素分泌肽1进行了质谱分析，结果如下：
分子式：C188H283N49O60S1；理论分子量：4221.71；测定值：4222.0
上述结果证明了所合成的促胰岛素分泌肽1是正确的多肽分子。
三、促胰岛素分泌肽1的生物活性分析：
首先将报告基因荧光素酶克隆到大鼠胰岛素基因启动子下游，构建报告载体pGL3-RIP-Luc(质粒的构建见附图3)，做法如下：大鼠胰岛素启动子(Rat Insulin Promoter，RIP)序列(核苷酸-410至9位)利用聚合酶链式反应(PCR)方法从大鼠基因组DNA中扩增出来，通过所用的寡聚核苷酸引物在两端引进BglII的StuI酶切位点，经酶切后克隆到质粒pGL3-Luc(购自美国Promega公司)中报告基因荧光素酶(Luciferase，Luc)的上游，产生pGL3-RIP-Luc。
将对照质粒pGL3-Luc或报告载体质粒pGL3-RIP-Luc与表达Puro筛选标记的质粒pBabe-puro以10∶1的比例用磷酸钙沉淀法共转染到RIN细胞中，然后用5微克/毫升的Puromycin筛选被转染的细胞，建立含有pGL3-RIP-Luc报告载体的细胞系RIN-RIP-Luc，及含有对照空载体pGL3-Luc的对照细胞系RIN-Luc。
为了分析比较GLP-1、伸展蛋白4(EX-4)、促胰岛素分泌肽1(SIP-1)的生物活性，RIN-Luc和RIN-RIP-Luc细胞首先在无血清培养基中培养24小时，然后分别加入上述多肽，使终浓度为10nM，2小时后，将含多肽的无血清培养基换成正常培养基，再经24小时后裂解细胞，利用荧光照度计(购自美国Turner Designs公司)测定裂解液中荧光素酶的含量，用多肽刺激后细胞中荧光素酶活性除以未经多肽刺激的细胞中荧光素酶活性，计算出多肽所刺激的荧光素酶活性增加倍数，即为多肽的生物活性，增加倍数越高，表明多肽的生物活性越高，结果见附图4。
结果表明，RIN-Luc对照细胞中有一定量的荧光素酶表达，但是对上述多肽刺激没有反应，而RIN-RIP-Luc细胞经多肽刺激后荧光素酶的活性有所增加，表明多肽刺激荧光素酶活性增加是通过RIP启动子实现的。图中结果还表明，SIP-1具有高于EX-4和GLP-1的生物活性。
四、促胰岛素分泌肽1的稳定性分析：
为了研究促胰岛素分泌肽在人体内的稳定性，本发明实例中利用人血浆模拟体内的条件。将2微克的各种促胰岛素分泌肽分别加入到1毫升的血浆中，37℃温浴2小时后，取50微升加入到1毫升RIN-RIP-Luc细胞培养液中(相当于多肽未降解浓度25nM)，通过分析刺激细胞荧光素酶活性的增加检测所保留的生物活性，以未经处理的多肽的活性作为对照，计算出活性保留百分率，试验结果见附图5。
图中结果表明，GLP-1具有非常低的稳定性，经与人血浆37℃温浴2小时后活性几乎完全丧失；EX-4和促胰岛素分泌肽1(SIP-1)的活性保留率则分别为77％和78％，表明促胰岛素分泌肽1的稳定性远高于GLP-1，与伸展蛋白4相似。
五、促胰岛素分泌肽1药物组合物：
为了研究促胰岛素分泌肽1作为药物的可行性，根据多肽类药物的常用药物组合物制备方法，本发明人在含有10微克/毫升促胰岛素分泌肽1的溶液中添加5毫克/毫升甘露醇和1毫克/毫升人血白蛋白，用磷酸缓冲液调节酸碱度至pH6-8，制成药物组合物，冷冻干燥后，样品更容易鉴别，外观也更美观，而且可使促胰岛素分泌肽的保存期限达到1年以上，而不影响生物活性。
实施例2：
一、促胰岛素分泌肽2(SIP-2)的氨基酸序列：
SIP-2：NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中：AA1为Gly，AA2为Glu，AA3为Val，AA4为Lys，AA5
为Tyr。
二、利用固相多肽化学合成方法制备促胰岛素分泌肽2：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同。
为了确证所合成、纯化产物的正确性，对纯化后的促胰岛素分泌肽2进行了质谱分析，结果如下：
分子式：C187H281N49O60S1；理论分子量：4207.68；测定值：4207.4
上述结果证明了所合成的促胰岛素分泌肽2是正确的多肽分子。
三、促胰岛素分泌肽2(SIP-2)的生物活性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图4。
图中结果表明，SIP-2具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰岛素分泌肽2(SIP-2)的稳定性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图5。
结果表明，SIP-2的稳定性远高于GLP-1，与伸展蛋白4相近。
实施例3：
一、促胰岛素分泌肽3(SIP-3)的氨基酸序列：
SIP-3：NH2-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中：AA1为Ser，AA2为Gln，AA3为Val，AA4为Lys，AA5为
Tyr。
二、利用固相多肽化学合成方法制备促胰岛素分泌肽3：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同。
为了确证所合成、纯化产物的正确性，对纯化后的促胰岛素分泌肽3进行了质谱分析，结果如下：
分子式：C188H284N50O60S1；理论分子量：4236.72；测定值：4236.3
上述结果证明了所合成的促胰岛素分泌肽3是正确的多肽分子。
三、促胰岛素分泌肽3(SIP-3)的生物活性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图4。
结果表明，SIP-3具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰岛素分泌肽3(SIP-3)的稳定性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图5。
结果表明，SIP-3的稳定性远高于GLP-1，与伸展蛋白4相近。
实施例4：
一、促胰岛素分泌肽4(SIP-4)的氨基酸序列：
SIP-4：Ac-His AA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5
Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn
Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
其中：AA1为D-Ala，AA2为Glu，AA3为Val，AA4为Lys，AA5
为Tyr。
二、利用固相多肽化学合成方法制备促胰岛素分泌肽4：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法基本相同，只是在肽链合成完成后，用乙酸酐将其氨基端乙酰化。
为了确证所合成、纯化产物的正确性，对纯化后的促胰岛素分泌肽4进行了质谱分析，结果如下：
分子式：C190H285N49O61S1；理论分子量：4263.75；测定值：4263.9
上述结果证明了所合成的促胰岛素分泌肽4是正确的多肽分子。
三、促胰岛素分泌肽4(SIP-4)的生物活性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图4。
结果表明，SIP-4具有高于伸展蛋白4和GLP-1的生物活性。
四、促胰岛素分泌肽4(SIP-4)的稳定性分析：
具体操作步骤与发明实例1中相应方法相同，结果见附图5。
结果表明，SIP-4的稳定性远高于GLP-1，也明显高于伸展蛋白4。
综上所述，本发明的促胰岛素分泌肽SIP-1～4具有高于EX-4的促胰岛素分泌活性和稳定性，尤其是其稳定性远高于GLP-1。因此，本发明的促胰岛素分泌肽可以在提高药物有效性的同时，降低给药剂量并因此可降低毒副作用。从而可以推断，本发明的促胰岛素分泌肽可用于制备治疗糖尿病及肥胖症的药物制剂。
序列表<110>北京中科亚光生物科技有限公司<120>促胰岛素分泌肽及其用途<130>PF030030CNI，Deng Dingji，Zhongzi Law Office<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>胰高血糖素类似肽(Glucogan Like Peptide 1，简称GLP-1)<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
20 25<210>2<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>伸展蛋白4(Exendin-4，简称EX4)<400>2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35<210>3<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SIP-1<220><221>MISC FEATURE<222>(2)..(2)<223>D-Ala<400>3His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35<210>4<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-2<400>4His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35<210>5<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-3<400>5His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35<210>6<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>SPI-4<220><221>MISC FEATURE<222>(2)..(2)<223>D-Ala<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化<400>6His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35
Claims (16)
1.一种促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为：NH2-HisAA1 AA2 Gly Thr Phe Thr Ser Asp AA3 Ser AA4 AA5 Met Glu GluGlu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro SerSer Gly Ala Pro Pro Pro Ser-COOH，其中AA1：中性或疏水性氨基酸；AA2：侧链带有负电荷的酸性氨基酸；AA3：疏水性氨基酸；AA4：侧链带正电荷的碱性氨基酸；AA5：侧链带有苯环的氨基酸。
2.如权利要求1所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，上述的AA1是选自D-丙氨酸、丝氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸中的任一种，上述的AA2是选自谷氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸中的任一种；上述的AA3是选自缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中的任一种；上述的AA4是赖氨酸或精氨酸；上述的AA5是酪氨酸或苯丙氨酸。
3.如权利要求2所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于：上述的AA1是D-丙氨酸或甘氨酸；上述的AA2是谷氨酸或谷氨酰胺；上述的AA3是缬氨酸；上述的AA4是赖氨酸；上述的AA5是酪氨酸。
4.如权利要求3所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，上述的AA1是D-丙氨酸；上述的AA2是谷氨酸。
5.如权利要求1所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有选自氨基、疏水基团和大分子载体基团中的任一种基团作为保护基。
6.如权利要求5所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其羧基端具有氨基作为保护基。
7.如权利要求1所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有选自乙酰基、疏水基团和大分子载体基团中的任一种基团作为保护基。
8.如权利要求7所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基端具有乙酰基作为保护基。
9.如权利要求5或7所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，上述的疏水基团为选自苄氧羰基、丹酰基、叔丁氧羰基中的任一种基团；上述的大分子载体基团为选自脂质-脂肪酸轭合物、聚乙二醇和碳水化合物中的任一种基团。
10.如权利要求1～6中的任一项所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为NH2-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
11.如权利要求1～6中的任一项的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为NH2-His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val SerLys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu LysAsn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
12.如权利要求1-6中的任一项所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为NH2-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValSer Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp LeuLys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
13.如权利要求1-6中的任一项所述的促胰岛素分泌肽，其特征在于，其氨基酸序列为Ac-His D-Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser AspVal Ser Lys Tyr Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu TrpLeu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-CONH2。
14.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1～13中任一项所述的促胰岛素分泌肽和可药用的常规辅料。
15.一种药物制剂，其特征在于，它含有权利要求1～13中任一项所述的促胰岛素分泌肽或权利要求14所述的药物组合物，其剂型为粉针剂、注射剂、喷雾剂和口服剂中的任一种。
16.权利要求1～13中任一项所述的促胰岛素分泌肽或权利要求14所述的药物组合物用于制备治疗糖尿病或肥胖症的药物制剂的用途。
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: ZHONGKE YAGUANG BIOTECH CO., LTD., BEIJING Free format text: FORMER OWNER: TIANJIN ZHONGHENG YAGUANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20100903 |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 300000 ROOM 401, 4/F, BUILDING B5, TIANDA SCIENCE + TECHNOLOGY PARK, TIANJIN DEVELOPMENT AREA TO: 100193 2/F, BUILDING 5, ATOMIC ENERGY RESEARCH INSTITUTE, NO.2, YUANMINGYUAN WEST ROAD, HAIDIAN DISTRICT, BEIJING |
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Effective date of registration: 20100903 Address after: 100193, No. 2, West Old Summer Palace Road, Beijing, Haidian District, building 5, two Patentee after: Beijing Zhongke Yaguang Bio-Technology Co.,Ltd. Address before: 300000, Tianjin Development Zone, great science and Technology Park, B5 building, Room 401, room four Patentee before: Tianjin constant light Ya biological science and Technology Co.,Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING YAMEI POLYPEPTIDE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: ZHONGKE YAGUANG BIOTECH CO., LTD., BEIJING Effective date: 20121107 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100193 HAIDIAN, BEIJING TO: 100070 FENGTAI, BEIJING |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20121107 Address after: The 100070 Beijing Seahawks Fengtai District Science City Road No. 7 4 layer 4-1 (Park) Patentee after: Beijing Asia polypeptide Biological Technology Co.,Ltd. Address before: 100193, No. 2, West Old Summer Palace Road, Beijing, Haidian District, building 5, two Patentee before: Beijing Zhongke Yaguang Bio-Technology Co.,Ltd. |
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| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20050928 |
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| CX01 | Expiry of patent term | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Xiao Lingyun Document name: Notice of Termination of Patent Rights |