CN101041818A - 重组生产胰高血糖素样肽－2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组制备胰高血糖素样肽－2(GLP－2)的方法。通过本发明方法可以方便、低成本的大量制备具有稳定生物活性的GLP－2肽。本发明还提供所制备GLP－2肽用于制备促进肠粘膜生长的药物的用途。

Description

重组生产胰高血糖素样肽-2的方法

                         技术领域

本发明一般地涉及基因工程领域，具体的说，本发明涉及重组生产胰高血糖素样肽-2(glucagon like peptide-2，GLP-2)的方法。

                         背景技术

1.胰高血糖素样肽-2(glucagon like peptide-2，GLP-2)生物学特性

GLP-2是胰高血糖素原基因(proglucagon gene，PG)表达的产物之一，属于胰高血糖素原衍生肽类(proglucagon-derived peptide，PGDP)，PG有6个外显子，其中包含一个cAMP反应元件和一个胰高血糖素上游增强子，PG编码的基因产物特点是主要表达于胰腺与胃肠道，生成不同的肽类，如氨基酸序列为1～69位的胰高血糖素、78～107位的GLP-1、1～30位的肠高血糖素相关胰多肽(GRPP)以及126～158位的GLP-2，具有多种生物学效应。其中GLP-2由肠道L细胞合成分泌，分子量为3.9KD，由33个氨基酸残基组成的单链多肽，无空间构像，这为其临床应用提供了良好的基础。目前，GLP-2已在52种脊椎类动物中发现，具有高度保守性，小鼠与大鼠GLP-2的区别仅在第11位氨基酸参基不同，大鼠与人的GLP-2区别也仅是在19位氨基酸上，大鼠为苏氨酸，而人为丙氨酸。GLP-2在肠粘膜组织及循环血液中主要以完整的GLP-2(1～33)形式存在，以旁分泌的形式作用于肠粘膜细胞，在体内被二酰肽肽酶-IV(dipeptidylpeptidase IV，DPP IV)水解氨基末端的前两个氨基酸后形成无生物学活性的GLP-2(3～33)并由肾脏排出。

2.GLP-2促进肠粘膜生长的研究

虽然GLP-2的发现可追溯到20世纪80年代，但对其生物学特性及其促进肠粘膜损伤修复的研究则始于近10年。1996年，Drucker D.J.等首先报道了GLP-2具有促进肠粘膜增殖与生长的功能，进一步的研究发现，在胰高血糖素原衍生肽中，只有GLP-2具有增加小肠重量、肠壁厚度、绒毛高度、促进肠粘膜细胞增殖而不影响其他组织器官的细胞增殖及组织形态学变化的作用。此研究结果引起人们的极大关注，也揭开了研究GLP-2作用的序幕，Brubaker等的研究也表明，GLP-2能促进小鼠肠粘膜RNA及蛋白质的合成，升高粘膜麦芽糖酶、乳糖酶、蔗糖酶、γ-谷氨酰转肽酶等标志粘膜细胞分化成熟酶的活性，进一步证实了GLP-2不仅促进肠粘膜细胞增殖，而且还能促进其分化。Toft等的研究也表明，GLP-2能刺激培养的大鼠肠上皮细胞分化。除此之外，GLP-2还能诱导钠依赖性葡萄糖转运体的转运活性，增强肠上皮细胞对葡萄糖的转运。在动物实验中证实GLP-2对肠粘膜的作用基本无性别及年龄的差异，而且给药途径无论是静脉、腹腔还是皮下均有明显效果。

GLP-2除了具有上述促进正常肠部膜生长的作用外，还能加速肠粘膜损伤后的再生修复。Chance等报道，在全胃肠外营养(TPN)营养液中加入GLP-2能使长期接受TPN大鼠的肠粘膜湿重、DNA、蛋白质含量。粘膜厚度、绒毛高度维持正常，防止肠粘膜萎缩，从而维护静脉营养时肠粘膜结构的完整性。Scott等的资料表明，GLP-2能促进小肠大部切除后残留肠段粘膜的适应性增生反应，表现在肠管直径、粘膜湿重、隐窝深度、绒毛高度、肠粘膜蔗糖酶活性、DNA及蛋白质含量均显著增加。采用硫酸葡聚糖及非甾体抗炎药物(NSAID)如消炎痛等诱导的实验性肠炎模型所进行的研究表明，GLP-2能显著提高动物存活率，明显降低菌血症发生率及肝、脾组织细菌培养阳性率，明显减轻肠道炎症反应如肠粘膜溃疡数量减少、髓过氧化物酶活性降低、炎性细胞因子产生减少，促进肠粘膜细胞增殖，抑制肠粘膜细胞凋亡，使肠粘膜完整性程度明显提高。用GLP-2治疗NSAID诱导的肠炎后，肠粘膜通透性较对照组明显提前恢复正常，肠道炎症反应减轻，肠道损伤的愈合速度明显加快，肠炎病程缩短30％。Prasad等用GLP-2治疗因肠系膜上动脉缺血再灌注所致的肠系膜损伤，结果是动物死亡率降低50％，同时肠系膜DNA和蛋白质含量则分别增加41％和60％。此外，最近的研究资料证实，GLP-2对大剂量化疗药物如5-氟尿嘧啶所引起的肠粘膜损伤的修复也具有显著的治疗作用。

3.GLP-2研究现状

GLP-2作为肠道保护性药物的研究与开发具有广阔的前景，主要有以下原因：

1.肠道相关疾病日益受到关注，具有广阔的市场前景；2，目前已有的文献报道均肯定其对肠道的特异性保护作用；3，GLP-2对肠道的保护作用明显；4，GLP-2无二硫键，空间结构简单，易于改造。目前，用于研究的GLP-2肽均为多肽合成，需要一定的设备与技术，价格昂贵。多肽合成GLP-2已被加拿大Allielix药厂(为美国NPS药业公司子公司)申报专利，并且已进入临床研究阶段。但多肽合成药物成本较高，且＞30个氨基酸的多肽合成从技术角度也有一定难度。因此，需要一种能更简单且低成本的制备具有稳定生物活性的GLP-2肽的方法。

                    发明内容

针对前面提到的问题，根据本发明，提供重组制备GLP-2肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段；

b)将所述片段可操作的连接入表达载体；

c)将所述载体导入宿主细胞；

d)筛选可表达含GLP-2肽序列的多肽的转化体宿主细胞；

e)培养所筛选的转化体；和

f)分离并纯化所表达的串联重复的GLP-2肽，水解串联重复的GLP-2肽，从而得到单体形式的GLP-2肽。

根据本发明的一个实施方案，还提供重组制备GLP-2肽的方法，其中包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段中包含1-100个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，优选包含1-50个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，进一步优选包含1-40个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，更优选包含1-30个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，更进一步优选包含1-20个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，还优选包含1-10个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，再进一步优选包含1-5个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，最优选包含3个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列，还可以包含2个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列或1个编码GLP-2的核苷酸序列。

根据本发明方法的一个方面，所述编码GLP-2的核苷酸序列可以来源于脊椎动物，优选来源于哺乳动物，更优选来源于啮齿目动物或灵长目动物，更优选来源于大鼠、小鼠、兔、或人，最优选来源于人。

根据本发明方法的一个方面，所述编码GLP-2的核苷酸序列编码如下肽：

(1)SEQ ID NO：1对应的序列；

(2)SEQ ID NO：2对应的序列；或

(3)与SEQ ID NO：1高度同源的、经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生的、并且与SEQ ID NO：1所编码肽具有相同的促进肠粘膜生长功能的肽的序列。

根据本发明方法的一个方面，所述GLP-2的表达载体包括但不限于来源于病毒的载体或质粒载体，所述载体可以是整合型载体或附加体型载体，所述来源于病毒的载体包括但不限于来源于DNA病毒的载体、来源于RNA病毒的载体、来源于逆转录病毒的载体、来源于慢病毒的载体、来源于腺病毒的载体、来源于腺伴随病毒的载体、来源于痘病毒的载体、来源于HBV病毒的载体、或来源于HIV病毒的载体，所述质粒载体包括但不限于pET系列质粒载体，所述pET系列质粒载体包括但不限于pET31质粒载体，所述pET31质粒载体包括但不限于pET31b(+)质粒载体。

根据本发明方法的一个方面，所述用于导入GLP-2表达载体的宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物，优选可以来源于细菌、真菌、酵母、昆虫或哺乳动物，所述细菌优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，所述酵母优选面包酵母、酿酒酵母或甲醇酵母，所述昆虫优选蚕，所述哺乳动物优选啮齿目动物或灵长目动物，所述啮齿目动物优选大鼠、小鼠、仓鼠或家兔，所述灵长目动物优选猕猴、恒河猴、非洲绿猴、或人，其中更优选来源于大肠杆菌、蚕、仓鼠、或人，最优选来源于大肠杆菌。

根据本发明方法的一个方面，对于所述包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段，各串联重复区之间以及串联重复区与载体序列之间用编码甲硫氨酸的核苷酸序列连接。

根据本发明方法的一个方面，所述分离和纯化GLP-2肽的步骤中使用酶法或化学方法水解串联重复的多肽产物，从而得到单体形式的GLP-2肽。所述酶法水解优选包括TEV蛋白酶在内的位点特异性蛋白酶。其中优选化学方法水解串联重复的多肽产物，最优选用溴化氰水解串联重复的多肽产物。

根据本发明的一个方面，还提供一种重组制备GLP-2肽的方法，包括以下步骤：

a)制备包含3个串联重复的编码GLP-2肽的核苷酸序列的片段；

b)将步骤a)的所述片段可操作的连接入pET31b(+)表达载体；

c)将步骤b)的载体导入大肠杆菌宿主细胞；

d)筛选可表达含GLP-2肽序列的多肽的转化体大肠杆菌；

e)培养所筛选的转化体大肠杆菌；和

f)分离并纯化所表达的串联重复的GLP-2肽，用溴化氰水解串联重复的GLP-2肽，得到单体形式的GLP-2肽。

根据上述本发明的方法，其中对于所述包含3个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段，各串联重复区之间以及串联重复区与载体序列之间用编码甲硫氨酸的核苷酸序列连接。

根据上述本发明的方法，其中所述GLP-2肽的序列是SEQ ID NO：2。

根据本发明的一个方面，还提供根据本发明方法制备的的表达载体。

根据本发明的一个方面，还提供根据本发明方法制备的宿主细胞转化体。

根据本发明的一个方面，还提供根据本发明方法制备的GLP-2肽。

根据本发明的一个方面，还提供根据本发明方法制备的GLP-2肽用于制备促进肠粘膜生长的药物的用途。

除非另有指明，否则此处使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域中对该术语的理解意义相同。尽管与此处所述相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实施或测试中，并且这些都在本发明范围之内，但以下仅描述了一些具体的方法和材料。在发生冲突的情况下，以本说明书为准，包括其中的定义在内。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的并且不限制本发明的范围。

本说明书中，“串联重复”的序列表示一个或多个相同序列在一维方向连续排列，其中在重复序列之间可以有或没有间隔序列。制备串联重复序列的方法除了本说明书举例说明的以外，还可以使用本领域技术人员已知的或对本领域技术人员显而易见的任何制备串联重复序列的方法。

本说明书中，“转化”表示用任何方法将外来物质导入宿主细胞中的过程。“转化体”表示被导入外来物质的细胞或生物。

本说明书中，根据具体内容，GLP-2(glucagon like peptide-2，胰高血糖素样肽-2)可以指GLP-2肽，也可以表示编码GLP-2肽的核酸。所述GLP-2肽或编码GLP-2肽的核酸既可以是独立的分子，也可以分别是更长多肽或核酸分子结构中的一部分。除了来源于生物体的野生型序列以外，GLP-2还可以表示具有相似或相同功能的GLP-2同源序列。这对于本领域技术人员是公知的。

本说明书中，“分离”和“纯化”表示将物质从混合物状态转变为更少杂质状态的过程。分离纯化可使用本领域已知的或对本领域技术人员显而易见的任何方法。一般来说，纯化可导致比分离更少杂质的状态。例如，“从细胞中分离纯化GLP-2肽”表示使原来处于细胞中的GLP-2肽与细胞中的多数杂质分开，而达到更少杂质的状态，使得所得体系中GLP-2肽含量更高或影响GLP-2肽功能的杂质更少。

                  附图说明

图1表示本发明一种具体实施方案的技术路线图。

图2表示合成双向引物退火后双链GLP-2DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图3表示经连接后的GLP-2DNA串联序列的琼脂糖凝胶电泳。

图4表示GLP-2/pET31b(+)测序结果。

图5表示GLP-2转化体大肠杆菌在诱导与非诱导条件下的SDS-PAGE电泳。

图6表示经纯化以后的GLP-2融合蛋白的SDS电泳，E2缓冲液纯化后信号最强。

图7表示纯化的GLP-2融合蛋白经脱盐以后各组分的SDS-PAGE。

图8表示化学发光Western印迹检测GLP-2融合蛋白。

图9表示GLP-2肽融合蛋白裂解前后样品的SDS-PAGE凝胶电泳。

                      具体实施方式

随着分子生物学技术的成熟，基因重组多肽正成为药物研发的重要途径。相对于多肽合成，基因重组具有以下优点：1，生物活性高；2，经济，成本为多肽合成的10％以下，3，易于分子改造，使其作用更明显。对于GLP-2来说，其分子量较小，仅为3.9kDa，用普通的基因重组表达较困难。在本发明的一个具体实施方案中，我们设计了以下的方法使其更易表达与纯化。其特点是：

1.选用更适合小分子多肽表达的pET31蛋白表达系统，设计了3个拷贝的GLP-2，使其表达分子量达到24kDa，是最适合蛋白表达的分子量范围，3个拷贝可使GLP-2得率更高。

2.将N端第二位二酰肽肽酶-IV水解位点丙氨酸替换为甘氨酸，使其耐水解能力更强，作用更明显。

3.没有酶切位点，而是利用pET31载体的特点由甲硫氨酸连接目的片段与筛选标签及KSI不溶序列，用溴化氰水解甲硫氨酸位点，将GLP-2单体分离。溴化氰水解甲硫氨酸位点特异性强，是经典的蛋白分解方法。溴化氰具有强烈挥发性，可完全挥发，不会污染GLP-2。

这种具体实施方案的技术路线如图1所示。需要说明的是，除了此处给出的具体实施方案以外，在不偏离本发明精神和范围的前提下，参考本发明，本领域技术人员还可以多种变化和修饰形式实施本发明，这些变化和修饰都在本发明的范围内。除了以下实施例以外，还可以应用本领域的常规分子生物学、微生物学、生物化学、细胞生物学等技术实施本发明。这些技术可以参考以下文献等：Sambrook，Fritsch &Maniatis，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1982)；“DNA Cloning：A PracticalApproach”，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait ed.1984)；″Transcription and Translation″[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]；″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney，ed.(1986)]；B.Perbal，″A Practical Guide ToMolecular Cloning″(1984)。这些参考文献的全部内容通过引用并入本文，作为本发明说明书的一部分。

本发明具体实施例中所使用材料和试剂来源如下：

1.人源性GLP-2编码序列来自于PUBMED核酸数据库(GenBank)，编号： NP 002045。设计后寡核苷酸由Invitrogen公司合成。

2.磷酸化试剂盒，连接试剂盒购自Takara公司，胶回收及质粒抽提试剂盒购于美国Omega公司。

3.载体系统：pET31b(+)载体、E.coliBLR(DE3)感受态细菌、DH5α菌株、蛋白表达及纯化系统购自Novagen公司。

4.脱盐柱购于Millipore公司。

5.anti-GLP-2抗体及其二抗购自美国Santa Cruz公司。

6.DMEM培养基、小牛血清购自Hyclone公司。

7.Caco2细胞购自上海细胞所细胞库

8.其余试剂购于Sigma公司及国产分析纯试剂。

1.重组GLP-2的设计：

根据PubMed核酸数据库(GenBank)中人源性GLP-2的序列，将第2位氨基酸编码的gct替换为ggc，第10位氨基酸编码的atg替换为atc，并在3’末端加上atg序列，以此为基础分别合成GLP-2上下游寡核苷酸引物如下：

上游引物：

5’-cat ggc gat ggt tct ttc tct gat gag atc aac acc att ctt gat aat ctt gcc gcc agg gac ttt ata aactgg ttg att cag acc aaa atc act gac atg-3’

下游引物：

5’-gtc agt gat ttt ggt ctg aat caa cca gtt tat aaa gtc cct ggc ggc aag att atc aag aat ggt gtt gatctc atc aga gaa aga acc atc gcc atg cat-3’

2.实验方法与步骤：

2.1引物5’端磷酸化，使用Takara kination kit进行。

上游或下游合成寡核苷酸       10μl

10mMATP                       2μl

10X反应缓冲液                 2μl

去离子水                      3μl

T4多核苷酸激酶                3μl(10U/μl)

总体积                       20μl

反应条件：按以上准备反应体系以后，将反应体系在37℃保温30min，然后70℃保温10min。

2.2上下游引物退火连接

将上下游磷酸化产物各20μl合并，99℃10min，30℃15min。退火后产物经琼脂糖电泳分析的结果如图2所示。

2.3目的片段纯化

将40μl退火产物转入0.5ml离心管中，加入60μl去离子水，10μl 3M醋酸钠，4μl DNA mate，250μl无水乙醇，混匀后，12000g离心10min，再用200μl无水乙醇洗涤，12000g离心1min，沉淀用20μl去离子水溶解。

2.4目的片段单拷贝的串连：Takara ligation kit

取10μl纯化DNA，加入10μl快速连接反应缓冲液，加1μl T4 DNA快速连接酶，室温(25℃)反应45min。3％琼脂糖电泳检测(见附图3)，将300bp处条带在紫外下切下，利用Omega公司胶回收试剂盒，行胶回收，稀释为40μl。测定DNA含量为10ng/μl。

2.5目的片段与pET31b(+)的插入连接：Takara ligation kit按插入片段：载体比例为3∶1将目的片段与pET31b(+)连接，

目的片段           15μl(150ng)

pET31b(+)           1μl(50ng)

去离子水            4μl

2X反应缓冲液       20μl

T4DNA连接酶         1μl(350U/μl)

反应条件：按以上准备反应体系，室温25℃反应30min。

2.6重组质粒的转化，抽提，测序鉴定

(1)取10μl反应产物加入到100μl E.coli DH5α感受态细菌中，冰浴30min，42℃静置处理90s，立即转入冰浴2min，加入900μl不含氨苄青霉素(Amp)的LB培养基，37℃振荡1h。10000g离心1min，弃去900μl上清。将剩下100μl液体混匀后，涂布于含氨苄的LB平板。37℃培养过夜。

(2)将生长的单克隆菌落转入5ml含Amp的液体LB培养基中，37℃ 250rpm振荡过夜。

(3)取1ml菌液送Invitrogen公司测序。

(4)剩余4ml菌液按照Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒。

2.7酶切电泳鉴定：将抽提质粒酶切鉴定，选用NdeI与XhoI进行双酶切，经电泳确认连接之前酶切片段为385bp，连接后酶切片段为688bp。

2.8目的片段在E.coli BLR(DE3)感受态的转化，将10μl抽提质粒pET31b(+)/GLP-2转化至100μl BLR(DE3)感受态细菌中，冰浴30min，42℃处理90s，冰浴2min，加入900μl不含氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基，37℃振荡1h。10000g离心1min，弃去900μl上清。将剩下100μl液体混匀后，涂布于含氨苄的LB平板。37℃，过夜。

2.9测序鉴定

挑取单克隆菌落。转入5ml含Amp的LB培养基中，37℃ 250rpm振荡过夜。

取1ml菌液，加入20％无菌甘油。送大连宝生物公司测序，测序结果见附图4，确认与预期一致。

2.10诱导表达与鉴定

(1)挑取单克隆菌落，转入5ml含Amp的LB培养基中，37℃ 250rpm振荡过夜。

(2)取1ml菌液转入100ml含Amp的LB培养基中，37℃振荡3h，测OD590nm为0.8时，取出5ml菌液作为对照，其余菌液中加入1ml100mM IPTG，继续摇菌3h。

(3)各取1ml对照与诱导菌液，10000g离心1min，弃上清，加入100μl0.1mM PBS，混匀，加入100μl Tricine上样缓冲液。煮沸5min。

(4)配制Tricine-SDS电泳系统，行SDS-PAGE电泳鉴定。电泳结果如图5所示。结果与预期一致。

2.11纯化与鉴定

(1)诱导结果正确，将余下诱导菌液移入无菌50ml离心管中，16000g，4℃，离心20min，弃上清。

(2)沉淀称重，按5ml/g加入Bugbuster蛋白抽提试剂，反复吹打混匀，加入1μl Benzonase核酸酶，水平摇床混匀20min。16000g，4℃，离心20min。

(3)弃上清，沉淀重悬于5ml Bugbuster中，吹打混匀，加入25U rLysozyme试剂，室温5min。

(4)加入30ml按1∶10稀释的Bugbuster蛋白抽提试剂，混匀后16000g，4℃，离心20min。

(5)沉淀重悬于15ml按1∶10稀释的Bugbuster蛋白抽提试剂中，混匀后16000g，4℃，离心20min。重复此步骤一次。

(6)沉淀用结合缓冲液(Buffer B)4ml溶解，冰浴1h，16000g，4℃，离心30min。将上清用0.45um滤膜过滤。

(7)加入1ml Ni-NTA His.Bind树脂，混旋1h。

(8)将混旋后结合液加入空色谱柱，收集流出液。

(9)分别用Buffer C，BufferD，BufferE冲洗色谱柱。收集流出组分。命名为C1、C2、D1、D2、D3、D4、E1、E2、E3、E4。

(10)配制Tricine-SDS电泳系统，行SDS-PAGE电泳鉴定(见图6)。可见E2缓冲液纯化后信号最强。

2.12脱盐透析与鉴定

利用Millipore公司Amicon脱盐柱Ultrafree-10脱盐。操作如下：

(1)纯化蛋白0.5ml放入脱盐柱，将脱盐柱放入离心管中，离心管底部加入0.4ml去离子水，10000g，4℃，离心20min，分子量＞10KD的蛋白保留于脱盐柱中，盐分通过滤膜进入离心管。收集离心管中盐分待测。

(2)加入0.4ml去离子水到脱盐柱中，另离心管底部加入0.4ml去离子水，10000g，4℃，离心20min，去除残留盐分。收集离心管中盐分待测。

(3)将纯化柱中脱盐后蛋白转入干净离心管中。

(4)各取10μl蛋白与收集盐分行SDS蛋白电泳鉴定(见图7)。

2.13Western Blot鉴定

(1)取纯化脱盐后蛋白10μl，行SDS-Page电泳，

(2)电泳后行半干转PVDF膜，电流1mA/cm²，2h。

(3)去离子水洗膜，蛋白封闭液封闭1h。

(4)加入GLP-2抗体(1∶1000)，孵育，4℃过夜。

(5)TBST洗膜，15min/次，4次。

(6)加入anti-goat HRP二抗(1∶1000)，室温孵育1h。

(7)TBST洗膜，15min/次，4次。

(8)化学发光检测GLP-2信号。结果见图8。

2.14GLP-2多肽单体的制备

(1)纯化脱盐多肽加入6ml 80％甲酸，转入50ml圆底烧瓶，在通风橱中加入0.2g溴化氰。用铝箔纸包好，通风橱中反应22h。

(2)水分及溴化氰挥发后，瓶中蛋白呈半透明胶状。将其重悬于含20mM KPO4，100mM NaCl溶液中(用1M NaHCO3调pH至7.4)，重悬液用铝箔纸包好过夜(以上步骤应在通风橱中进行)。

(3)混悬液5000g 4℃，离心20min，收集上清液，用消毒的0.22μm滤膜过滤。过滤后上清低温冷冻干燥后获得GLP-2单体多肽。称重后于-20℃保存。

(4)取溴化氰裂解前后的样品，进行SDS-PAGE电泳，结果如图所示。可见裂解后样品分子量约为裂解前样品分子量的1/3，这表明此处得到了单体GLP-2肽。

2.15用MTT实验测定重组GLP-2对肠上皮细胞增殖指数的作用研究

将干燥后的GLP-2在分析天平上称取1mg，溶解于300ml DMEM培养液中，浓度为1000nM，0.22μm抽滤灭菌，加入10％小牛血清，将人Caco2细胞消化计数，转移至96孔板中，1×10⁴个/孔，加入含10％小牛血清普通DMEM培养液。GLP-2组加入含GLP-2的DMEM。细胞培养箱孵育培养。分别于第1、2、3天利用MTT法测定细胞增殖指数。具体方法如下：

在培养板中各加入20μl MTT试剂(Promega公司)，培养箱孵育3.5h，以DMEM+MTT为空白对照，在490nm检测吸光度值。细胞增殖指数以吸光度值表示，结果如下：

组别	细胞增殖指数
					第一天	第二天	第三天
GLP-2组	0.3214±0.0125*	0.3582±0.0106*	0.3729±0.0112**
				对照组	0.2892±0.0116	0.2475±0.0097	0.2567±0.0102

注：GLP-2处理组细胞增殖指数从加入GLP-2后第一天起明显高于对照组，说明重组GLP-2对Caco2细胞有明显促增殖作用。

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>重组生产胰高血糖素样肽-2的方法

<130>GLP-2序列表

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>33

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1                   5                    10                        15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

              20                      25                        30

Asp

<210>2

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>修饰型GLP-2肽

<400>2

His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Ile Asn Thr Ile Leu Asp Asn

1                   5                     10                        15

Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr

              20                     25                        30

Asp

Claims (14)

1.重组制备GLP-2肽的方法，包括以下步骤：

a)制备包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段；

b)将所述片段可操作的连接入表达载体；

c)将所述载体导入宿主细胞；

d)筛选可表达含GLP-2肽序列的多肽的转化体宿主细胞；

e)培养所筛选的转化体；和

f)分离并纯化所表达的串联重复的GLP-2肽，水解串联重复的GLP-2肽，从而得到单体形式的GLP-2肽。

2.权利要求1的方法，其中所述包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段中包含1-100个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-50个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-40个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-30个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-20个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-10个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、1-5个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、3个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、2个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列、或1个编码GLP-2的核苷酸序列。

3.权利要求1的方法，其中所述编码GLP-2的核苷酸序列来源于脊椎动物、哺乳动物、啮齿目动物、灵长目动物、大鼠、小鼠、兔、或人。

4.权利要求1的方法，其中所述编码GLP-2的核苷酸序列编码如下肽：

(1)SEQ ID NO：1对应的序列；

(2)SEQ ID NO：2对应的序列；或

(3)与SEQ ID NO：1高度同源的、经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生的、并且与SEQ ID NO：1所编码肽具有相同的促进肠粘膜生长功能的肽的序列。

5.权利要求1的方法，其中所述载体是来源于病毒的载体、来源于DNA病毒的载体、来源于RNA病毒的载体、来源于逆转录病毒的载体、来源于慢病毒的载体、来源于腺病毒的载体、来源于腺伴随病毒的载体、来源于痘病毒的载体、来源于HBV病毒的载体、来源于HIV病毒的载体、质粒载体、pET系列质粒载体、pET31质粒载体、pET31b(+)质粒载体、或整合型载体。

6.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞来源于原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳动物、啮齿目动物、灵长目动物、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母、酿酒酵母、甲醇酵母、家蚕、大鼠、小鼠、仓鼠、家兔、猕猴、恒河猴、非洲绿猴、或人。

7、权利要求1的方法，其中对于所述包含一个或多个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段，各串联重复区之间以及串联重复区与载体序列之间用编码甲硫氨酸的核苷酸序列连接。

8.权利要求1的方法，其中所述分离和纯化GLP-2肽的步骤中使用酶法、位点特异性蛋白酶、TEV蛋白酶、化学方法、溴化氰水解串联重复的多肽产物，从而得到单体形式的GLP-2肽。

9.重组制备GLP-2肽的方法，包括以下步骤：

a)制备包含3个串联重复的编码GLP-2肽的核苷酸序列的片段；

b)将步骤a)的所述片段可操作的连接入pET31b(+)表达载体；

c)将步骤b)的载体导入大肠杆菌宿主细胞；

d)筛选可表达含GLP-2肽序列的多肽的转化体大肠杆菌；

e)培养所筛选的转化体大肠杆菌；和

f)分离并纯化所表达的串联重复的GLP-2肽，用溴化氰水解串联重复的GLP-2肽，得到单体形式的GLP-2肽。

10.权利要求9的方法，其中对于所述包含3个串联重复的编码GLP-2的核苷酸序列的片段，各串联重复区之间以及串联重复区与载体序列之间用编码甲硫氨酸的核苷酸序列连接，所述GLP-2肽的序列是SEQ ID NO：2。

11.根据权利要求1-10中任意一项的方法制备的表达载体。

12.根据权利要求1-10中任意一项的方法制备的宿主细胞转化体。

13.根据权利要求1-10中任意一项的方法制备的GLP-2肽。

14.权利要求13的GLP-2肽用于制备促进肠粘膜生长的药物的用途。

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