CN1754889A - PEG化干扰素α－1b - Google Patents

Abstract

本发明提供了PEG－IFNα－1b偶联物，其中PEG部分共价结合于人IFNα－1b的Cys⁸⁶。本发明还提供了一种药物组合物和用于治疗炎性病症、感染、以及癌症的方法。本发明进一步涉及一种通过PEG部分结合于干扰素分子中的游离半胱氨酸残基来修饰干扰素的方法。

Description

PEG化干扰素α-1b

技术领域

本发明一般地涉及人干扰素的修饰以增加血清半衰期、药代动力学参数、体内生物活性、稳定性，以及降低对干扰素蛋白的体内免疫反应。更具体地说，本发明涉及单聚乙二醇与人干扰素α-1b的游离巯基(Cys⁸⁶)的部位特异性共价结合作用。本发明还涉及干扰素的半胱氨酸特异性修饰的方法以及其在治疗、处理、预防、改善、和/或诊断细菌感染、病毒感染、自身免疫病和病症、炎症性过程和产生的疾病或病症、以及癌症方面的应用。

背景技术

干扰素

干扰素是天然存在的小蛋白和糖蛋白的家族，由大多数有核细胞所产生和分泌，例如，响应病毒感染和其他抗原性刺激。干扰素对各种细胞类型呈现广谱抗病毒、抗增生、以及免疫调节活性。干扰素已用来治疗许多疾病，包括病毒感染(例如，丙型肝炎、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV))、炎性病症和疾病(例如，多发性硬化症、关节炎、哮喘、囊性纤维化症、间质性肺病)以及癌症(例如，骨髓瘤、淋巴癌、肝癌、乳房癌、黑素瘤、毛样细胞白血病)，并且还应用于其他治疗领域。干扰素使细胞抗病毒感染并对细胞呈现广谱作用。它们通过结合于在细胞表面的特异性膜受体来发挥其细胞活性。在结合于细胞膜以后，干扰素引发复杂顺序的细胞内变化，包括：酶的诱导、抑制细胞增殖、免疫调节活性如增强巨噬细胞的吞噬细胞活性和增大淋巴细胞对靶细胞的特异性细胞毒性、以及在病毒感染细胞中抑制病毒复制。

根据其化学、免疫、以及生物特性，干扰素(IFNs)已被分成至少四类：α(白细胞)、β(成纤维细胞)、γ、以及ω。已知干扰素影响各种细胞功能，包括在正常和异常细胞中的DNA复制以及RNA和蛋白质合成。因而，干扰素的细胞毒性效应并不限于肿瘤或病毒感染细胞也呈现在正常健康的细胞中。因此，在干扰素治疗期间，尤其需要高剂量时，会产生不期望的副作用。使用干扰素可导致骨髓抑制，以致降低红细胞、白细胞、以及血小板水平。更高剂量的干扰素通常引起流感样症状(例如，发热、疲劳、头痛、以及寒战)、胃肠紊乱(例如，食欲缺乏、恶心、以及腹泻)、头晕、以及咳嗽。

α干扰素

人干扰素α由约20个基因组成的多基因家族进行编码，该多基因家族编码的蛋白质具有大约80-85％的同源氨基酸序列。人干扰素α多肽是由一些人细胞系和人白细胞系在暴露于病毒或双链RNA、或转化白细胞系后(例如，成淋巴细胞样系)产生。

从1986年开始，美国食品及药物管理局(FDA)已批准多种干扰素药物，包括干扰素α-2b和干扰素α-2a，用于治疗慢性肝炎、慢性骨髓白血病、以及毛样细胞白血病。

干扰素α-1b

干扰素α-1b的初级序列首先由Mantei等发表于1980年(Gene10：1-10)和Nagata等发表于1980(Nature 287：401-408)(其内容结合于本文作为参考)(基因文库进入编号NM_024013.1；GI：13128949；以及基因文库进入编号NP_076918.1；GI：13128950)。干扰素α-1b已确定为由166个氨基酸组成的单链多肽，其与干扰素α-2a和干扰素α-2b共享83％的同源性。

干扰素α-1b含有在氨基酸位置1、29、86、99、以及139的5个半胱氨酸残基。在其天然构象中，干扰素α-1b形成两对分子内二硫键(在Cys¹-Cys⁹⁹之间；在Cys²⁹-Cys¹³⁹之间)，在Cys⁸⁶残基留下游离的巯基(Weissmann et al，1982，Structure and expression ofhuman IFN-α genes，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.299：7-28)。

已报道，干扰素α-1b具有与干扰素α-2a以及α-2b相同的生物活性和治疗性能，包括免疫调节、抗病毒、以及抗癌性能。在中国已对干扰素α-1b进行了临床试验(几百名患者)以确定治疗性能和不良反应。干扰素α-1b(Sinogen，赛若金)是由中国卫生部批准上市的第一种重组蛋白药物。10多年来干扰素α-1b(Sinogen，赛若金)已用于治疗患有乙型肝炎、丙型肝炎、病毒感染、以及癌症的约几百万患者。

干扰素的PEG(聚乙二醇)化

干扰素可用非胃肠道给药，治疗各种适应症。然而，非胃肠道给药的蛋白可能产生免疫反应，并且可能具有较短的药理半衰期。从而，在患者体内可能较难达到治疗上有用的蛋白血药水平。这些问题可以通过将蛋白结合于聚合物如聚乙二醇加以克服。

惰性的、非毒性、可生物降解聚乙二醇聚合物(PEG)(也称作聚环氧乙烷(PEO))共价连接的分子在生物工程学和医学上具有重要的应用。已报道，生物活性和药物活性蛋白的PEG化，以改善原蛋白的药代动力学(延长持续时间)、改善安全性(例如，降低毒性、免疫原性、以及抗原性)、增加药效、降低给药频率、改善药物溶解性和稳定性、减少蛋白的酶水解、以及帮助受控药物释放。

目前，已使用的治疗性PEG-蛋白偶联物包括：PEG化(PEGlated)腺苷脱氨酶(ADAGEN^_，Enzon Pharmaceuticals)，用于治疗重症联合免疫缺陷病；PEG化L-天冬酰胺酶(ONCAPSPAR^_，Enzon Pharmaceuticals)，用于治疗急性成淋巴细胞白血病；以及PEG化干扰素α-2b(PEG-INTRON^_，Schering Plough)和PEG化干扰素α-2a(PEGASYS，Roche)，用于治疗丙型肝炎。关于具有临床疗效的PEG-蛋白偶联物的一般综述参见Burnham，Am.J.Hosp.Pharm.，15：210-218(1994)(其结合于本文作为参考)。

将PEG连接在蛋白上反应基团通常是利用亲电子活化的PEG衍生物来完成。例如，PEG可以连接于赖氨酸残基上的ε-氨基以及多肽链的N末端上的α-胺。

通常，PEG偶联物由群体组成，其中一个群体中的物质由每个蛋白分子结合不同数目的PEG分子组成(“PEG体”(“PEGmers”))，范围从零到蛋白质中氨基的数目；另一个群体中的物质由在不同部位仅连接一个PEG分子的蛋白组成(即位点异构体)。然而，非特异性PEG化可以导致偶联物部分地失活或基本上全部失活。活性的降低是因为蛋白活性受体的结合区域被屏蔽所引起的。例如，据报道，用大过量的甲氧基-聚乙二醇N-琥珀酰亚胺基戊二酸酯和甲氧基-聚乙二醇N-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯对重组IFN-β和IL-2进行的PEG化可导致溶解性增加，但也降低活性的水平和产率。

治疗性PEG化干扰素α(IFNα)是位点异构体的混合物，其在核心IFNα-2b分子上(Grace et al，2001，J.Interferon and CytokineResearch 21：1103-1115)和在核心IFNα-2a(Bailon et al，2001，Bioconjugate Chem 12：195-202；Monkarsh et al，1997，AnalyticalBiochemistry 247：434-440)上的特异性位点被单PEG化。体外抗病毒和抗增殖活性可由于PEG化的位点和连接的PEG的大小而变化(Grace et al，2005，J.Biological Chemistry，280：6327-6336)。

位点特异性的PEG化

多肽N末端的α-氨基可作为PEG化的单一位点，其取决于N末端是否包含在活性受体结合区域中。例如，G-CSF的N末端的α-氨基被单一PEG化，并保留生物活性(美国专利第5,824,784号，Kinstler，O.B.et al，1998，“N-terminal Chemically Modified ProteinCompositions and Methods”)。干扰素α-2b的N末端Cys¹的α-氨基被单一PEG化，与在His³⁴、Lys¹³⁴、Lys⁸³、Lys¹³¹、Lys¹²¹、Lys³¹单一PEG化的PEG-IFNα2b比较，在STAT移位测定中呈现最低的生物活性(Grace et al，2005，J.Biological Chemistry，280：6327-6336)。

蛋白质的位点特异性单一PEG化是一个期望的目标，然而除了蛋白质N末端的α-胺或蛋白质的游离半胱氨酸残基外，大多数蛋白质并不具有用于连接单一PEG聚合物的特异性天然位点。因此，蛋白质的PEG化将很可能产生部分或完全失活的异构体。

已报道，硫醇-选择性PEG衍生物可用于特定部位的PEG化。以对吡啶基二硫反应基团形式出现的稳定硫醇-保护PEG衍生物显示出特异性地结合于蛋白木瓜蛋白酶中的游离半胱氨酸。在木瓜蛋白酶和PEG之间的新形成的二硫键可以在缓和的还原条件下被剪切，再生天然蛋白。已报道PEG-IFN-β偶联物，其中通过用硫醇反应PEG化剂邻位吡啶基二硫化物进行的特定部位PEG化过程，PEG部分共价结合于人IFN-β的Cys¹⁷(专利WO 99/55377(PCT/US99/09161)，El Tayar，N.，et al，1999，“Polyol-IFN-BetaConjugates”)。

PEG IFN-α偶联物

欧洲专利申请EP 593 868(其结合于本文作为参考)描述了PEG-IFN-α偶联物的制备。在此专利中描述的PEG化反应是非位点特异性的，因而获得PEG-IFN-α偶联物是位置异构体的混合物(也参见Monkarsh et al，ACS Symp.Ser.，680：207-216(1997)，其在此以引用方式并入本文)。

因而，需要一种经位点特异性修饰的PEG IFN-α偶联物，特别是α-1b偶联物，及其制备方法，以补充适用于治疗人类疾病的干扰素药物的供应种类。

本文引用的出版物和参考文献所披露的内容以引用方式并入本文并且不承认是现有技术。

发明内容

本发明提供多元醇-干扰素α偶联物，其多元醇部分是共价结合于人干扰素α-1b的Cys⁸⁶。干扰素可以从人细胞或组织中分离，或可以是在宿主中表达的重组蛋白。这些宿主包括细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、以及转基因动物。

根据本发明，多元醇部分可以是，例如，聚乙二醇部分或聚亚烷基二醇部分。在某些具体实施例中，本发明的多元醇-干扰素α-1b偶联物具有和天然人干扰素α-1b的相同或更高体内干扰素α活性。本发明的优选方面是多元醇-干扰素α-1b偶联物将不含有其他位点的异构体并具有均匀的分子量。

本发明还提供药物组合物，其包括具有多元醇部分共价结合于人干扰素α-1b的Cys⁸⁶的多元醇-干扰素α偶联物，以及药用载体、赋形剂、或助剂。

还提供制备多元醇-干扰素偶联物的方法，其中具有单个游离半胱氨酸的干扰素偶联于马来酰亚胺多元醇或马来酰亚胺二多元醇，在多元醇和游离半胱氨酸之间形成共价键。

该方法可以用来制备天然存在、基因工程(例如，重组)、位点特异性突变、以及嵌合的干扰素的偶联物，包括人α干扰素的偶联物，如重组人干扰素α-1b偶联物。

本发明还提供了PEG化干扰素α-1b在制备用于治疗α干扰素-应答状态或疾病的药物中的应用(用途)，这些应答状态、疾病、以及病症可以包括：炎症、病毒感染、细菌感染、或癌症。更具体地说，这些过程、疾病、以及病症可以是丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、HIV感染、多发性硬化症、关节炎、哮喘、囊性纤维化症、间质性肺病、骨髓瘤、淋巴癌、肝癌、乳房癌、黑素瘤、以及毛样细胞白血病。施用该药物时包括给予患者有效量的多元醇-干扰素α-1b。

附图说明

下述附图是用来说明本发明的具体实施例，而不是限制本发明的保护范围。

图1A、1B以及1C表示人干扰素α-1b的核苷酸序列(图1A)、氨基酸序列(图1B)、核苷酸和氨基酸序列的对应排列(图1C)。

图2A和2B表示用单链mPEG(20kD)-马来酰亚胺(图2A)和支链mPEG₂(40kD)-马来酰亚胺(图2B)对干扰素α-1b进行Cys⁸⁶-特异性单一PEG化的偶联机理。马来酰亚胺的双键与巯基进行烷基化反应以形成稳定的硫醚键。相邻于马来酰亚胺双键的一个碳原子受到硫醇阴离子的亲核攻击以生成加成产物。在pH7，马来酰亚胺与巯基的反应速率大于其与氨基的反应速率1000倍。

图3表示mPEG-IFNα-1b偶联物的SDS-PAGE电泳图谱。第1泳道和第5泳道表示蛋白分子量标记；第2泳道表示未修饰IFNα-1b；第3泳道表示mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物；以及第4泳道表示mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物。

图4A、4B、和4C表示未修饰IFNα-1b(图4A)、mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物(图4B)、以及mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物(图4C)的分子筛HPLC图谱。

图5A和5B表示mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物(图5A)、和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b(图5B)的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。

图6A、6B、和6C表示未修饰IFNα-1b(图6A)、mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物(图6B)、以及mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物(图6C)的阳离子交换HPLC图谱。

图7表示进行IFNα-1b的Cys⁸⁶-特异性单一PEG化的结构确证的流程图。经提纯的mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物用蛋白酶Glu-C进行酶解，得到Cys⁸⁶-PEG化肽。Cys⁸⁶-PEG化肽通过反相HPLC乙腈/三氟乙酸的梯度洗脱分离获得，并进一步通过分子筛HPLC法提纯。Cys⁸⁶-PEG化肽的纯度经SDS-PAGE和反相HPLC分析确定。Cys⁸⁶-PEG化肽的分子量是通过SDS-PAGE和MALDI-质谱进行测定。Cys⁸⁶-特异性单一PEG化的肽是通过N末端序列测定进行证实。

图8A和8B表示反相HPLC蛋白酶Glu-C肽图谱，包括未修饰的IFNα-1b(图8A)、以及mPEG(20kD)-IFNα-1b(图8B)。29.1分钟峰表示为未修饰Cys⁸⁶肽(图8A)，而43.7分钟峰表示为Cys⁸⁶-PEG化肽(图8B)。

图9表示大鼠在一次性皮下给药后，未修饰IFNα-1b、mPEG(20kD)-IFNα-1b、以及mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物所显示出的药代动力学曲线。

图10表示在皮下埋植人肾肿瘤ACHN细胞的无胸腺Balb/C裸鼠中，mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物以及未修饰IFNα-1b所显示的的体内抗肿瘤活性。图中显示在治疗埋植肿瘤的小鼠时，使用不同剂量的mPEG(20kD)-IFNα-1b偶联物和未修饰IFNα-1b及赋形剂，经过不同时间观察到的肿瘤体积变化。X轴和Y轴分别表示给药周数和相应的肿瘤体积。

具体实施方式

本发明是基于下述发现，多元醇部分，尤其是PEG部分，连接于人IFNα-1b的Cys⁸⁶残基可以保留天然人干扰素α-1b的IFNα-1b生物活性。因而，在Cys⁸⁶残基连接有多元醇的IFNα-1b不仅呈现IFNα-1b生物活性，而且此多元醇-IFNα-1b偶联物也可以提供由多元醇部分所具有的性能，如改善药物代力学、以及降低抗原性。

干扰素α-1b的游离巯基(Cys⁸⁶)可适用于巯基-特异性偶联，例如，与聚乙二醇偶联。此外，在温和的中性水溶液中由马来酰亚胺-巯基的偶联是高度特异性的。巯基-特异性单一PEG化可以避免产生多元性的位点异构体，位点异构体是来自多位点的PEG化，如针对赖氨酸残基的PEG化的产物。

除非提供特殊定义，与本文描述的实验室操作、技术以及方法有关而使用的术语是那些在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号以及缩写词与由这类符号表示的全名可互换地使用。因而，例如，术语“碳”和“C”可理解为具有相同的含义。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、剂型、给药、以及治疗患者。标准技术可以用于重组DNA方法、寡核苷酸合成、组织培养等等。反应和纯化，例如使用试剂盒，应根据制造商的详细说明进行。这些操作方法是在本技术领域通常使用的，或如本文所描述的。前述技术和操作可以一般地按照本领域公知的常规方法来进行，以及如在各种一般或更具体的参考文献中所描述的那样进行，这些参考文献在本说明书中被引用和讨论。参见例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))，其结合于此作为参考，用于任何目的。

“IFN-α”或“α干扰素”、“干扰素α”，如在本文所使用的，指人白细胞干扰素，例如通过从生物液体、细胞、组织、细胞培养物进行分离所获得，或是用重组DNA技术在原核或真核宿主细胞中所获得。这些原核和真核宿主细胞包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、转基因动物、转基因植物、昆虫细胞，人白细胞干扰素包括但不限于其盐类、功能性衍生物、前体和活性片段。

“人IFNα-1b”指SEQ ID No.：2(图1B)给出的蛋白质氨基酸序列或与基因文库登录号：NP_076918.1GI：13128950一致的氨基酸序列蛋白质。人IFNα-1b的核苷酸序列示于图1A(SEQ ID No.1)并与基因文库登录号：NM_024013.1；GI：13128949一致。根据本发明，人IFNα-1b包括图1A和1B所示以及表1中描述的序列，以及IFNα-1b的任何同源物(homologues)、直系同源物(orthologs)、变异体、衍生物、类似物、活性(例如，生物性的或药物性的)片段或突变体。例如，本文所指的IFNα-1b在本技术领域也可以称为白细胞干扰素、IFL、IFN、IFNα1、IFNα、以及IFN-α。表1给出对IFNα-1b的序列(SEQ ID NOS.1和2)与描述在科学文献(Mantei et al，1980，Gene 10：1-10；Geoddel et al，1981，Nature 390：20-26)中的两个IFN-α序列的比较结果。可以预见在表1所列的IFN-α序列可以同样适用于制备本发明的物质。

表1.各种来源的人IFNα1序列的氨基酸变异体

来源(发表年)	位点	Mantei(1，2)1980	Goeddel(3)1981	Li(4)1991	Ding(5)1996	Chen(6)2001
							发表名称Li(4)建议的名称氨基酸变异体	93100114149158	IFNα1IFN-α1bLeuValAlaMetLeu	IFNαDIFN-α1aLeuValValMetLeu	IFNα1/158VIFN-α1cLeuAlaAlaMetVal	IFNα1b-LeuAlaAlaMetLeu	IFNα1b-ProValAlaValLeu

备注：

(1)Mantei，N.，Schwarzstein，M.，Streuli，M.，Panem，S.，Nagata，S.，andWeissmann，C.：The nucleotide sequence of a cloned humanleukocyte interferon cDNA.(1980)Gene 10，1-10

(2)Nagata，S.，Mantei，N.，Weissmann，C.，：The structure of one of theeight or more distinct chromosomal genes for human interferon-α.(1980)Nature 287，401-408

(3)Goeddel，D.V.，Leung，D.W.，Dull，T.J.，Gross，M.，Lawn，R.M.，McCandliss，R.，Seeburg，P.H.，Ullrich，A.，Yelverton，E.，and Gray，P.W.：The structure of eight distinct cloned human leukocyteinterferon cDNAs.(1981)Nature 290，20-26

(4)Li，M.F.，Jin，Q.，Hu，G.，Guo，H.Y.，and Hou，Y.D.：A novel variantof human interferonα1 gene.(1991)Science in Cghina(Series B)35，200-206

(5)丁锡申，重组人干扰素α-1b，基因工程药物，(1996)，154-157

(6)Chen，H.H.and Yu，X.B.：Homo sapiens interferon alpha 1b gene，partial cds.Accession (AF439447)，Version (AF439447，GI：17063948)，NCBI，submitted(24-OCT-2001)，Sun Yat-SenUniversity of Medical Sciences，Guangzhou，Guangdong，P.R.China。

本发明的IFNα-1b多核苷酸可以包含天然序列(即，内源性序列，编码IFNα-1b多肽或其部分)，或可以包含变异体、或该序列的生物性或抗原性功能等效物。相对于天然多肽，多核苷酸变异体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，如下面进一步描述的。术语“变异体”还包括异源的同源基因。通常，IFNα-1b变异体将保留所有、主要部分、或至少部分生物活性，其生物活性可以利用在下面实施例6中描述的干扰素生物检定或类似方法所确定的。还参看Rubinstein et al.，J.Virol.37：7551(1981)，其结合于此作为参考。

本发明的IFNα-1b类似物可以通过提供功能等效分子的取代、添加、或缺失来改变蛋白序列而制成，如在本技术领域所公知的。这些类似物用功能等效氨基酸残基代替原序列内的残基而改变序列，形成沉默改变。例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可以用类似极性的另一个氨基酸加以取代，作为功能等效物，形成沉默改变。序列内氨基酸的取代可以选自该氨基酸所属类的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、以及蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸以及谷氨酸。可以预见，含有保守性取代的天然存在和基因工程(例如，重组)变异体，以及在非生物活性蛋白区域中保守性取代的变异体将产生功能等效IFNα-1b多肽，均涵盖在本发明的保护范围之内。

本发明还包括多元醇偶联的IFNα-1b片段。如在本文所使用，IFNα-1b的“片段”指通过任何方法产生的IFNα-1b部分，包括但不限于用酶消化和化学剪切(例如，CNBr)以及物理剪切所获得的IPNα-1b部分。IFNα-1b的片段还可以通过重组DNA技术以及通过氨基酸序列合成来获得。

根据本发明，多元醇-IFNα-1b偶联的中的多元醇部分可以是具有直链或支链的任何水溶性单功能或双功能聚环氧烷。通常，该多元醇是聚亚烷基二醇如聚乙二醇(PEG)。然而，本领域技术人员将意识到其他多元醇，如聚丙二醇以及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，均能适用。

其他干扰素偶联物可以通过将干扰素偶联到水溶性聚合物来制备。这类聚合物的非限制性清单包括其他聚环氧烷均聚物如聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物、以及其嵌段共聚物。作为聚环氧烷基聚合物的替换物，可以使用有效非抗原性材料，如右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯乙醇、基于碳水化合物的聚合物、以及类似物。

如在本文使用的，“PEG”包括下述通式的分子：

--CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂--

PEG包括在每端具有羟基的线性聚合物：

该化学式可以简短地表示为HO-PEG-OH，其中-PEG-表示没有端基的聚合物骨架。

PEG通常用作甲氧基-PEG-OH，(m-PEG)，其中，一端是相对惰性的甲氧基，而另一端是易发生化学修饰的羟基。甲氧基PEG的化学式表示如下：

CH₃O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--OH

通常也使用支链PEG。支链PEG可以表示为R(-PEG-OH)_m，其中，R表示中心部分如季戊四醇或甘油，而m表示分支臂的数目。分支臂的数目(m)可以从3到一百或更多不等。羟基进一步受到化学修饰。

另一种分支形式，如描述在PCT专利申请WO 96/21469中的形式，具有易发生化学修饰的单端。这种类型的PEG可以表示为(CH₃O-PEG-)_pR--X，其中，p等于2或3，R表示中心如赖氨酸或甘油，而X表示官能团如羧基，其易发生化学活化。又一个分支形式“侧PEG”沿PEG骨架而不是在PEG链的末端具有反应基团，如羧基。

除这些PEG形式以外，该聚合物也可以用骨架中的弱键或可降解键进行制备。例如，Harris在美国专利申请第06/026,716号(其结合于本文作为参考)中已表明，可以用聚合物骨架中的易发生水解的酯键来制备PEG。这种水解导致聚合物剪切成低分子量的片段，其是按照以下反应图解：

术语聚乙二醇或PEG意指包括天然PEG以及所有上述衍生物。

环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物在其化学性能上与PEG紧密有关，因而在许多应用场合它们可用来代替PEG。它们具有下述通式：

HO--CH₂CHRO(CH₂CHRO)_nCH₂CHR--OH

其中R是H或CH₃、CH₂CH₃、(CH₂)_mCH₃。

PEG是一种有用的聚合物，其具有较高的水溶性以及在许多有机溶剂中具有较高的可溶性。PEG通常是非毒性和非免疫性的。当PEG化学连接(“PEG化”)于水不溶性化合物时，生成的偶联物通常变得水溶性的、以及可溶于许多有机溶剂。

如在本文所使用的，术语“PEG部分”是用来包括但不限于线型和分支PEG、甲氧基PEG、水解或酶促降解PEG、侧PEG、枝状体(dentrimer)PEG、PEG和一个或多个多元醇的共聚物、以及PEG和PLGA(聚(乳酸/乙醇酸))的共聚物。根据本发明，术语聚乙二醇或PEG是包括天然PEG以及所有本文描述的衍生物。

在本文所使用的“盐”是指羧基盐和通过已知方法获得的含氨基官能团化合物的盐。羧基盐包括无机盐如钠盐、钾盐、钙盐，以及有机碱的盐如那些与胺形成的盐，如三乙醇胺、精氨酸、或赖氨酸。含氨基酸的盐包括，例如，与无机酸如盐酸形成的盐以及与有机酸如乙酸形成的盐。

在本文所使用的，“官能衍生物”是在氨基酸部分的侧链上或在N-末端或C-末端基团上的官能团按已知方法制备而得的衍生物，对于药物的组成该衍生物适用于制药，不破坏蛋白活性，或不构成毒性，这些官能衍生物包括在本发明中。这样的衍生物包括例如羧基的酯或脂族酰胺、游离氨基的N-酰基衍生物、或游离羟基的O-酰基衍生物，并且这样的衍生物是和酰基如alcanoyl或芳酰基所形成。

“前体”是在人或动物体内，转化成IFNα-1b的化合物。

关于蛋白的“活性部分”，本发明指化合物本身的多肽链的任何片段或前体，单独或组合与结合于其上的有关分子或残基，例如，糖类或磷酸酯的残基、或多肽分子的聚集物，只要这样的片段或前体显示出作为药剂的IFNα-1b的相同活性。

本发明的偶联物可以用本领域熟知的任何方法进行制备。根据本发明的一个具体实施例，在适当的溶剂中IFNα-1b和PEG化试剂起反应，然后分离和提纯得到所希望的偶联物，例如通过应用一种或多种层析方法。

作为在本文所使用的，“巯基反应PEG化试剂”指能够和半胱氨酸残基的巯基起反应的任何PEG衍生物。它可以是，例如，含有官能团如邻位吡啶基二硫化物、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰亚胺的PEG，以及PEG的邻位吡啶基二硫化物(OPSS)衍生物。在本发明的一个方面，PEG化试剂是巯基选择性PEG。在本发明的一个具体实施例中，PEG化试剂是mPEG-MAL，其可以用以下化学式表示：

在另一个具体实施例中，PEG化剂是mPEG₂-MAL，其可以用以下化学式表示：

在优选的具体实施例中，PEG化试剂是Nektar Therapeutics提供的mPEG-MAL或mPEG₂-MAL。

本发明制备偶联物的典型反应图解表示在图2A和2B中。

已表明，在蛋白和PEG部分之间形成的硫醚键的类型在循环中是稳定的，但在进入细胞环境后它能被降解。不希望将本发明限制于任何一种学说或作用方式，在本发明的一个具体实施例中，没有进入细胞的偶联物在循环中是稳定的直到被清除。

应当注意到，上述反应对于IFNα-1b是位点特异性的，因为在位点86的Cys可用于与mPEG-MAL试剂相互作用；在人IFNα-1b的自然存在形式中出现在氨基酸位点1、29、99、以及139的其他Cys残基不与PEG试剂起反应，因为它们已形成二硫键(即，Cys¹-Cys⁹⁹；Cys²⁹-Cys¹³⁹)。

在某些具体实施例中，本发明的多元醇-干扰素α-1b偶联物具有和天然人干扰素α-1b相同或更高的干扰素α活性。在另一个具体实施例中，多元醇IFNα-1b具有天然人干扰素α-1b的部分或相当大部分的活性。在其他具体实施例中，多元醇IFNα-1b至少具有可测量的活性。偶联和未偶联干扰素α-1b的比活可以通过用于测定干扰素活性的任何方法来确定，如测量在体外或体内的生物抗病毒、消炎、或抗肿瘤性能。在一个适合用于本发明的测定中，测量了致细胞病变作用抑制。参见Rubinstein et al.，J.Virol.37：755(1981)。干扰素保护细胞免受病毒感染(致细胞病变作用)，因而在病毒感染的条件下增加宿主细胞的生存力。因此，根据此方法，干扰素抑制在宿主细胞中的病毒致细胞病变作用(CPE)，其是通过细胞增殖或生存力进行测量。

在本发明的一个方面，多元醇-干扰素α-1b偶联物具有均一的分子量。该分子量可以用本领域可获得的任何方法来测定，包括但不限于：天然或变性凝胶电泳、凝胶过滤、分子筛层析、超滤、以及质谱测定法。

“层析方法”或“层析法”指任何用来分离混合物组分的技术，通过将混合物施加于溶剂(流动相)流过的填充物(静止相)。进行分离层析法的分离原理是基于静止相和流动相的不同物理特性。

在文献中熟知的某些特定类型的层析方法包括：液相层析法、高压液相层析法、离子交换层析法、吸附层析、亲和层析法、分配层析法、疏水层析法、反相层析法、凝胶过滤层析法、超滤层析法、或薄层层析法。

PEG试剂可用单甲氧基化形式，其中仅一端可用于偶联作用；或用双功能形式，其中两端均可用于偶联作用，例如用两个IFNα-1b连接于一个PEG部分。PEG试剂的分子量通常在500和100,000之间。

本发明还涉及制备多元醇-干扰素偶联物的方法，包括下述步骤：提供单一游离半胱氨酸基团的干扰素和马来酰亚胺多元醇或马来酰亚胺二多元醇；在允许多元醇和任何位置的游离半胱氨酸之间形成共价键(即，硫醚键)的条件下；用马来酰亚胺多元醇或用马来酰亚胺二多元醇接触干扰素；从而产生多元醇-干扰素偶联物。根据此方法，干扰素可以是含有单一游离半胱氨酸的任何干扰素。在一个具体实施例中，自然存在的干扰素具有单一游离半胱氨酸，也可含有另外已自然形成分子内二硫键的半胱氨酸。在另一个具体实施例中，通过重组DNA方法设计获得的干扰素具有单一游离半胱氨酸，这是通过消除不希望的半胱氨酸或加入或突变核苷酸序列以编码新的半胱氨酸。这些干扰素也可以是设计而成的融合蛋白质或嵌合蛋白质，其中两种或更多蛋白质结合形成以利用多种物质组份的所希望的性能，包含但不限于用于PEG化的游离半胱氨酸部位。对于本领域技术人员来说，设计本发明的干扰素的方法是众所周知的。参见，例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989))；Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley & Sons Inc.，N.Y.(2003))，其内容结合于本文作为参考。

在本发明用此方法的某些具体实施例中，干扰素是α干扰素，如IFNα-1b，其含有单一游离半胱氨酸。

此外，该一般方法可用于具有可利用巯基残基的任何蛋白质。根据本发明的一个方面，该方法用来修饰含有单一巯基残基，例如，单游离半胱氨酸残基的蛋白质、多肽和肽。在另一个方面，这些蛋白质、多肽、或肽含有若干半胱氨酸残基，每对半胱氨酸残基可形成二硫键，剩余的半胱氨酸是游离的用于修饰，例如使用mPEG-MAL或mPEG₂-MAL。因而，根据本发明的这个方面，含有3个半胱氨酸残基的蛋白、多肽、或肽将形成一对二硫键，留余单一游离半胱氨酸；而含有7个半胱氨酸的成分形成3对二硫键，留余单一游离半胱氨酸用于PEG化。

本发明的PEG-多肽偶联物可用作制备药物或药用组合物，用于治疗疾病、病症、或病情。其中的多肽是作为活性成分而产生效用的。因此，本发明还提供由多元醇-干扰素α偶联物组成的药物组合物。包括多元醇部分共价结合于Cys⁸⁶的人干扰素α-1b的偶联物，以及药用载体、赋形剂或辅助剂。

本发明的IFNα-1b偶联物和其药用盐、溶剂化物、以及水合物预期可以有效地治疗由干扰素α-1b介导的疾病或状态。因此，本发明的化合物和其药用盐、溶剂化物、以及水合物被认为可以有效地治疗炎症、感染、以及癌症。

在本发明的一个具体实施例中，高度纯化的偶联物在药物组合物中被用作活性组分，用于治疗、诊断细菌和病毒感染以及自身免疫、炎性疾病、以及肿瘤。上述疾病的非限制性实例包括：感染性休克、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、类风湿性关节炎、红斑狼疮、以及多发性硬化症。

本发明还提供由干扰素α介导的调节过程的方法，包括给予患者有效量的多元醇-干扰素α-1b偶联物。这样的过程包括但不限于炎症、病毒感染、细菌感染、以及癌症。在又一个具体实施例中，本发明提供治疗患有干扰素α-反应病状或疾病的患者的方法，包括给予患者有效量的多元醇-干扰素α-1b偶联物。可以预见，这种治疗可用于任何疾病或状态，其中干扰素疗法可提供治疗、缓和、改善、或诸如此类，包括但不限于：炎性病症(例如，多发性硬化、关节炎、哮喘、囊性纤维化、或间质性肺病)；病毒感染(例如，丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、或HIV感染)；本领域熟知的细菌感染，特别是那些难治的或耐传统治疗(例如用抗生素)的细菌感染；以及癌症(例如，骨髓瘤、淋巴癌、肝癌、乳房癌、黑素瘤、以及毛样细胞白血病)。

本发明的一个具体实施例是把本发明的有效药理剂量的偶联物给予具有以上所列疾病发展风险的受治疗者或给予已经显示出这类病理特征的受治疗者。

可以使用任何与有效成分相适用的给药途径。在本发明的某些具体实施例中，优选非胃肠道给药，如皮下、肌内、或静脉注射。活性组分的使用剂量取决于根据患者的年龄、体重、以及个体反应的医用处方。

本发明的IFNα-1b偶联物可以结合药用载体以提供药物组合物，以用于治疗本文提到的哺乳动物的生物状态或病症，尤其是人类患者。在这些药物组合物中所用的特定载体可以采取各种形式，其取决于所希望的给药类型。适当的给药途径包括肠道(例如，口服)、局部、栓剂、吸入、以及非胃肠道(例如，静脉内、肌内、以及皮下)。

在制备口服液体剂型(例如，混悬剂、酏剂、以及溶液)的组合物时，可以采用典型的药物介质，如水、乙二醇、油、乙醇、增味剂、防腐剂、着色剂等等。类似地，当制备口服固体剂型(例如，散剂、片剂、以及胶囊剂)时，将采用诸如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等载体。由于其容易给药，片剂和胶囊剂是本发明的药物组合物的所希望的口服剂型。

用于非胃肠道给药的药物组成可以制备成包括有效成分和适当载体的注射剂型。为了非胃肠道给药，载体通常包括无菌水，也可包括其他帮助溶解或用作防腐剂的组分。此外，也可以制备注射性混悬剂，在这种情况下，将采用合适的液体载体、悬浮剂等等。用于非胃肠道给药的载体在本技术领域是熟知的并且包括，例如，水、盐溶液、林格氏液、和/或葡萄糖。该载体可以包含少量的赋形剂以便保持药剂的稳定性和等渗性。这些溶液的可以按照通常的方式制备。

为了局部给药，本发明的IFNα-1b偶联物可用温和的含水基质进行配制，如软膏或乳膏。适用软膏基质的实例是凡士林、凡士林加上挥发性硅酮、羊毛脂、以及油包水乳剂如Eucerin^TM，其可获自Beiersdorf(Cincinnati，Ohio)。适用膏基的实例是：Nivea^TM乳膏，可获自Beiersdorf(Cincinnati，Ohio)；冷霜(USP)；PurposeCream^TM，可获自Johnson & Johnson(New Brunswick，New Jersey)；亲水性软膏(USP)；以及，Lubriderm^TM，或获自Warner-Lambert(Morris Plains，New Jersey)。

本发明的药物组成和IFNα-1b偶联物一般以单位剂量的形式给药(例如，液体制剂、片剂、胶囊剂等)。本发明的化合物通常以每日、每周、以及每月剂量给药，从约0.01μg/kg体重至约50mg/kg体重。通常，本发明的IFNα-1b偶联物以每日、每周、以及每月剂量给药，从约0.1μg/kg体重至约25mg/kg体重。通常，本发明的化合物以每日、每周、以及每月剂量给药，从约1μg/kg体重至约5mg/kg体重。对于75kg的平均体重，剂量可以在每日10μg和1mg之间，而在一个具体实施例中，一日量是在20μg和200μg之间。此外，经修饰的IFNα-1b偶联物的延长作用可便于，例如，每周、或每两周给药方案。例如，每人每周剂量可以是约10至约500μg。在某些具体实施例中，每人每周剂量可以是约50至约250μg。在其他具体实施例中，每人每周剂量可以是约100至约200μg。如本领域技术人员所明了的，根据本发明的药物组成的特定量将取决于若干因素，包括但不限于所希望的生物活性、患者的状态、以及对药物的耐受性。

已参照特定具体实施例对本发明进行了描述，但描述的内容包括所有改进、修改和替代，在不偏离本发明的精神并在本发明的保护范围内，可以由本领域技术人员作出。

实施例

将通过下述实施例对本发明进行描述，其不应以任何方式作为是对本发明的限制。

实施例1.制备重组人干扰素α-1b

重组人干扰素α-1b(称作“IFNα-1b”或“rhIFNα-1b”)是通过大肠杆菌(E.coli)的发酵来制备的，该大肠杆菌经过基因工程处理以表达如图1所示的IFNα-1bDNA序列(序列识别号1、2、以及3)。收集并离心分离发酵细胞以形成细胞沉淀(cell pastes)。然后通过离子交换层析法、亲和层析法、以及分子筛层析法提纯IFNα-1b。IFNα-1b也可以获自商业来源。在某些实验中，IFNα-1b是由深圳科兴生物工程有限公司(Shenzhen Kexing Biotech.Co.，Ltd.，中国深圳)提供。

实施例2.mPEG(20kD)-IFNα-1b的制备

IFNα-1b与单链甲氧基聚乙二醇(mPEG(20kD)-MAL)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)的活化N-马来酰亚胺衍生物结合。该PEG聚合物的平均分子量为21.5KD。

IFNα-1b与单链mPEG(20kD)-马来酰亚胺的偶联

利用Amicon超滤器(350mL)以及YM-10膜(Millipore，Bedford，Mass.)把1克IFNα-1b超滤进50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。IFNα-1b的浓度最终稀释到大约1mg/mL。把mPEG(20kD)-MAL以3摩尔mPEG比1摩尔IFNα-1b的摩尔比过量加入到IFNα-1b溶液中，然后在室温下慢慢地搅拌溶液2小时。通过SDS-PAGE检测以确定反应的偶联程度。在这些条件下，在IFNα-1b的位点86上的半胱氨酸的游离巯基特异性地连接于mPEG(20kD)-MAL的活化马来酰亚胺基团，形成稳定的硫醚键。mPEG(20kD)-MAL的分子结构和Cys-特异性结合机理在图2A中表示。

偶联的最终产物包括以单PEG化IFNα-1b为主要成分、高分子量的PEG-IFNα-1b组分、未结合的IFNα-1b、以及mPEG(20kD)-MAL。

mPEG(20kD)-IFNα-1b的纯化

利用疏水作用层析法(HIC)把mPEG(20kD)-IFNα-1b从未偶联IFNα-1b和mPEG(20kD)-MAL分离出来，具体如下。把柠檬酸钠加入到偶联后溶液以达到0.4M的最终浓度。把该溶液装填到用缓冲液A(在50mM Tris中的0.4M柠檬酸钠，pH 6.8)平衡的Butyl Sepharose^TM 4Fast Flow(GE Healthcare，New Jersey)柱(5.0cm×13.5cm；柱床体积265mL)。该柱用5个柱体积的缓冲液A进行洗涤以除去未结合的IFNα-1b和mPEG(20kD)-MAL。利用线性梯度为0-50％10个柱体积的缓冲液B(50mM Tris，pH 6.8)洗脱单PEG化mPEG(20kD)-IFNα-1b。用280nm监测洗脱液的蛋白质成份。以30ml/min的流速对柱进行洗脱，然后收集mPEG(20kD)-IFNα-1b组分，并把总体积1150mL的mPEG(20kD)-IFNα-1b汇集一起。

利用体积排阻(分子筛)层析把单一PEG化IFNα-1b从高分子量组份分离出来。将从HIC汇集液透析过滤进缓冲液C(20mM乙酸钠/0.14M氯化钠，pH 6.0)，并浓缩至6-8mg/mL。然后把该浓缩液装填到用缓冲液C预平衡过的Superdex^TM 75(GE Healthcare，New Jersey)柱(16×53cm；柱床体积106mL)。以1ml/min的流速用缓冲液C洗脱单一PEG化IFNα-1b。用280nm监测洗脱液的蛋白质成份。收集mPEG(20kD)-IFNα-1b组分，并汇集总共20mL。在偶联和提纯后获得大约0.2克单一PEG化IFNα-1b，相当于大约20％的总产率。

实施例3.mPEG2(40kD)-IFNα-1b的制备

如实施例2中mPEG(20kD)-IFNα-1b制备方法所述IFNα-1b偶联于支链甲氧基聚乙二醇的活化N-马来酰亚胺衍生物{二[(甲氧基聚乙二醇)平均分子质量为40,000]的马来酰亚氨丙酰胺，修饰的甘油}(mPEG₂(40kD)-MAL)(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)。该PEG聚合物平均分子量为42.4KD。mPEG₂(40kD)-MAL的分子结构和Cys-特异性结合机理在图2B中表示。mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的纯化如在实施例2中所述。

实施例4：mPEG-IFNα-1b偶联物的鉴定

如下所述对mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b进行鉴定以确定这些偶联物的纯度和分子量。

SDS-PAGE分析

通过SDS-PAGE凝胶电泳测定了未结合IFNα-1b、mPEG(20kD)-IFNα-1b、以及mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的分子量。按照Laemmli的方法(Nature 227：680-685(1970))把相当于10μg未修饰IFNα-1b上样到4-12％BisTris NuPage凝胶(Invitrogen，Califomia)，用考马斯蓝染色进行显色。如图3所示，mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的表观分子量分别为49.7kD和74.6kD。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于结合了较长的线型PEG聚合物链，mPEG-IFNα-1b偶联物的表观分子大小显著地增加(与未修饰的球状IFNα-1b蛋白相比)。

SEC-HPLC分析

通过体积排阻-高效液相层析(SEC-HPLC)分析纯化的mPEG-IFNα-1b偶联物。HPLC层析系统是装备有Superose^TM 12HR(GE Healthcare，New Jersey)柱(10×300mm；颗粒大小10μm)的Hewlett-Packard系列1100分析型HPLC系统。流动相是0.1M磷酸钠/0.15M氯化钠，pH 6.0，而流速为0.5mL/min。在214nm条件下监测蛋白质信号。

如图4A-C所示，mPEG-IFNα-1b偶联物可从IFNα-1b和高分子量组份中分离出来。mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的表观分子量分别测定为312kD和769kD。在体积排阻层析中观察到的mPEG-IFNα-1b偶联物的流体动力学体积显著地增加(与球状IFNα-1b蛋白相比)，这是由于偶联着较长的线型PEG聚合物链。mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的纯度分别测定为98.9％和96.8％。

质谱测定法

通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)测定了mPEG-IFNα-1b偶联物的分子量，分子量的测定是在具有延迟引出的Applied Biosystems Voyager-DE质谱仪上进行的。辐照对具有芥子酸基质的试样板上的样品。用在337nm操作的氮激光器(Laser Science公司，Massachusetts)通过可变衰减器衰减激光束并聚焦于试样靶。用25,000V偏转电压加速在离子源产生的离子。然后利用飞行时间质谱分析器并依据其m/z鉴别这些离子。

图5A表示观察到的mPEG(20kD)-IFNα-1b(41.1kD)的主峰。较小的20.6kD峰表示相同的单PEG化IFNα-1b，其带有2个H⁺。19.4kD峰表示在样品中存在的剩余IFNα-1b。

图5B表示观察到的mPEG₂(40kD)-IFNα-1b(62.2kD)的主峰。较小的31.1kD峰表示相同的单PEG化IFNα-1b，其带有2个H⁺。19.4kD峰表示在样品中存在的剩余IFNα-1b。

通过不同方法测得的mPEG-IFNα-1b偶联物的分子量总结于表2。

表2.PEG化IFNα-1b偶联物的分子量

	IFNα-1bMW(kD)	mPEG(20kD)-IFNα-1bMW(kD)	mPEG2(40kD)-IFNα-1bMW(kD)
				PEG	-	21.5	42.4
预期(计算)	19.4	40.9	61.8
				MALDI-MS(绝对)	19.4	41.1	62.2
SDS-PAGE(表观)	18.4	49.7	74.6
				SEC-HPLC(表观)	21.5	312	769

CEX-HPLC分析

应用Monkarsh等(Anal.Biochem.247：434-440(1997)其结合于本文作为参考)的改进的高效阳离子交换层析方法分析了经提纯的mPEG-IFNα-1b偶联物，利用装备有TSK-GEL SP-5PW(Tosoh Bioscience，Pennsylvania)HPLC柱(7.5×75mm，10μm)的Hewlett-Packard 1100系列分析型HPLC系统。该柱用至少10个柱床体积的缓冲液A(5mM乙酸钠，pH 4.1)进行预平衡。mPEG-IFNα-1b偶联物上样，通过线性增长pH梯度(4.1至5.9)的0％至100％的缓冲液B(0.1M磷酸钠，pH 5.9)洗脱，流速为0.6mL/min，洗脱时间为120min。用波长为214nm的吸收峰对蛋白进行监测。

如图6A所示，未修饰的IFNα-1b(峰2)相当于92％以上的上样量。峰1和峰3的属性尚未确定。

如图6B所示，mPEG(20kD)-IFNα-1b(峰2)相当于90％以上的上样量。峰1和峰3的属性尚未确定。这些结果证实，mPEG-MAL的马来酰亚胺基团特异性地结合于IFNα-1b上残基Cys⁸⁶的游离巯基。未观察到多个位点异构体。

如图6C所示，mPEG₂(40kD)-IFNα-1b(峰2)相当于87％以上的上样量。峰1和峰3的属性尚未确定。这些结果证实，mPEG₂-MAL的马来酰亚胺基团特异性地结合于干扰素α-1b上残基Cys⁸⁶的游离巯基。未观察到多个位点异构体。

实施例5：Cys⁸⁶-特异性单PEG化的mPEG(20kD)-IFNα-1b的的结构确证

概述

用二硫苏糖醇(DTT)还原mPEG(20kD)-IFNα-1b，然后用碘乙酸进行S-羧甲基化。用蛋白内切酶Glu-C对S-羧甲基化mPEG(20kD)-IFNα-1b进行酶解。选择Glu-C酶解可产生5个含单-Cys肽段以及其他不含Cys的肽段。图7表示，通过用蛋白内切酶Glu-C肽谱以及通过N未端序列测定Cys⁸⁶-PEG化肽，证实用mPEG(20kD)-马来酰亚胺对IFNα-1b的Cys⁸⁶-特异性单-PEG化，其中Cys⁸⁶-PEG化肽分离自Glu-C酶解液。通过反相和体积排阻HPLC分析了分离Cys⁸⁶-PEG化肽的纯度，并通过SDS-PAGE和MALDI-MS分析了分离Cys⁸⁶-pEG化肽的分子量。最后通过N端肽序列测定确证分离所得的肽是在Cys⁸⁶残基上PEG化。

还原性烷基化和蛋白内切酶Glu-C的酶解

用5mg的mPEG(20kD)-IFNα-1b和5mg的IFNα-1b参照物进行缓冲液交换，缓冲液为0.3M Tris-HCl/6MGuanidinum盐/1mM EDTA(PH 8.4)蛋白终浓度为1mg/mL。加入DTT以还原IFNα-1b的二硫键。加入碘乙酸并在37℃下保温溶液20分钟以S-羧甲基化游离巯基。用pH 7.8的50mM碳酸氢铵(酶解缓冲液)对样品进行缓冲液交换。用蛋白内切酶Glu-C剪切S-羧甲基化mPEG(20kD)-IFNα-1b，酶与蛋白的比率为1∶10(w/w)，酶解缓冲液的温度为25℃。

肽图分析

用反相HPLC分析蛋白内切酶Glu-C的酶解混合物，HPLC系统用Hewlett-Packard 1100系列分析型HPLC仪，反相柱为C8-HPLC(Vydac，California)柱(4.6×250mm，5μm)。用214nm的吸收峰对肽进行检测。用流动相A(H₂O/0.1％TFA)和流动相B(10％H₂O/90％乙腈/0.1％TF)，以分步梯度系统来分离肽段：

时间(min)	0	70	80	82	85	100
							B％	0	80	92	92	0	0

对未修饰IFNα-1b参照物(图8A)和mPEG(20kD)-IFNα-1b(图8B)的肽图指纹图谱进行比较，观察含未修饰Cys⁸⁶肽的消失和Cys⁸⁶-PEG化肽出现。如图8A所示，观察到的29.1分钟峰，是对应于含未修饰Cys⁸⁶肽。如图8B所示，在29.1分钟峰消失的同时，出现在43.7分钟的新峰(在分开的实验中，类似于mPEG(20kD)-MAL的保留时间)被确定是PEG化肽。含Cys⁸⁶肽的29.1分钟的保留时间增加到Cys⁸⁶-PEG化肽的43.7分钟的保留时间主要由附着较大的非极性PEG聚合物所引起。该PEG聚合物显著降低了含Cys⁸⁶小肽的极性。比较肽图的指纹图谱，仅观察到这个显著差异，这表明单-Cys⁸⁶残基被PEG化。

Cys⁸⁶-PEG化肽的分离

如上所述，通过反相C8-HPLC层析，从蛋白内切酶Glu-C酶解液中分离出Cys⁸⁶-PEG化肽(43.7分钟峰)，用Superose^TM 12 HR柱(GE Healthcare，New Jersey)体积排阻HPLC层析进一步提纯。用SDS-PAGE和MALDI质谱测量其分子量，证实是Cys⁸⁶-PEG化肽。用SDS-PAGE、反相、和分子筛HPLC层析，确定Cys⁸⁶-PEG化肽的纯度后，进行N段肽序列测定。

N端肽序列测定

采用Edman方法(Edman，Acta Chem.Scand.4：283(1950)，其结合于本文作为参考)，用ABI Procise^_494序列分析仪对上述肽图分离所得的Cys⁸⁶-PEG化肽进行N端序列测定，确定其氨基酸序列。序列分析仪把精确容积的试剂输送到一个卡式装置上，在此处，多肽被固定于PVDF膜上。在每个循环，PTH-氨基酸被转移到HPLC用于分析和定量。

对肽进行了16个循环的序列测定。检测所得肽序列有：

H2NCycle：Detected：

-Ser731+

-Ser742+

-ALa753+

-Ala764+

-Trp775+

-Asp786+

-Glu797+

-Asp808+

-Leu819+

-Leu8210+

-Asp8311-

-Lys8412+

-Phe8513+

-Cys8614-

-Thr8715+

-Glu88

-COOH

在所用的酶解条件下，Glu-C在干扰素分子的Asp⁷²和Glu⁸⁸残基进行剪切，产生含有PEG的Ser⁷³-Glu⁸⁸肽。

还观察到，连接于蛋白的长线型PEG聚合物分子可屏蔽干扰素蛋白上的Glu⁷⁹残基，免于被蛋白内切酶Glu-C剪切。

在第14个循环，未检测出Cys⁸⁶，说明Cys⁸⁶在位置86被PEG化。

实施例6.通过WISH-VSV细胞病变抑制法测定来确定mPEG-IFNα-1b偶联物的体外抗病毒活性

用受到水泡性口炎病毒(VSV)攻击的WISH细胞(人羊膜细胞)作为致细胞病变测试法(Rubinstein et al.，J.Virol.37：755，1981)，确定IFNα-1b和PEG化IFNα-1b偶联物的体外抗病毒活性。在此WISH-VSV测定中使用的材料包括WISH细胞(ATCC，Rockville，Maryland)、VSV病毒(ATCC，Roekville，Maryland)、IFNα-1b和PEG化IFNα-1b偶联物，用实施例1、2、以及3中描述的方法制备所得。

用生长培养基(DMEM，2mM L-谷氨酰胺，10％FBS)连续两次稀释的干扰素样品加入96孔细胞培养板中。每孔接种2.5×10⁴WISH细胞，并在37℃、5％CO₂下温育18-24小时。然后用10⁷噬斑形成单位(pfu)的水泡性口炎病毒感染这些细胞并在37℃下再温育24小时。用XTT比色测定法(Roche Applied Science，Indiana)分析样品并确定细胞增殖。

干扰素的抗病毒活性定义是为获得致细胞病变作用的50％抑制(IC₅₀)所需要的干扰素浓度(mg/mL)。干扰素样品的比活性是通过比较干扰素样品的IC₅₀值和作为参照标准的IFNα-2b(WHO)的IC₅₀值(作为内参照标准)，并按照下述公式加以计算：

[IC₅₀参照标准(U/ml)]/[IC₅₀样品(mg/ml)]

来自体外抗病毒测定的结果列于下面的表4。

表4.IFNα-1b和mPEG-IFNα-1b偶联物的体外抗病毒活性*

	比活(IU/mg)	IFNα-1b的留存效价(％)
			IFNα-1b	1.11±0.27×107(n＝4)	100
mPEG(20kD)-IFNα-1b	1.73±0.25×105(n＝3)	1.6
			mPEG2(40kD)-IFNα-1b	2.40±0.29×105(n＝3)	2.2

mPEG(20kD)-IFNα-1b具有大约1.6％的留存IFNα-1b活性。mPEG₂(40kD)-IFNα-1b具有大约2.2％的残余IFNα-1b活性。SEC-HPLC分析结果(实施例4)表明，mPEG₂(40kD)-IFNα-1b制备产物具有相对高含量的未修饰IFNα-1b。在此细胞病变性作用测定中，PEG化干扰素降低抗病毒活性，可能产生于PEG聚合物的附着(其缠绕在干扰素分子的表面)，从而阻止干扰素与WISH细胞的配体/受体相互作用。然而，PEG化干扰素的体外活性并不一定反映体内药理活性，因为在循环中PEG部分可从干扰素中除去，从而展现分子的活性形式。没有希望本发明限制于一种学说或作用方式，相同机理可能是导致PEG化干扰素在体内稳定性增加(参见下面的实施例7)，而在体外观察到的活性低水平的原因。对于其他PEG化干扰素产品，如PEG化IFNα-2a(参见如，Bailon etal，Bioconjugate Chem.12：195-202(2001))和PEG化IFNα-2b(参见如，Wang et al，Advance Drug Delivery Rev.，54：547-570(2002))，在WISH测定中也观察到体外生物活性的降低，。

实施例7：大鼠的药代动力学研究

通过实施示于表5的药代动力学研究方案测定用上述方法制备的未修饰IFNα-1b、mPEG(20kD)-IFNα-1b、以及mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物的药代动力学参数。

表5.评估药代动力学参数的研究方案

	IFNα-1b	mPEG(20kD)-IFNα-1b	mPEG2(40kD)-IFNα-1b
				大鼠	6	6	6
剂量(IFN蛋白μg/kg)	208	1000	1000
				途径	皮下(S.C.)	皮下(S.C.)	皮下(S.C.)
给药	一次	一次	一次
				时点(hr)	0.08，0.17，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，8，12	0.5，2，8，12，24，48，72，96，120，144，168	0.5，2，8，12，24，48，72，96，120，144，168
测定	ELISA免疫法测定在不同时点大鼠血清中的IFNα-1b量

用6只大鼠组成为对照组，每一只大鼠皮下注射剂量208μg IFNα-1b/Kg体重。分别用6只大鼠组成两个试验组，每一只大鼠皮下注射剂量为1000μg(相当于IFNα-1b剂量的蛋白)的mPEG-IFNα-1b偶联物/Kg体重。在一次皮下给予试验蛋白后，在11个时点从大鼠尾部的静脉丛收集血样。用微离心从全血中分离血清样品，收集所有样品在-80℃冻存。用人干扰素α-特异性ELISA免疫测定法(PBL Biomedical Laboratories，Piscataway，N.J.)定量测定了血清中的干扰素α。该免疫测定法与大鼠IFN-α不发生交叉反应。

mPEG-IFNα-1b偶联物的药物动力学曲线示于图9而主要药物动力学数据则总结于表6。

表6.在对大鼠一次皮下给药以后mPEG-IFNα-1b的药物动力学参数

		平均值
					参数	单位	IFNα-1b	mPEG(20kD)-IFNα-1b	mPEG2(40kD)-IFNα-1b
PEG-偶联	MW	-	20kD(单链)	40kD(支链)
					AUC(0-t)	μg·h·mL-1	113.9	5135.7	8527.3
Cmax	μg·mL-1	36.9	82.7	88.4
					Tmax	h	0.7	14.7	19.3
t1/2(β)	h	3.4	30.9	30.7
					MRT	h	3.0	45.5	61.3
CL/F	mL·h-1·kg-1	1.7	0.2	0.1

mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物的主要药代动力学参数均显著不同于对未修饰的IFNα-1b药代动力学参数。与未修饰IFNα-1b的曲线下面积(AUC)相比，mPEG(20kD)-IFNα-1b的AUC增加了45倍，而mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的AUC则增加了75倍。与未修饰IFNα-1b的T_max相比，mPEG(20kD)-IFNα-1b的T_max增加了20倍，而mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的T_max则增加了25倍。两种mPEG-IFNα-1b偶联物的t_1/2(β)均增加了9倍。

在mPEG(20kD)-IFNα-1b和mPEG₂(40kD)-IFNα-1b偶联物之间，T_max和t_1/2(β)的值没有统计意义上的显著差异。然而，mPEG₂(40kD)-IFNα-1b的AUC、MRT、以及CL/F值显著高于mPEG(20kD)-IFNα-1b。

实施例8：mPEG-IFNα-1b的体内抗肿瘤活性

用埋植了人肿瘤细胞的小鼠，测定了mPEG(20kD)-IFNα-1b和干扰素α-1b的体内抑制肿瘤生长性能。无胸腺Balb/C裸鼠接收皮下埋植2×10⁶人肾肿瘤ACHN细胞(ATCC，Rockville，Maryland)。需要3周形成肿瘤。用50μg、150μg、以及300μg mPEG(20kD)-IFNα-1b的三种剂量针对小鼠侧腹部进行每周一次(星期一)的皮下注射，或用50μg的IFNα-1b进行每周三次(星期一、星期三、以及星期五)皮下注射(表7)。对小鼠治疗五周。每星期一在治疗前测量肿瘤体积。

表7.体内抗肿瘤活性的评估和肿瘤体积的测量结果

组	试验药物	小鼠	剂量/小鼠(IFN蛋白μg)	注射(皮下)/Wk	在第五周的肿瘤体积(cm3)
						1	安慰剂	6	-	1	1.00±0.37
2	PEG-IFNα-1b	6	50	1	0.46±0.30
						3	PEG-IFNα-1b	6	150	1	0.36±0.13
4	PEG-IFNα-1b	6	300	1	0.27±0.13
						5	IFNα-1b	6	50	3	0.39±0.07

如图10所示，与安慰剂(赋形剂)对照组相比，在治疗的最初四周内，mPEG(20kD)-IFNα-1b和IFNα-1b显著抑制埋植入ACHN肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长。在治疗的第五周，观察到mPEG(20kD)-IFNα-1b对抑制肿瘤生长的初期剂量效应。每周一次注射150μg的mPEG(20kD)-IFNα-1b和每周三次注射50μg的IFNα-1b对抑制肿瘤生长是近似的。

对本发明现已进行了充分描述，本领域技术人员将认可，在等效参数、浓度、以及条件的广泛范围内，无需过多的实验可以实施本发明而不偏离本发明的精神和范围。

虽然对本发明具体实施例已进行了特定描述，但应当理解，本发明可作进一步的改进。本申请是用来涵盖通常发明原则下本发明的任何变化、应用、或采用，以及包括所披露的内容的偏离作为本发明所属技术领域内已知或习惯实践的范围，以及作为应用于上文陈述的基本特点，进一步设定作为在所附权利要求所述的范围。

本文引用的所有参考文献，包括杂志论文或摘要、公开或未公开的美国或国外专利申请、发布的美国或国外专利、或任何其他参考文献，结合于本文作为参考，包括所有在引用文献中提供的数据、表格、附图、以及正文。另外，本文引用参考文献所引用的参考文献的内容也结合于本文作为参考。

参照已知方法步骤、传统方法步骤、已知方法或传统方法，决不是承认：本发明的任何方面、描述、或具体实施例是在相关技术领域中已披露、指导、或建议的内容。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (37)

1.一种多元醇-干扰素α偶联物，所述偶联物具有一个多元醇部分，所述多元醇部分共价结合在人干扰素α-1b的Cys⁸⁶。

2.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b分离自人细胞或组织。

3.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b是重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b在宿主中表达，所述宿主选自由细菌细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、以及转基因动物组成的组。

5.根据权利要求2或权利要求3所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b具有在SEQ ID No.2号中表示的氨基酸序列。

6.根据权利要求2或权利要求3所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b由具有在SEQ ID No.1号中表示的DNA序列的多核甘酸加以编码。

7.根据权利要求2、3、5中任一项所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述干扰素α-1b包括变异体、同源物、直系同源物、衍生物、类似物、生物性的或药用性的活性片段、和突变体。

8.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述多元醇部分是聚乙二醇部分。

9.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述多元醇部分是聚亚烷基二醇部分。

10.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述多元醇部分具有直链结构或支链结构。

11.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述多元醇-干扰素α-1b偶联物具有与天然人干扰素α-1b相同或更高的体内干扰素α活性。

12.根据权利要求1所述的多元醇-干扰素α偶联物，其中，所述多元醇-干扰素α-1b偶联物具有均一的分子量。

13.一种药物组合物，包括具有多元醇部分共价结合于人干扰素α-1b的Cys⁸⁶的多元醇-干扰素α偶联物、以及药用辅剂。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述多元醇部分是聚乙二醇部分。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述多元醇部分是聚亚烷基二醇部分。

16.一种制备多元醇-干扰素偶联物的方法，包括下述步骤：

提供干扰素，其中所述干扰素包括单一游离半胱氨酸；

提供马来酰亚胺多元醇；

用所述马来酰亚胺多元醇接触所述干扰素，

其中，所述马来酰亚胺多元醇与所述游离半胱氨酸形成共价硫醚键，从而制备多元醇-干扰素偶联物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述干扰素是人α干扰素。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述α干扰素是分离自人细胞或组织。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，所述α干扰素是重组人干扰素α-1b。

20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述干扰素选自由天然存在干扰素、基因工程干扰素、以及嵌合干扰素组成的组。

21.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，其中人干扰素α-1b包括变异体、同源物、直系同源物、衍生物、类似物、生物性的或药用性的活性片段、和突变体。

22.根据权利要求16所述的方法，其中，半胱氨酸残基包括单游离巯基。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述干扰素进一步包括二硫键连接的残基。

24.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中，所述人干扰素α-1b的Cys⁸⁶包括单一游离巯基。

25.根据权利要求21所述的方法，其中，所述人干扰素α-1b包括变异体、同源物、直系同源物、衍生物、类似物、生物性的或药用性的活性片段、突变体，具有单一游离巯基的半胱氨酸。

26.一种调节由干扰素α介导的过程的方法，包括给予患者有效量的多元醇-干扰素α偶联物，该述多元醇-干扰素α偶联物与根据权利要求1所述的一致，并由根据权利要求16所述方法制备。

27.多元醇-干扰素α-1b偶联物在制备用于治疗α干扰素-反应状态或疾病的药物中的应用。

28.根据权利要求27所述的应用，其中，所述反应状态、疾病包括：炎性病症、病毒感染、细菌感染、或癌症。

29.根据权利要求28所述的应用，其中，所述反应状态、疾病为细菌感染。

30.根据权利要求28所述的应用，其中，所述病毒感染包括丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、或HIV感染。

31.根据权利要求28所述的应用，其中，所述炎性病症是多发性硬化、关节炎、哮喘、囊性纤维化、或间质性肺病。

32.根据权利要求28所述的应用，其中，所述癌症选自骨髓瘤、淋巴癌、肝癌、乳房癌、黑素瘤、以及毛样细胞白血病。

33.一种用于提纯多元醇-干扰素α-1b偶联物的方法，包括以下步骤：

(a)用疏水性相互作用层析树脂接触多元醇-干扰素α-1b偶联物以使所述多元醇-干扰素α-1b偶联物结合于所述层析树脂；

(b)从所述疏水性相互作用层析树脂洗脱收集所述多元醇-干扰素α-1b偶联物；

(c)将经洗脱的多元醇-干扰素α-1b偶联物施加到分子筛层析柱；以及

(d)从所述分子筛层析柱收集经提纯的多元醇-干扰素α-1b偶联物，从而提纯所述多元醇-干扰素α-1b。

34.根据权利要求33所述的方法，在步骤(c)所述分子筛层析之前还包括一个浓缩步骤，把步骤(b)洗脱收集的多元醇-干扰素α-1b偶联物进行浓缩。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述浓缩步骤包括超滤和透析。

36.根据权利要求33所述的方法，其中，所述疏水性相互作用层析树脂是丁基琼脂糖树脂。

37.根据权利要求33所述的方法，其中，所述分子筛层析柱包括交联琼脂糖、右旋糖酐、或其混合物。

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