CN102584979A - PEG化干扰素λ - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PEG化的III型干扰素，即PEG化干扰素λ，通过硫醇反应性聚乙二醇试剂与IFN-λ中的游离半胱氨酸残基实现定点修饰，得到均一的PEG-IFN-λ，本发明得到的PEG-IFN-λ，在体内可以至少保留原有IFN-λ的活性，并具有更长的半衰期。
Description
技术领域
本发明涉及聚乙二醇化的Ⅲ型干扰素（即PEG-IFN-λ），其中聚乙二醇和Ⅲ型干扰素中的游离半胱氨酸的巯基共价结合。
背景技术
干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。哺乳动物的干扰素可以分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，干扰素已用来治疗许多疾病，包括病毒感染（如丙肝、乙肝、HIV）、炎症性病症以及癌症（如骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、乳房癌、黑色素瘤、白血病等）。
II类细胞因子受体典型地是异二聚体，由两个不同的受体链，即α和β受体亚基组成（Stahl等，cell，74,587-590，（1990））。一般地，α亚基是主要的细胞因子结合蛋白，而β亚基是形成高亲和结合位点以及进行信号肽转导所必需的。II类细胞因子受体可以通过受体的细胞外部分中大约200个氨基酸（D200）的保守细胞因子结合域来鉴定。
从治疗的角度出发，干扰素尤其有意义（关于干扰素的综述见De Maeyer和De Maeyer-Guignard，“干扰素”，《细胞因子手册》（The Cytokine Handbook）,第三版，Thompson（编），第491-516页（Academic Press Ltd. 1998）和Walsh, Biopharmaceuticals:
Biochemistry and Biotechnology,第158-188页（John Wiley&Sons 1998））。干扰素显示出多种生物学活性，可用于治疗某些自身免疫性疾病和增强对感染剂（包括病毒、细菌、真菌和原生物）的免疫应答。迄今，已经鉴定到6种形式的干扰素，它们分为三个大组。所谓的“I型”干扰素包括干扰素α、干扰素β、干扰素ω、干扰素δ、干扰素τ。目前，干扰素γ和干扰素α的一个亚类是仅有的II型干扰素。III型干扰素是最近发现的一类细胞因子家族，包括干扰素λ1、λ2和λ3，也称为IL-28A、IL-28B和IL-29。
I型干扰素被认为来源于相同的祖先基因，保留了充分相似的结构以致可以通过相同的细胞表面受体起作用。人干扰素α/β受体的α链包含N端细胞外域，其具有II类细胞因子受体的特征。干扰素γ与I型干扰素或II型干扰素α亚型没有显著同源性，但与I性干扰素有许多相同的生物学活性。
IL-28A、IL-28B和IL-29包含最近发现的新蛋白家族，所述蛋白质家族与I型干扰素有序列同源性，并与IL-10有基因序列的同源性。该新家族在共同所有的PCT申请WO 02/086087和Sheppard等，Nature Immunol.
4:63-68,2003（全文都纳入本文参考）中有详细的描述。从功能上说，IL-28和IL-29类似于I型干扰素，均能诱导细胞中的抗病毒状态，与I型干扰素不同的是，它们不显示出抗某些B细胞系的抗增殖活性。
已知IL-28和IL-29具有奇数个半胱氨酸（PCT申请WO 02/086087和Sheppard等，同上）。IL-28和IL-29的重组表达会导致形成蛋白质的非均一混合物，所述蛋白质包括多种构型的分子内二硫键，这些不同构象的异构体很难获得完全分离。
IL-28A（对应于干扰素λ2）有7个半胱氨酸残基，氨基酸残基第48位的半胱氨酸为游离半胱氨酸残基，可以形成分子间二硫键，尤其是和其它的IL-28A分子形成同二聚体，基于多重比对的IL-28A进一步分析预测，氨基酸残基第16和115位、第50和148位、以及第167和174位的半胱氨酸，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在序列SEQ ID NO:3中将形成分子内二硫键，编码本文所述的IL-28A多肽区域、域、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:4中。
IL-28B（对应于干扰素λ3）同样也有7个半胱氨酸残基，氨基酸残基第48位的半胱氨酸为游离半胱氨酸残基，可以形成分子间二硫键，尤其是和其它的IL-28B分子形成同二聚体，基于多重比对的IL-28B进一步分析预测，氨基酸残基第16和115位、第50和148位、和第167和174位的半胱氨酸，其该蛋白质成熟氨基酸显示在序列SEQ ID NO:5中将形成分子内二硫键，编码本文所述的IL-28B多肽区域、域、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:6中。
IL-29（对应于干扰素λ1）分子具有5个半胱氨酸残基，基于多重比对进行的IL-29的进一步分析预测，氨基酸残基第49和145位，及第112和171位的半胱氨酸将形成分子内二硫键，第15位的半胱氨酸是游离的，可以形成分子间二硫键，该蛋白质成熟氨基酸序列显示在SEQ ID NO:1中，编码本文所述的IL-29多肽区域、域、基序、残基和序列的相应多核苷酸显示在SEQ ID NO:2中。
蛋白治疗药物的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍在临床治疗上的应用，其它治疗蛋白的研究已经表明，通过使蛋白质与聚合物例如聚乙二醇（PEG）缀合，通过治疗蛋白和PEG两者共价结合的连接部分可以显著延长治疗蛋白在血浆中的半衰期。
这种PEG缀合的生物分子已经显示具有临床上的可应用特性（Inada等，J. Bioact. and Compatible
Polymers, 5:343(1990); Delgado等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,
9:249(1992);和Katre, Advanced Drug
Delivery Systems, 10:91(1993)）。在这些特性中有更好的物理和热稳定性、针对酶降解敏感性的保护作用、溶解度增加、使体内循环半寿期更长和清除率减少、降低免疫原性和抗原性以及降低毒性。
将亲水性多聚物聚乙二醇（PEG）（也称作聚环氧乙烷）与分子共价结合时生物技术和医学上的重要应用。PEG在其最常见形式下是在各末端具有羟基基团的线性多聚物：
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
该分子式能简单的代表为HO-PEG-OH，其中指-PEG-代表没有末端基团的多聚物主链：
“-PEG-”指“-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-”。
PEG通常用作甲氧基-PEG-OH，其中一个末端是相对惰性的甲氧基基团，而另一个末端是要化学修饰的羟基基团。
CH3O- (CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
也常用支链PEG。支链PEG可以表示成R(-PEG-OH)m，其中R代表例如季戊二醇或丙三醇的中央核心分子，而m代表支化臂的数目。支化臂的数目（m）能从3变化到100或更多，羟基基团要进行化学修饰。
其它如PCT专利申请WO 96/21469所述的支链形式具有要进行化学修饰的单个末端，这种PEG类型能表示成(CH3O-PEG-)pR-X，其中p等于2或3，R代表例如赖氨酸或丙三醇的中央核心，而X代表如能进行化学活化的羧基的功能性基团。而另一个支链形式，“测基PEG”具有如羧基（其主要在PEG主链上而不是在PEG链末端）的反应性基团。
除了PEG的这些形式，也能用在主链中的弱键或可降解来制备多聚物。例如，Harris已在美国专利申请06/026716中显示能多聚物主链中可进行水解的酯键来制备PEG。该水解（反应）导致多聚物被切成较小分子量的片段。
根据本发明，术语聚乙二醇或PEG指包括所有上述衍生物。
环氧乙烷和环氧丙烷的共多聚物在其化学上和PEG密切相关，而且它们能用来代替PEG的许多应用，它们具有以下通式：
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH
其中，R是H或CH3。
PEG是具有高水溶性以及在许多有机溶剂中具有高溶解性的有用的多聚物。PEG无毒性也无免疫原性，当PEG和水不溶性化合物化学结合（PEG化）时，得到的偶联物通常是水溶性的，以及在许多有机溶剂中是可溶的。
已使用的水溶性多聚物如乙二醇、丙二醇共聚物，羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环(poly-1,3-dioxolane)，聚-1,3,6-三恶烷、乙烯马来酸酐共聚物，多聚氨基酸（或者单一聚体或者随机共聚体）。
目前，已使用的治疗性PEG-蛋白偶联物包括：PEG化的腺苷脱氢酶（ADAGEN®，Enzon Pharmaceuticals），用于治疗重症联合免疫缺陷病；PEG化的L-天冬氨酰胺酶（ONCAPSPAR®，Enzon Pharmaceuticals），用于治疗急性淋巴细胞白血病；PEG化干扰素α-2b（PEG-INTRON®，Schering Plough）、PEG化干扰素α-2a（PEGASYS®，Roche）以及PEG化的共有干扰素PEG-CIFN（Amgen），用于治疗肝炎。关于具有临床疗效的PEG-蛋白偶联物的一般综述参见Burnham，Am. J. Hosp. Pharm.，15:210-218(1994)。
对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的来说，聚乙二醇分子是通过一个在蛋白质分子上发现的反应基团而联到蛋白质分子上。氨基，如赖氨酸残疾上的或N-末端上的氨基通常用于这类附着，例如，Royer（US4002531）认为可利用还原性烷基化反应将聚乙二醇分子附着到酶上。Wright于1993年4月28日公开的EP0539167，“Peg Imidates and Protein
Derivates Thereof”中认为带有自由氨基酸的肽及有机复合物可被PEG的直接衍生物或有关的水溶性有机多聚体所修饰。Shaw在1990年2月27日公开的美国专利号US4904584中涉及修饰蛋白质中用于通过反应性氨基基团附着聚乙二醇分子的赖氨酸残疾的数目。
通常，这些偶联物包括每个蛋白质分子结合的PEG分子数从0到蛋白质中氨基基团数变化的偶联物，对于已经单独修饰的蛋白质分子，PEG单元可以结合在许多不同的胺位点上。
对于不同的蛋白，在其游离的Cys残基上偶联时，偶联后的蛋白活性的保留率相差甚大，有的甚至完全失活。活性减弱通常是由于如同在许多细胞因子和抗体中一样，屏蔽了蛋白质的活性结合功能域所致。例如，Katre等在美国专利4766106和美国专利4917888中描述了用超量许多的甲氧基-聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基戊二酸和甲氧基-聚乙二醇基-N-琥珀酰亚胺基琥珀酸PEG化IFN-β和IL-2。两种蛋白质都是在微生物宿主细胞中产生的，其允许自由半胱氨酸位点特异性突变为丝氨酸，突变在IFN-β的微生物表达中是必需的，以促进蛋白折叠，具体的，这些试验中所用的IFN-β是商业产品Betaseron®，其中Cys17被丝氨酸替换。另外，无糖基化减弱了它在水溶液中的可溶性，非特异性PEG化导致可溶性提高，但主要问题是活性和产量的水平降低。中国专利CN1754889A对干扰素α-1b采用PEG在其Cys86上进行定向偶合，其体外活性保留率仅为干扰素α-1b的1.6%-2.2%，但其在体内可以获得与α-1b相当或更高的活性。
欧洲专利申请EP593868描述了PEG-IFN-α的制备，然而，PEG化反应不是位点特异性的，并因此获得了PEG-IFN-α偶联物位置异构体的混合物（也见Monkarsh等，ACS. Symp. Ser.，680:207-216,1997）。
Kinstler等在欧洲专利申请EP675201中演示了用mPEG-丙醛对巨核细胞生长和发育因子（MGDF）的N-末端残基的选择性修饰，这考虑到批次之间可重复性PEG化合物的代谢动力学。Gilbert等在美国专利5711944中证明能产生具有最适合水平；活性的IFN-α的PEG化，在该例中需要费力的纯化步骤来获得最适偶联物。
在PCT/US2004/025864中公开了一种IL28和IL29的均一化制剂，在该申请中，IL-28和IL-29的PEG化是在其N-末端上的氨基进行PEG化，反应在使其能利用蛋白质的赖氨酸残基的ε氨基和N-末端的α氨基之间的pKa差异的pH下进行，通过该选择性衍生作用，可控制诸如醛（如甲氧基聚乙二醇丙醛）等反应性基团的水溶性聚合物与蛋白质连接，与聚合物的缀合主要发生在蛋白质的N-末端上，而不显著修饰其它反应性基团，如赖氨酸侧链氨基。
Woghiren等在Bioconjugate Chem.，4（5）：314-318,1993中为这样的位点特异性PEG化合成了硫醇选择性PEG衍生物，显示了稳定的硫醇保护的PEG衍生物以二硫对吡啶反应基团的形式与蛋白质木瓜蛋白酶的自由半胱氨酸特异性偶联，木瓜蛋白酶和PEG酯键新形成的二硫键能在温和的自由半胱氨酸特异性偶联。木瓜蛋白酶和PEG酯键新形成的二硫键能在温和降解条件下被切开，以再生天然蛋白。
仍然需要提供一种经位点特异修饰的PEG-IFN-λ偶联物，及其制备方法，以补充适用于治疗人类各种相应疾病的长效干扰素类药物，以适应不同患者及医者需求。
发明概述
本发明涉及一种多肽偶联物，所述多肽是III型干扰素（即干扰素λ）具体是一种PEG-IFN-λ偶联物，通过硫醇反应使聚乙二醇（PEG）试剂与IFN-λ中的游离半胱氨酸残基反应获得特异性偶联物，所得产物中，PEG实现在游离半胱氨酸定点修饰，得到分子量均一的PEG-IFN-λ。较未PEG化的IFN-λ相比，所得的PEG-IFN-λ具有可溶性、稳定性提高、免疫原性减弱，体外可保留天然IFN-λ约8%的活性，活性留存率较高，且其在体内与天然的IFN-λ比较，单位时间内的曲线下面积显著（AUC）增加、并具有更为长效的功能。
具体地，本发明涉及：
1、多元醇-肽偶联物，所述偶联物包括：
(a)
多肽部分；和
(b)
与该多肽部分共价相连的非多肽部分；
其中，所述多肽是具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5至少90%序列同一性的氨基酸序列，且所述多肽的序列上，至少存在一个游离的半胱氨酸残基，所述非多肽部分为多元醇，所述非多肽部分共价连接到所述多肽部分的游离半胱氨酸残基上。
2、项1中所述的偶联物，其中所述的多元醇是聚乙二醇。
3、项2所述的偶联物，其中所述的聚乙二醇是直链或支链的聚乙二醇。
4、项1中所述的偶联物，所述偶联物具有均一的分子量。
5、一种制备项1-4中任意一项所述偶联物的方法，包括如下步骤：用硫醇反应性多元醇剂和所述多肽反应，所述多肽具有单一游离的半胱氨酸酸残基，所述多元醇试剂和所述多肽的位点特异性共价结合，形成共价硫醚键，得到多元醇-多肽偶联物，回收纯化产生的目的多元醇-多肽偶联物，即得。
6、项5所述的方法，其中所述硫醇反应性多元醇是硫醇反应性PEG化剂。
7、项5或6所述的方法，所述的硫醇反应性多元醇剂是单甲氧基化的。
8、项5或6所述的方法，其中所述的硫醇反应性多元醇是具有选自二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺的官能团的多元醇衍生物。
9、项5或6所述的方法，所述的硫醇反应性多元醇剂的分子量为10-50 kDa；项8中的单甲氧基化的硫醇反应性多元醇剂的分子量为10-50 kDa。
10、一种药物组合物，该组合物包括项1至4中任意一项所述偶联物作为活性成分，和药学上可接受的载体、赋形剂或辅料。其中所述偶联物是多元醇-多肽偶联物，更具体为多元醇-IFN-λ偶联物。
11、项1至4中任意一项所述偶联物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。
12、项10所述组合物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。
13、一种预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症的犯法，包括给哺乳动物施用有效量的项1-4所述偶联物或项10所述的组合物。
14、一种药物组合物，用于预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症，白组合物包括项1-4中所述偶联物，优选为PEG-IFN-λ偶联物，和其它用于具有预防和治疗病毒或增强机体免疫的药物。
15、一种试剂盒，包含装有本发明所述偶联物或药物组合物的容器和使用所述偶联物或其药物组合物预防和治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症的说明书。
以上各项中，所述多元醇为聚乙二醇，其中聚乙二醇可以是直链或支链的聚乙二醇。
附图说明
图1为pET30a-IFN-λ1质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a-IFN-λ1质粒NdeI单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN-λ1质粒NdeI+XhoI双酶切产物，泳道3为DL2000 plus Marker。
图2为pET30a-IFN-λ2质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a-IFN-λ2质粒NdeI单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN-λ2质粒NdeI+EcoRI双酶切产物，泳道3为DL2000 plus Marker。
图3 为pET30a-IFN-λ3质粒酶切鉴定图，其中泳道1为pET30a-IFN-λ3质粒NdeI单酶切产物，泳道2为pET30a-IFN-λ3质粒NdeI+HindIII双酶切产物，泳道3为DL2000 plus Marker。
图4为层析纯化后的IFN-λ电泳检测图（15%的Tricine-SDS-PAGE电泳），其中泳道1、2、3分别为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3纯化后5μg样品电泳图；泳道4为低分子量蛋白质Marker。
图5为IFN-λ mPEG10kDa-MAL修饰后的电泳检测图（12%SDS-PAGE电泳），其中泳道1、2、3分别为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3纯化后的10μg样品，泳道4为低分子量蛋白质Marker。
图6为IFN-λ mPEG20kDa-OPSS修饰后的电泳检测图（12%SDS-PAGE电泳），其中泳道1、2、3分别为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3纯化后的8μg样品，泳道4为低分子量蛋白质Marker。
图7为IFN-λ在HepG2细胞中抗EMCV病毒效果图。
图8为PEG修饰的IFN-λ在HepG2细胞中抗EMCV病毒的相对影响效果图。
图9为PEG干扰素在HepG2细胞中抗HCV病毒RNA复制的效果图。
发明详述
本发明的目的之一在于提供一种多元醇-多肽偶联物，该多元醇-多肽偶联物包括活性多肽部分，所述多肽是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，且在所述多肽序列上，保留具有至少一个游离的半胱氨酸残基；该多元醇-偶联物还包括共价连接在所述活性多肽上的非多肽部分，所述非多肽部分为多元醇，非多肽部分的多元醇通过与活性多肽上的游离半胱氨酸残基特异性偶联，得到分子量均一的多元醇-多肽偶联物。
本发明中，所述多肽序列，优选与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，更优选为具有至少95%、或者更优选为具有至少97%、98%、99%序列同一性的氨基酸序列。
更为具体地，本发明提供了一种多元醇-IFN-λ偶联物，所述多元醇为聚乙二醇，多元醇与IFN-λ上的游离半胱氨酸残基进行共价键合，实现多元醇在IFN-λ上定点修饰。IFN-λ包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，分别对应的成熟氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5，在这些λ干扰素中，均具有一个游离的半胱氨酸残基，比如IFN-λ1在其成熟氨基酸序列的第15为半胱氨酸Cys是游离的，IFN-λ2和IFN-λ3的成熟氨基酸序列的第48位半胱氨酸Cys是游离的，多元醇与这些游离的Cys可实现特异性偶联。
IFN-λ，如本文所使用，指一种III型干扰素，可以从生物液中分离获得的，或用DNA重组技术从原核或真核宿主细胞获得的人成纤维细胞干扰素，这些原核和真核宿主细胞包括但不限于细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、转基因动物、转基因植物、昆虫细胞，人白细胞干扰素（或人成纤维细胞干扰素）包括但不限于其盐、功能性衍生物、前体和活性片段，规定其含有天然存在形式的半胱氨酸残基。
本发明活性多肽IFN-λ，也可以是IFN-λ多肽类似物，这些类似物可以通过提供功能等效分子的取代、添加、或缺失来改变蛋白质序列而获得，如在本技术领域所公知的，这些类似物用功能等效氨基酸残基代替原序列内的残基而改变序列，形成沉默改变，例如，序列内的一个或多个氨基酸残基可以用类似极性的另一个或多个氨基酸加以取代，作为功能等效，形成沉默改变。例如，非极性（疏水）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及蛋氨酸，极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、络氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺，带正电的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、以及组氨酸，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明编码活性多肽IFN-λ的多核苷酸可以包括天然序列（即，内源性序列，编码IFN-λ成熟多肽或其它包括例如信号肽），或可以包含变异体、或该序列的生物性或抗原性等效物。相对于天然多肽，多核苷酸变异体可以包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，术语“变异体”还包括异源的同源基因，通常，IFN-λ变异体将保留所有、主要部分、或至少部分生物活性。
在此使用的术语“多肽”可以表达为“蛋白质”或有“生理活性的蛋白质”。
本文使用的术语“衍生物”，指以本文方法表达和回收的任何蛋白质变异体，这类变异体包括，但不限于，PEG化形式，二聚体或其它高级变异体、氨基酸变异体、融合蛋白、糖类的改变、磷酸化或在天然蛋白质中发现的其它附着基团，以及本文公开的任何其它变异体。
术语“异构体”表示一种被遗传工程方法或其它方法修饰的生理活性蛋白，它具有原始的生理活性蛋白的主要功能，在此术语“修饰”至少在一个氨基酸序列中的取代、加成和缺失，包括为了偶联聚乙二醇而被半胱氨酸取代或与半胱氨酸加成，而且，这些修饰还包括半胱氨酸和聚乙二醇之间的化学反应而形成的共价键。
术语“具有游离半胱氨酸残基的蛋白质”指任意含有2N+1个半胱氨酸残基的天然或重组蛋白肽，其中，N可以是0或任意整数。
本发明中，术语“IL-29”和“IFN-λ1”可互换使用、“IL-28A”和“IFN-λ2”可互换使用、“IL-28B”和“IFN-λ”可互换使用；术语“IFN-λ”可以同本发明多肽或蛋白或III型干扰素互换使用，在本发明没有特别指明时，“IFN-λ”是对“IFN-λ1”、“IFN-λ2”、“IFN-λ3”的统称。
根据本发明，多元醇-IFN-λ偶联物中的多元醇分子可以是任何具有线性或支链的水溶性单-或双功能性聚环氧烷基，通常，多元醇是聚乙二醇（PEG）。然而，本领域技术人员将认识到也能合适的使用其它多元醇，例如丙三醇和聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
如本发明所用的术语“PEG”分子指包括但不限于，线性或分支PEG，甲氧基PEG，可水解或酶解PEG，侧基PEG、树枝聚物PEG，PEG和一个或多个多元醇共聚物，以及PEG和PLGA（聚乳酸-乙醇酸）共聚物。
本发明中，“功能性衍生物”指能从存在于氨基酸分子侧链或末端N-C-基团的官能团根据已知方法制备的，并当其是药物学可接受时，亦即，当其不毁坏蛋白质活性或不授予含有它们的药物组合物毒性时包括在本发明中的衍生物。这种衍生物包含羧基的酯或脂肪酸，和自由氨基的N-酰基衍生物，或自由羟基的O-酰基衍生物，并通过酰基如链酰基-或芳酰基-基团形成。
“前体”是在人或动物体内转化为IFN-λ的氨基酸序列。
对蛋白质的“活性片段”，本发明指当这种片段或前体实现和药物相同的IFN-λ活性时，单独或/和与其结合的相关分子或残基，例如蔗糖或磷酸残基，或多肽分子的聚合物联合的化合物本身多肽链的任何片段或前体。
本发明还涉及一种对含有游离半胱氨酸残基的多肽进行均一PEG化的方法，本发明的偶联物能用任何本领域已知的方法制备。根据本发明的一个实施例，将IFN-λ和PEG化剂在合适的溶剂中相接触反应，即可得到PEG-IFN-λ偶联物。一般来说，PEG化蛋白质和这些试剂的方法类似与WO9412219（Cox和McDermott）和WO9422466（Cox和Russell）中所述的方法，并略加改良，本文引用这两篇文献以供参考。将含游离半胱氨酸的多肽或蛋白质与过量的“巯基化PEG”相接触（一般PEG：蛋白质或多肽的摩尔比为1:1、5:1、10:1、和50:1）搅拌进行反应，反应条件中优选的温度是4℃到37℃；优选的pH范围可以从6.5到9.5，但更优选为7.5到8.5。使用SDS-PAGE测定分子量的改变可检测蛋白质的PEG化，一般认为产生大量单PEG化产物而不产生二PEG化产物的PEG的最低量是最佳的（一般认为80%转变成单PEG化产物是较好的）。
用于附着本发明的半胱氨酸变异体以形成“PEG化”蛋白质的“PEG部分”包括任何合适的多聚体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是有环氧乙烷单元组成的合成多聚体，可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围大约为3,000-70,000 Da的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期。因此，可通过改变PEG部分的大小或结构来加工具有不同循环半衰期的蛋白变异体使之用于具体治疗应用或优选的剂量方案。
如本申请所用的“巯基化反应性PEG化剂”指任何与半胱氨酸残基的巯醇基团反应的PEG衍生物，这些用于半胱氨酸残基修饰的反应性PEG末端基团，其包括但不限于二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰胺。PEG末端基团应对游离巯基具有特异性，实现单PEG化。但在不损伤蛋白质的条件下发生反应。以其单-甲氧基化形式使用的PEG化剂，其中仅一个末端能被偶联。
术语“单PEG化”定义为指通过单个PEG部分共价附着到蛋白质的特定位点而修饰的蛋白质。“单PEG化”方法可使用本领域的技术人员已知的任何方法，包括，但不限于，例如，本发明实施例中所列举的方法。
在本发明中，优选的巯基化剂为mPEG-二硫对吡啶（mPEG-OPSS）或mPEG-马来酰亚胺（mPEG-MAL），分别具有如下结构
值得注意的是，上述两个PEG化剂与IFN-λ的反应是位点特异性的，分别是在IFN-λ的游离的Cys残基上（IFN-λ1为15Cys，IFN-λ2和IFN-λ3为48Cys），而其他天然存在的Cys残基位点由于易形成分子内二硫键，不和硫醇反应性PEG化剂反应。
在本发明中，还提供了一种纯化本发明所得的PEG-IFN-λ偶联物的方法，一般来说，经过诸如透析、超滤、分子排阻色谱、离子交换层析、亲和层析、反相色谱或疏水层析，从未PEG化蛋白质和未反应的PEG中纯化PEG化蛋白质缀合物，也可使用其它的纯化方法，如两相有机提取或盐沉淀法。
可以进行实验以证实PEG部分在正确的位点附着到蛋白质上，经过化学裂解或蛋白水解消化该蛋白质，以分子排阻、离子交换或反相层析纯化PEG化多肽（它具有较大的分子量），随后进行氨基酸测序可完成该实验。在氨基酸测序过程中，PEG偶联的氨基酸以空白出现。
术语“层析方法”或“层析法”指任何用来分离混合物组分的技术，通过将混合物施加于溶剂（流动相）流过填充物（固定相），进行分离层析法的分离原理是基于固定相和流动相的不同物理特性。
本发明还提供了制备可溶性干扰素，特别是III型干扰素（IFN-λ）的方法，该方法通过先构建含IFN-λ基因的表达载体，将所得的载体转入到宿主大肠杆菌中，得到相应的表达工程菌，再进行发酵和诱导表达、包涵体变性和复性，得到可溶性IFN-λ。
一般在方法的最后一步中，所需的蛋白质从可溶性细胞质部分，可溶性周质部分、培养基的可溶性部分以及包涵体中回收和纯化，可使用从培养基、细胞质、周质部分以及包涵体中回收和纯化蛋白质的任何方法，这些回收和纯化方法是已知的或本领域的技术人员容易确定的，包括，但不限于，例如，离心，过滤，透析，层析（包括分子排阻层析）等方法。回收和纯化所需蛋白质的合适方法部分取决于蛋白质的特性和目的用途。
术语“载体”是指一种DNA质粒分子，其作为一种载体能够稳定地转移异体基因进入一个宿主细胞。要成为一种有用的载体，它必须能够复制，能通过一定的方法转移进入宿主细胞，并能用一定的方法进行自身检测。另外，术语“重组表达载体”指将一种载体与异体基因可操作性地连接而形成的环状DNA分子，通过它异体基因可在一种宿主细胞中表达。
作为重组表达载体，可以生产插入IFN-λ的DNA载体，当构造一种重组表达载体时，为了增加异体基因在宿主细胞中的表达程度，相关基因应该可操作性地连接到一种在所选宿主细胞中起作用的转录和翻译表达调控序列上，这在该领域中通常为人熟知。表达调控序列和相关基因应优选包含在单一表达载体中，该载体还包括一个细菌性的选择标示物和复制起点。
一种适当的载体不仅包括编码人IFN-λ的基因，而且包括一些其它调控元件，例如调控序列，都可以通过基本重组DNA技术进行构建，为了得到期望的载体，独立分开的DNA片段应该彼此连接。因此每个DNA片段首先使用限制性内切酶进行酶切，然后将这些DNA片段按特定次序和方向连接起来。
本发明的PEG-IFN-λ偶联物可用作制备药物或药用组合物，用于治疗相关疾病或病症，其中，多肽是作为活性成分而产生效用的。本发明用药用组合物中，除包括多元醇部分共价结合于IFN-λ上的游离半胱氨酸偶联物，还包括其它一些活性成分，例如，包括，但不限于，I型干扰素，PEG化的I型干扰素，II型干扰素，PEG化的II型干扰素，丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂（例如施贵宝的BMS-790052，如吉里德科学公司的GS-9190、GS-9256，弗特克斯药品公司的Telaprevir等）以及一些其它抗病毒药物，例如以利巴韦林为代表的核苷类药物。
本发明中组合物中，还包括其它一些制药上可接受的载体或赋形剂，以制成不同目的需要的给药剂型单元。
本发明中，还提供了由IFN-λ介导的调节过程的方法，包括给予患者治疗有效量的多元醇-IFN-λ偶联物或含多元醇-IFN-λ偶联物的组合物，这样的合适的治疗疾病包括但不限于：炎症（例如，多发性硬化、关节炎、哮喘、囊性纤维化、或间质性肺炎）、病毒感染（例如，丙型肝炎感染、乙型肝炎感染、或HIV感染）、细菌感染以及癌症（例如，骨髓瘤，淋巴癌、肝癌、乳腺癌、黑素瘤、白血病等）。如本发明的实施例中给出了本发明PEG-IFN-λ偶联物对肝癌细胞HepG2、心肌炎病毒EMCV、丙肝病毒HCV的抑制作用。
本文方法产生的化合物可用于各种体外和体内用途，本发明的蛋白质及其衍生物可用于对于其野生型、天然的、或以前已知的修饰型对应物已知的研究，诊断或治疗目的。体外用途包括，例如，使用该蛋白质用于筛选、检测和/或纯化其它蛋白质。
对于治疗用途，技术人员可容易地确定合适的剂量、给药频率和给药途径。做出这些决定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白质的特性，所需治疗的病症，潜在的病人应变性，病人的年龄、体重以及个体反应等。本发明的化合物也可用作传递载体增强所附着的治疗剂的血浆循环半衰期或指导向体内特异性靶的传递。
本发明PEG- IFN-λ偶联物或含多元醇-IFN-λ偶联物的组合物，结合适合的药用载体或赋形剂，以用于治疗各种病症，在这些药物组合物中所用的特定载体可以采取各种形式，其取决于所希望的给药类型。适当的给药途径包括，但不限于，肠道（例如，口服）、局部、栓剂、吸入、以及非胃肠道，优选为非胃肠道给药，如皮下、肌肉、或静脉注射。
在制备口服液体剂型（例如，混悬剂、酊剂、胶体或溶液）的组合物时，可以采用典型的药物介质，如水、乙二醇、丙三醇、油、乙醇、增味剂、防腐剂、着色剂等。类似地，当制备口服固体剂型（如片剂、胶囊剂等）时，可采用诸如淀粉、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
用于非胃肠道给药的药物组成可以制备成包括有效成分和适当载体的注射剂型。为了非胃肠道给药，载体通常包括无菌注射水，也可包括一些其它可用的助溶剂或防腐剂组分，此外也可制备注射型混悬剂，在这种情况下，将采用合适的液体载体、悬浮剂等。用于非胃肠道给药的载体在本技术领域是熟知的并且包括，水、盐溶液、林格氏液、和/或葡萄糖，该载体可以包含少量的赋形剂以便保持药剂的稳定性和等渗性，这些溶液可以按照通常的方法制备。
为了局部给药，本发明的PEG-IFN-λ偶联物可用温和的含水基质进行配制，如软膏或乳膏，适用软膏基质的如凡士林、羊毛脂、以及油包水乳剂如EucerinTM，其可获自Beiersdorf（Cincinnati，Ohio）；冷霜（USP）；Purpose CreamTM，可获自Johnson & Johnson（New Brunswick，New Jersey）等。
本发明的PEG-IFN-λ偶联物一般以单位剂量的形式给药，本发明的化合物通常以每日、每周、以及每月剂量给药，从约0.01μg/kg体重至约50mg/kg体重，优选为从约0.1μg/kg体重至约25mg/kg体重，更优选为从约1μg/kg体重至约5mg/kg体重。对于75kg的平均体重，剂量可以在每日10μg和1mg之间，更优选为20μg到200μg之间。对经修饰的PEG-IFN-λ，其给药周期可延长，例如，每周、或每两周给药方案。例如，每人每周剂量可以是10μg至约500μg，在某些具体的实施例中，每人每周剂量可以是约50μg至约250μg，在某些其它的实施例中，每人每周剂量可以是约100至约200μg。如本领域技术人员所明了的，根据本发明的药物组成的特定量取决于若干因素，包括但不限于所希望的生物活性、患者的状态、以及对药物的耐受性等。
实施例
实施例1：III型干扰素的基因克隆及工程菌构建
采用分子克隆的方法分别构建了IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的原核表达载体。全序列合成IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的成熟肽基因，引入NdeI位点，下游分别引入XhoI、EcoRI和HindIII位点，在下游酶切位点前面引入两个连续的终止密码子TAATAA，以pET30a为表达载体，通过酶切、连接获得可表达IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的质粒载体，将各载体转入表达型宿主大肠杆菌BL21（DE3）中，即可获得相应的表达工程菌。
IFN-λ1工程菌的构建
1、pET30a-IFN-λ1表达载体的构建及鉴定
1）将IFN-λ1基因加ddH2O溶解并稀释至50ng/µl，取10µl至离心管中，分别加入NEB内切酶Xho I和Nde I各1µl，再加入2µl Buffer，补加ddH2O至20µl，37℃酶切3h。
2）取50ng/µl 的pET30a质粒30µl至离心管中，加入Xho I和Nde I各3µl及NEB Buffer 5µl，补加ddH2O至50µl，37℃酶切3h。在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,并切胶回收IFN-λ1基因片段及pET30a的酶切片段，洗脱体积为30µl。
3）取经琼脂糖凝胶电泳纯化回收的IFN-λ1 4µl及pET30a双酶切片段4.5µl，加入T4DNA连接酶0.5µl和T4DNA连接酶缓冲液1µl，混匀后16℃连接过夜。
4）根据说明书，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，取200µl转化产物涂布于LB（Kan 50µg/ml）平板上，37℃培养过夜。
5）在转化平板上挑取单菌落，转接至含有LB（Kan 50µg/ml）液体培养基的试管中，37℃，200r/min培养过夜。
6）试剂盒提取挑取单菌落的质粒，分别选取Xho I和Nde I， Pvu I和Aat I，Nhe I和Hpa I此三组酶进行双酶切鉴定。酶切体系20µl，质粒上样量5µl。取各双酶切产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
选取电泳结果与预期酶切结果一致的质粒，进行DNA序列测定。
2、IFN-λ1大肠杆菌工程菌的构建及筛选
取正确构建的pET30a与IFN-λ1连接的质粒pET30a-IFN-λ1，根据说明书，将pET30a-IFN-λ1转化大肠杆菌BL21（DE3），取200µl转化产物涂布于LB（Kan 50µg/ml）平板上，37℃培养过夜。
在转化平板上挑取单菌落，转接至含有LB（Kan 50µg/ml）液体培养基的试管中，37℃，200r/min培养过夜。
1%接菌量转接各转化子至10mL LB（Kan 50µg/ml）液体培养基的试管中，37℃，200r/min培养3.5h（OD600≈1.2~1.5）, 加入IPTG（终浓度为1mM）进行诱导。诱导6h后，取菌液300µl，离心，重悬于60µl 20mM的Tirs·Cl中，取其中的悬液20µl，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，选取其中表达量最高的作为IFN-λ1发酵用工程菌。
B、pET30a-IFN-λ2表达载体的构建以及大肠杆菌工程菌的筛选
通过Nde I和EcoR I酶切位点将IFN-λ2目的基因连接到pET30a表达载体上，酶切鉴定图见图2。然后采用与IFN-λ1工程菌相似的构建方法，筛选高效表达IFN-λ2重组蛋白的大肠杆菌工程菌。
C、pET30a-IFN-λ3表达载体的构建以及大肠杆菌工程菌的筛选
通过Nde I和HindIII酶切位点将IFN-λ3目的基因连接到pET30a表达载体上，酶切鉴定图见图3。然后采用与IFN-λ1工程菌相似的构建方法，筛选高效表达IFN-λ3重组蛋白的大肠杆菌工程菌。
实施例2：大肠杆菌工程菌的发酵和诱导表达
种子培养
一级种子培养：500ml三角瓶中装LB培养基(10克/ L的酪蛋白胨，5 g / L的酵母提取物，5 g / L的NaCl)100ml+ 50 μg/ml 卡那霉素，挑取单菌落至三角瓶中，37℃，培养8小时。
二级种子培养，500ml三角瓶中装LB培养基(10克/ L的酪蛋白胨，5 g / L的酵母提取物，5 g / L的NaCl)100ml+ 50 μg/ml 卡那霉素，接一级种子10ml至三角瓶中，37℃，培养8小时。
10L发酵罐分批补料培养
培养基：分批培养基（酵母抽提物50 g/L、 葡萄糖5 g/L、NH4Cl (0.5 g/L)溶于 5 L的去离子水中，加入发酵罐，灭菌；配制微量元素溶液，用10% NaOH调节PH至7.0）；Ⅱ补料培养基（30% (v/v) 甘油 和20% (w/v) 酵母提取物）。
分批-补料培养：取二级种子发酵液100ml接种到发酵罐中，维持恒温37℃，溶氧30%以上，以H3PO4和NaOH自动流加，维持pH7.0，约4小时，当OD600=20后，温度降为28℃，开始诱导，加入IPTG使最终浓度为1mM，5小时后开始补料，以 2g/min的速度流加，7小时后流速变4g/min，发酵10小时后，发酵结束，发酵液以6000g、4℃离心30min，收集菌体。
实施例3：III型干扰素的变性和复性
向收集的菌体中加入10 倍体积的TE(例：10 g菌体加入100ml TE)洗涤3-5次，200 ml超声裂解液（50 mM Tris-Cl+100 mM NaCl，pH8.0）重悬菌体进行超声破碎菌体，之后用包涵体洗涤液1（20mM Tris-Cl+1mM EDTA + 1%
Triton-X100，pH6.5）和包涵体洗涤液2（20mM Tris-Cl+1mM EDTA + 2
M 尿素，pH6.5）分别洗涤5次，收集包涵体。按照质量体积比1:10的比例向收集的包涵体中加入包涵体裂解液（7 M盐酸胍 + 20 mM Tris-Cl + 1 mM
DTT + 1 mM EDTA，pH6.5）12h以上，离心收集上清，检测裂解蛋白浓度，然后用复性液稀释（150 mM Tris-Cl + 20 mM
NaCl + 1 mM EDTA + 10% 甘油 + 8 mM GSH + 1 mM GSSG，pH6.5）进行稀释复性。
实施例4：干扰素的纯化
重组表达的干扰素复性液进行超滤浓缩，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的SP Sepharose FF阳离子交换柱，0-1M氯化钠梯度洗脱。初步纯化的干扰素上样于0.1% 三氟醋酸平衡好的Source 30RPC反相层析柱，10-95%乙腈梯度洗脱吸附。 反相层析纯化后，干扰素进一步经Superdex 75纯化，流动相为含0.15M 氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）。收集洗脱活性组分，SDS-PAGE检测表明干扰素已被纯化至电泳单一条带，见图4。
实施例5：PEG-IFN-λ偶联物的制备
1、PEG-IFN-λ1偶联物的制备
IFN-λ1用mPEG20k-OPSS进行修饰
将IFN-λ1溶入到0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0-8.0）中，配制成IFN-λ1的浓度最终稀释到大约1mg/ml，并向其中加入过量的mPEG20k-OPSS（Nektar产品），IFN-λ1与mPEG20k-OPSS的摩尔比为1:10，在37℃下搅拌进行反应2小时，通过SDS-PAGE检测以确定反应的偶联程度，在这些条件下，IFN-λ1上游离的半胱氨酸残基特异性地连接于mPEG20k-OPSS上，形成相对稳定的硫醚键，反应物通过使用1N HCl溶液降低pH至3.0从而中止。
2、PEG-IFN-λ2偶联物的制备
IFN-λ2用mPEG10k-MAL进行修饰
将IFN-λ2溶入到0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0-8.0）中，配制成IFN-λ2的浓度最终稀释到大约1mg/ml，并向其中加入过量的mPEG10k-MAL（Nektar产品），IFN-λ2与mPEG10k-MAL的摩尔比为1:3，在37℃下搅拌进行反应2小时，通过SDS-PAGE检测以确定反应的偶联程度，在这些条件下，IFN-λ2上游离的半胱氨酸残基特异性地连接于mPEG10k-MAL上，形成相对稳定的硫醚键，反应物通过使用1N HCl溶液降低pH至3.0从而中止。
2、PEG-IFN-λ3偶联物的制备
IFN-λ3用mPEG40k-MAL进行修饰
将IFN-λ3溶入到0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0-8.0）中，配制成IFN-λ3的浓度最终稀释到大约1mg/ml，并向其中加入过量的mPEG40k-MAL（Nektar产品），IFN-λ3与mPEG40k-MAL的摩尔比为1:5，在37℃下搅拌进行反应2小时，通过SDS-PAGE检测以确定反应的偶联程度，在这些条件下，IFN-λ3上游离的半胱氨酸残基特异性地连接于mPEG40k-MAL上，形成稳定的硫醚键，反应物通过使用1N HCl溶液降低pH至3.0从而中止。
同样的方法，可以制备不同分子大小的mPEG与IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3偶联物。
实施例6 PEG化干扰素的纯化
反应混合液先对50mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）透析，再将样品上样于同样缓冲液平衡好的SP Sepharose FF阳离子交换柱。用0-1M氯化钠梯度洗脱吸附蛋白。PEG-干扰素进一步经Superdex 75纯化，流动相为含0.15M 氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.5）。收集洗脱活性组分，SDS-PAGE检测结果显示，PEG-干扰素已被纯化至电泳单一条带，见图5和6。10 kD PEG修饰后3种IFN-λ的分子量均为32 kDa左右，20 kD PEG修饰后3种IFN-λ的分子量均为50 kDa左右。
实施例7：肝癌细胞株HepG2的培养
取复苏的HepG2细胞，将其转移到新鲜的细胞培养基RPMI-1640中，再加入20%胎牛血清接种密度为1×104/ml，然后在37℃、5% CO2孵育24h以上，使用pBS将细胞洗涤2次加入适量的0.15%胰蛋白酶，覆盖20s后吸去胰蛋白酶，然后加入新鲜培养基RPMI-1640（15%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素，pH6.8-7.4），通过细胞计数，将细胞稀释到104个细胞/ml，96孔板每孔103个细胞/100 μl，备用。
实施例8：脑心肌炎病毒（EMCV）和丙肝病毒（HCV）感染试验
选择HepG2细胞生长良好的96孔板，当细胞生长进入对数生长期时，每孔接种20 μl EMCV病毒和HCV病毒，37℃、5% CO2孵育3小时，用pBS洗涤细胞3次，更换不包含病毒的新鲜RPMI-1640培养基，然后37℃、5% CO2孵育24 h，细胞计数，备用。
实施例9：体外细胞学活性检测
在96孔细胞培养板内加入不同稀释度的干扰素λ1、λ2、λ3样品(50μl/孔)，每稀释度3个复孔，并设细胞对照。再向各孔加入50μl细胞悬液，混匀，置5% CO2 37℃培养18~24小时，每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5% CO2孵育4~6小时后，每孔加入裂解液 150μl，充分混匀，于37℃、5% CO2保温18~24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，在酶标仪中以630 nm为参比波长，在波长570 nm处测定吸光度，记录测定结果。结果显示，干扰素λ1、λ2、λ3抗EMCV的EC50分别为1.32 ng/ml、12.2 ng/ml和0.58 ng/ml，见图7。
以等量蛋白浓度的IFN-λ1和20 kD修饰的干扰素λ1—PEG-IFN-λ1、IFN-λ2和10 kD修饰的干扰素λ2—PEG-IFN-λ2以及IFN-λ3和40 kD修饰的干扰素λ3—PEG-IFN-λ3进行抗EMCV病毒的细胞学试验，结果显示mPEG分别修饰IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3后，其生物学活性下降到未修饰前的9.1%、11.2%和6.1%，见图8。
在HCV病毒侵染HepG2细胞96孔培养板内加入不同稀释度的干扰素λ1、λ2、λ3样品(50μl/孔)和IFN-α2b，每稀释度3个复孔，并设阴性对照。再向各孔加入50μl细胞悬液，混匀，置5% CO2孵箱37℃培养18~24小时。然后提取总RNA，采用上海科华生物工程股份有限公司丙肝病毒荧光定量PCR检测试剂盒进行HCV病毒RNA复制的检测，检测结果见附图9。结果显示，IFN-α2b的抗HCV病毒RNA复制的效果很好，IFN-λ1和IFN-λ3的效果相当，IFN-λ2的效果相对较差。
实施例10：IFN-λ3在大鼠体内的药代动力学试验
委托GLP研究中心进行40 kD mPEG修饰的IFN-λ3在大鼠体内的药代动力学试验研究，分2组，每组成年Wistar大鼠6只，体重180g-220g，雌雄各半，IFN-λ3给药组0.2 mg/kg和PEG-IFN-λ3给药组0.2 mg/kg，皮下注射，在以下14个时间点进行采样：0h、30min、60min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、15h、20h、32h、44h、56h，然后采用R&D公司的人IFN-λ3 Elisa检测试剂盒检测单次给药后不同时间点血样中的IFN-λ3含量。结果显示，IFN-λ3的半衰期不到4 小时，AUC（0-Tn）为1.26 mg/L·min，Cmax为134.3 μg/ml；而PEG40-IFN-λ3具有更长的半衰期，半衰期为44.5 小时，AUC（0-Tn）为14.5 mg/L·min，Cmax为23.3 μg/ml，PEG40-IFN-λ3的半衰期为44.5 h，其曲线下面积较IFN-λ3显著增加，说明PEG化的IFN-λ3在体内的半衰期显著延长，具有长效的效果。
Claims (12)
1.一种多元醇-多肽偶联物，其包含：
(a) 多肽部分；和
(b) 与该多肽共价连接的非多肽部分；
其中所述多肽部分与SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5具有至少90%序列同一性的氨基酸序列，且所述多肽具有至少一个游离的半胱氨酸残基，所述非多肽部分为多元醇，其特征在于，所述非多肽部分共价连接到所述多肽部分的游离半胱氨酸残基上。
2.权利要求1所述的偶联物，其中所述的多元醇是聚乙二醇。
3.权利要求2所述的偶联物，其中所述的聚乙二醇是直链或支链的聚乙二醇。
4.权利要求1所述的偶联物，其中所述偶联物具有均一的分子量。
5.一种制备权利要求1至4中任意一权利要求所述偶联物的方法，其特征在于包括如下步骤：用硫醇反应性多元醇剂和所述多肽反应，所述多肽具有单一游离的不按胱氨酸残基，所述多元醇试剂和所述多肽的位点特异性共价结合，形成共价硫醚键，得到多元醇-多肽偶联物，回收纯化产生的目的多元醇-多肽偶联物，即得。
6.权利要求5所述的方法，其中所述硫醇反应性多元醇是硫醇反应性PEG化剂。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述的硫醇反应性多元醇剂是单甲氧基化的。
8.权利要求5或6所述的方法，其中所述的硫醇反应性多元醇剂是具有选自二硫对吡啶、乙烯砜、马来酰亚胺或碘乙酰胺的官能团的多元醇衍生物。
9.权利要求5或6所述的方法，其中所述的硫醇反应性多元醇剂的分子量为10-50kda。
10.一种药用组合物，其特征在于，该组合物包括权利要求1至4中任意一权利要求所述偶联物作为活性组分，和药物学上可接受的载体、赋形剂或辅料。
11.权利要求1至4中任意一权利要求所述偶联物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。
12.权利要求10所述组合物在制备具有治疗炎症、病毒感染、细菌感染以及癌症药物中的用途。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106519024A (zh) * | 2015-09-15 | 2017-03-22 | 三生国健药业（上海）股份有限公司 | 一种用于去除单克隆抗体中异构体的复性液及复性方法 |
| CN110381985A (zh) * | 2016-12-20 | 2019-10-25 | Ucb生物制药私人有限公司 | 干扰素-λ治疗纤维化的医学用途 |
| CN115968291A (zh) * | 2020-04-22 | 2023-04-14 | 南湖制药公司 | 聚乙二醇化干扰素tau及其组合物和方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1754889A (zh) * | 2004-06-30 | 2006-04-05 | 深圳科兴生物工程有限公司 | PEG化干扰素α－1b |
| CN1910200A (zh) * | 2003-08-07 | 2007-02-07 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il－28和il－29的均一化制剂 |
| WO2007041713A1 (en) * | 2005-10-04 | 2007-04-12 | Zymogenetics, Inc. | Production and purification of il-29 |
| WO2009149377A1 (en) * | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Zymogenetics, Llc | Use of pegylated type iii interferons for the treatment of hepatitis c |
-
2011
- 2011-01-18 CN CN201110020949.4A patent/CN102584979B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1910200A (zh) * | 2003-08-07 | 2007-02-07 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il－28和il－29的均一化制剂 |
| CN1754889A (zh) * | 2004-06-30 | 2006-04-05 | 深圳科兴生物工程有限公司 | PEG化干扰素α－1b |
| WO2007041713A1 (en) * | 2005-10-04 | 2007-04-12 | Zymogenetics, Inc. | Production and purification of il-29 |
| WO2009149377A1 (en) * | 2008-06-05 | 2009-12-10 | Zymogenetics, Llc | Use of pegylated type iii interferons for the treatment of hepatitis c |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106519024A (zh) * | 2015-09-15 | 2017-03-22 | 三生国健药业（上海）股份有限公司 | 一种用于去除单克隆抗体中异构体的复性液及复性方法 |
| CN110381985A (zh) * | 2016-12-20 | 2019-10-25 | Ucb生物制药私人有限公司 | 干扰素-λ治疗纤维化的医学用途 |
| CN115968291A (zh) * | 2020-04-22 | 2023-04-14 | 南湖制药公司 | 聚乙二醇化干扰素tau及其组合物和方法 |
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