KR101502645B1 - 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101502645B1
KR101502645B1 KR1020107007270A KR20107007270A KR101502645B1 KR 101502645 B1 KR101502645 B1 KR 101502645B1 KR 1020107007270 A KR1020107007270 A KR 1020107007270A KR 20107007270 A KR20107007270 A KR 20107007270A KR 101502645 B1 KR101502645 B1 KR 101502645B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ifn
alpha
ypeg
peg
group
Prior art date
Application number
KR1020107007270A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100082774A (ko
Inventor
웨이동 자우
킹지앙 지아오
리 선
티에빙 왕
펭홍 인
쉬홍 루오
루 주앙
민 리우
티안레 주
옹 장
Original Assignee
바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드 filed Critical 바이오스티드 진 익스프레션 테크. 컴파니 리미티드
Publication of KR20100082774A publication Critical patent/KR20100082774A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101502645B1 publication Critical patent/KR101502645B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 단일 Lys 잔기에서 Y-형 분지된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 변형된 인터페론-α2b 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. PEG화된 IFN-α2b는 질병, 예컨대 바이러스 감염, 예를 들면 C형 간염의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.

Description

폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도{POLYETHYLENE GLYCOL MODIFIED INTERFERON ALPHA 2B AND PREPARATION METHOD AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 단일 아미노산 잔기에서 Y-형 분지된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 의해 변형된 인터페론 α2b 및 그의 제조 방법뿐만 아니라 단일 아미노산 잔기에서 제조된 PEG화된 IFN-α2b의 약학 분야에서의 용도에 관한 것이다.
인터페론(IFN)은 바이러스 감염 및 다른 항원 자극에 반응하여 진핵 세포에 의해 생성되는 소 분자 단백질 또는 당단백질 과이며, 이들은 넓은 범위의 항바이러스성, 항증식성 및 면역조절 효과를 나타낸다. IFN은 여러 가지 상태 및 질병, 예컨대 바이러스 감염, 예를 들면 B형 간염, C형 간염 및 HIV; 염증성 장애 및 질병, 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 천식, 낭성 섬유증 및 간질성 폐 질환; 및 종양, 예컨대 골수종, 림프종, 간 암, 폐 암, 모발상 세포 백혈병 등의 치료에 넓게 적용되어 왔다(문헌[Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002]).
IFN은 화학적, 면역학적 및 생물학적 특성의 차이에 따라 4가지 유형으로 분류된다: 인터페론-α, β, γ 및 ε. 인터페론-α(IFN-α)는 백혈구에 의해 분비된다. 인간 IFN-α는 약 20개의 유전자로 이루어진 다유전자 군에 의해 암호화되고, 암호화된 단백질은 약 90% 이하의 아미노산 서열 상동성을 공유한다(문헌[Henco K., Brosius F.J., et al. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985]). 인간 IFN-α2b는 인간 IFN-α 과의 α2 아과의 아형 중 하나이고, 다양한 생물학적 활성을 갖는 단일 쇄 단백질이다. 단일 쇄 단백질은 4개의 Cys를 갖는 165개의 아미노산 잔기로 구성되며, 이때 Cys1-Cys98과 Cys29-Cys138 사이에 2개의 쇄내의 다이설파이드 결합이 각각 형성되고, N-말단 아미노산은 하나의 유리 α-NH2 기를 갖는 Cys이다. 아미노산 서열의 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 및 164 위치에서의 잔기는 Lys이고, 이들 각각은 하나의 유리 ε-NH2 기를 함유한다. 이 단백질은 당화되지 않고 다수의 프로테아제에 대하여 민감하다. 인간 인터페론-α2b의 아미노산 서열이 서열 식별 번호: 1에 나타나 있다.
IFN은 보통 임상 치료시에 비경구로 투여된다. IFN의 짧은 생체내 반감기(2 내지 4시간) 및 강한 면역원성에 의해 보다 짧은 투약 간격 및 보다 빈번한 투약 회수를 초래한다. 생성된 항체가 치료 효능을 상당히 감소시키기 때문에, 이상적인 임상 효능을 달성하는 것은 어렵다. 최근 몇년 동안 개발된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 변형 기법은 상기 문제에 대한 가능한 해결책을 제공하였다.
PEG는 불활성의, 비독성의 생물분해성 유기 중합체이며, 생명공학 및 약학 분야에서 중요하다. PEG 변형 기법은 PEG를 활성 단백질에 공유 결합을 통해 연결하는 것이다. 폴리에틸렌-글리콜화(PEG화) 후에, 단백질의 특성은 상당히 개선될 수 있다(예컨대, 약물 대사 반감기의 연장, 면역원성의 감소, 안정성의 증가, 치료 효능의 개성, 투약 회수의 감소, 약물 용해도/수 용해도의 증가, 단백질 분해에 대한 내성의 증가, 약물 제어된 방출의 촉진 등). 보다 상세하게는 문헌[Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993] 및 미국 특허 제 4179337 호를 참고한다.
PEG의 효소 또는 인슐린으로의 연결 후, 단백질의 면역원성이 감소되면서 동시에 단백질의 활성이 마찬가지로 감소하는 것으로 미국 특허 제 4179337 호에 개시되어 있다. 이는 또한 G-CSF(문헌[Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992]), IL-2(문헌[Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987]), TNF-α(문헌[Tsutsumi et al. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994]), IL-6(문헌[Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994]) 및 CD4-IgG(문헌[Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994])에서 발견되었다.
분지된 PEG-변형된 단백질이 선형 쇄 PEG-변형된 단백질보다 더 우수한 pH 내성, 열안정성 및 단백질 분해에 대한 내성을 나타내는 것으로 보고되었다(문헌[Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995]). 일반적으로, PEG 분자는 그 자체를 단백질 분자 내의 N-말단 α-아미노 기 또는 Lys 잔기의 ε-아미노 기에 연결함으로써 단백질을 변형시킨다. 단백질 변형에 대해 일반적으로 세 가지 유형의 PEG가 존재한다: 선형 쇄 분자(유럽 특허 제 0593868 호), U-형 분지된 분자(유럽 특허 제 0809996 호) 및 Y-형 분지된 분자(중국 특허 제 1243779 C 호).
현재 여러 종류의 PEG화된 단백질이 임상적으로 적용되고 있다. 1990년도에, 엔존 인코포레이티드(ENZON Inc.)에 의해 제조된 PEG화된-소 아데노신 데아미나제(아다겐(Adagen))가 FDA에 의해 승인되었고, 중증 복합형 면역결핍 질환을 치료하는데 사용되었다(페그팜그(pegfamg)013102LB, http://www.fda.gov). 또한 1994년도에, 급성 림프모구 백혈병을 치료하기 위한 다른 PEG-변형된 단백질, 즉 PEG화된 아스파라기나제(페가스파르가제(pegaspargase), 온캐스파(Oncaspar))가 미국에서 판매되었다(103411s5052lbl, http://www.fda.gov). 쉐링-푸라우(Schering-Plough)에 의해 개발된 PEG 변형된 인터페론-α2b(PEG IFN-α2b, PEG-인트론)가 2000년도에 FDA에 의해 판매를 승인받았고, 호프만-라 로슈 리미티드(Hoffman-la Roche Ltd.)에 의해 제조된 PEG화된 인터페론-α(PEG IFN-α2a, 페가시스(Pegasys)) 또한 2002년도에 판매를 승인받았으며, 이 둘 모두 간염을 치료하는데 사용된다(103964s5037lbl, 페가슈011901LB(pegsche011901LB), http://www.fda.gov). 2002년도에, 암젠 인코포레이티드(Amgen Inc.)에 의해 제조된 PEG 변형된 인간 과립구 집락-자극 인자(PEG-필그라스팀(filgrastim, 뉴라스타(Neulasta))가 또한 FDA에 의해 승인받았고, 이는 전이성 유방암을 치료하는데 사용된다(페그팜그013102LB, http://www.fda.gov). 또한, FDA는 파마시아(Pharmacia)에 의해 개발된 PEG화된 인간 성장 인자 길항제의 적용을 허용하였다. 셀테크(Celltech)로부터의 PEG 결합된 TNF-α 항체 단편 및 암젠으로부터의 PEG-TNF 수용체는 진행중인 임상 실험에서 시험된다. 또한, 제 1 PEG-유기 분자 컨쥬게이트, 즉 PEG화된 캄토테킨이 임상 실험의 제 2 단계에 들어갔다. 2004년도에, PEG 변형된 올리고뉴클레오타이드(페갑타닙(Pegaptanib), 마큐젠(Macugen, 상표명))가 FDA에 의해 승인받았다. 약물에서 PEG(또는 PEG 그 자체)의 생체내 대사는 이미 명백하게 이해되고 있고, PEG는 어떠한 부작용도 없는 우수하고 안전한 약물 조절제인 것으로 입증되어 왔다.
단백질 약물에 연결될 수 있는 PEG는 PEG의 말단 중 1 또는 2개의 말단 기가 화학적으로 활성화되어 활성을 나타내는 적절한 작용기를 갖고, 따라서 연결될 약물의 하나 이상의 작용기와 안정한 공유 결합을 형성할 수 있도록 통상적으로 유도체화될 필요가 있다. 예를 들면, PEG는 단백질 펩타이드 쇄 내의 Lys 잔기의 ε-NH2 또는 단백질 펩타이드 쇄의 N-말단 아미노산 잔기의 α-NH2에 연결될 수 있다. 유럽 특허 제 0809996 호에 기재된 IFN-α의 PEG화에서, PEG-NHS는 친핵성 치환에 의해 IFN-α 내의 N-말단 아미노산의 α-NH2 또는 Lys의 ε-NH2에 연결된다. 상기 특허에서 언급된 PEG-NHS는 U-형 분지된 PEG 유도체(PEG2-NHS)이며, 그의 분자식은 다음과 같다:
Figure 112010021184056-pct00001
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 저분자량 알킬 기이고,
n 및 n'는 600 내지 1500이고,
PEG의 평균 분자량은 26kD 내지 66kD이다.
PEG2-NHS-변형된 IFN-α의 분자식은 다음과 같다:
Figure 112010021184056-pct00002
하나 이상의 PEG2-NHS 분자가 IFN-α내의 N-말단 아미노산의 α-NH2 또는 Lys의 ε-NH2에 연결되는 경우, 수득된 생성물은 단일 아미노산 잔기에서의 비-PEG화된 IFN-α, PEG화된 IFN-α와 다중 아미노산 잔기에서의 PEG화된 IFN-α의 혼합물이다. 단일 아미노산 잔기에서의 PEG화된 IFN-α는 임의의 적절한 정제 수단에 의해 수득된 생성물로부터 단리될 수 있다. IFN-α는 1개의 N-말단 아미노산 및 1개 초과의 Lys 잔기, 즉 PEG2-NHS에 대한 몇몇 반응성 부위를 가지므로, 단일 아미노산 잔기에서 단리된 PEG화된 IFN-α는 상이한 단일 아미노산 잔기에서 PEG화된 IFN-α의 이성질체들의 혼합물이다.
유럽 특허 제 0593868 호에서, 선형 쇄 PEG를 사용하여 IFN, 즉 하기 기재된 분자식의 변형된 단백질을 변형시켰다:
Figure 112010021184056-pct00003
상기 식에서,
R은 저분자량 알킬 기이고,
R1, R2, R3 및 R4는 H 또는 저분자량 알킬 기이고,
m은 1 내지 IFN에서 가능한 PEG 변형 위치의 수이고,
W는 O 또는 NH이고,
x는 1 내지 1000이고,
y 및 z는 0 내지 1000이고,
x + y + z는 3 내지 1000이고,
R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상은 저분자량 알킬 기이다.
유-센 왕(Yu-Sen Wang) 등(문헌[Yu-Sen Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002. Yu-Sen Wang et al, Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000])은 12KD 선형 모노메톡시-PEG(PEG-인트론)에 의한 rIFN-α2b의 변형을 보고하였고, HPLC-IE에 의해 분석된 생성물이 상이한 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 14개 초과의 이성질체들의 혼합물임을 증명하였다. 유-센 왕 등에 의해 사용된 선형 PEG의 분자식은 다음과 같으며, 이때 PEG의 평균 분자량은 12KD이다:
Figure 112010021184056-pct00004
본 발명에서 사용되는 PEG 유도체는 신규한 분지된, Y-형 분지된 PEG 유도체이고, 그의 구조는 U-형 분지된 PEG와 상이하다. 이들 두 종류의 PEG의 가장 큰 차이점은 본 발명에 따른 Y-형 PEG 유도체의 두 개의 분지 PEG 쇄가 N 원자를 통해 함께 연결되지만, 유럽 특허 제 0809996 호에서의 U-형 PEG 유도체의 두 개의 분지 PEG 쇄는 C 원자를 통해 함께 연결된다는 것이다. 본 발명에 따른 Y-형 PEG 유도체의 분자 조성은 다음과 같이 나타난다:
Figure 112010021184056-pct00005
상기 식에서,
Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
Ri는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고,
X1 및 X2는 독립적으로 연결기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 이루어진 군 중에서 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이고,
F는 하이드록실 기, 카복실 기, 에스터 기, 아실 클로라이드, 하이드라자이드, 말레이미드, 피리딘 및 다이설파이드로 이루어진 군 중에서 선택된 말단 기이고, 치료제 또는 기질의 아미노 기, 하이드록실 기 또는 메르캅토 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다.
도 1은 YPEG(40KD)에 의해 변형된 IFN-α2b의 2개의 배치의 SDS-PAGE이다. 분리 겔의 농도는 12%이고, 쿠아시에 블리안트 블루(Coomassie brilliant blue) R-250을 염색 염료로서 사용하였다. 도 1의 SDS-PAGE 결과로부터, 조건하에, rHuIFN-α2b의 PEG 변형 비율은 30 내지 50%이고, 안정함을 알 수 있다. 주된 변형된 생성물은 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 IFN-α2b(YPEG-IFN-α2b)이고, 또한 다중 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 몇몇 IFN-α2b(YPEGn-IFN-α2b)도 존재하였다. 레인 1: IFN-α2b, 0시간에서 NHS-YPEG(40KD) 변형 반응; 레인 2: IFN-α2b의 배치 060604-1, 2시간에서 NHS-YPEG(40KD) 변형 반응; 레인 3: IFN-α2b의 배치 060604-2, 2시간에서 NHS-YPEG(40KD) 변형 반응; 레인 4: 마커(쥐이 라이프사이언스(GE Lifescience)).
도 2는 SP-세파로스 FF에 의한 YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 분할 프로파일이다.
도 3은 SP-세파로스 FF에 의해 정제된 YPEG-IFN-α2b 샘플의 은-염색된 SDS-PAGE(12%)이다. 레인 1: 분자량 마커(쥐이 라이프사이언스); 레인 2: YPEG-IFN-α2b의 SP-세파로스 FF 정제 피크 1; 레인 3: YPEG-IFN-α2b의 SP-세파로스 FF 정제 피크 2; 레인 4: YPEG-IFN-α2b의 SP-세파로스 FF 정제 피크 3; 레인 5: YPEG-IFN-α2b의 SP-세파로스 FF 정제 피크 4.
도 4는 은 염색에 의해 SDS-PAGE를 7.5% 감소시킴으로써 측정된 SP-세파로스 FF 정제된 YPEG-rHuIFN-α2b 샘플의 겉보기 분자량이다. 레인 1: 분자량 마커(쥐이 라이프사이언시즈); 레인 2: YPEG-HuIFN-α2b SP1, 2㎍; 레인 3: YPEG-rHuIFN-α2b SP2, 2㎍; 레인 4: YPEG-rHuIFN-α2b SP3, 2㎍.
도 5는 말디-토프(MALDI-TOF) MS에 의해 측정된 SP-세파로스 FF 정제된 YPEG-IFN-α2b 샘플의 분자량이다.
도 6은 말디-토프 MS에 의해 측정된 YPEG-NHS(40KD)의 분자량이다.
도 7은 30㎍·kg-1 YPEG-rhIFN-α2b의 필리핀 원숭이(마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis))로의 단일 피하 주입 후 혈청 약물 농도 및 활성이다.
도 8은 트립신 소화된 YPEG-rHuIFN-α2b SP2의 트립시나제 펩타이드 멥핑의 블랭크 대조군이다. 두 개의 작은 피크가 각각 71.674분 및 17.589분에서 검출되었고, 트립신 피크는 2 내지 3분에 검출되었다.
도 9는 HPLC-RP C18에 의한 트립신 소화된 (0시간) YPEG-IFN-α2b SP2 샘플의 트립시나제 펩타이드 멥핑의 분석이다. YPEG-IFN-α2b SP2의 체류 시간은 62.114분이고, 71.908분에서의 용리 피크는 배경이며, 2 내지 3분이다.
도 10은 HPLC-RP C18에 의한 트립신 소화된 (48시간) YPEG-IFN-α2b SP2 샘플의 트립시나제 펩타이드 멥핑의 분석이다. 60.5분과 63.2분 사이에 어떠한 기질 피크(62.114분)도 검출되지 않았고, 이는 샘플이 완전히 소화되었음을 증명한다.
도 11은 트립신 완전히 소화된 YPEG-IFN-α2b SP2 샘플로부터의 YPEG 변형된 펩타이드의 세파크릴(Sephacryl) S-100 HR 분리 프로파일이다. 샘플을 피크에 따라 모았고, S100-1은 YPEG 변형된 펩타이드, 즉 표적 샘플이었다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, Y-형 PEG 유도체 분자는 다음과 같다:
Figure 112010021184056-pct00006
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기이고, 바람직하게는 메틸이고,
m 및 m'는 중합도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고,
m + m'는 바람직하게는 600 내지 1500이고,
Ri는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬 기이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
F는 하이드록실 기, 카복실 기, 에스터 기, 카복실산 클로라이드, 하이드라자이드, 말레이미드, 피리딘 및 다이설파이드로 이루어진 군 중에서 선택된 말단 기이고, 치료제 또는 기질의 아미노 기, 하이드록실 기 또는 메르캅토 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다.
바람직하게는, PEG의 총 평균 분자량은 약 10000 내지 약 60000 달톤, 가장 바람직하게는 약 40000 달톤이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, Y-형 PEG 유도체 분자의 가능한 구조식은 하기 화학식 I에 나타낸 바와 같다:
[화학식 I]
Figure 112010021184056-pct00007
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기이고, 바람직하게는 메틸이고,
m 및 m'는 중합도를 나타내고 임의의 정수일 수 있고,
m + m'는 바람직하게는 600 내지 1500이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
PEG의 총 평균 분자량은 약 40000 달톤이다.
본 발명자들은 인터페론-α2b(IFN-α2b)를 변형시키기 위해 Y-형 분지된 PEG 유도체(YPEG)를 사용하였고 Q-세파로스 FF 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b를 단리시켰다. 또한, 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 단리된 YPEG-IFN-α2b는 SP-세파로스 FF 크로마토그래피에 의해 추가로 분리되어 YPEG가 서열 식별 번호: 1의 134 위치에서 Lys의 측 쇄 ε-NH2에 주로 연결된 YPEG-IFN-α2b가 수득되었으며, 이는 YPEG-IFN-α2b(134)로 지칭된다. 측정 후, YPEG-IFN-α2b(134)의 시험관내 활성이 YPEG가 다른 아미노산 잔기에 연결된 YPEG-IFN-α2b보다 상당히 더 높고, YPEG-IFN-α2b(134)의 반감기가 혈청에서 비변형된 IFN-α2b보다 상당히 더 긴 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 하기의 화학식 A의 구조를 갖는 단일 아미노산 잔기에서 PEG화된 IFN-α2b를 제공한다:
[화학식 A]
Figure 112010021184056-pct00008
상기 식에서,
Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
Ri는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬 기이고,
X1 및 X2는 독립적으로 연결기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 이루어진 군 중에서 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b의 구조식은 하기 화학식 II에 나타낸 바와 같다:
[화학식 II]
Figure 112010021184056-pct00009
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기, 바람직하게는 메틸이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
m 및 m'는 중합도를 나타내고, 임의의 동일하거나 상이한 정수일 수 있다.
이러한 구조에서, Y-형 분지된 PEG 분자는 하나의 단일 아미노산 잔기를 통해 IFN-α2b 분자에 연결된다. 화학식 II에서 YPEG-IFN-α2b의 평균 분자량은 주로 중합도, m 및 m'에 의존한다. m + m'가 바람직하게는 600 내지 1500인 경우, 상응하는 YPEG의 평균 분자량은 약 26000 내지 약 66000 달톤이다. m + m'가 바람직하게는 795 내지 1030인 경우, 상응하는 YPEG의 평균 분자량은 약 35000 내지 약 45000 달톤이다. m + m'가 바람직하게는 885 내지 1030인 경우, 상응하는 YPEG의 평균 분자량은 약 39000 내지 약 45000 달톤이다. m + m'가 가장 바람직하게는 910인 경우, 상응하는 YPEG의 평균 분자량은 40000 달톤이다. m 대 m'의 비율은 0.5 내지 1.5 범위, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 범위일 수 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b에서 PEG 분자는 서열 식별 번호: 1에 나타낸 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 또는 164 위치에 상응하는 IFN-α2b의 Lys 잔기의 측 쇄 ε-아미노 기 또는 N-말단 아미노산의 α-아미노기에 의해 형성된 아미도 결합을 통해 IFN-α2b에 연결된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b에서, PEG 분자는 서열 식별 번호: 1에 나타낸 134 위치에 상응하는 IFN-α2b의 Lys 잔기의 측 쇄 ε-아미노 기에 의해 주로 형성된 아미도 결합을 통해 IFN-α2b에 연결된다.
선택적으로, 본 발명의 IFN-α2b는 재조합 생명공학에 의해 수득되거나 천연 공급원으로부터 추출될 수 있다. 바람직하게는, IFN-α2b는 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 IFN-α2b(hIFN-α2b)이고, 이는 재조합 생명공학에 의해 수득되거나 천연 공급원으로부터 추출된다. 보다 바람직하게는, 인간 IFN-α2b는 재조합 인간 IFN-α2b(rhIFN-α2b)이다. rhIFN-α2b는 인위적으로 합성되거나 원핵 발현 시스템, 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 발현되거나, 진핵 이스트 발현 시스템, 예컨대 피치아(Pichia)로부터 발현되거나 곤충 세포 발현 시스템 또는 포유류 세포 발현 시스템, 예컨대 CHO로부터 발현될 수 있다. 천연 또는 재조합 IFN-α2b의 제조 방법 및 IFN-α2b 및 YPEG 변형된 IFN-α2b의 활성 시험은 종래 기술에 공지되어 있다.
IFN-α2b와 유사하게, 본 발명의 YPEG-IFN-α2b는 또한 종양 및 바이러스 감염, 예컨대 간염, 모발상 세포 백혈병, 세포-매개된 림프구 용해, 카포시(Kaposi) 육종 등을 치료하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 임상시에, 본 발명의 YPEG-IFN-α2b는 안정성, 용해도, 혈청에서의 반감기 및 임상 치료 효능 면에서 IFN-α2b와 비교할 경우 명백히 개선된다. 투여 방식에 있어서, 본 발명의 YPEG-IFN-α2b는 약학적 유효량의 YPEG-IFN-α2b 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다른 양태에서, 약학적 효과량의 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 만니톨, 아미노산, 염화나트륨 및 아세트산나트륨을 포함하고, 이때 아미노산은 바람직하게는 아스파르트산, 아스파라긴 및 글리신으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 IFN-α2b 치료가 필요한 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b 또는 본 발명의 PEG화된 IFN-α2b를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게는, IFN-α2b 치료가 필요한 질병은 바이러스 감염, 예컨대 B형 간염, C형 간염, D형 간염 및 첨형 콘딜로마, 종양, 예컨대 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저등급 악성 비호지킨(non-Hodgkin) 백혈병, 세포-매개된 림프구 용해, 카포시 육종, 다발 골수종, 악성 흑색종, 피부 T 세포 림프종, 후두 유두종, 재발성 또는 전이성 신 세포 암, 염증 장애 및 질환, 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 천식, 낭성 섬유증 및 간질성 폐 질환, 및 골수증식 질환 관련 고혈소판증으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
YPEG 변형된 IFN-α2b를 수득하기 위해, 본 발명의 한 실시양태에서, 활성화된 YPEG 유도체, 예컨대 PEG N-하이드록실 석신이미딜 에스터(YPEG-NHS)의 PEG 잔기는 먼저 친핵성 치환을 통해 단백질의 아미노(-NH2) 기에 공유 결합되며, 이때 아미노 기는 Lys 잔기의 ε-아미노 기 및 단백질의 N-말단 α-아미노 기를 포함한다. IFN-α2b 및 YPEG로부터 YPEG-IFN-α2b의 생성에 대한 반응식은 다음과 같다:
Figure 112010021184056-pct00010
반응 조건은 온화하며, pH는 4.5 내지 9.5 범위이고, 온도는 0 내지 25℃이고, 교반 또는 다른 혼합 기구가 필요하다. 상세한 조건은 본 발명의 상세한 설명의 실시예를 참고한다. 상이한 분자량을 갖는 모든 YPEG는 상기 방법을 사용하여 IFN-α2b에 연결될 수 있다. 생성물은 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 것(YPEG-IFN-α2b), 두 개의 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 것(YPEG2-IFN-α2b) 및 다중 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 것(YPEGn-IFN-α2b)을 포함하며, 이때 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물이 반응 조건을 조정함으로써 주된 생성물이 될 수 있다.
이어서, 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b는 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 배제 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 모든 종류의 YPEG 변형된 IFN-α2b의 혼합물로부터 단리될 수 있고, 이어서 상이한 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 IFN-α2b는 더욱 분할되어 YPEG가 특정 위치에서 연결된 YPEG-IFN-α2b가 수득될 수 있다. 통상적인 정제 방법은 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 배제 크로마토그래피를 포함한다. 특성화 분석은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예컨대 질량 분광분석, 폴리아크릴아마이드 겔 전기이동 및 고 성능 액체 배제 크로마토그래피를 사용하여 생성물의 분자량을 분석하여 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물을 둘 또는 다중 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 것 및 비변형된 IFN-α2b와 구별할 수 있다. 또한, 상기 언급된 정제 방법을 사용하여 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물을 더욱 분할하여 상이한 단일 위치에서 PEG 변형을 갖는 상이한 이성질체를 수득할 수 있다. 모든 종류의 PEG 변형된 생성물의 시험관내 생물학적 활성은 IFN-활성에 대해 공지된 임의의 분석, 예컨대 세포변성 효과 억제에 따라 측정될 수 있다. 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 IFN의 경우, 상이한 이성질체에서 PEG 잔기는 IFN의 활성 도메인을 유지하는데 상이한 효과를 가져서, 상이한 이성질체의 생물학적 활성의 큰 차이를 유발시킨다. 일반적으로, IFN의 시험관내 활성은 PEG 변형 후 현저하게 감소된다. 그러나, 본 발명에 따라 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수득된 3개의 피크의 단리물의 시험관내 특이적 활성이 측정되었고, 그 결과 피크 3(SP2)의 단리물이 다른 피크의 단리물 및 페가시스(스위스 바젤 소재의 호프만-라 로슈)보다 더 상당히 높은 특이적 활성을 갖고, 비변형된 IFN-α2b보다 혈청에서 상당히 긴 반감기를 갖는 것으로 나타났다.
추가의 실시양태에서, SP2로부터 단리된 Y-분지된 PEG-연결된 펩타이드를 에드만(Edman) 분해를 사용하여 서열화하였고, 그 결과 SP2의 주 성분이 YPEG-IFN-α2b(134)인 것으로 나타났다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 또한
(a) 알칼리성 조건하에, 바람직하게는 pH 9.0에서 하기 화학식 I에 나타난 Y-형 분지된 PEG를 IFN-α2b와 반응시킨 후 PEG화된 IFN-α2b를 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서의 반응 생성물을 음이온 교환 수지, 바람직하게는 Q 세파로스 FF에 의해 포획하고, 생성물을 음이온 구배, 바람직하게는 클로라이드 이온 구배에서 용리하여 변형된 생성물을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 포획된 반응 생성물을 양이온 교환 수지, 바람직하게는 SP 세파로스 FF에 의해 양이온 구배, 바람직하게는 나트륨 이온 구배에서 용리하고 각각의 피크를 별도로 모으는 단계;
(d) 각각의 피크로부터의 생성물의 활성을 측정하고, 가장 높은 활성을 갖는 반응 생성물에 상응하는 피크를 선택하는 단계
를 포함하는, YPEG-IFN-α2b의 제조 및 정제 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure 112010021184056-pct00011
상기 식에서,
R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기, 바람직하게는 메틸이고,
j는 1 내지 12의 정수이고,
m 및 m'는 중합도를 나타내며, 임의의 정수일 수 있고,
m + m'는 바람직하게는 600 내지 1500이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재되지만, 임의의 실시예 또는 그의 조합이 본 발명의 범위 또는 실시양태를 제한하는 것으로서 이해해서는 안된다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다. 상세한 설명 및 종래 기술과 함께, 당해 분야의 숙련자는 청구범위에 의해 제한된 범위를 명백하게 이해할 것이다.
실시예 1
Y-형 분지된 PEG 변형된 재조합 인간 IFN-α2b의 제조
(1) Y-형 분지된 PEG 변형된 재조합 인간 IFN-α2b의 소규모 제조
YPEG(화학식 I, 평균 분자량 40KD, 등지, 제품 번호 RD010P041, 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드(Beijing JenKem Technology Co., Ltd.)) 166.1mg을 칭량하고 2mM HCl(구앙동 구앙후아 케미칼 팩토리 컴파니 리미티드(Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.) 1ml에 용해시켰다. IFN-α2b(샤먼 아모이톱 바이오테크 컴파니 리미티드(Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) 40mg 및 50mM 붕산-붕사 완충액(pH 9.0 시노팜 상하이 케미칼 리전트 컴파니 리미티드(Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.))을 10ml의 최종 반응 부피에 첨가하였다. 이러한 반응 시스템에서, IFN-α2b의 최종 농도는 4mg/ml이고, IFN-α2b 대 YPEG의 반응 몰 비는 1:2이다. 반응 시스템을 교반하면서 2시간 동안 0 내지 20℃하에 유지시켰다. 이어서, PEG화된 IFN-α2b가 생성되었고, 빙초산(산터우 시룽 케미칼 컴파니 리미티드(Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.))을 첨가하여 pH 4.0 미만으로 만들어 반응을 중지시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 가하였다. 반응 시스템을 물로 50배 희석하고 이어서 0.2㎛ 여과한 후 추가의 용도를 위해 4℃에서 저장하였다.
Q-세파로스 FF 크로마토그래피를 사용하여 남아있는 PEG 및 PEG 하이드롤레이트, 다중 아미노산 잔기에서 YPEG에 의해 변형된 IFN-α2b, 단일 아미노산 잔기에서 YPEG에 의해 변형된 IFN-α2b 및 비변형된 IFN-α2b를 분리하였다. Q-세파로스 FF(쥐이 헬쓰케어(GE healthcare)) 컬럼(Φ12mm × 90mm, 1CV = 10ml)을 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-1M NaCl(BBI)의 3CV로 재생시킨 후 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)의 5CV로 평형화시켰다. UV 검출 파장을 280nm에서 설정하였다. 4℃에서 저장된 전체 샘플을 부하하였다. 부하 후, 컬럼을 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)의 3CV로 평형화시킨 후 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-12mM NaCl을 제 1 피크가 완전히 용리될 때까지 용리하기 위해 사용하였으며, 이 피크는 남아있는 PEG이었다. 이어서, 용리를 위해 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-60mM NaCl을 사용하였고, 이 용리 피크에서 모은 샘플은 주로 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b이었다. 이어서, 용리를 위해 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-500mM NaCl을 사용하였고, 용리 피크는 비변형된 IFN-α2b이었다.
표적 생성물은 주로 20 내지 40%의 수율을 갖는 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b이었다.
(2) Y-형 분지된 PEG 변형된 재조합 인간 IFN-α2b의 대규모 제조
YPEG(화학식 I, 평균 분자량 40KD, 등지, 제품 번호 RD010P041, 베이징 젠켐 테크놀로지 컴파니 리미티드) 4982.4mg을 칭량하고 2mM HCl 25ml에 용해시켰다. IFN-α2b 1200mg 및 50mM 붕산-붕사 완충액(pH 9.0)을 200ml의 최종 반응 부피에 첨가하였다. 이러한 반응 시스템에서, IFN-α2b의 최종 반응 농도는 6mg/ml이고, IFN-α2b 대 YPEG의 반응 몰 비는 1:2이다. 반응 시스템을 교반하면서 2시간 동안 0 내지 25℃하에 유지시켰다. 빙초산을 첨가하여 pH 4.0 미만으로 만들어 반응을 중지시켰다. 샘플을 SDS-PAGE에 가하였다. 반응 시스템을 물로 50배 희석하고 이어서 0.2㎛ 여과한 후 추가의 용도를 위해 4℃에서 저장하였다.
Q-세파로스 FF 크로마토그래피를 사용하여 남아있는 PEG 및 PEG 하이드롤레이트, 다중 아미노산 잔기에서 YPEG에 의해 변형된 IFN-α2b, 단일 아미노산 잔기에서 YPEG에 의해 변형된 IFN-α2b 및 비변형된 IFN-α2b를 분리하였다. Q-세파로스 FF(쥐이 헬쓰케어) 컬럼(Φ38mm × 265mm, 1CV = 300ml)을 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-1M NaCl의 3CV로 재생시킨 후 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)의 5CV로 평형화시켰다. UV 검출 파장을 280nm에서 설정하였다. 4℃에서 저장된 전체 샘플을 부하하였다. 부하 후, 컬럼을 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)의 3CV로 평형화시킨 후 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-12mM NaCl을 제 1 피크가 완전히 용리될 때까지 용리하기 위해 사용하였으며, 이 피크는 남아있는 PEG이었다. 이어서, 용리를 위해 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-60mM NaCl을 사용하였고, 이 용리 피크에서 모은 샘플은 주로 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b이었다. 이어서, 용리를 위해 20mM 붕산/붕사 완충액(pH 9.0)-500mM NaCl을 사용하였고, 용리 피크는 비변형된 IFN-α2b이었다.
표적 생성물은 주로 35 내지 50%의 수율을 갖는 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 YPEG-IFN-α2b이었다.
도 1은 YPEG(40KD)에 의해 변형된 IFN-α2b의 2개의 배치의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 도 1로부터 조건하에, rhIFN-α2b의 PEG 변형 비율은 35 내지 50%이고, 안정하게 남아 있음을 알 수 있다. 주된 변형된 생성물은 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형되었고(YPEG-IFN-α2b), 또한 다중 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 몇몇 생성물도 존재하였다(YPEGn-IFN-α2b).
실시예 2
SP-세파로스 FF에 의한 YPEG-IFN-α2b의 분할
Q-세파로스 FF 포획된 YPEG-IFN-α2b 샘플을 20% 아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 조정하고, 이어서 5mM NaAc/HAc(pH 5.0, 산터우 시룽 케미칼 컴파니 리미티드)를 사용하여 15배로 희석하였다. SP-세파로스 FF 100ml(쥐이 헬쓰케어) 컬럼(Φ18mm × 394mm)에 대해 0.5mg/ml 부하 용량으로 샘플을 부하하였다. 컬럼을 5mM NaAc/HAc(pH 5.0)의 3CV를 사용하여 평형화하고, 이어서 0 내지 30% 5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH 5.0) 구배의 2.5CV에 이어서 30 내지 100% 5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH 5.0) 구배의 50CV를 사용하여 용리하였다. YPEG-IFN-α2b를 SP-세파로스 FF 100ml에 의해 4개의 용리 피크로서 분할하였다. 샘플을 이 피크에 따라 모으고, 이어서 각각 은 염색하면서 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. SDS-PAGE 결과에 따라, SP-세파로스 FF에 의해 분할된 피크 1은 주로 다중 아미노산 잔기에서 YPEG에 의해 변형된 생성물(YPEGn-IFN-α2b)인 것을 알 수 있다. SP-세파로스 FF에 의한 피크 2는 주로 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물(YPEG-IFN-α2b)이었고, 또한 다중 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 몇몇 생성물을 함유하였다. SP-세파로스 FF에 의한 피크 3 및 피크 4는 모두 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물이었다. SP-세파로스 FF에 의해 분할된 피크 2 내지 4는 상이한 단일 위치에서 YPEG에 의해 변형된 이성칠체이었으며, 이를 각각 YPEG-IFN-α2b SP1, YPEG-IFN-α2b SP2 및 YPEG-IFN-α2b SP3으로 지칭하였다. 분할 프로파일 및 은-염색된 SAD-PAGE 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
YPEG-IFN-α2b SP1 내지 3의 모든 샘플을 염화나트륨, 아세트산나트륨, 만니톨, 아스파르트산으로 보충하고 0.22㎛ 필터로 살균한 후 추가의 용도를 위해 4℃에서 저장하였다.
실시예 3
YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 특성화 분석
(1) 단백질 농도
YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 농도를 켈달(Kjeldahl) 방법에 의해 측정하였다.
(2) 단백질 겉보기 분자량
YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 겉보기 분자량을 SDS-PAGE에 의해 측정하였다. 방법은 램밀리(Laemmli) 등(문헌[Nature 227: 680, 1970])에 따랐다. 겔의 농도는 7.5%이었고, 겔을 은 염색에 의해 시각화하였다. YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 겉보기 분자량은 약 123KD로 거의 동일하였다(도 4).
(3) 말디-토프 MS에 의해 측정된 분자량
말디-토프 MS(오토플렉스(Autoflex) 토프/토프 시스템, 독일 소재의 브루커 달토닉스(Bruker Daltonics))를 사용하여 YPEG-rHuIFN-α2b 변형 이성질체의 분자량을 측정하였다. 시나핀산(SA, C11H12O5, 분자량 224.22, 제품 번호: 2006 236870 002, 독일 소재의 브루커 달토닉스)을 매트릭스로서 사용하였다. 단백질 보정 표준물 II(부품 번호 207234, 독일 소재의 브루커 달토닉스)를 단백질 분자량 표준물로서 사용하였으며, 데이터 분석 소프트웨어는 플렉스어날리시스(FlexAnalysis) 버젼 3.0.54.0이었다. YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체의 MS 분자량은 약 59000 달톤으로 거의 동일하였다(도 5).
(4) 내독소 함량 시험
리물러스 측정법(문헌[Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C])에 기초할 때, 모든 YPEG-IFN-α2b 샘플의 내독소 함량은 5.0EU/mg 미만이었다.
(5) 동물에서 YPEG-IFN-α2b SP2의 생체내 활성 및 약동학
① 동물에서 YPEG-IFN-α2b SP2의 생체내 활성
IFN의 작용 기전은 부분적으로 2',5'-AS(2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제)의 생성을 유도하며, 이는 결국 그의 항바이러스 효과를 발휘한다. 표지자로서 125I를 사용함으로써, IFN의 약역학 매개변수는 생체내 2',5'-AS 활성에 의해 반영되었다. 2',5'-AS는 폴리(I)·폴리(C) 아가(agar)의 존재하에 ATP로부터 2',5'-A(2',5'-올리고아데닐레이트)의 합성을 촉매한다(2',5'-AS의 활성은 합성된 2',5'-A의 농도에 의해 표시될 수 있다). 먼저, 샘플 중 2',5'-AS를 폴리(I)·폴리(C) 아가로스에 의해 흡착시키고 활성화시킨 후 기질 ATP를 촉매화하여 2',5'-A를 생성시켰다. 125I 표지된 2',5'-A, 항-2',5'-A 혈청 및 2차 항체의 혼합물을 샘플에 첨가하고, 그 후 이를 배양하고 원심분리하여 혼합물을 분리하였다. 상청액을 버리고, 감마 카운터(Gamma Counter)를 사용하여 침전물의 방사선활성을 측정하였다. 초기에 첨가된 125I 표지된 2',5'-A의 결합 비율을 계산하였다. 4개의 매개변수 로지스틱 회귀(Logistic regression)를 사용하여 표준 곡선을 만들고, 그 후, 미확인 샘플 중 2',5'-AS-유도된 2',5'-A 생성물의 농도를 평가할 수 있었다.
상기 언급된 2',5'-A 방법을 사용하여 표 1 및 도 7에서의 결과는 30㎍·kg-1 YPEG-IFN-α2b SP2의 필리핀 원숭이(마카카 파시큘라리스)로의 단일 피하 주입 후 혈청 2',5'-A 농도를 나타내었다(18마리의 필리핀 원숭이, 구앙시 웨이메이 바이오테크놀로지 컴파니 리미티드(Guangxi Weimei Biotechonology Co., Ltd.), 인증 번호 SCXK-GUI 2002-0001, 체중 2.5 내지 5.5kg, 6마리의 암컷과 12마리의 수컷, 별도의 우리에서 사육됨, 표준 원숭이 사료를 공급함, 자유롭게 음용함). 도 8로부터, 평균 시간 대 피크는 64±27.71시간이고, 농도 대 피크는 292.30±148.08Pmol·dL-1임을 알 수 있다. 투여 후 혈청 중 2',5'-AS의 활성이 명백히 증가하였으며, 혈청 중 2',5'-A의 시간 대 피크가 YPEG-rhIFN-α2b SP2보다 지연되었다.
Figure 112010021184056-pct00012
② 필리핀 원숭이에서 YPEG-IFN-α2b 및 rhIFN-α2b의 약동학
10, 30 또는 100㎍·kg-1 YPEG-IFN-α2b의 단일 피하 주입을 필리핀 원숭이에게 하였다. 투여 그룹에서, 정맥혈 1ml를 투여 전, 투여 후 1, 2, 4, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240 및 312 시간에 주입된 쪽 반대의 뒷다리로부터 채취하였다. IFN-α2b의 단일 피하 주입(30㎍·kg-1)을 갖는 그룹에서, 혈액 1ml를 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 및 24시간에 채취하였다. 30분 동안 4℃에서 유지시킨 후, 혈액 샘플을 저온하에 10분 동안 2000rpm에서 원심분리하고, 이어서 혈청을 즉시 분리하고 추가의 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다.
정량 이중 샌드위치 면역분석을 사용하였다. 재조합 인간 IFN-α에 특이적인 단클론성 항체를 마이크로타이터 판 상에 예비코팅하였다. 표준물 및 샘플을 마이크로타이터 웰로 피펫팅하였고, 이때 IFN-α2b 또는 YPEG-IFN-α2b SP2는 고정된 항체에 결합한다. 판을 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고, 이어서 항-인간 IFN-αIgG(2차 항체)를 웰에 첨가하였다. 반응이 완료된 후, 판을 세척하고, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)를 웰에 첨가하였다. 세척하여 결합되지 않은 효소 및 시약을 제거한 후, HRP 기질 용액을 각 웰에 첨가하여 생성된 색은 제 1 단계에서 결합된 IFN-α2b 또는 YPEG-rhIFN-α2b SP2의 양에 비례하였다. 반응을 중지하고, 색 강도를 측정하였다. 흡광 OD 값이 보다 높을수록 샘플 중 IFN-α2b 또는 YPEG-IFN-α2b SP2의 농도가 보다 높았다. 표준 곡선을 각각 IFN-α2b 및 YPEG-IFN-α2b SP2에 대해 플롯팅하여 혈액 샘플 중 혈청 약물 농도를 측정하였다.
키트 사양의 프로토콜에 따라(어메리칸 바이오메디칼 컴파니(American Biomedical Co.), 제품 번호 3271), 100㎕ 표준물 또는 혈액 샘플을 각각의 웰에 첨가하고 판 혼합기를 사용하여 부드럽게 혼합하였다. 미확인 샘플의 예상 농도에 따라, 희석 용액을 사용하여 표준 곡선의 농도 범위로 샘플을 희석하였다. 각각의 판에 대한 IFN-α2b 또는 YPEG-IFN-α2b SP2 표준 곡선을 플롯팅하여 판 중 미확인 샘플의 농도를 계산하였다. 판을 1시간 동안 실온에서 배양하고, 판 세척 용액으로 1회 세척하였다. 100㎕ 2차 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 실온하에 유지하였다. 판을 3회 세척하고, 100㎕ HRP 컨쥬게이트를 각각의 웰에 첨가하였다. 판을 1시간 동안 실온에서 배양하고 4회 세척하였다. 100㎕ TMB 기질을 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 어두운 상태로 실온하에 유지하였다. 100㎕ 정지액을 각각의 웰에 첨가하고, 부드럽게 혼합하여 반응을 중지하였다. 450nm에서 흡광 OD 값을 5분 이내에 마이크로판 판독기로 측정하여 각각의 샘플의 농도를 측정하였다.
낮은 투여량, 중간 투여량 또는 높은 투여량(각각, 10, 30 및 100㎍·kg-1)의 YPEG-IFN-α2b의 필리핀 원숭이로의 단일 피하 주입 후, 반감기는 각각 48.87±11.67, 51.94±3.52 및 49.60±2.97 시간이었다. 30㎍·kg-1 IFN-α2b의 필리핀 원숭이로의 단일 피하 주입 후, 반감기는 3.22±0.10시간이었다. IFN-α2b의 반감기는 YPEG 변형 후 10배 이상 연장되었다.
(6) YPEG-IFN-α2b 변형 이성질체 각각의 시험관내 생물학적 활성을 세포변성 효과 억제 분석을 사용하여 평가하였다. 인터페론 활성의 측정 방법에 기재된 방법에 따라(문헌[Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C]), 인터페론은 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 의해 유발된 손상으로부터 인간 양막 세포(WISH)를 보호한다. 크리스탈 바이올렛을 사용하여 생존된 WISH 세포를 염색하고, 흡광 OD 값을 570nm에서 측정하였다. 인터페론 보호 효과 곡선을 WISH 세포에 대해 플롯팅하여 인터페론의 시험관내 생물학적 활성을 측정하였다. 각각의 샘플의 시험관내 생물학적 활성 결과를 표 2에 나타내었고 3개의 유사한 시험을 각각의 샘플에 대해 수행하였다. YPEG 변형 후, 단일 아미노산 잔기에서 PEG에 의해 변형된 생성물의 모든 변형 이성질체에서, SP2 샘플이 가장 높은 시험관내 특이적 활성인 것으로 나타났고, 이는 SP1, SP3 및 페가시스(스위스 바젤 소재의 호프만-라 로슈에 의해 제조됨; 상하이 로슈 파마슈티칼스 리미티드(Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd.)에 의해 별도로 포장됨, 생산 제품 번호 B1016, 포장 제품 번호 SH0020)보다 1 내지 2배 더 높으며, 또한 분할되지 않은 샘플보다 1 내지 2배 더 높다.
YPEG-IFN-α2b의 각각의 변형 이성질체에 대한 시험관내 생물학적 활성 결과(3개의 유사한 시험)
샘플 PEG 유형 PEG 분자량
(KD)		 변형 위치의 번호 평균 특이적 활성
(× 106IU/mg)
YPEG-IFN-α2b SP1 Y-분지형 40 1 1.07±0.172
YPEG-IFN-α2b SP2 Y-분지형 40 1 2.65±0.185
YPEG-IFN-α2b SP3 Y-분지형 40 1 1.13±0.215
YPEG-IFN-α2b 분할되지 않은 샘플 Y-분지형 40 1 1.68±0.217
페가시스 U-분지형 40 1 0.934±0.042
주: 분할되지 않은 샘플은 SP-세파로스 FF에 의해 YPEG-rhIFN-α2b를 분할하기 전 샘플을 지칭한다.
(7) YPEG-IFN-α2b SP2에서 변형 위치의 분할
YPEG-IFN-α2b SP2의 용매 시스템을 5K 울트라필터(밀리포어(Millipore), 폴리에터설폰 물질)에 의해 한외 여과하여 50mH NH4HCO3(pH 8.0)으로 변화시켰고, 단백질 농도는 UV 분광학을 사용하여 3.82mg/ml로 측정하였다. TPCK 트립신(프로메가(Promega))을 제조자에 의해 제공된 용액에 용해시켰다(0.5㎍/㎕). 표 3에 따라 샘플을 첨가하였다.
YPEG-IFN-α2b SP2 트립신 소화의 반응 조성
반응 성분 부피
50mM NH4HCO3, pH 8.0 7.08ml
PEG-IFN-α2b SP2(3.82mg/ml) 1.32ml
트립신(0.5㎍/㎕) 0.2ml
총 반응 부피 8.6ml
반응 시스템을 48시간 동안 37℃에서 수 욕에서 유지시킨 후 20% 아세트산 1.52ml를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 소량의 샘플을 HPLC-RP C18 펩타이드 맵핑을 위해 취하였다. 분석용 기구는 유형 600의 조절기, 2487 이중 파장 검출기를 갖춘 워터스 HPLC 시스템(Waters HPLC system)이고, 데이터 프로세싱을 위한 소프트웨어는 엠파워(Empower) 2이다. HPLC 분석 컬럼은 주피터(Jupiter) C18(미국 소재의 페노메넥스(Phenomenex)에 의해 제조됨, 입경 5㎛, 공극 직경 300Å, Φ4.6 × 150mm)이다. 이동 상 A는 0.1% TFA/H2O이고, 이동 상 B는 0.1% TFA/90% ACN/H2O이고, 유속은 1ml/분이고, 검출 파장은 214nm에서 설정하였다. 용리 구배를 위해 표 4를 참고하며, 결과를 도 8 내지 10에 나타내었다.
트립신 소화된 YPEG-IFN-α2b SP2의 HPLC-RP C18 펩타이드 맵핑을 위한 용리 구배
시간(분) A% B% ACN%
1 0 100 0 0
2 8 100 0 0
3 68 40 60 54
4 72 40 60 54
5 75 100 0 0
6 80 100 0 0
검출 결과에 기초하여, 샘플이 거의 완전히 소화되었음을 결정할 수 있다. 생성물은 반응이 중지된 후 DTT 감소로 치료되었다. 세파크릴 S-100HR 컬럼(Φ18 × 255mm, 1CV = 64ml; 쥐이 헬쓰케어)을 20mM PBNa-400mM NaCl(pH 7.0)의 3CV로 예비평형화시켰고, TPCK 트립신에 의해 완전히 소화된 YPEG-IFN-α2b SP2 샘플의 3% CV를 수압기에 의해 부하하였다. 용리를 위해 20mM PBNa-400mM NaCl(pH 7.0)을 사용하고, 검출 파장을 280nm에서 설정하였다. 제 1 용리 피크로부터의 샘플을 모으고(샘플 번호: YPEG-IFN-α2b S100-1, 도 11), 용매 시스템을 5K 울트라필터에 의해 5mM PBNa(pH 7.0)로 변화시켰다. 진공 동결-건조를 행하였다. 동결-건조된 샘플의 N-말단 아미노산을 에드만 분해를 사용하여 결정하였으며, 샘플의 N-말단에서 7개의 아미노산의 서열은 XYSPXAW이고(표 5), 이때 X는 α-아미노산 시스테인(Cys), 비-α-아미노산 또는 에드만 분해를 사용하여 검출될 수 없는 다른 변형된 아미노산을 나타낸다. 서열 식별 번호: 1에 나타낸 서열에 따라, YPEG-IFN-α2b SP2가 주로 Lys 134에서 YPEG에 의해 변형된 생성물인 것으로 결정할 수 있다.
YPEG-IFN-α2b S100-1의 N-말단 아미노산에 대한 서열화 결과
샘플 검출된 N-말단 서열 상응하는 PEG 변형 위치
YPEG-IFN-α2b S100-1 XYSPXAW Lys 134
주: X는 α-아미노산 시스테인(Cys), 비-α-아미노산 또는 에드만 분해를 사용하여 검출될 수 없는 다른 변형된 아미노산을 나타낸다.
SEQUENCE LISTINGS <110> BIOSTEED GENE EXPRESSION TECH. CO., LTD. <120> POLYETHYLENE GLYCOL MODIFIED INTERFERON ALPHA 2B AND PREPARATION METHOD AND APPLICATIONS THEREOF <130> P2007474C <140> PCT/CN2007/002644 <141> 2007-09-04 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165

Claims (28)

  1. 인터페론-α2b(IFN-α2b)를 Y-형 분지된 폴리에틸렌 글리콜(YPEG)과 연결시킴으로써 수득되는, 하기 화학식 A의 구조를 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)화된 IFN-α2b:
    화학식 A
    Figure 112014039793167-pct00027

    상기 식에서,
    Pa 및 Pb는 동일하거나 상이한 PEG이고,
    j는 1 내지 12의 정수이고,
    Ri는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기, 치환된 아릴, 아르알킬 또는 헤테로알킬이고,
    X1 및 X2는 독립적으로 연결기이고, 이때 X1은 (CH2)n이고, X2는 (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO 및 (CH2)nCO로 이루어진 군 중에서 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이고,
    이때 YPEG는 서열 식별 번호: 1의 134 위치에 상응하는 IFN-α2b 내의 Lys 잔기의 측쇄 ε-아미노 기에 의해 형성된 아미도 결합을 통해 IFN-α2b에 연결된다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 II의 구조를 갖고, YPEG의 평균 총 분자량이 10,000 내지 60,000 달톤인, PEG화된 IFN-α2b:
    화학식 II
    Figure 112014039793167-pct00028

    상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기이고,
    j는 1 내지 12의 정수이고,
    m 및 m'는 중합도를 나타내고, 임의의 정수일 수 있다.
  3. 제 2 항에 있어서,
    R 또는 R'가 메틸인, PEG화된 IFN-α2b.
  4. 제 2 항에 있어서,
    m + m'가 600 내지 1,500인, PEG화된 IFN-α2b.
  5. 제 2 항에 있어서,
    YPEG의 평균 총 분자량이 40,000 달톤인, PEG화된 IFN-α2b.
  6. 제 1 항에 있어서,
    IFN-α2b가 천연 공급원으로부터 추출되거나 재조합 생명공학을 통해 수득되는, PEG화된 IFN-α2b.
  7. 제 6 항에 있어서,
    IFN-α2b가 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 인간 IFN-α2b인, PEG화된 IFN-α2b.
  8. 제 6 항에 있어서,
    IFN-α2b가 재조합 인간 IFN-α2b인, PEG화된 IFN-α2b.
  9. 제 8 항에 있어서,
    재조합 인간 IFN-α2b가 인위적으로 합성되거나, 원핵 발현 시스템, 진핵 이스트 발현 시스템, 곤충 세포 발현 시스템 및 포유류 세포 발현 시스템으로 이루어진 군 중에서 선택되는 발현 시스템으로부터 발현되는, PEG화된 IFN-α2b.
  10. 제 9 항에 있어서,
    원핵 발현 시스템이 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)인, PEG화된 IFN-α2b.
  11. 제 9 항에 있어서,
    진핵 이스트 발현 시스템이 피치아(Pichia)인, PEG화된 IFN-α2b.
  12. 제 9 항에 있어서,
    포유류 세포 발현 시스템이 CHO 세포인, PEG화된 IFN-α2b.
  13. 제 1 항에 있어서,
    YPEG가 40,000 달톤의 분자량을 갖는 등지(equal-arm) YPEG인, PEG화된 IFN-α2b.
  14. 약학적 유효량의 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 PEG화된 IFN-α2b 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하고, 바이러스 감염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, 첨형 콘딜로마, 종양, 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저등급 악성 비호지킨 백혈병, 세포-매개된 림프구 용해, 카포시 육종, 다발 골수종, 악성 흑색종, 피부 T 세포 림프종, 후두 유두종, 재발성 또는 전이성 신 세포 암, 염증 장애 및 질환, 다발성 경화증, 관절염, 천식, 낭성 섬유증, 간질성 폐 질환 및 골수증식 질환 관련 고혈소판증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 IFN-α2b 치료가 필요한 질병을 갖는 환자를 치료하기 위한 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    만니톨, 아미노산, 염화나트륨 및 아세트산나트륨을 추가로 포함하는, 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    아미노산이 아스파르트산, 아스파라긴 및 글리신으로 이루어진 군 중에서 선택되는, 조성물.
  17. 제 14 항에 있어서,
    환자가 인간인, 조성물.
  18. (a) 알칼리성 조건하에서 하기 화학식 I의 Y-형 분지된 PEG를 IFN-α2b와 반응시킨 후 PEG화된 IFN-α2b를 수득하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 수득된 반응 생성물을 음이온 교환 수지에 의해 포획하고, 그 생성물을 음이온 구배에서 용리하여 개질된 생성물을 수득하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 포획된 반응 생성물을 양이온 교환 수지에 의해 양이온 구배에서 용리한 후, 각각의 피크별로 생성물을 별도로 모으는 단계;
    (d) 각각의 피크로부터의 생성물의 활성을 측정하고, 가장 높은 활성을 갖는 반응 생성물에 상응하는 피크를 선택하는 단계
    를 포함하는, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 PEG화된 IFN-α2b의 제조 및 정제 방법:
    화학식 I
    Figure 112014087257198-pct00029

    상기 식에서,
    R 및 R'는 독립적으로 C1-C4 알킬 기이고,
    j는 1 내지 12의 정수이고,
    m 및 m'는 중합도를 나타내며, 임의의 정수일 수 있다.
  19. 제 18 항에 있어서,
    단계 (a)의 반응이 pH 9.0에서 수행되는, 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    R 또는 R'가 메틸인, 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    m + m'가 600 내지 1,500인, 방법.
  22. 제 18 항에 있어서,
    음이온 교환 수지가 Q 세파로스 FF이고, 음이온 구배가 클로라이드 이온 구배인, 방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    양이온 교환 수지가 SP 세파로스 FF이고, 양이온 구배가 나트륨 이온 구배인, 방법.
  24. 제 18 항에 있어서,
    YPEG가 40KD의 분자량을 갖는, 방법.
  25. 제 18 항에 있어서,
    YPEG가 등지 YPEG인, 방법.
  26. 제 18 항에 있어서,
    IFN-α2b와 YPEG의 반응 몰 비가 1:2인, 방법.
  27. 인간을 제외한 환자에게, 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 PEG화된 IFN-α2b, 또는 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 PEG화된 IFN-α2b 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 바이러스 감염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, 첨형 콘딜로마, 종양, 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 저등급 악성 비호지킨 백혈병, 세포-매개된 림프구 용해, 카포시 육종, 다발 골수종, 악성 흑색종, 피부 T 세포 림프종, 후두 유두종, 재발성 또는 전이성 신 세포 암, 골수증식 질환 관련 고혈소판증, 염증 장애 및 질환, 다발성 경화증, 관절염, 천식, 낭성 섬유증 및 간질성 폐 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 IFN-α2b 치료가 필요한 질병의 치료 방법.
  28. 삭제
KR1020107007270A 2007-09-04 2007-09-04 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도 KR101502645B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2007/002644 WO2009030066A1 (fr) 2007-09-04 2007-09-04 Interféron alpha 2b modifié par du polyethylèneglycol et procédé de préparation et applications associés

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100082774A KR20100082774A (ko) 2010-07-19
KR101502645B1 true KR101502645B1 (ko) 2015-03-13

Family

ID=40428422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107007270A KR101502645B1 (ko) 2007-09-04 2007-09-04 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8597635B2 (ko)
EP (1) EP2186830B1 (ko)
JP (1) JP5325884B2 (ko)
KR (1) KR101502645B1 (ko)
CN (1) CN101636414B (ko)
AT (1) ATE548382T1 (ko)
AU (1) AU2007358605B8 (ko)
BR (1) BRPI0721984B8 (ko)
CA (1) CA2698173C (ko)
DK (1) DK2186830T3 (ko)
ES (1) ES2382124T3 (ko)
MX (1) MX2010002557A (ko)
PL (1) PL2186830T3 (ko)
PT (1) PT2186830E (ko)
RU (1) RU2485134C2 (ko)
WO (1) WO2009030066A1 (ko)
ZA (1) ZA201001556B (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
ES2382124T3 (es) 2007-09-04 2012-06-05 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferón alfa 2b modificado con polietilenglicol y método de preparación y aplicaciones de este
DK2196475T3 (da) * 2007-09-04 2012-09-17 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferon alfa 2a, som er modificeret med polyethylenglycol, fremgangsmåde til syntese deraf samt anvendelse deraf
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
KR101943821B1 (ko) 2011-06-21 2019-01-31 한국전자통신연구원 무선 통신 시스템에서 제어채널 송수신 방법
BR112014005091A2 (pt) * 2011-09-05 2017-06-13 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd composição farmacêutica para o tratamento do câncer compreendendo conjugado de interferon alfa
EA022617B1 (ru) * 2013-03-28 2016-02-29 Илья Александрович МАРКОВ Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA021610B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Жидкое противовирусное лекарственное средство
EA023323B1 (ru) * 2013-03-28 2016-05-31 Илья Александрович МАРКОВ Разветвленный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
PL3215193T3 (pl) * 2014-11-06 2024-03-18 Pharmaessentia Corporation Reżim podawania pegylowanego interferonu
US20180066229A1 (en) * 2015-03-17 2018-03-08 Shinshu University Method for preparing dendritic cells via non-adhesive culture using ifn
CN106146325B (zh) * 2015-04-24 2019-01-29 北京键凯科技股份有限公司 一种y型多缩乙二醇衍生物及其制备方法
WO2020256795A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 The Research Foundation For The State University Of New York Methods for treating neointimal hyperplasia using f11r/jam-a inhibitors
US20230218644A1 (en) 2020-04-16 2023-07-13 Som Innovation Biotech, S.A. Compounds for use in the treatment of viral infections by respiratory syndrome-related coronavirus
CN115968291A (zh) * 2020-04-22 2023-04-14 南湖制药公司 聚乙二醇化干扰素tau及其组合物和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
EP1496076A1 (en) * 2002-03-13 2005-01-12 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophilic polymer derivate with y type branch and preparation method of it medical composite comprising above compound

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US103411A (en) 1870-05-24 Improved liniment
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
TW426523B (en) * 1995-04-06 2001-03-21 Hoffmann La Roche Interferon solution
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
CN1243779A (zh) 1998-07-31 2000-02-09 东莞中镇鞋材有限公司 纤维板及其制造方法
US6610822B2 (en) * 2000-09-01 2003-08-26 Merck & Co., Inc. Purification process
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
JP2006508918A (ja) * 2002-09-05 2006-03-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 修飾されたアシアロインターフェロンおよびその使用
WO2004039996A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-13 Cadila Healthcare Limited Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris
AU2003293668A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Positional isomers of peg ifn alpha 2a
JP2006519235A (ja) * 2003-02-26 2006-08-24 インターミューン インコーポレイティッド ポリエチレングリコール修飾インターフェロン組成物およびその使用方法
JP2008545393A (ja) * 2005-05-18 2008-12-18 マキシジェン， インコーポレイテッド 進歩したインターフェロンαポリペプチド
CN103030690A (zh) * 2005-06-03 2013-04-10 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
ES2382124T3 (es) 2007-09-04 2012-06-05 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferón alfa 2b modificado con polietilenglicol y método de preparación y aplicaciones de este
DK2196475T3 (da) * 2007-09-04 2012-09-17 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferon alfa 2a, som er modificeret med polyethylenglycol, fremgangsmåde til syntese deraf samt anvendelse deraf

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
EP1496076A1 (en) * 2002-03-13 2005-01-12 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophilic polymer derivate with y type branch and preparation method of it medical composite comprising above compound

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Advanced Drug Delivery Reviews Vol.54(4):547-570 (2002) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2186830A4 (en) 2010-10-20
BRPI0721984B1 (pt) 2020-11-17
EP2186830B1 (en) 2012-03-07
CA2698173A1 (en) 2009-03-12
CA2698173C (en) 2015-02-03
AU2007358605B2 (en) 2011-09-08
WO2009030066A1 (fr) 2009-03-12
MX2010002557A (es) 2011-12-16
EP2186830A1 (en) 2010-05-19
CN101636414A (zh) 2010-01-27
US20110158943A1 (en) 2011-06-30
PT2186830E (pt) 2012-06-20
ATE548382T1 (de) 2012-03-15
ZA201001556B (en) 2010-12-29
BRPI0721984A2 (pt) 2014-03-18
AU2007358605A1 (en) 2009-03-12
ES2382124T3 (es) 2012-06-05
BRPI0721984B8 (pt) 2021-05-25
JP5325884B2 (ja) 2013-10-23
PL2186830T3 (pl) 2012-09-28
AU2007358605B8 (en) 2012-02-02
DK2186830T3 (da) 2012-04-02
KR20100082774A (ko) 2010-07-19
RU2010106430A (ru) 2011-10-10
CN101636414B (zh) 2012-02-15
RU2485134C2 (ru) 2013-06-20
JP2010538022A (ja) 2010-12-09
US8597635B2 (en) 2013-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101502645B1 (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도
Ramon et al. PEGylated interferon-α2b: a branched 40K polyethylene glycol derivative
US8901277B2 (en) Interferon alpha mutant and its polyethylene glycol derivative
US20060029573A1 (en) Pegylated interferon alpha-1b
IL136290A (en) Improved interferon polymer couplings
KR101483814B1 (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도
CA2710841A1 (en) Y-shaped polyethylene glycol modified g-csf, the preparation and use thereof
KR20110014564A (ko) 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도
RU2575796C9 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение
RU2575796C2 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180227

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200303

Year of fee payment: 6