CN101636414B - 聚乙二醇修饰的干扰素α2b及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

提供了Y型分支的聚乙二醇在特定的赖氨酸位点单位点修饰的干扰素α2b及其制备方法。该聚乙二醇化的干扰素α2b可用于制备治疗病毒性感染如丙型肝炎等疾病的药物组合物。

Description

聚乙二醇修饰的干扰素α2b及其制备方法和应用
发明领域
本发明涉及Y型分支的聚乙二醇单位点修饰的干扰素α2b及其制备方法，以及获得的单位点聚乙二醇化干扰素α2b在制药领域中的应用。
发明背景
干扰素(interferon，IFN)是真核细胞针对病毒感染和其它抗原刺激而产生的一类小分子蛋白质或糖蛋白，具有广谱抗病毒、抗增殖和免疫调节作用。干扰素已被广泛应用于多种疾病的治疗，如乙型肝炎、丙型肝炎和HIV等病毒性感染，多发性硬化、关节炎、哮喘、胆囊纤维化和间质性肺病等炎症反应异常性疾病，骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌和毛状细胞白血病等肿瘤等疾病(Kenji Oritani，Paul W Kincade，et al.Type Iinterferon and limitin：a comparison of structures，receptors，and functions.Cytokine and Growth Factor Reviews，12，337-348，2001；Yu-Sen Wang，Stephen Youngster，et al.Structural and biological characterization ofpegylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications.Advance Drug Delivery Reviews，54，547-570，2002)。
根据化学、免疫学和生物学性质的不同，干扰素被分为4类：干扰素α、β、γ和ε。干扰素α由白细胞分泌产生。人干扰素α由约20个基因组成的多基因家族编码，编码蛋白质的氨基酸序列具有高达约90％的同源性(Henco et al.J.Mol.Biol.，185，227-260，1985)。人干扰素α2b是人干扰素α家族α2亚族的亚型之一，是一种具有多种生物学活性的单链蛋白。该蛋白单链由165个氨基酸残基组成，内含4个Cys，其中Cys1-Cys98和Cys29-Cys138分别形成2对链内二硫键；N-端氨基酸为Cys，有1个游离α-NH2；氨基酸序列之第31、49、70、83、112、121、131、133、134和164位为Lys，均有1个游离ε-NH2。蛋白质无糖基化修饰，对各种蛋白酶敏感。人干扰素α2b的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
干扰素用于临床治疗时，通常为胃肠外给药。由于体内药代半衰期短(2-4h)、免疫原性强，导致给药间隔短、给药频度高，并且由于抗体的生成使疗效显著降低，因此目前还难以达到理想的临床疗效。近年来发展的聚乙二醇(PEG)修饰技术有效地克服了上述问题。
聚乙二醇是一种惰性、无毒、可生物降解的有机多聚物，在生物技术和制药领域有重要用途。PEG修饰技术是通过共价结合将PEG连接到活性蛋白上。蛋白质药物经PEG化后，其性状有显著改善，具体包括药代半衰期延长、免疫原性降低、安全性提高、疗效增强、给药频度降低、药物可溶性和水溶性提高、蛋白酶酶解抗性增强、方便药物的控释等。具体可见Inada等(Inada et a1.J.Bioact.and Compatible Polymers，5，343，1990)、Delgado等(Delgado et al.Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems，9，249，1992)、Katre等(Katre.Advanced Drug DeliverySystems，10，91，1993)和Davis等(美国专利UP 4179337)的报道。
美国专利第4179337号披露，PEG与酶和胰岛素结合后，蛋白质的免疫原性降低的同时蛋白质的活性明显下降。这种效应在G-CSF(Satake-Ishikawa et al.，Cell Structure andFunction，17，157-160，1992)、IL-2(Katre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1487，1987)、TNF-α(Tsutsumi et al.，Jpn.J.Cancer Res.，85，9，1994)、IL-6(Inoue et al.，J.Lab.Clin.Med.，124，529，1994)和CD4-IgG(Chamow et al.，Bioconj.Chem.，5，133，1994)中均有发现。
已有文献报道(Monfardini et al.，Bioconjugate Chem.，6，62，1995)，支链PEG修饰蛋白质的pH抗性、热稳定性和抗蛋白酶酶解能力均明显强于直链PEG。通常情况下，聚乙二醇分子通过连接至蛋白质分子的N端α-氨基或分子内部的赖氨酸的ε-氨基而对蛋白质进行修饰。已经用于修饰蛋白质的聚乙二醇通常有三种形式：直链分子形式(EP 0593868)、U形分支的支链分子形式(EP 0809996)和Y形分支的支链分子形式(CN1243779C)。
目前已有多种PEG化治疗性蛋白质药物应用于临床。1990年，ENZON公司的第一种用聚乙二醇修饰的药用蛋白一聚乙二醇化牛腺苷脱氨酶(Adagen)被FDA批准上市，用于治疗严重的复合免疫缺陷疾病(pegfamg013102LB，http://www.fda.gov)；1994年，另一种用于治疗急性淋巴细胞白血病的聚乙二醇修饰药用蛋白--PEG化天冬酰胺酶(pegasprgase，Oncaspar)也在美国上市(103411s5052lbl，http://www.fda.gov)；2000年，Schering-Plough公司的PEG修饰干扰素α2b(PEG IFN-α2b，PEG-Intron)得到FDA批准上市；Hoffman-la Roche公司的另外一种PEG化的α干扰素(PEG IFN-α2a，Pegasys)也于2002年获得上市批准，二者均用于治疗肝炎(103964s5037lbl，pegsche011901LB，http://www.fda.gov)。2002年，Amgen公司的PEG修饰人粒细胞集落刺激因子(PEG-filgrastim，Neulasta)也获得FDA批准，用于治疗迁移性乳腺癌(pegfamg013102LB，http://www.fda.gov)；Pharmacia公司的PEG人生长因子拮抗剂获FDA申请受理；Celltech公司PEG化结合TNF-α抗体片断、Amgen公司的PEG-TNF受体进入高级临床实验阶段；第一个PEG-有机分子偶联物--PEG化喜树碱也已经进入二期临床试验阶段。2004年，FDA批准了PEG修饰寡核苷酸(Pegaptanib，MacugenTM)。药物中的PEG部分(或PEG)在体内的代谢过程已相当清楚，已证实其是一种良好的、安全的、无副作用的药物改性剂。
能与蛋白质药物结合的PEG通常需经过衍生，使PEG两端的一个或二个端基被化学活化后具有适当的官能团，该官能团对要结合的药物中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的共价键。例如，PEG可连接到蛋白质肽链中的Lys残基的ε-NH2上，或连接到蛋白质肽链N端氨基酸残基的α-NH2上。欧洲专利EP0809996所描述的IFN-α的PEG化，即为PEG-NHS通过亲核取代结合到IFN-α的N-端氨基酸的α-NH2或Lys的-NH2上。该专利所述PEG-NHS为U型分支的PEG衍生物(PEG2-NHS)，其分子式如下：
Figure GPA00000736771400031
式中，R和R’各自独立为低分子量烷基；n和n’介于600-1500之间；PEG平均分子量介于26KD-66KD。IFN-α的PEG2-NHS修饰产物分子式如下：
Figure GPA00000736771400032
1个或多个PEG2-NHS分子结合到IFN-α的N-端氨基酸的α-NH2或Lys的ε-NH2上，所得产物为非PEG化、单位点PEG化和多位点PEG化IFN-α的混合物；通过已知纯化手段可将单位点PEG化IFN-α从反应产物中分离出来。由于IFN-α具有1个N-端氨基酸和多个Lys，即有多个PEG2-NHS反应位点，因此分离得到的单位点PEG化IFN-α为多种单位点PEG异构体的混合物。
欧洲专利EP 0593868采用直链线性PEG衍生物来修饰干扰素，修饰产物的分子式如下：
Figure GPA00000736771400041
其中，R为低分子量烷基；R1、R2、R3和R4为H或低分子量烷基；m介于1到干扰素潜在PEG修饰位点的数目之间；W为O或NH；x介于1-1000，y和z介于0-1000，x+y+z介于3-1000；R1、R2、R3和R4至少其一为低分子量烷基。Yu-Sen Wang等(Yu-Sen Wang et al，Advanced Drug DeliveryReviews，54：547-570，2002.Yu-Sen Wang et al，Biochemistry，39，10634-10640，2000.)报道了12KD线性单甲氧基PEG修饰的rIFN-α2b(Peg-Intron)，通过HPLC-IE分离分析证明其产物为14个以上单位点修饰异构体的混合物。Yu-Sen Wang等采用的线性PEG分子式如下：
Figure GPA00000736771400042
该PEG平均分子量12KD。
发明概述
本发明采用的PEG衍生物为Y型分支，是一种新型的分支型PEG衍生物，其结构不同于U型分支PEG，二者最大区别在于：本发明采用的Y型PEG衍生物的2条PEG分支链通过N原子连接在一起，而EP0809996U型PEG衍生物2条PEG分支链通过C原子连接在一起。本发明所述Y型PEG衍生物分子组成示意如下：
其中，Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基或杂烷基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或巯基反应形成共价键。
在本发明一个优选的实施方案中，所述Y型PEG衍生物分子如下式所示：
Figure GPA00000736771400052
其中，R和R’各自独立为C1-C4烷基，优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基、或杂烷基；j为1-12的整数；F是选自于以下组中的端基：羟基、羧基、酯基、酰氯、酰肼、马来酰亚胺、吡啶二硫化物，可以与治疗药物或基体上的氨基、羟基或巯基反应形成共价键。优选地，其中聚乙二醇的总平均分子量为约10000-60000道尔顿，最优选为约40000道尔顿。
在本发明一个优选的实施方案中，Y型PEG衍生物分子一种可能的结构式如下式(I)所示：
其中R和R’各自独立为C1-C4烷基，优选甲基；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500；j为1-12的整数；聚乙二醇的总平均分子量为约40000道尔顿。
本发明人采用Y形分支的支链PEG(YPEG)衍生物修饰干扰素α2b(IFN-α2b)，并经Q Sepharose FF离子交换层析分离得到单位点修饰的YPEG-IFN-α2b。进一步地，分离的单位点修饰的YPEG-IFN-α2b经SPSepharose FF层析拆分进一步得到IFN-α2b在相应于SEQ ID NO：1的134位赖氨酸的侧链ε氨基为主的连接YPEG的YPEG-IFN-α2b，称为YPEG-IFN-α2b(134)。经测定，YPEG-IFN-α2b(134)的体外比活性显著高于在其他赖氨酸位点连接YPEG的YPEG-IFN-α2b，并且血清药代半衰期显著长于非修饰的IFN-α2b。
因此，本发明提供了一种单位点修饰的聚乙二醇化干扰素α2b，其具有如下结构：
Figure GPA00000736771400061
其中，Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；j为1-12的整数；Ri为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基、或杂烷基；X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数。
在本发明一个优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇化干扰素α2b具有如下式Ⅱ所示结构式：
Figure GPA00000736771400062
其中，R和R’各自独立为C1-C4烷基，优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数，可为相同或不同整数。该结构中，Y分支PEG通过单位点结合连接到干扰素α2b分子上。式Ⅱ之YPEG-IFN-α2b的分子量主要取决于聚合度m和m’。m+m’优选600到1500，对应YPEG的平均分子量为约26000道尔顿到约66000道尔顿；m+m’进一步优选795到1030，对应YPEG平均分子量为35000道尔顿到45000道尔顿；m+m’特别优选885到1030，对应YPEG平均分子量为39000道尔顿到45000道尔顿；m+m’最优选910，对应YPEG平均分子量为40000道尔顿。m和m’的比值范围可以为0.5到1.5，优选0.8到1.2。
在一个优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇化干扰素α2b中聚乙二醇与干扰素α2b连接的酰胺键位于干扰素α2b中相应于SEQ ID NO：1的31、49、70、83、112、121、131、133、134或164位赖氨酸的侧链ε氨基或N端氨基酸的α氨基。
在一个更优选的实施方案中，本发明的聚乙二醇化干扰素α2b中聚乙二醇与干扰素α2b连接的酰胺键主要位于干扰素α2b中相应于SEQ IDNO：1的134位赖氨酸的侧链ε氨基。
任选地，本发明的干扰素α2b可以为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的干扰素α2b。优选地，所述干扰素α2b为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的具有SEQ ID NO：1所示序列的人干扰素α2b(hIFN-α2b)。更优选地，所述人干扰素α2b是重组人干扰素α2b(rhIFN-α2b)。rhIFN-α2b可以是人工合成的，也可以是原核系统如大肠杆菌(E.coli)表达的，也可以是真核酵母系统如毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的，也可以是其它昆虫细胞系统或哺乳细胞系统如CHO表达的。制备天然或重组IFN-α2b的方法以及IFN-α2b和其YPEG修饰产物的活性检测方法为本领域现有技术。
本发明所述YPEG-IFN-α2b与IFN-α2b的临床用途相同，均适用于肿瘤和抗病毒感染治疗，如肝炎、毛细胞白血病、细胞介导淋巴细胞溶解、Kapasi’s肉瘤等。临床使用时，相对IFNα，本发明YPEG-IFN-α2b在稳定性、溶解度、血清药代半衰期和临床疗效等方面均有明显改进。在给药方式中，本发明的YPEG-IFN-α2b可以以组合物的形式给予患者，所述组合物中包含药物学有效剂量的YPEG-IFN-α2b和药物学可接受的载体或赋形剂。因此，本发明另一方面提供了一种组合物，其包含药物学有效剂量的本发明的聚乙二醇化干扰素α2b和药物学可接受的载体或赋形剂。优选地，所述组合物包含甘露醇、氨基酸、氯化钠和醋酸钠，其中氨基酸优选天冬氨酸、天冬酰胺和甘氨酸。
在另一方面，本发明还提供了本发明的聚乙二醇化干扰素α2b或包含本发明的聚乙二醇化干扰素α2b的组合物在制备用于治疗需要用干扰素α2b治疗的疾病的药物中的应用。优选地，所述需要用干扰素α2b治疗的疾病选自病毒性感染如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、尖锐湿疣，肿瘤如毛状细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、低度恶性非何杰金氏白血病、细胞介导淋巴细胞溶解、Kapasi’s肉瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、喉乳头状瘤病、复发性或转移性肾细胞癌，炎症反应异常性疾病如多发性硬化、关节炎、哮喘、胆囊纤维化和间质性肺病以及与骨髓增生性疾病相关的血小板增多等。
为了获得YPEG修饰的IFN-α2b，在本发明的一个实施方案中，首先将YPEG经活化的衍生物如聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(YPEG-NHS)，通过亲核取代反应，将PEG部分共价结合在蛋白质的氨基(-NH2)上，包括蛋白质N端的α-氨基和赖氨酸残基的ε-氨基。IFN-α2b与YPEG反应生成YPEG-IFN-α2b的反应方程式如下：
Figure GPA00000736771400081
反应条件温和，pH范围4.5-9.5，温度0-25℃，需搅拌或保持其它方式的混匀。具体条件例如参见实施例。各种分子量的YPEG均可通过本方法连接到IFN-α2b上，反应产物包括单位点(YPEG-IFN-α2b)、双位点(YPEG2-IFN-α2b)和多位点(YPEGn-IFN-α2b)修饰产物，可通过控制反应条件使产物以单位点取代产物为主。
接下来利用阳离子交换层析、阴离子交换层析和排阻层析等方法从各种YPEG修饰的IFN-α2b混和物中分离单位点修饰的YPEG-IFN-α2b，并对单位点修饰的YPEG-IFN-α2b进行进一步拆分得到在不同位点连接YPEG的YPEG-IFN-α2b。常用方法如阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析和排阻层析等。可通过本领域已知方法来进行性质分析，如采用质谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱排阻层析等分析产物的分子量，从而将单位点修饰产物与双位点、多位点修饰产物和未修饰底物IFN-α2b区分开，并进而采用上述纯化方法将单位点修饰产物中的各种不同位点异构体拆分开。各种修饰产物的体外生物学活性检测根据干扰素的已知活性检测方法进行，如细胞病变抑制法。对于PEG单位点修饰IFN，不同的修饰位点异构体由于PEG成分对IFN活性结构域的保持的影响不同，导致修饰位点异构体间的生物学活性有较大区别；从总体上说，PEG修饰后，IFN的体外生物学活性均明显下降。而本发明对离子交换层析结果中获得的3个峰的分离物进行体外比活性测定结果显示第3峰分离物(SP2)与其他峰的分离物以及PEGASYS(Roche Inc.)相比具有显著高的比活性，并且比未修饰的IFN-α2b具有显著更长的血清药代半衰期。
在进一步的实施方案中，分离获得SP2的Y分支PEG连接的肽段，利用Edman降解的方法对其进行氨基酸序列测定，结果显示SP2的主要成分为YPEG-IFN-α2b(134)。
因此，在另一方面，本发明还提供了制备并纯化YPEG-IFN-α2b(134)的方法，包括：
(a)在碱性条件下，优选pH值为9.0，将具有下式(I)所示的Y形分支结构的PEG与干扰素α2b溶液反应得到PEG化干扰素α2b；
其中R和R’各自独立为C1-C4烷基，优选甲基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；m+m’优选600到1500；
(b)用阴离子交换树脂，优选Q Sepharose FF，捕获步骤(a)获得的反应产物，并用阴离子梯度洗脱，优选使用氯离子梯度，得到修饰后产物；
(c)用阳离子交换树脂，优选SP Sepharose FF，对步骤(b)捕获的反应产物进行阳离子梯度洗脱，优选使用钠离子梯度，分别收集各个峰；
(d)测量各个峰的活性，取活性最高的峰对应的反应产物。
附图简述
图1：二批次Y-PEG(40KD)修饰IFN-α2b反应的SDS-PAGE结果。分离胶浓度为12％，考马斯亮蓝R-250显色。从图1中的SDS-PAGE电泳结果可见，在本反应条件下，rhuIFN-α2b的PEG修饰率介于30-50％之间，修饰率稳定；修饰产物以单位点修饰产物(YPEG-IFN-α2b)为主，有多位点修饰产物(YPEGn-IFN-α2b)。泳道1：IFN-α2b NHS-YPEG40KD修饰反应0h；泳道2：IFN-α2b NHS-YPEG 40KD修饰反应060604-1批2h；泳道3：IFN-α2b NHS-YPEG 40KD修饰反应060604-2批2h；泳道4：marker，GE Lifescience。
图2：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF纯化拆分修饰位点异构体图谱。
图3：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF纯化样品12％SDS-PAGE电泳银染结果。泳道1：分子量参照，GE Lifescience；泳道2：YPEG-IFN-α2bSP Sepharose FF纯化峰1；泳道3：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF纯化峰2；泳道4：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF纯化峰3；泳道5：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF纯化峰4。
图4：YPEG-rHuIFN-α2b SP Sepharose FF纯化样品表观分子量检测7.5％SDS-PAGE还原型电泳银染结果。泳道1：分子量参照，GELifescience；泳道2：YPEG-rHuIFN-α2b SP 1，2μg；泳道3：YPEG-rHuIFN-α2b SP2，2μg；泳道4：YPEG-rHuIFN-α2b SP3，2μg。
图5：YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF拆分样MALDI-TOF MS分子量测定结果
图6：YPEG-NHS(40KD)MALDI-TOF MS法分子量测定结果。
图7：食蟹猴单次s.c 30μg·kg-1YPEG-rhIFNα2b后血清药物浓度及活性比较。
图8：YPEG-rHuIFN-α2b SP2胰酶肽图检测酶切体系空白对照检测结果。在71.674min和17.589min处各检出1个小峰；在2-3min间检出Trypsin峰。
图9：YPEG-IFN-α2b SP2胰酶酶解0h样品HPLC-RP C18检测结果。YPEG-IFN-α2b SP2保留时间为62.114min；71.908min洗脱峰为背景峰，2-3min。
图10：YPEG-IFN-α2b SP2胰酶酶解48h样品HPLC-RP C18肽图检测结果。60.5min-63.2min处无底物YPEG-IFN-α2b SP2峰(62.114min)检出，说明样品酶解彻底。
图11：YPEG-IFN-α2b SP2胰酶完全酶切样品YPEG修饰肽段Sephacryl S-100HR分离图谱。按峰分部收集样品，S100-1为YPEG修饰肽段，即目的样。
发明详细描述
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。
实施例1
Y型分支PEG修饰重组人干扰素α2b的制备
(1)Y型分支PEG修饰重组人干扰素α2b的少量制备
取166.1mg YPEG(式I，平均分子量40KD，等臂，批号RD010P041)(北京键凯科技有限公司)溶解于1ml 2mM HCl(广东光华化学厂有限公司)，加入40mg IFN-α2b(厦门特宝生物工程股份有限公司)和50mM硼酸一硼砂缓冲液(pH9.0)(中国医药集团上海化学试剂公司)使反应总体积为10ml。该反应体系中，IFN-α2b反应终浓度为4mg/ml，IFN-α2b与YPEG反应摩尔比为1∶2。搅拌条件下0-20℃温浴2h，生成PEG化的IFN-α2b，加入冰乙酸(汕头市西陇化工厂)使pH＜4.0以终止反应，取样进行SDS-PAGE电泳。反应体系用水稀释50倍，0.2μm过滤，4℃放置备用。
使用Q Sepharose FF层析分离残余PEG和PEG水解物、多位点YPEG化的IFN-α2b、单位点YPEG化的IFN-α2b和未修饰的IFN-α2b。Q SepharoseFF(GE Healthcare)层析柱(Φ12mm×90mm，1CV＝1oml)用20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-1M NaCl(BBI)再生3CV，20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)平衡5CV。设定紫外检测波长为280nm。4℃放置备用样品全部上样；上样结束后，20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)平衡3CV；换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-12mM NaCl洗脱至第一个峰完全洗出，该峰为残留PEG；换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-60mM NaCl洗脱，收集洗脱峰样品即为以单位点PEG化产物YPEG-IFN-α2b为主的修饰产物；再换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-500mM NaCl洗脱，洗脱峰为未修饰的IFN-α2b。
目的产物以单位点PEG化的YPEG-IFN-α2b为主，得率20-40％。
(2)Y型分支PEG修饰重组人干扰素α2b的大规模制备
取4982.4mg YPEG(式I，平均分子量40KD，等臂；批号RD010P041)(北京键凯科技有限公司)溶解于25ml 2mM HCl，加入1200mg IFN-α2b和50mM硼酸-硼砂缓冲液(pH9.0)使反应总体积为200ml。该反应体系中，IFN-α2b反应终浓度为6mg/ml，IFN-α2b与YPEG反应摩尔比为1∶2。搅拌条件下0-25℃温浴2h，加入冰乙酸使pH＜4.0以终止反应，取样进行SDS-PAGE电泳。反应体系用水稀释50倍，0.2μm过滤，4℃放置备用。
使用Q Sepharose FF层析分离残余PEG和PEG水解物、多位点YPEG化的IFN-α2b、单位点YPEG化的IFN-α2b和未修饰的IFN-α2b。Q SepharoseFF(GE Healthcare)层析柱(Φ38mm×265mm，1CV＝300ml)用20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-1M NaCl再生3CV，20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)平衡5CV。设定紫外检测波长为280nm。4℃放置备用样品全部上样；上样结束后，20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)平衡3CV；换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-12mM NaCl洗脱至第一个峰完全洗出，该峰为残留PEG；换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-60mM NaCl洗脱，收集洗脱峰样品即为以YPEG-IFN-α2b为主的修饰产物；换20mM硼酸/硼砂缓冲液(pH9.0)-500mM NaCl洗脱，洗脱峰为未修饰的IFN-α2b。
目的产物以单位点PEG化的YPEG-IFN-α2b为主，得率35-50％。
图1示出了二批次YPEG(40KD)修饰IFN-α2b反应的SDS-PAGE结果。从图1中的SDS-PAGE电泳结果可见，在本反应条件下，rhIFN-α2b的PEG修饰率介于35-50％之间，修饰率稳定；修饰产物以单位点修饰产物(YPEG-IFN-α2b)为主，有多位点修饰产物(YPEGn-IFN-α2b)。
实施例2
YPEG-IFN-α2b SP Sepharose FF拆分
YPEG-IFN-α2b Q Sepharose FF捕获样用20％乙酸调pH值至5.0，用5mM NaAc/HAc(pH5.0)(汕头市西陇化工厂)稀释15倍；按0.5mg/ml载量上样SP Sepharose FF 100ml(GE Healthcare)(Φ18mm×394mm)，5mMNaAc/HAc(pH5.0)平衡3CV，0％-30％的5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH5.0)梯度洗脱2.5CV，30％-100％的5mM NaAc/HAc-70mM NaCl(pH5.0)梯度洗脱50CV。SP Sepharose FF 100ml将YPEG-IFN-α2b拆分成4个洗脱峰，按峰收集样品，分别取样进行SDS-PAGE电泳，采用银染显色。对照电泳结果确定，SP Sepharose FF拆分1峰主要为YPEG多位点修饰产物(YPEGn-IFN-α2b)；SP Sepharose FF拆分2峰以单位点修饰产物(YPEG-IFN-α2b)为主，含有部分多位点修饰产物；SP SepharoseFF拆分3峰、4峰均为单位点修饰产物。SP Sepharose FF拆分2-4峰为不同YPEG修饰位点的单位点修饰产物异构体，分别命名为YPEG-IFN-α2b SP1、YPEG-IFN-α2b SP2和YPEG-IFN-α2b SP3。拆分图谱及电泳银染结果分别示于图2和图3。
YPEG-IFN-α2b SP1-3各样品分别补加氯化钠、醋酸钠、甘露醇、天冬氨酸，0.22μm过滤除菌，4℃放置备用。
实施例3
YPEG-IFN-α2b修饰位点异构体的性质分析
(1)蛋白质浓度检测
YPEG-IFN-α2b的修饰位点异构体采用凯氏定氮法检测蛋白质浓度。
(2)蛋白质表观分子量检测
采用SDS-PAGE电泳检测YPEG-IFN-α2b的修饰位点异构体的表观分子量。实验方法按Laemmli(Nature 227：680，1970)的报道进行，凝胶浓度7.5％，银染显色。YPEG-IFN-α2b的修饰位点异构体的表观分子量基本一致，大小约123KD(图4)。
(3)MALDI-TOF MS法检测分子量
采用德国BRUKER公司autoflex TOF/TOF质谱仪，MALDI-TOF MS法测定YPEG-rHuIFN-α2b的修饰位点异构体的分子量。基质采用芥子酸(Sinapinic acid，SA，C11H12O5，MW 224.22；批号2006 236870 002，德国BRUKER公司)，蛋白分子量标准品采用BRUKER公司之ProteinCalibration Standard Ⅱ(Part No.207234)，分析软件为flexAnalysisVer.3.0.54.0.。YPEG-IFN-α2b的修饰位点异构体的MS分子量一致，大小约59000道尔顿(图5)。
(4)内毒素含量检测
采用鲎试剂法(《中华人民共和国药典》2005年版三部附录XC)测定YPEG-IFN-α2b的内毒素含量，各样品的检测结果均＜5.0EU/mg。
(5)YPEG-IFN-α2b SP2的动物体内活性及药物代谢动力学研究
①YPEG-IFN-α2b SP2的动物体内活性研究
在IFN作用机制中，部分是由于促使机体产生2’-5’AS(2’5’-寡腺苷合成酶)，从而进一步发挥其抗病毒等作用。用125I作为示踪，通过检测体内2’-5’AS活性反映IFN的药效学指标。2’-5’AS在poly(I)poly(C)琼脂存在时能够催化ATP生成2’-5’A(2’5’-寡腺苷；2’-5’AS的活性由产生的2’-5’A浓度表示)。首先，样品中的2’-5’AS被poly(I)poly(C)琼脂糖吸附并激活后，催化底物ATP生成2’-5’A。加入含125I标记的2’-5’A、2’-5’A抗血清和二抗的混合物，孵育，离心分离混合物，去除上清，用γ计数仪测定沉淀物中的放射性，计算与最初加入的125I标记2’-5’A的结合率，并用四参数Logistic回归作出标准曲线，计算未知样品中2’-5’AS诱导产生的2’-5’A浓度。
表1及图7是2’-5’A法测得的食蟹猴(18只(广西玮美生物科技有限公司(合格证编号：S.CXK桂2002-0001))，体重2.5～5.5kg，雌6雄12，分笼喂养，饲以标准猴饲料，自由饮水)单次皮下注射(s.c)30μg·kg-1YPEG-IFN-α2b SP2后血清中2’-5’A的浓度。从图8中可以看出，平均达峰时间为64±27.71h，达峰浓度为292.30±148.08Pmol·dL-1，给药后血清中2’-5’AS的活性明显升高，血清中2’-5’A的达峰时间比YPEG-rhIFNα2bSP2的达峰时间后延。
表1食蟹猴sc 30μg·kg-1YPEG-rhIFNα2b后血清内2’-5’A浓度随时间变化情况(Pmol·dL-1)
②YPEG-IFN-α2b与rhIFN-α2b在食蟹猴体内的药物代谢动力学研究
YPEG-IFN-α2b单次皮下注射10、30、100μg/kg给予食蟹猴，给药组于药前、药后1、2、4、8、10、12、24、48、72、96、168、240和312h取注药对侧后肢静脉血1mL；IFN-α2b 30μg·kg-1单次皮下注射给予食蟹猴，给药组于药前、药后0.5、1、2、3、4、5、6、8、24h取血1mL，血样于4℃放置30min后，2000转低温离心10min，立即分离血清于-20℃保存待分析。
应用定量双夹心饼干免疫技术。将一个对重组人干扰素α特异的单抗预先包被在微孔板上。将标准品和样品吸入至孔内，其中的IFN-α2b或YPEG-IFN-α2b SP2将与固化抗体结合。洗掉所有未结合的物质后，将抗人干扰素α的IgG(二抗)加至孔内，反应完全后，洗板并加入辣根过氧化物酶(HRP)加至孔内，在洗掉所有未结合的酶试剂后，每孔内加入HRP的底物溶液而产生的颜色与最初一步结合的IFNα-2b或YPEG-rhIFNα-2b SP2量成比例。终止反应测定颜色强度。吸光度OD值越高，则样品中IFN-α2b或YPEG-IFN-α2b SP2浓度越高。分别作两种样品的标准曲线测定各血样的血清药物浓度。
按照试剂盒(美国Biomedical公司，Lot#3271)说明书的要求操作。每孔加入100μL标准品或血清样品，并以平板混匀器轻轻混匀，根据未知样品预期浓度，用稀释液将样品稀释至标准曲线的浓度范围。各板都设置IFNα-2b或YPEG-IFN-α2b SP2标准曲线，用以计算该板未知样品浓度。室温孵育1h。以洗板液洗板1次，每孔加入100μL二抗，继续室温反应1h。洗涤3次，每孔加入100μL HRP结合物，室温反应1h。洗板4次，每孔加入100μL TMB底物，室温避光放置15min。每孔加100μL终止液，轻轻混匀，终止反应。在5min内用酶标仪于450nm波长读光吸收OD值。测定各样品浓度。
食蟹猴单次s.c YPEG-IFN-α2b 10、30、100μg/kg低、中、高剂量后T1/2分别是48.87±11.67、51.94±3.52和49.60±2.97h；食蟹猴单次s.cIFN-α2b 30μg/kg后T1/2为3.22±0.10h。YPEG修饰后，IFN-α2b末端半衰期至少延长10倍以上。
(6)体外比活性检测
采用细胞病变抑制法检测YPEG-IFN-α2b的各修饰位点异构体的体外生物学活性。按照《中华人民共和国药典》2005版三部附录XC《干扰素效价测定法》中所述方法，根据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于570nm处检测吸光度，绘制干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的体外生物学活性。各样品体外生物学活性检测结果见表2，每个样品同步检测3个平行样。YPEG修饰后，单位点修饰产物的各修饰位点异构体中SP 2样品的体外比活性最高，比SP 1和SP 3以及PEGASYS(瑞士巴塞尔豪夫迈·罗氏有限公司制造，上海罗氏有限公司分装，产品批号B1016，分装批号SH0020)高1-2倍，比未拆分样亦高约1倍。
表2.YPEG-IFN-α2b的各修饰位点异构体的体外生物学活性检测结果(三次测定)
Figure GPA00000736771400151
注：未拆分样指YPEG-rhIFN-α2b SP Sepharose FF纯化拆分前样品。
(7)YPEG-IFN-α2b SP2修饰位点解析
YPEG-IFN-α2b SP2用5K超滤器(Millipore，聚醚砜材质)将溶剂体系超滤替换成50mM NH4HCO3 pH8.0，紫外扫描确定蛋白浓度3.82mg/ml。TPCK胰蛋白酶(Promega)用商品附带的溶解液配制成0.5μg/μl。按表3加样：
表3.YPEG-IFN-α2b SP2胰蛋白酶酶解反应组分
  反应组分   体积
  50mM NH4HCO3，pH8.0   7.08ml
  PEG-IFN-α2b SP2(3.82mg/ml)   1.32ml
  胰蛋白酶(0.5μg/μl)   0.2ml
  反应总体积   8.6ml
反应体系37℃水浴48h，加入1.52ml 20％乙酸终止反应。取小样做HPLC-RP C18肽图检测，检测用仪器为Waters HPLC系统，主机型号600，2487双波长检测器，数据处理软件Empower 2。HPLC分析柱为JupiterC18，粒径5μm，孔径
Figure GPA00000736771400161
Φ4.6×150mm，美国Phenomenex公司出产。流动A相为0.1％TFA/H2O，流动B相为0.1％TFA/90％ACN/H2O；检测流速1ml/min，检测波长214nm。洗脱梯度见表4，结果见图8-10。
表4.YPEG-IFN-α2b SP2HPLC-RP C18胰酶肽图检测洗脱梯度
  时间(分钟)   A％   B％   ACN％
  1   0   100   0   0
  2   8   100   0   0
  3   68   40   60   54
  4   72   40   60   54
  5   75   100   0   0
  6   80   100   0   0
根据检测结果确定样品已酶解彻底。反应终止产物进行DTT还原处理。Sephacryl S-100HR(Φ18×255mm，1CV＝64ml；GE Healthcare)预先用20mM PBNa-400mM NaCl(pH7)平衡3CV，将YPEG-IFN-α2b SP2之TPCK胰蛋白酶完全酶解样用静水压按3％CV上样，20mM PBNa-400mMNaCl(pH7)洗脱，检测波长280nm。收集第一个洗脱峰样品(样品编号：YPEG-IFN-α2b S100-1，图11)，5K超滤将溶剂体系替换为5mM PBNa(pH7)，真空冷冻干燥。冻干样采用Edman降解法测定N端氨基酸序列。样品的N端7个氨基酸序列为XYSPXAW(表5)，其中X指Edman降解法无法检出的α氨基酸的半胱氨酸(Cys)、非α氨基酸和其它修饰氨基酸。根据与SEQ ID NO：1所示序列进行比对，确定YPEG-IFN-α2b SP2主要为Lys134的YPEG修饰产物。
表5.YPEG-IFN-α2b S100-1N端氨基酸序列测定结果
  样品   检出N端肽段序列   对应PEG修饰位点
  YPEG-IFN-α2b S100-1   XYSPXAW   Lys134
注：X指Edman降解法无法检出的α氨基酸的半胱氨酸(Cys)、非α氨基酸和其它修饰氨基酸。

Claims (31)

1.一种聚乙二醇化干扰素α2b，其具有如下结构，其通过将由SEQ ID NO：1所示序列组成的干扰素α2b与Y型分支结构的聚乙二醇(YPEG)连接而获得：
Figure FSB00000674114500011
其中：
Pa和Pb是相同或不同的聚乙二醇；
j为1-12的整数；
Rj为H、C1-12经取代或未经取代的烷基、取代芳基、芳烷基、或杂烷基；以及
X1和X2分别独立地是连接基团，其中X1为(CH2)n，X2为选自于以下组中的基团：(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCO，而n为1-10的整数，
其中YPEG与干扰素α2b连接的酰胺键位于SEQ ID NO：1的134位赖氨酸的侧链ε氨基。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇化干扰素α2b，其具有如下结构式：
Figure FSB00000674114500012
其中R和R’为无关的C1-C4低分子量烷基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数。
3.权利要求2的聚乙二醇化干扰素α2b，其中R或R’为甲基。
4.权利要求2的聚乙二醇化干扰素α2b，其中m+m’为600到1500。
5.权利要求2的聚乙二醇化干扰素α2b，其中YPEG的总平均分子量为约10000-60000道尔顿。
6.权利要求5的聚乙二醇化干扰素α2b，其中YPEG的总平均分子量为约40000道尔顿。
7.权利要求1-6任一项所述的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述干扰素α2b为从天然来源提取的或通过重组生物技术获得的干扰素α2b。
8.权利要求7的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述干扰素α2b为重组人干扰素α2b。
9.权利要求8的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述重组人干扰素α2b是人工合成的或由选自如下一组的表达系统表达：原核系统、真核酵母系统、昆虫细胞系统和哺乳动物细胞系统。
10.权利要求9的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述原核系统是大肠杆菌。
11.权利要求9的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述真核酵母系统是毕赤酵母。
12.权利要求9的聚乙二醇化干扰素α2b，其中所述哺乳动物细胞系统是CHO细胞。
13.权利要求1-12任一项的聚乙二醇化干扰素α2b，其中YPEG是分子量为40000道尔顿的等臂YPEG。
14.一种组合物，其包含药物学有效剂量的权利要求1-13任一项的聚乙二醇化干扰素α2b和药物学可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求14的组合物，其进一步包含甘露醇、氨基酸、醋酸和醋酸钠。
16.权利要求15的组合物，其中所述氨基酸选自天冬氨酸、天冬酰氨或甘氨酸。
17.权利要求1-13任一项的聚乙二醇化干扰素α2b或权利要求14-16任一项的组合物在制备用于治疗需要用干扰素α2b治疗的疾病的药物中的应用。
18.权利要求17的应用，其中所述需要用干扰素α2b治疗的疾病选自病毒性感染，肿瘤，或炎症反应异常性疾病。
19.权利要求18的应用，其中所述病毒性感染选自乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎或尖锐湿疣。
20.权利要求18的应用，其中所述肿瘤选自毛状细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、低度恶性非何杰金氏白血病、细胞介导淋巴细胞溶解、Kapasi’s肉瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、喉乳头状瘤病、复发性或转移性肾细胞癌。
21.权利要求18的应用，其中所述炎症反应异常性疾病选自多发性硬化、关节炎、哮喘、胆囊纤维化和间质性肺病以及与骨髓增生性疾病相关的血小板增多。
22.一种制备和纯化权利要求1-13任一项的聚乙二醇化干扰素α2b的方法，其包括如下步骤：
(a)在碱性条件下将具有下式的YPEG与干扰素α2b溶液反应得到PEG化干扰素α2b；
Figure FSB00000674114500031
其中R和R’为无关的C1-C4低分子量烷基；j为1-12的整数；m和m’表征聚合度，为任何整数；
(b)用阴离子交换树脂捕获步骤(a)获得的反应产物，并用阴离子梯度洗脱得到修饰后产物；
(c)用阳离子交换树脂对步骤(b)捕获的反应产物进行阳离子梯度洗脱，分别收集各个峰；及
(d)测量各个峰的活性，获得活性最高的峰所对应的反应产物。
23.权利要求22的方法，其中所述YPEG分子量为40kD。
24.权利要求23的方法，其中所述YPEG为等臂YPEG。
25.权利要求22的方法，其中步骤(a)在pH值9.0下反应。
26.权利要求22的方法，其中步骤(b)中的阴离子交换树脂为Q Sepharose FF及阴离子梯度为氯离子梯度。
27.权利要求22的方法，其中步骤(c)中的阳离子交换树脂为SP Sepharose FF及阳离子梯度为钠离子梯度。
28.权利要求22的方法，其中IFN-α2b与YPEG的反应摩尔比为1∶2。
29.权利要求22的方法，包括如下步骤：
(a)在pH9.0条件下将分子量为40kD的等臂YPEG与干扰素α2b溶液反应得到PEG化干扰素αt2b，其中干扰素α2b与YPEG的反应摩尔比为1∶2；
(b)用Q Sepharose FF交换树脂捕获步骤(a)获得的反应产物，并用氯离子梯度洗脱得到修饰后产物；
(c)用SP Sepharose FF交换树脂对步骤(b)捕获的反应产物用钠离子梯度洗脱，分别收集各个峰；及
(d)测量各个峰的活性，获得活性最高的峰所对应的反应产物。
30.权利要求22-29任一项的方法，其中R或R’为甲基。
31.权利要求22-29任一项的方法，其中m+m’为600到1500。
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