MXPA99011862A - Conjugados mejorados de polimero de interferon - Google Patents

Abstract

Se exponen composiciones que contienen alfa interferón conjugado con un polímero sustancialmente no antigénico en donde por lo menos aproximadamente 30%del conjugado incluye la unión covalente del alfa interferón con el polímero sustancialmente no antigénico en una histidina. También se expone un proceso para preparar los conjugados. El proceso incluye poner en contacto el alfa interferón con un polímero sustancialmente no antigénico activado con succinimidil carbonato, a un pH que es suficiente para facilitar la unión covalente del polímero sobre una histidina del alfa interferón.

Description

CONJUGADOS MEJORADOS DE POLÍMERO DE INTERFERON ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1, Campo de la Invención La presente invención se dirige a conjugados polímero de interferón. En particular la invención se dirige a conjugados que tienen un perfil novedoso de la unión interferón-polímero. 2_^_ Descripción de la Técnica Relacionada Se ha sugerido que la conjugación de proteínas biológicamente activas con los polímeros mejora una o más de las propiedades consistentes en vida de circulación, solubilidad en agua o antigenicidad in vivo. Por ejemplo, algunos de los conceptos iniciales de la copulación de péptidos o polipéptidos con polietilenglicol (PEG) y polímeros similares solubles en agua se exponen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,179,337, la exposición de la cual se incorpora aquí como referencia. La insulina y la hemoglobina están entre los primeros agentes terapéuticos conjugados. Estos polipéptidos relativamente grandes contienen varios sitios libres de unión lisina e-amino. Varios polímeros pudieran unirse sin una pérdida significativa de la actividad biológica.

ENZON Para muchos materiales biológicamente activos, el proceso de conjugación no está exento de complicaciones. Debe tenerse cuidado en limitar la pérdida de la actividad biológica provocada por la relación de conjugación. Por ejemplo, si mucha cantidad del polímero activado está unida a la proteína o polipéptido blanco, la actividad biológica puede verse reducida severamente o puede perderse. Además, si se utiliza un ligante equivocado que une el polímero a la proteína o si una cantidad insuficiente del polímero se une al blanco, el valor terapéutico del conjugado resultante es más bien limitado. Normalmente, estos conjugados no demuestran un aumento suficiente en la vida circulante que pueda compensar la pérdida de bioactividad. También pueden surgir problemas cuando un sitio activo de la entidad terapéutica (es decir, cuando los grupos asociados con la bioactividad se encuentran) queda bloqueado como resultado de la unión del polímero. Este problema puede ser difícil de evitar ya que el polímero y la proteína están unidos típicamente en reacciones a base de soluciones. El pre-bloqueo de los sitios activos con materiales como son fosfato de piridoxal, ha sido sugerido, pero los resultados han sido inconsistentes. Los problemas son particularmente agudos con péptidos y proteínas de bajo peso molecular. Estos materiales bioactivos normalmente tienen pocos sitios de unión no asociados con la ENZON mención en estas exposiciones de que estén implicados aminoácidos distintos a la lisina en la conjugación o que esto pudiera ser ventajoso. A pesar de las exposiciones antes descritas, la mayoría de los conjugados interferón-polímero se consideran como inaceptables por una u otra razón. La presente invención se dirige a estos problemas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen una mezcla de conjugados de alfa interferón en cadena y mono-polimero. En esta mezcla, el conjugado individual mono-polímero-IFN se define como un isómero posicional, dependiendo de si el residuo de aminoácido está unido covalentemente al polímero. Dentro de esta mezcla se encuentra un isómero que es un alfa interferón conjugado en forma covalente con un polímero en un residuo de histidina sobre el alfa interferón. Las composiciones pueden distinguirse de los productos de la técnica anterior debido, en parte, al hecho de que por lo menos aproximadamente el 15% y de preferencia por lo menos aproximadamente el 30% de los conjugados de interferón incluyeron, como parte de la composición - un polímero unido covalentemente a una histidina del alfa ENZON interferón. Sin embargo, de preferencia los conjugados o isómeros posicionales contienen aproximadamente una hebra de polímero por alfa interferón, sin importar si el polímero está unido. Todavía otros aspectos de la invención incluyen métodos para preparar conjugados de alfa interferón y composiciones preparadas por los métodos. Los conjugados de IFN-polímero se preparan haciendo reaccionar una solución que contiene alfa interferón con una cantidad suficiente de un polímero activado con oxicarbonil-N-dicarboximida, por ejemplo, PEG activado con succinimidil carbonato bajo condiciones que son suficientes para efectuar la unión covalente del polímero con el interferón, por lo menos en parte, con un residuo His, por ejemplo, His 34 de alfa interferón. Partes de estas condiciones incluyen llevar a cabo la reacción de conjugación dentro de un intervalo de pH que es suficiente parar facilitar la unión covalente de por lo menos una porción de las hebras de polímero con los grupos amino del residuo de histidina de las moléculas de interferón. Los alfa interferones adecuados incluyen alfa interferones recombinantes y no recombinantes aislados de los mamíferos. La porción polimérica del conjugado de preferencia es un polialquilenóxido (PAO) , por ejemplo, un monometoxipolietilenglicol (mPEG) . En modalidades ENZON alternativas, otros polímeros substancialmente no antigénicos también pueden emplearse. Los polímeros de preferencia tienen un peso molecular de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 35,0000. Las condiciones para efectuar la conjugación incluyen llevar a cabo la reacción de unión con de aproximadamente una cantidad equimolar a aproximadamente un exceso molar relativamente pequeño del polímero activado en relación al alfa interferón. Las condiciones incluyen además realizar la reacción a un pH de menos de aproximadamente 7 y de preferencia a un pH de entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 6.8. La invención incluye también métodos para tratar condiciones susceptibles de alfa-interferón en mamíferos. En este aspecto, el tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz de una composición que contiene el conjugado IFN aquí descrito, en mamíferos que requieren de esta terapia. Como resultado de la invención, se ha encontrado inesperadamente que son posibles mejoras adicionales en las composiciones de conjugado interferón-polímero. Por ejemplo, al modificar las condiciones de conjugación, es posible obtener nuevas composiciones que contienen conjugados de monopolímero-IFN con una actividad relativamente alta, en donde una porción del alfa ENZON interferón está unida a ubicaciones únicas en , los polímeros. Además, se ha encontrado que al llevar a cabo la reacción de conjugación con carbonato de succinimidilo y algunos polímeros relacionados activados con compuestos del tipo oxicarbonil-N-dicarboximida, por ejemplo, SC-PEG, a niveles de pH que son más ácidos que los típicamente utilizados para la conjugación, se ocasionará que el polímero se una no solamente a los sitios de lisina esperados en la molécula IFN, sino también selectivamente a los sitios de histidina, por ejemplo, el aminoácido preferido His 34, en los alfa interferones. Para . una mejor comprensión de la presente invención se hará referencia a la siguiente descripción y a los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una serie de cromatogramas referidos al Ejemplo 11. La Figura 2 es una serie de cromatogramas referidos al Ejemplo 13.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Interferones La porción de interferón (IFN) del conjugado de polímero puede prepararse u obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo las técnicas recombinantes como las del uso de genes sintéticos expresados en E. Coli. Ver también Pestka, "Interferon a" in Human Cytokines, Blakwell Scientific Publications 1-16 (1996) , la exposición de la cual se incorpora aquí como referencia. Además, el IFN también puede ser un extracto de fuente mamífera, por ejemplo, alFN de humano, rumiante o bovino. Un IFN particularmente preferido es el IFNa-2b, un producto elaborado por técnicas recombinantes de Shering Corp., Kenilworth, NJ. El término "interferón" o "IFN" que se utiliza aquí se refiere a la familia de proteínas altamente específicas de especies homologas que inhiben la replicación viral y la proliferación celular y modulan la respuesta inmunológica. Los interferones humanos se agrupan en tres clases con base en su origen celular y antigenicidad: a-interferón (leucocitos) ß-interferón (fibroblastos) y ?-interferón (células B) . Las formas recombinantes de cada grupo se han desarrollado y están disponibles comercialmente. Los subtipos en cada grupo se basan en características antigénicas/estructurales . Por lo menos 24 interferones alfa (agrupados en subtipos A hasta H) tienen distintas secuencias de aminoácidos que se han identificado aislando y secuenciando DNA que codifica para estos péptidos. Ver también, Viscomi, 1996, Biotherapy ENZON 10:59-86, el contenido de la cual se incorpora aquí como referencia. Los términos "a-interferón" , "interferón alfa" y "interferón de leucocito humano" se utilizan indistintamente en esta solicitud para describir miembros de este grupo. Los a-interferones recombinantes así como los que se encuentran en la naturaleza, incluyendo el interferón consenso como el descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,897,471, el contenido de la cual se incorpora aquí por referencia, podrán utilizarse en la práctica de la invención. La purificación del interferón alfa a partir de leucocitos humanos aislados a partir de la fracción de la capa leucocitaria de sangre íntegra se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,503,035. El interferón de leucocito humano preparado en esta forma contiene una mezcla de interferones de leucocito humano que tienen diferentes secuencias de aminoácido. Los a-interferones humanos naturales purificados y las mezclas de los mismos que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen, de manera enunciativa, Sumiferon® interferón alfa-nl que se obtiene de Sumitomo, Japón, Wellferon® interferón alfa-nl (Ins) disponibles de Glaxo-Wellcome Ltd, Londres, Gran Bretaña y Alferon® interferón alfa-n3 disponibles de Purdue Frederick Co., Norwalk, CT. El advenimiento de la tecnología de ADN recombinante aplicada a la producción de interferón ha permitido que varios interferones humanos se sinteticen exitosamente, permitiendo así una fermentación, producción, aislamiento y purificación a gran escala de varios interferones hasta la homogeneidad. El interferón producido en forma recombinante retiene sus actividades antiviral e inmunomoduladora in vi tro e in vivo . También se entiende que las técnicas recombinantes pudieran incluir un sitio de glucosilación para la adición de una entidad carbohidrato del polipéptido derivado de técnicas recombinantes. La construcción de plásmidos de ADN recombinante que contienen secuencias que codifican para por lo menos parte del interferón de leucocito humano y la expresión en E. Coli de un polipéptido que tiene una actividad inmunológica o biológica del interferón de leucocito humano se expone en la Patente de los Estados Unidos No. 4,530,901 y en la Patente Europea No. EP 0 032 134. La construcción de genes híbridos a-interferón que contienen combinaciones de diferentes secuencias subtipo (por ejemplo, A y D, A y B, A y F) se expone en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,414,150, 4,456,748 y 4,678,751. Los a-interferones recombinantes típicos y adecuados que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen, de manera enunciativa, interferón alfa-2b como Intron® A disponible de Shering Corporation, Kenilworth, N.J., interferón alfa- ENZON 2a como Roferon® A disponible de Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J. , e Infergen® disponible de Amgen, Thousand Oaks, CA. Las modalidades alternativas en donde el alFN extraño no es completamente autólogo, también pueden utilizarse si se desea. Sin embargo, una clave es que el alFN no autólogo tiene suficiente bioactividad o efecto alFN, por ejemplo actividad antiviral en el mamífero blanco. Otras sustancias incluyen fracciones alFN o polipéptidos predecesores que pueden incluirse en los conjugados de la presente invención. En el sentido aquí empleado "efecto a-IFN en mamíferos" se refiere a la actividad in vivo que corresponde a la observada con los alFN. Estas sustancias se preparan utilizando técnicas conocidas para aquéllos con pericia en este campo, como son el cultivo de tejidos, extracción a partir de fuentes animales o metodologías de ADN recombinante . Las fuentes transgénicas de alFN y las entidades relacionadas también se contemplan. Estos materiales se obtienen a partir de animales transgénicos, es decir, ratones, puercos, vacas, etc., en donde la proteína alFN se expresa en la leche, la sangre u otros tej idos . El método por el cual se prepara el alFN para lo conjugados de esta invención no está limitado a los antes descritos. Para los fines de la presente, los alFN son los preferidos debido a sus propiedades bioquímicas y serológicas . En particular, el ENZON alFN tiene propiedades antivirales documentadas y se difunde con más eficacia hacia el torrente sanguíneo que otros interferones . 2_¡_ Polímeros No Antiqénicos Para conjugar el IFN y los polímeros, como por ejemplo, poli (óxidos de alquileno), uno de los grupos hidroxilo extremos del polímero se convierte en un grupo funcional reactivo que permite la conjugación. Este proceso se denomina frecuentemente "activación" y el producto se denomina polímero "activado" o poli (óxido de alquileno) activado. Otros polímeros substancialmente no antigénicos están similarmente "activados" o funcionalizados . Los polímeros activados se hacen reaccionar con alFN de manera que la unión se presenta en los grupos e-amino de las lisinas, el grupo amino de la cisteína N-terminal y, como se describe abajo, en los grupos amino de las histidinas. Los grupos de ácido carboxílico libre, los grupos carbonilo adecuadamente activados, las entidades de carbohidrato oxidadas y los grupos mercapto, si están disponibles en IFN, también pueden utilizarse como sitios de unión suplementarios, si se desea. En un aspecto preferido de la invención, se forman uniones de uretano (carbamatos) entre uno de los ENZON grupos amino del aminoácido de alFN (es decir, lisina, histidina, N-terminal) y el polímero activado. De preferencia, la unión de uretano se forma utilizando un grupo oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida terminal como por ejemplo, un grupo succinimidil carbonato. Los grupos de activación alternativos incluyen N-succinimida, N-ftalimida, N-glutarimida, N- tetrahidroftalimida y N- _ norboreno-2 , 3-dicarbóxido. Estos grupos formadores de uretano se describen en la Patente de Propiedad Mancomunada No. 5,122,614, la exposición de la cual se incorpora aquí como referencia. Esta patente expone también la formación de derivados de carbonato de N-succinimida de los óxidos de polialquileno incluyendo polietilenglicoles, que son capaces de formar uniones de uretano con los blancos de los grupos amino de la lisina. Entre los polímeros substancialmente no antigénicos, los polialquilen óxidos terminados en alcoxi, mono-activados (PAO's), por ejemplo, polietilenglicoles terminados en monometoxi (mPEG's) son los preferidos; los óxidos de polietileno bis-activados (glicoles) se contemplan también para los fines de la reticulación de los alFN o para proporcionar un medio para unir otras entidades como por ejemplo, agentes blanco para la localización del conjugado polímero-alFN en un área particular, por ejemplo, el hígado.

ENZON Los polímero adecuados variarán substancialmente en peso. Los polímeros tienen pesos moleculares promedio numéricos que varían entre aproximadamente 200 y aproximadamente 35,000 y se seleccionan normalmente para los fines de esta invención. Los pesos moleculares de entre aproximadamente 1,000 y aproximadamente 15,000 son preferidos y de 2,000 a aproximadamente 12,500 son los particularmente preferidos . Las sustancias poliméricas incluidas también son preferentemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitante de estos polímeros incluyen homopolímeros de óxido de polialquileno, como por ejemplo, polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre y cuando la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque se mantenga. Además, también son útiles los mPEG, polímeros terminados en alquilo C _A . Como polímeros a base de PAO alternativos, pueden utilizarse materiales efectivamente no antigénicos como dextrano, polivinil pirrolidonas, poliacrilamidas como HPMA1 s-hidroxipropilmetacrilamidas, alcoholes de polivinilo, polímeros a base de carbohidratos, copolímeros de los anteriores y lo semejante. Aquéllos con pericia ordinaria en este campo se darán cuenta que la lista ENZON anterior es simplemente ilustrativa y que todos los materiales poliméricos que tienen las calidades descritas aquí están contemplados. Para los fines de la presente invención "substancialmente o efectivamente no antigénicos" se refiere a que todos los materiales que en la técnica se entienden son no tóxicos y que no producen una respuesta inmunogénica apreciable, en mamíferos, están incluidos. 3. Condiciones de Reacción Las reacciones de conjugación, algunas veces referidas como reacciones de PEGilación, normalmente se llevan a cabo en solución sin importar si el polímero se unirá a la proteína. Estas técnicas normalmente se llevan a cabo a un pH ligeramente alcalino, es decir, pH 7+ hasta aproximadamente 9 para la conjugación de alFNx. Una clave para la presente invención es que la bioactividad IFN retenida puede llevarse al máximo si el polímero está unido a una histidina, de preferencia His34 sobre IFNa 2b. Se apreciará por el artesano que aunque varias especies de alFN pueden o no tener una histidina en el aminoácido 34, los conjugados de interferón sin embargo incluirán de preferencia por lo menos algunos isómeros posicionales que contienen un polímero unido a una histidina disponible. Los procesos de la invención incluyen, por lo tanto, hacer reaccionar una solución que contiene un alfa ENZON interferón con una cantidad de un polímero activado con oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida, por ejemplo, mPEG activado con succinimidil carbonato, a un pH que es suficiente para facilitar la unión covalente de por lo menos una porción de las hebras de polímero con una histidina, por ejemplo la His 34 de IFNa2b, de las moléculas de interferón individuales. En particular, el pH de preferencia será ligeramente ácido, es decir, menos de aproximadamente 7.0; con mayor preferencia, menos de aproximadamente 6.8 y todavía con mayor preferencia en el intervalo de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 6.8. Las condiciones de reacción para efectuar la conjugación incluyen, además, llevar a cabo la reacción de unión con de aproximadamente una cantidad equi-molar a aproximadamente un exceso molar relativamente pequeño del polímero activado con respecto al alfa-interferón. En este aspecto, el proceso puede llevarse a cabo con aproximadamente 1 a 8 veces de exceso molar; de preferencia aproximadamente 1.5 a 7 veces de exceso molar y con mayor referencia entre aproximadamente 1.75 y 5 veces de exceso molar. La reacción de conjugación puede llevarse a cabo aproximadamente a temperatura ambiente, 20-25°C. También se prefiere que la reacción de copulación puede proceder por periodos de tiempo relativamente cortos, es decir, de 1 a 2 horas, antes de extinguirlas. En la práctica, las ENZON condiciones de reacción proporcionan una mezcla de isómeros posicionales de polímero-IFN. De preferencia, cada isómero contiene una sola hebra de polímero unida al interferón mediante un residuo de aminoácido. En modalidades alternativas, puede haber más de una hebra de polímero unida como resultado del proceso. Las soluciones que contienen estos conjugados son útiles tal como están o bien pueden procesarse adicionalmente para separar los conjugados con base en el peso molecular. La caracterización de los conjugados preferidos de polímero de una sola hebra-IFN (isómeros) mediante cromatografía de intercambio catiónico, para dar picos separados, reveló que el polímero puede unirse hasta aproximadamente 8 sitios diferentes de la molécula de IFNa2b. Estos sitios, representan isómeros posicionales individuales y son Cysl, Lys31, His34, Lys49, Lys83, Lysl21, Lysl31, Lysl34. En algunas modalidades preferidas, las combinaciones de los medios de reacción que contienen los conjugados mono-polímero-IFN pueden contener proporciones relativamente altas del isómero posicional His34, es decir, de aproximadamente 30 a 60%, el isómero posicional Cysl de aproximadamente 7 a 20% y el isómero posicional Lysl21 de aproximadamente 7 a 15%, el resto de los isómeros posicionales comprenden el balance. Se entenderá que los IFN alternativos proporcionarán ENZON distribuciones alternativas de isómeros posicionales, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del material de partida. Debido a la naturaleza de las reacciones de conjugación a base de solución, las composiciones son una mezcla heterogénea de especies que contienen hebras de polímero unidas a diferentes sitios de la molécula de interferón. En cualquier solución que contiene los conjugados, es muy probable que esté presente una mezcla de por lo menos aproximadamente 3, de preferencia de aproximadamente 6 y con mayor preferencia de aproximadamente 8 isómeros posicionales. Por ejemplo, cuando se utiliza IFNa2b, la solución contendrá isómeros conjugados con el polímero unido a uno o más de Cysl, Lys31, His34, Lys49, Lys83 , Lysl21, Lysl31 y Lysl34 del interferón. En el caso de IFNa2b y las formas preferidas de polímeros activados descritos aquí, los 3 sitios más prominentes de unión son His34 (55%) , Cysl (15%) y Lysl21 (15%) . Una composición preferida de la invención es una mezcla de isómeros IFN-polímero que está compuesta de por lo menos aproximadamente 15% de IFN sustituido con polímero His. Es decir, por lo menos aproximadamente 15% de los conjugados incluyen unión covalente del alfa interferón con el polímero substancialmente no antigénico en un His. En ENZON aspectos más preferidos, por lo menos aproximadamente el 30% de los conjugados y, en aspectos todavía más preferidos, por lo menos el 40% de los conjugados, incluyen la unión covalente del polímero con His34. Cuando IFNa2b o los IFN relacionados se utilizan, el sitio de unión a histidina de preferencia es His34.

. Efecto del pH de Reacción sobre la Distribución de Isómeros Posicionales PEG-IFN El proceso de la presente invención aprovecha el descubrimiento de que el sitio de unión del polímero en el interferón alfa se ve influenciado en gran medida por el pH del sistema de reacción. A medida que el pH de la solución de reacción varía, la reactividad hacia formar específicas de los polímeros activados de varios grupos funcionales, por ejemplo, alfa-aminas, imidazoles y épsilon aminas variará. Típicamente, las reacciones de conjugación del polímero se llevan a cabo a pHs básicos con objeto de llevar al máximo la unión en los grupos amino lisina-épsilon. Por ejemplo, Zalipsky et al., Biotech- & App . Biochem, Vol. 15, p. 100-114; (1992) evaluó el reactivo SC-PEG para la PEGilación y reportó que la reactividad óptima era de aproximadamente pH 9.3. El método de la presente invención incluye llevar a cabo la reacción a pHs menores con objeto de permitir que una porción de las hebras del ENZON polímero activado se unan a los grupos amino de histidina y des-acentuar, pero no eliminar, los sitios de lisina para la unión. Además, se ha encontrado también que la actividad biológica de los diferentes isómeros posicionales del polímero conjugado difieren, inesperadamente, incluso cuando cada uno de los isómeros posicionales tienen el mismo grado de sustitución de polímero. El método descrito aquí proporciona la unión novedosa de los polímeros, por ejemplo, PEG, con un residuo de histidina específico en moléculas IFN. En las modalidades preferidas, la reacción de conjugación da por resultado una cantidad substancial, es decir, por lo menos aproximadamente 30% de los conjugados están unidos a los sitios de histidina IFN, como por ejemplo His34 sobre IFNa2b . También se ha determinado inesperadamente que la distribución relativa de los isómeros posicionales depende en gran medida del pH al cual se lleva a cabo la reacción de conjugación. El desplazamiento del pH del pH básico a ligeramente ácido (5.5-6.5) favorece la formación de conjugados unidos a His34 sobre IFNa2b, y en menor grado al N-terminal (Cysl) . Utilizando el pH (8-10) durante la reacción de conjugación, por otra parte, se favorece la formación de los sitios de unión relacionados con lisina, ENZON confirmada por la cromatografía de intercambio catiónico. En las situaciones en donde IFNa2b no está incluida, el sitio His34, por supuesto, no siempre podrá estar presente. Las condiciones de reacción permiten, sin embargo, la unión covalente de un polímero activado con una His. Por lo tanto, los solicitantes han demostrado que el pH del sistema de reacción influye en la colocación de algunos tipos de polímeros activados sobre una superficie de proteína, en especial respecto a diferentes residuos de aminoácidos (es decir, lisina contra amina N-terminal contra histidina) .

. Fraccionación de Conjugados Aunque el proceso de la invención produce una cantidad substancial de conjugados que tienen una sola hebra de polímero, los conjugados que tienen varios grados de sustitución de óxido de polialquileno también se generan. Los PAO's residuales no conjugados y los alFN también pueden estar presentes. Esta mezcla es típicamente un amortiguador de reacción que contiene uno o más aniones de fosfato, cloruro y bicarbonato. El PAO, el alFN y la mezcla de conjugado de preferencia se fraccionan en una solución amortiguadora que contiene de aproximadamente 1 a mg/ml de conjugados PAO-alFN. Las soluciones de fraccionación adecuadas tienen un pH de entre ENZON aproximadamente 7.0 y aproximadamente 9.0 y de preferencia de aproximadamente 7.5 y aproximadamente 8.5. Las soluciones de preferencia contienen una o más sales amortiguadoras seleccionadas de KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04; Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, (NH4)2COa y glicina NaOH. Las soluciones amortiguadoras de fosfato de sodio son las preferidas . Dependiendo del amortiguador de reacción, la solución que contiene al conjugado alFN-polímero puede primero pasar por intercambio con amortiguador/ultrafiltración. Por ejemplo, las soluciones de conjugado alFN pueden ultrafiltrarse a través de una membrana de discriminación de bajo peso molecular (10,000 a 30,000 Daltons) que también puede retirar a la mayoría de los surfactantes, en caso de estar presentes. La fraccionación de los conjugados en especies deseadas de preferencia se lleva a cabo utilizando un medio de intercambio aniónico. Estos medios son capaces de unir selectivamente aquellos conjugados alFN que tienen de 1 a 4 hebras de polímero, el polímero en exceso y el alFN no modificado. Esta fraccionación se presenta ya que las moléculas alFN de varios grados de sustitución tendrán puntos isoeléctricos que varían en una forma algo predecible. Por ejemplo, el punto isoeléctrico de alFN se determina por el número de grupos amino disponibles sobre ENZON la superficie de la proteína. Estos grupos amino sirven también como el punto de unión de conjugados de óxido de polioxialquileno. Por lo tanto, a medida que aumenta el grado de sustitución de óxido de polioxialquileno, el punto isoeléctrico disminuye y la habilidad el conjugado a unirse con la resina de intercambio aniónico se debilita. El uso de resinas de intercambio aniónico fuertemente polares es especialmente preferido para el método de la invención. Por esta razón, se utilizan resinas de intercambio aniónico recubiertas con amina cuaternaria. La resina de amina cuaternaria puede recubrirse sobre ya sea una matriz polimérica o una matriz de sílice, sin embargo se prefieren las matrices poliméricas. Un número de resinas de tetrametil amina o metilamina cuaternaria, resinas de intercambio aniónico, están comercialmente disponibles y recubiertas sobre las matrices de soporte. Entre las resinas de intercambio aniónico cuaternarias disponibles comercialmente para utilizarse con esta invención está la Q-HD que se obtiene de Bio-Sepra, QA TRISACRYL® y QMA-SPHEROSIL®, resinas de amina cuaternaria recubiertas sobre matriz polimérica, fabricada por IBF de Garenne, Francia, para Sepracor, Inc. de Marlborouhg, Massachusetts; TMAE650M®, una resina de tetrametilamino etil recubierta con una matriz polimérica, fabricada por EM-Separators de Gibbstown, New Jersey; ENZON QAE550C® y SUPERQC®, cada una es una resina de amina cuaternaria recubierta sobre una matriz polimérica y fabricada por TosoHaas de Montgomeryville, PA. QMA Accell, fabricada por Millipore de Millford, MA y las resinas PEÍ fabricadas por JT Baker de Phillipsburg, NJ, también podrán utilizarse. La resina de intercambio aniónico se empaca en una columna y se equilibra por medios convencionales. Un amortiguador que tiene el mismo pH y osmolalidad que las solución alFN conjugada se utiliza. La solución que contiene conjugado se absorbe entonces sobre la columna. Al terminar la carga, se aplica un flujo de gradiente de un amortiguador de elución aumentando las concentraciones de sales, en la columna para eluir las fracciones deseadas del conjugado de óxido de polialquileno y alFN. Las fracciones son de peso molecular esencialmente uniforme y grado de sustitución esencialmente uniforme. Las fracciones de conjugado preferidas de IFN tienen de 1 a 4 hebras de polímero por cada molécula de alFN. Con mayor preferencia, las fracciones contienen de aproximadamente 1 a 2 y con mayor preferencia de aproximadamente 1 hebra de polímero por molécula de alFN. El amortiguador de elución de preferencia contiene una o más sales seleccionadas de KC1, NaCl, KH2P04; Na2HP04, NaH2P04, NaHCQ3, NaB04, (NH4)2C03. Estas fracciones ENZON están esencialmente libres de otros conjugados. Cualquier especie no conjugada puede después retrolavarse de la columna por técnicas convencionales . Las técnicas que utilicen pasos isocráticos múltiples de aumento de concentración también podrán emplearse. Los pasos de elución isocráticos múltiples para aumentar la concentración originarán la elución secuencial de los conjugados alFN-polímero. El grado de conjugación del polímero con cada fracción será esencialmente uniforme. Sin embargo, el grado de conjugación del polímero para cada fracción disminuirá con el tiempo de elución. La purificación de intercambio iónico de los conjugados también puede llevarse a cabo, por ejemplo, con una columna Q-HD de Sepracor, Inc. junto con una solución diluida de fosfato de sodio (10 mM NaP04 ion) . La muestra se lava con 10 mM NaP04 para retirar cualquier PAO sin reaccionar y posteriormente se utiliza un paso de elución pro gradiente con NaCl. La elución con 10 mM de NaCl recupera fracciones que contienen conjugados con más de 3 hebras de polímero PAO por IFN, la elución con 50 mM NaCl recupera conjugados que contienen 1 a 2 hebras; la elución con 150 mM NaCl recupera al IFN no modificado. El intervalo de temperaturas para la elución queda entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 25°C. De preferencia, la elución se lleva a cabo a una temperatura ENZON de entre aproximadamente 6°C y aproximadamente 22 °C. La elución de la fracción PAO-alFN se detecta por absorbancia UV a 254nm. La colección de fracciones puede lograrse a través de perfiles de elución en un solo tiempo. Las fracciones preferidas también pueden combinarse en el amortiguador de elución.

. Surfactantes En otro aspecto preferido, las condiciones de reacción incluyen la presencia de un surfactante. Los surfactantes utilizados en los procesos de la invención son agentes de tipo iónico. Un agente particularmente preferido es el dodecil sulfato de sodio (SDS) . Otros surfactantes iónicos como dodecil sulfato de litio, compuestos de amonio cuaternario, ácido taurocólico, ácido caprílico, ácido decan sulfónico, etc., podrán utilizarse.

Los surfactantes no iónicos también pueden utilizarse. Por ejemplo, pueden utilizarse materiales como polioxietilen sorbitán (Tweens) , polioxietilen éteres (Tritons) . Ver también, Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. Las únicas limitaciones en el tipo de surfactante utilizado en los procesos de la invención son que no se provoque la desnaturalización substancial del IFN y no se inhiba completamente la conjugación del polímero. Los ENZON surfactantes están presentes en las mezclas de reacción en cantidades de aproximadamente 0.01-0.5%; de preferencia de 0.05-0.5% y con mayor preferencia entre aproximadamente 0.075-0.25%. Se contemplan las mezclas de surfactantes. 7. Parámetros Farmacocinéticos Como ya se mencionó, las composiciones de esta invención contienen una mezcla heterogéne de especies polímero-IFN en donde la hebra o hebras de polímero se unen a sitios diferentes de la molécula de interferón. A pesar de la naturaleza heterogénea de los conjugados, las composiciones tienen un perfil de farmacocinética predecible in vivo que aumenta al máximo el efecto terapéutico del interferón. Las composiciones de la invención contienen IFN-a y de preferencia incluyen por lo menos aproximadamente 15% de los conjugados polímero-His, con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 30% y con preferencia superlativa por lo menos aproximadamente 40% de los conjugados polímero-His. Mientras que los solicitantes no están limitados por alguna teoría, se considera que la unión de los isómeros posicionales His incluidos en las composiciones de la invención es relativamente lábil frente a los isómeros posicionales Lys. Como resultado a pH fisiológico, las composiciones demuestran un inicio relativamente suave en la actividad después de la administración, así como un efecto de duración prolongada. Este perfil permite que el artesano administre la composición en dosis menos frecuentes que aquéllas que se utilizan para IFN no modificado. 8. Métodos de Tratamiento Otro aspecto de la invención proporciona métodos para el tratamiento de varias condiciones médicas en mamíferos, de preferencia humanos. Los métodos incluyen administrar una cantidad eficaz de una composición que contiene el conjugado de alFN-polímero que ha sido preparada como se describe aquí, en un mamífero que necesita del tratamiento. Los conjugados son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento de condiciones susceptibles al interferón o condiciones que responderían positiva o favorablemente, en términos en las técnicas médicas se conoce como terapia a base de interferón. Las condiciones que pueden tratarse de acuerdo a la presente invención en general son aquéllas que son susceptibles al tratamiento con interferón alfa. Por ejemplo, las condiciones susceptibles incluyen condiciones que responderían positiva o favorablemente a la terapia a base de alfa interferón, tal y como estos términos, son conocidos en el campo médico. Para los fines de la invención, las condiciones podrán tratarse con terapia de alfa interferón incluyendo condiciones en donde el tratamiento con alfa interferón muestra esta eficacia, pero que no pueden tratarse con alfa interferón debido a que los efectos colaterales negativos superan a los beneficios del tratamiento. Por ejemplo, los efectos colaterales acompañantes a la terapia con alfa interferón se han prácticamente descartado como tratamiento del virus Epstein Barr utilizando alfa interferón. La práctica de la invención da por resultado efectos colaterales substancialmente reducidos o eliminados en comparación con el tratamiento convencional con alfa interferón. Las condiciones ejemplificativas que pueden tratarse con interferón incluyen, de manera enunciativa, trastornos de proliferación celular, en particular cáncer (por ejemplo, leucemia de célula pilosa, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, carcinoma de célula basal y melanoma maligno, cáncer ovárico, linfoma de célula T cutánea) e infecciones virales. Sin limitación, el tratamiento con interferón puede utilizarse para tratar condiciones que se beneficiarían de la inhibición de la replicación de los virus sensibles a interferón. Las infecciones virales que pueden tratarse de acuerdo a la invención incluyen hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y otros tipos de hepatitis no A/no B, virus de herpes, virus Epstein-Barr (EBV) , citomegalovirus (CMV) , herpes simple, herpes humano, virus tipo 6 (HHV-6) , papiloma, poxvirus, picornavirus, adenovirus, rinovirus, virus linfotrópico T humano tipos 1 y 2 (HTLV-1/-2) , rotavirus humano, virus de rabia, retrovirus que incluye virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , infecciones virales con encefalitis e infecciones respiratorias . Los métodos de la invención también pueden utilizarse para modificar varias respuestas inmunológicas . Las variantes del interferón alfa están aprobadas actualmente en los Estados Unidos y otros países para el tratamiento de leucemia de célula pilosa, verrugas venéreas, Sarcoma de Kaposi y hepatitis crónica no A/no B y son: interferón alfa-2b, comercializado con el nombre comercial INTRON® A (Schering Corporation, Kenilworth N.J.), e interferón alfa-2a, comercializado con el nombre Roferon® A (Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J.), e interferón consenso comercializado con el nombre Infergen??j (Amgen, Thousand Oaks, CA) . Como el interferón alfa-2b, entre todos los interferones, tiene la aprobación más amplia en todo el mundo para el tratamiento de la infección de hepatitis crónica C, es el más preferido para utilizarse en el tratamiento de hepatitis crónica C de acuerdo a la práctica de la invención. La administración de dosis deseadas puede ser ENZON cada tercer día, pero de preferencia una o dos veces a, la semana. Las dosis normalmente se administran durante por lo menos un periodo de 24 semanas, mediante inyección. La administración de la dosis puede ser intravenosa, subcutánea, intramuscular o por cualquier método sistémico aceptable. Con base en el juicio del doctor que esté atendiendo, la cantidad de fármaco administrado y el régimen de tratamiento utilizado dependerá, por supuesto, de la edad, sexo e historial médico del paciente a tratar, cuenta de neutrófilos (es decir, severidad de la neutropenia) , severidad de la condición de enfermedad específica y la tolerancia del paciente al tratamiento, según se evidencie por toxicidad local y por efectos colaterales sistémicos. La cantidad de la dosis y la frecuencia podrán determinarse durante los análisis iniciales de conteo de neutrófilos. Las formulaciones farmacéuticas convencionales también podrán prepararse utilizando las composiciones que contienen al conjugado de la presente invención. Las formulaciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición del conjugado interferón-polímero junto con portadores farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, adyuvantes, diluyentes, conservadores y/o solubilizantes, en caso de necesitarse, podrán utilizarse en la práctica de la invención. Las composiciones ENZON % farmacéuticas de interferón que incluyen aquéllas de la presente invención pueden incluir diluyentes de varios amortiguadores (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) que tienen un intervalo de pH y fuerza iónica, portadores (por ejemplo, albúmina de suero humano) , solubilizantes (por ejemplo, tween polysorbate) , y conservadores (por ejemplo, timerosol, alcohol bencílico) . Ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 4,496,537. La cantidad del conjugado a—IFN-polímero administrada para tratar las condiciones antes descritas se basa en la actividad del IFN de conjugado polimérico. Se trata de una cantidad que es suficiente para afectar de manera significativa una respuesta clínica positiva. Aunque la dosis clínica ocasionará cierto nivel de efectos colaterales en algunos pacientes, la dosis máxima para mamíferos incluyendo al humano, es la dosis más alta que puede provocar efectos colaterales clínicamente importantes y no manejables. Para los fines de la invención, los efectos colaterales clínicamente importantes son aquéllos que requerirán del cese de la terapia debido a síntomas severos semejantes a la influenza, depresión del sistema nervioso central, trastornos gastrointestinales severos, alopecia, prurito severo o rash. Las condiciones de anormalidades severas en leucocitos y/o eritrocitos y/o enzimas hepáticas o condiciones semejantes a la anemia, también son limitantes de la dosis. Naturalmente, las dosis de las varias composiciones de alFN variarán un poco dependiendo de la entidad alFN y del polímero seleccionados. En general, el conjugado se administra en cantidades que varían de aproximadamente 100,000 a aproximadamente varios millones de Ul/m2 por día, con base en la condición del mamífero. El intervalo establecido antes es ilustrativo y aquellos expertos en este campo determinarán la dosificación óptima del conjugado seleccionado con base en la experiencia clínica y la indicación del tratamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una solución, suspensión, tableta, cápsula, polvo liofilizado o lo semejante, pueden prepararse de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica. También se contempla que la administración de estas composiciones principalmente será la ruta parenteral, aunque pueden utilizarse las rutas oral o por inhalación, dependiendo de las necesidades del técnico.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar \ una apreciación adicional de la invención, pero no deben interpretarse de ninguna manera como restrictivos del alcance efectivo de la misma.

ENZON EJEMPLO 1 Preparación de raIFN-PEG??000 en presencia de SDS (0.1%) En este ejemplo, el aIFN-2b recombinante, (ralFN) , un producto de Shering-Plough Corporation, Kenilworth, New Jersey se conjugó con carbonato de N-succinimida activado con polietilenglicol (SC-PEG) como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,122,614.

El polímero tuvo un peso molecular de aproximadamente ,000. 36 mg del ralFN se dializaron en 0.1 molar de fosfato de sodio pH 7.5 utilizando Centricon-10 (un producto de Amicon Corporation de Beverly, Mass) . La concentración final de ralFN fue de aproximadamente 3 mg/ml. Se añadieron 0.1 mi de SDS al 10% al ralFN y se dejó incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Posteriormente, 42 mg de SC-PEG5 000 se añadieron a la solución proteína-SDS y se agitaron a temperatura ambiente por 2 horas y después se extinguió la reacción con glicina. Posteriormente, la mezcla de reacción se dializó en fosfato de sodio 10 mM, pH 8, para fraccionar el IFN PEGilado utilizando un Centricon-30.

EJEMPLO 2 Preparación de raIFN12 000 en presencia de SDS (0.1%) En este ejemplo, se repitieron los pasos del ENZON Ejemplo 1, excepto que el polietilenglicol tuvo un peso molecular de aproximadamente 12,000. Los pasos de reacción fueron exactamente iguales para proporcionar el conjugado EJEMPLO 3 Fraccionación de 2PEG^000raIFN En este ejemplo, los conjugados se prepararon de acuerdo al Ejemplo 1, en donde se fraccionaron para obtener la fracción deseada 2-PEG 5,,000 ' El PEG-alFN en amortiguador de fosfato de sodio se cargó sobre una columna de intercambio aniónico QHD. La fracción 2 -PEG se eluyó con un gradiente de 0 a 400 de mM de cloruro de sodio en 10 mM de fosfato pH 8. La fracción 2-PEG se verificó utilizando cromatografía de exclusión de tamaño y SDS-PAGE.

EJEMPLO 4 Fraccionación de 2PEG12?000raIFN Los conjugados de polímero del Ejemplo 2 se fraccionaron en la forma descrita en el Ejemplo 3 y se verificaron de la misma manera.

EJEMPLOS 5 A 8 En estos ejemplos, se prepararon preparaciones adicionales de PEG12000-raIFN como se describe previamente, ENZON excepto que no se utilizó surfactante. Después de las reacciones de conjugación, las muestras se probaron para determinar actividad retenida y número de PEG. Los resultados se proporcionan a continuación en el Cuadro 1.

CUADRO 1 EJEMPLO 9 Datos Comparativos En este ejemplo, el producto del Ejemplo 3, (SDS- 2-PEG-5/000raIFN) , 2-PEGS/000raIFN se elaboró en ausencia de un surfactante y se analizó el ralFN no conjugado. La actividad se determinó utilizando el análisis CPE con inoculación del virus EMC en células de carcinoma de pulmón humano A549. La vida circulante se determinó utilizando un valor promedio obtenido a partir de la sangre de 3 ratas en un grupo que recibe 1 millón de unidades, con puntos de tiempo tomados en un lapso de 7 días .

ENZON CUADRO 2 Estos datos muestran claramente las ventajas del proceso de la invención. La actividad retenida es hasta del doble de la obtenida utilizando técnicas estándar.

EJEMPLO 10 En este ejemplo, se generaron varios datos farmacocinéticos utilizando los conjugados 2PEG ralFN preparados de acuerdo a los métodos descritos antes. Estas muestras se compararon con IFN sin modificar de acuerdo al protocolo establecido en el Cuadro 4. La Muestra B se preparó con SDS .

CUADRO 3 ACTIVIDAD RETENIDA ENZON Por ejemplo: CUADRO 4 PROTOCOLO FARMACOCINÉTICO ANIMALES : Sprague Dawley (3 ratas/punto de tiempo DOSIS: 10xl0s UN IFN/rata RUTA: Subcutánea (S.C.) FÁRMACO: 2-PEG-IFNa's con PEG de 5,000 y 12,000 de peso molecular PUNTOS TIEMPO: 0 min., 5 min., 30 min., 1 hr., 2 hr., 4 hr., 8 hr., 24 hr. , 48 hr. , 5 días y 7 días después de la administración del fármaco VALORACIÓN: Valoración CPE utilizando muestras de suero en un virus EMC y en carcinoma de pulmón humano A 549.

ENZON AUC = Área Bajo la Curva, Cmax, T1/2a, T1/2ß - todas tienen sus significados generalmente conocidos para los expertos.

CUADROS 5 Y 6 SUMARIO DE DATOS FARMACOCINÉTICOS PARA PEG- INTERFERONES CUADRO 5 CUADRO 6 Los datos anteriores proporcionan las siguientes conclusiones : los conjugados 2 -PEG-raIFN preparados con pesos ENZON moleculares tanto de 5,000 como de 12,000 tienen distintas ventajas respecto a los interferones no modificados en los mamíferos. En el caso de las composiciones administradas en forma subcutánea, T.^ aumentó esencialmente por la conjugación de la proteína con aproximadamente 2 PEG. Para condiciones crónicas, fueron deseables las Tmax más largas y permitieron a los médicos espaciar las administraciones recurrentes debido a la longitud de duración del efecto. De forma todavía más inesperada, se tuvo el hecho de que los conjugados de 2-PEG12000 eran incapaces de aumentar inesperadamente la AUC en más de 10 veces . Este aumento dramático en el área bajo la curva no fue proporcional al peso del polímero adicional. Evidentemente, las ventajas terapéuticas pueden percibirse por este aumento inesperado.

EJEMPLO 11 EFECTO DEL PH SOBRE PEGILACIÓN Con objeto de probar este efecto, la reacción de conjugación del polímero (PEGilación) de los Ejemplos 5 a 8 se repitió utilizando mPEG12000 (sin surfactante) a cuatro diferentes pHs, 5.4, 6.5, 8.0 y 10.0. La proporción de 2.6 gramos de SC-PEG12#000 a 1 gramo de IFN (proporción molar 3.9:1) se utilizó para la reacción a pH 5.4, 6.5 y 8.0 mientras que la proporción de 2.1 gramos de SC-PEG12>000 a 1 gramo de IFN (proporción molar 3.2:1) se utilizó a pH 10.

ENZON moleculares tanto de 5,000 como de 12,000 tienen distintas ventajas respecto a los interferones no modificados en los mamíferos. En el caso de las composiciones administradas en forma subcutánea, Tmax aumentó esencialmente por la conjugación de la proteína con aproximadamente 2 PEG. Para condiciones crónicas, fueron deseables las Tmax más largas y permitieron a los médicos espaciar las administraciones recurrentes debido a la longitud de duración del efecto. De forma todavía más inesperada, se tuvo el hecho de que los conjugados de 2-PEG12 000 eran incapaces de aumentar inesperadamente la AUC en más de 10 veces. Este aumento dramático en el área bajo la curva no fue proporcional al peso del polímero adicional. Evidentemente, las ventajas terapéuticas pueden percibirse por este aumento inesperado.

EJEMPLO 11 EFECTO DEL PH SOBRE PEGILACIÓN Con objeto de probar este efecto, la reacción _ de conjugación del polímero (PEGilación) de los Ejemplos 5 a 8 se repitió utilizando mPEG12000 (sin surfactante) a cuatro diferentes pHs, 5.4, 6.5, 8.0 y 10.0. La proporción de 2.6 gramos de SC-PEG12?000 a 1 gramo de IFN (proporción molar 3.9:1) se utilizó para la reacción a pH 5.4, 6.5 y 8.0 mientras que la proporción de 2.1 gramos de SC-PEG12 000 a 1 gramo de IFN (proporción molar 3.2:1) se utilizó a pH 10.

ENZON Al final de la reacción, se añadió glicina para inactivar cualquier residuo residual de PEGilación. El producto de cada reacción se purificó utilizando una resina Q-hyper D a un pH de 8 con elución salina para retirar ingredientes sin reaccionar. El conjugado purificado obtenido a los diferentes pHs se evaluó en su actividad biológica, sensibilidad dehidroxilamina y distribución de isómeros posicionales . La actividad biológica se determinó por actividad específica (valoración MTT-CPE) . La sensibilidad de hidroxilamina se tomó para determinar que porcentaje del conjugado se PEGiló en los sitios de histidina, incluyendo el IFN-His34. La hidroxilamina es un reactivo conocido que encontramos rompe selectivamente PEG a partir de histidinas de IFN. Una alícuota de cada una de las muestras (50xl) se diluyó con 0.45 mi de fosfato de sodio y 10 mi de mM pH 7.0. Una alícuota de esta solución de proteína (150 µl) se trató con 150 µl de 0.5 M de hidroxilamina y se incubó a temperatura ambiente por 60 minutos. Posteriormente se cargó un volumen de 75 µl sobre una columna Mini-S (Pharmacia Biotech) para la cromatografía de intercambio catiónico. La fase móvil A incluyó 10 mM de acetato de sodio como amortiguador pH 5.3 y 25% de 2-propanol. La fase móvil B contuvo 500 mM de cloruro de sodio disueltos en fase móvil A. La velocidad de ENZON flujo se estableció a 0.5 ml/min y la proteína eluida se detecto a 214nm. Las soluciones individuales PEG-IFN se diluyeron con 10 mM acetato de sodio, pH 5.3, que contenía 2-propanol (5%) a una concentración de proteína de 1 mg/ml. Los volúmenes de inyección variaron de 10 a 30 µl , dependiendo de la concentración de proteína. Se utilizó un gradiente lineal. Los resultados se establecen en el Cuadro 7 siguiente en la Figura 1. La Figura 1 muestra el traslape de los cromatogramas obtenidos de la columna de cromatografía de intercambio catiónico Mono-S de productos de reacción de pH diferentes. El sitio de conjugación del polímero para cada isómero posicional se determinó por digestión de picos individuales a partir de la cromatografía de intercambio catiónico utilizando enzimas proteolíticas (tripsina, V8-proteasa, quimiotripsina o subtilisina) , aislamiento de fragmentos PEGilados y análisis de secuenciación N-terminal y espectroscopia de masas . Como se observa en la Figura, la distribución de los isómeros posicionales cambia significativamente a medida que cambia el pH de la reacción. Mientras más alto es el pH menor es el His34 unido al PEG-IFN y menos dramáticamente se producen los productos PEG-IFN unidos a Cysl. El Cuadro 7 resume la bioactividad específica que se determina utilizando el bioensayo MTT-CPE para IFN en la ENZON cantidad de IFN liberado durante el tratamiento con 0.5M de hidroxilamina durante 2 horas a 25°C para los diferentes productos conjugados. Estos hallazgos confirman que las diferencias observadas en la Figura 1 también pueden relacionarse con diferentes características biológicas del producto. Cuando la conjugación se lleva a cabo a pHs más altos (es decir entre 8 ó 10) los productos formados son menos bioactivos y más resistentes a hidroxilamina, lo que significa que a pH's más altos hay menos polímero sobre His34.

CUADRO 7 BIQACTIVIDADES Y SENSIBILIDADES DE HIDROXILAMINA DE PEG- IFN GENERADO A DIFERENTES PHS Los resultados anteriores indican que el pH es una variable clave de la reacción de conjugación y que la distribución relativa de los isómeros posicionales varía ENZON dramáticamente con el pH. Inesperadamente, la bioactividad de la mezcla PEG-IFN resultante de los isómeros posicionales también se ve afectada.

EJEMPLO 12 COMPARACIÓN DE UNIÓN DE URETANO QUE FORMA POLÍMEROS ACTIVADOS En este ejemplo, se comparó el efecto del pH sobre las condiciones de reacción utilizando un tipo diferente de ligante de uretano para ver si el grupo activante tenía un papel en la determinación del sitio de unión del polímero y la bioactividad. En particular, el Metoxipoli (etilenglicol) -succinimidil carbonato PM 12,000 (SC-PEG12/000) utilizado en los ejemplos anteriores se comparó con metoxipoli (etilenglicol) -2-piridil carbonato, PM 12,000 (PC-PEG12r000) expuesto en la Patente de los Estados Unidos No. 5,382,657, como los reactivos de polímero activado para interferón alfa-2b (IFN) . Las reacciones de conjugación se llevaron a cabo para los reactivos SC-PEG12000 y PC-PEG12 000, a pH 6.5 y 10.0. Las condiciones utilizadas para generar las 4 muestras de IFN monopegilado para el análisis fueron 1) SC-PEG12/000 @ pH 6.5, 2) PC-PEG12/000 @ pH 6.5; 3) SC-PEG12/000 @ pH 10.0; y 4) PC-PEG12r000 @ pH 10.0. En cada pH 6.5, se utilizó una proporción molar de 3.9 a 1 de PEG: IFN. En cada pH 10.0 se utilizó una proporción molar de 3.2:1 de PEG:IFN. Estas condiciones se seleccionaron para evaluar la ENZON influencia tanto del pH de la reacción como del ligante en la composición del producto final. El material conjugado para cada condición de reacción se recuperó y se probó la actividad biológica (valoración CPE) y la distribución de los isómeros posicionales utilizando la valoración cromatográfica Mini-S. El PEG-IFN generado haciendo reaccionar IFN con PC-PEG, a pH 6.5 tuvo una actividad biológica menor al elaborado con ese sello en SC-PEG12 000 a pesar de que ambos reactivos forman enlaces uretano. Por lo tanto, se mostró que a pesar de la similitud entre los ligantes, SC-PEG, un polímero activado con oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida, con mayor preferencia se une a His34. Sin embargo es interesante que los productos PEG-IFN generados llevando a cabo la reacción a pH 10 tanto con PC-PEG^^o como con SC- PEG 12,000 tuvieron actividades biológicas similares . En ambos casos, las actividades fueron menores a las obtenidas para SC-PEG12/000 a pH de 6.5. Las valoraciones por cromatografía Mini-S mostraron que el PEG-IFN ligado con histidina-34 es el isómero posicional principal presente cuando se utiliza SC-PEG12#000 a pH de 6.5. PEG-IFN unido a Lisina-121 es el isómero posicional importante presente cuando la reacción se lleva a cabo a pH de 6.5 utilizando PC-PEG^^. A pH de 10, PEG-IFN unido a lisina-121 es el producto más importante utilizando cualquiera de los reactivos. Ver Cuadro 8. Por lo tanto, el uso de pH ácido y un polímero activado con oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida es decir SC-PEG, produce conjugados que son productos únicos que no pueden reproducirse substituyendo otro polímero activado que forma enlace uretano como por ejemplo PC-PEG-^^ en lugar de SC-PEG12000. Los materiales anteriores contuvieron menos de 5% en total de di-PEG y multi-PEG-IFN como se indica en la valoración HPLC por exclusión de tamaño.

CUADRO 8 SUMARIO DE LOS RESULTADOS DE LA VALORACIÓN MINIS NUMERO DE PICO - (Por ciento de Área) Mues ra 1 2 3. 4 5 6. 7 8 SC-PEG; pH 6.5 2.1 63 ND 0.7 11.8 5.6 3.4 13.3 PC-PEG; pH 6.5 ND 4.8 9 9.6 33.8 13 3.8 25.9 SC-PEG; pH 10 ND ND 14.8 11.2 57.6 9.5 3.1 3.8 PC-PEG; pH 10 ND ND 9.6 13.8 51.7 13.7 3.5 7.8 ND: no detectado Asignación de Pico: Pico 2: PEG-IFN ligado a His-34; Pico 4: PEG-IFN ligado a Lys-31; Pico 5: PEG-IFN ligado a Lys-121; Pico 6: PEG-IFN ligado a Lys-49; Pico 7: PEG-IFN ligado a Lys-83; Pico 8: PEG-IFN ligado a N-terminal (cisteína) .

ENZON EJEMPLO 13 Caracterización por Cromatografía de Intercambio Catiónico En este ejemplo, la separación analítica de varios lotes del producto PEG-IFN se produjo utilizando el procedimiento del Ejemplo 11 (pH 6.5) utilizando la cromatografía de intercambio catiónico a fin de determinar los sitios de unión del polímero e identificar los isómeros posicionales individuales. El aparato de intercambio catiónico fue una columna Mini-S (Pharmacia Biotech) . La fase móvil A incluyó 10 mM de amortiguador de acetato de sodio pH 5.3 y 25% de 2-propanol. La fase móvil B contuvo 500 mM de cloruro de sodio disuelto en fase móvil A. La velocidad de flujo se ajustó a 0.5 ml/min y la proteína eluida se detectó a 214nm. Las soluciones PEG-IFN individuales se diluyeron con 10 mM de acetato de sodio pH 5.3, que contenía 2-propanol (5%) a una concentración de proteína de 1 mg/ml . Los volúmenes de inyección variaron de 10 a 30 µl, dependiendo de la concentración de la proteína. Se utilizó el siguiente gradiente molar: Los resultados se proporcionan en el siguiente Cuadro 9 y se ilustran gráficamente en la Figura 2.

CUADRO 9 CUANTIFICACIÓN DE PORCENTAJE DE ÁREA DE LOS LOTES PEG- IFN POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO CATIÓNICO Asignación de Pico Principal: Pico 2: EPG-IFN unido a Lys-134; Pico 3/4: PEG-IFN unido a His-34; Pico 6: PEG-IFN unido a Lys-121 y PEG-IFN unido a Lys-131; Pico 8: ENZON PEG-IFN unido a Cys-1. Estos resultados ilustran que una mayoría de los conjugados se encontraron en los picos 3 y 4 (PEG-IFN unido a His-34) . Los resultados también muestran que en forma contraria a lo que se esperaba, la mayoría de los conjugados se formaron uniendo el polímero a una histidina en lugar de a los grupos amino de la lisina. Otras modalidades de la invención serán evidentes para aquellos expertos en este campo a partir de una consideración de esta especificación o práctica de la invención revelada aquí. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideren solo como ejemplificativos, y el verdadero espíritu y alcance de la invención estará indicado en las siguientes reivindicaciones .

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla de isómeros posicionales del conjugado de alfa interferón y polímeros, en donde uno de los isómeros posicionales comprende un alfa interferón conjugado covalente con un polímero esencialmente no antagénico, en un residuo de histidina sobre el alfa interferón.
2. 2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el alfa interferón es alfa 2b.
3. 3. La composición farmacéutica según la reivindicación 2, en donde el residuo de histidina es His34.
4. 4. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde la mezcla de los isómeros posicionales de alfa interferón comprende por lo menos aproximadamente 3 isómeros posicionales.
5. 5. La composición farmacéutica según la reivindicación 4, en donde la mezcla de los isómeros posicionales de alfa interferón comprende por lo menos aproximadamente 6 isómeros posicionales.
6. 6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en donde la mezcla de los isómeros posicionales de alfa interferón comprende por lo menos aproximadamente 8 isómeros posicionales.
7. 7. La composición farmacéutica según la ENZON reivindicación 6, en donde el alfa interferón es alfa interferón 2b y los isómeros posicionales se seleccionan del grupo que consiste de Cysl, Lys31, His34, Lys49, Lys83, Lysl21, Lysl31 y Lysl34.
8. 8. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el polímero comprende un óxido de polialquileno.
9. 9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde el óxido de polialquileno es polietilenglicol.
10. 10. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde el óxido de polialquileno es monometoxi-polietilenglicol (Mpeg) .
11. 11. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 a aproximadamente 35,000.
12. 12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1,000 a aproximadamente 15,000.
13. 13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2,000 a aproximadamente 12,500. ENZON
14. 14. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el polímero se selecciona del grupo que consiste de polipropilenglicol, dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes de polivinilo y polímeros a base de carbohidrato.
15. 15. Una composición que contiene alfa interferón que comprende una pluralidad de conjugados de alfa interferón y polímero, en donde por lo menos aproximadamente 15% de los conjugados incluyen la unión covalente de un polímero substancialmente no antigénico en una histidina de alfa interferón, en donde el polímero substancialmente no antigénico es un óxido de polialquileno que comprende un alquilo terminal.
16. 16. La composición según la reivindicación 15, en donde la porción del alfa interferón de la composición es alfa interferón 2b y la histidina es His3 .
17. 17. La composición según la reivindicación 15, en donde por lo menos aproximadamente 30% de los conjugados incluyen la unión covalente del polímero esencialmente no antigénico en histidina-34 del alfa interferón.
18. 18. La composición según la reivindicación 17, en donde por lo menos aproximadamente 40% de los conjugados incluyen la unión covalente del polímero substancialmente no antigénico en histidina-34 del alfa interferón.
19. 19. Una composición farmacéutica que comprende ENZON una mezcla de isómeros posicionales de alfa interferón 2b-polímero, en donde de aproximadamente 30 a aproximadamente 60% de los isómeros posicionales incluyen un polímero esencialmente no antigénico conjugado con His34 del alfa interferón, de aproximadamente 7 a aproximadamente 20% de los isómeros posicionales incluyen un polímero esencialmente no antigénico conjugado con el Cysl de alfa interferón y aproximadamente 7 a aproximadamente 15% de los isómeros posicionales incluyen un polímero substancialmente no antigénico conjugado con el Lysl21 del alfa interferón.
20. 20. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, en donde aproximadamente 55% de los isómeros posicionales incluyen un polímero substancialmente no antigénico conjugado con el His34 del alfa interferón, aproximadamente 15% de los isómeros posicionales incluyen un polímero esencialmente no antigénico conjugado con el Cysl del alfa interferón y aproximadamente 15% de los isómeros posicionales incluyen un polímero substancialmente no antigénico conjugado con el Lysl21 del alfa interferón. 21. Un método para preparar conjugados de alfa interferón, que comprende poner en contacto un alfa interferón con una cantidad suficiente de un polímero substancialmente no antigénico activado con oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida bajo las condiciones que son suficientes para facilitar la unión covalente del polímero ENZON substancialmente no antigénico en una histidina del alfa interferón. 22. El método según la reivindicación 21, en donde la oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida es succinimidil carbonato . 23. El método según la reivindicación 21, en donde las condiciones incluyen llevar a cabo el contacto a un pH de menos de aproximadamente 7.0. 24. El método según la reivindicación 23, en donde las condiciones incluyen llevar a cabo el contacto a un pH de menos de aproximadamente 6.8. 25. El método según la reivindicación 24, en donde las condiciones incluyen llevar a cabo el contacto a un pH de entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 6.8. 26. El método según la reivindicación 21, en donde el polímero activado substancialmente no antigénico está presente en un exceso molar con respecto al alfa interferón. 27. El método según la reivindicación 26, en donde el polímero está presente en una proporción molar que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 partes de partes de alfa interferón. 28. El método según la reivindicación 27, en donde el exceso molar del polímero es de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 7 veces. ENZON 29. El método según la reivindicación 28, en donde el exceso molar del polímero es de aproximadamente 1.75 a aproximadamente 5 veces . 30. El método según la reivindicación 21, en donde el polímero substancialmente no antigénico comprende un óxido de polialquileno. 31. El método según la reivindicación 8, en donde el óxido de polialquileno es polietilenglicol. 32. El método según la reivindicación 21, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 a aproximadamente 35,000. 33. El método según la reivindicación 32, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1,000 a aproximadamente 15,000. 34. El método según la reivindicación 33, en donde el polímero substancialmente no antigénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2,000 a aproximadamente 12,500. 35. El método según la reivindicación 21, en donde el alfa interferón es interferón alfa 2b. 36. Un método para tratar una condición susceptible de interferón en mamíferos, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición de la ENZON reivindicación 1. 37. Un método para tratar una condición susceptible de interferón en mamíferos, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 15. 38. Un método para tratar una condición susceptible de interferón en mamíferos, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición de la reivindicación 19. 39. Un conjugado substancialmente no antigénico de polímero e interferón preparado de acuerdo al método de la reivindicación
21. 21.