BRPI0721984B1 - interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos - Google Patents

interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BRPI0721984B1
BRPI0721984B1 BRPI0721984-9A BRPI0721984A BRPI0721984B1 BR PI0721984 B1 BRPI0721984 B1 BR PI0721984B1 BR PI0721984 A BRPI0721984 A BR PI0721984A BR PI0721984 B1 BRPI0721984 B1 BR PI0721984B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
ifn
ypeg
peg
group
amino acid
Prior art date
Application number
BRPI0721984-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Weidong Zhou
Qingjiang Xiao
Li Sun
Tiebing Wang
Fenghong Yin
Shihong Luo
Lu Zhuang
Min Liu
Tianle Xu
Yong Zhang
Original Assignee
Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. filed Critical Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd.
Publication of BRPI0721984A2 publication Critical patent/BRPI0721984A2/pt
Publication of BRPI0721984B1 publication Critical patent/BRPI0721984B1/pt
Publication of BRPI0721984B8 publication Critical patent/BRPI0721984B8/pt

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

INTERFERON ALFA 2B MODIFICADO POR POLIETILENO GLICOL, PREPARAÇÃO E USO DO MESMO. A presente invenção refere-se ao interferon-(Alfa)2b modificado com polietileno glicol (PEG) de ramificação em forma de Y em um único resíduo Lys e a preparação do mesmo. O IFN-(Alfa)2b PEGuilado pode ser usado para a preparação de um medicamento para tratar uma doença, por exemplo, infecções virais tais como Hepatite C.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se ao interferon-a2b modificado com polietileno glicol de ramificação em forma de Y (PEG) em um único resíduo de aminoácido e a preparação do mesmo, bem como o uso do IFN-a2b PEGuilado preparado em um único resíduo de aminoácido no campo farmacêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Interferons (IFNs) são uma família de proteínas ou glicoproteínas de molécula pequena produzida por células eucarióticas em resposta a infecção viral e outros estímulos antigênicos, que exibe efeitos antivirals, anti prol iterativos e imunomoduladores de amplo espectro. IFNs foram amplamente aplicados no tratamento de várias condições e doenças, tal como infecções virais, por exemplo, hepatite B, hepatite C e HIV; distúrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística e pulmonar intersticial doença; e tumores, por exemplo, mielomas, linfomas, câncer do fígado, câncer do pulmão, leucemia de célula pilosa, e assim por diante (Kenji Oritani, Paul W Kincade e outros. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, e outros Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alfa-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002).
[0003] IFNs são classificados em quatro tipos de acordo com suas diferenças em propriedades químicas, imunológicas e biológicas:interferon- α, β, ye ε. Interferon-α (IFN-α) é secretado por leucócitos. IFNs-α humanos são codificados por uma família de multigene que consiste em cerca de 20 genes, as proteínas codificadas compartilhando até cerca de cerca de 90% de homologia de sequência de aminoácido (Henco K., Brosius F.J., e outros. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985). IFN-a2b humano é um dos subtipos da subfamília a2 da família de IFN-a humana, e é uma proteína de cadeia única com várias atividades biológicas. A proteína de cadeia única consiste em 165 resíduos de aminoácidos com 4 Cys, em que duas ligações de dissulfeto de intracadeia são formadas entre Cys1-Cys98 e Cys29-Cys138 respectivamente e o aminoácido N-terminal é Cys com um grupo a-NH2 livre. Os resíduos nas posições 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 e 164 da sequência de aminoácido são Lys, cada dos quais contém um grupo ε-NH2 livre. Esta proteína não é glicosilada e sensível a muitas proteases. A sequência de aminoácido de interferon-a2b humano é mostrada em SEQ ID No: 1.
[0004] IFNs são geralmente administrados parenteral mente em tratamentos clínicos. A meia-vida in vivo curta (2-4h) e imunogenicidade forte de IFNs resultam em um intervalo de dosagem mais curto e uma frequência de dosagem maior. Como os anticorpos gerados significantemente diminuem a eficácia terapêutica, é difícil obter uma eficácia clínica ideal. A tecnologia de modificação de polietileno glicol (PEG) desenvolvida nos últimos anos forneceu uma possível solução para os problemas acima.
[0005] PEG é um polímero orgânico inerte, não-tóxico e biodegradável, e é importante nos campos tanto de biotecnologia quanto de farmacêuticos. A técnica de modificação de PEG é ligar PEG a uma proteína ativa através de ligação covalente. Após a glicolação de polietileno (PEGuilação), as propriedades da proteínapodem ser significantemente melhoradas, por exemplo, o prolongamento da meia vida metabólica do fármaco, a redução da imunogenicidade, o aumento da segurança, a melhora da eficácia terapêutica, a diminuição da frequência de dosagem, o aumento de solubilidade de fármaco/solubilidade em água, o aumento de resistência contra proteólise, a facilitação de liberação controlada de fármaco e assim por diante. Para detalhes adicionais, favor referir-se a Inada e outros J. Bioact and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado e outros Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993, e Publicação de Patente U.S. UP 4179337.
[0006] É descrita na Patente U.S. No. 4179337, que após a ligação de PEG a uma enzima ou insulina, a imunogenicidade da proteína foi reduzida, ao mesmo tempo em que simultaneamente as atividades da proteína foram reduzidas também. Isto foi também encontrado em G-CSF (Satake-lshikawa e outros Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Katre e outros Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987), TNF-α (Tsutsumi e outros Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue e outros J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) e CD4-lgG (Chamow e outros Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
[0007] Foi reportado que a proteína modificada por PEG ramificado exibiu melhor tolerância ao pH, termoestabilidade e resistência contra proteólise do que proteínas modificadas por PEG de cadeia linear (Monfardini e outros Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995). Geralmente, uma molécula PEG modifica uma proteína por ligação da própria ao grupo a-amino N-terminal ou grupos ε-amino de um resíduo Lys na molécula de proteína. Existem normalmente três tipos de PEGs para modificação de proteína: um PEG de cadeia linear (EP 0593868), um PEG de ramificação em forma de U (EP 0809996) e um PEG deramificação em forma de Y (CN1243779C).
[0008] Atualmente muitos tipos de proteínas PEGuiladas têm sido aplicadas clinicamente. Em 1990, a adenosina deaminase PEGuilada- bovina (Adagen) produzida por ENZON Inc. foi fornecida por FDA, e usada para tratar doença da imunodeficiência combinada severa (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov). Em 1994, outra proteína modificada por PEG para tratar leucemia linfoblástica aguda, a asparaginase PEGuilada (pegaspargase, Oncaspar), foi também comercializada em US (103411s50521b1, http://www.fda.gov). O interferon-a2b modificado por PEG (PEG IFN-α2b, PEG-lntron) desenvolvido por Schering-Plough foi aprovado pelo FDA para o comércio em 2000 e o interferon-a PEGuilado (PEG IFN-α2a, Pegasys) produzido por Hoffman-la Roche Ltd. foi também aprovado para comercialização em 2002, ambos os quais são usados para tratar hepatite (103964s50371b1, pegsche011901LB, http://www.fda.gov). Em 2002, o fator de estimulação de colônia de granulócito humano modificado por PEG produzido por Amgen Inc. (PEG-filgrastim, Neulasta) foi também aprovado pelo FDA, que é usado para tratar câncer de mama metastático (pegfamg013102LB, http://www.fda.qov). O FDA também aceitou a aplicação para antagonista de fator de crescimento humano PEGuilado desenvolvido por Pharmacia. O fragmento de anticorpo de TNF-a combinado de PEG de Celltech e o receptor de PEG-TNF de Amgen são testados nas experiências clínicas avançadas. O primeiro conjugado de PEG-molécula orgânica, camptotecina PEGuilada, também entrou na fase II de experiência clínica. Em 2004, o oligonucleotídeo modificado por PEG (Pegaptanib, Macugen®) foi aprovado pelo FDA. O metabolismo in vivo do PEG no fármaco (ou próprio PEG) já foi claramente entendido, e PEG provou ser um modificador de fármaco bom e seguro sem qualquer efeito adverso.
[0009] Os PEGs que podem ser ligados a um fármaco de proteína normalmente necessitam de derivação, se modo que um ou dois grupos terminais das extremidades de PEGs possam ser quimicamente ativados para possuir um grupo funcional adequado que exiba atividade, e desse modo possa formar uma ligação covalente estável com, pelo menos um grupo funcional do fármaco a ser ligado. Por exemplo, PEGs podem ser ligados a ε-NH2 de resíduo Lys na cadeia de peptídeo de proteína, ou ao α-NHz do resíduo de aminoácido N-terminal da cadeia de peptídeo de proteína. Na PEGuilação de IFN-a descrita na patente Europeia EP0809996, PEG- NHS é ligado por meio de substituição nucleofílica ao α-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-NH2 de Lys em IFN-a. O PEG-NHS mencionado na patente acima é um derivado de PEG de ramificação em forma de U (PEG2-NHS), a fórmula molecular do mesmo como abaixo:
Figure img0001
ROCH^CHatOCHjCHjJπ —O—C—NHR'OCH,C HjfOCHgC H2)n o—C'ItOem que, R e R' são independentemente um grupo alquilade peso molecular baixo, n e n' são de 600 a 1500, e o peso molecular médio do PEG é de 26KD a 66KD. A fórmula molecular do IFN-a modificado por PEG2-NHS é como abaixo:
Figure img0002
oiiROCHjCHjfOCHjCHA—O-C -NH(CHj),onde uma ou mais moléculas de PEG2-NHS são ligadas a O-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-NFfe de Lys em IFN-a, os produtos obtidos são uma mistura de IFNs-a não-PEGuilados, IFNs-a PEGuilados em um único resíduo de aminoácido e IFNs-a PEGuiladosem múltiplos resíduos de aminoácidos. O IFN-a PEGuilado em um único resíduo de aminoácido pode ser isolado dos produtos obtidos por qualquer meio de purificação apropriado. IFN-a tem um aminoácido N-terminal e mais do que um resíduo de Lys, isto é, vários sítios reativos para PEG2-NHS, desse modo os IFNs-a PEGuilado isolados em um único resíduo de aminoácido são uma mistura de isômeros dos IFNs-a PEGuilados em diferentes resíduos deaminoácido únicos.
[00010] Na Patente Europeia EP 0593868, PEG de cadeia linear é usado para modificar IFN, a fórmula molecular do produto modificadocomo abaixo:
Figure img0003
OROXCHjCHOJ^CHjCHOHCHaÇHO^-CHaCH-Wt’ k MNH— interferon- αmem que R é um grupo alquila de peso molecular baixo ; Ri, R2, R3 θ R4 são H ou grupos alquila de peso molecular baixo ; m é de 1 ao número de possíveis modificações de PEG em IFN; W é O ou NH; x é de 1 a 1000, y e z são de 0 a 1000, x+y+z é de 3 a 1000; e pelo menos um dentre Ri, R2, R3 e R4 é um grupo alquila de peso molecular baixo. Yu-Sen Wang e outros (Yu-Sen Wang e outros, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002. Yu-Sen Wang e outros, Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000.) reportaram a modificação de rlFN-α2b com monometóxi-PEG linear de 12KD (Peg-intron) e mostraram que os produtos analisados por HPLC-IE são uma mistura de mais do que 14 isômeros modificados por PEG em diferentesresíduos de aminoácidos únicos. A fórmula molecular dos PEGslineares usados por Yu-Sen Wang e outros é mostrada abaixo:
Figure img0004
oH3C-(0CH2CH2)n-0-C-0-em que o peso molecular médio do PEG é 12KD.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[00011] Os derivados de PEG usados na presente invenção são novos derivados de PEG ramificados, de ramificação em forma de Y, e suas estruturas são diferentes daquelas dos PEGs de ramificação em forma de U . A maior diferença entre estes dois tipos de PEGs é que as cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de Y de acordo com a presente invenção são conectados juntos através de átomo de N, ao mesmo tempo em que as cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de U em EP0809996 são conectados juntos através de átomo de C. A composição molecular dos derivados de PEG em forma de Y de acordo com a presente invenção é mostrada como abaixo:
Figure img0005
Pa XR(CHRJj F Pb x2em que, Pa e Pb são PEGs iguais ou diferentes; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, um grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído, uma arila substituída , uma aralquila ou uma heteroalquila; Xi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO e (CH2)nCO; n é um número inteiro de 1 a 10; e F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagirom grupo amino, hidroxila ou mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente.
[00012] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como abaixo:
Figure img0006
ROCH2CH2(OCH2CH2 )m-O-CH2CH2■■--N-ÍCHRiJj-FR'OCH2CH2(OCH2CH2)m'-0 —CH,—/ ‘ II Oem que, R e R' são independentemente um grupo C1-C4 alquila , preferivelmente metila; m e ní significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500; Ri é H, um grupoC1-C12 alquila substituída ou não-substituída, um grupo arila substituída, um grupo aralquila, ou a heteroalquila ; j é um número inteiro de 1 a 12; e F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de ácido carboxílico, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um amino grupo, um grupo hidroxila ou um grupo mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente. Preferivelmente, o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 10000 a cerca de 60000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 40000 Dáltons.
[00013] Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma possível fórmula estrutural da molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como fórmula (I):
Figure img0007
oROCH2CH2(OCH2CH2)m-0-CH2CH2 ° H X-"■■■-N-(CH2)Í — C— N— O—N (DR'0CH2CH2(0CH2CH2)m'_O CH-—“ II /O oem que R e R' são independentemente um grupoC1-C4alquila, preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500; j é um número inteiro de 1 a 12; e o peso molecular total médio dos PEGs é cerca de 40000 Dáltons.
[00014] Os presentes inventores usaram derivados de PEG de ramificação em forma de Y (YPEG) para modificar interferon-a2b (IFN- a2b), e isolaram o YPEG-IFNs-a2b, modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido, por cromatografia de permuta de ion de Q- Sefarose FF. Além disso, os YPEG-IFNs-a2b isolados, modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido, foram também separados por cromatografia de SP-Sefarose FF para obter YPEG- IFN-a2b em que o YPEG é principal mente ligado ao ε-NHz de cadeia lateral de Lys na posição 134 em SEQ ID NO: 1, que é chamado de YPEG-IFN-a2b(134). Após a medição, descobriu-se que a atividade in vitro do YPEG-IFN-α2b(134) é significantemente maior do que aquela do YPEG-IFN-α2b no qual o YPEG é ligado a outro resíduo de aminoácido, e a meia vida do YPEG-IFN-α2b(134) no soro é significantemente mais longa do que aquela do IFN-a2b não- modificado.
[00015] Entretanto, a presente invenção fornece IFNs-a2b PEGuilados em um único resíduo de aminoácido, a estrutura do qual é como abaixo:
Figure img0008
Pa i| HN (CH Ri), C — N— IFN-a.2 bPb x2em que Pa e Pb são iguais ou diferentes PEGs; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, um grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído , um grupo arila , aralquila, ou heteroalquila substituído; Xi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO e (CH2)nCO, em que n é um número inteiro de 1 a 10.
[00016] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os IFNs-a2b PEGuilados da presente invenção são da fórmula estrutural (II) abaixo:
Figure img0009
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-o-CH2CH^ ° HN-(CH2)j — C — N —IFN-oc2b R'OCH2CH2(OCH2CH2W-0 CHn—cz ■ II o(II)em que Re R' são independentemente um grupo C1-C4 alquila , preferivelmente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro iguais ou diferentes. Nesta estrutura, a molécula de PEG de ramificação em forma de Y é ligada a uma molécula de IFN-a2b através de um único resíduo de aminoácido. O peso molecular médio do YPEG-IFN-a2b na fórmula (II) depende principal mente do grau de polimerização, m e m'. Onde m+m' for preferivelmente de 600 a 1500, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cerca de 26000 a cerca de 66000 Dáltons. Onde m+m' for preferivelmente de 795 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cerca de 35000 a cerca de 45000 Dáltons. Onde m+m' for preferivelmente de 885 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cerca de 39000 a cerca de 45000 Dáltons. Onde m+m' for mais preferivelmente 910, 0 peso molecular médio correspondente do YPEG será 40000 Dáltons. A relação de m e m' pode estar em uma faixa de 0,5 a 1,5, preferivelmente de 0,8 a 1,2.
[00017] Em uma modalidade preferida, no IFN-a2b PEGuilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através deuma ligação de amido formada por grupo α-amino do aminoácido N- terminal ou do grupo ε-amino de cadeia lateral de resíduo Lys de IFN- a2b correspondendo a posição 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 ou 164 como mostrado em SEQ ID NO: 1.
[00018] Em uma outra modalidade preferida, no IFN-a2b PEGuilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através de uma ligação de amido principalmente formada pelo grupo ε-amino de cadeia lateral de resíduo Lys de IFN-a2b correspondendo à posição 134 como mostrado em SEQ ID NO: 1.
[00019] Opcionalmente, o IFN-a2b da presente invenção pode ser extraído de fontes naturais ou obtido pela biotecnologia recombinante. Preferivelmente, o IFN-a2b é IFN-a2b humano (hlFN-a2b) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, que é extraída de fontes naturais ou obtida pela biotecnologia recombinante. Mais preferivelmente, o IFN-a2b humano é IFN-o2b humano recombinante (rhlFN-a2b). O rhlFN-a2b pode ser artificial mente sintetizado, ou ser expressado de sistemas de expressão procarióticos tais como E. coli, ou ser expressado de sistemas de expressão de levedura eucarióticos tais como Pichia, ou ser expresso de sistemas de expressão de célula de inseto ou sistemas de expressão de célula de mamífero tais como CHO. Os métodos de preparação do IFN-a2b natural ou recombinante e os testes de atividade de IFN-α2b e IFN-a2b modificado por YPEG são conhecidos na técnica anterior.
[00020] Similar a IFN-a2b, o YPEG-IFN-a2b da presente invenção pode também ser usado clinicamente para tratar tumores e infecções virais, tal como hepatite, leucemia de célula pilosa, linfólise mediada por célula, sarcoma de Kaposi e assim por diante. Clinicamente, o YPEG-IFN-a2b da presente invenção é claramente melhorado, quando comparado com IFN-a2b, em estabilidade, solubilidade, meia-vida em soro e eficácia terapêutica clínica. Quanto ao modo de administração, o YPEG-IFN-a2b da presente invenção pode ser administrado aos pacientes na forma de uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do YPEG-IFN- a2b e um veículo ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Portanto, a presente invenção, em outro aspecto, também fornece uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2b PEGuilado da presente invenção e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição compreende manitol, aminoácidos, cloreto de sódio e acetato de sódio, em que os aminoácidos são preferivelmente selecionados do grupo que consiste em ácido aspártico, asparagina e glicina.
[00021] Em outro aspecto, a presente invenção também fornece o uso do IFN-a2b PEGuilado da invenção ou a composição que compreende o IFN-a2b PEGuilado da invenção na preparação de um medicamento para tratar uma doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b. Preferivelmente, a doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b é selecionada do grupo que consiste em infecções virais, por exemplo, hepatite B, hepatite C, hepatite D e condiloma acuminado, tumores, por exemplo, leucemia de célula pilosa, leucemia mieloide crônica, leucemia de não-Hodgkin maligno de grau baixo, linfólise mediada por célula, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfoma de célula T cutâneo, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal recorrente ou metastático, distúrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística e pulmonar intersticial doença, e doenças mieloproliferativas relacionadas com trombocitemia.
[00022] Para obter o IFN-α2b modificado por YPEG, em uma modalidade da presente invenção, inicialmente a fração de PEG de derivado de YPEG ativados tal como succinimidil éster de N-hidroxila de PEG (YPEG-NHS) é covalentemente ligada a um grupo amino (- NH2) da proteína através de substituição nucleofílica, em que o grupo amino inclui grupo a-amino N-terminal da proteína e um grupo ε-amino de resíduo de Lys. A equação da reação para a geração de YPEG- IFN-α2b de IFN-a2b e YPEG é como abaixo:
Figure img0010
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-0-CH2CH:^R'OCH2 CH2(OCH2 C-H2 Im -O-CH,-/’ I!O+ H2N-IFNa2bROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH,CHn il H- ;N-(CH2)j-C-N-IFNdibR'OCH2CH2(OCH2CH2)rn'-0-CH.-C/' IIO
[00023] As condições de reação são moderadas, o pH está em uma faixa de 4,5 a 9,5, a temperatura está entre 0-25°C, e as medições de agitação ou outra mistura são necessárias. Para condições detalhadas favor referir-se aos Exemplos na DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO. Todos YPEGs com pesos moleculares diferentes podem ser ligados a IFN-a2b usando 0 método acima. Os produtos incluem a modificação por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG- IFN-α2b), a modificação por PEG em dois resíduos de aminoácidos (YPEG2-IFN-a2b) e a modificação por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b), em que os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido podem ser os produtos predominantes ajustando-se à condição da reação.
[00024] Subsequentemente, o YPEG-IFN-α2b, modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido, pode ser isolado da mistura de todos os tipos do IFNβ-α2b modificado por YPEG usando um método tal como cromatografia de permuta de cátion, cromatografia de permuta de ânion, ou cromatografia por exclusão, e em seguida o IFNs-a2b modificado por PEG em resíduo de aminoácidos únicos diferentes pode ser também resolvido para obter o YPEG-IFN-α2b no qual o YPEG está ligado em uma posição específica. Os métodos de purificação convencionais incluem cromatografia de permuta de cátion, cromatografia de permuta de ânion, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia por exclusão. A análise característica pode ser realizada por um método conhecido na técnica, por exemplo, a espectroscopia de massa, a eletroforese em gel de poliacrilamida e a cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão pode ser usada para analisar o peso molecular dos produtos, a fim de distinguir os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido daqueles modificados por PEG em dois ou múltiplos resíduos de aminoácido e IFN-a2b não-modificado. Os métodos de purificação mencionados acima podem também ser usados para também resolver os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido para obter isômeros diferentes com a modificação de PEG em posições únicas diferentes. As atividades biológicas in vitrode todos os tipos dos produtos modificados por PEG podem ser medidas de acordo com qualquer ensaio conhecido para a atividade de IFN, por exemplo, inibição do efeito citopático. Para IFNs modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido, as frações de PEG nos isômeros diferentes têm efeitos diferentes em manter os domínios ativos de IFNs, resultando nas diferenças maiores nas atividades biológicas de isômeros diferentes. De modo geral, as atividades in vitrode IFNs sãonotavelmente diminuídas após a modificação de PEG. Entretanto, de acordo com a presente invenção, a atividade específica in vitrodos isolados de três picos obtidos por cromatografia de permuta de íon foram medidos, e os resultados indicam que o isolado de pico 3 (SP2) tem atividade específica significantemente maior do que os isolados de outros picos e PEGASYS (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland), e tem meia-vida significantemente mais longa no soro do que IFN-a2b não-modificado.
[00025] Em uma outra modalidade, o peptídeo ligado a PEG em forma de Y isolado do SP2 é sequenciado usando a degradação de Edman, e os resultados mostraram que o componente primário de SP2 foi YPEG-IFN-a2b(134).
[00026] Portanto, em outro aspecto, a presente invenção também fornece os métodos de preparação e purificação para YPEG-IFN- a2b(134), que compreendem:(a) sob uma condição alcalina, preferivelmente em pH 9,0, permitindo PEG de ramificação em forma de Y como mostrado na fórmula (I) abaixo reagir com IFN-a2b, e obter IFN-a2b PEGuilado.;
Figure img0011
o,ROCH2CH2(OCH2CH2)m-o-CH2CH2 ff H’■-■-N—(CH2)j —C—N—O—N*R'0CH2CH2(0CH2CH2)m'-O CH„ (/~ II /o O(I)em que R e R' são independentemente um grupoC1-C4 alquila , preferivelmente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; e m+ní é preferivelmente de 600 a 1500;(b) capturar os produtos de reação na etapa (a) com uma resina de permuta de ânion, preferivelmente Q Sefarose FF, e eluindoos produtos em um gradiente de ânion, preferivelmente em um gradiente de íon de cloreto, para obter os produtos modificados;(c) eluir os produtos de reação capturados na etapa (b) com uma resina de permuta de cátion, preferivelmente SP Sefarose FF, em um gradiente de cátion, preferivelmente em um gradiente de íon de sódio, e coletar cada pico separadamente:(d) determinar a atividade do produto de cada pico, e selecionar o pico correspondendo ao produto de reação com atividade maior.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00027] Figura 1: SDS-PAGE de 2 bateladas de IFN-a2b modificado com YPEG (40KD). A concentração do gel de separação foi 12%, e azul Coomassie brilhante R-250 foi usado como tinta de manchamento. Pode ser visto a partir do resultado de SDS-PAGE da Figurai, sob a condição, a taxa de modificação de PEG de rHulFN- a2b foi entre 30-50%, e foi estável. Os produtos modificados primários foram IFN-a2b modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e houve também algum IFN-a2b modificado por PEG em múltiplos resíduos de aminoácido (YPEGn- IFN-a2b). A Faixa 1: IFN-a2b, reação de modificação de NHS-YPEG (40KD) em 0h; Faixa 2: Batelada 060604-1 de IFN-a2b, reação de modificação de NHS-YPEG (40KD) em 2h; Faixa 3: Batelada 060604- 2 de IFN-a2b, reação de modificação de NHS-YPEG (40KD) em 2h; Faixa 4: marcador (GE Lifescience).
[00028] Figura 2: O perfil de resolução de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b por SP-Sefarose FF.
[00029] Figura 3: SDS-PAGE manchado de prata (12%) das amostras de YPEG-IFN-a2b purificadas por SP-Sefarose FF. Faixa 1: marcador de peso molecular (GE Lifescience); Faixa 2: pico depurificação 1de SP-Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b; Faixa 3: pico de purificação 2 de SP-Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b, Faixa 4: pico de purificação 3 de SP-Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b; Faixa 5: pico de purificação 4 de SP-Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b.
[00030] Figura 4: Peso molecular evidente da amostra de YPEG- rHulFN-a2b purificada por SP-Sefarose FF determinado por 7,5% de redução de SDS-PAGE com manchamento prata. Faixa 1: marcador de peso molecular (GE Lifesciences); Faixa 2: YPEG-HulFN-α2b SP1, 2pg; Faixa 3: YPEG-rHulFN-α2b SP2, 2pg; Faixa 4: YPEG-rHulFN- α2b SP3, 2pg.
[00031] Figura 5: Os pesos moleculares das amostras de YPEG- IFN-a2b purificadas por SP-Sefarose FF determinados por MALDI- TOF MS.
[00032] Figura 6: O peso molecular de YPEG-NHS (40KD) determinado por MALDI-TOF MS.
[00033] Figura 7: A concentração de fármaco no soro e atividade após uma única injeção s.c. de 30 pg-kg-1 de YPEG-rhlFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri (Macaca fascicularís).
[00034] Figura 8: O controle nulo de Mapeamento de Peptídeo de Tripsinase do YPEG-rHulFN-α2b SP2 digerido por tripsina. Dois picos pequenos foram detectados respectiva mente em 71,674min e 17,589min; e o pico de tripsina foi detectado entre 2-3 min.
[00035] Figura 9: A análise de Mapeamento de Peptídeo de Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-α2b SP2 digerido por tripsina (0h) por HPLC-RP Cie. O tempo de retenção de YPEG-IFN-α2b SP2 foi 62,114 min; e o pico de eluição em 71,908min foi a base, 2-3min.
[00036] Figura 10: A análise de Mapeamento de Peptídeo de Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-α2b SP2 digerida por tripsina (48h) por HPLC-RP Cie. Nenhum pico de substrato (62,114min) foidetectado entre 60,5 min-63,2 min, demonstrando que a amostra foi completamente digerida.
[00037] Figura 11: Perfil de separação de Sephacryl S-100 HR dos peptídeos modificados por YPEG da amostra de YPEG-IFN-α2b SP2 completamente digerida por tripsina. As amostras foram coletadas de acordo com os picos, S100-1 foi o peptídeo modificado por YPEG, isto é, a amostra-alvo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00038] A presente invenção será melhor descrita pelos seguintes exemplos, porém qualquer exemplo ou a combinação destes não deveria ser entendido como limitante do escopo ou modalidade da invenção. O escopo da invenção é limitado somente pelas reivindicações anexas. Em combinação com a descrição e técnica anterior, as pessoas versadas na técnica claramente entenderiam o escopo limitado pelas reivindicações.
Exemplo 1 Preparação de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG de ramificação em forma de Y (1) Preparação em pequena escala de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG de ramificação em forma de Y
[00039] 166,1 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio de40KD, ramificação uniforme, número do lote RD010P041, Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foi pesado e dissolvido em 1 mL de 2mM de HCI (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.), e 40mg de IFN-α2b (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e tampão de ácido bórico-borax a 50mM (pH 9,0, Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados a um volume de reação final de 10 mL. Neste sistema de reação, a concentração final de IFN-a2b foi 4 mg/mL, e a relação molar da reação de IFN-a2b e YPEG foi 1:2. Osistema de reação foi mantido sob 0-20°C durante 2h com agitação. Os IFNs-a2b PEGuilados foram em seguida gerados, e a reação foi parada adicionando-se ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) para tornar o pH < 4,0. Uma amostra foi submetida a SDS- PAGE. O sistema de reação foi diluído 50 vezes com água e em seguida 0,2pm filtrado antes do armazenamento a 4°C para uso adicional.
[00040] A cromatografia de Q-Sefarose FF foi usada para separar o restante de hidrolatos de PEG e PEG, IFNs-α2b modificado por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácidos, IFNs-a2b modificado por YPEG em um único resíduo de aminoácido e o IFN-a2b não modificado. A coluna de Q-Sefarose FF (GE Healthcare) (<t>12mm x 90mm, 1CV = 10 mL) foi regenerada com 3CV de tampão de ácido bórico/borax a 20 mM de (pH 9,0)-1M de NaCI (BBI), e em seguida equilibrada com 5CV de tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0). O comprimento de onda de detecção UV foi ajustado a 280nm. A amostra total armazenada a 4°C foi carregada. Após o carregamento, a coluna foi equilibrada com 3CV de tampão de ácido bórico/borax (pH 9,0), e em seguida tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0)- NaCI a 12 mM foi usado para eluição até que o primeiro pico fosse completamente eluído, cujo pico foi o PEG restante. O tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9.0)- NaCI a 60 mM foi então usado para eluição, e a amostra coletada neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFNs-a2b, modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido. e em seguida o tampão de ácido bórico/borax a 20mM (pH9,0)- NaCI a 500mM foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2b não modificado.
[00041] Os produtos-alvo foram principal mente o YPEG-IFNs-a2b modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido, com umataxa de produção de 20-40%.
(2) Preparação em grande escala de IFN-α2b humano re∞mbinante modificado por PEG de ramificação em forma de Y
[00042] 4982,4 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio40KD, ramificação uniforme, número do lote RD010P041, Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foi pesado e dissolvido em 25 mL de HCI a 2mM. E 1200 mg de IFN-α2b e tampão de ácido bórico/borax a 50mM (pH 9,0) foram adicionados a urn volume de reação final de 200 mL. Neste sistema de reação, a concentração de reação final de IFN- α2b foi 6 mg/mL, e a relação molar da reação de IFN-α2b e YPEG foi 1:2. O sistema de reação foi mantido sob 0-25°C durante 2h com agitação. A reação foi parada adicionando-se ácido acético glacial para tornar o pH<4,0. Uma amostra foi submetida a SDS-PAGE. O sistema de reação foi diluído 50 vezes com água e em seguida 0,2pm filtrado antes de armazenado a 4°C para uso adicional.
[00043] A cromatografia de Q-Sefarose FF foi usada para separar os hidrolatos de PEG e PEG restantes, IFNs-α2b modificado por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácido, IFNs-α2b modificado por YPEG em um único resíduo de aminoácido e o IFN-α2b não modificado. Coluna de Q-Sefarose FF (GE Healthcare) (<P38mmx265mm, 1CV = 300 mL) foi regenerada com 3 CV de tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0)- NaCI a 1M, e em seguida equilibrada com 5CV de tampão de ácido bórico/borax a 20mM (pH 9,0). O comprimento de onda de detecção UV foi ajustado a 280 nm. A amostra total armazenada a 4°C foi carregada. Após o carregamento, a coluna foi equilibrada com 3CV de tampão de ácido bórico/borax (pH9,0), e em seguida tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0)- NaCI a 12 mM foi usado para eluição até que o primeiro pico fosse completamente eluído, cujo pico foi o PEG restante. Otampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0) - NaCI a 60 mM foi então usado para eluição, e a amostra coletada neste pico de eluição foi principal mente o YPEG-IFNs-a2b modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido. E em seguida o tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0) - NaCI a 500 mM foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2b não-modificado.
[00044] Os produtos-alvo foram principal mente o YPEG-IFNs-a2b modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido, com uma taxa de produção de 35-50%.
[00045] A figurai mostra os resultados de SDS-PAGE para 2 bateladas de IFNs-a2b modificado com YPEG (40KD). Pode ser visto a partir da figura 1 que sob a condição, a taxa de modificação de PEG de rhlFN-a2b foi entre 35-50% e mantida estável. Os produtos modificados primários foram modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e houve também alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b).
Exemplo 2 Resolução de YPEG-IFNs-a2b por SP-Sefarose FF
[00046] A amostra de YPEG-IFNs-a2b capturada por Q-Sefarose FF foi ajustada ao pH 5,0 com 20% de ácido acético, em seguida diluída 15 vezes com NaAc/HAc a 5 mM (pH 5,0, Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.). A amostra foi carregada a 0,5 mg/mL de capacidade de carregamento para coluna de 100 mL de SP-Sefarose FF (GE Healthcare) (d>18 mmx394 mm). A coluna foi equilibrada com 3CV de NaAc/HAc a 5 mM (pH 5,0), e em seguida eluída com 2,5 CV do gradiente de 0%-30% de NaAc/HAc a 5 mM - NaCI a 70 mM (pH 5,0), seguindo com 50 CV do gradiente de 30%-100% de NaAc/HAc a 5 mM -NaCI a 70 mM (pH 5,0). YPEG-IFN-a2b foi resolvido como 4picos de eluição por SP-Sefarose FF a 100 mL. As amostras foram coletadas de acordo com estes picos e em seguida medidas por SDS- PAGE com manchamento de prata respectivamente. De acordo com os resultados de SDS-PAGE, pode ser visto que o pico 1 resolvido por SP-Sefarose FF foi principal mente os produtos modificados por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b). O pico 2 por SP-Sefarose FF foi principal mente os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e também conteve alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácido. O pico 3 e pico 4 por SP-Sefarose FF foram ambos os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido. Os picos 2-4 resolvidos por SP-Sefarose FF foram isômeros com modificação de YPEG em posições únicas diferentes, e foram chamados respectivamente como YPEG-IFN-α2b SP1, YPEG-IFN-a2b SP2 e YPEG-IFN-α2b SP3. Os resultados de perfil de resolução e SAD-PAGE manchado de prata foram mostrados na figura 2 e figura3 respectivamente.
[00047] Toda a amostra de YPEG-IFN-α2b SP1-3 foi suplementada com cloreto de sódio, acetato de sódio, manitol, ácido aspártico e foi esterilizado com 0,22 pm de filtro antes de armazenado a 4°C para uso adicionado.
Exemplo 3 Análise da Característica de isômeros de modificação de YPEG-IFN- g2b (1) Concentração de Proteína
[00048] As concentrações de isômeros de modificação de YPEG- IFN-a2b foram determinadas pelo método de Kjeldahl.
(2) Peso molecular evidente de proteína
[00049] Os pesos moleculares evidentes de isômeros demodificação de YPEG-IFN-α2b foram determinados por SDS-PAGE. O método foi de acordo com Laemmli e outros (Nature 227: 680, 1970). A concentração do gel foi 7,5%, e o gel foi visualizado por manchamento de prata. Os pesos moleculares evidentes de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b foram quase iguais, cerca de 123KD (figura4).
(3)Peso molecular determinado por MALDI-TOF MS
[00050] MALDI-TOF MS (Autoflex TOF/TOF system, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado para determinar os pesos moleculares de isômeros de modificação de YPEG-rHulFN-a2b. Ácido sinapínico (SA, C11H12O5, M.W. 224.22, número do lote: 2006 236870 002, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado como matriz. O Padrão de Calibração de Proteína II (Part No.207234, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado como padrão de peso molecular de proteína, e o programa para análises de dados foi FlexAnalysis Ver.3.0.54.0. Os pesos moleculares MS de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b foram quase iguais, cerca de 59000 Dáltons (figuraõ).
(4) Teste de teor de endotoxina
[00051] Com base no ensaio de limulus (Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C), o teor de endotoxina de cada amostra de YPEG-IFN-α2b foi menor do que 5,0EU/mg.
(5) Atividade in vivo eFarmacocinéticos de YPEG-IFN-α2b SP2 no animal.
[00052] Atividade in vivo de YPEG-IFN-α2b SP2 em animal.
[00053] O mecanismo de ação de IFN é parcialmente para induzir a produção de 2',5'-AS (2',5-oligoadenilato sintetase), que sucessivamente exerce seus efeitos antivirals. Usando 125l como um traçador, os parâmetros farmacodinâmicos de IFN são refletidos pelaatividade 2',5-AS in vivo. 2',5-AS catalisa a síntese de 2',5'-A (2'5- oligoadenilato) de ATP na presença de Poli(l)-Poli(C) ágar (A atividade de 2',5-AS pode ser representada pela concentração do 2',5'-A sintetizado). Primeiro, 2',5-AS nas amostras são absorvidos e ativados por Poli(l)-Poli(C) agarose, em seguida catalisa o substrato ATP para gerar 2',5'-A. Uma mistura de 2',5'-A rotulado por 125l, soro anti-2',5'-A e anticorpo secundário é adicionado na amostra que em seguida é incubada e centrifugada para separar a mistura. O sobrenadante é descartado e um Contador Gama foi usado para medir a radioatividade do sedimento. A taxa de ligação do 2',5'-A rotulado por 125l inicialmente adicionado é calculada. A regressão logística de quatro parâmetros é usada para gerar a curva padrão, e em seguida a concentração dos produtos de 2',5'-A induzidos por 2',5'-AS em uma amostra desconhecida pôde ser estimada.
[00054] Ao usar o método de 2', 5'-A mencionado acima, os resultados na Tabela 1 e na figura 7 mostraram a concentração de 2', 5'-A de soro após uma única injeção s.c. de 30pg kg-1 de YPEG-IFN- α2b SP2 em Macaco que se alimenta de siri (Macaca fascicularis) (18 Macacos que se alimentam de siris, Guangxi Weimei Biotecnologia Co., Ltd., Certificação No. S.CXK GUI 2002-0001, peso corporal 2,5- 5,5 kg, 6 fêmeas e 12 machos, elevado em gaiolas separadas, alimentados com comida de macaco, água livremente). Pode ser visto a partir da figuraδ que o tempo para o pico médio foi 64±27,71h, e aconcentração para pico foi 292,30±148,08 PmoldL-1. Após a administração, a atividade de 2', 5'-AS no soro foi claramente aumentada, e o tempo para pico de 2', 5'-A no soro foi mais lento do que aquele de YPEG-rhlFNcc2b SP2.Tabela 1. As concentrações de 2',5'-A no soro com o passar do tempo,após uma única injeção s.c. de 30 pg*kg1de YPEG-rhlFN-α2b SP2 em Macaco que se alimenta de siri (Pmol-dL'1)
Figure img0012
[00055] 2 Farmacocinéticos de YPEG-IFNs-a2b e rhlFN-a2b emMacaco que se alimenta de siri
[00056] Uma única injeção s.c. de 10, 30 ou 100 pgkg’1 de YPEG- IFN-a2b foi dada ao Macaco que se alimenta de siri. Para o grupo de administração, 1 mL de sangue venoso foi tomado do membro traseiro oposto ao lado injetado na hora anterior, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h, 240 h, e 312 h após a administração. Para o grupo com uma única injeção de s.c. de IFN-a2b (30pg-kg_1), 1 mL de sangue foi tomado na hora anterior, 0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 8 h e 24 h após a administração. Após serem mantidas a 4°C durante 30 min, as amostras de sangue foram centrifugadas em 2000rpm durante 10 min sob baixa temperatura, em seguida o soro foi separado imediatamente e armazenado a -20°C para outra análise.
[00057] O imunoensaio intercalado duplo quantitativo foi usado. Um anticorpo monoclonal específico para IFN-a humano recombinante foi pré-revestido em placa de microtítulo. O padrão e as amostras foram pipetadas nas cavidades de microtítulo, em que o IFN-a2b ou YPEG- IFN-α2b SP2 se ligaria ao anticorpo imobilizado. A placa foi lavada para remover as substâncias soltas, e em seguida IgG de IFN-a anti- humano (anticorpo secundário) foi adicionado nas cavidades. Após a reação ter sido concluída, a placa foi lavada e a peroxidase de rábano- silvestre (HRP) foi adicionada nas cavidades. Após a lavagem longe da enzima solta e reagentes, a cor gerada adicionando-se solução de substrato de HRP em cada cavidade foi proporcional à quantidade do IFN-a2b ou YPEG-rhlFN-α2b SP2 ligado na primeira etapa. A reação foi parada e a intensidade de cor foi medida. Quanto maior o valor de OD de absorbância, maior a concentração de IFN-a2b ou YPEG-IFN- α2b SP2 na amostra. As curvas-padrão foram plotadas para IFN-a2b e YPEG-IFN-α2b SP2, respectivamente, para medir a concentração de fármaco no soro nas amostras de sangue.
[00058] De acordo com o protocolo na descrição do kit (American Biomedical Co., número do lote 3271), 100 pL de amostra de sangue ou padrão foram adicionados em cada cavidade, e misturados com misturador de placa gentil mente. De acordo com a concentração antecipada de uma amostra desconhecida, a amostra foi diluída com a solução diluída para as faixas de concentração da curva-padrão. A curva-padrão de IFN-a2b ou YPEG-IFN-α2b SP2 para cada placa foiplotada para calcular a concentração da amostra desconhecida naquela placa. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 1h, e lavada uma vez com solução de lavagem de placa. 100 pL de anticorpo secundário foram adicionados a cada cavidade, e mantidos em temperatura ambiente durante 1h. A placa foi lavada 3 vezes, e 100 pL de conjugado de HRP foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 1h e lavada 4 vezes. 100 pL de substrato de TMB foram adicionados em cada cavidade, e mantido em temperatura ambiente no escuro durante 15 min. 100 pL de solução de interrupção foram adicionados a cada cavidade, e misturados suavemente para parar a reação. O valor de OD de absorbância em 450nm foi medido com um leitor de microplaca em 5 minutos para determinar a concentração de cada amostra.
[00059] Após uma única injeção subcutânea de dose baixa, dose média, ou dose elevada (10, 30 e 100 pg kg1, respectivamente) de YPEG-IFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri, as meia-vidas foram 48,87±11,67, 51,94±3,52 e 49,60±2,97h, respectivamente. Após uma única injeção subcutânea de 30 pg-kg1 de IFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri, a meia-vida foi 3,22 ± 0,10h. A meia-vida deIFN-a2b foi prolongada pelo menos dez vezes após a modificação de YPEG.(6) A atividade biológica in vitrode cada isômero de modificação YPEG-IFN-a2b foi estimada usando ensaio de inibição de efeito citopático. De acordo com o método descrito em Determination Method of Interferon Activity (Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C), interferon protege as células amnióticas humanas (WISH) do dano causado pelo vírus de estomatite vesicular (VSV). A violeta cristal foi usada para manchar as células de WISH sobreviventes, e o valor de OD de absorbância foimedido em 570 nm. A curva de efeito de proteção de interferon foi plotada para as células WISH, para determinar a atividade biológica in vitrodos interferons. Os resultados da atividade biológica in vitro de cada amostra são mostrados na Tabela 2, e 3 testes paralelos foram realizados para cada amostra. Após a modificação de YPEG, em todos os isômeros de modificação dos produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido, a amostra de SP2 mostrou a atividade específica in vitromais elevada, que foi 1-2 vezes maior do que SP1, SP3 e PEGASYS (fabricado por Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland; embalado separadamente por Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd., número do lote do produto B1016, número do lote da embalagem SH0020), e foi também 1-2 vezes maior do que a amostra não resolvida.Tabela 2. Resultados da atividade biológica in vitropara cada isômerode modificação de YPEG-IFN-a2b (3 testes paralelos)
Figure img0013
Figure img0014
[00060] Observação: a amostra não-resolvida refere-se a amostra antes de resolver YPEG-rhlFN-a2b por SP-Sefarose FF(7) A resolução da posição de modificação em YPEG-IFN-α2b SP2
[00061] O sistema de solvente de YPEG-IFN-α2b SP2 foi mudado para 50mM de NH4HCO3 (pH8,0) por ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona), e a concentração de proteína foi determinada ser 3,82 nrig/mL usando espectroscopia UV. A tripsina de TPCK (Promega) foi dissolvida (0,5 pg/pL) na solução fornecida pelo fabricante. As amostras foram adicionadas de acordo com a Tabela 3:Tabela 3. Composição de reação de digestão de tripsina de YPEG- IFN-α2b SP2
Figure img0015
[00062] O sistema de reação foi mantido em um banho de água a 37°C durante 48h, em seguida 1,52 mL de 20% de ácido acético foi adicionado para parar a reação. Uma quantidade pequena da amostra foi tomada para mapeamento de peptídeo de HPLC-RP C18. O instrumento para análise foi o sistema de HPLC Waters, com um controlador do tipo 600, detector de comprimento de onda dupla 2487,e o software para processamento de dados foi Empower 2. A coluna analítica de HPLC foi Jupiter C18 (diâmetro de partícula 5pm, diâmetro de poro 300À, <J>4,6x 150mm, produzido por Phenomenex, USA). A Fase Móvel A foi 0,1% de TFA/H2O, Fase Móvel B foi 0,1% de TFA/90% de ACN/H2O, a taxa de fluxo foi 1 mL/min, e o comprimento de onda de detecção foi ajustado em 214nm. Favor referir-se a Tabela 4 para os gradientes de eluição, e os resultados foram mostrados nas figuras 8-10.Tabela 4. Os gradientes de eluição para mapeamento de peptídeo deHPLC-RP C18 do YPEG-IFN-a2b SP 2 digerido por tripsina
Figure img0016
[00063] Com base no resultado de detecção, pode ser determinado que a amostra foi quase completamente digerida. Os produtos foram tratados com redução de DTT após a reação ter sido parada. A coluna de Sephacryl S-100HR (4>18x255 mm, 1CV=64 mL; GE Healthcare) foi pré-equilibrada com 3CV de PBNa a 20 mM -NaCI a 400 mM (pH7,0), e 3% de CV da amostra de YPEG-IFN-α2b SP2 por TPCK digerida por tripsina completamente foi carregado por pressão hidrostática. PBNa a 20 mM -NaCI a 400 mM (pH7,0) foi usado para eluição, e 0 comprimento de onda de detecção foi ajustado em 280 nm. A amostra do primeiro pico de eluição foi coletada (número da amostra: YPEG-IFN-α2b S100-1, figurai 1), e o sistema de solvente foimudado para PBNa a 5mM (pH 7,0) com ultrafiltro 5K. Liofilização a vácuo foi feita. Os aminoácidos N-terminal da amostra liofilizada foram determinados usando degradação de Edman, e a sequência dos 7 aminoácidos no N-terminal da amostra foi XYSPXAW (Tabela 5), em que X significa cisteína de a-aminoácido (Cys), um não a-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não possa ser detectado usando a degradação de Edman. De acordo com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, pode ser determinado que YPEG-IFN-α2b SP2 foi principalmente os produtos modificados com YPEG em Lys134.Tabela 5. Resultado de sequenciamento para os aminoácidos N- terminal de YPEG-IFN-α2b S100-1
Figure img0017
Nota: X significa cisteína de a-aminoácido, um não a-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não possa ser detectado usando a degradação de Edman.

Claims (9)

1. Interferon-α2b PEGuilado (IFN-α2b) da estrutura como abaixo, caracterizado pelo fato de que é obtido por ligação de IFN-a2b com um polietileno glicol de ramificação em forma de Y (YPEG):
Figure img0018
Pa X! || HN—(CHRi)i c — N —TFN-n2bPb X2em que,pae Pb são polietileno glicol igual ou diferente (PEG);j é um número inteiro entre 1-12;Rié H, grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído, arila, aralquila, ou heteroalquila substituída; eXi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CFhJn, (CH2)nOCO, (CH2)n NHCO e (CH2)n CO, em que n é um número inteiro entre 1-10, em que o YPEG está ligado ao IFN-a2b por meio de uma ligação amido formada pelo grupo ε-amino da cadeia lateral de um resíduo Lys dentro do IFN-a2b correspondente à posição 134 na SEQ ID NO: 1.
2. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura como abaixo
Figure img0019
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH2CH2._ ° H^'N-(CH2)j —C—N —IFN-ot2b R'OCH2CH2(OCH2CH2:Jm'-Q CH. /IIOem que R e R' são independentemente um grupo C1-C4 alquila, preferivelmente metila;j é um número inteiro entre 1-12;m e m' significam o grau de polimerização e pode ser qualquer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500, eo peso molecular total médio do YPEG é preferivelmente de 10000 a 60000 Dáltons, mais preferivelmente 40000 Dáltons.
3. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o IFN-o2b é extraído de uma fonte natural ou obtido através de biotecnologia recombinante, preferivelmente é IFN-a2b humano tendo a sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 1, mais preferivelmente é um IFN-a2b humano recombinante.
4. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o YPEG é um YPEG de ramificação uniforme do peso molecular de 40000 Dáltons.
5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2b PEGuilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que ainda compreende manitol, um aminoácido, cloreto de sódio e acetato de sódio, em que o aminoácido é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico, asparagina e glicina.
7. Uso do IFN-a2b PEGuilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou a composição como definida na reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de uma doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b, em que a doença é preferivelmente selecionada do grupo que consiste em infecções virais, por exemplo, hepatite B, hepatite C, hepatite D, e condiloma acuminado, tumores, por exemplo, leucemia de célula pilosa, leucemia mieloide crônica, leucemia de não-Hodgkin maligno de grau baixo,linfólise mediada por célula, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfoma de célula T cutâneo, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal recorrente ou metastático, distúrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística e doença pulmonar intersticial, e doenças mieloproliferativas relacionadas com trombocitemia.
8. Método para preparar e purificar o IFN-a2b PEGuilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:(a) sob uma condição alcalina, preferivelmente em pH 9,0, permitindo PEG de ramificação em forma de Y da seguinte fórmula reagir com IFN-a2b, e obter IFN-a2b PEGuilado;
Figure img0020
oROCH2CH2(OCH2CH2)m-o-CH2CH2._ ° HN—(CH2)j —C — N—O—NR'OCH2 CH2(OCH2 CH2 )m'-0 CH.—CZII ffO oem que R e R' são independentemente um grupo C1-C4 alquila, preferivelmente metila;j é um número inteiro entre 1-12;m e m' significam o grau de polimerização e pode ser qualquer número inteiro, e m+m' é preferivelmente de 600 a 1500;(b) capturar os produtos de reação obtidos na etapa (a) com uma resina de permuta de ânion, preferivelmente Q Sefarose FF, e eluir os produtos em um gradiente de ânion, preferivelmente em um gradiente de íon de cloreto, para obter produtos modificados;(c) eluir os produtos de reação capturados na etapa (b) com uma resina de permuta de cátion, preferivelmente SP Sefarose FF, em um gradiente de cátion, preferivelmente em um gradiente de íon de sódio, e em seguida coletar cada pico separadamente:(d) determinar a atividade do produto de cada pico, e selecionar o pico correspondendo ao produto de reação com atividade mais elevada.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o YPEG tem um peso molecular de 40 KD, e preferivelmente é um Y-PEG de ramificação uniforme, e mais preferivelmente a relação molar da reação de IFN-a2b e YPEG é 1:2.
BRPI0721984A 2007-09-04 2007-09-04 interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos BRPI0721984B8 (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2007/002644 WO2009030066A1 (fr) 2007-09-04 2007-09-04 Interféron alpha 2b modifié par du polyethylèneglycol et procédé de préparation et applications associés

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0721984A2 BRPI0721984A2 (pt) 2014-03-18
BRPI0721984B1 true BRPI0721984B1 (pt) 2020-11-17
BRPI0721984B8 BRPI0721984B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=40428422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0721984A BRPI0721984B8 (pt) 2007-09-04 2007-09-04 interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8597635B2 (pt)
EP (1) EP2186830B1 (pt)
JP (1) JP5325884B2 (pt)
KR (1) KR101502645B1 (pt)
CN (1) CN101636414B (pt)
AT (1) ATE548382T1 (pt)
AU (1) AU2007358605B8 (pt)
BR (1) BRPI0721984B8 (pt)
CA (1) CA2698173C (pt)
DK (1) DK2186830T3 (pt)
ES (1) ES2382124T3 (pt)
MX (1) MX2010002557A (pt)
PL (1) PL2186830T3 (pt)
PT (1) PT2186830E (pt)
RU (1) RU2485134C2 (pt)
WO (1) WO2009030066A1 (pt)
ZA (1) ZA201001556B (pt)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
CA2698396C (en) * 2007-09-04 2014-01-21 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferon alpha2a modified by polyethylene glycol, the preparation and use thereof
EP2186830B1 (en) 2007-09-04 2012-03-07 Biosteed Gene Expression Tech. CO., LTD. Polyethylene glycol modified interferon alpha 2b and preparation method and applicatioins thereof
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
KR101943821B1 (ko) 2011-06-21 2019-01-31 한국전자통신연구원 무선 통신 시스템에서 제어채널 송수신 방법
RU2622077C2 (ru) * 2011-09-05 2017-06-09 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая конъюгат интерферона-альфа
EA023323B1 (ru) * 2013-03-28 2016-05-31 Илья Александрович МАРКОВ Разветвленный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
EA022617B1 (ru) * 2013-03-28 2016-02-29 Илья Александрович МАРКОВ Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA021610B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Жидкое противовирусное лекарственное средство
EA037151B1 (ru) * 2014-11-06 2021-02-11 Фармаэссентия Корпорейшн Способ лечения с использованием пегилированного интерферона
EP3272857B1 (en) * 2015-03-17 2020-08-12 Shigetaka Shimodaira Method for preparing dendritic cell by non-adhesive culture using ifn
CN106146325B (zh) * 2015-04-24 2019-01-29 北京键凯科技股份有限公司 一种y型多缩乙二醇衍生物及其制备方法
US20220339248A1 (en) * 2019-06-19 2022-10-27 The Research Foundation For The State University Of New York Methods for treating neointimal hyperlasia using f11r/jam-a inhibitors
US20230218644A1 (en) 2020-04-16 2023-07-13 Som Innovation Biotech, S.A. Compounds for use in the treatment of viral infections by respiratory syndrome-related coronavirus
US20230131808A1 (en) * 2020-04-22 2023-04-27 Southlake Pharmaceuticals, Inc. Pegylated interferon tau and compositions and methods thereof

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US103411A (en) 1870-05-24 Improved liniment
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
CN1243779A (zh) 1998-07-31 2000-02-09 东莞中镇鞋材有限公司 纤维板及其制造方法
US6610822B2 (en) * 2000-09-01 2003-08-26 Merck & Co., Inc. Purification process
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
DE60315145T2 (de) * 2002-03-13 2008-04-30 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophiles polymerderivat mit y-verzweigung und herstellungsverfahren dafür; obige verbindung enthaltender medizinischer verbundwerkstoff
WO2004021993A2 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 The General Hospital Corporation Modified asialo-interferons and uses thereof
AU2002356422A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-25 Cadila Healthcare Limited Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris
RU2005118752A (ru) * 2002-11-15 2006-02-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг (Ch) Позиционные изомеры пэгилированного интерферона l-2а (конъюгата пэг-ifn-l-2а)
WO2004076474A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Intermune, Inc. Polyethylene glycol modified interferon compositions and methods of use thereof
KR20080019619A (ko) * 2005-05-18 2008-03-04 맥시겐, 인크. 개량된 인터페론-알파 폴리펩티드
KR20080026135A (ko) * 2005-06-03 2008-03-24 암브룩스, 인코포레이티드 개선된 인간 인터페론 분자 및 이의 용도
CA2698396C (en) 2007-09-04 2014-01-21 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferon alpha2a modified by polyethylene glycol, the preparation and use thereof
EP2186830B1 (en) 2007-09-04 2012-03-07 Biosteed Gene Expression Tech. CO., LTD. Polyethylene glycol modified interferon alpha 2b and preparation method and applicatioins thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2186830A1 (en) 2010-05-19
ATE548382T1 (de) 2012-03-15
US8597635B2 (en) 2013-12-03
CN101636414B (zh) 2012-02-15
AU2007358605B2 (en) 2011-09-08
MX2010002557A (es) 2011-12-16
CN101636414A (zh) 2010-01-27
AU2007358605A1 (en) 2009-03-12
JP2010538022A (ja) 2010-12-09
RU2010106430A (ru) 2011-10-10
US20110158943A1 (en) 2011-06-30
KR20100082774A (ko) 2010-07-19
WO2009030066A1 (fr) 2009-03-12
BRPI0721984A2 (pt) 2014-03-18
PT2186830E (pt) 2012-06-20
BRPI0721984B8 (pt) 2021-05-25
JP5325884B2 (ja) 2013-10-23
CA2698173C (en) 2015-02-03
EP2186830B1 (en) 2012-03-07
ZA201001556B (en) 2010-12-29
CA2698173A1 (en) 2009-03-12
AU2007358605B8 (en) 2012-02-02
EP2186830A4 (en) 2010-10-20
KR101502645B1 (ko) 2015-03-13
RU2485134C2 (ru) 2013-06-20
ES2382124T3 (es) 2012-06-05
PL2186830T3 (pl) 2012-09-28
DK2186830T3 (da) 2012-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0721984B1 (pt) interferon-2b peguilado (ifn-2b), seu método de preparo e de purificação, composição, bem como uso dos mesmos
WO2008074230A1 (en) Interferon alpha mutant and its polyethylene glycol derivative
AU2007363326B2 (en) Y-type polyethylene glycol modified G-CSF and preparation method and use thereof
ES2386575T3 (es) Interferón alfa 2a modificado por polietilenglicol, su proceso de síntesis y su aplicación
CN105802948A (zh) 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用
ES2453946T3 (es) Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta
RU2575796C9 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение
RU2575796C2 (ru) Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение
BR112014014868B1 (pt) Composições de hormônio estimulante da tiroide, métodos de produção do mesmo e uso de tais composições
Mohammadi et al. Development of Simple and Fast Method for Preparation and Purification of Monopegylated Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor (rhG-CSF, Filgrastim) with High Efficiency
EA022617B1 (ru) Монопегилированный интерферон-альфа разветвленной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA021643B1 (ru) Монопегилированный интерферон-альфа линейной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа

Legal Events

Date Code Title Description
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 4A ANUIDADE.

B08G Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: C07K 14/56 (2006.01), A61K 47/60 (2017.01), A61K 3

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 17/11/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 04/09/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF