EA021643B1 - Монопегилированный интерферон-альфа линейной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к областям фармацевтики и медицины, в частности к монопегилированному интерферону IFN α-2b линейной структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи. Технический результат изобретения заключается в получении ковалентного конъюгата IFN α-2b с длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона альфа.

Description

Изобретение относится к областям фармацевтики и медицины, в частности к соединению с активностью интерферона-альфа, представляющему собой монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь линейной структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где а - целое число от 200 до 1800;

Ь - целое число от 1 до 5 и

ΙΡΝ обозначает остаток ΙΡΝ а-2Ь.

Изобретение также представляет фармацевтическую композицию для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, активным веществом которой является указанный монопегилированный ΙΡΝ а-2Ь.

Предшествующий уровень техники

Интерфероны (ΙΡΝ) - биологически активные белки или гликопротеины, продуцируемые в организме в ответ на вирусную инфекцию (Рс8!ка 8. Ткс 1п1сгГсгоп5: 50 усаг8 айег 1Пс1г Д|8соусгу, 1ксгс 18 тисЬ тоге ΐο 1сагп, 1. Βίοί. СЬет., Уо1. 282, Νο. 28 (1и1у 2007), р. 20047-20051. ΙΡΝ взаимодействуют с рецепторами, что индуцирует синтез ряда внутриклеточных белков, которые опосредуют противовирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие ΙΡΝ (Рс8!ка 8., Кгаи8с С.Э., ТОаЙсг М.К. [ЩегГсгопх, 1п1сгГсгоп-Пкс су1ок|пс8, апД 1Пс1г гссср1ог8, Iттиηο1. Ксу., Уо1. 202 (2004), р. 8-32).

Лекарственные средства, содержащие рекомбинантные ΙΡΝ, применяются в лечении вирусных, онкологических и иммунных заболеваний. Наиболее широко препараты ΙΡΝ применяют для лечения вирусных гепатитов, представляющих одну из наиболее значимых социальных и медицинских проблем (Сксуакс/ 8., Ра\\1о18ку !М. кИегГсгот апД 1Пс1г и8с ίη рсг8181сп1 упа1 тГесОот, НапДЬ. Ехр. РЬагтасо1., 2009, р. 203-241).

Эффективность препаратов ΙΡΝ ограничена их быстрым выведением, малой стабильностью, большим объемом распределения, коротким периодом циркуляции, а также высокой иммуногенностью и реактогенностью (ТОД18 К.1. СНшса1 рЬагтасокшсДс8 оГ ш1егГсгоп8, С1ш. РЬагтасокшсГ, 1990, №. 19, р. 390399).

Эффективность ΙΡΝ увеличивается при использовании препаратов пролонгированного действия, например ковалентных конъюгатов с полимером (НаД/1уапш8 8. с! а1. Апп. кЦсгп. МеД., Уо1. 140 (2004), р. 346).

Полиэтиленоксид или полиэтиленгликоль (ПЭГ) является широко распространенным полимером для ковалентной модификации (пегилирования) биологических макромолекул, например полипептидов, имеющей большое значение в современной фармакологии и медицине. Цель пегилирования - предотвращение деградации белков протеолитическими ферментами и защита от антигенных и иммуногенных эпитопов. Кроме того, пегилирование увеличивает размеры полипептидов, уменьшая почечную фильтрацию, а также изменяет объем биораспределения.

Наибольшее значение в пегилировании полипептидов имеет выбор пегилирующего агента и способа конъюгации, от которых зависит вид и структура конечного конъюгата, и, следовательно, его биологическая активность, стабильность и время циркуляции в крови.

Так, например, противовирусная активность пегилированных ΙΡΝ в значительной степени зависит как от размера и геометрии ПЭГ, так и от места прикрепления полимера к молекуле белка, т.е. от функциональной группы ΙΡΝ, с которой непосредственно взаимодействует соответствующий пегилирующий агент (КоЬсй8 М.1. с! а1. СЬст181гу Гог рерИДс апД рго1сш РЕОуШюп АДу. Эгид Эскусгу Ксу., Уо1. 54, (2002), р. 459-476).

Известны конъюгаты ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь, полученные конъюгацией ΙΡΝ а-2Ь с линейными (КИ 2311930, опубл. 20.08.2008) или разветвленными (КИ 2382048, опубл. 20.02.2010) производными ПЭГ с молекулярной массой 13-17 кДа, обладающие противовирусной активностью от 29 до 38% от активности немодифицированного ΙΡΝ. Недостатки полученных коньюгатов и способов их синтеза обусловлены применением трезил-производных ПЭГ, имеющих время полужизни в водных растворах не более 20 мин. В результате реакции трезил-производных ПЭГ с аминогруппами белков образуются не только стабильные амиды, но также и нестабильные сульфаматы (Са18 Н.Ц Киррей 8. МоДШсаДоп апД кптоЫк/акоп оГ рго1сш8 νίΐΐι ро1у8асскаг|Дс 1гс8у1а1с8: с\1Депсс 8иддс81шд а гсу18юп оГ !Ьс соирйпд тсскаШт апД !Ьс 81гис1игс оГ !Ьс ро1утсг-ро1утсг Цикаде, Тс1гаЬсДгоп Ьсй., Уо1. 36. №. 22 (1995), р. 3837-3838).

Известен коньюгат ΙΡΝ а-2Ь, полученный конъюгацией ΙΡΝ а-2Ь с разветвленным триазиновым производным мПЭГ с молекулярной массой 7,5-35 кДа (КИ 2298560, опубл. 10.05.2007), противовирусная активность которого составляет 7% от активности немодифицированного ΙΡΝ. Недостатком данного конъюгата является низкая противовирусная активность и использование цианурхлоридного производ- 1 021643 ного ПЭГ, способного, помимо целевых аминогрупп, реагировать с другими функциональными группами аминокислот с образованием нестабильных или фармацевтически неактивных соединений. Цианурхлоридные производные также проявляют высокую токсичность (Уегоиеке Р., Раки! С. РЕОу1айои, киссе8к1и1 арргоасб !о бгид бебуету, Эгид Э|5соуегу Тобау, Уо1. 10, Νο. 21 (2005), р. 1451-1458), что требует тщательной очистки продукта перед приготовлением медицинского препарата.

Наиболее часто для пегилирования применяют активированные эфиры ПЭГ-производных, которые взаимодействуют с аминогруппами белков. Активированные эфиры представляют собой удобные в обращении ацилирующие агенты с высокой реакционной способностью. Однако им присущ ряд недостатков, к которым, в первую очередь, относятся невысокая стабильность при хранении и способность вызывать рацемизацию субстрата, что в конечном итоге может сказаться на биологической активности полученного конъюгата. Их типичные представители - активированные эфиры, как правило, не являются высокоспецифичными реагентами и, помимо аминогрупп, способны взаимодействовать с имидазольным фрагментом гистидина, фенольным гидроксилом тирозина, спиртовыми гидроксилами серина и треонина, а также тиольной группой цистеина, что, в свою очередь, снижает долю высокоактивных конъюгатов в общей смеси позиционных изомеров.

В настоящее время наиболее изученными и широко применяемыми в клинике препаратами данной группы являются пегилированные интерфероны-альфа (ΙΡΝ-α). Препарат ПегИнтрон (товарный знак, зарегистрированный фирмой §сбегтд-Р1оидб) представляет собой монопегилированный ΙΡΝ α-26, ковалентно связанный с линейной молекулой ПЭГ, имеющей молекулярную массу 12 кДа. Препарат Пегасис (товарный знак, зарегистрированный фирмой НоГГтапп Ьа Косбе) является монопегилированным ΙΡΝ а-2а, в котором белок ковалентно связан с разветвленной молекулой ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа. Оба препарата получены с помощью гидроксисукцинимидных эфиров ПЭГ соответствующих структур.

Так, например, Пегасис (КИ 2180595, опубл. 20.03.2002) получают взаимодействием Νгидроксисукцинимидного эфира дипегилированного лизина с ΙΡΝ а-2а. Недостатком данного процесса является частичная рацемизация субстрата. По-видимому, это приводит к существенному снижению противовирусной активности конъюгата, которая составляет только 1-7% от активности немодифицированного ΙΡΝ а-2а (Войекби А. е! а1. Т^ейу-Гоит боит кшебск оГ бераббк С У1гик апб апбу1га1 еГГес! оГ а1рбачйетГетои, I. Меб. Уио1., Уо1. 78, №. 3 (Магсб, 2006), р. 365-371).

В качестве ближайшего аналога настоящего изобретения авторы рассматривают монопегилированный ΙΡΝ α-26, ковалентно связанный с линейной молекулой ПЭГ массой 12 кДа - препарат ПегИнтрон, получение и свойства которого раскрыты в И8 5951974 (опубл. 14.09.1999). Данный конъюгат получен взаимодействием линейного ПЭГ, активированного сукцинимидилкарбонатной группой, с ΙΡΝ α-26. Противовирусная активность препарата ПегИнтрон составляет 28% активности немодифицированного белка, время циркуляции - порядка 72 ч.

Недостатками данного конъюгата являются относительно малые показатели противовирусной активности и времени циркуляции в крови, что, вероятно, обусловлено частичной рацемизацией субстрата и существенной долей легкогидролизуемых сложноэфирных и карбаматных связей с функциональными группами аминокислотных фрагментов. Причиной тому служит применение сукцинимидилкарбонатного пегилирующего агента.

Таким образом, технической задачей изобретения является разработка пегилированного интерферона-альфа, создание содержащей его фармацевтической композиции с улучшенными фармакологическими свойствами и расширение арсенала противовирусных средств на основе интерферона-альфа.

Техническим результатом изобретения является получение ковалентного конъюгата ΙΡΝ α-26 с ПЭГ, характеризующегося длительной циркуляцией в кровотоке и улучшенными характеристиками противовирусной активности и иммуногенности, а также получение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа.

Для достижения указанного технического результата монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ α-26) линейной структуры согласно изобретению содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенный к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι)

где а - целое число от 200 до 1800;

- целое число от 1 до 5 и

ΙΡΝ обозначает остаток интерферона α-26 (ΙΡΝ α-26).

Фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомога- 2 021643 тельные вещества согласно изобретению в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь линейной структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где а - целое число от 200 до 1800;

Ь - целое число от 1 до 5 и

ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Сущность изобретения

В результате обширных исследований авторы установили, что техническая задача изобретения может быть решена применением для образования пептидной связи между полимером и белком азидного метода, который, как известно, не приводит к рацемизации субстрата и не затрагивает гидроксильных групп полипептида (Гринштейн Дж., Виниц М. Химия аминокислот и пептидов. - М.: Мир, 1965, с. 446464).

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ а-2Ь) линейной структуры, который содержит фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ), присоединенный к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (I)

где а - целое число от 200 до 1800;

Ь - целое число от 1 до 5 и

ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Изобретение также обеспечивает получение фармацевтической композиции для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, содержащей активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которая в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь линейной структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ) присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой (Ι)

где а - целое число от 200 до 1800;

Ь - целое число от 1 до 5 и

ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).

Выбор фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ для целей настоящего изобретения очевиден среднему специалисту в области фармакологии. Например, вспомогательными веществами могут быть натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия ацетат, уксусная кислота, лимонная кислота, цитрат натрия, глутамат натрия, сахароза, бензиловый спирт, полисорбаты и др.

Для получения монопегилированного ΙΡΝ а-2Ь линейной структуры (конъюгата) в соответствии с изобретением используют ΙΡΝ а-2Ь и гидразид пегилированного фенилаланина с молекулярными массами 20 и 30 кДа. Пегилированный ΙΡΝ а-2Ь получают конденсацией азида ПЭГ-фенилаланина, приготовленного из гидразида ПЭГ-фенилаланина непосредственно перед пегилированием, со свободной аминогруппой белка

- 3 021643

Состав полученного конъюгата определяют общеизвестными методами обращено-фазовой ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ. Например, для этого можно применять колонку УУЭАС® Μδ С18 150x4,6 мм (22°С, расход элюента: 1 мл/мин в линейном градиенте от 0,1% ТФУ/Н₂О до 0,085% ТФУ/МсСй в течение 20 мин) или колонку Бирегоке 6, 10/300 СЬ (22°С, расход элюента (50 ммоль натрия фосфат, 300 ммоль №С1. 10% этанол, рН 6,8): 0,4 мл/мин соответственно).

Значения индексов а и Ь в формуле (I) определяют методами исследования, известными из уровня техники. В частности, ориентировочные значения индекса а можно вычислить с помощью метода МАЬΌΙ по молекулярной массе конъюгата, а значения индекса Ь рассчитать по результатам хромато-массспектрометрического определения после полного гидролиза образца концентрированной бромистоводородной или иодисто-водородной кислотой с идентификацией соответствующих бром-, йод- или гидроксикислот.

Фармакологические и медицинские преимущества конъюгата в соответствии с изобретением следуют из результатов определений, выполненных в соответствии с действующими нормативными актами с использованием сертифицированных приборов и/или диагностических наборов, рекомендованных уполномоченными органами к применению в этих целях.

В исследованиях ίη νίνο на беспородных лабораторных белых мышах было показано, что конъюгаты ПЭГ-ΙΡΝ-α в соответствии с изобретением являются нетоксичными при введении максимально переносимой дозы 10 млн МЕ/мышь.

Время циркуляции немодифицированных и монопегилированных ΙΡΝ а-2Ь определяют на мышиной модели по содержанию ΙΡΝ-α в сыворотке крови методом иммуно-ферментного анализа, например, с помощью набора Нитап ΙΡΝ-α ЕЫБА Κίΐ (номер в каталоге: СК2003-1). Время циркуляции конъюгатов ПЭГ₂₀-IΡN а-2Ь и ПЭГзо-ΙΡΝ а-2Ь в 1,5-2 раза превосходит аналогичный показатель для известного препарата ПегИнтрон.

Медицинские преимущества конъюгата в соответствии с изобретением следуют из его показателей антипролиферативной и противовирусной активностей.

В соответствии с ОФС Бактериальные эндотоксины (42-000-2-00) с помощью ЬАЕ-теста, выполняемого, например, с применением диагностического набора фирмы Ьо^а, США. ЛАЛ-реактив ΡΥРОСЕЙТ с чувствительностью 0,03 ЕС/мл (номер в каталоге: 0000184452), контрольный стандарт эндотоксина (номер в каталоге: 0000167426; активность КСЭ 10 ЕЭ/нг; ЛАЛ-вода (номер в каталоге: 01022012), уровень бактериальных эндотоксинов в образцах составляет менее 0,015 ЕЭ/мкг, что значительно ниже допустимого значения (0,25 ЕЭ/мкг), разрешенного Европейской Фармакопеей для рекомбинантных белков.

Антипролиферативную активность конъюгатов ПЭГ₂₀-ШН а-2Ь и ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь определяют на человеческих клетках с помощью колориметрического теста с бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразола по отношению к международному стандартному препарату сравнения ΙΡΝ а-2Ь (код 95/566) в сериях разведений и выражают в виде доз, вызывающих 50% снижение пролиферации. Антипролиферативные активности конъюгатов ПЭГ ₂₀-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГ ₃₀-ΙΡΝ а-2Ь составляют соответственно 53 и 44% от активности стандарта, тогда как препарат ПегИнтрон (по данным Сгасе М. е1 а1. Б1гис1ига1 апД Ью1ощса1 сЬа^асΐе^^ζаΐ^οη оГ редуШеД гесотЬшай ШЛ-а1рЬа2Ь, 1. БИегГегоп СуЮкше Рек., Уо1. 21, Νο. 12 (ЭесетЬег 2001), р. 1103-1115) обладает антипролиферативной активностью на уровне 29%.

Специфическую противовирусную активность конъюгатов ПЭЦо-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГз-ΙΡΝ а-2Ь определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном по подавлению цитопатического действия тест-вируса везикулярного стоматита в дозе 100 ЦПД5₀ в диплоидной культуре клеток ΜΌΒΚ, чувствительных к интерферону-альфа. Противовирусная активность конъюгатов в соответствии с изобретением на 20-45% выше аналогичного показателя известного препарата ПегИнтрон.

Из приведенного выше следует, что конъюгаты ΙΡΝ а-2Ь в соответствии с изобретением дольше циркулируют в кровотоке и имеют большую биологическую активность по сравнению с препаратом сравнения, что является их преимуществами по отношению к решениям, известным из уровня техники, и характеризует изобретательский уровень настоящего изобретения.

Далее изобретение проиллюстрировано примерами его осуществления, подтверждающими достижение технического результата.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Получение монопегилированного ΙΡΝ а-2Ь.

К охлажденному до 0-5°С раствору 5 мкмоль гидразида ПЭГ-фенилаланина в 0,1 М СН₃СООН приливают раствор 10 мкмоль NаNО₂ и перемешивают в течение 15 мин. Избыток №ΝΟ₂ удаляют добавлением азида натрия. Полученный раствор азида ПЭГ-фенилаланина приливают к охлажденному до 0-5°С раствору 1 мкмоль ΙΡΝ а-2Ь в фосфатном буфере с рН 7,5. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают в течение 5 ч. Через различные промежутки времени для контроля протекания реакции из реакционной смеси отбирают аликвоты, которые анализируют обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Бирегоке 6, 10/300 СЬ, 22°С, расход элюента (50 ммоль натрия фосфат, 300 ммоль №С1, 10% этанол, рН 6,8): 0,4 мл/мин). По достижении необходимой степени превращения ΙΡΝ а-2Ь (75-85%) реакцию останавливают

- 4 021643 прибавлением избытка глицина.

Реакционную смесь разбавляют в 10 раз добавлением СН₃СООН, устанавливают рН 5,0 и наносят на СМ-сефарозу, предварительно уравновешенную 20 мМ ацетатным буфером с рН 5,0. После нанесения реакционной смеси сорбент промывают уравновешивающим буфером и далее градиентом от 0,1 до 0,8 М ЫаС1. Отобранные фракции анализируют обращено-фазовой ВЭЖХ на содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь. Целевые фракции объединяют и повторно анализируют, определяя чистоту и содержание моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь. Выход (в пересчете на ΙΡΝ а-2Ь) очищенного ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь составляет 54%, выход ПЭЦо-ΙΡΝ α2Ь равен 42%. Чистота ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь составляет 95,5%, чистота ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь составляет 97,3%.

Время удерживания дано в табл. 1.

Таблица 1

Образец	Время удерживания, мин
Обращенно-фазовая ВЭЖХ	Эксклюзионная ВЭЖХ
ΙΓΝ а-2Ь	13,92 ±0,07	31,6 ±0,9
Π3Γ2(,-ΙΓΝ а-2Ь	13,51 ±0,08	23,7 ±0,8
Ди-ПЭГгДГЦ а-2Ь	13,33 ±0,08	19,3 ±0,6
ПЭГзо-ΙΡΝ а-2Ь	13,39 ±0,06	21,3 ±0,7
Ди-ПЭГзо-ΙΡΝ а-2Ь	13,22 ±0,07	17,9 ±0,6

Перед проведением последующих исследований проводят стерилизующую фильтрацию водного раствора полученного продукта.

Пример 2. Исследование токсичности ПЭЩЦЖ а-2Ь и ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь.

Самцам белых нелинейных мышей массой 20±1 г вводят конъюгаты в дозах от 1 до 10 млн МЕ в объеме 0,1 мл. У животных ежедневно в течение недели регистрируют клинические симптомы, взвешивают, отбирают пробы крови для проведения общего и биохимического анализа. В последний день животных подвергают эвтаназии и некропсии с забором органов для последующего гистологического анализа. Гибели подопытных животных на протяжении всего исследования выявлено не было, показатели крови были в норме. При патологоморфологическом исследовании лабораторных животных не было обнаружено каких-либо значимых патологических изменений.

Таким образом, коньюгаты не обладают токсичностью и реактогенностью и соответствуют требованиям 4 класса опасности вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества).

Пример 3. Исследование времени циркуляции немодифицированных и монопегилированных ΙΡΝ α2Ь.

Нелинейных белых мышей (самцы) разделяют на группы по количеству исследуемых препаратов. Исследуемые конъюгаты в дозе 1 млн МЕ в 0,1 мл вводят внутрибрюшинно. Параллельно другим группам мышей вводят немодифицированный ΙΡΝ а-2Ь и препарат ПегИнтрон. Через каждые 6 ч у животных отбирают пробы крови и стандартным методом готовят из нее сыворотку. Содержание ΙΡΝ α в образцах сыворотки (нг/мл) определяют с помощью иммуно-ферментного аналитического набора (ИФАнабора) Нитап ΙΡΝ-α ЕЫ§Л Кй (номер в каталоге СК2003-1). Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Образец	Время циркуляции, сутки	Активность, млн. МЕ/мг	% остаточной активности немодифицированного ΙΡΝ а-2Ь, МЕ/мг
ΙΡΝ а-2Ь	0,5	200	100
«ПегИнтрон»	3	56*	28*
ПЭГм-ΙΡΝ а-2Ъ	5	82	41
ПЭГзо-ΙΡΝ а-2Ь	7	68	34

* - литературные данные.

Пример 4. Исследование уровня бактериальных эндотоксинов.

Содержание бактериальных эндотоксинов в конъюгате моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь определяли ίη νίΐτο с помощью ЛАЛ-теста по стандартной методике (ГФ ΧΙΙ, ч. 1, с. 128). В работе использовали набор фирмы йоп/а. США. ЛАЛ-реактив ΡΥΚΟΟΕΝΤ с чувствительностью 0,03 ЕС/мл (номер в каталоге: 0000184452) и контрольный стандарт эндотоксина (номер в каталоге: 0000167426). Активность КСЭ 10 ЕЭ/нг. ЛАЛ-вода (номер в каталоге: 01022012).

На основании проведенных исследований было показано, что содержание эндотоксинов в конъюгатах моно-ПЭГ-ΙΡΝ а-2Ь составило менее 2,5 ед. эндотоксина на 1 мг белка, что гораздо ниже уровня эн- 5 021643 дотоксинов, разрешенных Европейской Фармакопеей для рекомбинантных белков.

Пример 5. Исследование антипролиферативной активности коньюгатов Π3Γ₂ο-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГ₃₀ΙΡΝ а-2Ь.

Антипролиферативную активность определяют на человеческих клетках линии Иаий колориметрическим тестом с бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразола. Препаратом сравнения служит международный стандарт ΙΡΝ а-2Ь (код 95/566). Клетки (2х10⁴) в 100 мкл среды ΚΡΜΙ 1540, содержащей 10%-ную сыворотку эмбриона теленка и 2 мМ глутамина, вносят в лунки планшетов для микротитрования. В лунки добавляют серии разведений объемом 100 мкл, содержащие различные концентрации конъюгатов ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГэд-ΙΡΝ а-2Ь или стандарта ΙΡΝ а-2Ь. Планшеты инкубируют при 37°С в среде 5% СО₂ в течение 72 ч, после чего добавляют раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатносолевом буфере до концентрации 0,5 мг/мл и инкубируют в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляют, к клеткам добавляют по 100 мкл ДМСО и измеряют поглощение при 570 и 620 нм. Относительные активности ΙΡΝ а-2Ь и исследуемых конъюгатов определяют, сравнивая дозы, вызывающие 50% снижение пролиферации для стандартного и испытуемых препаратов.

Антипролиферативная активность ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь составляет 53%, а для конъюгата ПЭГ₃₀-ШИ а2Ь она равна 44% от активности стандарта. Препарат ПегИнтрон обладает более низкой антипролиферативной активностью (29% по данным Стасе Μ. с1 а1. 81гис1ига1 апй Ью1ощса1 скагасЮп/абоп оГ реду1а1ей тесотЬшай ШИ-а1рйа2Ь, 1. ШегГетоп Су1окше Кек., Уо1. 21, Νο. 12 (ОесетЬег 2001), р. 1103-1115).

Пример 6. Определение специфической противовирусной активности конъюгатов ПЭГ₂₀-ШИ а-2Ь и ПЭГэд-ΙΡΝ а-2Ь.

Противовирусную активность определяют микрометодом в 96-луночных планшетах с плоским дном по подавлению цитопатического действия тест-вируса везикулярного стоматита в диплоидной культуре клеток ΜΌΒΚ, чувствительных к интерферону-альфа. Для этого используют тест-вирус в дозе 100 ЦПД₅₀ и питательную среду Игла ΜΕΜ с добавлением 10% сыворотки КРС. В качестве стандарта применяют международный стандарт ΙΡΝ а-2Ь. Результаты приведены в табл. 2.

Пример 7. Исследование иммуногенности конъюгатов ΙΡΝ а-2Ь.

Конъюгаты ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь, полученные в соответствии с примером 1, в дозе 1 млн ΜΕ в объеме 0,1 мл внутримышечно вводят мышам СВА с массой тела 18-22 г 1 раз в неделю в течение 8 недель. Аналогично вводят немодифицированный ΙΡΝ. По прошествии 8 недель у животных отбирают пробы крови и готовят сыворотку стандартным методом. Титр антител определяют прямым твердофазным ИФА-методом. В лунки микропланшета вносят по 100 мкл раствора немодифицированного ΙΡΝ а-2Ь в концентрации 0,2 мкг/100 мкл. Антисыворотки от разных групп животных вносят в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Иммунный комплекс обнаруживают антимышиными иммуноглобулинами, конъюгированными с пероксидазой. Иммуногенность конъюгатов ПЭГго-ΙΡΝ а-2Ь и ПЭГ₃₀-ШИ а-2Ь в 4 раза ниже, чем у ^модифицированного ΙΡΝ.

Пример 8. Приготовление фармацевтической композиции, содержащей конъюгаты ПЭГ^-ΙΡΝ а-2Ь или ПЭГ₃₀-ШИ а-2Ь.

Все операции проводят в стерильных условиях. В мерный стакан вместимостью 100 мл, снабженный комбинированным потенциометрическим электродом ЭКОМ рН ком, соединенным с рН-метром Экотест-2000 при перемешивании магнитной мешалкой последовательно вносят стерильные растворы 520 мг моногидрата лимонной кислоты в 10 мл воды, 380 мг ΝπΗ₂ΡΟ₄·2Η₂Ο в 10 мл, 2,00 г сорбита в 10 мл воды, 500 мг Ь-глутамата натрия в 10 мл воды и 10 мг полисорбата 20 в 10 мл воды.

К полученной смеси при перемешивании по каплям прибавляют 5% №ЮН до установления величины рН 6,3-6,5 и приливают 30 мл раствора соответствующего ПЭГ-ИНФ а-2Ь с концентрацией 1 мг/мл. Значение рН полученного раствора корректируют прибавлением 5% №ЮН и общий объем смеси доводят до 100 мл водой для инъекций. Раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с размером пор 0,22 мкм и в асептических условиях разливают в стерильные флаконы по 100 мл с содержанием конъюгата ПЭГ₂₀-ШИ а-2Ь или ПЭГ₃₀-ШИ а-2Ь 0,3 мг/мл. На флаконы наносят маркировку для целей идентификации и дальнейшего применения.

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Монопегилированный интерферон-альфа (ΙΡΝ а-2Ь) линейной структуры, отличающийся тем, что содержит фрагмент полиэтиленгликоля, присоединенный к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой где а - целое число от 200 до 1800;

   Ь - целое число от 1 до 5 и

   ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).
2. 2. Фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа, содержащая активное вещество и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит монопегилированный интерферон ΙΡΝ а-2Ь линейной структуры, в котором фрагмент полиэтиленгликоля присоединен к белку через фенилаланиновый линкер с помощью амидной связи, как представлено общей формулой где а - целое число от 200 до 1800;

   Ь - целое число от 1 до 5 и

   ΙΡΝ обозначает остаток интерферона а-2Ь (ΙΡΝ а-2Ь).