BRPI0722341A2

BRPI0722341A2 - G-csf modificado por polietileno glicol em forma de y, a preparação e uso do mesmo

Info

Publication number: BRPI0722341A2
Application number: BRPI0722341-2A
Authority: BR
Inventors: Shiyuan Wang; Jianhua Zheng; Li Sun; Huili Cai; Meihua Yang; Yan He; Ping Chen; Hongyuan Deng; Liping Zhong; Shuying Huang
Original assignee: Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd
Priority date: 2007-12-29
Filing date: 2007-12-29
Publication date: 2014-03-18
Also published as: CA2710841A1; CN101627056A; AU2007363326B2; AU2007363326A1; US20110280826A1; EP2236521A4; EP2236521A1; CN101627056B; US8530417B2; WO2009086656A1; JP2011507913A; CA2710841C

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "G-CSF MO- DIFICADO POR POLIETILENO GLICOL EM FORMA DE Y, A PREPARA- ÇÃO E USO DO MESMO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a fator de estimulação de colônia

de granulócito (G-CSF) modificado com polietileno glicol em forma de Y (YPEG-G-CSF) e preparação da mesma, bem como a composição farma- cêutica compreendendo a mesma e uso do mesmo.

Antecedentes da Invenção Fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF) é um

dos fatores de estimulação de colônia que contribuem para a formação das colônias de células de medula óssea. Pode especificamente estimular e regular a proliferação, diferenciação, sobrevivência e ativação de granulóci- tos, e é promissor no tratamento de granulopenia de várias causas.

Gene de G-CSF de ser humano está localizado na região de

q21-22 no cromossoma 17 com um comprimento total de 2,5 kb. O gene é consistido em 5 éxons e 4 íntrons, e a proteína madura correspondente compreende 174 aminoácidos. G-CSF expresso por E. coli tem um Met não seu N-terminal, e é consistido em 175 aminoácidos, como mostrado na figu- 20 ra 1 (SEQ ID NO: 1). A molécula compreende 5 resíduos de cisteína, em que Cys37-Cys43 e Cys75-Cys85 formam dois pares de ligações de dissulfeto, e compreende 4 resíduos de lisina, localizados nas posições 17, 24, 35 e 41 separadamente.

Neutropenia causada por quimioterapia, especialmente neutro- 25 penia febril (FN) é o efeito colateral mais comum e usualmente o efeito cola- teral mais sério depois de quimioterapia de pacientes de câncer, especial- mente no primeiro ciclo de quimioterapia. FN levarão a hospitalização força- da e uso de antibióticos, causando peso econômico extra e alta fatalidade. Um outro resultado de dano é que devido à redução de neutrófilos, o es- 30 quema para o tratamento de pacientes com câncer tem de ser mudado, por exemplo, redução da dosagemm para quimioterapia e adiamento do próximo ciclo terapêutico, que estão diretamente relacionados com o resultado tera- pêutico final. Uma vez que a aprovação de rHuG-CSF por FDA em 1991, milhões de pacientes com câncer submetidos a quimioterapia se beneficia- ram a partir do mesmo. O medicamento foi listado como um dos 10 mais vendidos medicamentos biotecnológicos do mundo, e acredita-se que seja muito promissor.

No entanto, G-CSF de ser humano recombinante diminuiu semi- vida in vivo (t1/2 de cerca de 1,3-4,2 h) e atividade, e tende a ser hidrolisado por enzimas e depurado do rim, portanto, necessita ser injetado muitas ve- zes, que é muito inconveniente para o paciente e pode causar algumas res- postas indesejadas que afetará a eficácia.

Recentemente, o desenvolvimento de técnica de modificação de polietileno glicol (PEG) proveu uma alternativa para a solução do problema mencionado acima.

PEG é um polímero neutro dissolúvel e não tóxico. É biocompa- 15 tível e hemocompatível, e foi aprovado pela FDA para uso tópico e enteral e injeção intravenosa. Modificação por PEG de uma proteína é alcançada por ativação de um ou ambos os grupos terminais em ambas as extremidades de PEG para criar um grupo funcional, que é reativo com pelo menos um grupo na proteína a ser ligada, de modo a ligar PEG com o terminal N ou C 20 da proteína ou um aminoácido específico, em que o sítio para a modificação de PEG é universal.

PEG é o polímero de etileno glicol e óxido de etileno, também chamado carbowax, com a estrutura mostrada na seguinte fórmula:

CH2 ( OH ) - ( CH2 CH2O ) n- CH2OH

A aparência de mudanças de PEG convencionais quando seu 25 peso molecular aumenta: aparece de líquido viscoso incolor (190-630 Dál- ton), pasta branca (950-1050 Dálton) a sólido ceroso ou escamoso branco (> 1200 Dálton). Usualmente, PEG para a modificação de proteínas ou ou- tros fármacos tem um grande peso molecular (Tabela 1), tal como o PEG de fio duplo modelo por U com um peso molecular de 40 KD empregado em 30 Pegasys (injeção de interferon alfa2a pegilado, PEGASYS®, Roche, Shan- ghai), ou o PEG linear com um peso molecular de 12 KD empregado em Peg-Intron (injeção de interferon alfa2b pegilado, PEG-INTRON®, Schering- Plough, US), ou o PEG linear com um peso molecular de 20 KD empregado em Neulasta® (fator de estimulação de colônia de granulócito pegilado, Am- gen US). O processo metabólico in vivo do PEG conjugado é totalmente de- purado, indicando que PEG é um modificador de fármaco bom, seguro com nenhum efeito colateral.

Tabela 1. Os parâmetros para as propriedades fisicoquímicas dos fármacos de proteína peqilados atualmente comercializados Í181

Protudo (nome Média MW ti/2 antes ti/2 após a Fabrica¬ comercial) MW de da peguila- peguilação ção PEG ção L-asparginase 14 kDa 5 kDa 20 h 2 semanas Enzon peguilada (On- caspar) IFNa2b pequi- 31 kDa 12 4-12 h 40 h (22 - Schering Iada (PEGIn- kDa 60 h) tron) IFNa2a pegui¬ 60 kDa 40 5,1 h (3,7- 80 h (50 ~ Roche lada (Pegasys) kDa 8,5 h) 140 h) G-CSF peguila¬ 39 kDa 20 3,5 h 15-80 h Amgen da (Neulasta) kDa Fármacos proteináceos depois da glicolisação de polietileno (Pegilação) têm propriedades significativamente aperfeiçoadas, incluindo semivida farmacocinética prolongada (Tabela 1), imunogenicidade reduzida, segurança aperfeiçoada, eficácia aumentada, frequência diminuída de ad- ministração, solubilidade aumentada, resistência a protease aumentada, que facilitam a liberação controlada dos fármacos. Por exemplo, como descrito na patente de U.S. no. 4.179.337, depois da conjugação de PEG com enzi- mas e insulina, a imunogenicidade das proteínas é reduzida, enquanto uma certa percentagem da atividade original das proteínas ainda permanece. Um outro único efeito de pegilação é que a atividade in vitro da proteína é dimi- nuída, mas a atividade in vivo é aumentada. Por exemplo, como descrito na patente de U.S. no. 4.179.337, depois da conjugação de PEG com uma en- zima ou insulina, a imunogenicidade da proteína é reduzida, e a atividade da proteína é significativamente diminuída, mas a proteína ainda retém uma certa percentagem da atividade original.

tipos de acordo com a estrutura: o tipo linear e o tipo ramificado. Por exem- 5 pio, Pegasys® (injeção de interferon a2a pegilado, PEGASYS®, Roche US) emprega derivado de PEG de fio duplo ramificado em forma de U, com um peso molecular médio que varia de 26KD-66KD (a patente de U.S. no. 5382657 - depositada em 26 de agosto de 1992 - Hoffmann-La Roche Inc.), que é representado pela seguinte fórmula:

em que, ReR' são independentemente de grupos alquila de baixo peso mo- lecular, nen1 são de 600 a 1500.

usada em Neulasta® (fator de estimulação de colônia de granulócito pegila- do, Amgen) aprovado pela U.S. FDAem 2002 (a patente de U.S. n° 5824784 - depositada em 12 de outubro de 1994 -Amgen Inc.). A reação para a mo- dificação é como se segue:

Amgen1S Neulasta® emprega PEG com grupo aldeído na extre- midade. A modificação é no aminoácido N-terminal da proteína e PEG-G- CSF modificado em um ponto simples é obtido. É caracterizado pelo fato de que PEG é conjugado com G-CSF via ligação de C-N.

PEGs usados para modificar fármacos são divididos em dois

O

Molécula de PEG linear tendo um peso molecular de 20 kD é

O

Il

H—O-PfiCi NrCNMlt

Ψ

S"H.·

IKK VH—OI:—PKi PEGs com diferentes configurações são usados para modificar proteínas, resultando em produtos com características aparentemente dife- rentes. Literatura da técnica anterior (Monfardini C, Schiavon O, Caliceti P, e outros, Bioconjugate Chem, 1995, 6 (1) :62-69) relata que comparação a 5 PEG linear, PEG ramificado aperfeiçoa resistência de pH a proteínas, estabi- lidade térmica e resistência a digestão de protease.

A patente chinêsa ZL 03801105.0 relatou um novo derivado de PEG em forma de Y de fio duplo, que tem a seguinte estrutura básica:

Pa-X1

-(CHR1)-F

Pb-X2

em que, Pa e Pb são os polímeros hidrofílicos iguais ou diferentes, que pode ser polietileno glicol, polipropileno glicol, álcool polivinílico, poliacrimorfolina e seus copolímeros, de preferência é polietileno glicol e seus copolímeros; j é um número inteiro de 1 a 12;

Ri é H, um grupo C1-C12 alquila substituído ou não substituído, uma arila substituída, uma aralquila ou uma heteroalquila;

X1 e X2 são independentementeum grupo de ligação,

em que X1 é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, e (CH2)nCO; n é um número inteiro de 1 a 10; e

F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de acila, hi- drazida, maleimida, piridina dissulfeto, capaz de reagir com grupo amino, hidroxila ou mercapto de um agente terapêutico ou uma proteína para for- mar uma ligação covalente.

Quando Pa e Pb são de preferência PEG ou seu copolímero, a sua estrutura molecular básica é

ROCH2CH2(OCH2CH2 )m-0-CH,CH,

'""'N-(CHRl)j-F

ROCH2 CH2(C)CH2 CH2 )m'-0-CH-.-C

" Il O

O PEG em forma de Y modifica a proteína no grupo amino livre da proteína, em que um sítio de modificação não é fixo.

Na técnica anterior, ativação de N-hidroxissuccinimida pode ser usada para sintetizar NHS-PEG ramificado em forma de Y que é usado para a modificação. NHS-PEG é caracterizado pelo fato de que pode formar Iiga- 5 ção de amida com o grupo amino livre na Iisina ou o grupo amino terminal livre de rhG-CSF, e a ligação de amida pode ser hidrolisada lentamente in vivo, de modo que a atividade de rhG-CSF seja restaurada. No entanto, o NHS-PEG ramificado em forma de Y atualmente usado em geral têm o de- feito de alta atividade e pobre seletividade, e não podem ser usados para 10 alcançar seleção direcional de sítios de modificação, portanto é difícil se ob- ter produtos com modificação em um único sítio fixo.

Sumário da Invenção

A invenção é baseada no novo fator de estimulação de colônia de granulócito pegilado em forma de Y (YPEG-G-CSF) com única modifica- 15 ção no sítio. Particularmente, a invenção refere-se a G-CSF modificado por YPEG e seu método de preparação, a composição farmacêutica compreen- dendo YPEG-G-CSF e seu uso. Particularmente, YPEG-G-CSF da presente invenção é modificada na 17a Iisina (K17) como uma única modificação no sítio. O uso de YPEG-G-CSF modificado no sítio único de K17 alcança bons 20 efeitos terapêuticos em animais. Além disso, YPEG-G-CSF modificado no sítio único de K17 tem semivida farmacocinética significativamente prolon- gada no soro.

Em um aspecto, essa invenção refere-se a derivados de PEG em forma de Y (também registrado como YPEG) modificaram G-CSF (tam- bém registado como YPEG-G-CSF ou PEG-G-CSF), em que sua composi- ção molecular é como se segue

Pa-X1

-(CHR1)j- F-G-CSF

Pb-X2 (I)

em que,

Pa e Pb são PEGs iguais ou diferentes;

j é um número inteiro de 1 a 12;

X1 e X2 são independentementeum grupo de ligação, em que X1 é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CHn)n, (CHn)nOCO, (CHn)nNHCO, e (CHn)nCO; n é um número inteiro de 1 a 10; e F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em

um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de acila, hi- drazida, maleimida, piridina dissulfeto, capaz de reagir com amino, hidroxila ou mercapto grupo de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente.

Em uma concretização, a fórmula estrutural do PEG em forma

de Y-G-CSF tem a seguinte estrutura:

ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CHjCH2^ fj H

"""N-(CH2)J —C —N— G-CSF

ROCH2 CH2(OCH2 CH2 W-O- CH,-C7

‘ Il

0 (II)

Em que ReR' são independentemente uma alquila de baixo peso molecular, de preferência metila;

j é um número inteiro de 1-12;

m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer

número inteiro; de preferência m=m' e m+m' é de 600 a 1500. Na fórmula (II), o PEG ramificado em forma de Y se liga a G-CSF através de uma liga- ção de amida em único sítio.

Em uma concretização preferida, no dito PEG-G-CSF em forma de Y, G-CSF liga Y-PEG através da ligação de amida formada pelo grupo ε- amino na cadeia lateral de Iisina em G-CSF que corresponde a posição 17 de SEQ ID NO: 1 e o grupo carboxila terminal de Y-PEG.

Alternativamente, o G-CSF da presente invenção pode ser ex- traído de fontes naturais ou obtidos através de biotecnologia recombinante. 25 De preferência, G-CSF extraído de fontes naturais ou obtido através de bio- tecnologia recombinante é G-CSF de ser humano (hG-CSF) mostrado na SEQ ID NO: 1. Mais de preferência, o dito G-CSF de ser humano é G-CSF de ser humano recombinante (rhG-CSF). rhG-CSF pode ser sintetizado, ex- presso por sistemas procarióticos tal como E. coli, expresso por sistemas eucarióticos tal como Pichia pastoris, ou expresso por outros sistemas de célula de inseto ou sistemas de célula de mamífero tais com células de CHO. O método para a preparação de G-CSF natural ou recombinante e o método para detectar as atividades de G-CSF e seus produtros modificado por YPEG são convencionais por aquele versado na técnica.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um mé- todo para a preparação de G-CSF modificado por YPEG. Em uma concreti- zação, derivados ativados de YPEG tal como polietileno glicol succinimida (YPEG-NHS) mostrados na fórmula Ill podem ser usados para covalenta- mente ligar PEG com o grupo ε-amino na Iisina que corresponde a posição

17 no G-CSF através de reação de substituição nucleofílica:

O.

ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH2CH2 ° H

'"''-'N-(CH2)j-C-N-O-N ROCH2CH2(OCH2CH2)rrV-O-CH2-C7

° ° (III)

Em que,YPEG-NHS pode ser preparado como descrito na EP

1496076.

A reação de G-CSF com YPEG para formar YPEG-G-CSF é mostrada abaixo:

ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH2CH2^ íí H

ROCH2 CH2(OCH2 CH2 ) -o - CH,-^

~ Il o

N-(CH2)J-C-N-O-N +H2N-G-CSF

4

ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CHXH, íí H

~ ^N-(CH2)j-C-N-G-CSF ROCH2 CH2 (OCH2 CH2 )m'-0 —CHi-C^

A reação é realizada sob condições de reação moderada, pH 6,0-10, de preferência 8,0, temperatura 0-20°C, é misturada por agitação etc. O sítio de modificação de pegilação é determinado por realização de análise de peso molecular no YPEG-G-CSF combinado com mapeamento 20 da impressão digital molecular e padrão de digestão de tripsina e sequenci- ação N-terminal da proteína. O inventor verificou-que o sítio de pegilação no G-CSF era na Iisina da posição 17, e o produto da modificação foi registrado como YPEG-G-CSF (17).

A separação e purificação de YPEG-G-CSF (17) podem ser rea- lizadas por métodos tal como troca de íons. Em uma concretização, o 5 YPEG-G-CSF preparado é passado através de uma coluna de troca de íons catiônicos, o quarto pico ativo é coletado, e o produto é ulteriormente purifi- cado por uma coluna de Sephacryl S-400HR para se obter o YPEG-G-CSF purificado (17).

A invenção também provê o uso do YPEG-G-CSF da presente invenção ou a composição compreendendo o YPEG-G-CSF da presente invenção no tratamento de doença que necessita de tratamento com G-CSF. O uso clínico do G-CSF pegilado ou a composição compreendendo o G- CSF pegilado da presente invenção é o mesmo que aquele de G-CSF, e eles podem ser aplicados no tratamento de doenças relacionadas com gra- nulocitopenia tal como granulocitopenia induzida por infecção severa, trata- mento para leucemia, transplante de célula-tronco, e quimioterapia de tumor sólido maligno (Ying Tong e outros, "The clinicai application of G-CSF e GM- CSF", Basic & Clinicai Medicine 2000 Vol.20 No.2 P 101-104). Resultados in vivo mostram que comparados com G-CSF, o uso de YPEG-G-CSF da pre- sente invenção alcança efeitos inesperados — eficácia igual ou melhor é alcançada ainda que a dosagemm total for reduzida, vide os exemplos de trabalho. Além disso, a semivida farmacocinética de YPEG-G-CSF da pre- sente invenção no soro e outras propriedades são significativamente aper- feiçoadas. O YPEG-G-CSF da invenção pode ser administrado a pacientes na forma de composição, em que a composição contém uma quantidade farmaceuticamente eficaz de YPEG-G-CSF e um veículo ou excipiente far- maceuticamente aceitável. De preferência, a composição acima contém ma- nitol, aminoácidos, acetato de sódio e ácido acético, em que o aminoácido é selecionado de ácido aspártico, asparagina e glicina. A composição pode ser preparada em formas de dosagemm apropriadas, e administrada por médi- cos experientes de qualquer modo adequado aceitável. A invenção também provê um método de tratamento neutropenia, que incluem a administração da composição compreendendo YPEG-G-CSF da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura. 1: mostra a seqüência de aminoácidos de G-CSF (SEQ ID NO:1), MW18801.79, Pl 5.62, em que os aminoácidos sublinhados repre- sentam cinco sítios teóricos para a modificação por YPEG na seqüência de aminoácidos, incluindo grupo amino N-terminal e o grupo amino livre na Lys.

Figura. 2 mostra os picos obtidos a partir da separação de YPEG-G-CSF por uma coluna de troca de íons catiônicas, em que o quarto pico (4#) é o pico alvo de YPEG-G-CSF (17).

Figura 3 mostra o pico obtido a partir de purificação de YPEG-G-

CSF por uso de coluna de Sephacryl S-400HR.

Figura 4 mostra o resultado obtido por uso de MALDI-TOF para determinar o peso molecular de YPEG-G-CSF.

Figura 5 mostra o resultado obtido por uso de Maldi-Tof para realizar mapeamento de impressão digital da massa de peptídeo nos frag- mentos de peptídeo de G-CSF.

Figura 6 mostra o resultado obtido por uso de Maldi-Tof para realizar mapeamento de impressão digital da massa de peptídeo nos frag- mentos de peptídeo de PEG-G-CSF.

Figura 7 mostra separação de G-SF digerido por tripsina pela

coluna de RP-HPLC C18.

Figura 8 mostra separação de PEG-G-CSF digerido por tripsina pela coluna de RP-HPLC C18.

Figura 9 mostra a sequenciação de seqüência de aminoácidos N-terminal de YPEG-G-CSF.

Figura 10 mostra o resultado do ensaio para a atividade biológi- ca especifica de YPEG-G-CSF.

Figura 11 mostra o efeito de YPEG-rHuG-CSF no valor logaritmo do número de neutrófilos em macacaso irradiados com 60Co.

Figura 12 mostra a comparação de curvas farmacocinéticas de

PEG-GCSF e G-CSF.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção será ulteriormente ilustrada pelos seguintes exemplos. As vantagens da presente invenção comparada com a técnica anterior são:

1. YPEG-G-CSF da presente invenção é obtido por uso de

YPEG para modificar G-CSF e purificação da mistura de reação para se ob- ter produtos com única modificação no sítio em K17, de modo a resolver o seguinte problema técnico para facilitar o controle de qualidade e assegurar estabilidade de batelada por batelada na produção em massa: uma vez que NHS-PEG tem alta atividade, pobre seletividade, e não pode ser usado para

seleção direcional do sítio de modificação, é difícil se obter produtos com um único sítio modificado.

2. A semivida circulante in vivo de YPEG-G-CSF da presente invenção é significativamente prolongada comparada com G-CSF.

3. YPEG-G-CSF da presente invenção significativamente aper-

feiçoa em suas características farmacodinâmicas em comparação com G-

CSF não pegilado. Particularmente, quando do uso de uma mesma quanti- dade ou ainda quantidade menor de YPEG-G-CSF comparada com G-CSF convencional, o primeiro pode alcançar o mesmo ou ainda efeitos terapêuti- cos mais evidentes.

Aquele na técnica entederia que quaisquer exemplos ou sua

combinação não seriam entendidos como Iimitantes do escopo presente in- venção. O escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações a- nexas, e uma pessoa de habilidade comum pode claramente entender o es- copo definido nas reivindicações combinadas com o ensinamento da descri-

ção e percepção comum Exemplos

Exemplo 1 - Preparação de YPEG-G-CSF

O sistema de tampão de estoque contendo 400 mg de G-CSF a uma concentração de 9,58 mg/ml foi substituído por tampão de borato de

sódio a 50 mM (pH 8,0), e HCI a 2 mM foi usado para dissolver 3,2g de NHS-YPEG de 40 KD (adquirido da Beijing JianKai Technology Co., Ltd.). A proteína e PEG foram misturados na razão de proteína: PEG = 1:6 (razão de massa). A mistura foi mantida a 4°C por 3 horas, e então foi diluída 15 vezes com NaAc a 10 mM pH 4,0 antes de carregada em uma coluna de troca de íons catiônicos (adquirida da GE Healthcare) equilibrada com NaAc/HAc a 10 mM pH 4,0. Tampão de gradiente de eluição de NaAc a 10 mM/HAc + 5 NaCI a 160 mM pH4,0 foi usado para eluir a mistura diluída, e o quarto pico ativo foi coletado (Figura 2). Coluna de Sephacryl S-400HR (adquirida da GE Corporation) equilibrada com tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0) foi usado para remover os polímeros macromoleculares, e o pico ativo foi coletado (Figura 3). Sistema de tampão de NaAc a 10 mM pH 4,0 foi u- 10 sado para ultrafiltração, e 73 mg de amostra foram obtidos.

Exemplo 2 - Determinação do peso molecular de PEG-G-CSF

MALDI-TOF foi usado para determinar o peso molecular do PEG-G-CSF obtido no Exemplo 1. Particularmente espectometria de massa autoflex TOF/TOF (Bruker Dáltonics, Germany) e o método de TOF/TOF MS 15 foram usados para determinar o peso molecular de YPEG-rHuG-CSF e rHuG-CSF. Matriz usada é ácido sinapínico (SA, C11H1205, MW 224.22), e o software de análise e a flexAnálise Ver.3.0.54.0..

Resultados de teste: O peso molecular de MS de YPEG-rHuG- CSF era cerca de 59 kD, consistente com o peso molecular teórico 58801.8 Dálton. O resultado como mostrado na figura 4.

YPEG-rHuG-CSF foi obtido por modificação de rHuG-CSF com YPEG. Modificador (YPEG) era a mistura de uma série de YPEGs cujos pe- sos moleculares eram normalmente distribuídos, com um peso molecular médio de 40kD±10%. Devido à distribuição normal do peso molecular de 25 YPEG, os pesos moleculares de produtos modificados por YPEG eram tam- bém normalmente distribuídos (±10%), isto é, o peso molecular de YPEG- rHuG-CSF seria 58802.0 Dálton ± 10%.

Exemplo 3 - Determinação do sítio de peqilacão

O sítio de pegilação no PEG-G-CSF obtido a partir de Exemplo 1 foi analisado.

O tampão contendo G-CSF e PEG-G-CSF foi substituído por (NH4)HCC>3 a 50 mM, pH 8,0. Endoproeinase Glu-C foi adicionada na razão de 1:20 para digerir YPEG-G-CSF, e o método de Maldi-Tof foi usado para realizar mapeamento de impressão digital da massa de peptídeo nos frag- mentos de peptídeos obtidos. Os resultados foram mostrados na Figura 5 e na Figura 6.

5 Os resultados acima indicavam que os seguintes fragmentos de

peptídeos poderiam ser obtidos a partir de G-CSF/Glu-C: fragmentos de peptídeos de 1-20 aminoácidos, que continham os sítios de reação de YPEG M1 e K17 (MTPLGPASSLPQSFLLKCLE, peso molecular 2132.6D), fragmentos de peptídeos de 21-34 aminoácidos, que continham sítio de rea- 10 ção de YPEG K24 (QVRKIQGDGAALQE, peso molecular 1512.7D), fragmen- tos de peptídeos de 35-47 aminoácidos, que continham sítios de reação de YPEG K35 e K41 (KLCATYKLCHPEE, peso molecular 1534.7D). Fragmento de peptídeo de 1-20 aminoácidos não poderia ser obtido a partir de YPEG- G-CSF/Glu-c, mas fragmentos de peptídeos de 21-34 aminoácidos (QVR- 15 KIQGDGAALQE) e do 35-47 aminoácidos (KLCATYKLCHPEE) foram obti- dos, indicando que a modificação não ocorreu no K24, K35 e K4, mas no ami- noácido N-terminal ou Iisina na posição 17, resultando na mudança do peso molecular do fragmento de peptídeo em comparação com os peptídeos não modificados devido à conjunção com YPEG de 40 kD.

Para confirmar essa conclusão, o inventor comparou o mapea-

mento de PEG-G-CSF com aquele de G-CSF. Tripsina de grau sequencia- ção (Promega, suíno, grau de seq. modificado,> 5000 U / mg) foram diluídos com uma solução de tampão à uma concentração de 1 pg/ul. G-CSF-PEG foi submetido a uItrafiItração, e o tampão foi substituído com NH4HCO3 a 50 25 mM pH 8,0 de modo que solução de amostra com uma concentração de PEG-G-CSF de 1 mg/ml foi obtido. Adição de 1 μΙ de tripsina em 5 ΟμΙ de amostra de YPEG-G-CSF, e incubação da mistura a 37°C por 24 horas. A amostra de G-CSF não modificada foi tratada do mesmo modo que o contro- le.

Amostras de G-CSF e PEG-G-CSF digeridas foram separadas

por coluna de C18 RP-HPLC enchida com octadecilsilila (Φ4,6 mm χ 150 mm, diâmetro de partícula 5 pm, tamanho de poro de 300 Â). Eluição de gradiente foi realizada sob as seguintes condições: fase móvel Ade 0,1% de TFA/H20 (V/V), fase móvel B 0,1% de TFA/90% de ACN (V/V); taxa de fluxo de 1,0 ml/min, como mostrado na Tabela 2. O resultado como mostrado na figura 7 e na Figura 8.

Tabela 2 Gradientes de eluicão na HPLC-RPC C18 para o mapeamento de YPEG-rHuG-CSF digerido

tempo(min) % de A % de B 1 0 100 0 2 1 100 0 3 71 30 70 4 81 0 100 91 100 0 6 100 100 0 Comparado com 0 G-CSF não modificado, o mapeamento de peptídeo de PEG-G-CSF mostrou um pico adicional da 52,479 min mas o pico a 39,172 min desapareceram. Os fragmentos de peptídeos foram cole- 10 tados e os cinco aminoácidos N-terminais foram submetidos a degradação de Edman. O resultado mostrou que todos os fragmentos de peptídeos ti- nham a mesma seqüência N-terminal MTPLG. O tempo de retenção dos fragmentos de peptídeos mudado depois da conjugação com YPEG, indi- cando que o sítio de pegilação de Y de fato ocorreu no segmento N-terminal. 15 O PEG-G-CSF foi ulteriormente submetido a sequenciação N-

terminal, e demonstrou ter 15 seqüências de aminoácidos N-terminais MT- PLGPASSLPQSFL. Análise mostrou que 0 primeiro aminoácido era o Met, e comparada com o segundo aminoácido Thr, sua área de pico não era signi- ficativamente reduzida (Figura 9), indicando a existência de grupo amino 20 livre no N-terminal, que não foi modificado. Isto é modificação de PEG não ocorreu no M1 N-terminal, mas no K17. O resultado provou que o YPEG-G- CSF preparado no Exemplo 1 foi modificado no único sítio de K17.

Exemplo 4 - Ensaio da atividade biológica de PEG-G-CSF

1 - Formulação de agentes e meio de cultivo de células 1.1 1640: meio líquido de RPMI1640, que foi incubado a 4°C; ou

que foi formulado de acordo com as instruções do fabricante. Penicilina e estreptomicina foram adicionadas no meio a 105 IU/L antes do uso.

1.2. Meio de cultura mínimo: solução de 1640 com 2,5% de soro bovino fetal (FBS, v/v) e 12,5% soro de cavalo (ES, v/v), foram incubadas a 4°C.

1.3 Meio de cultura completo: rhG-CSF foi adicionado em meio

de cultura mínimo a uma concentração final de 20 ng (2000U)/ml, 4°C.

1.4 Linhas de células de NFS-60: As células foram cultivadas em meio de cultura completo a 37°C, 5% de C02 e foram passadas a cada 48 até 72 horas. A uma concentração das células foi controlada entre 2,0*105-

10,0><105/ml. O título de rhG-CSF era determinado de 24-36 horas depois da última passagem.

1.5 Tampão de fosfato (Hyclone): 8 g de NaCI, 0,2 g de KCI, 1,44 g de fosfato de hidrogênio de dissódio, 0,24 g de fosfato de diidrogênio de potássio foram formulados em 1000 ml de solução com água ultrapura.

Depois de 121 °C, 15 min de incubação a solução foi autoclavada.

1.6 Solução de MTT: Pó de MTT (Sigma) foi formulado com so- lução de tampão de fosfato em 5,0mg/ml, e foi esterilizada por filtragem de membrana de 0,22 pm, foi armazenada a 4°C no escuro.

1.7 tampão de Iise

Tampão de Iise 1: Solução de álcool isopropílico contendo 1%

de HCL concentrado, 5% de Triton X-100, armazenado a temperatura ambi- ente no escuro.

Ou tampão de Iise 2: Solução de álcool isopropílico contendo 2,8% de HCL concentrado, 10% de Triton X-100, armazenada a temperatura

ambiente no escuro.

2. Ensaio da atividade biológica de PEG-G-CSF

2.1 Preparação de suspensão de célula

Quantidade suficiente de cultura de célula de NFS-60 foi centri- fugada para coletar células de NFS-60. As células coletadas foram lavadas

com PBS 3 vezes, e então foram suspensas no meio de cultura mínimo. A uma concentração de célula foi ajustada para cerca de 2,0x105/ml, foi pre- servada a 37°C. 2.2 Padrão de G-CSF (pardrão de trabalho, ou padrão nacional provido por NICPBP, com o pardão internacional usado como uma referên- cia para checagem) e as amostras a serem testadas foram pré-diluídas a 2 ng/ml por meio de cultura mínimo de acordo com a quantidade de proteína,

e o fator de diluição para cada etapa não era mais do que 10.

2.3 Meio de cultura mínimo foi adicionado em a placa de célula de 96 cavidades a 50 μΙ/poço. Os materiais e amostras de referência a se- rem testados obtidos no 2.2 foram diluídos em série a 1:2 a oito diferentes concentração de 1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,25 ng/ml..., e cada poço continha 50

μΙ. Contole negativo (sem rhG-CSF) e controle positivo (com rhG-CSF 2 ng/ml) foram ajustados, cada um em pelo menos triplicata.

2.4 50 μΙ de suspensão de célula por poço foram adicionados, e foram incubados a 37 °C, 5% de C02 por 40-48 horas. Depois de um núme- ro substativo das células negativas (> 95%) foram rompidas, solução de

MTT foi adicionada a 20 μΙ por poço, foi incubada a 37°C, com 5% de C02 por 4-6 horas.

2.5 180 μΙ de tampão de Iise 1 ou 100 μΙ tampão de Iise 2 foram adicionados em cada poço, foram misturados por método colorimétrico a comprimento de onda de 570 nm, e o comprimento de onda de referência

era de 630 nm.

3. Resultado

A relação de dose-efeito do padrão e a amostra a ser testada foi representada graficamente com valor de OD 570nm-630 nm como um eixo

Y e os valores logarítmicos do gradiente de diluição na placa como eixo X.

Dados de teste foram processados por método de ajuste de 4 fatores. O va- lor de ED50 (50% de dose eficaz) a OD570nm-630nm foi calculado como o valor médio da concentração de fármaco máxima e a concentração de fár- maco mínima na curva do padrão a OD570nm-630nm. O valor de logaritmo do fator de diluição que corresponde a ED50 a OD570nm-630nm na curva

de amostra foi definida como o valor de C da amostra. O cálculo foi realiza- do de acordo com a seguinte equação:

Título de Amostra a ser testada (IU/frasco) = título do pa- drãoxC1/C2xD1/D2xV em que:

C1 é o fator de diluição da amostra que corresponde a ED50 do

padrão;

C2 é o fator de diluição do padrão a ED50;

D1 é o fator de pré-diluição de amostra a ser testada;

D2 é o fator de pré-diluição do padrão;

V é o volume marcado doe frasco (expresso em ml).

Foi determinado que a atividade biológica de YPEG-G-CSF pre- parado no trabalho dos Exemplos era 2,96 * 107 lU/mg (Figura 10).

Exemplo 5 - Ensaio farmacodinâmico de YPEG-G-CSF

(A) Efeito do fator de estimulação de colônia de granulócito pegi- Iado (YPEG-G-CSF) na granulocitopenia induzida por 5-fluorouracila.

1. Materiais e Métodos A amostra de teste: YPEG-G-CSF padrão (Biosteed Gene Ex-

pression Tech Co. Ltd.), : 1 mg/frasco, armazenada a 2-8 °C.

Controle positivo: Filgrastim (rhG-CSF) 300 pg/frasco (KK- PHARM Co.Ltd), armazenada a 2 ~ 8°C no escuro.

Animais: 140 camundongos machos (Kunming, grau SPF grade, 20 Staidson Pharmaceutical Co., Ltd. Beijing, número de Iicensa SCXK-(Beijing) -2006-0004). Os camundongos foram aleatoriamente divididos em 7 grupos: o grupo de controle normal, o grupo de controle de modelo, o grupo de baixa dose 1, o grupo de baixa dose 2, o grupo de média dose e grupo de alta do- se e o grupo de controle positivo.

Abodagem de modelagem: Exceto quanto ao grupo de controle

normal, ao grupo de controle de modelo e cada grupo de tratamento rece- beu uma dose de 150 mg/kg de 5-FU, e foram submetidos a terapia com a amostra de teste ou controle no dia seguinte.

Dosagem e frequência:

YPEG-rHuG-CSF foi administrado a uma dosagem de 15, 50,

150, 500 pg/kg, a cada 4 dias, por 3 vezes. A dosagem do controle positivo era de 50 pg/kg, foi administrada a cada 1-11 dias. A escala foi mostrada na Tabela 3.

Tabela 3 - Projeto de dose de YPEG-rHuG-CSF

Grupo Dosagem Modelagem Frequência MQ/kg Controle normal 0 - - Controle de modelo 0 5-FU,iv, - 150mg/kg Baixa YPEG-rHuG- 15 5-FU,iv, d1,d5,d9 dose 1 CSF-1 150mg/kg Baixa YPEG-rHuG- 50 5-FU,iv, d1,d5,d9 dose 2 CSF-2 150mg/kg Dose YPEG-rHuG- 150 5-FU,iv, d1,d5,d9 média CSF-3 150mg/kg Alta dose YPEG-rHuG- 500 5-FU,iv, d1,d5,d9 CSF-4 150mg/kg Controle G-CSF 50 5-FU,iv, d 1 -d 11 positivo 150mg/kg Administração:

Exceto quanto ao grupo de controle normal e ao grupo de con- 5 trole de modelo, outros grupos foram administrados subcutaneamente com a amostra de teste e controle positivo 24 horas depois da administração para a modelagem na dada frequência.

2. Resultado

O número de neutrófilos em camundongos foi reduzido em res- 10 posta a 5-FU, e depois de 3-9 dias o número de neutrófilos na maioria dos animais era demasiadamente baixo para ser detectado. As percentagens de neutrófilos antes do teste, e 3 e 9 dias depois do teste foram determinados, e a contagem de neutrófilo absoluta (ANC) foi calculada. Os resultados fo- ram mostrados na Tabela 4. Os resultados mostraram que depois da admi- 15 nistração de 5-FU, ANCs do grupo de controle de modelo e o grupo de 15 pg/kg foram significativamente reduzidos no dia 3 (p <0,05 e p <0,01 em comparação com o grupo de controle normal), enquanto os ANCs do grupo de 50-500 pg/kg e o grupo de controle positivo não foram reduzidos em comparação com o número de WBC em grupos de controle. Os resultados indicavam que a amostra de teste de 50-500 Mg/kg poderiam diminuir a re- dução de ANC. Até o dia 9, ANC do grupo de modelo era ainda mais baixo do que aquele de controle normal, enquanto p ANC do grupo de 150 e 500 pg/kg era mais alto do que o nível do grupo de controle normal, e o ANC do 5 grupo de controle positivo também atingiu aquele do grupo de controle nor- mal. O nível de ANC do grupo de controle de modelo no dia 11 atingiu o ní- vel do grupo de controle normal, indicando que a amostra de teste ou con- trole positivo poderia aumentar neutrófilos no animal para níveis normais mais cedo.

Tabela 4 - Efeito de YPEG-rHuG-CSF em camundongos 5-FU ANC (* 109/L)

^^^"Tempo DO (n=20) D3 (n=10) D9 (n=10) Grupo Controle 3,73±1,23 5,73±1,88 3,81±1,26 normal Controle de 3,13±0,97 3,25±1,43 A 1,78±0,68A modelo Baixa dose 1 4,53±2,14 2,74±1,06 A A 2,59±1,30 Baixa dose 2 4,72±3,87 3,90±1,82 3,00±0,96* Dose média 3,96±1,21 4,63±1,70 7,80±2,42** A A Alta dose 4,34±1,59 4,87±2,13 12,81±6,15**A A Controle 4,23±1,79 4,97±1,20** 4,84±3,10 positivo Os valores mostrados na tabela é x± DP n representa o número

de animais, mas o número real de animais em que o número de neutrófilos foi mensurável é menos do que n. Em comparação com o grupo de modelo, **: P <0,01; *: P <0,05; com o grupo de controle normal, A Á: P <0.01; ▲: P <0.05. Tabela 4 continuada YPEG-rHuG-CSF em 5-FU em camundongos ANC (* 109/L)

Tempo D10 (n=10) D11 (n=10) D12 (n=10) Grupo Controle 4,99±2,13 5,26±1,19 5,23±1,22 normal Controle de 2,24±0,92 A 5,48±3,17 5,73±2,23 modelo Baixa dose 1 10,35±2,87** A A 7,92±2,91**AA 5,62±2,31 A A Baixa dose 2 15,71±7,15** A A 23,60±7,39**AA 8,47±3,45**A A Dose média 33,07±11,42** A A 44,41±16,28**A 21,02±7,90** A A A Alta dose 32,80±16,74**A A 52,67±16,17**A 41,08±23,71**A A A Controle 9,72±3,66**A A 9,56±6,40 24,21 ±7,20** A A positivo Os valores mostrados na tabela é x± DP n representa o número

de animais, mas o número real de animais em que o número de neutrófilos 5 foi mensurável é menos do que n. Em comparação com o grupo de modelo, **: P <0,01; *: P <0,05; com o grupo de controle normal, A A: P <0,01; A: P <0,05.

3. Conclusão

O inventor verificou que além do efeito de longo prazo significa- 10 tivo, YPEG-G-CSF demonstrou proteção significativa contra neutropenia induzida por 5-fluorouracila em camundongos. YPEG-G-CSF poderia dimi- nuir o curso da neutropenia em modelo de camundongo com neutropenia, de modo que o número de neutrófilos no sangue periférico poderia ser recu- perado a uma taxa acelerada. Em comparação G-CSF administrado uma 15 vez ao dia a 50 pg/kg por 11 vezes (Filgrastim 50 pg/kgxH) a YPEG-G-CSF de 50 μ/kg administrado a cada 4 dias por 3 vezes (YPEG-G-CSF de dose baixa de 50 pg/kgx3, dose média de CSF 50pg/kg*3), estava evidente que embora a dosagem total de YPEG-G-CSF da presente invenção fosse signi- ficativamente reduzido, seu efeito no aumento do número de neutrófilos era equivalente ou muito melhor.

(B) O efeito terapêutico de fator de estimulação de colônia de granulócito de ser humano recombinante modificado por PEG em forma de

Y (YPEG-rHuG-CSF) em neutropenia induzida por radiação de 60Co 3.OGy no macaco.

1. Materiais e Métodos

Amostra de teste: YPEG-G-CSF (Biosteed Gene Expression Te- ch Co. Ltd.): 1 mg/frasco, armazenada a 2-8°C.

Controle positivo: Filgrastim (rhG-CSF) 300 pg/frasco (KK- PHARM Co.Ltd), armazenada a 2 ~ 8°C, no escuro.

Animais experimentais: Macacos Cynomolgus, machos e fê- meas de 3-4 anos de idade, peso de 2,5-4,5 kg (Xishanzhongke Laboratory Animal Co., Ltd., Su Zhou, License No.: SCXK (Su) 2002-0032). O grupo de controle de modelo compreendia 5 animais, os outros grupos compreendiam 4 animais cada.

Modelagem e administração: Depois de 30 dias de alimentação adaptativa e quarantina, animais foram irradiados com 60Co a 3.OGy no cor- po inteiro, taxa de dose de radiação de 1,8 Gy/min. Animais foram adminis- trados no dia da exposição (em 5 horas) subcutaneamente no interior das patas traseiras. Ver a Tabela 5 abaixo.

Tabela 5 - Projeto de regime de dosagem

Grupo Dosagem (pg/kg) Número de Frequência animais Controle normal - 6 - Controle de - 5 - modelo Amostra de 25 4 Uma vez a cada 6 teste dias, dO, d6, d12, d18, d24 Controle 10 4 Uma vez por dia,d0- positivo d24 2. Análise dos resultados Durante o teste, parâmetros de sangue foram medidos a cada dia, e o número de neutrófilos era contado. Os resultados mostraram que, em grupos de baixa, media e alta dose e o grupo de controle positivo, os ANCs médios eram mais altos que no grupo de controle de modelo, e com- paração entre grupos de dose e o grupo de controle de modelo em pontos de tempo diferentes mostravam diferenças significativas (p <0,05 ou p <0,01). Os resultados foram mostrados na Tabela 6, Figura 11.

Tabela 6 YPEG-rHuG-CSF no ANC de macaco irradiado com 60Co (* 109/L)

^'\Tempo DO D3 D6 D9 grupo^\^ Controle de 5,94±1,88 2,40±0,95 1,67±0,57 2,30±0,87 modelo Controle 5,62±2,68 8,37±3,78* 7,44 ±2,67** 7,71 ±1,40** positivo Amostra de 4,52±0,85 7,15±2,24** 6,04±1,28** 12,31 ±5,33** teste Os valores mostrados na tabela é *±DP. O grupo de controle de

modelo incluia 5 camundongos, e outros grupos compreendia 4 camundon- gos.

Comparado com o grupo de controle de modelo, **: P<0,01; *:

P<0,05.

Tabela 6-1 continuada YPEG-rHuG-CSF na ANC de camundongos irradia-

dos com 60Co (x 109/L) Tempo D12 D15 D18 D21 grupo Controle de 1,78±1,13 1,58±0,71 1,41 ±0,91 1,01 ±1,03 modelo Controle positivo 6,40±2,43* 3,44±1,12* 4,26±1,36* 5,24±3,77* Amostra de teste 6,60±2,59* 7,52±4,91* 3,00±0,87* 4,36±2,11* Os valores mostrados na tabela é x ±DP. O grupo de controle de

modelo incluia 5 camundongos, e outros grupos compreendia 4 camundon- gos.

Comparado com o grupo de controle de modelo, **: P < 0,01; *:

P < 0,05. Tabela 6-2 continuada YPEG-rHuG-CSF no ANC de macaco irradiado com

60Co (x 109/L) Tempo D25 D28 D30 D34 grupo Controle de modelo 0,46±0,36 0,59±0,28 0,69±0,25 1,96±1,35 Controle positivo 22,58±20,07* 8,76±7,91 6,19±4,15* 6,50±3,33* Amostra de teste 24,68±13,79* 7,30±2,98** 6,28±3,80* 6,98±3,79* Os valores mostrados na tabela era * ±DP. O grupo de controle

de modelo incluia 5 camundongos, e outros grupos compreendia 4 camun-

dongos.

Comparado com o grupo de controle de modelo,**: P<0,01; *:

P<0,05.

Tabela 6-3 continuada YPEG-rHuG-CSF no ANC de macaco irradiado com 60Co (x 109/L)

Tempo D38 D42 D46 D50 grupo Controle de 2,05±1,16 2,90±0,92 3,00±0,91 3,22±0,51 modelo Controle 6,84±2,80* 4,56±1,52 4,32±1,34 5,94±3,12 positivo Amostra de 5,29±3,03 10,19±5,65* 8,62±3,61* 10,14±9,80 teste Os valores mostrados na tabela era X±DP. O grupo de controle

de modelo incluia 5 camundongos, e outros grupos compreendia 4 camun- dongos.

Comparado com o grupo de controle de modelo,**: P<0,01; *:

P<0,05.

3. Conclusão

Fator de estimulação de colônia de granulócito de ser humano recombinante pegilado em Y (YPEG-rHuG-CSF) exerceu efeitos terapêuti- cos na neutropenia induzida por radiação de macaco cynomolgus.

YPEG-rHuG-CSF tinha um efeito prolongado in vivo. Os resulta- dos acima mostraram que, em comparação com injeção de 10 pg/kg de G- CSF uma vez por dia por 25 vezes, injeção de 25 pg/kg YPEG-G-CSF da invenção uma vez a cada 6 dias por 5 vezes alcançaram efeitos de estimu- lação equivalentes nos neutrófilos com menos quantidade de fármaco.

Exemplo 6. Ensaio farmacocinético in vivo para YPEG-G-CSF 1. Métodos e procedimentos

1.1 Fármacos e reaqentes

Amostra de teste: YPEG-G-CSF padrão (Biosteed Gene Ex- pression Tech Co. Ltd.): de 1 mg/por injeção, armazenada a 2-8°C.

Controle positivo: Filgrastim(rhG-CSF) de 300 pg/frasco (KK-

PHARM Co.Ltd), armazenada a 2 ~ 8°C no escuro.

1.2 Animais

6 Macacos Cynomolgus, 3 machos e 3 fêmeas. (Monkey Forest Management e Development Center de produção de base de alimentação de Guangxi (número de certifugado: SCXK (Gui) 2005-0005)), peso 3,11 ~ 5,62 kg, submetido a alimentação subengaiolados com ração de macaco padrão. Água foi provida ad lib. e fruta fresca foi provida duas vezes por dia.

1.3 Projeto de experiência

A experiência incluia 2 grupos, YPEG-G-CSF de 300 pg/kg sub- cutaneamente, G-CSF (FiIgrastim) de 300 pg/kg.

2 Métodos Experimentais

2.1 Amostra de sangue

YPEG-rHuG-CSF foi injetado subcutaneamente uma vez antes da administração, ou 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h, 168 h, 240 h, 312 h, 384 h e 480 h depois de administração e 1 mL de sangue ve- noso foi tirado da pata traseira oposta. Para o grupo de Filgrastim (G-CSF),

1 mL de sangue venoso foi tirado antes da administração ou 5 min, 15 min, min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h depois da administração. As amostras de sangue foram incubadas 4°C por 30 min, então foram submetidas a 3000 rpm de centifugação de baixa velocidade por 10 min, e soro foi imediata- mente separado e foi e armazenado a -20°C até a análise. 2.2 Ensaio de concentração de fármaco no soro

Kit de ensaio imunoistoquímico (ELISA) foi usado para a deter- minação de concentrações de G-CSF or YPEG-rHuG-CSF no soro no ma- cacos cynomolgus. G-CSF de kit de ELISA de ser humano (Ray Biotech 5 Inc.) foi usado em ELISA para a determinação de concentrações de G-CSF e YPEG-rHuG-CSF no soro.

2.2.1 Princípio do ensaio

A análise foi baseada na técnica de sanduíche quantitativa. Anti- corpos monoclonais contra G-CSF de ser humano recombinante foram pré- 10 revestidos na microplaca. O padrão e as amostras foram transferidos para dentro dos poços, em que G-CSF ou YPEG-G-CSF ligaria os anticorpos i- mobilizados. Todos os materiais não conjugados foram removidos por lava- gem, e IgG de anti-G-CSF de ser humano conjugada com peroxidase de rábano picante (HRP) foi adicionada nos poços. Depois de remoção por Ia- 15 vagem da totalidade dos reagentes de anticorpo - enzima não conjugados, a cor produzida depois da adição do substrato para HRP era proporcional à quantidade do G-CSF ou YPEG-G-CSF conjugado. Parar a reação para de- terminar a intensidade da cor. A concentração de G-CSF ou YPEG-G-CSF na amostra aumentada com o valor de OD.

2.2.2 Procedimentos do ensaio

O ensaio foi operado de acordo com as instruções no kit. 100 pL de amostras de soro ou padrão foram adicionados em cada poço e foram levemente misturados. De acordo com a concentração esperada das amos- tras, a mistura é diluída na faixa de curva de calibração padrão. Curva de 25 calibração padrão para G-CSF ou YPEG-G-CSF recombinante foi ajustada para cada placa para calcular uma concentração das amostras desconheci- das. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 1 h. A placa foi lava- da 3 vezes, e 100 μί de segundo anticorpo foram adicionados em cada po- ço, e foram incubados a temperatura ambiente por 1 h. A placa foi lavada 30 por 3 vezes. 100 pL de HRP foram adicionados em cada poço e a reação foi mantida a temperatura ambiente por 1 h. 100 μί de substrato de TMB foram adicionados em cada poço e foram mantidos no escuro a temperatura ambi- ente por 15 min. 100 μΙ_ de solução de parada foram adicionados a cada poço, foram misturados gentilmente para parar a reação. Valores de OD a 450 nm foram lidos em 5 mins.

2.2.3 Resultados

Software Origin® foi usado para representar graficamente os

valores de logaritmo de diferentes concentrações contra os valores de Iog OD. De acordo com a curva padrão para a determinação da concentração das amostras na placa de 96 poços, a concentração de G-CSF ou YPEG-G- CSF recombinante nas amostras foi calculada por regressão linear, a con- centração no soro foi obtida depois da calibração pelos fatores de diluição.

2.3 Métodos Estatísticos e Avaliação de Parâmetros Farmacocinéticos

Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados pelo método de Rosenblueth de modelo de não compartimento, e o software usado era versão 3P97. Comparação dos dados do mesmo macaco foi realizado por 15 teste t de Studenfs pareado, e comparação dos dados de diferentes maca- cos foi realizada por teste t, e em ambas as comparações o cálculo foi reali- zado pelo software estatístico provido pela Microsoft Office Excel (version XP). Os dados da experiência foram processados por software Origin® para se obter a equação de regressão e parâmetros estatísticos relevantes. A 20 comparação de curvas farmacocinéticas como mostrada na figura 12.

Depois da injeção de 300 pg/kg de YPEG-rHuG-CSF subcuta- neamente para dentro de macacos cynomolgus, a concentração de YPEG- rHuG-CSF no soro alcaçou seu pico depois de 8 ~ 24h, e Cmax era 4,53 ±

0.86, semivida terminal era de 77,55 ± 0,34 h, MRT era de 95,03 ± 14,51 h, AUC(0-480 h) era de 534,75 ± 155,28 pghmL-1 ; AUC(0-~) era de 539,27 ±

158,32 pghml_-1. Ataxa de depuração média era de 0,60 ± 0,20 mLkg-1 h-

1, substancialmente exibia as características farmacocinéticas lineares.

Depois da única injeção subcutânea de 300 pg/kg G-CSF, Cmax era de 2,49 ± 0,20 pg h· mL-1, AUC (0-24 h) era de 23,07± 2,93 pg-hmL-1, taxa de depuração era de 12,95 ± 1,95 ml_kg-1h-1, semivida terminal era de 4,00±1,44 h, MRT era de 6,48±1,35 h, e VSS era de 72,53±18,6 mLkg-1. O resultado indicava que as características farmacocinéticas de YPEG-G- CSF foram grandemente diferentes de G-CSF em macacos cynomolgus, e a modificação de YPEG de G-CSF resultou na redução óbvia da constante de taxa de eliminação, taxa de depuração e volume aparente de distribuição e MRT prolongado e semivida terminal (77,55 ± 0,34 h vs 4,00 ± 1,44 h)

Claims

1. G-CSF pegilado em forma de Y da estrutura como mostrado na fórmula (I): <formula>formula see original document page 29</formula> em que ReR' são independentemente alquila de baixo peso molecular, de preferência metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é de preferência de 600 a 1500; Ri é H, grupo C1-Ci2 alquila substituído ou não substituído, arila substituída, aralquila ou heteroalquila; j é um número inteiro de 1-12; . F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de acila, hi- drazida, maleimida, piridina dissulfeto, capaz de reagir com amino, hidroxila ou mercapto grupo on G-CSF para formar uma ligação covalente.

2. G-CSF pegilado em forma de y de acordo com a reivindicação1, em que o PEG em forma de Y é conjugado com o grupo amino no G-CSF através de seu grupo carboxila terminal, como mostrado na fórmula (II): <formula>formula see original document page 29</formula> em que ambos ReR' são metila; j é um número inteiro entre 1-12; m=m' e m+m' é de 600 a 1500.

3. G-CSF pegilado em forma de y de acordo com a reivindica- ção 2, em que o grupo amino é o grupo ε-amino de cadeia lateral de um re- síduo de Lys no G-CSF que corresponde a posição 17 de SEQ ID NO:1.

4. G-CSF pegilado em forma de y de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o peso molecular médio total do PEG é de cerca de 10000 a cerca de 60000 Dálton, de preferência cerca de .40000±4000 (10%) Dálton.

5. G-CSF pegilado em forma de y de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o G-CSF é extraído de uma fonte natural ou é obtido através de biotecnologia recombinante, de preferência o G-CSF tem a seqüência como mostrada na SEQ ID N0 1.

6. Uso do G-CSF pegilado em forma de y como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças que necessitam de tratamento com G-CSF, em que as doenças que necessitam de tratamento com G-CSF é, por exem- pio, granulocitopenia induzida por infecção severa, leucemia, transplante de célula-tronco, e quimioterapia para tumor sólido maligno.

7. Método para a preparação e purificação do G-CSF pegilado em forma de y como definido na reivindicação 3, compreendendo as seguin- te etapas: (a) misturação do PEG ramificado em forma de Y da seguinte fórmula (III) com G-CSF na razão de proteína:PEG=1:6 (razão de massa), e permitindo-os reagir a 4°C para se obter YG-CSF pegilado; <formula>formula see original document page 30</formula> em que ambos ReR' são metila; j é um número inteiro entre 1-12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro, e de preferência m=m' e m+m' é de 600 a 1500; (b) diluição da mistura de reação com NaAc a 10 mM/HAc pH 4,0, e carregamento da mistura diluída sobre uma coluna de troca de íons catiônicos equilibrada com NaAc a 10 mM/HAc pH 4,0; eluição com gradien- te de tampão de NaAc a 10 mM/HAc+NaCI a 160 mM pH 4,0, coleta do quarto pico, remoção de polímeros macromoleculares por uma coluna de Sephacryl S-400HR (GE Healthcare) equilibrada com tampão de fosfato de sódio a 10 mM (pH 7,0), e coleta do eluente do pico ativo para se obter YPEG-G-CSF modificado na posição K17.

8. Método de tratamento de granulocitopenia, compreendendo a etapa de administração do YG-CSF pegilado como definido na reivindicação3.