CN107446908A - 分支型聚乙二醇修饰的l‑门冬酰胺酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分支型聚乙二醇修饰的L‑门冬酰胺酶的制备方法,其结构式如式(I)所示,m为单甲氧基monomethoxy的缩写,R是去除n个氨基的L‑门冬酰胺酶亚基分子,n是1‑300的整数。本发明的化合物成分均一、免疫原性更低、抗肿瘤活性高、化学性质稳定。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种分支型聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶及其制备方法。
技术背景
L-门冬酰胺酶广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中,具有较强的抗肿瘤作用。但是,对人而言是一种外源蛋白,有较强的免疫原性,临床上经常出现进行性免疫反应和全身性过敏反应,而限制了其临床应用。为此,如何获得低免疫原性的L-门冬酰胺酶,改善该蛋白酶的药物动力学以提高耐受性及给药便利度,一直是研究的重点。
解决上述问题的方法之一就是对L-门冬酰胺酶进行聚乙二醇化修饰。专利CN1498965A公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法,使用聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯对门冬酰胺酶进行修饰。由于聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯属第一代活化的聚乙二醇修饰剂,具有修饰产物在体内不稳定,易水解的缺点。
因此,本领域迫切需要提供一种由新的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶化合物,具有更稳定的化学性质,更好的抗肿瘤效果和更低的免疫原性。
发明内容
本发明提供一种分支型聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶化合物,具有式(I)结构
其中m为单甲氧基;PEG为聚乙二醇;R为去除n个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子;n为1-300的整数;L-门冬酰胺酶是天然或重组的;mPEG的分子量为1000-50000Da。
该分支型聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶化合物的制备方法,包含以下步骤:
(1)在L-门冬酰胺酶溶液中,加入缓冲液,调节其pH在4-10,然后与式II所示的活化的分支型聚乙二醇衍生物进行反应,反应温度为5-35℃,反应时间为10-100分钟,得到含式I化合物的混合物,
其中,R-NH2为L-门冬酰胺酶;
(2)从混合物中分离得到式I的化合物。
在一优选的方案中,所述的n为50-200的整数。
在一优选的方案中,所述的mPEG的分子量为5000-30000Da。
在一优选的方案中,所述的pH为6-8。
在一优选的方案中,所述的反应温度为10-25℃。
在一优选的方案中,所述的反应时间为15-40分钟。
在一优选的方案中,所述的活化的分支型聚乙二醇和L-门冬酰胺酶的摩尔比为1-300。
在一优选的方案中,所述的分离纯化采用离子交换层析。
下面通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解,对本发明的技术特征所作的等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。
具体实施例方式
实施例1
取4mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml,加入醋酸钠缓冲液调节pH=6.0,然后与式II所示的活性分支型聚乙二醇5000固体6.875mg进行反应,反应温度为15℃,反应时间为20分钟,形成含有分支型聚乙二醇5000修饰的L-门冬酰胺酶混合物。
将干燥的柱填料加入50毫升活性聚乙二醇溶液中,搅拌,反应3小时,将填料装入层析柱中。再用0.06M醋酸钠缓冲液淋洗,以除去未反应的活性聚乙二醇及其他杂质。最后,用0~100%的梯度添加0.06MK2HPO4-KH2PO4缓冲液,得到分支型聚乙二醇5000修饰的L-门冬酰胺酶混合物。
实施例2
取4mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml,加入醋酸钠缓冲液调节pH=8.0,然后与式II所示的活性分支型聚乙二醇10000固体9.847mg进行反应,反应温度为25℃,反应时间为30分钟,形成含有分支型聚乙二醇10000修饰的L-门冬酰胺酶混合物。
将干燥的柱填料加入100毫升活性聚乙二醇溶液中,搅拌,反应3小时,将填料装入层析柱中。再用0.06M醋酸钠缓冲液淋洗,以除去未反应的活性聚乙二醇及其他杂质。最后,用0~100%的梯度添加0.06MK2HPO4-KH2PO4缓冲液,得到分支型聚乙二醇10000修饰的L-门冬酰胺酶混合物。
Claims (6)
1.一种分支型聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶化合物,其特征在于,具有式(I)结构
其中m为单甲氧基;PEG为聚乙二醇;R为去除n个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子;n为1-300的整数。
2.如权利要求1所述,其特征在于,L-门冬酰胺酶是天然或重组的。
3.如权利要求1所述,其特征在于,式中mPEG的分子量为1000-50000Da。
4.一种如权利要求1所述的分支型聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶化合物的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)在L-门冬酰胺酶溶液中,加入缓冲液,调节其pH在4-10,然后与式II所示的活化的分支型聚乙二醇衍生物进行反应,反应温度为5-35℃,反应时间为10-100分钟,得到含式I化合物的混合物,
其中,R-NH2为L-门冬酰胺酶;
(2)从混合物中分离得到式I的化合物。
5.如权利要求4所述,其特征在于,活化的分支型聚乙二醇衍生物与L-门冬酰胺酶的摩尔比为0.5-300。
6.如权利要求4所述,其特征在于,分离式I化合物采用离子交换层析。
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- 2016-06-01 CN CN201610381717.4A patent/CN107446908A/zh active Pending
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