JPH04121187A - ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規かつ有用なポリエチレングリコール修飾
アルギニンデイミナーゼ、およびその製造法に関する。

さらに本発明はこのポリエチレングリコール修飾アルギ
ニンデイミナーゼを有効成分とする血中安定性の高い制
癌剤に関する。

〔従来の技術〕

近年、遺伝子工学の進歩やタンパク賞を大量精製する技
術の向上により、酵素や生理活性物質などを医療として
使用することが可能となった。癌治療の分野においても
、癌細胞の栄養要求性に基づいた酵素療法（Ｎａｔｕｒ
ｅ誌、２２９　１６８（１９７１）、　Ｂｒ、Ｊ、　Ｃ
ａｎｃｅｒ誌、■、　３７９　（１９６５）　）が注目
されている。アルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３，５，３
，６）は、癌細胞の増殖に必須であるし一アルギニンを
Ｌ−シトルリンとアンモニアに加水分解することにより
、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて強い制癌作用を示すことが
知られているＣＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ誌、ｉｎ　ｐｒｅ
ｓｓ）　。

しかしながら、アルギニンデイミナーゼには、酵素療法
における固有な性質としての循環血液中からの急速な消
失（クリアランス）の問題と、異種タンパク賞としての
抗原性の問題が予想されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明はアルギニンデイミナーゼのこのような欠点を解
決するためになされたものであって、アルギニン分解能
を保持し、血中安定性を向上させたアルギニンデイミナ
ーゼの化学修飾体を製造し、これを制癌剤として利用し
ようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、アルギニンデイミナーゼの化学修飾に使
用する至適な合成高分子の探索研究を行った。

その結果、ポリエチレングリコールで化学修飾したアル
ギニンデイミナーゼが優れた性質を示すことを見出し、
本発明を完成するに至った。

ポリエチレングリコールは、それ自体毒性が低く、免疫
原性がなく、また、水溶液中で酵素の立体構造に影響を
与えないので酵素活性を保持しうる修飾試薬である。と
りわけ、平均分子量ｔ、ｏｏ。

〜１０，０００の該修飾試薬は該酵素の安定化と免疫原
性の抑制に優れた効果を発揮することがわかった。

また、該修飾体は次の方法によって調製される。

アルギニンデイミナーゼは、いかなる生物由来のものを
使用してもよい、たとえば、マイコプラズマ、シュード
モナス、ストレプトコッカス等の微生物を例に挙げるこ
とができる。特に好適な菌株は、（財）発酵研究所から
入手することができるマイコプラズマ　アルギニイ、：
ｌ−（Ｍ、ａｒｇｊｎｉｎｉ）　［夏Ｆ０１４４７６　
、＾ＴＣＣ２３８３８またはＮＣＴＣ１０１２９）であ
る。

本発明のアルギニンディミナーゼは上記マイコプラズマ
の菌体抽出液から、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等のカラムクロマトグラフィーによってアルギ
ニンデイミナーゼを分離精製することができる。また、
遺伝子工学的手法を用いて生産することもできる。

本発明に用いられる特に好ましいアルギニンデイミナー
ゼの一つは次の理化学的性質を有する。

（イ）作用 Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する。

（ロ）至適ｐ　Ｈ：　６．０〜７．５ （ハ）安定Ｐ　Ｈ：　４．５〜９．０ （ニ）至適温度：約５０°Ｃ （ホ）ｋｍ値：約０．２ｍＭ （へ）等電点（ｐｉ）　：約４．７ 電気泳動法による） （チ）Ｎ末端からのアミノ酸配列 ５ｅｒ−シａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−さらに、このアルギニンデイミナ
ーゼは第１図に示すアミノ酸配列を含有する。

また、修飾に使用するポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）は、蛋白質と共有結合しうるちのであれば、いかなる
ものを用いてもよい０例えば、末端にカルボキシル基を
有するポリエチレングリコールとＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドとをカルボジイミドを用いて脱水結合して得ら
れる活性化ＰＥＧなどが挙げられる。特に好適なものは
、塩化シアヌル（２，４，６−）リクロロー３−トリア
ジン）に２つのポリエチレングリコール（平均分子量的
５０００）鎖を結合させた活性型ＰＥＧ１　［２，４−
ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−ク
ロロ−５−）リアジン］である。該活性型ＰＥＧｔは常
法に従い、合成・精製される。

本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミ
ナーゼは上記の活性型ＰＥＧ□のトリアジン環と、前記
のアルギニンデイミナーゼの分子表面に存在するアミノ
基とを結合させることにより得ることができる。

尚、該修飾体の制癌活性は未修飾アルギニンデイミナー
ゼと同等である。

本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミ
ナーゼは、試験例に示すように、優れた血中安定性を有
することから、制癌剤としてを用である。

本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミ
ナーゼは、通常の製剤用担体、賦形側あるいは希釈剤等
を用いて慣用の方法で製剤とすることができる。この剤
型としては、錠剤、丸荊、カプセル剤、顆粒剤等として
経口投与したり、あるいは静注、筋注、筋注等の注射剤
の形として投与したり、また半割の形にして投与したり
することができる。

投与量は、症状や投与対象者の年令、性別等を考慮して
個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１日当
り１０〜５００■であり、これを１日１回または数回に
分けて投与する。

該修飾体の毒性については、これをマウスに経口的ある
いは尾静脈内にＩｇ／ｋｇ投与しても死亡例がなく、ま
た投与後解剖した所見によると各臓器には何等の異常が
観察されず、きわめて安全であることが分かった。

また、抗原性試験の結果、モルモットにおいて抗体生産
性は著しく抑制され、免疫原性を減少していることがわ
かった。

実施例 次に、本発明を実施例を示して具体的に説明する。

実施例１ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾アルギニンデ
イミナーゼの調製 （１）　　２．４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレング
リコール）−６−クロロ−５−）リアジン〔活性型ＰＥ
Ｇｔ〕の合成法 グリコール〕 〔活性型ＰＥＧ１　） 無水炭酸ナトリウム（Ｌｏｇ）とモレキュラーシーヴ３
Ａ（５ｇ）を含む乾燥ベンゼン１００ｍにモノメトキシ
ポリエチレングリコール（平均分子量５０００）　　（
２０ｇ　）と塩化シアヌル（３６５■）を添加し、８０
℃で４８時間還流した０次に反応液に石油エーテル２０
０ｄを添加し、生成した活性型ｐＥｃｔを沈澱させた。

この沈澱物を、ベンゼン−アセトン（１：　１）２００
ｄに溶解し、石油エーテル２００ｊ１１で沈澱させる精
製操作を３回繰り返し、さらにゲル濾過カラムクロマト
グラフィーにより一本鎖の活性型ＰＥＧ＋を除去したの
ち、凍結乾燥して活性型ＰＥＧｚ　（１０，３ｇ）を得
た。

（２）アルギニンデイミナーゼの調製 マイコプラズマ・アルギニイニ（Ｍ、　ａｒｇｘ旧旧）
（ＩＦｏ　１４４７６株）を３０ｆ培養液（ＰＰＬＯｂ
ｒｏｔｈ　ｗ／。

ＣＶ　（Ｄｉｒｃｏ）　２１　ｇ　、　Ｌ−アルギニン
Ｌｏｇ、馬血清２００ａｄ、２５％新鮮イーストエキス
１００ｍ、０．４％フェノールレッド液５ｄ及び蒸留水
７００　ｍの組成よりなり、ｐＨ７，０に調整〕に接種
し、５％ＣＯ！インキュベーター内で３７°Ｃにおいて
２日間静置培養した０次に得られた培養液を７０００ｒ
ｐ−で２０分間遠心することにより菌体３０ｇを集菌し
、これをリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）を含む生理食塩
液（ＰＢＳ）で２回洗浄後、１０−Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）２０ＯＮ！Ｈに懸濁した。この懸濁液を超音
波処理してその中に含まれる菌体を破砕し、遠心分離に
よって不溶物を除き、得られた上清をマイコプラズマ・
アルギニイニ（Ｍ、　ａｒｇｉｎｉｎｉ）の菌体抽出液
とした。

上記で得られた菌体抽出液を出発材料として、通常用い
られるカラムクロマトグラフィー（ゲル濾過、陰イオン
交換、アルギニン・アフィニティカラム）を行うことに
より、アルギニンディミナーゼ０．３２ｇを得た。

このときの結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 菌体抽出液 １．３６　　１．６３Ｘ１０’　　　１２．０Ｓａｐｈ
ａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ ０，６１ １，６０Ｘ１０’ ２６．２ １）ＥＡＥ− 丁ｏｙｏｐｅａｒｌ　　６５０ｓ ０．３８ １．４７Ｘ１０’ ３８．７ ＾ｒｇｌｆｌｌｆｌ＠＋− ３ｅｐｂａｒｏｓｅ　４Ｂ ０．３２ １．４１Ｘ１０’ ４４．５ ８に のアルギニンデイミナーゼは、前記した理比学的性質を
有し、第１図に示したアミノ酸配列を有していた。

ＰＥＧ−修飾アルギニンディミナーゼの調製〔活性型Ｐ
Ｅｈ） （ＰＥＧ−修飾ＡＤ） （２）で調製したアルギニンディミナーゼ（２５■）に
０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）５ｄを添
加し、３７℃で３０分間撹拌した。氷冷した１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）５ｄを添加し、反応を停
止させた後、ＭＸ−５０（アミコン社、分子量５万カツ
ト）を用いた限外濾過により未反応の活性化ＰＥＧＺを
除去した。得られたＰＥＧ修飾アルギニンデイミナーゼ
について、リン酸緩衝液（ｐＨ１，４）を含む生理食塩
水（ＰＢＳ）に対して透析した後、収量、比活性および
アミノ基の修飾率を渕定した。

なお、蛋白定量は生血清アルブミンを標準として通常の
ビウレット法により、酵素活性は生成したシトルリンを
Ａｒｃｈｉｂａｌｄの方法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

誌、ｌｉ、　１２１　（１９４４）により測定した。こ
のとき、１分間にＩμｍｏｌのシトルリンを生産するア
ルギニンデイミナーゼ活性を１単位（Ｕ）とし、比活性
は酵素１■当たりの単位数（ｏ７１１ｇ蛋白）で表わし
た。

また、ＰＥＧ−修飾アルギニンデイミナーゼのアミノ基
修飾率は未修飾アルギニンデイミナーゼを対照として２
，４．６−　）リニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ
）を用いた５ａｔａｋｅらの方法（Ｊ、Ｂｊｏｃｈｅｔ
誌。

ｌ　、　６５４　（１９６０）　）により測定した。

このときの結果を第２表に示す。

収　ｉ）　　　　　　　１６．０　（＊蛋白）比活性　
　　　　　２５．５（Ｕ／■蛋白）実施例２ 注射用酵素製剤の調製 実施例１−（３）で得られたＰＥＧ−修飾アルギニンデ
イミナーゼをＰＢＳを用いて希釈し、濾過滅菌して２５
　Ｕ／ｄの注射用酵素製剤を調製した。

なお、実施例１−（２）で得られた未修飾アルギニンデ
イミナーゼを実施例２と同様にして注射用酵素製剤を調
製し、比較試験の対照として使用した。

試験例 マウスにおける血中安定性の向上 ７遇齢の雄性ＣＤＦ　、マウス６匹を無作為に対照群３
匹、試験群３匹に群分けした。そして、実施例２で調製
した未修飾アルギニンデイミナーゼ製剤を対照群に、Ｐ
ＥＧ−修飾アルギニンデイミナーゼ製剤を試験群に、そ
れぞれ０．２　ｄ　（５Ｕ／マウス）ずつ尾静脈内に投
与し、投与１日後、３日後、８日後および１５日後に眼
窩静脈叢より採血を行った。

各製剤の血中安定性は、血中アルギニン濃度とシトルリ
ン濃度の経時変化を指標した。なお、血中アミノ酸濃度
の測定は、各アミノ酸をケイ光試薬（ＮＢＤ−Ｆ４．フ
ルオロ−７−二トロベンゾーＺ−オキサ−１，３−ジア
ゾール）を用いて誘導体化したのち、高速液体クロマト
グラフィーにより行った。

このときの結果を第３表に示す。

この結果、試験群では対照群にくらべて血中のアルギニ
ン濃度が長期間に亘り低減し、シトルリン濃度が増加し
ているので、ＰＥＧ−修飾アルギニンデイミナーゼは血
中で長期間安定にその作用を持続すると判断される。

〔発明の効果〕

本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミ
ナーゼは、アルギニンデイミナーゼと同等の制癌活性を
示し、しかも血中安定性が向上し、抗原性が減少し、し
かも低毒性であるので制癌剤として有用に利用すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に好適に用いられるアルギニンデイミナ
ーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩
基配列を示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリエチレングリコールまたはその誘導体により
   化学修飾されたポリエチレングリコール修飾アルギニン
   デイミナーゼ
2. （２）式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で表される請求項（１）記載のポリエチレングリコール
   修飾アルギニンデイミナーゼ （式中、ＡＤはアルギニンデイミナーゼを表し、ｎはポ
   リエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜１０
   ，０００となる任意の正の整数を表す）
3. （３）アルギニンデイミナーゼが次の理化学的性質を有
   する請求項（１）または（２）に記載のポリエチレング
   リコール修飾アルギニンデイミナーゼ （イ）Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ−
   シトルリンとアンモニアを生成する （ロ）至適ｐＨ：６．０〜７．５ （ハ）安定ｐＨ：４．５〜９．０ （ニ）至適温度：約５０℃ （ホ）ｋｍ値：約０．２ｍＭ （ヘ）等電点（ｐｌ）：約４．７ （ト）分子量：約４５，０００ （ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）
   ：約９０，０００ （ゲル濾過ＨＰＬＣ法による）
4. （４）アルギニンデイミナーゼがマイコプラズマ・アル
   ギニイニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ａｒｇｉｎｉｎｉ）
   由来のものである請求項（１）〜（３）のいずれかに記
   載のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナー
   ゼ
5. （５）アルギニンデイミナーゼが第１図のアミノ酸配列
   を含有するものである請求項（１）〜（４）のいずれか
   に記載のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミ
   ナーゼ
6. （６）アルギニンデイミナーゼとポリエチレングリコー
   ルまたはその誘導体とを反応させて両者を共有結合させ
   ることを特徴とするポリエチレングリコール修飾アルギ
   ニンデイミナーゼの製造法
7. （７）ポリエチレングリコール誘導体として２，４−ビ
   ス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロ
   ロ−ｓ−トリアジンを用いることを特徴とする請求項（
   ５）に記載のポリエチレングリコール修飾アルギニンデ
   イミナーゼの製造法
8. （８）請求項（１）〜（４）のいずれかに記載のポリエ
   チレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼを有効成
   分とする血中安定性の高い制癌剤