JPH02273176A

JPH02273176A - グリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシドジスムターゼ及びその製造法

Info

Publication number: JPH02273176A
Application number: JP1091798A
Authority: JP
Inventors: Katsukiyo Sakurai; 桜井　勝清; Tadasuke Miyazaki; 匡輔宮崎
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1989-04-13
Filing date: 1989-04-13
Publication date: 1990-11-07
Anticipated expiration: 2013-06-18
Also published as: JP2766303B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的］（産業上の利用分野）本発明は、修飾酵素及びその製造法に関し、更に詳しく
はグリコサミノグリカンで修飾されたスーパーオキシド
ジスムターゼ及びその製造法に関するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）スーパ
ーオキシドジスムターゼ（以下ｒＳ　ＯＤＪという、）
は、ラジカルで反応性に富む活性酵素であるスーパーオ
キシドの有害作用から生体を防禦する働きを有するとい
われている。薬効の面では、抗リウマチ剤、心筋梗塞又
は臓器移植の際の使用、抗血栓剤の使用後に生じるラジ
カルの除去等の種々の炎症への適用が期待されている。

ＳＯＤの原料としては、ヒト赤血球（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２４４．４５６５（１９６９１）、ウシ
赤血球（ＪＢｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４６．２８７５
（１９７５１１、ニワトリ肝臓（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、　２４８．３５８２（１９７３））　、麦芽（
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　３
１７．５０（１９７３））、エントウマメ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　２６８．３０
５（１９７２１）　、ホウレンソウ（Ｅｕｒ、　Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

３６、２５７（１９７３）ｌ、酵母（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

’Ａｃｔａ、　２８９．２７６（１９７２）ｌ　、パン
カビ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２４７．３４１０（１９７２１）等があ
り、更に遺伝子組換えで大量調製も可能である。

しかし、蛋白のもつ宿命である、ヒト由来以外のＳＯＤ
の゛抗原性の問題、ヒト又は哨乳動物由来のＳＯＤでの
血中における安定性及び効果の問題（ヒト由来のものは
活性が小さく、血中での安定性が悪いと報告されている
。）が報告されており、実用化には更に一工夫が必要で
ある。

かかる問題点を解消すべくポリアルキレングリコールで
ＳＯＤを修飾する試みがなされているが（特開昭６１−
２４９３８８号公報及び特開昭６２−１１５２８０号公
報）、多糖による修飾ではデキストランによる修飾が報
告されているのみである（特開昭６２−１１５２８０号
公報）。

しかしながら、デキストランによる修飾では、ＳＯＤの
抗炎症作用の増強が認められるが、免疫原性を抑制する
効果は認められていない（特開昭６２−１１５２８０号
公報５頁左下欄参照）。

本発明者らは、デキストランによるＳＯＤの修飾の欠点
を解消すべく鋭意研究を重ねた結果、デキストランの代
わりにグリコサミノグリカン（以下ｒＧＡＧＪという、
）を用いることにより抗炎症作用を維持し、かつ、免疫
原性を抑制できることを見出し本発明を完成するに至っ
た。

［発明の構成］（課題を解決するための手段及び作用）本発明は、ＳＯ
ＤとＧＡＧとを化学的に結合させてなることを特徴とす
る修飾酵素及びその製造法に関するものである。

本発明に用いるＳＯＤとしては、特に制限はないが、特
にヒト又はその他の嗜乳類由来のＳＯＤが好ましい。

また、ＧＡＧとしては、例えば、ヒアルロン酸（以下ｒ
ＨＡＪという、）、コンドロイチン硫酸（以下ｒｃｓＪ
という、）（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ。

Ｅ、Ｆ、Ｈ）、ヘパリン（以下ｒＨｅｐＪという、）、
ヘパラン硫酸（以下「Ｈ８」という、）、ケラタン硫酸
（以下ｒＫｓ」という、）、ケラタンポリ硫酸（以下ｒ
ＫＰＳＪという、）及びこれらの塩、例えばナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。

本発明の修飾酵素は、前述のＳＯＤとＧＡＧを化学的に
結合させてなるものであり、かかる結合の方法としては
、特に制限はないが、例えば、ＳＯＤのアミノ基又はカ
ルボキシル基と、ＧＡＧのカルボキシル基もしくは水酸
基又は還元末端の官能基との反応によって結合させる方
法、ＳＯＤやＧＡＧの前記官能基を臭化シアン、エビへ
ロヒドリン、ジエポキシド、ω−アミノアルキルアミン
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等で活性化したりスペ
ーサーを付けて結合させる方法、ＧＡＧの還元末端を還
元して生じた一級水酸基のみを部分酸化しアルデヒド基
としてＳＯＤのアミノ基と反応させる方法が挙げられる
。

カルボジイミド縮合法により結合させる場合、カルボジ
イミド類としては、例えばジエチルカルボジイミド、ジ
イソプロピルカルボジイミド、メチルプロピルカルボジ
イミド、ジシクロへキシルカルボジイミド、ヘキサメチ
レンカルボジイミド、ヘプタメチレンカルボジイミド、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリ
ノエチル）カルボジイミドメソ−ｐ−トルエンスルホネ
ート、１−ｔ−ブチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド、ジフェニルカルボジイミド、４
．４′−ジニトロジフェニルカルボジイミド、ジーｐ−
）リルカルポジイミド、ビス（トリメチルシリル）カル
ボジイミド等が挙げられる。

本発明の修飾酵素は、水溶性であること好ましい。

本発明の修飾酵素中のＧＡＧ含量は、目的とする医薬用
途により異なるが、通常２０〜９９．９９重量％、好ま
しくは４５〜９９．５重量％である。

水溶性カルボジイミドによる縮合法では、１〜１０％の
ＧＡＧ水溶液を塩酸でｐＨ４〜６に調整し、水溶性カル
ボジイミドを加え、再度ｐＨを４〜６に調整する。ＳＯ
Ｄを加え室温で１時間ｐＨを４〜６に保持し、その後５
〜２０時間放置する０反応液にエタノールを加え沈殿さ
せ、その後、沈殿物を精製し、目的物を得る。

臭化シアン活性化法では、ＧＡＧの２Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ１１，５）の溶液に臭化シアンのアセトニトリル溶
液を加え、４℃で５分間反応させた後、アセトニトリル
を加えて沈殿させ、過剰の臭化シアンを除いた後、Ｏ，
１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、ＳＯＤを加え
て４℃で２００時間反応せ、精製して目的物を得る。

還元末端酸化法では、０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，３）にＧＡＧを溶解し、水素化ホウ素ナトリウムを加
えて室温で５時間反応させて還元末端還元ＧＡＧを得る
。これを４０ｍＭイミダゾール塩酸（ｐＨ６，５）水溶
液に溶解し、５〜７倍モルの過ヨウ素酸ナトリウムを０
℃で加えて反応させ、還元末端酸化ＧＡＧを得る。これ
にＳＯＤを加えて室温で１〜２０時間反応させた後、水
素化シアノホウ素ナトリウムを加えて室温で２〜２０時
間反応させ、精製して目的物を得る。

以上の結合反応によって得られる修飾酵素は。

常法に従って、透析、アルコール沈殿、ゲルろ過、イオ
ン交換クロマトグラフィー等により精製することができ
る。

本発明の修飾酵素は、抗炎症剤、特に抗リウマチ剤とし
て有用である。

本発明の修飾酵素を医薬として適用するに際しては、有
効成分として本発明の修飾酵素又はその無毒性で薬学的
に許容される塩を、固体又は液体の医薬用担体又は希釈
剤、即ち、賦形剤、安定剤等の添加剤とともに含む製剤
とすることが好ましい。特に好ましい塩は、アルカリ金
属塩及びアルカリ土類金属塩のような薬学的に許容され
る無毒性の塩であり、例えばナトリウム塩、カリウム塩
、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩が挙
げられる。これらの塩は水溶性であるため、注射剤とし
て用いる場合に最適である。該医薬製剤において、前記
有効成分の担体成分に対する割合は、１〜９０重量％の
間で変動させつる。

剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠
剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、又
は原末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静脈
内投与、筋肉的投与又は皮下投与してもよい、また、坐
剤、軟膏剤、バッグ剤、貼付剤、リニメント剤、ローシ
ョン剤等の剤形にして、外用剤として用いることもでき
る。また、注射用の粉末にして、用時調製して使用して
もよい。

経口、経腸、非経口もしくは局所投与に適した医薬用の
有機又は無機の、固体又は液体の担体もしくは希釈剤を
、本発明の修飾酵素を含む医薬製剤を調製するために用
いることができる。水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベンジ
ルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール、石油
樹脂、やし油、ラノリン又は医薬に用いられる他のキャ
リアー（担体）は全て、本発明の修飾酵素の担体として
用いることができる。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤や
、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なｐＨを維持するた
めの塩類を補助薬剤として適宜用いることもできる。

更に、該医薬製剤は、リウマチ等の炎症性の疾患又は症
状の治療において、本発明の修飾酵素とともに適切に投
与することができる他の医薬として有効な成分、例えば
他の適当な抗炎症剤又は抗炎症酵素剤を含有していても
よい。

顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤又はカプセル剤の場合には
、該医薬製剤は本発明の修飾酵素を５〜８０重量％含有
しているのが好ましく、液剤の場合には、対応する量（
割合）は、１〜３０重量％であるのが好ましい。また、
非経口投与のうち、注射剤の場合は１〜１０重量％、坐
剤の場合は１〜５０重量％が好ましい。局所投与用であ
る軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、医薬製剤
１　ｏｏｇに対し、本発明の修飾酵素を０．１〜１０ｇ
含有させることが好ましい。

臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し本発明の修
飾酵素として、１日量１００〜２０００ｍｇを内服する
のが好ましいが、年令、症状により適宜増減することも
可能である。前記１日量の本発明の修飾酵素は、１日に
１回、又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分
けて投与することが好ましい。

また、注射剤として用いる場合には、本発明の修飾酵素
として成人に対し１回量１０〜１０００ｍｇを投与する
のが好ましく、軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合
は、前記含有割合のものを適当量患部に塗布することが
好ましい。

（発明の実施例）以下、実施例、試験例により本発明を更に詳細に説明す
るが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

なお、以下の実施例等において、酵素活性及び物性の測
定等は以下の条件で行った。

１立見皿並辺［：Ｊ、Ｍ、　ＭｃＣｏｒｄ及び１．　Ｆｒ１ｄｖｉｃｈの
方法（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４４．６０４９（１９６９
１）に準じて行った。

１１放ｌニアセチルセルロース膜（Ｓｅｐａｒａｘ　ＪＯＯＫＯＯ
Ｃｏ、。

ＬＴＤ、）を用い、Ｏ，１Ｍピリジン／ギ酸緩衝液（ｐ
Ｈ３，０）　、０．５ｍＡ／ｃｍで３０分泳動し、クー
マシーブルー、又はアルシアンブルー及びトルイジンブ
ルーで染色した。

ＨＰＬＣによる　　　１　：東ソー製カラムＧ　６０００　ＰＷＸ　２を用い、０．
２Ｍ食塩水溶液で溶出し、ＨＡのキャリブレーションカ
ーブからＨＡ−ＳＯＤの分子量を測定した。

実施例Ｉ　　ＨＡ修飾ＳＯＤの製造（水溶性カルボジイ
ミド縮合法）鶏冠由来のＨＡ（分子量１００万）５００ｍｇを水５０
ｍ１に溶解し、０．０ＩＮ塩酸でｐＨ６４０とした。こ
の水溶液にウシ赤血球由来のＳＯＤ５ｍｇを溶解し、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩（以下ｒＷＳＣＪという、）３０ｍｇを
加えて４℃で２００時間反応せた０反応液にエタノール
を加えて沈殿物を得た。この沈殿物を水に溶解し、再度
エタノールを加えて、沈殿物としてＨＡ修飾ＳＯＤを得
た。

収量：　　　　　４８２ｍｇ５ＯＤ含量：０．９２％ＨＡ含量：９９．０８％分子量＝　　　１１８万電気泳動：　　第１図参照ＳＯＤ活性：　未修飾ＳＯＤの６７．２％［ＣＥ］　ｏ
　：　　　−７９，０（Ｃ＝１．　Ｈｉｄ）実施例２　
　ＨＡ修飾ＳＯＤの製造（水溶性カルボジイミド縮合法
）鶏冠由来（７）ＨＡ（分子量１００万）２００ｍｇ、ヒ
ト赤血球由来（７）　Ｓ　ＯＤ　５　ｍ　ｇ及びＷＳＣ
１９ｍｇを用い、実施例１と同様に処理してＨＡ修飾Ｓ
ＯＤを得た。

収量：　　　　　１９８ｍｇ５ＯＤ含量：２．３０％ＨＡ含量：９７．７０％分子量：　　　１１８万電気泳動：　　第１図参照ＳＯＤ活性：　未修飾ＳＯＤの４４，４％［ａｌ　ｏ　
：　　　−７８，５（Ｃ＝１．　Ｈｉｄ）実施例３　　
ＨＡ修飾ＳＯＤの製造（臭化シアン活性化法）鶏冠由来のＨＡ（分子量１５万）４００ｍｇを２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ１１，５）に溶解し、臭化シアンのアセ
トニトリル溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加えて４
℃で５分間反応させた。

直ちに、アセトニトリル１５０ｍ１を加えて沈殿物を得
、アセトニトリルで素早く洗浄した。この沈殿物を０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解し、１％のイヌ赤
血球由来のＳＯＤ水溶液１０ｍ１を加えて４℃で２００
時間反応せた０反応液にエタノールを加え、得た沈殿物
を水に溶解し、エタノールアミンＯ，１ｍｌを加えて室
温で１時間反応させた０反応液にエタノールを加えて沈
殿させ、沈殿物を充分にエタノールで洗浄して乾燥させ
て、ＨＡ修飾ＳＯＤを得た。

収量：　　　　　３５０ｍｇ５ＯＤ含量：２１．２％ＨＡ含量：　　　７Ｂ、８％分子量：　　　　１７．２万電気泳動：　　第１図参照ＳＯＤ活性：　未修飾ＳＯＤの８２．１％［α］。：　
　　−６８，０（Ｃ＝、１．　Ｈ，０）実施例４　　Ｈ
Ａ修飾ＳＯＤの製造（還元末端酸化法）（１）ＨＡの還元末端の還元鶏冠由来ｆニア）ＨＡ　（分子量１００万）２０００ｍ
ｇ　（０，ＯＯｌ　９２ｍｍｏｌ）を０．０５Ｍホウ酸
緩衝液（ｐＨ８，３）２００ｍｌに溶解し、水素化ホウ
素ナトリウム１．８２ｍｇを加えて室温で５時間反応さ
せた６反応液に酢酸を加えてｐＨを４．５として、エタ
ノールを加えて沈殿させた。

沈殿物を充分にエタノールで洗浄して乾燥させて、還元
末端還元ＨＡを得た。

収量：　　１８００ｍｇ（２）還元末端酸化ＨＡ還元末端還元ＨＡ　１７００　ｍ　ｇ　（０，００１６
３５ｍｍａｌｌを４０ｍＭイミダゾール塩酸（ｐＨ６，
５）水溶液２５０ｍ１に溶解し、０℃に冷却して過ヨウ
素酸ナトリウム１．３９９５６ｍｇを加えて１時間反応
させた６反応液にエタノールを加えて沈殿させ、沈殿物
を充分にエタノールで洗浄して、還元末端酸化ＨＡを得
た。

収量二　１６１０ｍｇアルデヒド基：還元末端の７０％（３）ＨＡ修飾ＳＯＤ還元末端酸化ＨＡ１００ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）１０ｍｌに溶解し、ウシ赤血球由来の５
ＯＤ２．３ｍｇを加えて室温で２００時間反応せた０次
いで、水素化シアノホウ素ナトリウム０．４ｍｇを加え
て室温で２時間反応させた。反応液にエタノールを加え
て沈殿させ、沈殿物を充分にエタノールで洗浄して乾燥
させて、ＨＡ修飾ＳＯＤを得た。

収量：　　　　　８９．７ｍｇ５ＯＤ含量：　　２．０％ＨＡ含量：　　　９Ｂ、０％分子量：　　　１００万電気泳動：　　第１図参照ＳＯＤ活性；　未修飾ＳＯＤの８９．８％［ａ］　ｏ　
：　　　　７８．　Ｏ（Ｃ：１．　ＨｚＯ）実施例５　
　Ｃ５修飾ＳＯＤの製造（水溶性カルボジイミド縮合法
）ウシ気管軟骨由来のＣＳ（分子量１５０００）１００ｍ
ｇを水１０ｍ１に溶解し、０．０ＩＮ塩酸でｐＨ６、Ｏ
とした。これにウシ赤血球由来のＳＯＤを１．２．５．
１０．２０又は４０ｍｇ加えた後、ＷＳＣを６ｍｇずつ
加えて４℃で２００時間反応せた１反応液にエタノール
を加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度エタノール
を加えて沈殿させて、それぞれ以下の表１に示すＣ８−
５ＯＤ−１，２，３，４，５又は６を得た。

表　　１＊未修飾ＳＯＤの活性に対する比率実施例６　　Ｈｅｐ修飾ＳＯＤの製造（還元末端酸化法
）（１）Ｈｅｐの還元末端の還元豚小腸由来のＨｅｐ　（分子量１５０００）５０００　
ｍ　ｇ　（０，３３３５ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素ナ
トリウム３１５　、４　ｍ　ｇ　（１８，３４ｍｍａｌ
ｌ　を用い、実施例４（１）と同様に処理して還元末端
還元Ｈｅｐを得た。

収量：　　４８３５ｍｇ５含量：１２．５７％（２）還元末端酸化Ｈｅｐ還元末端還元Ｈｅ　ｐ　４０００　ｍｇ　（０，２６６
７ｍｍｏｌ）及び過ヨウ素酸ナトリウム２２８　ｍｇ　
（１，０６７ｍｍａｌｌを用い、実施例４（２）と同様
に処理して還元末端酸化Ｈｅｐを得た。

収量：　　３７８５ｍｇ５含量：１２．６６％アルデヒド基：還元末端の６８％（３）Ｈｅｐ修飾ＳＯＤ還元末端酸化Ｈｅｐ　ｌ　００ｍｇを０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０）ｌ　Ｏｍｌに溶解し、つシ赤血球
由来のＳＯＤ６０ｍｇを加えて室温で２００時間反応せ
た。次いで、水素化シアノホウ素ナトリウム２０　ｍ　
ｇを加えて室温で２時間反応させた１反応液にエタノー
ルを加えて沈殿させ、沈殿物を水に溶解し再度エタノー
ルで沈殿させてＨｅｐ修飾ＳＯＤを得た。

収量：　　　　　１２０ｍｇ５ＯＤ含量：　　５５％Ｈｅｐ含量＝　４５％分子量：　　　　４３６００電気泳動；　　第１図参照ＳＯＤ活性：　未修飾ＳＯＤの８２．４％［α］。：　
　　１２．０　　（Ｃ＝１．　Ｈ，０）実施例７　　Ｈ
Ａ修飾ＳＯＤの製造（水溶性カルボジイミド縮合法）鶏冠由来のＨＡ（分子量１００万）を実施例１に準じて
大腸菌由来のＳＯＤ　（３０００Ｕ／ｍｇ蛋白）に結合
させた。

ＳＯＤ含量：１．００％ＨＡ含量：９９．００％分子量：　　　　１１０万ＳＯＤ活性：　未修飾５ＯＤ（７）４４．０９６［α］
　、　：　　　−６９，０（Ｃ＝１．　Ｈ，０１試験例
１　免疫学的活性の測定５ｗ１ｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ系雌性マウス４匹を１群と
して、腹腔内に週に１回１２週間、０．０５Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７，０（以下ｒＰＢＳＪという、）に溶解した
大腸菌由来のＳＯＤ又は実施例７で得たＨＡ修飾ＳＯＤ
　（以下ｒＨＡ−ＳＯＤ−７Ｊという、）を蛋白として
Ｏ，１ｍｇ分投与した。

Ｏ１３，６，９，１２週目に眼窩後の血管（ｒｅｔｒｏ
ｏｒｂｉｔａｌ　ｐｌｅｘｕｓ）から採血して一２０℃
に保存した。それぞれの血清はＶｏｌｌｅｒらの方法（
Ｉｎ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（Ｎ、Ｒ，Ｒｏｓｅａｎｄ　Ｈ，Ｆｒｉ
ｅｄｍａｎ、　ｅｄｓ、）、　ｐｐ、５０６−５１２．
　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（
１９７６１）に従い、ＨＰＯ（ホースラデイツシュペル
オキシダーゼ）ＥＬＩＳＡで力価を測定した。

即ち、抗原を炭酸塩緩衝液（０，５Ｍ、ｐＨ９，５）で
１０ｕｇ／ｍｌに希釈し、１００ｕ　ｌを用いた。プレ
ート（Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ　　Ｈｍ１ｃｒｏｔｉｔ
ｅｒｐｌａｔｅｓ）を４℃で一晩インキユベートし、ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎｌ入り生理食塩水（０，０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０）で３回洗浄した。試験に用いられる血清を
ツイーン（Ｔｗｅｅｎｌ　入りＰＢＳ　（０，０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０）で希釈し、１００μｌを加えた。３つの
コントロール、即ち、抗原コントロール、抗血清コント
ロール、正常マウスコントロールが作られたことになる
。室温で１時間インキュベートし、各々に１００μｍの
ＨＯＰ−結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ＋
Ｉ　ｇＡ＋Ｉ　ｇＭ）を加えて、室温で１時間３０分イ
ンキュベートした。０−フ二二レンジアミン基質１００
μｌを加えて１０分間インキュベートし、４Ｎ硫酸０．
０１ｍ１を加えて反応を中止した。力価は光学密度がコ
ントロールの血清を対照にして０．０１となるところの
希釈倍率で表した。

なお、デキストラン（分子量１２００００）を用いて実
施例　と同様に処理して得られる修飾ＳＯＤ　（以下ｒ
Ｄｅｘ−３ＯＤＪという、）にっいても同様の試験を行
った。結果を表２に示す。

表２＊抗体の希釈倍率で表現表２から、本発明の修飾酵素は、未修飾ＳＯＤ及びＤｅ
ｘ−ＳＯＤに比し抗原性が顕著に低いことがわかる。

試験例２　マウス虚血足浮腫に及ぼす影響Ｙ、　Ｏｙａ
ｎａｇｕｉらの方法（Ｆｒｅｅ　Ｒａｄ、　Ｒｅｓ、　
Ｃｏｍｍ５．。

４ｆ６）、　３８５−３９６１に準じて行った。

８週令のｄｄｙ系雄性マウスを保定器にて保定し、縫合
糸（プレイン２号）で右後肢を一周縛り、一方を固定し
、もう一方に５００ｇのオモリを吊して一定時間虚血を
行った。虚血前及び６０分後の足践厚をノギスで測定し
た。その後、足践を切断し足厳重量も測定した。−群５
匹を用い、投与群には、ウシ赤血球由来のＳＯＤ又は実
施例１で得た）ＩＡ−３ＯＤを虚血開始前３０分又は虚
血直前に、ＳＯＤは１００００単位／ｋｇ、ＨＡ−３Ｏ
Ｄは５００．２０００単位／ｋｇ投与した。なお、コン
トロール群には、生理食塩水を虚血直前に静注した。結
果を表３に示す。

表３＊　虚血足浮腫抑制率Ａ（４０以上が有効とされる。）＊＊　虚血足浮腫抑制率Ｂ ×１００（６０以上が有効とされる。）表３から明らかなように１本発明の修飾酵素は、未修飾
ＳＯＤに比し、活性単位で１／２０、蛋白量で１／１３
．４の量で虚血直前投与でほぼ同等の効果を示した。虚
血３０分前投与では未修飾ＳＯＤが効果を示さないのに
対し、本発明の修飾酵素は明らかに効果を示した。この
ことは、本発明の修飾酵素が血中で安定であり、持続性
を有することを示すものといえる。

試験例３　急性毒性試験実施例１〜４で得たＨＡ修飾ＳＯＤを生理食塩水に２％
溶解し、急性毒性試験を行った。被検動物としては４週
令の５ｌｃ−ｄｄｙ系雌雄マウスを用い、投与は最も毒
性が発現しやすい腹腔内投与により行った。

何れのＨＡ修飾ＳＯＤのＬＤ、。も２０００ｍ　ｇ　／
　ｋ　ｇ以上であった。

［発明の効果］本発明によれば、従来の多糖修飾ＳＯＤの欠点である抗
原性を低下させたＧＡＧ修飾ＳＯＤを提供することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、電気泳動の結果を示す図である。第１図にお
いて、Ａはクーマシーブルーで、Ｂはアルシアンブルー
及びトルイジンブルーで、それぞれ染色した場合を示す
。１・・・ウシ赤血球由来の５ＯＤ２・・・実施例１で得たＨＡ−５ＯＤ３・・・ヒト赤血球由来の５ＯＤ４・・・実施例２で得た）（Ａ−ＳＯＤ５・・・イヌ赤
血球由来の５ＯＤ６・・・実施例３で得たＨＡ−３ＯＤ７・・・実施例４で得たＨＡ−３ＯＤ８　・ＨＡ　＋　ＣＳ　＋　Ｈｅ　ｐ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）スーパーオキシドジスムターゼとグリコサミノグ
リカンとを化学的に結合させてなることを特徴とする修
飾酵素。
（２）スーパーオキシドジスムターゼとグリコサミノグ
リカンとを化学的に結合させることを特徴とする修飾酵
素の製造法。