JP4006058B2 - 多臓器不全予防及び／又は治療剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な多臓器不全予防及び／又は治療剤に関する。
本発明により、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行を予防し、あるいは治療することができる。
【０００２】
【従来の技術】
多臓器不全の発症あるいは増悪は、その要因からみると、
(1) 同一因子による、並列に数個の臓器障害の誘発、
(2) ある臓器の異常による、特定の臓器異常の誘発、
(3) 医源性因子の関与、
の３様式に大きく分類される。重度外傷や大きな手術による過度の侵襲、感染症、ショックなどは直接あるいは各種のメディエーターを介して(1) の様式で多臓器不全の発症、増悪に関与する。外傷による臓器障害や原発性の肝不全などに併発してみられる多臓器不全には、臓器相関の機序が働いた(2) の様式の関与が大きい。(3) は集中治療で行われる医療行為や、ある臓器障害への対応策が他の臓器へ障害性に働く様式である。しかし、実際の症例においては、これら３つの様式が絡み合いつつ病態の進行あるいは悪化に関与しているのが実状である。一般に多臓器不全の治療成績はきわめて不良であり、広範囲にわたる対応策をとっても、救命率は２０〜３０％と低いのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述の状況に鑑み、本発明者らは多臓器不全の予防及び／又は治療薬を求めて鋭意探索した結果、ヒト線維芽細胞由来の糖蛋白質である腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor cytotoxic factor−II; ＴＣＦ−II) またはヒト血液、特に劇症肝炎患者の血液由来の蛋白性物質である肝細胞増殖因子 (hepatocyte growth factor; ＨＧＦ）に熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカへキシー（悪液質）などを原因とする多臓器不全に対し、優れた予防及び／又は治療効果があることを見いだした。従って本発明は、ＴＣＦ−IIまたはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＣＦ−IIまたはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤に関する。
本発明の多臓器不全予防及び／又は治療剤は、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行の予防及び／又は治療に有用である。これらの多臓器不全は、熱傷、外科手術、化学物質（医薬を含む）の投与、放射線の照射、他の疾病との併発等によって生ずる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、本発明者らによって見出された、ヒト線維芽細胞由来の公知の蛋白質であり、下記の特性を有する。
上記ＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞培養液を濃縮しイオン交換体に吸着させ、その溶出液をアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製する方法（WO 90/10651 号公報）、或いは遺伝子工学的手法（WO 92/01053 号公報）によって得ることができる。
【０００６】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、線維芽細胞由来のものを用いることが可能であり、又、WO 90/10651 号公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や他の細胞より遺伝子組換え操作により生産されたものでもよい。又、WO 92/01053 号公報に開示された遺伝子工学的手法により得られたものを用いてもよい。この時、宿主細胞又は微生物の違いによる糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合していないものであっても使用可能である。しかし、糖鎖は生体内の代謝速度に関係しているため、糖鎖の結合しているものを用いることが望ましい。これらの方法により得られたＴＣＦ−IIは、通常の単離精製法によってさらに濃縮、精製することができる。例えば、有機溶媒による沈殿法、塩析、ゲル濾過、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法等が挙げられる。モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトによる精製は、特開平5-97号公報に開示されているモノクローナル抗体を用いて精製することができる。得られた精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥或いは凍結保存することができる。
その他、ＴＣＦ−IIと同様の活性を有するものであれば、本発明と同様の薬剤として利用可能である。例えば、ＴＣＦ−II蛋白質に５個のアミノ酸が挿入された肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；特開昭63-22526号）、あるいは精製Scatter Factor (ＳＦ；Gherardi and Stocker, Nature, 346, 228 (1990))などが挙げられる。
【０００７】
また、本発明の有効成分のＨＧＦは、肝細胞を増殖させる活性を有し、劇症肝炎患者の血液から単離された、下記の特性を有する公知の蛋白性物質である（特許第 2564486号明細書)。
i) 分子量(SDS-PAGE)；非還元下；76,000〜92,000
ii) 前記活性は56℃、15分間の加熱では失活せず、80℃、10分間の加熱により失活する、
iii) トリプシンあるいはキモトリプシン消化により前記活性が失活する、
iv) ヘパリンに強い親和性を有する。
このＨＧＦは、血漿を56℃程度で約15分間加熱し、硫安濃度約 1.1〜1.2Mの沈澱区分を取得し、これをゲルろ過、ＤＥＡＥ等陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーで精製して得ることができる。また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【０００８】
本発明の多臓器不全予防及び／又は治療剤は、注射剤として静脈、筋肉内、及び皮下に投与することができる。これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ製造され、必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を添加することができる。本発明の製剤を患者に投与する場合、投与患者の症状の程度、健康状態、年齢、体重等の条件によって異なり、特に限定されないが、成人１日当たり精製ＴＣＦ−IIとして 0.6mg〜600mg 、好ましくは 6mg〜60mgを含有する製剤を１日１回若しくはそれ以上投与すれば良い。また、同様にＨＧＦにおいてもこの程度の量を同様に投与すれば良い。
このように投与することにより、前記要因に基づく種々の多臓器不全を予防、あるいは症状を軽減し、さらに治療することができる。
【０００９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。しかし、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】
ＴＣＦ− II の精製
WO 90/10651 号公報に開示された方法及び東尾らの方法（Higashio, K. et al, B.B.R.C., vol.170, pp397-404 (1990))に準じて細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。即ち、ヒト繊維芽細胞ＩＭＲ−90 (ATCC CCL 186) 細胞を５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地 100mlをいれたローラーボトルに 3×106 個移植し、 0.5〜２回転／分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が 1×107 個になったところでトリプシンにより細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミック100g (東芝セラミック社）を殺菌して投入し、24時間静置して培養した。その後、上記培養液を 500ml加え、培養を継続した。７〜10日ごとに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このようにして２ヵ月間生産を継続し、ローラーボトル一本当たり4Lの培養液を回収した。このようにして得た培養液当たりの比活性は32μg/mlであった。培養液750Lをメンブランフィルター(MW 6000カット；アミコン社）処理によりＵＦ濃縮し、CMセファデックス C-50(ファルマシア社）、Con-A セファロース（ファルマシア社）、Mono Sカラム（ファルマシア社）、ヘパリンセファロース（ファルマシア社）による５段階のクロマト精製を行い、精製ＴＣＦ−IIを得た。この精製ＴＣＦ−IIは、前記した分子量、等電点を示す。
【００１１】
【実施例２】
遺伝子組換えＴＣＦ− II の生産
WO 92/01053 号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ−II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。即ち、形質転換ナマルワ(Namalwa) 細胞を培養し、培養液20L を得た。この培養液を CM-セファデックスC-50クロマト（ファルマシア社）、Con-A セファロース CL-6Bクロマト（ファルマシア社）、Mono Sカラム（ファルマシア社）を装着したＨＰＬＣの順に処理を行い、約11mgの遺伝子組換え型ＴＣＦ−IIを得た。このＴＣＦ−IIも前記と同様の分子量、等電点を示す。
【００１２】
【実施例３】
遺伝子組換えＨＧＦの生産
ＨＧＦｃＤＮＡの発現ベクターは、プラスミドpcDNA1のNheI部位にマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）転写単位、2.4kb 断片を挿入し、さらにMiyazawaらによりクローニングされたＨＧＦｃＤＮＡ (BBRC 163, 967-973, 1989) 2.3kbをサイトメガロウイルス（CMV)プロモーターの下流に挿入して構築した。構築したＨＧＦｃＤＮＡ発現ベクター10μg とpSV2 neo 1μg をリポフェチンによるリポソーム介在トランスフェクション法によりナマルワ（Namalwa)細胞にコトランスフェクションした。形質転換した細胞をG418耐性により選別した後、続いてメトレキセート（MTX)により遺伝子増幅した。ＨＧＦ高生産株を2Lローラーボトルを用い、5 ％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地1Lで37℃、 7日間培養した。約20本のローラーボトル培養（回転数約2 回／分) を実施し、約21L の培養液を得た。このようにして得られた培養液は、4mg/L のＨＧＦを含んでいた。ＨＧＦを含む培養液20L について、東尾らの方法（Higashio et al., BBRC vol. 170, 397-404, 1990) を若干改変し、CMセファデックスC-50（ファルマシア社) 、Mono Sカラム（ファルマシア社）、ヘパリン5-PW（東ソー社）のFPLCによる3 段階のクロマト精製を行い、SDS-電気泳動的に均一な精製ＨＧＦを約60％の収率で得た。
【００１３】
【実施例４】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）に実施例２で得られたＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒（前記pH6.03のクエン酸緩衝液、以下同じ）のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のエンドトキシン（LPS-E. coli; 20mg/kg、ディフコラボラトリーズ社）を静脈内投与した。生存率を図１に示す。溶媒投与群では４日以後の生存率が12％ (3/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では56％(14/25匹）が生存した（図１）。この結果より、ＴＣＦ−IIがエンドトキシンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１４】
【実施例５】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群15匹）に実施例３で得られたＨＧＦ(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒（クエン酸緩衝液 pH 6.03 ）のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のエンドトキシン（LPS-E. coli; 20mg/kg、ディフコラボラトリーズ社）を静脈内投与した。生存率の結果を図２に示す。この結果、溶媒投与群では４日目以降の生存率が13％（2/15匹）であったのに対し、ＨＧＦ１mg/kg 投与群の生存率は、33％（5/15匹）であった。この結果より、ＨＧＦがエンドトキシンにより誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１５】
【実施例６】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
６週齢の Wistar 系雄ラットに浸透圧ポンプ（モデル I2001、Alzet 社）を用いてエンドトキシン（LPS-E. coli; 10mg/kg/日、ディフコラボラトリーズ社）を持続注入し、多臓器不全を発症させた。発症後群分け（１群９匹）し、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日１回７日間静脈内投与した。最終投与終了翌日のラットの臨床検査値を表１に示す。溶媒投与群では総蛋白、アルブミン、プラスミノーゲン及び総コレステロールが低下しカへキシー状態を示したが、ＴＣＦ−II投与群では有意にこれらの値が改善した（表１）。この結果より、ＴＣＦ−IIがエンドトキシンにより誘発されるカヘキシーを原因とする多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【実施例７】
ジメチルニトロサミン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）にＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量の0.15％ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ)(溶媒：生理食塩水、0.1ml/10g 体重、東京化成工業社）を静脈内投与した。発症２４時間後のマウスの臨床検査値の結果を表２に、及び生存率の結果を図３に示す。溶媒投与群はＧＯＴ及びＧＰＴの異常な上昇、及び血液凝固時間の延長がみられたが、ＴＣＦ−II投与群では有意にこれを抑制した（表２）。又、溶媒投与群では４日以後は全例が死亡したのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した（図３）。この結果より、ＴＣＦ−IIがジメチルニトロサミンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【実施例８】
薬物中毒を原発とした多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）に、ＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のチオアセタミド (600mg/kg、和光純薬工業社）、及びアセトアミノフェン (800mg/kg、シグマ社）を投与した。生存率の結果を図４及び図５に示す。この結果、チオアセタミド試験において、溶媒投与群ではチオアセタミド処置４日以降の生存率は12％ (3/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では92％(23/25匹）が生存した。又、アセトアミノフェン試験において、溶媒投与群ではアセトアミノフェン処置翌日に68％(17/25匹）が死亡したのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した。この結果より、ＴＣＦ−IIがチオアセタミド、及びアセトアミノフェンなどの薬物により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２０】
【実施例９】
塩化第二水銀による腎不全を原発障害とする多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）にＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量の塩化第二水銀（和光純薬工業社）を静脈内投与した。生存率の結果を図６に示す。溶媒投与群では４日以後の生存率は８％ (2/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した（図６）。この結果より、ＴＣＦ−IIが塩化第二水銀による腎不全に誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２１】
【実施例１０】
トリプシン誘発多臓器不全に対する防御効果
８週齢の Wistar 系雄ラットに、溶媒（１群55匹）又はＴＣＦ−II 1mg/kg(１群35匹）を１日２回５日間（計10回）静脈内投与し、最終投与翌日に致死量のトリプシン（シグマ社；50000U/ml)とタウロコール酸（三光純薬社；100mg/ml) との混合液0.16mlを総胆管より膵臓に向けて注入した。生存率の結果を図７に示す。溶媒投与群では６日以後の生存率は、５％ (3/55匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は29％(10/35匹）であった（図７）。この結果より、ＴＣＦ−IIがトリプシンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２２】
【実施例１１】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢の Wistar 系雄ラット（１群50匹）に、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日２回６日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。最終投与６時間後、剃毛した背部に加熱プレート（岩城硝子社）で25％熱傷(250℃、30秒）を作製した。生存率を図８に示す。又、熱傷処置４時間後のラットの臨床検査値を表３に示す。25％熱傷を受けたラット（熱傷処置４時間後）において、循環血漿量の減少（Ｈｔ値上昇、総蛋白減少、アルブミン減少）、肝腎障害（ＧＰＴ上昇、ＢＵＮ上昇）が見られ、熱傷ショックによる多臓器不全が起きていることが確認された（表３）。又、溶媒投与群の６日以後の生存率は、12％ (6/50匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は、40％(20/50匹）であった（図８）。これらの結果より、ＴＣＦ−IIが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２３】
【表３】
────────────────────────────────
検査項目 熱傷処置前 熱傷処置４時間後
────────────────────────────────
ヘマトクリット値（％） 44.8 ± 1.8 53.9 ± 3.6
総蛋白（g/dl) 7.2 ± 0.5 5.8 ± 0.7
アルブミン（g/dl) 3.1 ± 0.2 2.4 ± 0.3
ＧＰＴ (U/L) 20.5 ± 5.8 150.0 ± 30.4
尿素窒素 (mg/dl) 21.5 ± 1.9 43.5 ± 7.3
────────────────────────────────
【００２４】
【実施例１２】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
９週齢の Wistar 系雄ラットに85℃の熱湯で40％熱傷を作製した。熱傷後、１群27匹に群分けし、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日３回３日間（計９回）静脈内投与した。生存率を図９に示す。溶媒投与群の８日以後の生存率は37％(10/27匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は67％ (18/27 匹）であった。これらの結果より、ＴＣＦ−IIが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２５】
【実施例１３】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
９週齢のWistar系雄ラットに85℃の熱湯で40％熱傷を作製した。熱傷後、１群10匹に群分けし、溶媒又はＨＧＦ 1mg/kg を１日３回３日間（計９回）静脈内投与した。生存率を図10に示す。溶媒投与群の11日目以降の生存率は20％（2/10匹）であったのに対し、ＨＧＦ 1mg/kg 投与群の生存率は40％（4/10匹）であった。この結果より、ＨＧＦが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２６】
【実施例１４】
ＴＣＦ− II 製剤の製造
実施例２により得られた遺伝子組換えＴＣＦ−IIの注射剤の製造例を示す。
上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液(10mM クエン酸ナトリウム、0.3M食塩、0.03％ポリソルベートより構成される）に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２７】
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２８】
上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００２９】
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３０】
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３１】
上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３２】
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３３】
上記組成をpH6.03のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３４】
【実施例１５】
ＨＧＦ製剤の製造
実施例３により得られた遺伝子組換えＨＧＦの注射剤の製造例を示す。
上記組成をpH6.08のクエン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に２mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３５】
上記組成を注射用生理食塩水に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に2 mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３６】
上記組成を pH7.0の 0.01Mリン酸緩衝液に溶解し全量を20mlに調製し、滅菌後バイアル瓶に20mlづつ分注したものを凍結乾燥後密封した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によりＴＣＦ−IIあるいはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤が提供される。本発明の、多臓器不全予防及び／又は治療剤は、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行を予防及び／又は治療するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＣＦ−IIのエンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図２】ＨＧＦのエンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＨＧＦ投与群
●：溶媒投与群
【図３】ＴＣＦ−IIのジメチルニトロサミン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図４】ＴＣＦ−IIの薬物中毒（チオアセタミド）を原発とした多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図５】ＴＣＦ−IIの薬物中毒（アセトアミノフェン）を原発とした多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図６】ＴＣＦ−IIの塩化第二水銀による腎不全を原発障害とする多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図７】ＴＣＦ−IIのトリプシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図８】実施例９のＴＣＦ−IIの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図９】実施例１４のＴＣＦ−IIの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図１０】ＨＧＦの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＨＧＦ投与群
●：溶媒投与群
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な多臓器不全予防及び／又は治療剤に関する。
本発明により、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行を予防し、あるいは治療することができる。
【０００２】
【従来の技術】
多臓器不全の発症あるいは増悪は、その要因からみると、
(1) 同一因子による、並列に数個の臓器障害の誘発、
(2) ある臓器の異常による、特定の臓器異常の誘発、
(3) 医源性因子の関与、
の３様式に大きく分類される。重度外傷や大きな手術による過度の侵襲、感染症、ショックなどは直接あるいは各種のメディエーターを介して(1) の様式で多臓器不全の発症、増悪に関与する。外傷による臓器障害や原発性の肝不全などに併発してみられる多臓器不全には、臓器相関の機序が働いた(2) の様式の関与が大きい。(3) は集中治療で行われる医療行為や、ある臓器障害への対応策が他の臓器へ障害性に働く様式である。しかし、実際の症例においては、これら３つの様式が絡み合いつつ病態の進行あるいは悪化に関与しているのが実状である。一般に多臓器不全の治療成績はきわめて不良であり、広範囲にわたる対応策をとっても、救命率は２０〜３０％と低いのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述の状況に鑑み、本発明者らは多臓器不全の予防及び／又は治療薬を求めて鋭意探索した結果、ヒト線維芽細胞由来の糖蛋白質である腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor cytotoxic factor−II; ＴＣＦ−II) またはヒト血液、特に劇症肝炎患者の血液由来の蛋白性物質である肝細胞増殖因子 (hepatocyte growth factor; ＨＧＦ）に熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカへキシー（悪液質）などを原因とする多臓器不全に対し、優れた予防及び／又は治療効果があることを見いだした。従って本発明は、ＴＣＦ−IIまたはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＴＣＦ−IIまたはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤に関する。
本発明の多臓器不全予防及び／又は治療剤は、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行の予防及び／又は治療に有用である。これらの多臓器不全は、熱傷、外科手術、化学物質（医薬を含む）の投与、放射線の照射、他の疾病との併発等によって生ずる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、本発明者らによって見出された、ヒト線維芽細胞由来の公知の蛋白質であり、下記の特性を有する。
【０００６】
本発明の有効成分であるＴＣＦ−IIは、線維芽細胞由来のものを用いることが可能であり、又、WO 90/10651 号公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や他の細胞より遺伝子組換え操作により生産されたものでもよい。又、WO 92/01053 号公報に開示された遺伝子工学的手法により得られたものを用いてもよい。この時、宿主細胞又は微生物の違いによる糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合していないものであっても使用可能である。しかし、糖鎖は生体内の代謝速度に関係しているため、糖鎖の結合しているものを用いることが望ましい。これらの方法により得られたＴＣＦ−IIは、通常の単離精製法によってさらに濃縮、精製することができる。例えば、有機溶媒による沈殿法、塩析、ゲル濾過、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法等が挙げられる。モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトによる精製は、特開平5-97号公報に開示されているモノクローナル抗体を用いて精製することができる。得られた精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥或いは凍結保存することができる。
その他、ＴＣＦ−IIと同様の活性を有するものであれば、本発明と同様の薬剤として利用可能である。例えば、ＴＣＦ−II蛋白質に５個のアミノ酸が挿入された肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；特開昭63-22526号）、あるいは精製Scatter Factor (ＳＦ；Gherardi and Stocker, Nature, 346, 228 (1990))などが挙げられる。
【０００７】
また、本発明の有効成分のＨＧＦは、肝細胞を増殖させる活性を有し、劇症肝炎患者の血液から単離された、下記の特性を有する公知の蛋白性物質である（特許第 2564486号明細書)。
i) 分子量(SDS-PAGE)；非還元下；76,000〜92,000
ii) 前記活性は56℃、15分間の加熱では失活せず、80℃、10分間の加熱により失活する、
iii) トリプシンあるいはキモトリプシン消化により前記活性が失活する、
iv) ヘパリンに強い親和性を有する。
このＨＧＦは、血漿を56℃程度で約15分間加熱し、硫安濃度約 1.1〜1.2Mの沈澱区分を取得し、これをゲルろ過、ＤＥＡＥ等陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィーで精製して得ることができる。また遺伝子工学的手法によっても得ることができる。
【０００８】
本発明の多臓器不全予防及び／又は治療剤は、注射剤として静脈、筋肉内、及び皮下に投与することができる。これらの製剤は公知の製剤学的製法に準じ製造され、必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を添加することができる。本発明の製剤を患者に投与する場合、投与患者の症状の程度、健康状態、年齢、体重等の条件によって異なり、特に限定されないが、成人１日当たり精製ＴＣＦ−IIとして 0.6mg〜600mg 、好ましくは 6mg〜60mgを含有する製剤を１日１回若しくはそれ以上投与すれば良い。また、同様にＨＧＦにおいてもこの程度の量を同様に投与すれば良い。
このように投与することにより、前記要因に基づく種々の多臓器不全を予防、あるいは症状を軽減し、さらに治療することができる。
【０００９】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。しかし、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】
ＴＣＦ− II の精製
WO 90/10651 号公報に開示された方法及び東尾らの方法（Higashio, K. et al, B.B.R.C., vol.170, pp397-404 (1990))に準じて細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。即ち、ヒト繊維芽細胞ＩＭＲ−90 (ATCC CCL 186) 細胞を５％仔牛血清を含むＤＭＥＭ培地 100mlをいれたローラーボトルに 3×106 個移植し、 0.5〜２回転／分の回転速度で回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が 1×107 個になったところでトリプシンにより細胞を剥離し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミック100g (東芝セラミック社）を殺菌して投入し、24時間静置して培養した。その後、上記培養液を 500ml加え、培養を継続した。７〜10日ごとに培地を全量回収し、新鮮培地を補給した。このようにして２ヵ月間生産を継続し、ローラーボトル一本当たり4Lの培養液を回収した。このようにして得た培養液当たりの比活性は32μg/mlであった。培養液750Lをメンブランフィルター(MW 6000カット；アミコン社）処理によりＵＦ濃縮し、CMセファデックス C-50(ファルマシア社）、Con-A セファロース（ファルマシア社）、Mono Sカラム（ファルマシア社）、ヘパリンセファロース（ファルマシア社）による５段階のクロマト精製を行い、精製ＴＣＦ−IIを得た。この精製ＴＣＦ−IIは、前記した分子量、等電点を示す。
【００１１】
【実施例２】
遺伝子組換えＴＣＦ− II の生産
WO 92/01053 号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ−II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを得た。即ち、形質転換ナマルワ(Namalwa) 細胞を培養し、培養液20L を得た。この培養液を CM-セファデックスC-50クロマト（ファルマシア社）、Con-A セファロース CL-6Bクロマト（ファルマシア社）、Mono Sカラム（ファルマシア社）を装着したＨＰＬＣの順に処理を行い、約11mgの遺伝子組換え型ＴＣＦ−IIを得た。このＴＣＦ−IIも前記と同様の分子量、等電点を示す。
【００１２】
【実施例３】
遺伝子組換えＨＧＦの生産
ＨＧＦｃＤＮＡの発現ベクターは、プラスミドpcDNA1のNheI部位にマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）転写単位、2.4kb 断片を挿入し、さらにMiyazawaらによりクローニングされたＨＧＦｃＤＮＡ (BBRC 163, 967-973, 1989) 2.3kbをサイトメガロウイルス（CMV)プロモーターの下流に挿入して構築した。構築したＨＧＦｃＤＮＡ発現ベクター10μg とpSV2 neo 1μg をリポフェチンによるリポソーム介在トランスフェクション法によりナマルワ（Namalwa)細胞にコトランスフェクションした。形質転換した細胞をG418耐性により選別した後、続いてメトレキセート（MTX)により遺伝子増幅した。ＨＧＦ高生産株を2Lローラーボトルを用い、5 ％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地1Lで37℃、 7日間培養した。約20本のローラーボトル培養（回転数約2 回／分) を実施し、約21L の培養液を得た。このようにして得られた培養液は、4mg/L のＨＧＦを含んでいた。ＨＧＦを含む培養液20L について、東尾らの方法（Higashio et al., BBRC vol. 170, 397-404, 1990) を若干改変し、CMセファデックスC-50（ファルマシア社) 、Mono Sカラム（ファルマシア社）、ヘパリン5-PW（東ソー社）のFPLCによる3 段階のクロマト精製を行い、SDS-電気泳動的に均一な精製ＨＧＦを約60％の収率で得た。
【００１３】
【実施例４】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）に実施例２で得られたＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒（前記pH6.03のクエン酸緩衝液、以下同じ）のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のエンドトキシン（LPS-E. coli; 20mg/kg、ディフコラボラトリーズ社）を静脈内投与した。生存率を図１に示す。溶媒投与群では４日以後の生存率が12％ (3/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では56％(14/25匹）が生存した（図１）。この結果より、ＴＣＦ−IIがエンドトキシンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１４】
【実施例５】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群15匹）に実施例３で得られたＨＧＦ(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒（クエン酸緩衝液 pH 6.03 ）のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のエンドトキシン（LPS-E. coli; 20mg/kg、ディフコラボラトリーズ社）を静脈内投与した。生存率の結果を図２に示す。この結果、溶媒投与群では４日目以降の生存率が13％（2/15匹）であったのに対し、ＨＧＦ１mg/kg 投与群の生存率は、33％（5/15匹）であった。この結果より、ＨＧＦがエンドトキシンにより誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１５】
【実施例６】
エンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果
６週齢の Wistar 系雄ラットに浸透圧ポンプ（モデル I2001、Alzet 社）を用いてエンドトキシン（LPS-E. coli; 10mg/kg/日、ディフコラボラトリーズ社）を持続注入し、多臓器不全を発症させた。発症後群分け（１群９匹）し、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日１回７日間静脈内投与した。最終投与終了翌日のラットの臨床検査値を表１に示す。溶媒投与群では総蛋白、アルブミン、プラスミノーゲン及び総コレステロールが低下しカへキシー状態を示したが、ＴＣＦ−II投与群では有意にこれらの値が改善した（表１）。この結果より、ＴＣＦ−IIがエンドトキシンにより誘発されるカヘキシーを原因とする多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１６】
【表１】
【実施例７】
ジメチルニトロサミン誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）にＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量の0.15％ジメチルニトロサミン（ＤＭＮ)(溶媒：生理食塩水、0.1ml/10g 体重、東京化成工業社）を静脈内投与した。発症２４時間後のマウスの臨床検査値の結果を表２に、及び生存率の結果を図３に示す。溶媒投与群はＧＯＴ及びＧＰＴの異常な上昇、及び血液凝固時間の延長がみられたが、ＴＣＦ−II投与群では有意にこれを抑制した（表２）。又、溶媒投与群では４日以後は全例が死亡したのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した（図３）。この結果より、ＴＣＦ−IIがジメチルニトロサミンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００１８】
【表２】
【実施例８】
薬物中毒を原発とした多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）に、ＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量のチオアセタミド (600mg/kg、和光純薬工業社）、及びアセトアミノフェン (800mg/kg、シグマ社）を投与した。生存率の結果を図４及び図５に示す。この結果、チオアセタミド試験において、溶媒投与群ではチオアセタミド処置４日以降の生存率は12％ (3/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では92％(23/25匹）が生存した。又、アセトアミノフェン試験において、溶媒投与群ではアセトアミノフェン処置翌日に68％(17/25匹）が死亡したのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した。この結果より、ＴＣＦ−IIがチオアセタミド、及びアセトアミノフェンなどの薬物により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２０】
【実施例９】
塩化第二水銀による腎不全を原発障害とする多臓器不全に対する防御効果
７週齢のＩＣＲ系雄マウス（１群25匹）にＴＣＦ−II(100μg/匹）を１日２回５日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。又、対照として、溶媒のみを投与した群をおいた。最終投与６時間後に、致死量の塩化第二水銀（和光純薬工業社）を静脈内投与した。生存率の結果を図６に示す。溶媒投与群では４日以後の生存率は８％ (2/25匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群では全例が生存した（図６）。この結果より、ＴＣＦ−IIが塩化第二水銀による腎不全に誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２１】
【実施例１０】
トリプシン誘発多臓器不全に対する防御効果
８週齢の Wistar 系雄ラットに、溶媒（１群55匹）又はＴＣＦ−II 1mg/kg(１群35匹）を１日２回５日間（計10回）静脈内投与し、最終投与翌日に致死量のトリプシン（シグマ社；50000U/ml)とタウロコール酸（三光純薬社；100mg/ml) との混合液0.16mlを総胆管より膵臓に向けて注入した。生存率の結果を図７に示す。溶媒投与群では６日以後の生存率は、５％ (3/55匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は29％(10/35匹）であった（図７）。この結果より、ＴＣＦ−IIがトリプシンに誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２２】
【実施例１１】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
７週齢の Wistar 系雄ラット（１群50匹）に、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日２回６日間（但し最終日のみ１回投与）静脈内投与した。最終投与６時間後、剃毛した背部に加熱プレート（岩城硝子社）で25％熱傷(250℃、30秒）を作製した。生存率を図８に示す。又、熱傷処置４時間後のラットの臨床検査値を表３に示す。25％熱傷を受けたラット（熱傷処置４時間後）において、循環血漿量の減少（Ｈｔ値上昇、総蛋白減少、アルブミン減少）、肝腎障害（ＧＰＴ上昇、ＢＵＮ上昇）が見られ、熱傷ショックによる多臓器不全が起きていることが確認された（表３）。又、溶媒投与群の６日以後の生存率は、12％ (6/50匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は、40％(20/50匹）であった（図８）。これらの結果より、ＴＣＦ−IIが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２３】
【表３】
────────────────────────────────
検査項目 熱傷処置前 熱傷処置４時間後
────────────────────────────────
ヘマトクリット値（％） 44.8 ± 1.8 53.9 ± 3.6
総蛋白（g/dl) 7.2 ± 0.5 5.8 ± 0.7
アルブミン（g/dl) 3.1 ± 0.2 2.4 ± 0.3
ＧＰＴ (U/L) 20.5 ± 5.8 150.0 ± 30.4
尿素窒素 (mg/dl) 21.5 ± 1.9 43.5 ± 7.3
────────────────────────────────
【００２４】
【実施例１２】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
９週齢の Wistar 系雄ラットに85℃の熱湯で40％熱傷を作製した。熱傷後、１群27匹に群分けし、溶媒又はＴＣＦ−II 1mg/kg を１日３回３日間（計９回）静脈内投与した。生存率を図９に示す。溶媒投与群の８日以後の生存率は37％(10/27匹）であったのに対し、ＴＣＦ−II投与群の生存率は67％ (18/27 匹）であった。これらの結果より、ＴＣＦ−IIが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２５】
【実施例１３】
熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果
９週齢のWistar系雄ラットに85℃の熱湯で40％熱傷を作製した。熱傷後、１群10匹に群分けし、溶媒又はＨＧＦ 1mg/kg を１日３回３日間（計９回）静脈内投与した。生存率を図10に示す。溶媒投与群の11日目以降の生存率は20％（2/10匹）であったのに対し、ＨＧＦ 1mg/kg 投与群の生存率は40％（4/10匹）であった。この結果より、ＨＧＦが熱傷により誘発される多臓器不全に対し、優れた防御効果を有することが確認された。
【００２６】
【実施例１４】
ＴＣＦ− II 製剤の製造
実施例２により得られた遺伝子組換えＴＣＦ−IIの注射剤の製造例を示す。
【００２７】
【００２８】
【００２９】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【実施例１５】
ＨＧＦ製剤の製造
実施例３により得られた遺伝子組換えＨＧＦの注射剤の製造例を示す。
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【発明の効果】
本発明によりＴＣＦ−IIあるいはＨＧＦを有効成分とする多臓器不全予防及び／又は治療剤が提供される。本発明の、多臓器不全予防及び／又は治療剤は、熱傷、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、循環不全、出血性ショック、感染症、急性膵炎、虚血性障害、肝腎症候群、消化管出血、栄養代謝不全、末期癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、放射線障害などによる全身状態の悪化、及びカヘキシー（悪液質）などからの多臓器不全への進行を予防及び／又は治療するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＣＦ−IIのエンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図２】ＨＧＦのエンドトキシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＨＧＦ投与群
●：溶媒投与群
【図３】ＴＣＦ−IIのジメチルニトロサミン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図４】ＴＣＦ−IIの薬物中毒（チオアセタミド）を原発とした多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図５】ＴＣＦ−IIの薬物中毒（アセトアミノフェン）を原発とした多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図６】ＴＣＦ−IIの塩化第二水銀による腎不全を原発障害とする多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図７】ＴＣＦ−IIのトリプシン誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図８】実施例９のＴＣＦ−IIの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図９】実施例１４のＴＣＦ−IIの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＴＣＦ−II投与群
●：溶媒投与群
【図１０】ＨＧＦの熱傷誘発多臓器不全に対する防御効果を示す。
【符号の説明】
○：ＨＧＦ投与群
●：溶媒投与群
Claims (1)
- 腫瘍細胞壊死因子−II（Tumor cytotoxic factor−II;ＴＣＦ−II)又は肝細胞増殖因子 (Hepatocyte growth factor; ＨＧＦ )を有効成分とする、熱傷を原因とする多臓器不全治療剤。
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