JPH0640935A

JPH0640935A - Ｔｃｆ−ｉｉを有効成分とする蛋白合成促進剤

Info

Publication number: JPH0640935A
Application number: JP4212229A
Authority: JP
Inventors: Hiroaki Masunaga; 博明升永
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-07-16
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 1994-02-15
Anticipated expiration: 2018-02-24
Also published as: JP3380573B2

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト線維芽細胞由来の糖蛋白、ＴＣＦ−IIを
有効成分とする低蛋白血症治療用蛋白合成促進剤。【効果】本発明の低蛋白血症治療用蛋白合成促進剤
は、ＴＣＦ−IIを有効成分とすることによって、肝障害
性、腎不全による漏出性あるいは低栄養性による低蛋白
血症を有効に治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト線維芽細胞の生産す
る糖蛋白質、ＴＣＦ−IIを有効成分とする低蛋白血症治
療用蛋白合成促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト由来の線維芽細胞が生産する生理活
性物質、例えば腫瘍細胞障害性因子としてβ−インター
フェロンが存在することは広く知られている。またこの
β−インターフェロン以外にも線維芽細胞が生産する生
理活性物質としては特開昭58−146293号公報に記載のＣ
ＢＦとよばれる腫瘍細胞障害性糖蛋白質、特開昭61−33
120 号公報記載の分子量35,000〜45,000の腫瘍増殖阻害
因子（ＩＮＦ）、特開昭61−1872号公報記載の腫瘍壊死
因子ＦＮＦ、62−103021号公報記載の分子量40,000〜6
0,000、等電点ｐＨ5.0 ±0.5 の細胞障害作用を有する
生理活性物質、特開昭64−10998 号公報記載のヒト由来
の線維芽細胞の培養上澄みから得られる分子量36,000±
1,000 、等電点10.5以上で特定のアミノ酸配列を示す腫
瘍細胞障害因子等が知られている。本発明者らはヒト線
維芽細胞由来の抗腫瘍性蛋白質を研究する過程におい
て、これまで報告されたこれらの蛋白質と全く異なる新
規な抗腫瘍性物質を発見し、さらにこの蛋白質をコード
するｃＤＮＡのクローニングに成功し、その全アミノ酸
配列を確定するとともに、有用性を確認した。この新規
な抗腫瘍性蛋白質とその遺伝子は、本出願人によって出
願され、国際公開90/10651号として公開されている。こ
の新規抗腫瘍性蛋白質はＴＣＦ−IIと命名されている。
このＴＣＦ−IIは強い抗腫瘍活性と正常細胞の増殖活性
を合わせもち、さらに肝臓実質細胞の増殖因子であるＨ
ＧＦの多様なファミリーの一種であることが確認され
た。ＴＣＦ−IIはＳＤＳ電気泳動による分子量測定では
78,000±2,000 または74,000±2,000 の分子量を示し、
還元した場合52,000±2,000 の共通のバンド（Ａ鎖）と
30,000±2,000 または26,000±2,000 の２本のバンド
（Ｂ鎖、Ｃ鎖）とを示す。

【０００３】ＴＣＦ−IIは肝臓実質細胞の増殖因子であ
ることから肝切除後の肝臓再生を目的とした利用が可能
であるが、肝障害や、腎不全、低栄養に伴う低蛋白血症
の改善や、治療効果を有することはこれまで知られてい
なかった。血漿蛋白は80種以上におよぶ多数の蛋白質か
ら構成され、その分子量は大部分が４万〜100 万の範囲
にあり、糖質あるいは脂質と結合して複合蛋白を構成し
ているものが多い。これらの血漿蛋白は血液凝固因子、
免疫グロブリン、補体、酵素などとして重要な生理的意
義をもつとともに、血漿膠質浸透圧の維持に関係し、末
梢組織における物質交換にあずかっている。免疫グロブ
リン以外の血漿蛋白の大部分は肝臓で合成され、血中に
分泌されたのち、血管内に存在するのみでなく、組織
液、体腔液など血管外にも広く分布し、リンパ液などを
介して活発に血管内外で交流が行われている。また、各
蛋白の異化はおもに胃腸管、腎臓、呼吸器、生殖器、涙
液などの分泌液や排泄液への漏出と、肝臓および細網内
皮系における崩壊により行われる。おもな血漿蛋白の半
減期は２〜20日前後のものが多い。臨床的に問題とされ
る低蛋白血症は、潰瘍、血尿等を含む広範囲の出血、ネ
フローゼを含む全ての肝疾患による蛋白合成機能の低
下、多臓器不全、悪性腫瘍、感染症、糖尿病、妊娠中毒
症等の低栄養状態に伴う血漿蛋白の損耗、生産低下等の
諸要因が複合的に関与して発症する。これまで上記低蛋
白血症の治療法としては、アルブミン製剤の静脈投与な
どが行なわれてきたが、この治療法は、一時的な改善を
もたらすが、完全に治療することができず、低蛋白血症
の有効な治療方法は見いだされなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはＴＣＦ─
IIの生理活性に注目し、抗腫瘍剤としての利用や疾病の
診断のマーカーとしての利用を検討してきた。さらに、
本発明者らは、ＴＣＦ−IIの肝臓に対する作用を研究す
る過程から、ＴＣＦ−IIが単に肝実質細胞の増殖をもた
らすだけでなく、種々の低蛋白血症に対し治療効果を有
する事を見いだした。これまで、ＴＣＦ−IIが播種血管
内凝固症候群（ＤＩＣ）など血液凝固異常に対して有効
であることは確証されておらず、本発明者によりＴＣＦ
−IIが低蛋白血症に対し治療効果を見出したことは驚く
べきことである。本発明は、ＴＣＦ−IIを有効成分とす
る治療効果の高い低蛋白血症治療用蛋白合成促進剤を提
供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＴＣＦ−IIを
有効成分とする低蛋白血症治療用蛋白合成促進剤に関す
る。本発明の有効成分は、前記したようにヒト線維芽細
胞由来の公知の糖蛋白質である。このＴＣＦ−IIは、Ｓ
ＤＳ電気泳動法による分子量測定で、非還元では78,000
±2,000 又は74,000±2,000 であり、還元下では52,000
±2,000 の共通バンドＡと、30,000±2,000 のバンドＢ
及び26,000±2,000 Ｃの２本のバンドとを示す。また等
電点は7.4 〜8.6 で 723個のアミノ酸配列よりなる糖蛋
白である。上記ＴＣＦ−IIは、ヒト線維芽細胞培養液を
濃縮し、イオン交換体に吸着させ、その溶出液をアフィ
ニティクロマトグラフィーを行って得ることもできるし
（WO 90/10651)あるいは遺伝子工学的手法（WO 92/1010
53）によって得ることもできる。

【０００６】すなわち、ＴＣＦ−IIは先に示したWO 90/
10651 号公報に開示された方法によって得られたヒト線
維芽細胞由来のものを用いることが可能である。また同
公報に記載された遺伝子配列に基づいて、微生物や他の
細胞により遺伝子組み換え操作により生産されたもので
あっても差し支えない。遺伝子操作によりＴＣＦ−IIを
製造する方法については、本発明者らにより出願され、
WO 92/01053 号公報に開示されている方法で生産したも
のを用いることができる。また宿主細胞、微生物の違い
により糖鎖の異なったものや、糖鎖の結合していないも
のであっても使用可能である。しかし糖鎖は生体内の代
謝速度に関係しているため糖鎖の結合しているものが望
ましい。

【０００７】ＴＣＦ−IIは通常の単離精製法によってさ
らに濃縮・精製することができる。例えば、有機溶媒に
よる沈殿法、塩析、ゲル濾過クロマト、モノクローナル
抗体を用いたアフィニティークロマト、電気泳動法など
が挙げられる。これらの精製法の内モノクローナル抗体
を用いたアフィニティークロマトについては、本発明者
により特願平３−177236号として出願されているモノク
ローナル抗体を用いて精製することができる。得られた
精製ＴＣＦ−IIは、凍結乾燥若しくは凍結保存すること
ができる。

【０００８】本発明の蛋白合成促進剤は注射剤として投
与することができる。この場合、静注、動注、筋注ある
いは皮下注射のいずれを用いてもよい。また必要に応じ
て、フィブリノーゲンのような血液凝固剤または、アン
チトロンビンIII などの凝固制御因子あるいはＦＯＹな
どのプロテアーゼ阻害剤などのＤＩＣ治療に用いられて
いる薬物と併用することができる。注射剤は、ＴＣＦ−
IIを単独あるいは前記薬物と併用してもよいが、さらに
ヒト血清アルブン、界面活性剤、アミノ酸、糖類等の補
助剤を併用してもよい。本発明の蛋白合成促進剤に含ま
れる、ＴＣＦ−IIの投与量は、投与患者の症状や、病
状、年令等によって定められるが、成人一人あたり精製
ＴＣＦ−IIとして100−30000 μg 、好ましくは 500−3
000μg を含有する製剤を１週間に１〜７回投与するこ
とができる。また患者の症状によっては長期間の投与も
可能である。

【０００９】以下に実施例を示しさらに本発明を詳細に
説明する。

【実施例１】ＴＣＦ−IIの精製 WO 90/10651 号公報に開示された方法及び東尾らの方法
（Higasio,K. et.al.B.B.R.C.,vol.170,397-404,1990)
に準じてヒト線維芽細胞を培養し精製ＴＣＦ−IIを得
た。ヒト線維芽細胞ＩＭＲ−９０（ATCC CCL 186) 細胞
を５％子牛血清を含むＤＭＥＭ 100mlをいれたローラー
ボトルに３×10⁶個移植し、0.５〜２回転／分の回転速
度で回転させながら７日間培養を続けた。総細胞数が１
×10⁷個になったところでトリプシンにより細胞を剥離
し細胞をボトル底面に集め、５〜９メッシュのセラミッ
ク 100ｇ（東芝セラミック社製）を殺菌して投入し、24
時間静置して培養した。その後上記培養液を 500ml加
え、培養を継続した。７〜10日ごとに培地を全量回収
し、新鮮培地を補給した。このようにして２ケ月間の生
産を継続し、ローラーボトル一本あたり４ｌの培養液を
回収した。このようにして得た培養液当たりの比活性は
32μ／mlであった。培養液 750ｌをアミコン社製メンブ
ランフィルター（MW 6000 カット）処理によりＵＦ濃縮
し、CMセファテックスＣ−50（ファルマシア社製）、Co
n A セファロース（ファルマシア社製）、Mono Sカラム
（ファルマシア社製）、ヘパリンセファロース（ファル
マシア社製）による５段階のクロマト精製を行い、比活
性 5,248,000μ／mgの精製ＴＣＦ−IIを得た。

【００１０】

【実施例２】遺伝子組換ＴＣＦ−IIの生産 WO 92/01053 号公報に開示された方法に従い、ＴＣＦ−
II遺伝子を組み込んだ細胞を培養し、精製ＴＣＦ−IIを
得た。形質転換ナマルワ（Namalwa)細胞を培養し、培養
液20l を得た。この培養液をCM─セファデックスC-50ク
ロマト、Con-AセファロースCL-6B クロマト、MonoS カ
ラムを装着したHPLCの順に処理を行い、約11mgの活性Ｔ
ＣＦ−IIを得た。

【００１１】

【実施例３】ＴＣＦ−II製剤の生産例本実施例においては、上記実施例２の方法により得るこ
とのできた遺伝子組み換えＴＣＦ−IIの注射製剤の生産
例を示した。 (1) ＴＣＦ−II 20μg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。 (2) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 1mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００１２】 (3) ＴＣＦ−II 20μｇツイーン80 2mg ソルビトール 4ｇ上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。 (4) ＴＣＦ−II 40μg ツイーン80 2mg グリシン 2ｇ上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。

【００１３】 (5) ＴＣＦ−II 40μｇツイーン80 1mg ソルビトール 2ｇグリシン 1ｇ上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (6) ＴＣＦ−II 20μg ソルビトール 4ｇヒト血清アルブミン 50mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１４】 (7) ＴＣＦ−II 40μg グリシン 2ｇヒト血清アルブミン 50mg 上記組成を注射用生理食塩水に溶解し、全量を20mlに調
製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍結乾燥
密封した。 (8) ＴＣＦ−II 10mg ヒト血清アルブミン 100mg 上記組成をｐＨ7.0 の0.01M のPBS で溶解し、全量を20
mlに調製し、滅菌後、バイアル瓶に2ml ずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【００１５】

【発明の効果】本発明によりＴＣＦ−IIを有効成分とし
て含有する低蛋白血症治療用蛋白合成促進剤が提供され
る。以下に本実施例により製造した治療剤の効果を確認
した実験例を示し、本発明の効果を説明する。

【実験例１】血清総蛋白増加効果 (1) 方法７週齢のウィスター系雄ラット（１群６匹）にＴＣＦ−
II（0 、5 、50、500、5000μg/kg) を12時間間隔で14
日間（計28回) の反復静脈内投与を行い、最終投与12時
間後採血を行い、血清総蛋白量、血清アルブミン量を定
量した。 (2) 結果ＴＣＦ−IIの用量に依存して血清総蛋白量（図１）及
び、血清アルブミン量（図２）の増加が観察された。と
くに5 μg/kg以上の投与により両数値とも有意に増加し
た。血漿蛋白の増加効果を確認できた。

【００１６】

【実験例２】肝臓切除による低蛋白血症ラットに対する治療効果肝臓切除による血漿蛋白の低下ラットを作製し、このモ
デルに対するＴＣＦ−IIの効果を確認した。また血漿蛋
白の指標として血漿フィブリノーゲン量、および外因性
凝固因子に注目し、プロトロンビン時間の変化をこの外
因性凝固因子(ファクターII、Ｖ、 VII、Ｘ) を含む血
漿蛋白の指標とした。 (1) 方法７週齢のウィスター系雄ラット（１群６匹）に70％肝切
除を行い、ＴＣＦ−II(0、20、100 、500 μg/kg) を12
時間間隔で 2日間( 計 4回) の反復静脈内投与を行い、
投与開始48時間後採血を行い、プロトロンビン時間、血
漿フィブリノーゲン量、血清総蛋白値を測定した。 (2) 結果ＴＣＦ−II投与にともない、プロトロンビン時間の短縮
（図５）、血漿フィブリノーゲン量の増加（図３）、血
清総蛋白の増加（図４）が観察された。この結果、肝臓
由来の低蛋白血症に、本発明が有効であることが確認で
きた。

【００１７】

【実験例３】ＤＩＣによる低蛋白血症の治療効果ＤＩＣは、血管内凝固により急激に血漿蛋白質が消費さ
れ、低蛋白血症を呈する。このモデル動物に本発明治療
剤を投与し、治療効果を確認した。 (1) 方法７週齢のウィスター系雄ラット（１群10匹）に70％肝切
除を行った直後にガラクトサミンを500mg/kg皮下投与
し、肝臓障害とDIC 症状を合併させた病態モデルを作製
した。この病態モデルに、ＴＣＦ−II(500μg/kg) を12
時間間隔で 2日間（計４回) の反復静脈内投与を行い、
投与開始48時間後採血を行い、低蛋白の指標として血漿
フィブリノーゲン量、アンチトロンビンIII 活性、血清
総蛋白値を測定した。 (2) 結果ＴＣＦ−II投与にともない、血漿フィブリノーゲン量の
増加（図６）、アンチトロンビンIII 活性の増加（図
７）、及び血清総蛋白（図８）の増加が観察された。DI
C 由来の低蛋白症に、本発明が有効であることが確認で
きた。

【００１８】

【実験例４】腎不全による漏出性低蛋白血症の治療効果 (1) 方法部分腎切除後3 週間経過した8 週齢のウィスター系雄ラ
ット（１群11匹）に、ＴＣＦ−II（0 、500 μg/kg) を
12時間間隔で 10 回反復静脈内投与を行い、投与終了12
時間後採血を行い、血清総蛋白値を測定した。 (2) 結果ＴＣＦ−II投与にともない、血清総蛋白の増加が観察さ
れた。腎不全による漏出性低蛋白血症に本発明が有効で
あることが確認できた( 図 9) 。

【００１９】

【実験例５】低栄養性低蛋白血症の治療効果 (1) 方法必須アミノ酸であるメチオニンを合成アミノ酸であるDL
- エチオニンに代えることにより、必須アミノ酸欠乏ラ
ットを作製した。エチオニンを250mg/kg/dayを4 日間繰
り返し腹腔内に投与することにより、メチオニン欠乏ラ
ットを作製した。ラットの血漿蛋白質は、アミノ酸欠乏
により低下した。このラット(1群10匹) にＴＣＦ−II
（0 、50、500 μg/kg) を12時間間隔で 2日間( 計 4
回) の反復静脈内投与を行い、投与開始48時間後採血を
行い、低蛋白の指標としてプロトロンビン時間、アンチ
トロンビンIII 活性を測定した。 (2) 結果ＴＣＦ−II投与にともないその用量に依存して、プロト
ロンビン時間の短縮（図１０）及びアンチトロンビンII
I 活性の増加（図１１）が観察された。低栄養由来の低
蛋白症に、本発明が有効であることが確認できた。以上
の結果、本発明による治療剤は低蛋白血症に有効である
ことが確認できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】正常ラットに対する本発明治療剤投与による血
清総蛋白量の増加効果を示す。

【図２】正常ラットに対する本発明治療剤投与による血
清アルブミン量増加効果を示す。

【図３】70％肝臓切除後の低蛋白血症ラットに対する本
発明治療剤投与による血漿フィブリノーゲン量増加効果
を示す。

【図４】70％肝臓切除後の低蛋白血症ラットに対する本
発明治療剤投与による血清総蛋白量の増加効果を示す。

【図５】70％肝臓切除後の低蛋白血症ラットに対する本
発明治療剤投与によるプロトロンビン時間の短縮を示
す。

【図６】ＤＩＣによる低蛋白血症ラットに対する本発明
治療剤投与による血漿フィブリノーゲン量の増加効果を
示す。

【図７】ＤＩＣによる低蛋白血症ラットに対する本発明
治療剤投与によるアンチトロンビンIII 活性の増加効果
を示す。

【図８】ＤＩＣによる低蛋白血症ラットに対する本発明
治療剤投与による血清総蛋白量の増加効果を示す。

【図９】慢性腎不全による低蛋白血症ラットに対する本
発明治療剤投与による血清総蛋白量の増加効果を示す。

【図１０】低栄養による低蛋白血症ラットに対する本発
明治療剤投与によるプロトロンビン時間の短縮を示す。

【図１１】低栄養による低蛋白血症ラットに対する本発
明治療剤投与によるアンチトロンビンIII 活性の増加効
果を示す。

【符号の説明】

＊Ｐ＜0.05を示す。＊＊Ｐ＜0.01を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＣＦ−IIを有効成分とする低蛋白血症
治療用蛋白合成促進剤。
【請求項２】低蛋白血症が肝障害性、腎不全による漏
出性あるいは低栄養性に由来する低蛋白血症である請求
項１記載の蛋白合成促進剤。