WO2005058951A1 - 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子 - Google Patents

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WO2005058951A1
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Kunio Matsumoto
Kazuhiro Fukuta
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Toshikazu Nakamura
Kunio Matsumoto
Kazuhiro Fukuta
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Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain deficient hepatocyte growth factor. More specifically, the present invention relates to a hepatocyte growth factor modified by deleting a sugar chain of hepatocyte growth factor.
  • Hepatocyte growth factor (hereinafter also referred to as HGF) is a protein having proliferative activity of liver parenchymal cells, and one having a different amino acid sequence has been reported, and its name is SF (scatter factor), TCF (Tumor cytotoxic factor), etc. are used.
  • these proteins having known hepatocyte proliferation activity are collectively referred to as HGF.
  • HGF is known to be a physiologically active peptide which exhibits various pharmacological actions such as cell migration promotion, morphogenesis promotion, angiogenesis action, neuroprotective action or anti-apoptotic action as well as proliferation of hepatocytes. (See Non-Patent Document 1).
  • HGF is its pharmacological action
  • Therapeutic agents for liver cirrhosis agents for treating renal diseases, agents for promoting proliferation of epithelial cells, anticancer agents, agents for preventing side effects for cancer therapy, agents for treating lung disorders, agents for treating gastric and duodenal injuries, treating cranial nerve disorders
  • Agent immunosuppressive side effect preventive agent, collagen degradation promoter, agent for treating cartilage disorder, agent for treating arterial disease, agent for treating pulmonary fibrosis, agent for treating liver disease, agent for treating blood coagulation abnormality, agent for treating low blood plasma, agent for treating wound It is expected to be developed as a neuropathy improving agent, a hematopoietic stem cell increasing agent, a hair growth promoting agent and the like (see, for example, Patent Documents 1-14).
  • HGF is secreted from organs such as liver, brain, lung, bone marrow, spleen, placenta or kidney, or from blood cells such as platelets and white blood cells, but since it is present only in extremely small amounts in the living body, HGF In order to use it as a pharmaceutical preparation, it is necessary to produce in large quantities using cells by genetic engineering techniques. Conventionally, it is known that HGF can be produced using animal cells such as Chinese hamster ovary (CH ⁇ ) cells (see Patent Documents 15 and 16). However, in general, methods for producing proteins using animal cells such as CHO cells are considered to be expensive and lead to an increase in drug prices.
  • CH ⁇ Chinese hamster ovary
  • Yeast is known as a host capable of inexpensively producing proteins and as a cell having an ability of glycosylation (see Non-patent Literature 8-10). Since yeast is a eukaryote and has an endoplasmic reticulum and a Golgi apparatus, it has a sugar chain biosynthesis mechanism. However, since the sugar chain biosynthesis mechanism of yeast is largely different from that of animal cells, when a protein having a glycosylation site is produced in yeast, yeast-type sugar chains are added. It is known that the sugar chain structure of yeast is greatly different from those of human and other mammals (see Non-patent Document 11).
  • insect cells are also hosts having glycosylation ability, and the ability to produce proteins at relatively low cost S ability to be able to differ in the sugar chain structure of insect cells from human-type sugar chain structures It is known (see Non-Patent Document 12).
  • insect cells may also exhibit antigenicity to humans and other mammals.
  • HGF has five sugar chains attached thereto (see Non-Patent Documents 13 and 14). If the sugar chain of HGF is removed, the effect on the activity will be produced, for example, by culturing Tumi-fumicin, an inhibitor of N-linked glycosylation, when added to HGF-producing cells. It has been reported that HGF retains cell migration activity (in the article, HGF is expressed as SF) (see Non-Patent Document 15).
  • HGF In addition to cell migration activity, HGF has a wide range of activities such as cell proliferation, morphogenesis promotion, angiogenesis, anti-cell death activity or neuroprotection (see Non-patent Document 16). It is difficult to say that HGF deficient in sugar chain has cell migration activity and also has other functions. For example, NK2, which is a truncated variant of HGF, has cell migration activity but not cell proliferation activity (see Non-patent Document 17).
  • HGF retains various functions when the sugar chain of HGF is deleted. Since HGF has various activities, it is considered to be a biorepair factor, and it was not considered that the deletion of the sugar chain of HGF would not affect the high function of HGF.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-18028
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-49246
  • Patent Document 3 European Patent Application Publication No. 492614
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-25010
  • Patent Document 5 International Publication No. 93/8821
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-172207
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-89869
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-40934
  • Patent Document 9 International Publication No.
  • Patent Document 10 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-40935
  • Patent Document 11 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-56692
  • Patent Document 12 Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-41429
  • Patent Document 13 International Publication WO 93/3061 Brochure
  • Patent document 14 Unexamined-Japanese-Patent No. 5-213721 gazette
  • Patent Document 15 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-4696
  • Patent Document 16 Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-191991
  • Non-patent literature 1 Matsumoto 'K (Matsumoto, K) et al., Kidney ⁇ ⁇ ⁇ (Kidney International), 2001, 59, p.
  • Non-Patent Document 2 Swartz 'Ji'ar (Swarts, JR), Current' Opinion 'in' Nano Technology (Current opinion in biotechnology), 2001, 12th ed., P. 195-201
  • Non-patent document 3 Cornfeld 'R (Komfeld, R.) et al., 1 person,' functional 'review,' ab 'biochemistry (Annual review of biochemistry.), 1985, 54th, p. 631-664
  • Non-Patent Document 4 Kobata 'A (Kobata, A.), Yo-bit Bian' Journal 'Ob' 'Biochemistry' (European journal of biochemistry), 1992, 209, ⁇ ⁇ 483 — 501
  • Non-Patent Document 5 Birki 'A (Varki, A.), Glycobiology, 19 93, 3rd ed., P. 97-130.
  • Non-patent document 6 Goochy, C. F. et al., Biotechnologies (Biot echnolgy), 1991, 9th, p. 1347-1355
  • Non-Patent Document 7 Takeuchi 'M (Takeuchi, M.) et al., 1 person, Glycobiology, 1991, 1st report, p. 337-346
  • Non-Patent Document 8 Wisman A. (Wiseman A.), Endeavor., 1 996, 20, p. 130-132.
  • Non-Patent Document 9 Russell, C., et al., Australian 'Journal' biotechnology (Australian journal of biotechnology, 1991, 5th ed., P. 48-55
  • Non-Patent Document 10 Buckholz, R. G., et al., 1 person, Biotechnology, 1991, 9th, p. 1067-1072
  • Non-Patent Document 11 Gemmill, T. R. M., 1 person, Biochemica 'Eto', Biooffica force 'Akta (Biochimica et biophysica acta), 1999, No. 1426, p. 227-237
  • Non-patent literature 12 Altmann 'F (Altmann, F. et al., Glycoconjugate' journal)
  • Non-patent literature 13 Hara 'Eichi (Hara, H. et al., Journal' ob 'biochemistry). urnal of biochemistry), 1993, 114, p. 76- 82
  • Non-patent literature 14 Shimizu 'N (Shimizu, N.) et al., Biochemical' and 'biofuel force nore' Lisa 1 -chi 'co-uni-shi-shionsu, Biochemical ana biophvsica research communications), 1992, 189, p. 1329-1335.
  • Non-Patent Document 15 Hoffmann 'R (Hofmann, R.) et al., Biochemica' Et 'Biophysica * acta (Biochimica et biophysica acta), 1992, No. 1120, p. 343-350
  • Non-Patent Document 16 Matsumoto 'K (Matsumoto, K.) et al., 1' Biochemical 'and' Biometrical Nore 'Research' Communications (Biochemical and biophysical search communications), 1997, 239, p. 639 —644
  • Non-Patent Document 17 Hartmann 'G (Hartmann, G. et al., Proceeding' Ob 'the' Nashonare 'Aka Kademi One Ob Science' Ob The The United '' State 'Ob' Amely Power (Proceedings oi the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 1992, 89, p. 11574-11578
  • An object of the present invention is to provide a sugar chain deficient hepatocyte growth factor in which the sugar chain of HGF is deleted, and to provide a method for producing the same.
  • the present inventors have made extensive researches on the sugar chain function of HGF in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, they have found that even if the sugar chain of HGF is removed, the function of HGF is maintained. It was quite unexpected that a protein with high function such as HGF retains the function even after removing the sugar chain. On the contrary, the glycan-deficient HGF has improved stability in blood as compared to HGF having a sugar chain, and such a fact was a totally surprising discovery. Based on the above findings, the present inventors have further studied to complete the present invention.
  • a sugar chain deficient hepatocyte growth factor characterized in that a sugar chain is deleted in all or at least one site of the glycosylation site of the hepatocyte growth factor
  • the sugar chain is not added at position 294 by substituting the amino acids at positions 294 and / or 296 with other amino acids or the amino acids at Z and 295 with Pro; b) The sugar chain is not added at position 402 by substitution of the amino acid at position 402 or / and position 404 with another amino acid, or by substitution of the amino acids at position Z and position 403 with Pro; c) no glycosylated at position 476 due to substitution of the amino acid at position 476 with another amino acid;
  • glycosylated form is not added at position 566 by substitution of the amino acid at position 566 and / or 568 with another amino acid or / and amino acid at position 567 with Pro; Or
  • a sugar chain is not added at position 653, as a result of substitution of amino acids at positions 653 or Z and 655 with other amino acids, and / or substitution of an amino acid at position 654 with Pro. as well as
  • hepatocyte growth factor according to any of (1) to (4) above, which is modified based on the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, which corresponds to the amino acid in SEQ ID NO: 2
  • a sugar chain deficient hepatocyte growth factor characterized in that at least one or more of the modifications shown in the following a) to e) are made;
  • glycosylated form is not added at position 289 by substitution of the amino acid at position 289 or / and amino acid 291 with another amino acid or / and / or amino acid 290 at Pro; b) A sugar chain is not added at position 397 by substitution of the amino acid at position 397 or / and amino acid 399 with another amino acid or / and amino acid at position 398 with Pro; c) The sugar chain is not added at position 471 by substitution of the amino acid at position 471 with another amino acid;
  • a sugar chain is not added at position 561 by substitution of the amino acid at position 561 and / or 563 with another amino acid or / and amino acid at position 562 with Pro; Or
  • a sugar chain is not added at position 648 by substituting the amino acids at positions 648 or Z and 650 with other amino acids or / and the amino acid at position 649 with Pro, About.
  • a DNA comprising a nucleotide sequence capable of encoding the sugar chain deficient hepatocyte growth factor according to any one of (1) to (7) above,
  • the vector described in (9) above is introduced into an insect individual to produce a sugar chain deficient hepatocyte growth factor in the insect individual, and the sugar chain deficient hepatocyte growth factor is purified and recovered from the insect individual.
  • sugar chains are completely or partially removed by treating liver cell growth factor having sugar chains with an enzyme, and sugar chain deficient hepatocyte growth factor is purified and recovered from the enzyme reaction solution.
  • a gene comprising a vector incorporating a DNA sequence containing a nucleotide sequence encoding a hepatocyte growth factor having a sugar chain or the vector described in (9) above is introduced into a cell not capable of glycosylation and the cells are cultured. And producing a sugar chain-deficient hepatocyte growth factor in the cell or in the culture solution of the cell, and purifying and recovering the sugar chain-deficient liver cell growth factor in the cell or in the culture solution of the cell.
  • a method for producing a sugar chain deficient hepatocyte growth factor according to any one of (1) to (7) above, characterized in that
  • a sugar chain-deficient hepatocyte growth factor is synthesized by the cell-free protein synthesis system using a nucleotide sequence encoding a hepatocyte growth factor having a sugar chain or a gene consisting of the nucleotide sequence according to (8) as a template.
  • a gene therapeutic agent comprising the DNA according to (8) above,
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention has the same activity as HGF having a sugar chain in cell proliferation activity, cell migration activity or morphogenic activity, etc., and the temperature stability is also equivalent. Can be a substitute for HGF. Therefore, the pharmaceutical preparation containing the glycan-deficient HGF of the present invention as an active ingredient has the same use as that of HGF having a sugar chain, that is, a mammal (for example, human, dog, cat, rat, mouse, rabbit, (Uma, Ushi, Hedge, guinea pig, etc.), liver cirrhosis treatment agent, renal disease treatment agent, epithelial cell proliferation promoter, anticancer agent, anti-cancer agent side effect agent, lung disorder treatment agent, stomach ⁇ duodenum Therapeutic agents for injury, cranial nerve disorder, immunosuppressive side effects, collagen degradation promoters, agents for treating cartilage disorders, agents for treating arterial disease, agents for treating pulmonary fibrosis, agents for treating liver disease, agents for treating blood coagul
  • the medicament containing the DNA encoding the sugar chain deficient HGF of the present invention can be used as a gene therapeutic drug for the above-mentioned diseases.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention is more stable in blood than HGF having a sugar chain, the dose of HGF can be reduced, and the side effects due to HGF can be prevented.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention can be produced in yeast or insect cells, and therefore can be produced inexpensively.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of each HGF by SDS-PAGE. After each HGF was reduced and run, the gel was stained with silver.
  • FIG. 2 is a graph showing the growth activity of HGF in hepatocyte proliferation, and the amount of DNA synthesis in rat hepatocytes as an indicator.
  • FIG. 3 The cell migration activity of HGF was compared according to the degree of dispersion of MDCK cells It is a figure which shows a result.
  • FIG. 4 shows the results of comparison of the morphogenic activity of HGF according to the degree of lumen formation of MDCK cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the temperature stability of HGF. Each HGF was incubated at 37 ° C for the indicated number of days. The residual activity was measured using the amount of DNA synthesis of rat hepatocytes as an index and expressed as a relative value.
  • FIG. 6 shows the stability of HGF in blood.
  • the sugar chain deficient type HGF is a glycosylation site of a mammal having a sugar chain, for example, human, dog, cat, rat, mouse, rabbit, dog, dog, guinea pig or the like. HGF whose structure has been modified such that all or at least one of the sugar chains in the group is deleted.
  • one or several amino acids in the amino acid sequence in which a mutation is introduced so as not to add a sugar chain to known HGF are deleted, substituted, added or Also included are proteins having an inserted amino acid sequence and having HGF activity.
  • a protein having at least about 60% or more homology with the amino acid sequence to which mutation has been introduced so as not to add a sugar chain to known HGF preferably A protein having about 80% or more homology, more preferably a protein having about 90% or more homology, even more preferably a protein having about 95% or more homology, and having HGF activity included.
  • the phrase "deletion, substitution, addition or insertion of one or several amino acids” means a number that can be naturally produced by known technical methods such as site-directed mutagenesis. Means that it has been deleted, substituted, added or inserted.
  • homology in the above amino acid sequences refers to the degree of matching of the amino acid residues constituting the respective sequences by comparing the primary structures of the proteins and comparing the sequences.
  • the sugar chain-depleted HGF of the present invention can be obtained by introducing into a cell a vector incorporating a mutated HGF gene such that a sugar chain is not added at at least one site of the glycosylation site of HGF.
  • the sugar chain-deficient HGF of the present invention can also be obtained by introducing a vector containing the nucleotide sequence of HGF having a sugar chain into a cell without the ability to add sugar.
  • amino acids used for conversion it is preferable to appropriately select amino acids that do not form a new consensus sequence with the amino acid sequences before and after the above consensus sequence.
  • mutations may be introduced into the nucleotide sequence such that proline is introduced at the X site in the consensus sequence.
  • the glycosylation site in HGF is Asn (N-linked sugar chain) at position 294 and Asn (N at position 402 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. — (Linked sugar chain), 476 Thr (O-linked sugar chain), position 566 Asn (N-linked sugar chain), and position 653 Asn (N-linked sugar chain).
  • the glycosylation site in 5-amino acid-deleted human HGF represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is Asn at position 289 (N-linked sugar chain) , Asn at position 397 (N-linked sugar chain), Thr at 471 ( ⁇ 1-linked sugar chain), Asn at position 561 (N-linked sugar chain), Asn at position 648 (N -Linked sugar chains).
  • the above consensus sequence of the above human HGF is the position 294 to position 296, the position 402 to the position 404, the position 566 to the position 568, and the position 294 to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is from 653 to 655.
  • the consensus sequence is the positions 289 to 291, 397 to 399, and 561 to 563 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. And it is from the 648th position to the 650th position.
  • the DNA is cut out by a restriction enzyme from the thus obtained DNA encoding the amino acid sequence of the glycan-depleted HGF or a recombinant vector such as a plasmid or a phage containing the DNA encoding the amino acid sequence of HGF having a sugar chain
  • a recombinant expression vector can be prepared by religation using a restriction enzyme and a DNA ligase downstream of the promoter of a vector suitable for expression of sugar chain deficient HGF.
  • nucleotide sequences encoding (1) promoter, (2) ribosome binding site, (3) initiation codon, and (4) the sugar chain deficient HGF of the present invention if necessary
  • a recombinant expression vector is constructed to contain DNA, (5) stop codon, (6) terminator and the like.
  • DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a carbohydrate-deficient HGF in which a mutation is introduced at the above-mentioned glycosylation site is added (a) 1 of the bases of the nucleotide sequence encoding the above-mentioned carbohydrate-deficient HGF Or a DNA encoding a protein having an HGF activity and having a nucleotide sequence in which several bases have been deleted, substituted, added or incorporated, (b) a nucleotide sequence encoding the aforementioned sugar chain deficient HGF DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA having the DNA and a nucleotide sequence hybridizing under stringent conditions and encoding a protein having HGF activity, or (c) a base encoding the aforementioned sugar chain deficient HGF Also included is a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a protein having at least about 60% or more homology with
  • nucleotide sequence may be naturally occurring or may be naturally occurring by well-known technical methods such as site-directed mutagenesis when "one or several bases are deleted, substituted, added or inserted”. It means that a certain number of bases are deleted, substituted, added or inserted.
  • the DNA capable of hybridizing under stringent conditions means the colony 'no hybridization' method, the plaque 'no hybridization' method, or the Southern blot Ibrida, using the above DNA as a probe. It means DNA obtained by using the imaging method or the like.
  • a salt concentration for example, an about 0.1-fold concentration of SSC solution (the composition of the 1-fold SSC solution is composed of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate).
  • Hybridization conditions at a temperature of about 65 ° C.
  • the DNA having the homology is a DNA having at least about 60% homology, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, under high stringency conditions. It refers to DNA having sex, more preferably DNA having homology of about 95% or more.
  • the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 1 to 20 mM
  • the temperature is about 50 to 70 ° C., preferably about 60 to 65 ° C. I say the condition.
  • a sodium concentration of about 19 mM and a temperature of about 65 ° C. are the most preferable conditions.
  • vectors examples include plasmids such as pBR322, pUC18 and pUC19 (Toyobo) when using E. coli as a host, and plasmids such as pUB 110 (Sigma) when using B. subtilis as a host.
  • plasmids such as pBR322, pUC18 and pUC19 (Toyobo) when using E. coli as a host
  • plasmids such as pUB 110 (Sigma) when using B. subtilis as a host.
  • yeast When a yeast is used as a host, a plasmid such as pYES2 (Invitrogen) or pRB15 (ATCC37062) can be used.
  • pCAGGS or pCXN2 Niwa, H., Yamamura, K. and Miyaza ki, J., Gene, 1991, No. 108, p.
  • pcDL-SRa Takebe, Y. et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8th ed., P. 466-472
  • vectors derived from bacteraio phages lgt10, gtll (Stratagene), virus SV40 (BRL), BPV (ATCC VR-703) or a retrovirus gene, etc.
  • replication within the host is possible.
  • ⁇ It is especially limited if it is an amplifiable vector It is not fixed.
  • the promoter or terminator is not particularly limited as long as it corresponds to the host used for expression of the nucleotide sequence encoding the sugar chain deficient HGF.
  • Examples of the promoter include trp promoter, lac promoter, rec A promoter, ⁇ PL promoter or lpp promoter when the host is E. coli, and PH05 promoter, PGK promoter, GAP when the host is yeast. Promoter or ADH promoter etc. may be mentioned.
  • rous sarcoma virus virus RSV
  • MPSV polymeric virus
  • avian sarcoma virus cytomegalovirus
  • SMV cytomegalovirus
  • promoters obtained from viral genomes such as simian virus 40 (SV40) or vaccinia virus, merothionein promoter or heat shock promoter.
  • an enhancer is introduced into the vector. Transfer is enhanced by the introduction of enantiomers.
  • enhancers include SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter / enhancer, adenovirus enhancer or adenovirus enhancer.
  • terminator if the host is E. coli, ti "p terminator or lpp terminator, etc., if the host is Bacillus subtilis, amyF terminator, etc .; if the host is yeast, CYC1 terminator, etc. When it is an animal cell, it may be exemplified SV40 terminator or HSV1TK terminator etc. It is preferable to use these promoters and terminators appropriately in combination depending on the host used.
  • the sugar chain deficient HGF expression vector constructed in this manner can be obtained by the combinatorial cell method CJ.
  • Examples of cells that can be used as a host include, but are not particularly limited to, cells of animals, plants, insects, nuclear microorganisms or eukaryotic microorganisms. These cells may form an individual, and may be an animal, a plant or an insect as a host. In animal cells, either adherent cells or floating cells can be used, and animal cells that produce and accumulate sugar chain deficient HGF in cells or animals that secrete and produce sugar chain deficient HGF extracellularly Even cells, please. For example, CHO cells (Chinese Nomster ovary cells), COS cells, BHK cells, mouse C127 cells, Hela cells and the like can be mentioned.
  • Examples of plant cells include rice, tobacco and Arabidopsis thaliana, and examples of insect cells include cells such as Sf9 and Sf21.
  • examples of insects for example, silkworm can be mentioned.
  • Examples of prokaryotic microorganisms include Escherichia coli and Bacillus subtilis, and examples of eukaryotic microorganisms include yeasts such as Saccharomyces cerevisi ae, ⁇ chizosaccharomyces pombe, and ida boidinii f or Pichia pastoris or filamentous fungi such as Aspergillus, Trichoderma or Mucor. It is possible to do S.
  • it is a yeast, an insect cell or an insect individual.
  • prokaryotic cells since there is no glycosylation ability, HGF gene having wild type sugar chain is introduced.
  • the resulting transformant is cultured in an appropriate medium depending on the host in order to produce the target sugar chain deficient HGF.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances, vitamins, serum, drugs and the like necessary for the growth of the transformant.
  • the medium when the host of the transformant is E. coli, LB medium (Nissui Pharmaceutical) or M9 medium Exp. Mol. Genet., Cold Spring Laboratory, New York, 1972, p.
  • YEPD medium Genetic Engineering, No. 1; Plenum Press, New York, 1979, p. 117
  • MEM medium modified Eignore medium
  • DMEM medium Dalbecco modified Eagle medium
  • RPMI 1640 medium RPMI 1640 medium
  • Culturing of transformants is usually performed at about 20 ° C. and 45 ° C.
  • pH is in the range of about 5-8
  • aeration and agitation are performed as needed.
  • glass beads, collagen beads, or acetylcellulose hollow eye A carrier such as a bar is used. It is not limited to these, as long as the transformant grows under any other medium composition or culture condition.
  • the sugar chain deficient type HGF thus produced in the culture supernatant of the transformant or in the transformant is known salting out method, solvent precipitation method, dialysis method, ultrafiltration method, gel electricity. Separation and purification can be carried out by combining one or more species such as electrophoresis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reversed phase chromatography and affinity chromatography, etc.
  • salting out with ammonium sulfate S-sepharose ion chromatography, heparin Sepharose affinity mouth chromatography, and combination of reversed phase ephemeral phase chromatography or salting out with ammonium sulfate, S —
  • a combination of sepharose ion chromatography, anti-HGF antibody sepharose affinity chromatography, etc. is preferred.
  • the sugar chain-deficient HGF of the present invention can also be obtained by treating HGF with a sugar chain-removed enzyme after obtaining HGF with added sugar chains by a conventionally known method.
  • a sugar chain-removed enzyme As an enzyme for removing a sugar chain, glycopeptidase F or dalycopeptidase A can be used for the purpose of removing an N-linked sugar chain. Removal of the O-linked sugar chain is achieved by one or a combination of two such as sialidase, fucosidase and O-dalicanase.
  • Sugar chain removal HGF obtained by enzyme treatment can be purified by the above-mentioned purification method as a sugar chain deficient HGF of the present invention.
  • the sugar chain-deficient HGF of the present invention can also be obtained using a cell-free protein synthesis system.
  • the target protein is encoded using the cell extract prepared from E. coli, rabbit reticulocyte cells, wheat germ or the like, or the protein synthesis factor group contained in the cell extract.
  • This refers to a system that uses the DNA or mRNA as a template to perform protein synthesis without using live cells. Since the cell extract contains a group of molecules necessary for protein synthesis such as ribosomes, tRNAs or translation factors, when an amino acid serving as an energy source and substrate such as ATP or GTP is added to this, the protein is synthesized. Ru.
  • the protein synthesis factor group contained in the cell extract may be mixed and used.
  • the cell-free protein synthesis system does not include the endoplasmic reticulum or the Golgi body, and therefore, does not contain DNA encoding HGF having a sugar chain having a glycosylation site or It is possible to produce sugar chain deficient HGF deficient in sugar chain by using mRNA as a template. Alternatively, DNA or mRNA in which a mutation is introduced at a glycosylation site can also be used.
  • the sugar chain deficient HGF synthesized in the cell-free protein synthesis reaction solution can be purified by the above-mentioned purification method.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention obtained as described above has an activity equivalent to that of HGF having a sugar chain in cell proliferation activity, cell migration activity or morphogenic activity, etc., and is stable in temperature stability. Is also equivalent.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention is more stable in blood than HGF having a sugar chain.
  • the sugar chain deficient HGF according to the present invention can be applied to mammals including humans (eg, dogs, cats, rats, mice, rabbits, animals, dogs, dogs, guinea pigs, etc.).
  • mammals including humans (eg, dogs, cats, rats, mice, rabbits, animals, dogs, dogs, guinea pigs, etc.).
  • the medicament containing the sugar chain deficient HGF of the present invention as an active ingredient has the same use as that of HGF to which a wild type sugar chain is added, for example, a therapeutic agent for liver cirrhosis, therapeutic agent for renal disease, epithelial cell proliferation promoter, anticancer agent Anti-cancer drug side effect preventive agent, lung disorder therapeutic agent, stomach 'duodenal injury therapeutic agent, cranial nerve disorder therapeutic agent, immunosuppressive side effect preventive agent, collagen degradation promoter, cartilage disorder therapeutic agent, arterial disease therapeutic agent, pulmonary fibrosis It can be used as a therapeutic agent, a liver disease therapeutic agent, a blood coagulation disorder therapeutic agent, a plasma low protein therapeutic agent, a wound therapeutic agent, a neurological disorder improving agent, a hematopoietic stem cell increasing agent or a hair growth promoting agent.
  • the medicament containing the DNA encoding the sugar chain deficient HGF of the present invention can be used as a gene therapeutic drug for the above-mentioned diseases.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention is effective as a protein drug, and is used in the form of a general pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation containing the sugar chain deficient HGF of the present invention as an active ingredient can take various formulation forms (for example, liquid preparation, solid preparation, capsule, etc.).
  • the defective HGF and the binding substance alone or together with a conventional carrier are used as injections, inhalants, satiation or oral agents, and among them, injections are preferred.
  • the injection can be prepared by a conventional method, for example, after dissolving the glycosylated HGF and the binding substance in an appropriate solvent (eg, sterilized water, buffer solution, physiological saline, etc.),
  • the lysate can be prepared by filtering through a filter, sterilizing it and then filling it into a sterile container.
  • the content of sugar chain deficient HGF in the injection is usually adjusted to about 0.0002-3 (WZV%), preferably about 0.012 (W / V%).
  • oral As the medicine, for example, it is formulated into dosage forms such as tablets, granules, fine granules, powders, soft or hard capsules, solutions, emulsions, suspensions or syrups, and these preparations are formulated It can be prepared according to the conventional method of Suppositories can also be prepared by conventional methods on a formulation using conventional bases (eg, cocoa butter, laurin butter, glucose gelatin, macrogol, witepsol etc.). Inhalants can also be prepared according to the conventional means of formulation. The sugar chain deficient HGF content in the preparation can be appropriately adjusted according to the dosage form, the disease to be applied and the like.
  • bases eg, cocoa butter, laurin butter, glucose gelatin, macrogol, witepsol etc.
  • Inhalants can also be prepared according to the conventional means of formulation.
  • the sugar chain deficient HGF content in the preparation can be appropriately adjusted according to the dosage form, the disease to be applied and the like.
  • a stabilizer be added at the time of formulation of the pharmaceutical preparation of the sugar chain deficient type HGF of the present invention.
  • the stabilizing agent for example, albumin, globulin, gelatin, alanine, glycine, mannitol, gnolose, dextran, sonolebitolee, ethylene glycol and the like can be mentioned.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may contain other additives necessary for formulation, such as solvents (eg, physiological saline, sterile purified water, water for injection, etc.), excipients (eg, fructose, D-sorbitol, Glucose, starch, crystalline cellulose, dextrin, etc., binder (eg, gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic etc.), solubilizing agent (eg, lauro macrogol, poisonoleate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil) 60, gum arabic, sodium benzoate, etc., antioxidants (eg, L-ascorbic acid, tocoferol nore, sodium edetate, etc.), soothing agents (eg, sodium dihydroxybenzene, procaine hydrochloride, etc.) , Tonicity agents (eg, sodium chloride, glucose, D-mannitol, darcerin etc.), buffers (eg, citric acid, citric acid)
  • a liquid preparation it is desirable to remove the water by cryopreservation, lyophilization, etc. for preservation.
  • the freeze-dried preparation is used by adding distilled water for injection and the like at the time of use and re-dissolving.
  • enteric coatings eg For capsules that are preferably coated with cellulose acetate phthalate, methacrylic acid copolymer, hydroxypropyl cellulose sulfate, carboxymethyl cellulose etc, etc., it is preferable to use enteric capsules. Ma ,.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be administered by an appropriate administration route depending on the form of the preparation.
  • it can be administered intravenously, arterially, subcutaneously or intramuscularly in the form of injections.
  • the dose is appropriately adjusted according to the patient's disease, symptoms, age, body weight, etc.
  • for adults usually about 0.20 mg to 500 mg, preferably about 0.5 mg to 100 mg of HGF deficient HGF. It is appropriate to administer it once or several times a day.
  • a DNA having a nucleotide sequence encoding a sugar chain-deficient HGF of the present invention is incorporated into the above vector and can also be used as a gene therapeutic agent.
  • the gene therapeutic agent of the present invention is preferably produced as a complex of the above sugar chain deficient HGF gene and a gene carrier.
  • the gene carrier is preferably a viral vector or a cationic gene carrier.
  • virus vectors include mouse white blood virus virus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, HIV vector, Herpes simplex vector, Sendai virus vector and the like.
  • cationic gene carriers include substances having an affinity to genes such as polyamino acids such as polylysine or polydiaminobutyric acid, or cationic synthetic polymers such as ribosomes and ethyleneimine.
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • dHGF 5-amino acid deleted hepatocyte growth factor
  • DMEM medium Dulbecco's modified eagle medium
  • FCS fetal calf serum
  • NaCl Sodium chloride
  • PBS phosphate buffered saline
  • Tween 80 polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate
  • dHGF 5-amino acid-deleted HGF
  • SEQ ID NO: 3 in the sequence listing was incorporated into pCAGGS vector.
  • the resulting vector (hereinafter referred to as a wild-type vector) is referred to as pCAGGS-dHGF.
  • mutation vector The mutation-introduced vector (hereinafter referred to as mutation vector) was transformed into E. coli XLIO Gold competent cells, and Amp resistant colonies were picked up on LBZAmp plates. The clones of interest were screened by extracting each obtained clonogenic plasmid and analyzing the nucleotide sequence of the coding part of the sugar chain deficient HGF. Vectors in which the target mutation was introduced at 5 sites and no other mutations were confirmed were selected and used for the subsequent experiments. The resulting mutant vector is called pCAGGS-dHGF-NG.
  • wild-type vector pCAGGS-dHGF and mutation vectors pCAGGS_dHGF_NG, pCAGGS-dHGF-HIG, and pCAGGS-dHGF- / 3NG were respectively transfected into COS-7 filamentous vesicles.
  • COS-7 cells in fetal calf serum (FCS) in DMEM medium 10. / o was added and cultured. The cells were replaced with serum-free DMEM medium just before transfer. Transfection was performed by lipofection using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Six hours after the transfection, the medium was changed to DMEM containing 1% FCS, at which time heparin was added to a concentration of 1 ⁇ g / mL.
  • the wild-type dHGF and the glycosylated dHGF were eluted by raising the NaCl concentration to 1 M. . Elution was performed at a flow rate of 0.4 mL / min and fractionated at 0.4 mL / tube. The fractions in which wild-type dHGF and carbohydrate-deficient dH GF were present were collected, and the state of purification was confirmed by SDS-PAGE.
  • DHGF obtained by introducing a wild-type vector is COS-dHGF-WT
  • a sugar chain deleted dHGF obtained by introducing a mutant vector is COS_dHGF_NG, COS-dHGF-a NG or COS_dHGF_ ⁇ NG, respectively. It is called.
  • dHGF protein was also prepared by CH0 cells according to the method described in JP-A-10-191991 (referred to as CHO_dHGF-WT).
  • Example 2 Using the wild-type dHGF and the sugar chain-deficient dHGF obtained in Example 1, the proliferation activity on rat liver parenchymal cells was measured.
  • Hepatic parenchymal cells were separated from SD rats (8 weeks old, male) by collagenase perfusion.
  • the obtained hepatocytes were suspended in Williams E (WE) medium containing 5% FCS, and seeded in culture dishes at a cell density of 30,000 Zc m 2 . After 4 hours, the medium was removed and fresh, replaced with 480 ⁇ L of WE medium (containing 5% FCS), and culture was continued. After an additional 20 hours, 20 ⁇ L of a sample solution containing wild-type dHGF and carbohydrate-deficient dHGF was added and culture was continued.
  • WE Williams E
  • the radioactivity value represents the amount of [ 3 H] thymidine incorporated into cells, which reflects the amount of DNA synthesis involved in cell proliferation. That is, the value of radioactivity reflects cell proliferation activity.
  • the sugar chain deficient dHGF (COS_dHGF_NG) exhibited hepatocyte proliferation activity equivalent to that of wild-type dHGF (COS_dHGF_WT and CHO_dHGF—WT).
  • the C ⁇ S_dHGF-HNG which lacks the ⁇ -chain sugar chain and the C ⁇ S_dHGF_j3 NG which lacks the / 3 chain sugar chain showed similar activities.
  • MDCK- 3 B cells are suspended in DMEM (containing 10% FCS) and seeded at 1 X 10 4 cells / well (480 ⁇ L / well) in a 24-well plate, where wild-type dHGF and sugar chain deficient type A test sample containing 20 h of dH GF was added. After culturing at 37 ° C. for 20 hours, the presence or absence of scatter was observed with a microscope (FIG. 3).
  • COS_dHGF_NG The sugar chain deficient dHGF (COS_dHGF_NG) showed cell migration activity equivalent to that of wild-type dHGF (COS_dHGF_WT and CHO_dHGF—WT).
  • COS-dHGF-a NG which lacks a sugar chain of ⁇ chain
  • COS_dHGF_ ⁇ NG which lacks a sugar chain of ⁇ chain showed similar activities.
  • MDCK-3B cells are suspended in a collagen solution (Cellmatrix I-A, Nitta gelatin) dissolved in DMEM (containing 10% FCS) to give a solution of 5000 cells / mL, and 500 ⁇ L in a 24-well plate. Aliquoted (2500 cells / well). After gelation of collagen by incubating at 37 ° C. for 10 minutes, 480 ⁇ l of DMEM (containing 10% FCS) is overlaid and a test sample 20 ⁇ m containing wild type dHGF and sugar chain deficient dHGF L was added. After culturing at 37 ° C. for 6 days, the state of tube formation was observed with a microscope (FIG. 4).
  • collagen solution Cellmatrix I-A, Nitta gelatin
  • DMEM containing 10% FCS
  • the sugar chain deficient dHGF (COS_dHGF_NG) is a wild-type dHGF (COS_dHGF_WT). And CHO-dHGF-WT) showed morphogenic activity equivalent. COS-dHGF-a NG which lacks the sugar chain of a chain and COS_dHGF_ ⁇ NG which lacks sugar chain of the ⁇ chain showed similar activity.
  • a wild type dHGF and a sugar chain deficient dHGF sample were diluted with 50 mM Tris_HCl (pH 7.5), 0.10% Tween 80, 0.3M NaCl to a concentration of 50 ⁇ g / mL and sealed. It was placed in a container and incubated at 37 ° C. for 7 days. A portion was sampled daily and stored at -80 ° C. The residual activities of wild-type dHGF and sugar chain-deficient dHGF in the sampled solution were evaluated by examining DNA synthesis in rat hepatocytes in the same manner as in Example 2.
  • the sampled solution was diluted to 125 ng / mL with PBS, 0.5% BSA, and the 20 ⁇ L was added to 480 ⁇ L of a culture solution of hepatocytes to make a final 5 ng Z mL.
  • the sugar chain deficient dHGF (COS_dHGF_NG) showed the same temperature stability as wild-type dHGF (COS_dHGF_WT and CHO-dHGF-WT) (FIG. 5).
  • the C ⁇ S_dHGF_a NG which lacks a sugar chain of the ⁇ chain and the C ⁇ S_dHGF_i3 NG which lacks a sugar chain of the chain also showed the same stability.
  • OOOcpm 125 1-dHGF was diluted with PBS containing 0.1% BSA to make a 100 / i L solution.
  • the tail vein force was also administered to ICR mice (8 weeks old, male). Blood was collected at 1 minute, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes and 120 minutes after administration. Plasma is separated from the collected blood and The radioactivity was measured with a round-table counter to evaluate the blood stability of wild-type dHGF and carbohydrate-deficient dHGF (Fig. 6).
  • COS_dHGF_NG sugar chain deficient dHGF
  • COS-dHGF_NG sugar chain deficient dHGF
  • CHO_dHGF-WT The sugar chain deficient dHGF (COS_dHGF_NG) has improved blood stability compared to CHO_dHGF-WT.
  • COS-dHGF_WT showed an intermediate stability between COS-dHGF-NG and CHO-dHGF-WT. This was considered to be because, as shown in Example 1, COS-dHGF-WT partially lacked a sugar chain.
  • the sugar chain deficient HGF of the present invention is useful as a substitute for HGF to which a sugar chain is added.

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Abstract

　ＨＧＦの糖鎖を欠損させた改変体及びその製造方法を提供すること。 　肝細胞増殖因子の少なくとも１ヶ所の糖鎖付加部位において糖鎖が付加されないようにアミノ酸配列に変異を導入された糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。  

Description

明 細 書
糖鎖欠損型肝細胞増殖因子
技術分野
[0001] 本発明は、糖鎖欠損型肝細胞増殖因子に関する。より詳細には、肝細胞増殖因子 の糖鎖を欠損させることによって改変した肝細胞増殖因子に関する。
背景技術
[0002] 肝細胞増殖因子 (以下、 HGFともいう。）は肝実質細胞の増殖活性を有する蛋白質 であり、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されており、その名称は HGF以外 に SF (scatter factor)、 TCF (Tumor cytotoxic factor)等が使用されている。 本発明では、これらの公知の肝実質細胞増殖活性を有する蛋白質を HGFと総称す る。 HGFは肝実質細胞の増殖以外にも細胞遊走促進、形態形成促進、血管新生作 用、神経保護作用又は抗アポトーシス作用等様々な薬理作用を示す生理活性ぺプ チドであることが知られている（非特許文献 1参照。）。 HGFはその薬理作用力 肝硬 変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防 止剤、肺障害治療剤、胃 ·十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副 作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維 症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療 剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促進剤等としての開発が期待さ れている（例えば特許文献 1一 14参照。）。
[0003] HGFは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤又は腎臓等の臓器あるいは血小板や 白血球等の血液細胞等から分泌されるが、生体内には極微量にしか存在しないため 、 HGFを医薬製剤として用いるためには、遺伝子工学的手法により細胞を用いて大 量に生産する必要がある。従来、 HGFはチャイニーズハムスター卵巣（CH〇）細胞 等の動物細胞を用いて生産できることが知られている（特許文献 15、 16参照。）。 しかし、一般に CHO細胞等の動物細胞を用いて蛋白質を生産する方法はコストが 高ぐ引いては薬価の上昇につながることが考えられる。
[0004] 安価に蛋白質を組換え生産する方法としては、大腸菌等の原核生物に目的遺伝 子を導入して発現させる方法が知られている（非特許文献 2参照。）。しかし、大腸菌 等の原核生物で生産した組換え蛋白質には糖鎖が付加されないという問題がある。 これは、大腸菌等の原核生物には糖鎖生合成の場である小胞体及びゴノレジ体が存 在しないからである。
[0005] 動物細胞内での蛋白質への糖鎖付加及び糖鎖の修飾は、 DNAあるいは蛋白質 の生合成の場合とは異なり、錡型によらない翻訳後修飾 (post— translational mo dification)である。この翻訳後修飾は小胞体及びゴルジ体と呼ばれる細胞内小器 官に局在する数多くの糖鎖生合成関連酵素が介在する複雑な機構を通して行われ る。すなわち、特定の単糖と、その結合様式に特異的な酵素 (糖加水分解酵素及び 糖転移酵素）との連携による複雑な生合成経路に従って、単糖が順次切り取られたり 付加されたりしながら、所定の糖鎖構造が得られるように糖鎖が伸長されていく（非特 許文献 3参照。）。このようにして蛋白質に付加される糖鎖は高等生物の生命現象全 般に深く関わっていることが知られている (非特許文献 4、 5参照。）。
[0006] ヒト体内の蛋白質の半数以上は糖鎖が付加された糖蛋白質として存在することが知 られている (非特許文献 6参照。）。
本来糖鎖の付加された形で存在し、活性を有する糖蛋白質を糖鎖のない状態にす ると、活性を失うことが懸念される。例えば、赤血球造血ホルモンとして知られるエリス ロボチンでは糖鎖を除去すると薬効を失ってしまうことが知られている（非特許文献 7 参照。）。
[0007] 蛋白質を安価に生産できる宿主で糖鎖付加の能力を有する細胞としては酵母が知 られている（非特許文献 8— 10参照。）。酵母は真核生物であり、小胞体及びゴルジ 体を有しているため、糖鎖生合成機構が備わっている。しかし、酵母の糖鎖生合成 機構は動物細胞とは大きく異なっているため、糖鎖付加部位を有する蛋白質を酵母 で生産すると、酵母型の糖鎖が付加されることになる。酵母の糖鎖構造はヒトその他 の哺乳動物の糖鎖構造とは大きく異なっていることが知られている（非特許文献 11参 照。）。
このため、このような組換え蛋白質はヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示す のでヒト及び動物の医薬品として用いることはできない。 [0008] また、昆虫細胞も糖鎖付加能を有する宿主であって、比較的安価に蛋白質を生産 すること力 Sできる力 昆虫細胞の糖鎖構造もヒト型の糖鎖構造とは異なることが知られ ている (非特許文献 12参照。）。
従って、昆虫細胞もヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示す可能性がある。
[0009] そこで、酵母や昆虫細胞等を用いて生産した蛋白質から糖鎖を除去するか、もしく は蛋白質分子中の糖鎖付加部位に変異が導入されるようにした遺伝子を酵母ゃ昆 虫細胞等に導入することで、糖鎖付加のない蛋白質をつくることが考えられる。しかし 、上述のように、本来糖鎖の付加された形で存在する蛋白質を糖鎖のない状態にす ると、活性を失うことが懸念される。
[0010] HGFは 5本の糖鎖が付加されている（非特許文献 13、 14参照。）。 HGFの糖鎖を 除去した場合の活性への影響にっレ、ては、 N-結合型糖鎖付加の阻害剤であるツユ 力マイシンを HGF産生細胞に添カ卩して培養した場合、産生される HGFが細胞遊走 活性を保持しているとの報告がある（論文中では HGFは SFと表されている）（非特許 文献 15参照。）。
し力し、この論文では、ッニカマイシン存在下で産生された HGFの糖鎖がどの程度 欠損しているかについての解析がなされておらず、十分な知見を与えるものではない また、同論文において、 HGFを N—ダリカナーゼゃ O—ダリカナーゼで処理しても、 HGFが細胞遊走活性を保持しているとの記載があるが、同論文中では N—ダリカナ ーゼ処理した HGFや O—ダリカナーゼ処理した HGF力 糖鎖を認識する ConAカラ ムに吸着されていることを示している。 N_ダリカナーゼ処理した HGFや〇—ダリカナ ーゼ処理した HGFが ConAカラムに吸着されることは、糖鎖の除去が十分になされ ていないことを意味する。したがって、 N—ダリカナーゼ処理した HGFや〇_ダリカナ ーゼ処理した HGFが細胞遊走活性を保持しているとの記載は、糖鎖を欠損した HG Fが細胞遊走活性を保持していると結論づけるものではない。
[0011] さらに、 HGFは細胞遊走活性に加えて細胞増殖、形態形成促進、血管新生作用、 抗細胞死活性又は神経保護作用等多岐にわたる活性を有している（非特許文献 16 参照。）。 糖鎖を欠損した HGFが細胞遊走活性を有してレ、ても、他の機能も有してレ、るとは 言い難い。例えば、 HGFのトランケート型バリアントである NK2は、細胞遊走活性を 有するが、細胞増殖活性は有していない（非特許文献 17参照。）。
このように、 HGFの糖鎖が欠損した場合に、 HGFが多彩な機能を保持しているか どうかは全く不明であった。 HGFは多彩な活性を有することから、生体修復因子と考 えられており、 HGFの糖鎖を欠損させても、 HGFの高度な機能に影響がないとは考 えられなかった。
特許文献 1 :特開平 4 - 18028号公報
特許文献 2：特開平 4 - 49246号公報
特許文献 3 :欧州特許出願公開第 492614号明細書
特許文献 4 :特開平 6— 25010号公報
特許文献 5 :国際公開第 93/8821号ノ
特許文献 6 :特開平 6 - 172207号公報
特許文献 7：特開平 7 - 89869号公報
特許文献 8：特開平 6 - 40934号公報
特許文献 9 :国際公開第 ί
特許文献 10 :特開平 6 - 40935号公報
特許文献 11 :特開平 6 - 56692号公報
特許文献 12：特開平 7 - 41429号公報
特許文献 13 :国際公開第 93/3061号パンフレット
特許文献 14 :特開平 5 - 213721号公報
特許文献 15：特開平 11 - 4696号公報
特許文献 16 :特開平 10 - 191991号公報
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明の課題は、 HGFの糖鎖を欠損させた糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を提供し 、またその製造方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは上記課題を解決すべく HGFの糖鎖機能に関する研究を鋭意重ねた 結果、 HGFの糖鎖を除去しても HGFの機能が保持されることを見出した。 HGFのよ うな高度な機能を有する蛋白質が、糖鎖を除去しても機能を保持していることは全く 予想外のことであった。それどころか、糖鎖欠損型 HGFは糖鎖を有する HGFに比べ て血中安定性が向上しており、このような事実は全く驚くべき発見であった。以上の 発見に基づき、本発明者らはさらに研究をすすめ本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、
(1) 肝細胞増殖因子の糖鎖付加部位の全部又は少なくとも一ヶ所において糖鎖が 欠損していることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
(2) 上記（1)記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、肝細胞増殖因子の少な くとも 1ケ所の糖鎖付加部位において糖鎖が付加されないようにアミノ酸配列に変異 が導入された糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、 (3) 肝細胞増殖因子のアミノ酸配列に対して、次の a)から d)に示される改変の少な くとも一つ以上がなされてレ、ることを特徴とする上記（2)記載の糖鎖欠損型肝細胞増 殖因子；
a)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、少なくとも一つのコンセンサス配列の Asnが他のアミノ酸残基に置換されている b)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、一つのコンセンサス配列の Ser又は Thr、あるいは 2以上のコンセンサス配列の Ser又は Z及び Thrが他のアミノ酸残基に置換されてレ、る；
c)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、少なくとも一つのコンセンサス配列の X力 Proに置換されている；又は
d)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する少なくとも一つの〇-結合型糖鎖付 加を受ける Ser又は/及び Thrが他のアミノ酸残基に置換されている、
(4) 肝細胞増殖因子がヒト肝細胞増殖因子であることを特徴とする上記（1)から（3) のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
(5) 肝細胞増殖因子がネコ又はィヌ肝細胞増殖因子であることを特徴とする上記（ 1)から（3)のレ、ずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
(6) 配列番号 1に記載のアミノ酸配列をもとに改変される上記（1)から (4)のいずれ かに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、配列番号 1中のアミノ酸に対して
、次の a)から e)に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
a)第 294位又は/及び第 296位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は Z及び第 295位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 294位に糖鎖が付加されていない； b)第 402位又は/及び第 404位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は Z及び第 403位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 402位に糖鎖が付加されていない； c)第 476位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第 476位に糖鎖 が付加されていない；
d)第 566位又は/及び第 568位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 567位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 566位に糖鎖が付加されていなレ、； 又は
e)第 653位又は Z及び第 655位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 654位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 653位に糖鎖が付加されていなレ、、 及び
(7) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をもとに改変される上記（1)から (4)のレ、ずれ かに記載の肝細胞増殖因子であって、配列番号 2中のアミノ酸に対して、次の a)から e)に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする糖鎖欠損型 肝細胞増殖因子；
a)第 289位又は/及び第 291位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 290位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 289位に糖鎖が付加されていなレ、； b)第 397位又は/及び第 399位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 398位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 397位に糖鎖が付加されていなレ、； c)第 471位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第 471位に糖鎖 が付加されていない；
d)第 561位又は/及び第 563位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 562位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 561位に糖鎖が付加されていなレ、； 又は
e)第 648位又は Z及び第 650位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 649位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 648位に糖鎖が付加されていなレ、、 に関する。
また、本発明は、
(8) 上記（1)から（7)のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子をコードしう る塩基配列からなる DNA、
(9) 上記（8)記載の DNAを組み込んだベクター、 (10) 上記（9)記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは 該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは 該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とす る上記（1)から（7)のレ、ずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
(11) 細胞が真核細胞である上記（10)記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造 法、
(12) 真核細胞が酵母又は昆虫細胞である上記（11)記載の糖鎖欠損型肝細胞増 殖因子の製造法、
(13) 上記（9)記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型肝 細胞増殖因子を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回 収することを特徴とする上記（1)から（7)のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増 殖因子の製造法、
(14) 糖鎖を有する肝細胞増殖因子を酵素で処理することによって糖鎖を全部又は 部分的に除去し、該酵素反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収するこ とを特徴とする上記（1)から（7)のレ、ずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の 製造法、
(15) 糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列を含む DNAを組み込ん だベクター又は上記（9)記載のベクターからなる遺伝子を糖鎖付加能のない細胞に 導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞 増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中力 糖鎖欠損型肝細 胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（1)から（7)のレ、ずれかに記載の 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
(16) 糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列又は上記（8)記載の塩 基配列からなる遺伝子を铸型として無細胞蛋白質合成システムによって糖鎖欠損型 肝細胞増殖因子を合成し、該合成反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回 収することを特徴とする上記（1)から（7)のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増 殖因子の製造法、
(17) 上記（1)から（7)のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を有効成 分とする医薬製剤、及び
(18) 上記 (8)記載の DNAを含む遺伝子治療薬、
に関する。
発明の効果
[0015] 本発明の糖鎖欠損型 HGFは、細胞増殖活性、細胞遊走活性又は形態形成活性 等において糖鎖を有する HGFと同等の活性を有し、温度安定性も同等であるので、 糖鎖を有する HGFの代替品となり得る。従って、本発明の糖鎖欠損型 HGFを有効 成分とする医薬製剤は、糖鎖を有する HGFと同様の用途、すなわち、哺乳動物 (例 えば、ヒト、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、モルモット等）に対し 、肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作 用防止剤、肺障害治療剤、胃 ·十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑 制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺 線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷 治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促進剤等として用いることが できる。
また、本発明の糖鎖欠損型 HGFをコードする DNAを含む医薬は、上記疾患の遺 伝子治療薬として用いることができる。
また、本発明の糖鎖欠損型 HGFは糖鎖を有する HGFよりも血中安定性が向上し ているので、 HGFの投与量を低減することができ、 HGFによる副作用の防止が図れ る。
本発明の糖鎖欠損型 HGFは、酵母や昆虫細胞での生産が可能であるため、安価 に生産することができる。
図面の簡単な説明
[0016] [図 1]各 HGFの SDS-PAGEによる分析結果を示す図である。各 HGFを還元処理し て泳動した後、ゲルを銀染色した。
[図 2]HGFの肝実質細胞増殖活性にっレ、て、ラット肝実質細胞の DNA合成量を指 標として示した図である。
[図 3]HGFの細胞遊走活性について、 MDCK細胞の分散の程度によって比較した 結果を示す図である。
[図 4]HGFの形態形成活性について、 MDCK細胞の管腔形成の程度によって比較 した結果を示す図である。
[図 5]HGFの温度安定性を示す図である。 37°Cにおいて各 HGFを表示された日数 の間インキュベートした。残存活性をラット肝実質細胞の DNA合成量を指標として測 定し、相対値として表した。
[図 6]HGFの血中安定性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係わる糖鎖欠損型 HGFは、糖鎖を有 する哺乳動物、例えばヒト、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、ゥサギ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ又は モルモット等の HGFの糖鎖付加部位の全部又は少なくとも 1ケ所の糖鎖が欠損する ように、構造が改変された HGFをいう。
また、本発明の糖鎖欠損型 HGFには、公知の HGFに糖鎖が付加されないように 変異が導入されたアミノ酸配列のうち、 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加も しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有する蛋白質も含まれる。さ らに、本発明の糖鎖欠損型 HGFには、公知の HGFに糖鎖が付加されないように変 異が導入されたアミノ酸配列と少なくとも約 60%以上の相同性を有する蛋白質、好ま しくは約 80%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 90%以上の相同性を 有する蛋白質、さらに好ましくは約 95%以上の相同性を有する蛋白質であって、か つ HGF活性を有する蛋白質も含まれる。
なお、アミノ酸配列について、「1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは 挿入」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に 生じうる程度の数が、欠失、置換、付加又は揷入等されていることを意味する。
また、上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間 におレ、て各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
本発明の糖鎖欠損型 HGFは、 HGFの糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において 糖鎖が付加されなレ、ように変異を導入した HGF遺伝子を組み込んだベクターを細胞 に導入して得られる。 また、本発明の糖鎖欠損型 HGFは、糖鎖を有する HGFの塩基配列を含むベクタ 一を糖鎖付加能のない細胞に導入して得ることもできる。
[0018] HGFの糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において糖鎖が付加されないように HGF 遺伝子に変異を導入する方法としては、欠損させたレ、糖鎖の付加部位のアミノ酸配 列に対応する塩基配列に変異を導入するのがよい。蛋白質に糖鎖が付加する場合 、糖鎖には N結合型糖鎖と O 結合型糖鎖があるので、それぞれについて次のような 変異を導入する。
N—結合型糖鎖にはコンセンサス配列〔Asn_X_Ser又は Asn_X_Thr (Xはプロリ ン以外のアミノ酸を示す。）〕が存在することが知られている。コンセンサス配列が存在 するときには Asnに糖鎖が結合する（Kobata, A. , Eur. J. Biochem.、 1992年、 第 209卷、 p. 483— 501)。このため、コンセンサス配列中の Asnを他のアミノ酸（例 えば、 Gin等）に変換する力 \あるいは、 Ser又は Thrを他のアミノ酸（例えば、 Gly、 A la等）に変換するように塩基配列に変異を導入することで、該当部位の N 結合型糖 鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は、上記コンセンサス 配列の前後のアミノ酸配列と新たなコンセンサス配列を形成しないアミノ酸を適宜選 択するのが好ましい。また、コンセンサス配列中の Xの部位にプロリンが導入されるよ うに塩基配列に変異を導入してもよい。
O 結合型糖鎖にはコンセンサス配列は存在しないが、〇 結合型糖鎖では、 Ser 力 Thrの水酸基に糖鎖が付加するので、 O 結合型糖鎖付加を受ける部位の Ser又 は Thrを他のアミノ酸 (例えば、 Gly等）に変換するように塩基配列に変異を導入する ことで該当部位の糖鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は 、該アミノ酸の前後のアミノ酸配列と上記コンセンサス配列を形成しなレ、アミノ酸を適 宜選択するのが好ましい。
[0019] HGFにおける糖鎖付加部位は、例えばヒト HGFにおいては、配列表の配列番号 1 で示されるアミノ酸配列の第 294位の Asn (N—結合型糖鎖）、第 402位の Asn (N— 結合型糖鎖）、第 476の Thr (O -結合型糖鎖）、第 566位の Asn (N -結合型糖鎖）、 第 653位の Asn (N -結合型糖鎖）である。また、配列表の配列番号 2で示される 5ァ ミノ酸欠失型ヒト HGFにおける糖鎖付加部位は、第 289位の Asn (N 結合型糖鎖） 、第 397位の Asn (N -結合型糖鎖）、第 471の Thr (〇一結合型糖鎖）、第 561位の A sn (N -結合型糖鎖）、第 648位の Asn (N -結合型糖鎖）である。
また、上記ヒト HGFの上記コンセンサス配列は、配列表の配列番号 1で示されるァ ミノ酸配列の第 294位から第 296位、第 402位から第 404位、第 566位から第 568位 、及び第 653位から第 655位に存在する。 5アミノ酸欠失型ヒト HGFでは、コンセンサ ス配列は、配列表の配列番号 2で示されるアミノ酸配列の第 289位から第 291位、第 397位から第 399位、第 561位から第 563位、及び第 648位から第 650位に存在す る。
HGFの塩基配列に変異を導入する方法としては、変異を導入したい部分に対応 する変異プライマーを合成し、クンケル法等の既知の技術を用いて行うことができる。 また、市販の変異導入キット等を用いるとより簡便に変異を導入することができる。 こうして得られた糖鎖欠損型 HGFのアミノ酸配列をコードする DNAあるいは糖鎖を 有する HGFのアミノ酸配列をコードする DNAを含有するプラスミドやファージ等の組 換ベクターから、制限酵素によって該 DNAを切り出し、糖鎖欠損型 HGFの発現に 適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素と DNAリガーゼを用いて再結合し て組換発現ベクターを作製することが出来る。より詳しくは、転写の下流方向に順番 に、必要により（1)プロモーター、（2)リボソーム結合部位、 （3)開始コドン、（4)本発 明の糖鎖欠損型 HGFをコードする塩基配列を含む DNA、（5)終止コドン、（6)ター ミネーター等を含むように組換発現ベクターが構築される。
上記 DNAには、上記糖鎖付加部位に変異が導入された糖鎖欠損型 HGFをコード する塩基配列からなる DNAだけでなぐ (a)前記糖鎖欠損型 HGFをコードする塩基 配列の塩基の 1もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは揷入された塩基配列 を有し、かつ HGF活性を有する蛋白質をコードする DNA、（b)前記糖鎖欠損型 HG Fをコードする塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有する蛋白質をコードする塩基 配列からなる DNA、又は（c)前記糖鎖欠損型 HGFをコードする塩基配列を有する DNAと少なくとも約 60%以上の相同性を有し、かつ HGF活性を有する蛋白質をコ ードする塩基配列からなる DNAも包含するものである。 上記塩基配列について、「1もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入」 とレ、うときは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然 に生じうる程度の数の塩基が、欠失、置換、付加又は挿入等されていることを意味す る。
ストリンジエントな条件下でハイブリダィズ可能な DNAとは、上記 DNAをプローブと して、コロニー 'ノヽイブリダィゼーシヨン法、プラーク'ノヽイブリダィゼーシヨン法、あるい はサザンプロットノヽイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味 する。
ストリンジェントな条件とは、塩濃度、例えば約 0. 1— 2倍程度の濃度の SSC溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよ りなる。）、温度約 65°C程度でのハイブリダィズ条件をいう。
相同性を有する DNAとは、ハイストリンジェントな条件において、少なくとも約 60% 以上の相同性を有する DNA、好ましくは約 80%以上の相同性を有する DNA、より 好ましくは、約 90%以上の相同性を有する DNA、さらに好ましくは約 95%以上の相 同性を有する DNAをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム 濃度が約 19一 40mM程度、好ましくは約 19一 20mM程度で、温度が約 50— 70°C 程度、好ましくは約 60— 65°C程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約 19mMで 温度が約 65°C程度の場合が最も好ましい条件である。
本発明で用いることが出来るベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合は pBR32 2、 pUC18、 pUC19 (東洋紡績)等のプラスミドを、枯草菌を宿主とする場合は pUB 110 (シグマ社)等のプラスミドを、酵母を宿主とする場合はpYES2 (Invitrogen)、p RB15 (ATCC37062)等のプラスミドを用いることができる。動物細胞用の発現べク ターとしては、 pCAGGS又は pCXN2 (Niwa， H. , Yamamura, K. and Miyaza ki, J. ， Gene, 1991年，第 108卷， p. 193— 200、特開平 03— 168087)、 pcDL— SR a (Takebe, Y. et al. ， Mol. Cell. Biol. ， 1988年、第 8卷、 p. 466-472) 等が挙げられる。その他、バタテリオファージ; l gtl0、 gtl l (ストラタジーン社）、ゥ ィルス SV40 (BRL社）、 BPV (ATCC VR—703)又はレトロウイルスの遺伝子由来 のベクター等を列挙できるが、宿主内で複製 ·増幅可能なベクターであれば特に限 定はない。
[0022] プロモーター又はターミネータ一に関しても、糖鎖欠損型 HGFをコードする塩基配 列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。プロモーター の例としては、宿主が大腸菌である場合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 rec Aプロモーター、 λ PLプロモーター又は lppプロモーター等が挙げられ、宿主が酵母 である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター又は A DHプロモーター等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、ラウス肉腫 ウィルス（ウィルス RSV)、 MPSV、ポリオマーウイルス、鶏頭ウィルス、アデノウイルス 、ゥシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス（SMV)、 B型肝炎ゥ ィルス、シミアンウィルス 40 (SV40)又はワクシニアウィルス等のウィルスゲノムから得 られるプロモーター、メロチォネインプロモーター又はヒートショックプロモーター等が 挙げられる。また、高等哺乳動物宿主を用いる際には、好ましくは、ベクターにェンハ ンサーを導入する。ェンノヽンサ一を導入することにより転写が増大する。ェンハンサ 一としては、 SV40ェンハンサー、サイトメガロウィルスの初期プロモーター/ェンハ ンサ一、ポリオマーェンハンサー又はアデノウイルスのェンハンサ一等が挙げられる 。またターミネータ一としては、宿主が大腸菌の場合、 ti"pターミネータ一又は lppタ ーミネーター等を、宿主が枯草菌の場合、 amyFターミネータ一等を、宿主が酵母の 場合、 CYC1ターミネータ一等を、宿主が動物細胞の場合、 SV40ターミネータ一又 は HSV1TKターミネータ一等を例示することが出来る。これらのプロモーターとター ミネーターは用いる宿主に応じて適宜組み合わせて用いるのが好ましい。
[0023] このようにして構築された糖鎖欠損型 HGF発現ベクターは、コンビテント細胞法 CJ.
Mol. Biol.、 1970年、第 53卷、 p. 154)、プロトプラスト法（Pro Natl. Acad. Sc i. USA, 1978年、第 75卷、 p. 1929)、リン酸カノレシゥム法（Science, 1983年、第 221卷、 p. 551)、 DEAEデキストラン法（Science, 1982年、第 215卷、 p. 166)、 電気ノヽ。ノレス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984年、第 81卷、 p. 7161)、イン ビトロパッケージング法（pro Nat. Acad. Sci. USA, 1975年、第 72卷、 p. 581 )、ウィルスベクター法（Cell、 1984年、第 37卷、 p. 1053)、又はマイクロインジエタ シヨン法（Exp. Cell. Res.、 1984年、第 153卷、 p. 347)等 ίこよって宿主 (こ導人さ れ、形質転換体が作製される。
[0024] 宿主として用いることのできる細胞としては、特に制限はなぐ動物、植物、昆虫、原 核微生物又は真核微生物の細胞等が挙げられる。これらの細胞は個体を形成してい てもよく、動物個体、植物個体又は昆虫個体を宿主としてもよい。動物細胞では、付 着性細胞又は浮遊性細胞の何れも使用でき、糖鎖欠損型 HGFを細胞内に生産蓄 積する動物細胞でもよぐあるいは糖鎖欠損型 HGFを細胞外に分泌生産する動物 細胞でもよレ、。例えば、 CHO細胞（チャイニーズノヽムスター卵巣細胞）、 COS細胞、 BHK細胞、マウス C127細胞又は Hela細胞等が挙げられる。植物細胞ではイネ、タ バコ又はシロイヌナズナ等を挙げることができ、昆虫細胞では Sf9や Sf21等の細胞 を挙げることができる。昆虫個体では例えばカイコを挙げることができる。原核微生物 では大腸菌又は枯草菌等が挙げられ、真核微生物では Saccharomyces cerevisi ae、 ^chizosaccharomyces pombe、し andida boidinii又 fま Pichia pastoris等 の酵母あるいは Aspergillus属、 Trichoderma属又は Mucor属等の糸状菌を挙げ ること力 Sできる。好ましくは、酵母、昆虫細胞又は昆虫個体である。これらのうち、原核 生物の細胞では、糖鎖付加能がないため、野生型の糖鎖を有する HGF遺伝子を導
[0025] 得られた形質転換体は、 目的とする糖鎖欠損型 HGFを産生させるためにその宿主 に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭 素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。培地の例としては、 形質転換体の宿主が大腸菌の場合、 LB培地（日水製薬）又は M9培地 Exp. M ol. Genet. 、 Cold Spring Laboratory, New York, 1972年、 p. 431]等力 S挙 げられ、宿主が酵母の場合は YEPD培地（Genetic Engineering,第 1卷、 Plenu m Press, New York, 1979年， p. 117)等が挙げられる。宿主が動物細胞の場 合、約 20%以下のゥシ胎児血清を含有する改変ィーグノレ培地（MEM培地）、ダル べッコ改変イーグル培地（DMEM培地）又は RPMI1640培地（日水製薬）等を挙げ ること力 S出来る。形質転換体の培養は、通常約 20°C 45°C、 pHは約 5— 8の範囲で 行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞等の 場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビーズ、あるいはァセチルセルロースホローフアイ バー等の担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転 換体が生育すれば、これらに限定されるものではない。
[0026] このようにして形質転換体の培養上清中又は形質転換体中に生成した糖鎖欠損型 HGFは、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲ ル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ及びァフィ二 テイク口マトグラフィ等の 1種又は 2種以上を組み合わせて分離精製することが出来る 。特に、精製方法として、硫酸アンモニゥムによる塩析法、 S—セファロースイオンクロ マトグラフィ、へパリンセファロースァフィニテイク口マトグラフィ、及びフエ二ルセファロ 一ス逆相クロマトグラフィの組み合せ、あるいは硫酸アンモニゥムによる塩析法、 S— セファロースイオンクロマトグラフィ、及び抗 HGF抗体セファロースァフィニテイクロマ トグラフィの組み合わせ等が好ましレ、。
[0027] また、本発明の糖鎖欠損型 HGFは、従来の既知の方法により糖鎖が付加した HG Fを得た後、糖鎖を除去する酵素で該 HGFを処理することでも得られる。糖鎖を除去 する酵素としては、 N—結合型糖鎖の除去の目的ではグリコべプチダーゼ F又はダリ コぺプチダーゼ A等を使用することができる。 O—結合型糖鎖の除去は、シァリダーゼ 、フコシダーゼ及び O—ダリカナーゼ等の 1種又は 2種の組み合わせによって達成さ れる。酵素処理して得られた糖鎖除去 HGFは、本発明の糖鎖欠損型 HGFとして上 述の精製法によって精製することができる。
[0028] さらに、本発明の糖鎖欠損型 HGFは、無細胞蛋白質合成システムを利用して得る こともできる。無細胞蛋白質合成システムとは、大腸菌、ゥサギ網状赤血球細胞又は 小麦胚芽等から調製した細胞抽出液を用いる力、あるいは細胞抽出液中に含まれる 蛋白質合成因子群を利用して、 目的蛋白質をコードする DNAあるいは mRNAを铸 型として、生細胞を用いずに蛋白質合成を行うシステムをいう。細胞抽出液にはリボ ソーム、 tRNA又は翻訳因子等の蛋白質合成に必要な分子群が含まれているため、 これに ATPや GTP等のエネルギー源及び基質となるアミノ酸を添加すると、蛋白質 が合成される。細胞抽出液の代わりに、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群 を混合して用いてもよい。無細胞蛋白質合成システムでは、小胞体やゴルジ体が含 まれないため、糖鎖付加部位を有する糖鎖を有する HGFをコードする DNAあるい は mRNAを铸型として、糖鎖の欠損した糖鎖欠損型 HGFを生産することができる。 また、糖鎖付加部位に変異を導入した DNAあるいは mRNAを用いることもできる。 無細胞蛋白質合成反応液中において合成された糖鎖欠損型 HGFは、上述の精製 法によって精製することができる。
[0029] 上記のようにして得られる本発明の糖鎖欠損型 HGFは、細胞増殖活性、細胞遊走 活性又は形態形成活性等において糖鎖を有する HGFと同等の活性を有し、温度安 定性においても同等である。一方、本発明の糖鎖欠損型 HGFは糖鎖を有する HGF よりも血中安定性が向上している。
[0030] 本発明に係わる糖鎖欠損型 HGFは、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ィヌ、ネコ、ラッ ト、マウス、ゥサギ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、モルモット等）に適用できる。
本発明の糖鎖欠損型 HGFを有効成分とする医薬は、野生型の糖鎖が付加された HGFと同様の用途、例えば肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、 抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃'十二指腸損傷治療剤、脳 神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療 剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、 血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促 進剤等として用いることができる。また、本発明の糖鎖欠損型 HGFをコードする DN Aを含む医薬は、上記疾患のための遺伝子治療薬として用いることができる。
[0031] 本発明の糖鎖欠損型 HGFは蛋白質医薬品として有効であり、一般的な医薬製剤 の形態で用いられる。本発明の糖鎖欠損型 HGFを有効成分として含有する医薬製 剤は、種々の製剤形態 (例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的 には有効成分である糖鎖欠損型 HGFと結合性物質のみ、又はそれと慣用の担体と 共に注射剤、吸入剤、坐斉又は経口剤とされ、中でも注射剤が好適である。当該注 射剤は常法により調製することができ、例えば、糖鎖欠損型 HGF及び結合性物質を 適切な溶剤 (例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、該溶解 物をフィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製 すること力 Sできる。注射剤中の糖鎖欠損型 HGF含量としては、通常約 0. 0002— 3 ( WZV%)程度、好ましくは約 0. 001 2 (W/V%)程度に調製される。また、経口 薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳 剤、懸濁剤又は、シロップ剤等の剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法 に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤 (例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グ リセ口ゼラチン、マクロゴール、ウイテツプゾル等）を用いた製剤上の常法によって調 製すること力 Sできる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる 。製剤中の糖鎖欠損型 HGF含量は、剤形、適用疾患等に応じて適宜調製すること ができる。
本発明の糖鎖欠損型 HGFの医薬製剤の製剤化に際して、安定化剤が添加される ことが好ましい。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、ァラニ ン、グリシン、マンニトーノレ、グノレコース、デキストラン、ソノレビトーノレ、エチレングリコー ル等が挙げられる。さらに、本発明の医薬製剤は製剤化に必要な他の添加物、例え ば、溶剤 (例えば、生理食塩液、滅菌精製水、注射用水等）、賦形剤 (例えば、果糖、 D-ソルビトール、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、デキストリン等）、結合剤（例 えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等）、溶解補助剤（例えば、 ラウロマクロゴール、ポリソノレべート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、アラビア ゴム、安息香酸ナトリウム等）、酸化防止剤（例えば、 Lーァスコルビン酸、トコフェロー ノレ、ェデト酸ナトリウム等）、無痛化剤（例えば、塩ィヒベンザルコニゥム、塩酸プロカイ ン等）、等張化剤（例えば、塩ィ匕ナトリウム、ブドウ糖、 D-マンニトール、ダルセリン等） 、緩衝剤（例えば、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、乳酸、リン酸 水素ナトリウム等）、増粘剤（アラビアゴム、カルメロース、ポピドン、メチルセルロース 等）、保存剤（例えば、パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、パラ ォキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニ ゥム等）又は pH調整剤 (塩酸、水酸化ナトリウム、クェン酸、酢酸等）などを含んでい てもよい。
液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存する のが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用さ れる。
また、経口剤とする場合には、顆粒又は錠剤等は、腸溶性コーティング剤 (例えば 酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフ タレート、カルボキシメチルェチルセルロース等）などで剤皮を施されるのが好ましぐ カプセル剤では、腸溶性カプセル剤とされるのが好ましレ、。
[0033] 本発明の医薬製剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る 。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下又は筋肉内等に投与することがで きる。その投与量は、患者の疾患、症状、年齢又は体重等により適宜調整されるが、 例えば、成人に対し、通常糖鎖欠損型 HGFとして約 0. Olmg— 500mg、好ましくは 約 0. 05mg— lOOmgであり、これを 1日 1回ないし数回に分けて投与するのが適当 である。
[0034] 本発明の糖鎖欠損型 HGFをコードする塩基配列を有する DNAは、上記ベクター に組み込まれ、遺伝子治療薬としても用いることができる。
本発明の遺伝子治療薬は、上記の糖鎖欠損型 HGF遺伝子と遺伝子運搬体との複 合体として作製されることが好ましい。遺伝子運搬体としては、ウィルスベクター又は カチオン性遺伝子運搬体等が好ましい。ウィルスベクターでは、例えば、マウス白血 病ウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、 HIVベタ ター、ヘルぺスシンプレックスベクター又はセンダイウィルスベクター等が挙げられる
。カチオン性遺伝子運搬体では、例えば、ポリリジン又はポリジァミノ酪酸等のポリアミ ノ酸、あるいはリボソームやエチレンィミン等のカチオン性合成高分子等の遺伝子と 親和性のある物質が挙げられる。
[0035] 以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施 例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
HGF :肝細胞増殖因子
dHGF： 5アミノ酸欠失型肝細胞増殖因子
LB培地： Luria—Bertani培地
DMEM培地：ダルベッコ改変イーグル培地
Amp :アンピシリン
FCS :牛胎児血清 NaCl :塩化ナトリウム
BSA：ゥシ血清アルブミン
PBS :リン酸緩衝食塩水
Tween80：ポリオキシエチレン（20)ソルビタンモノォレエート
実施例 1
[0036] 配列表の配列番号 3に示される 5アミノ酸欠失型 HGF (dHGF；野生型 dHGFとレ、 うこともある。）をコードする塩基配列を pCAGGSベクターに組み込んだ。得られたベ クタ一（以下、野生型ベクターという。）を pCAGGS— dHGFと称する。
dHGF蛋白質に存在する 5箇所の糖鎖付加部位 (配列表の配列番号 2の 289位、 397位、 471位、 561位、 648位）に変異を導入するため、表 1の 5種類の変異プライ マー（5，-リン酸ィ匕）を合成し、 pCAGGS— dHGFベクターをテンプレートとして変異 導入を実施した。この変異により、配列番号 2で示されるアミノ酸配列のうち、 Asn28 9、 Asn397、 Asn561、 Asn648は Ginに、 Thr471は Glyに置換される。
[表 1]
Figure imgf000022_0001
[0037] 変異導入には STRATAGENE社の QuikChange Multi Kitを利用した。変異 の導入されたベクター（以下、変異ベクターという。）は E. coli XLIO Goldのコンビ テント細胞に形質転換し、 LBZAmpプレート上で Amp耐性コロニーをピックアップし た。得られた各クローン力 プラスミドを抽出し、糖鎖欠損型 HGFのコード部分につ いて塩基配列を解析することによって、 目的のクローンをスクリーニングした。 5箇所 に目的の変異が導入され、また他の変異がないことが確認できたベクターを選択し、 以後の実験に用いた。得られた変異ベクターは pCAGGS-dHGF— NGと称する。ま た、上記 1、 2、 3の 3種の変異プライマーを用いて同様の操作を行い、 α鎖の 3箇所 の糖鎖を欠損するように設計した変異ベクター pCAGGS_dHGF— a NGを作製し た。さらに、上記 3、 4の変異プライマーを用いて同様の操作を行レ、、 鎖の 2箇所の 糖鎖を欠損するように設計した変異ベクター pCAGGS_dHGF— β NGを作製した。
[0038] 次に、野生型ベクター pCAGGS—dHGF及び変異ベクター pCAGGS_dHGF_N G、 pCAGGS— dHGF—ひ NG、 pCAGGS— dHGF— /3 NGをそれぞれ COS— 7糸田 胞にトランスフエタトした。 COS—7細胞は DMEM培地に牛胎児血清（FCS)を 10。/o 添加して培養した。細胞はトランスフヱクシヨンの直前に無血清 DMEM培地に交換し た。トランスフエクシヨンはリポフエクタミン 2000 (Invitrogen)を用いてリポフエクシヨン 法によって行った。トランスフエクシヨンの 6時間後、 1 %FCSを含む DMEMに培地 交換し、その際にへパリンを 1 μ g/mLとなるように添加した。これを 3日間培養し、 野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを培地中に蓄積させた。 3日後に培地を回収 して混合し、 0. 22 z mフィルターで濾過した後、精製に供するまで一 80°Cで保存し た。培地中に分泌された野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFの濃度は ELISAによ つて分析した。
[0039] 上記の培地を解凍し、再度 0. 22 μ ΐηフィルターで濾過した後、 50mM Tris-HC 1 (ρΗ7. 5)、 0· 01 %Tween80、 0. 3Μ NaClで平衡化した HiTrap Heparin (B ed volume： 5mL) (Amersham Biosciences)に 0. 6mL 分の流速で添カ卩した 。カラムを 50mM Tris-HCl (pH7. 5)、 0. 01 %Tween80、 0. 3M NaClで洗浄 後、 NaCl濃度を 2Mまで上昇させることによって野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dH GFを溶出させた。溶出は lmL/分の流速で行い、 2. 5mL/tubeで分画した。野 生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFの存在する画分を回収し、限外濾過によって 50 mM Tris-HCl (pH7. 5)、 0. 01 %Tween80、 0. 3M NaClに buffer交換した。 これを同 bufferで平衡化した Mini Sカラム（Bed volume : 0. 8mL) (Amersham Biosciences)に 0. 4mLZ分の流速で添加した。カラムを 50mM Tris-HCl (ρΗ 7. 5)、 0. 01 %Tween80、 0. 3M NaClで洗浄後、 NaCl濃度を 1Mまで上昇させ ることによって野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを溶出させた。溶出は 0. 4mL /分の流速で行い、 0. 4mL/tubeで分画した。野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dH GFの存在する画分を回収し、精製状態を SDS—P AGEによって確認した。 [0040] 野生型ベクターの導入によって得られた dHGFを COS— dHGF— WT、変異べクタ 一の導入によって得られた糖鎖欠損型 dHGFをそれぞれ COS_dHGF_NG、 COS -dHGF- a NG又は COS_dHGF_ β NGと称する。
また、特開平 10—191991に記載の方法に従って CH〇細胞によっても dHGF蛋白 質を調製した（CHO_dHGF-WTと称する）。
[0041] これらの dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを SDS—P AGEによって比較した結果を図
1に示す。糖鎖欠損型 dHGFの COS_dHGF_NGでは、 ひ鎖及び /3鎖ともに糖鎖 を欠損する分子量に対応する位置にバンドがシフトしていることが確認された。糖鎖 付加型（野生型） dHGFである C〇S_dHGF— WTと CHO_dHGF— WTを比較する と、 C〇S_dHGF_WTは CHO_dHGF_WTより糖鎖付加の程度が少なレ、が、これ は宿主として用いた COS細胞と CH〇細胞の糖鎖付加能力の差あるいは精製方法 の差によるものと考えられた。 ひ鎖の糖鎖のみを欠損する COS_dHGF_ひ NGでは 、 a鎖のバンドが糖鎖を欠損する分子量に対応する位置にシフトしてレ、ることが確認 された。 鎖の糖鎖のみを欠損する C〇S_dHGF_ i3 NGでは、 鎖のバンドが糖 鎖を欠損する分子量に対応する位置にシフトしていることが確認された。
実施例 2
[0042] 実施例 1で得られた野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを用いて、ラット肝実質 細胞に対する増殖活性を測定した。
SDラット（8週齢、雄)から、コラゲナーゼ灌流法によって肝実質細胞を分離した。 得られた肝実質細胞を 5%FCSを含むウイリアムズ E (WE)培地に懸濁し、 3万個 Zc m2の細胞密度で培養ディッシュに播レ、た。 4時間後に培地を除去して新しレ、WE培 地（5%FCSを含む) 480 x Lに置換し、培養を継続した。さらに 20時間後に野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを含むサンプル溶液を 20 μ L添カ卩し、培養を継続し た。野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを添カ卩してから 20時間の後、 [ ]チミジ ン（25Ci/mmol)を 2. 5 μ Ci/mLとなるように添加し、さらに培養を 6時間継続した 。その後、細胞を PBSで 2回洗浄し、 10%トリクロ口酢酸を添加して 4°Cで 20分間静 置した。さらに、新しい 10%トリクロ口酢酸に置換して 10分間静置し、次に H OlmL
2 で洗浄した。これに 0. 5N_Na〇Hを加えて 37°Cで 30分間インキュベートし、細胞を 溶解させた。細胞溶解液に 1N—HC1を加えて中和した。これをセルハーべスターに かけ、細胞溶解物をガラスフィルターに捕集した。フィルターを乾燥させた後、フィノレ ター上に固形シンチレ一ター（MeltiLex)をのせてホットプレート上で加温し、シンチ レーターをフィルタ一中に溶け込ませた後、 /3—カウンターによって放射活性を測定 した（図 2)。放射活性の値は、細胞に取り込まれた [3H]チミジンの量を表しており、こ れは細胞増殖に伴う DNA合成の量を反映している。すなわち、放射活性の値は、細 胞増殖活性を反映している。
糖鎖欠損型 dHGF (COS_dHGF_NG)は、野生型 dHGF (COS_dHGF_WT 及び CHO_dHGF— WT)と同等の肝細胞増殖活性を示した。 α鎖の糖鎖を欠損す る C〇S_dHGF—ひ NG及び /3鎖の糖鎖を欠損する C〇S_dHGF_ j3 NGも同等の 活性を示した。
実施例 3
[0043] MDCK— 3B細胞を DMEM (10%FCSを含む）に懸濁して 24wellプレートに 1 X 104cells/well (480 μ L/well)で播き、ここに野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dH GFを含む被検サンプル 20 /i Lを添加した。 37°Cで 20時間培養した後、 scatterの 有無を顕微鏡で観察した（図 3)。
糖鎖欠損型 dHGF (COS_dHGF_NG)は、野生型 dHGF (COS_dHGF_WT 及び CHO_dHGF— WT)と同等の細胞遊走活性を示した。 α鎖の糖鎖を欠損する COS-dHGF- a NG及び β鎖の糖鎖を欠損する COS_dHGF_ β NGも同等の活 性を示した。
実施例 4
[0044] DMEM (10%FCSを含む）に溶解したコラーゲン溶液（Cellmatrix I— A、新田 ゼラチン）に MDCK— 3B細胞を懸濁して 5000cells/mLの溶液とし、 24wellプレ ートに 500 μ Lずつ分注した（2500cells/well)。 37°Cで 10分間インキュベートして コラーゲンをゲル化した後、 DMEM (10%FCSを含む）を 480 μ L上層し、ここに野 生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを含む被検サンプル 20 μ Lを添加した。 37°Cで 6日間培養した後、チューブ形成の状態を顕微鏡で観察した（図 4)。
糖鎖欠損型 dHGF (COS_dHGF_NG)は、野生型 dHGF (COS_dHGF_WT 及び CHO— dHGF— WT)と同等の形態形成活性を示した。 a鎖の糖鎖を欠損する COS-dHGF- a NG及び β鎖の糖鎖を欠損する COS_dHGF_ β NGも同等の活 性を示した。
実施例 5
[0045] 野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFサンプルを 50mM Tris_HCl (pH7. 5)、 0. 01 %Tween80、 0. 3M NaClで希釈して 50 μ g/mLの濃度に調製し、密封し た容器に入れて 37°Cで 7日間インキュベートした。経日的に一部をサンプリングして 、 -80°Cに保存した。サンプリングした溶液中の野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHG Fの残存活性を、実施例 2と同様にしてラット肝実質細胞における DNA合成を調べる ことによって評価した。活性測定にあたっては、サンプリングした溶液を PBS、 0. 5 % BSAで 1 25ng/mLに希釈した後、その 20 β Lを肝細胞の培養液 480 μ Lに添加し て final 5ngZmLとした。
糖鎖欠損型 dHGF (COS_dHGF_NG)は、野生型 dHGF (COS_dHGF_WT 及び CHO— dHGF— WT)と同等の温度安定性を示した（図 5)。 α鎖の糖鎖を欠損 する C〇S_dHGF_ a NG及び 鎖の糖鎖を欠損する C〇S_dHGF_ i3 NGも同等 の安定性を示した。
実施例 6
[0046] 80 z Lの 50mM Tris-HCl (pH7. 5) , 0. 01 %Tween80, 0. 3M NaCUこ Na 125Iを 50 μ Ci添加し、これに IODO— BEADS (PIERCE)を 1粒添加して、室温で 5 分間インキュベートした。ここに 5 μ gの野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFを含む 20 /i Lの溶液（50mM Tris-HCl (pH7. 5)、 0. 01 %Tween80、 0. 3M NaCl) を添加し、室温で 5分間インキュベートすることによってョード化反応を行った。チュー ブから反応液を抜き出すことによってョード化反応を停止させ、抜き出した反応液を S ephadex G— 25 (Amersham Biosciences)カラムによるゲノレ滤過に供することに よって未反応の Na125Iを除去し、 1251— dHGFを精製した。
500 , OOOcpmの1251— dHGFを、 0 · 1 %BSAを含む PBSで希釈して 100 /i Lの溶 液とした。これを ICRマウス (8週齢、雄）に尾静脈力も投与した。投与後、 1分、 5分、 1 5分、 30分、 60分、 1 20分に血液を採取した。採取した血液から血漿を分離し、ガ ンマカウンタ一にて放射活性を測定し野生型 dHGF及び糖鎖欠損型 dHGFの血中 安定性を評価した（図 6)。
糖鎖欠損型 dHGF (COS_dHGF_NG)は、 CHO_dHGF-WTに比べて、血中 の安定性が向上してレ、た。 COS— dHGF_WTは COS— dHGF— NGと CHO— dHG F— WTの中間の安定性を示した。これは、実施例 1に示したように、 COS-dHGF- WTが糖鎖を部分的に欠損しているためと考えられた。
産業上の利用可能性
本発明の糖鎖欠損型 HGFは、糖鎖が付加した HGFの代替 HGFとして有用である

Claims

請求の範囲
[1] 肝細胞増殖因子の糖鎖付加部位の全部又は少なくとも一ヶ所において糖鎖が欠 損していることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
[2] 請求の範囲第 1項記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、肝細胞増殖因子 の少なくとも 1ケ所の糖鎖付加部位において糖鎖が付加されないようにアミノ酸配列 に変異が導入された糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
[3] 肝細胞増殖因子のアミノ酸配列に対して、次の a)から d)に示される改変の少なくと も一つ以上がなされていることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の糖鎖欠損型肝 細胞増殖因子；
a)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、少なくとも一つのコンセンサス配列の Asnが他のアミノ酸残基に置換されている b)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、一つのコンセンサス配列の Ser又は Thr、あるいは 2以上のコンセンサス配列の Ser又は Z及び Thrが他のアミノ酸残基に置換されてレ、る；
c)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する Asn— X— Ser又は Asn— X— Thr (X は Pro以外のアミノ酸を示す。 )で示される N—結合型糖鎖付加のコンセンサス配列の うち、少なくとも一つのコンセンサス配列の X力 SProに置換されている；又は d)肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する少なくとも一つの〇-結合型糖鎖付 加を受ける Ser又は Z及び Thrが他のアミノ酸残基に置換されている。
[4] 肝細胞増殖因子がヒト肝細胞増殖因子であることを特徴とする請求の範囲第 1項か ら第 3項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
[5] 肝細胞増殖因子がネコ又はィヌ肝細胞増殖因子であることを特徴とする請求の範 囲第 1項から第 3項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
[6] 配列番号 1に記載のアミノ酸配列をもとに改変される請求の範囲第 1項から第 4項 のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、配列番号 1中のアミノ酸 に対して、次の a)から e)に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを 特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
a)第 294位又は/及び第 296位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 295位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 294位に糖鎖が付加されていなレ、； b)第 402位又は/及び第 404位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は Z及び第 403位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 402位に糖鎖が付加されていなレ、； c)第 476位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第 476位に糖鎖 が付加されていない；
d)第 566位又は/及び第 568位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は Z及び第 567位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 566位に糖鎖が付加されていなレ、； 又は
e)第 653位又は Z及び第 655位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 654位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 653位に糖鎖が付加されていなレ、。
[7] 配列番号 2に記載のアミノ酸配列をもとに改変される請求の範囲第 1項から第 4項 のいずれかに記載の肝細胞増殖因子であって、配列番号 2中のアミノ酸に対して、 次の a)から e)に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
a)第 289位又は/及び第 291位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 290位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 289位に糖鎖が付加されていなレ、； b)第 397位又は/及び第 399位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 398位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 397位に糖鎖が付加されていなレ、； c)第 471位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第 471位に糖鎖 が付加されていない；
d)第 561位又は/及び第 563位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は Z及び第 562位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 561位に糖鎖が付加されていなレ、； 又は
e)第 648位又は Z及び第 650位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は/及び第 649位 のアミノ酸が Proに置換されていることによって第 648位に糖鎖が付加されていなレ、。
[8] 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子をコ ードしうる塩基配列からなる DNA。
[9] 請求の範囲第 8項記載の DNAを組み込んだベクター。
[10] 請求の範囲第 9項記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もし くは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしく は該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴と する請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子 の製造法。
[11] 細胞が真核細胞である請求の範囲第 10項記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の 製造法。
[12] 真核細胞が酵母又は昆虫細胞である請求の範囲第 11項記載の糖鎖欠損型肝細 胞増殖因子の製造法。
[13] 請求の範囲第 9項記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型 肝細胞増殖因子を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製 回収することを特徴とする請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠 損型肝細胞増殖因子の製造法。
[14] 糖鎖を有する肝細胞増殖因子を酵素で処理することによって糖鎖を全部又は部分 的に除去し、該酵素反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを 特徴とする請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増 殖因子の製造法。
[15] 糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列を含む DNAを組み込んだべ クタ一又は請求の範囲第 9項記載のベクターからなる遺伝子を糖鎖付加能のない細 胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝 細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中力 糖鎖欠損型 肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする請求の範囲第 1項から第 7項のい ずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
[16] 糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列又は請求の範囲第 8項記載の 塩基配列からなる遺伝子を铸型として無細胞蛋白質合成システムによって糖鎖欠損 型肝細胞増殖因子を合成し、該合成反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製 回収することを特徴とする請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠 損型肝細胞増殖因子の製造法。
[17] 請求の範囲第 1項から第 7項のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を 有効成分とする医薬製剤。
[18] 請求の範囲第 8項記載の DNAを含む遺伝子治療薬。
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