KR101203606B1

KR101203606B1 - 당쇄결손형 간세포 증식 인자

Info

Publication number: KR101203606B1
Application number: KR1020067011680A
Authority: KR
Inventors: 도시카즈 나카무라; 구니오 마츠모토; 카즈히로 후쿠타
Original assignee: 도시카즈 나카무라
Priority date: 2003-12-16
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2012-11-23
Also published as: US7741452B2; HK1093748A1; KR20060133999A; WO2005058951A1; EP1695982B1; CA2549878A1; EP1695982A1; US20070161549A1; US20100222274A1; JPWO2005058951A1; JP4716875B2; EP1695982A4; US8420350B2

Abstract

HGF의 당쇄를 결손시킨 변형체 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

특히, 간세포 증식 인자 중 적어도 한 곳의 당쇄부가 부위에서 당쇄가 부가되지 않도록 아미노산 서열에 변이가 도입된 당쇄결손형 간세포 증식 인자가 제공된다.

HGF, 간세포증식인자, 변형, 당쇄 결손

Description

당쇄결손형 간세포 증식 인자{GLYCOSYLATION-DEFICIENT HEPATOCYTE GROWTH FACTOR}

본 발명은, 당쇄(糖鎖)결손형 간세포 증식 인자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간세포 증식 인자의 당쇄를 결손시키는 것에 의해 변형된 간세포 증식 인자에 관한 것이다.

간세포 증식 인자(이하, HGF라고도 한다.)는 간실질세포의 증식 활성을 가지는 단백질이며, 다른 아미노산 서열을 가지는 것이 보고되어 있고, 그 명칭은 HGF 이외에 SF(scatter　factor), TCF(Tumor　cytotoxic　factor) 등이 사용되고 있다. 본 발명에서는, 이들 공지의 간실질세포 증식 활성을 가지는 단백질을 HGF라고 총칭한다. HGF는 간실질세포의 증식 이외에도 세포유주(遊走, migration)촉진, 형태형성촉진, 혈관신생작용, 신경보호작용 또는 항아포토시스(apoptosis) 작용 등 여러가지 약리 작용을 나타내는 생리 활성 펩티드인 것이 알려져 있다(비특허 문헌1 참조). HGF는 그 약리 작용으로부터 간경변 치료제, 신장 질환 치료제, 상피 세포 증식 촉진제, 항암제, 암요법용 부작용 방지제, 폐장해 치료제, 위?십이지장 손상 치료제, 뇌신경 장해 치료제, 면역 억제 부작용 방지제, 콜라겐 분해 촉진제, 연골 장해 치료제, 동맥 질환 치료제, 폐선유증 치료제, 간장 질환 치료제, 혈액 응고 이상 치료제, 혈장 저단백 치료제, 창상 치료제, 신경장해 개선약, 조혈간세포 증가제 또는 육모 촉진제 등으로서의 개발이 기대되고 있다(예를 들면 특허 문헌 1~14 참조).

HGF는, 간장, 뇌, 폐장, 골수, 비장, 태반 또는 신장 등의 장기 혹은 혈소판이나 백혈구 등의 혈액 세포 등으로부터 분비되는데, 생체 내에는 극미량 밖에 존재하지 않기 때문에 HGF를 의약 제제로서 이용하기 위해서는, 유전자 공학적 수법에 의해 세포를 이용하여 대량으로 생산할 필요가 있다. 종래, HGF는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 등의 동물세포를 이용하여 생산할 수 있는 것이 알려져 있다(특허 문헌 15, 16 참조).

그러나, 일반적으로 CHO 세포 등의 동물세포를 이용하여 단백질을 생산하는 방법은 비용이 비싸고, 나아가서는 약값의 상승으로 연결되는 것을 생각할 수 있다.

염가로 단백질을 재조합 생산하는 방법으로서는, 대장균 등의 원핵 생물에게 목적하는 유전자를 도입하여 발현시키는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌2 참조). 그러나, 대장균 등의 원핵 생물에서 생산한 재조합 단백질에는 당쇄가 부가되지 않는 문제가 있다. 이것은, 대장균 등의 원핵 생물에게는 당쇄 생합성 장소인 소포체 및 골지체가 존재하지 않기 때문이다.

동물세포 내에서의 단백질로의 당쇄부가 및 당쇄 수식은, DNA 혹은 단백질 생합성의 경우와는 달리 주형에 의하지 않는 번역 후 수식(post－translational　modification)이다. 이 번역 후 수식은 소포체 및 골지체라고 불리는 세포내 소기 관에 국재하는 수많은 당쇄 생합성 관련 효소가 개재하는 복잡한 기구를 통해 이루어진다. 즉, 특정의 단당과 그 결합 양식에 특이적인 효소(당가수분해 효소 및 당전이 효소)와의 제휴에 의한 복잡한 생합성 경로에 따라, 단당이 순차적으로 잘리거나 부가되거나 하면서, 소정의 당쇄구조를 얻을 수 있도록 당쇄가 신장되어 간다(비특허 문헌 3 참조). 이렇게 하여 단백질에 부가되는 당쇄는 고등 생물의 생명 현상 전반에 깊게 관련되어 있는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 4, 5 참조).

사람 체내의 단백질의 반수 이상은 당쇄가 부가된 당단백질로서 존재하는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 6 참조).

본래 당쇄가 부가된 형태로 존재하고 활성을 가지는 당단백질을 당쇄가 없는 상태로 하면, 활성을 잃는 것이 우려된다. 예를 들면, 적혈구 조혈 호르몬으로서 알려진 에리스로포이에틴(erythropoietin)에서는 당쇄를 제거하면 약효를 잃어 버리는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 7 참조).

단백질을 염가로 생산할 수 있는 숙주로 당쇄부가능력을 가지는 세포로서는 효모가 알려져 있다(비특허 문헌 8~10 참조). 효모는 진핵생물이며, 소포체 및 골지체를 가지고 있기 때문에, 당쇄 생합성 기구가 구비되어 있다. 그러나, 효모의 당쇄 생합성 기구는 동물세포와는 크게 다르기 때문에, 당쇄부가 부위를 가지는 단백질을 효모에서 생산하면, 효모형의 당쇄가 부가되게 된다. 효모의 당쇄구조는 사람 외 포유동물의 당쇄구조와는 크게 다르다고 알려져 있다(비특허 문헌 11 참조).

이 때문에, 이러한 재조합 단백질은 사람 외의 포유동물에 대해서 항원성을 나타내므로 사람 및 동물의 의약품으로서 이용할 수 없다.

또, 곤충 세포도 당쇄부가능력을 가지는 숙주로서, 비교적 염가로 단백질을 생산할 수 있지만, 곤충 세포의 당쇄구조도 사람형 당쇄구조와는 다른 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 12 참조).

따라서, 곤충 세포도 사람 외의 포유동물에 대해서 항원성을 나타낼 가능성이 있다.

그래서, 효모나 곤충 세포 등을 이용하여 생산한 단백질로부터 당쇄를 제거하거나, 혹은 단백질 분자중의 당쇄부가 부위에 변이가 도입되도록 한 유전자를 효모나 곤충 세포등에 도입함으로써, 당쇄부가가 없는 단백질을 만드는 것을 생각할 수 있다. 그러나 상술한 바와 같이, 본래 당쇄가 부가된 형태로 존재하는 단백질을 당쇄가 없는 상태로 하면 활성을 잃는 것이 우려된다.

HGF는 5개의 당쇄가 부가되어 있다(비특허 문헌 13, 14 참조). HGF의 당쇄를 제거한 경우의 활성에 미치는 영향에 대해서는, N－결합형 당쇄부가 저해제인 투니카마이신을 HGF 생산세포에 첨가하여 배양한 경우, 생산되는 HGF가 세포유주활성을 보존하고 있다는 보고가 있다(논문 중에서는 HGF는 SF라고 표기되어 있다)(비특허 문헌 15 참조).

그러나 이 논문에서는, 투니카마이신 존재하에서 생산된 HGF의 당쇄가 어느 정도 결손되어 있는지에 대한 해석이 이루어지지 않아 충분한 지견을 주는 것은 아니다.

또, 상기 논문에서 HGF를 N－글리카나제나 O－글리카나제로 처리해도 HGF가 세포유주활성을 보존하고 있다는 기재가 있지만, 상기 논문 중에서는 N－글리카나 제 처리한 HGF나 O－글리카나제 처리한 HGF가 당쇄를 인식하는 ConA 컬럼에 흡착되어 있는 것을 나타내고 있다. N－글리카나제 처리한 HGF나 O－글리카나제 처리한 HGF가 ConA 컬럼에 흡착되는 것은, 당쇄의 제거가 충분히 되지 않은 것을 의미한다. 따라서, N－글리카나제 처리한 HGF나 O－글리카나제 처리한 HGF가 세포유주활성을 보존하고 있다는 기재는, 당쇄를 결손한 HGF가 세포유주활성을 보존하고 있다고 결론 짓는 것은 아니다.

또한, HGF는 세포유주활성에 덧붙여 세포 증식, 형태형성촉진, 혈관신생작용, 항세포사활성 또는 신경보호작용 등 다방면에 걸친 활성을 가지고 있다(비특허 문헌 16 참조).

당쇄를 결손한 HGF가 세포유주활성을 가지고 있어도, 다른 기능도 가지고 있다고는 말하기 어렵다. 예를 들면, HGF의 트런케이트형 변형인 NK2는, 세포유주활성을 가지지만, 세포 증식 활성은 가지지 않는다(비특허 문헌 17 참조).

이와 같이, HGF의 당쇄가 결손한 경우에, HGF가 다채로운 기능을 보존하고 있는지 어떤지는 전혀 불분명했다. HGF는 다채로운 활성을 가지는 점에서 생체 수복 인자라고 생각되고 있고, HGF의 당쇄를 결손시켜도 HGF의 고도의 기능에 영향이 없다고는 생각할 수 없었다.

　　[특허 문헌 1]

특개평 4－18028호 공보

　　[특허 문헌 2]

특개평 4－49246호 공보

　　[특허 문헌 3]

유럽 특허 출원 공개 제 492614호 명세서

　　[특허 문헌 4]

특개평 6－25010호 공보

　　[특허 문헌 5]

국제 공개 제 93/8821호 팜플렛

　　[특허 문헌 6]

특개평 6－172207호 공보

　　[특허 문헌 7]

특개평 7－89869호 공보

　　[특허 문헌 8]

특개평 6－40934호 공보

　　[특허 문헌 9]

국제 공개 제 94/2165호 팜플렛

　　[특허 문헌 10]

특개평 6－40935호 공보

　　[특허 문헌 11]

특개평 6－56692호 공보

　　[특허 문헌 12]

특개평 7－41429호 공보

　　[특허 문헌 13]

국제 공개 제 93/3061호 팜플렛

　　[특허 문헌 14]

특개평 5－213721호 공보

　　[특허 문헌 15]

특개평 11－4696호 공보

　　[특허 문헌 16]

특개평 10－191991호 공보

　　[비특허 문헌 1]

마쓰모토, 케이. (matsumoto, K) 외, 키드니 인터내셔날 (Kidney　International), 2001년, 제59권, p.2023－2038

　　[비특허 문헌 2]

스와츠, 제이. 알. (Swarts, J. R.), 커런트 오피니언 인 바이오테크놀로지(Current　opinion　in　biotechnology), 2001년, 제12권, p.195－201

　　[비특허 문헌 3]

콘펠드, 알. (Kornfeld, R.) 외 1명, 애뉴얼 리뷰 오브 바이오케미스트리 (Annual　review　of　biochemistry.), 1985년, 제54권, p.631－664

　　[비특허 문헌 4]

코바타, A. (Kobata, A.), 유러피언 저널 오브 바이오케미스트리 (European　journal　of　biochemistry), 1992년, 제209권, p. 483－501

　　[비특허 문헌 5]

바키, A. (Varki, A.), 글리코바이올로지 (Glycobiology), 1993년, 제3권, p. 97－130

　　[비특허 문헌 6]

구치, 씨. 에프.(Goochee, C. F.) 외, 바이오테크놀로지(Biotechnolgy), 1991년, 제9권, p. 1347－1355

　　[비특허 문헌 7]

타케우치, M. (Takeuchi, M.)외 1명, 글리코바이올로지(Glycobiology), 1991년, 제1권, p. 337－346

　　[비특허 문헌 8]

위스만 A. (Wiseman　A.), 엔데보아 (Endeaｖour.), 1996년, 제20권, p. 130－132

　　[비특허 문헌 9]

러셀, C (Russell, C.)외, 오스트레일리안 저널 오브 바이오테크놀로지 (Australian　journal　of　biotechnology), 1991년, 제5권, p. 48－55

　　[비특허 문헌 10]

북홀츠, 알. 지. (Buckholz, R. G.)외 1명, 바이오테크놀로지(Biotechnology), 1991년, 제9권, p. 1067－1072

　　[비특허 문헌 11]

게밀, 티. 알. (Gemmill, T. R.)외 1명, 바이오케미카 엣 바이오피지 카 악타 (Biochimica　et　biophysica　acta), 1999년, 제1426권, p. 227－237

　　[비특허 문헌 12]

알트만, 에프 (Altmann, F.)외, 글리코콘주게이트 저널(Glycoconjugate　journal), 1999년, 제16권, p. 109－123

　　[비특허 문헌 13]

하라, 에이치 (Hara, H.)외 , 저널 오브 바이오케미스트리(Journal　of　biochemistry), 1993년, 제114권, p. 76－82

　　[비특허 문헌 14]

시미즈, 엔. (Shimizu, N.)외, 바이오케미칼 앤드 바이오피지칼 리서치 커뮤니케이션즈 (Biochemical　and　biophysical　research　communications), 1992년, 제189권, p. 1329－1335

　　[비특허 문헌 15]

호프만, 알. (Hofmann, R.)외, 바이오케미카 엣 바이오피지카 악타 (Biochimica　et　biophysica　acta), 1992년, 제1120권, p. 343－350

　　[비특허 문헌 16]

마쓰모토, 케이. (Matsumoto, K.)외 1명, 바이오케미칼 앤드 바이오피지칼 리서치 커뮤니케이션즈 (Biochemical　and　biophysical　research　communications), 1997년, 제239권, p. 639－644

　　[비특허 문헌 17]

하트만, 지. (Hartmann, G.)외, 프로시딩 오브 더 내셔날 아카데미 오브 사이언스 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 (Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America), 1992년, 제89권, p. 11574－11578

[발명이 해결하려고 하는 과제]

본 발명의 과제는, HGF의 당쇄를 결손시킨 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제공 및 그 제조 방법의 제공에 있다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

본 발명자들은 상기 과제를 해결할 만한 HGF의 당쇄기능에 관한 연구를 예의 거듭한 결과, HGF의 당쇄를 제거해도 HGF의 기능이 보존되는 것을 찾아냈다. HGF와 같은 고도의 기능을 가지는 단백질이 당쇄를 제거해도 기능을 보존하고 있는 것은 전혀 예상 외의 것이었다. 그뿐만 아니라, 당쇄결손형 HGF는 당쇄를 가지는 HGF에 비하여 혈중 안정성이 향상되어 있고, 이러한 사실은 매우 놀랄 만한 발견이었다. 이상의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 한층 더 연구를 진행하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

(1) 간세포 증식 인자의 당쇄부가 부위의 전부 또는 적어도 한 곳에 있어서 당쇄가 결손되어 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자,

(2) 상기(1)에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자로서, 간세포 증식 인자의 적어도 한 곳의 당쇄부가 부위에서 당쇄가 부가되지 않도록 아미노산 서열에 변이가 도입된 당쇄결손형 간세포 증식 인자,

(3) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열에 대해서, 다음의 a)부터 d)에 나타낸 변형 중 적어도 하나 이상이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 상기(2)에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스(consensus) 서열 중, 적어도 하나의 콘센서스 서열의 Asn이 다른 아미노산잔기로 치환되어 있다；

b) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스 서열 중, 하나의 콘센서스 서열의 Ser 또는 Thr, 혹은 2 이상의 콘센서스 서열의 Ser 또는/및 Thr가 다른 아미노산기로 치환되어 있다；

c) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스 서열 중, 적어도 하나의 콘센서스 서열의 X가 Pro로 치환되어 있다；또는

d) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열중에 존재하는 적어도 하나의 O－결합형당쇄부가를 받는 Ser 또는/및 Thr가 다른 아미노산기로 치환되어 있다,

(4) 간세포 증식 인자가 사람 간세포 증식 인자인 것을 특징으로 하는 상기(1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자,

(5) 간세포 증식 인자가 고양이 또는 개 간세포 증식 인자인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자,

(6) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기초로 변형되는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자로서, 서열 번호 1중 아미노산에 대해서 다음의 a)부터 e)에 나타낸 변형 중 적어도 하나 이상이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 제294위 또는/및 제296위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제295위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제294위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

b) 제402위 또는/및 제404위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제403위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제402위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

c) 제476위의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있음으로써 제476위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

d) 제566위 또는/및 제568위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제567위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제566위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；또는

e) 제653위 또는/및 제655위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제654위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제653위에 당쇄가 부가되어 있지 않다, 및

(7) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 기초로 변형되는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 간세포 증식 인자로서, 서열 번호 2중의 아미노산에 대해서 다음의 a)부터 e)에 나타낸 변형 중 적어도 하나 이상이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 제289위 또는/및 제291위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제290위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제289위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

b) 제397위 또는/및 제399위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제398위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제397위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

c) 제471위의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있음으로써 제471위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

d) 제561위 또는/및 제563위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제562위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제561위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；또는

e) 제648위 또는/및 제650위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제649위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제648위에 당쇄가 부가되어 있지 않은 것에 관한다.

　또, 본 발명은

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 코드 할 수 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(9) 상기(8)에 기재된 DNA를 넣은 벡터,

(10) 상기(9)에 기재된 벡터를 세포에 도입하여 상기 세포를 배양하고, 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액 중에 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 생산하게 하고, 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액 중에서 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(11) 세포가 진핵세포인 상기 (10)에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(12) 진핵세포가 효모 또는 곤충 세포인 상기 (11)에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(13) 상기 (9)에 기재된 벡터를 곤충 개체에 도입하여 곤충 개체 중에 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 생산하게 하고, 상기 곤충 개체로부터 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(14) 당쇄를 가지는 간세포 증식 인자를 효소에서 처리함으로써 당쇄를 전부 또는 부분적으로 제거하고, 상기 효소 반응액으로부터 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(15) 당쇄를 가지는 간세포 증식 인자를 코드 하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 넣은 벡터 또는 상기 (9)에 기재된 벡터로 이루어지는 유전자를 당쇄부가능력이 없는 세포에 도입하여 상기 세포를 배양하고, 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액 중에 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 생산하게 하여 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액중에서 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재의 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(16) 당쇄를 가지는 간세포 증식 인자를 코드 하는 염기 서열 또는 상기 (8)에 기재된 염기 서열로 이루어지는 유전자를 주형으로 하여 무세포 단백질 합성 시스템에 의해 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 합성하고, 상기 합성 반응액으로부터 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법,

(17) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 유효 성분으로 하는 의약 제제, 및

(18) 상기 (8)에 기재된 DNA를 포함하는 유전자 치료약,

에 관한다.

[발명의 효과]

본 발명의 당쇄결손형 HGF는 세포증식활성, 세포유주활성 또는 형태형성활성 등에서 당쇄를 가지는 HGF와 동등한 활성을 가지고, 온도 안정성도 동등하므로, 당쇄를 가지는 HGF의 대체품이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 당쇄결손형 HGF를 유효 성분으로 하는 의약 제제는, 당쇄를 가지는 HGF와 같은 용도, 즉, 포유동물(예를 들면, 사람, 개, 고양이, 래트, 쥐, 토끼, 말, 소, 양, 몰모트 등)에 대해, 간경변 치료제, 신장 질환 치료제, 상피 세포 증식 촉진제, 항암제, 암요법용 부작용 방지제, 폐장해 치료제, 위?십이지장 손상 치료제, 뇌신경 장해 치료제, 면역 억제 부작용 방지제, 콜라겐 분해 촉진제, 연골 장해 치료제, 동맥 질환 치료제, 폐선유증 치료제, 간장 질환 치료제, 혈액 응고 이상 치료제, 혈장저단백 치료제, 창상 치료제, 신경장해 개선약, 조혈간세포 증가제 또는 육모 촉진제 등으로서 이용할 수 있다.

또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 DNA를 포함하는 의약은 상기 질환의 유전자 치료약으로서 이용할 수 있다.

또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF는 당쇄를 가지는 HGF보다도 혈중 안정성이 향상되어 있으므로 HGF의 투여량을 저감할 수 있고 HGF에 의한 부작용 방지를 꾀할 수 있다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF는 효모나 곤충 세포에서의 생산이 가능하기 때문에 염가로 생산할 수 있다.

도 1은 각 HGF의 SDS-PAGE에 의한 분석 결과를 나타내는 도면이다. 각 HGF를 환원 처리하여 영동(泳動)한 후, 겔을 은염색했다.

도 2는　HGF의 간실질 세포 증식 활성에 대해, 래트 간실질 세포의 DNA 합성량을 지표로서 나타낸 도면이다.

도 3은　HGF의 세포유주활성에 대해, MDCK 세포의 분산 정도에 따라 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4는　HGF의 형태형성활성에 대해, MDCK 세포의 관강형성 정도에 따라 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는　HGF의 온도 안정성을 나타내는 도면이다. 표시된 일수 동안 37℃에서 각 HGF를 인큐베이트(incubate) 했다. 잔존 활성을 래트 간실질 세포의 DNA 합성량을 지표로 측정하여 상대치로 나타냈다.

도 6은　HGF의 혈중 안정성을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명과 관련되는 당쇄결손형 HGF는 당쇄를 가지는 포유동물, 예를 들면 사람, 개, 고양이, 래트, 쥐, 토끼, 말, 소, 양 또는 몰모트 등의 HGF의 당쇄부가 부위의 전부 또는 적어도 한 곳의 당쇄가 결손되도록 구조가 변형된 HGF를 말한다.

또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF에는, 공지의 HGF에 당쇄가 부가되지 않도록 변이가 도입된 아미노산 서열 중, 하나 혹은 몇 개의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 부가 혹은 삽입된 아미노산 서열을 가지는 한편, HGF 활성을 가지는 단백질도 포함된다. 나아가 본 발명의 당쇄결손형 HGF에는, 공지의 HGF에 당쇄가 부가되지 않도록 변이가 도입된 아미노산 서열과 적어도 약 60%이상의 상동성을 가지는 단백질, 바람직하게는 약 80%이상의 상동성을 가지는 단백질, 보다 바람직하게는 약 90%이상의 상동성을 가지는 단백질, 한층 더 바람직하게는 약 95%이상의 상동성을 가지는 단백질이고, 또한 HGF 활성을 가지는 단백질도 포함된다.

또한, 아미노산 서열에 대해, 「하나 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 부가 혹은 삽입」이란, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지의 기술적 방법에 의해, 또는 천연적으로 생길 수 있는 정도의 수(數)가 결실, 치환, 부가 또는 삽입 등이 이루어져 있는 것을 의미한다.

또, 상기 아미노산 서열에 대해 「상동」이란, 단백질의 일차 구조를 비교하여 서열간에 있어서 각각의 서열을 구성하는 아미노산잔기의 일치 정도의 의미이다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF는, HGF의 당쇄부가 부위의 적어도 한 곳에서 당쇄가 부가되지 않도록 변이를 도입한 HGF 유전자를 넣은 벡터를 세포에 도입하여 얻을 수 있다.

또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF는, 당쇄를 가지는 HGF의 염기 서열을 포함하는 벡터를 당쇄부가능력이 없는 세포에 도입하여 얻을 수도 있다.

HGF의 당쇄부가 부위의 적어도 한 곳에서 당쇄가 부가되지 않도록 HGF 유전자에 변이를 도입하는 방법으로서는, 결손시키고 싶은 당쇄의 부가 부위의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열에 변이를 도입하는 것이 좋다. 단백질에 당쇄가 부가될 경우, 당쇄에는 N－결합형당쇄와 O－결합형당쇄가 있으므로, 각각에 대해 다음과 같은 변이를 도입한다.

N－결합형당쇄에는 콘센서스 서열〔Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 프로린 이외의 아미노산을 나타낸다.)〕이 존재하는 것이 알려져 있다. 콘센서스 서열이 존재할 때에는 Asn에 당쇄가 결합한다 (Kobata, A. , Eur. J. Biochem. , 1992년, 제209권, p. 483－501). 이 때문에, 콘센서스 서열 중의 Asn을 다른 아미노산 (예를 들면, Gln 등)으로 변환하거나, 혹은, Ser 또는 Thr를 다른 아미노산(예를 들면, Gly, Ala 등)으로 변환하도록 염기 서열에 변이를 도입함으로써 해당 부위의 N－결합형당쇄를 결손시킬 수 있다. 이 경우, 변환에 이용하는 아미노산은, 상기 콘센서스 서열 전후의 아미노산 서열과 새로운 콘센서스 서열을 형성하지 않는 아미노산을 적절히 선택하는 것이 바람직하다. 또, 콘센서스 서열 중의 X 부위에 프로린이 도입되도록 염기 서열에 변이를 도입해도 좋다.

O－결합형당쇄에는 콘센서스 서열은 존재하지 않지만, O－결합형당쇄에서는 Ser이나 Thr의 수산기에 당쇄가 부가되므로, O－결합형당쇄부가를 받는 부위의 Ser 또는 Thr를 다른 아미노산(예를 들면, Gly 등)으로 변환하도록 염기 서열에 변이를 도입함으로써 해당 부위의 당쇄를 결손시킬 수 있다. 이 경우, 변환에 이용하는 아미노산은, 상기 아미노산 전후의 아미노산 서열과 상기 콘센서스 서열을 형성하지 않는 아미노산을 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

HGF에서의 당쇄부가 부위는, 예를 들면 사람 HGF에서는, 서열표의 서열 번호 1에서 나타낸 아미노산 서열의 제294위의 Asn(N－결합형당쇄), 제402위의 Asn(N－결합형당쇄), 제476의 Thr(O－결합형당쇄), 제566위의 Asn(N－결합형당쇄), 제653위의 Asn(N－결합형당쇄)이다. 또, 서열표의 서열 번호 2에서 나타낸 5 아미노산 결실형 사람 HGF에서의 당쇄부가 부위는, 제289위의 Asn(N－결합형당쇄), 제397위의 Asn(N－결합형당쇄), 제471의 Thr(O－결합형당쇄), 제561위의 Asn(N－결합형당쇄), 제648위의 Asn(N－결합형당쇄)이다.

또, 상기 사람 HGF의 상기 콘센서스 서열은, 서열표의 서열 번호 1에서 나타 낸 아미노산 서열의 제294위에서 제296위, 제402위에서 제404위, 제566위에서 제568위, 및 제653위에서 제655위에 존재한다. 5 아미노산 결실형 사람 HGF에서는, 콘센서스 서열은, 서열표의 서열 번호 2에서 나타낸 아미노산 서열의 제289위에서 제291위, 제397위에서 제399위, 제561위에서 제563위, 및 제648위에서 제650위에 존재한다.

HGF의 염기 서열에 변이를 도입하는 방법으로서는, 변이를 도입하고 싶은 부분에 대응하는 변이 프라이머를 합성하고 쿤켈법 등의 기존 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 또, 시판되는 변이 도입 키트 등을 이용하면 보다 간편하게 변이를 도입할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 당쇄결손형 HGF의 아미노산 서열을 코드 하는 DNA 혹은 당쇄를 가지는 HGF의 아미노산 서열을 코드 하는 DNA를 함유하는 플라스미드(plasmid)나 박테리오파지(bacteriophage) 등의 재조합 벡터로부터, 제한 효소에 의해 상기 DNA를 잘라내고, 당쇄결손형 HGF의 발현에 적합한 벡터의 프로모터의 하류에 제한 효소와 DNA 리가제를 이용해 재결합하여 재조합발현 벡터를 제작할 수 있다. 보다 자세하게는, 전사(轉寫)의 하류 방향으로 차례로, 필요에 따라 (1) 프로모터, (2) 리보솜 결합 부위, (3) 개시코돈, (4) 본 발명의 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열을 포함하는 DNA, (5) 종지코돈, (6) 터미네이터 등을 포함하도록 재조합 발현 벡터가 구축된다.

상기 DNA에는, 상기 당쇄부가 부위에 변이가 도입된 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열로 이루어지는 DNA 뿐만이 아니라, (a) 상기 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열의 염기 하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 부가 혹은 삽입된 염기 서열을 가지는 한편, HGF 활성을 가지는 단백질을 코드 하는 DNA, (b) 상기 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열을 가지는 DNA와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트(stringent)인 조건하에서 하이브리다이즈하는 한편, HGF 활성을 가지는 단백질을 코드 하는 염기 서열로 이루어지는 DNA, 또는 (c) 상기 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열을 가지는 DNA와 적어도 약 60% 이상의 상동성을 가지고 또한 HGF 활성을 가지는 단백질을 코드 하는 염기 서열로 이루어지는 DNA도 포함하는 것이다.

상기 염기 서열에 대해, 「하나 혹은 여러 개의 염기가 결실, 치환, 부가 혹은 삽입」이라고 할 때는, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등의 주지의 기술적 방법에 의해, 또는 천연적으로 발생할 수 있는 정도의 수의 염기가, 결실, 치환, 부가 또는 삽입 등이 되어 있는 것을 의미한다.

스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈 가능한 DNA란, 상기 DNA를 프로브로 하여 콜로니 하이브리디제이션(colony hybridization)법, 플라그 하이브리디제이션법 혹은 서던블롯 하이브리디제이법 등을 이용하여 얻어지는 DNA를 의미한다.

스트린젠트인 조건이란, 소금 농도, 예를 들면 약 0.1~2배 정도 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mM염화 나트륨, 15mM구연산 나트륨으로 이루어진다.), 온도 약 65℃정도에서의 하이브리다이즈 조건을 말한다.

상동성을 가지는 DNA란, 하이스트린젠트인 조건에서, 적어도 약 60%이상의 상동성을 가지는 DNA, 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA, 보다 바 람직하게는, 약 90%이상의 상동성을 가지는 DNA, 한층 더 바람직하게는 약 95%이상의 상동성을 가지는 DNA를 말한다. 한편, 하이스트린젠트인 조건이란, 예를 들면, 나트륨 농도가 약 19~40mM정도, 바람직하게는 약 19~20mM정도이고, 온도가 약 50~70℃정도, 바람직하게는 약 60~65℃정도의 조건을 말한다. 특히, 나트륨 농도가 약 19mM이고 온도가 약 65℃ 정도인 경우가 가장 바람직한 조건이다.

본 발명에서 이용할 수 있는 벡터로서는, 대장균을 숙주로 하는 경우는 pBR322, pUC18, pUC19(도요보세키) 등의 플라스미드 (plasmid)를, 고초균을 숙주로 하는 경우는 pUB110(시그마사) 등의 플라스미드를, 효모를 숙주로 하는 경우는 pYES2(Inｖitrogen), pRB15(ATCC37062) 등의 플라스미드를 이용할 수 있다. 동물세포용 발현 벡터로서는, pCAGGS 또는 pCXN2(Niwa, H., Yamamura, K. and　Miyazaki, J., Gene, 1991년, 제108권, p. 193－200, 특개평 03－168087), pcDL－SRα(Takebe, Y. et　al., Mol. Cell. Biol., 1988년, 제8권, p. 466－472) 등을 들 수 있다. 그 밖에 박테리아퍼지(bacteriophage)λgt10, λgt11(스트라타진사), 바이러스 SV40(BRL사), BPV(ATCC　VR－703) 또는 레트로바이러스의 유전자 유래의 벡터 등을 열거할 수 있지만, 숙주 내에서 복제?증폭 가능한 벡터라면 특별히 한정은 없다.

프로모터 또는 터미네이터에 관해서도, 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열 발현에 이용되는 숙주에 대응한 것이면 특별히 한정은 없다. 프로모터의 예로서는, 숙주가 대장균인 경우는, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λPL프로모터 또는 lpp 프로모터 등을 들 수 있고, 숙주가 효모인 경우는, PHO5 프로모 터, PGK 프로모터, GAP 프로모터 또는 ADH 프로모터 등을 들 수 있다. 동물세포를 숙주로서 이용하는 경우는, 라우스 육종 바이러스(바이러스 RSV), MPSV, 폴리오마 바이러스, 맨드라미 바이러스, 아데노바이러스, 소 파피로마바이러스, 새육종 바이러스, 사이트메가로바이러스(SMV), B형 간염 바이러스, 시미안바이러스 40(SV40) 또는 우두바이러스 등의 바이러스 게놈으로부터 얻을 수 있는 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 또는 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 고등 포유동물 숙주를 이용할 때에는, 바람직하게는 벡터에 인핸서(inhancer)를 도입한다. 인핸서를 도입함으로써 전사가 증대된다. 인핸서로서는, SV40 인핸서, 사이트메가로바이러스의 초기 프로모터/인핸서, 폴리오마 인핸서 또는 아데노바이러스의 인핸서 등을 들 수 있다. 또 터미네이터로서는, 숙주가 대장균인 경우, trp 터미네이터 또는 1 pp터미네이터 등을, 숙주가 고초균의 경우, amyF 터미네이터 등을, 숙주가 효모인 경우, CYC1 터미네이터 등을, 숙주가 동물세포의 경우, SV40 터미네이터 또는 HSV1TK 터미네이터 등을 예시할 수 있다. 이들 프로모터와 터미네이터는 이용하는 숙주에 따라서 적절히 조합하여 이용하는 것이 바람직하다.

이와 같이 하여 구축된 당쇄결손형 HGF 발현 벡터는, 콤피턴트(competent) 세포법(J. Mol. Biol., 1970년, 제53권, p. 154), 프로토플프로스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978년, 제75권, p. 1929), 인산 칼슘법(Science, 1983년, 제221권, p. 551), DEAE 덱스트란법(Science, 1982년, 제215권, p. 166), 전기펄스법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984년, 제81권, p. 7161), 인비트로패키징법(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975년, 제72권, p. 581), 바이러스 벡터법(Cell, 1984년, 제37권, p. 1053), 또는 마이크로인젝션법(Exp. Cell. Res., 1984년, 제153권, p. 347) 등에 의해 숙주로 도입되어 형질 전환체가 제작된다.

숙주로 이용할 수 있는 세포로서는, 특별한 제한은 없고, 동물, 식물, 곤충, 원핵미생물 또는 진핵미생물의 세포 등을 들 수 있다. 이들 세포는 개체를 형성하고 있어도 좋고, 동물 개체, 식물 개체 또는 곤충 개체를 숙주로 하여도 좋다. 동물세포에서는, 부착성 세포 또는 부유성 세포 양쪽 모두 사용할 수 있고, 당쇄결손형 HGF를 세포 내에 생산 축적하는 동물세포여도 되며, 혹은 당쇄결손형 HGF를 세포 밖에 분비 생산하는 동물세포라도 좋다. 예를 들면, CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소 세포), COS 세포, BHK 세포, 쥐 C127 세포 또는 Hela 세포 등을 들 수 있다. 식물세포에서는 벼, 담배 또는 시로이누나즈나 등을 들 수 있고, 곤충 세포에서는 Sf9나 Sf21 등의 세포를 들 수 있다. 곤충 개체에서는 예를 들면, 누에를 들 수 있다. 원핵미생물에서는 대장균 또는 고초균 등을 들 수 있고, 진핵미생물에서는 Saccharomyces　cereｖisiae, Schizosaccharomyces　pombe, Candida　boidinii 또는 Pichia　pastoris등의 효모 혹은 Aspergillus속, Trichoderma속 또는 Mucor속등의 사상균을 들 수 있다. 바람직한 것은, 효모, 곤충 세포 또는 곤충 개체이다. 이들 중, 원핵생물의 세포에서는, 당쇄부가능력이 없기 때문에 야생형의 당쇄를 가지는 HGF 유전자를 도입해도 좋다.

얻어진 형질 전환체는, 목적으로 하는 당쇄결손형 HGF를 생산시키기 위해 그 숙주에 맞춘 적절한 배지속에서 배양된다. 배지속에는 상기 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물, 비타민, 혈청 및 약제 등이 함유된다. 배지의 예 로서는, 형질 전환체의 숙주가 대장균인 경우, LB 배지(닛스이 제약) 또는 M9배지[J. Exp. Mol. Genet., Cold　Spring　Laboratory, New　York, 1972년, p. 431］등을 들 수 있고, 숙주가 효모인 경우는, YEPD 배지(Genetic　Engineering, 제1권, Plenum　Press, New　York, 1979년, p. 117) 등을 들 수 있다. 숙주가 동물세포인 경우, 약 20% 이하의 소 태아 혈청을 함유하는 변형 이글 배지(MEM 배지), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM 배지) 또는 RPMI1640 배지(닛스이 제약) 등을 들 수 있다. 형질 전환체의 배양은, 통상 약 20℃~45℃, pH는 약 5~8의 범위에서 이루어지고 필요에 따라 통기, 교반이 이루어진다. 또, 숙주가 접착성의 동물세포 등일 경우는, 유리 비즈, 콜라겐 비즈, 혹은 아세틸셀룰로오스 홀로파이버 등의 담체가 이용된다. 이들 이외의 배지 조성 혹은 배양 조건하에서도 형질 전환체가 생육하면, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 하여 형질 전환체의 배양상청중 또는 형질 전환체중에 생성한 당쇄결손형 HGF는, 공지의 염석법, 용매 침전법, 투석법, 한외여과법, 겔 전기 영동법, 겔 여과 크로마토그라피, 이온교환 크로마토그라피, 역상 크로마토그라피 및 아피니티 크로마토그라피 등의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 분리 정제할 수 있다. 특히, 정제 방법으로서 황산암모늄에 의한 염석법, S－세파로스 이온 크로마토그라피, 헤파린 세파로스 어피니티 크로마토그라피, 및 페닐 세파로스 역상 크로마토그라피의 조합, 혹은 황산암모늄에 의한 염석법, S－세파로스 이온 크로마토그라피 및 항 HGF 항체 세파로스 어피니티 크로마토그라피의 조합 등이 바람직하다.

또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF는, 종래의 공지된 방법에 의해 당쇄가 부가된 HGF를 얻은 후, 당쇄를 제거하는 효소로 상기 HGF를 처리하는 방법으로도 얻을 수 있다. 당쇄를 제거하는 효소로서는, N－결합형당쇄의 제거 목적으로는 글리코펩티다제 F 또는 글리코펩티다제 A 등을 사용할 수 있다. O－결합형당쇄의 제거는, 시아리다제, 푸코시다제 및 O－글리카나제 등의 1종 또는 2종의 조합에 의해 달성된다. 효소 처리하여 얻어진 당쇄 제거 HGF는, 본 발명의 당쇄결손형 HGF로서 상술의 정제법에 따라 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 당쇄결손형 HGF는, 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 얻을 수도 있다. 무세포 단백질 합성 시스템이란, 대장균, 토끼 망상 적혈구 세포 또는 밀배아 등으로 조제한 세포 추출액을 이용하든가, 혹은 세포 추출액중에 포함되는 단백질 합성 인자군을 이용하여 목적 단백질을 코드 하는 DNA 혹은 mRNA를 주형으로 하여, 생세포를 이용하지 않고 단백질 합성을 실시하는 시스템을 말한다. 세포 추출액에는 리보솜, tRNA 또는 번역 인자 등의 단백질 합성에 필요한 분자군이 포함되어 있기 때문에, 이것에 ATP나 GTP 등의 에너지원 및 기질이 되는 아미노산을 첨가하면 단백질이 합성된다. 세포 추출액 대신에, 세포 추출액중에 포함되는 단백질 합성 인자군을 혼합하여 이용해도 좋다. 무세포 단백질 합성 시스템에서는, 소포체나 골지체가 포함되지 않기 때문에, 당쇄부가 부위를 가지는 당쇄를 가지는 HGF를 코드 하는 DNA 혹은 mRNA를 주형으로 하여, 당쇄가 결손된 당쇄결손형 HGF를 생산할 수 있다. 또, 당쇄부가 부위에 변이를 도입한 DNA 혹은 mRNA를 이용할 수도 있다. 무세포 단백질 합성 반응액중에서 합성된 당쇄결손형 HGF는, 상술한 정제법에 따라 정제할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 얻을 수 있는 본 발명의 당쇄결손형 HGF는, 세포증식활성, 세포유주활성 또는 형태형성활성 등에서 당쇄를 가지는 HGF와 동등한 활성을 가지고, 온도 안정성에 있어서도 동등하다. 한편, 본 발명의 당쇄결손형 HGF는 당쇄를 가지는 HGF보다 혈중 안정성이 향상되어 있다.

본 발명과 관련된 당쇄결손형 HGF는, 사람을 포함한 포유동물(예를 들면, 개, 고양이, 래트, 쥐, 토끼, 말, 소, 양, 몰모트 등)에 적용할 수 있다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF를 유효 성분으로 하는 의약은, 야생형의 당쇄가 부가된 HGF와 같은 용도, 예를 들면 간경변 치료제, 신장 질환 치료제, 상피 세포 증식 촉진제, 항암제, 암요법용 부작용 방지제, 폐장해 치료제, 위?십이지장 손상 치료제, 뇌신경 장해 치료제, 면역 억제 부작용 방지제, 콜라겐 분해 촉진제, 연골 장해 치료제, 동맥 질환 치료제, 폐선유증 치료제, 간장 질환 치료제, 혈액 응고 이상 치료제, 혈장저단백 치료제, 창상 치료제, 신경장해 개선약, 조혈간세포 증가제 또는 육모 촉진제 등으로서 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 DNA를 포함하는 의약은, 상기 질환을 위한 유전자 치료약으로서 이용할 수 있다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF는 단백질 의약품으로서 유효하고, 일반적인 의약 제제의 형태로 이용된다. 본 발명의 당쇄결손형 HGF를 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제는, 여러 가지의 제제 형태(예를 들면, 물약, 고형제, 캡슐제 등)를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효 성분인 당쇄결손형 HGF와 결합성 물질만, 또는 이것과 관용의 담체와 함께 주사제, 흡입제, 좌제 또는 경구제로 되고, 그 중에서 주사 제가 더욱 적합하다. 해당 주사제는 상법(常法)에 의해 조제할 수가 있고, 예를 들면, 당쇄결손형 HGF 및 결합성 물질을 적절한 용제(예를 들면, 멸균된 물, 완충액, 생리 식염수 등)에 용해한 후, 상기 용해물을 필터 등으로 여과하여 멸균하고, 이어서 무균적인 용기에 충전함으로써 조제할 수가 있다. 주사제 중의 당쇄결손형 HGF 함량으로서는, 통상 약 0.0002~3(W/V%) 정도, 바람직하게는 약 0.001~2(W/V%) 정도로 조제된다. 또, 경구약으로서는, 예를 들면, 정제, 과립제, 세립제, 산제, 연캡슐제 또는 경캡슐제, 액제, 유제, 현탁제 또는 시럽제 등의 제형으로 제제화되고, 이들 제제는 제제화의 상법에 준하여 조제할 수 있다. 좌제도 관용의 기제(예를 들면, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴, 매크로골, 위텝졸 등)를 이용한 제제상의 상법에 따라 조제할 수 있다. 또, 흡입제도 제제상의 상투수단에 준하여 조제할 수 있다. 제제중의 당쇄결손형 HGF 함량은, 제형, 적용 질환 등에 따라 적절히 조제할 수 있다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF의 의약 제제의 제제화시에, 안정화제가 첨가되는 것이 바람직하다. 안정화제로서는, 예를 들면, 알부민, 글로블린, 젤라틴, 알라닌, 글리신, 만니톨, 글루코스, 덱스트란, 솔비톨, 에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 나아가 본 발명의 의약 제제는 제제화에 필요한 다른 첨가물, 예를 들면, 용제(예를 들면, 생리 식염액, 멸균 정제수, 주사용수 등), 부형제(예를 들면, 과당, D－솔비톨, 포도당, 전분, 결정 셀룰로오스, 덱스트린 등), 결합제(예를 들면, 젤라틴, 콘스타치, 트라간트, 아라비아고무 등), 용해 보조제(예를 들면, 라우로마크로골, 폴리솔베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 아라비아고무, 안식향산나트륨 등), 산화 방지제(예를 들면, L－아스코르빈산, 트코페롤, 에데트산나트륨 등), 무통화제(예를 들면, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 등장화제(예를 들면, 염화 나트륨, 포도당, D－만니톨, 글세린 등), 완충제(예를 들면, 구연산, 구연산 나트륨, 초산, 초산나트륨, 유산, 인산 수소 나트륨 등), 증점제(아라비아고무, 칼메로스, 포피돈, 메틸 셀룰로오스 등), 보존제(예를 들면, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산에틸, 파라옥시안식향산프로필, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 염화벤잘코늄 등) 또는 pH조정제(염산, 수산화 나트륨, 구연산, 초산 등)등을 포함하고 있어도 좋다.

액상 제제로 한 경우는 동결 보존, 또는 동결 건조 등에 의해 수분을 제거하여 보존하는 것이 바람직하다. 동결 건조 제제는, 이용시에 주사용 증류수 등을 더해 재용해하여 사용된다.

또, 경구제로 하는 경우에는, 과립 또는 정제 등은, 장용성 코팅제(예를 들면 초산프탈산셀룰로오스, 메타아크릴산코포리마, 히드록시플로필셀룰로오스 프탈레이트, 카복시메틸에틸셀룰로오스 등)등으로 제피(劑皮)를 실시하는 것이 바람직하고, 캡슐제로는, 장용성 캡슐제로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 제제는, 그 제제 형태에 따른 적절한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 주사제의 형태로 하여 정맥, 동맥, 피하 또는 근육내 등에 투여할 수 있다. 그 투여량은, 환자의 질환, 증상, 연령 또는 체중 등에 의해 적절히 조정되는데, 예를 들면, 성인에 대해, 통상 당쇄결손형 HGF로서 약 0.01mg~500mg, 바람직하게는 약 0.05mg~100mg이며, 이것을 1일 1회 내지 몇 차례로 나누어 투여하는 것이 적당하다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF를 코드 하는 염기 서열을 가지는 DNA는, 상기 벡터에 넣어져 유전자 치료약으로서도 이용할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료약은, 상기 당쇄결손형 HGF 유전자와 유전자 운반체의 복합체로서 제작되는 것이 바람직하다. 유전자 운반체로서는, 바이러스 벡터 또는 카치온성 유전자 운반체 등이 바람직하다. 바이러스 벡터로는, 예를 들면, 쥐 백혈병 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, HIV 벡터, 헤르페스심플렉스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 카타이오익(cationic, 양이온성) 유전자 운반체로는, 예를 들면, 폴리리진 또는 폴리지 아미노낙산 등의 폴리 아미노산, 혹은 리포솜이나 에틸렌이민 등의 카타이오익 합성 고분자 등의 유전자와 친화성이 있는 물질을 들 수 있다.

이하, 실시예를 예로 들어 본 발명을 한층 더 상세하게 설명하나, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

한편, 실시예에서 사용하는 각 약호의 의미는 다음과 같다.

HGF：간세포 증식 인자

dHGF：5 아미노산 결실형 간세포 증식 인자

LB배지：Luria－Bertani 배지

DMEM 배지：둘베코 변형 이글 배지

Amp：암피실린

FCS：소 태아 혈청

NaCl：염화 나트륨

BSA：소 혈청 알부민

PBS：인산 완충 식염수

Tween80：폴리옥시에틸렌(20) 솔비탄 모노올레이트

[실시예 1]

서열표의 서열 번호 3에 나타낸 5 아미노산 결실형 HGF(dHGF；야생형 dHGF 라고 하는 경우도 있다.)를 코드 하는 염기 서열을 pCAGGS 벡터에 넣었다. 얻어진 벡터(이하, 야생형 벡터라고 한다.)를 pCAGGS－dHGF라고 칭한다.　

dHGF 단백질에 존재하는 5개소의 당쇄부가 부위(서열표의 서열 번호 2의 289위, 397위, 471위, 561위, 648위)에 변이를 도입하기 위해, 표 1의 5종류의 변이 프라이머(5'－인산화)를 합성하고, pCAGGS－dHGF 벡터를 템플릿으로서 변이 도입을 실시했다. 이 변이에 의해, 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열 가운데, Asn289, Asn397, Asn561, Asn648는 Gln로, Thr471는 Gly로 치환된다.

변이 도입에는 STRATAGENE사의 QuikChange　Multi　Kit를 이용했다. 변이가 도입된 벡터(이하, 변이 벡터라고 한다.)는 E. coli　XL10　Gold의 콤피턴트 세포로 형질 전환하고, LB/Amp 플레이트상에서 Amp 내성 콜로니를 픽업했다. 얻어진 각 클론으로부터 플라스미드를 추출하고, 당쇄결손형 HGF의 코드 부분에 대해 염기 서열을 해석함으로써, 목적한 클론을 스크리닝(screening) 했다. 5개소에 목적한 변이가 도입되고, 또한 다른 변이가 없는 것이 확인된 벡터를 선택하여 이후의 실험에 이용했다. 얻어진 변이 벡터는 pCAGGS－dHGF－NG라고 칭한다. 또, 상기 1, 2, 3의 3종의 변이 프라이머를 이용하여 같은 조작을 실시하고, α쇄 3개소의 당쇄를 결손하도록 설계한 변이 벡터 pCAGGS－dHGF－αNG를 제작했다. 나아가 상기 3, 4의 변이 프라이머를 이용하여 동일 조작을 실시하고, β쇄 2개소의 당쇄를 결손하도록 설계한 변이 벡터 pCAGGS－dHGF－βNG를 제작했다.

다음으로, 야생형 벡터 pCAGGS－dHGF 및 변이 벡터 pCAGGS－dHGF－NG, pCAGGS－dHGF－αNG, pCAGGS－dHGF－βNG를 각각 COS－7 세포로 트랜스펙트(transfect)했다. COS－7 세포는 DMEM 배지에 소태아 혈청(FCS)을 10% 첨가하여 배양했다. 세포는 트랜스펙션(transfection) 직전에 무혈청 DMEM 배지로 교환했다. 트랜스펙션은 리포펙타민(lipofectamine) 2000(Inｖitrogen)을 이용하여 리포펙션법에 따라 실시했다. 트랜스펙션 6시간 후, 1% FCS를 포함하는 DMEM으로 배지 교환하고, 그 때에 헤파린을 1μg/mL이 되도록 첨가했다. 이것을 3일간 배양하고 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 배지속에 축적시켰다. 3일 후에 배지를 회수하여 혼합하고, 0.22μm필터로 여과한 후, 정제에 공급할 때까지-80℃로 보존했다. 배지속에 분비된 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF의 농도는 ELISA에 의해 분석했다.

상기 배지를 해동하여, 재차 0.22μm필터로 여과한 후, 50mM　Tris－HCl(pH7. 5), 0.01% Tween80, 0.3M　NaCl로 평형화한 HiTrap　Heparin (Bed　ｖolume：5mL) (Amersham　Biosciences)에 0.6mL/분의 유속으로 첨가했다. 컬럼을 50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween80, 0.3M　NaCl로 세정 후, NaCl 농도를 2M까지 상승시킴으로써 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 용출시켰다. 용출은 1mL/분의 유속으로 실시하여, 2.5mL/tube로 분획했다. 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF가 존재하는 획분을 회수하고, 한외 여과에 의해 50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween80, 0.3M NaCl로 버퍼(buffer) 교환했다. 이것을 같은 버퍼로 평형화한 Mini　S컬럼(Bed　ｖolume：0.8mL)(Amersham　Biosciences)에 0.4mL/분의 유속으로 첨가했다. 컬럼을 50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween80, 0.3M　NaCl로 세정 후, NaCl 농도를 1M까지 상승시킴으로써 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 용출시켰다. 용출은 0.4mL/분의 유속으로 실시하여, 0.4mL/tube로 분획했다. 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF가 존재하는 획분을 회수하고, 정제 상태를 SDS－PAGE에 의해 확인했다.

야생형 벡터의 도입에 의해 얻어진 dHGF를 COS－dHGF－WT, 변이 벡터의 도입에 의해 얻어진 당쇄결손형 dHGF를 각각 COS－dHGF－NG, COS－dHGF－αNG 또는 COS－dHGF－βNG라고 칭한다.

또, 특개평 10－191991에 기재된 방법에 따라 CHO 세포에 의해서도 dHGF 단백질을 조제했다(CHO－dHGF－WT라고 칭한다).

이들 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 SDS－PAGE에 의해 비교한 결과를 도 1에 도시한다. 당쇄결손형 dHGF의 COS－dHGF－NG에서는, α쇄 및 β쇄 모두 당쇄를 결손하는 분자량에 대응하는 위치에 밴드가 시프트(shift) 하고 있는 것이 확인되었다. 당쇄부가형(야생형) dHGF인 COS－dHGF－WT와 CHO－dHGF－WT를 비교하면, COS－dHGF－WT는 CHO－dHGF－WT보다 당쇄부가의 정도가 적지만, 이것은 숙주로서 이용한 COS 세포와 CHO 세포의 당쇄부가능력의 차이 혹은 정제 방법의 차이에 의한 것이라고 생각되었다. α쇄 당쇄만을 결손하는 COS－dHGF－αNG에서는, β쇄 밴드가 당쇄를 결손하는 분자량에 대응하는 위치에 시프트 하고 있는 것이 확인되었다. β쇄 당쇄만을 결손하는 COS－dHGF－βNG에서는,β쇄 밴드가 당쇄를 결손하는 분자량에 대응하는 위치에 시프트 하고 있는 것이 확인되었다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻어진 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 이용하여, 래트 간실질 세포에 대한 증식 활성을 측정했다.

SD래트(8주, 수컷)로부터, 콜라게나이제 관류법에 따라 간실질 세포를 분리했다. 얻어진 간실질 세포를 5% FCS를 포함하는 윌리암스 E(WE) 배지에 현탁하고, 3만개/cm²의 세포 밀도로 배양 접시에 뿌렸다. 4시간 후에 배지를 제거하고 새로운 WE배지(5% FCS를 포함한다) 480μL로 치환하여 배양을 계속했다. 또한 20시간 후에 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 포함하는 샘플 용액을 20μL 첨가하여 배양을 계속했다. 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 첨가하고나서 20시간 후,［³H］티미딘(25Ci/mmol)을 2.5μCi/mL가 되도록 첨가하고 다시 배양을 6시간 계속했다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세정하고, 10% 트리클로로 초산을 첨가하여 4℃에서 20분간 정치(靜置)했다. 나아가 새로운 10% 트리클로로 초산으로 치환하여 10분간 정치하고, 이어서 H₂O 1mL로 세정했다. 이것에 0.5N－NaOH를 더하여 37℃에서 30분간 인큐베이트하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액에 1N－HCl를 더해 중화하였다. 이것을 세포 하비스터(cell harvester)에 걸어 세포 용해물을 유리 필터에 포집했다. 필터를 건조시킨 후, 필터상에 고형 신틸레이터(MeltiLex)를 싣고 핫 플레이트상에서 가온하여 신틸레이터를 필터중에 용해시킨 후, β-카운터에 의해 방사 활성을 측정했다(도 2). 방사 활성치는, 세포에 넣어진［³H］티미딘 양을 나타내고 있고, 이것은 세포 증식에 수반되는 DNA 합성량을 반영하고 있다. 즉, 방사 활성치는, 세포 증식 활성을 반영하고 있다.

당쇄결손형 dHGF(COS－dHGF－NG)는, 야생형 dHGF(COS－dHGF－WT 및 CHO－dHGF－WT)와 동등한 간세포 증식 활성을 나타냈다. α쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－αNG 및 β쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－βNG도 동등한 활성을 나타냈다.

[실시예 3]

MDCK－3B세포를 DMEM(10% FCS를 포함한다)에 현탁하여 24well 플레이트에 1×10⁴cells/well(480μL/well)로 뿌리고, 여기에 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 포함하는 피검 샘플 20μL을 첨가하였다. 37℃에서 20시간 배양한 후, 스캐터(scatter)의 유무를 현미경으로 관찰했다(도 3).

당쇄결손형 dHGF(COS－dHGF－NG)는, 야생형 dHGF(COS－dHGF－WT 및 CHO－dHGF－WT)와 동등한 세포유주활성을 나타냈다. α쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－αNG 및 β쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－βNG도 동등한 활성을 나타냈다.

[실시예 4]

DMEM(10% FCS를 포함한다)에 용해한 콜라겐 용액(Cellmatrix　I－A, 닛타 제러틴)에 MDCK－3B세포를 현탁하여 5000cells/mL의 용액으로 하고, 24well 플레이트에 500μL씩 분주(分注)하였다(2500cells/well). 37℃에서 10분간 인큐베이트하여 콜라겐을 겔화한 후, DMEM(10% FCS를 포함한다)를 480μL 상층(上層)하고, 여기에 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 포함하는 피검 샘플 20μL을 첨가했다. 37℃에서 6일간 배양한 후, 튜브 형성 상태를 현미경으로 관찰했다(도 4).

당쇄결손형 dHGF(COS－dHGF－NG)는, 야생형 dHGF(COS－dHGF－WT 및 CHO－dHGF－WT)와 동등한 형태 형성 활성을 나타냈다. α쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－αNG 및 β쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－βNG도 동등한 활성을 나타냈다.

[실시예 5]

야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF 샘플을 50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween80, 0.3M　NaCl로 희석해 50μg/mL의 농도로 조제하고, 밀봉한 용기에 넣어 37℃에서 7일간 인큐베이트했다. 경일적(經日的)으로 일부를 샘플링하여 －80℃로 보존했다. 샘플링 한 용액중의 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF의 잔존 활성을, 실시예 2와 동일하게 하여 래트 간실질 세포에서의 DNA 합성을 조사함으로써 평가했다. 활성 측정에 있어서는, 샘플링 한 용액을 PBS, 0.5% BSA에서 125ng/mL에 희석한 후, 그 20μL를 간세포의 배양액 480μL에 첨가하여 최종 5ng/mL로 하였다.

당쇄결손형 dHGF(COS－dHGF－NG)는, 야생형 dHGF(COS－dHGF－WT 및 CHO－dHGF－WT)와 동등한 온도 안정성을 나타냈다(도 5). α쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－αNG 및 β쇄 당쇄를 결손하는 COS－dHGF－βNG도 동등한 활성을 나타냈다.

[실시예 6]

80μL의 50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween 80, 0.3M　NaCl에 Na¹²⁵I를 50μCi첨가하고, 이것에 IODO－BEADS(PIERCE)를 1알 첨가하여 실온에서 5분간 인큐베이트했다. 여기에 5μg의 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF를 포함하는 20μL의 용액(50mM　Tris－HCl(pH7.5), 0.01% Tween 80, 0.3M　NaCl)를 첨가하여 실온에서 5분간 인큐베이트 함으로써 요오드화 반응을 실시했다. 튜브로부터 반응액을 뽑아냄으로써 요오드화 반응을 정지시키고, 뽑아낸 반응액을 Sephadex　G－25(Amersham　Biosciences) 컬럼에 의한 겔 여과에 공급함으로써 미반응의 Na¹²⁵I를 제거하고 ¹²⁵I－dHGF를 정제하였다.　

500,000cpm의 ¹²⁵I－dHGF를, 0.1% BSA를 포함하는 PBS로 희석하여 100μL의 용액으로 하였다. 이것을 ICR 쥐(8주, 수컷)에 꼬리 정맥부터 투여했다. 투여 후, 1분, 5분, 15분, 30분, 60분, 120분에 혈액을 채취했다. 채취한 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 감마 카운터에서 방사 활성을 측정해 야생형 dHGF 및 당쇄결손형 dHGF의 혈중 안정성을 평가했다(도 6).

당쇄결손형 dHGF(COS－dHGF－NG)는, CHO－dHGF－WT에 비해, 혈중 안정성이 향상되어 있었다. COS－dHGF－WT는 COS－dHGF－NG와 CHO－dHGF－WT 중간의 안정성을 나타냈다. 이것은, 실시예 1에 나타낸 것처럼, COS－dHGF－WT가 당쇄를 부분적으로 결손하고 있기 때문이라고 생각되었다.

본 발명의 당쇄결손형 HGF는, 당쇄가 부가된 HGF의 대체 HGF로서 유용하다

Sequence Listing <110> Toshikazu Nakamura <120> Modified hepatocellular growth factor <130> p06-4015 <160> 8 <210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapience <220> hepatocyte growth factor <223> <400> 1 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560 Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725 <210> 2 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapience <220> hepatocyte growth factor of five amino acid deletion <223> <400> 2 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg 165 170 175 Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg 180 185 190 Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr 195 200 205 Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly 210 215 220 Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe 225 230 235 240 Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg 245 250 255 Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His 260 265 270 Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met 275 280 285 Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln 290 295 300 Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro 305 310 315 320 Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro 325 330 335 Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 340 345 350 Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg 355 360 365 Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln 370 375 380 Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln 385 390 395 400 Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp5 405 410 415 Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr 435 440 445 Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys 450 455 460 Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile 465 470 475 480 Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr 485 490 495 Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His 500 505 510 Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg 515 520 525 Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly 530 535 540 Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu 545 550 555 560 Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu 565 570 575 Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile 580 585 590 Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser 595 600 605 Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu 610 615 620 Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His 625 630 635 640 His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala 645 650 655 Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu 660 665 670 Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro5 675 680 685 Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val 690 695 700 Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val 705 710 715 720 Pro Gln Ser <210> 3 <211> 2172 <212> DNA <213> Homo sapience <220> hepatocyte growth factor of five amino acid deletion <223> <400> 3 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg 540 ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 600 tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat ggggagagtt atcgaggtct catggatcat 660 acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc 720 ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc 780 cagccgaggc catggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt 840 aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc 900 atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa tggaattcca 960 tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag 1020 tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt 1080 tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg 1140 tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa 1200 acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat 1260 atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat 1320 gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga ttattgccct 1380 atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca tcccgtaata 1440 tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata 1500 ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat aaacatatct gcggaggatc attgataaag 1560 gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa 1620 gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc 1680 aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc 1740 aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta tggatgcaca 1800 attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggatt gatcaactat 1860 gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat 1920 catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga 1980 tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga 2040 atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt 2100 tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg atacacaaaa ttattttaac atataaggta 2160 ccacagtcat ag 2172 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> <400> 4 tgcgctgaca atactatgca agacactgat gttcctttg 39 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> <400> 5 ggcaaaaatt atatgggcca gttatcccaa acaagatctg g 41 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> <400> 6 tgcaaacagg ttctccaagt ttcccagctg gtatatgg 38 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> <400> 7 gggaaggtga ctctgcaaga gtctgaaata tgtgctgg 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> <400> 8 ggtgatacca cacctggaat agtcaattta gaccatcc 38

Claims

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간세포 증식 인자의 당쇄부가 부위의 전부에 있어서 당쇄가 결손되어 있으며, 여기서 상기 간세포 증식 인자의 당쇄부가 부위의 전부에 있어서 당쇄가 부가되지 않도록 상기 간세포 증식 인자의 아미노산 서열에 변이가 도입되며, 상기 간세포 증식 인자의 아미노산 서열에 대하여 다음의 a)부터 c)에 나타낸 변형 중 하나 이상 및 d)에 나타낸 변형이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열 중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스 서열의 Asn이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다；

b) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열 중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스 서열의 Ser 또는 Thr가 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다；

c) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열 중에 존재하는 Asn－X－Ser 또는 Asn－X－Thr(X는 Pro 이외의 아미노산을 나타낸다.)로 나타나는 N－결합형당쇄부가의 콘센서스 서열의 X가 Pro로 치환되어 있다；또는

d) 간세포 증식 인자의 아미노산 서열 중에 존재하는 O－결합형당쇄부가를 받는 Ser 또는/및 Thr이 다른 아미노산 잔기로 치환되어 있다.
청구항 제3항에 있어서,

상기 간세포 증식 인자가 사람 간세포 증식 인자인 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자.
청구항 제3항에 있어서,

상기 간세포 증식 인자가 고양이 또는 개 간세포 증식 인자인 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자.
서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기초로 변형된, 청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자로서, 서열 번호 1 중의 아미노산에 대해서, 다음의 a)부터 e)에 나타낸 변형이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 제294위 또는/및 제296위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제295위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제294위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

b) 제402위 또는/및 제404위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제403위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제402위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

c) 제476위의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있음으로써 제476위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

d) 제566위 또는/및 제568위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제567위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제566위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；또는

e) 제653위 또는/및 제655위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제654위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제653위에 당쇄가 부가되어 있지 않다.
서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 기초로 변형된, 청구항 제3항에 기재된 당쇄 결손형 간세포 증식 인자로서, 서열 번호 2 중의 아미노산에 대해서, 다음의 a)부터 e)에 나타낸 변형이 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 당쇄결손형 간세포 증식 인자；

a) 제289위 또는/및 제291위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제290위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제289위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

b) 제397위 또는/및 제399위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제398위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제397위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

c) 제471위의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있음으로써 제471위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；

d) 제561위 또는/및 제563위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제562위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제561위에 당쇄가 부가되어 있지 않다；또는

e) 제648위 또는/및 제650위의 아미노산이 다른 아미노산으로, 또는/및 제649위의 아미노산이 Pro로 치환되어 있음으로써 제648위에 당쇄가 부가되어 있지 않다.
청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 코드할 수 있는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
청구항 제8항에 기재된 DNA를 넣은 벡터.
청구항 제9항에 기재된 벡터를 세포에 도입하여 상기 세포를 배양하고, 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액 중에 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 생산하도록 하고, 상기 세포내 혹은 상기 세포의 배양액 중에서 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는, 청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법.
청구항 제10항에 있어서,

세포가 진핵세포인 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법.
청구항 제11항에 있어서,

진핵세포가 효모 또는 곤충 세포인 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법.
청구항 제9항에 기재된 벡터를 곤충 개체에 도입하여 곤충 개체 중에 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 생산하게 하고, 상기 곤충 개체로부터 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는, 청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법.
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청구항 제8항에 기재된 염기 서열로 이루어지는 유전자를 주형으로 하여 무세포 단백질 합성 시스템에 의해 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 합성하고, 상기 합성 반응액으로부터 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 정제 회수하는 것을 특징으로 하는, 청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자의 제조법.
청구항 제3항에 기재된 당쇄결손형 간세포 증식 인자를 유효 성분으로 하는 간경변 치료, 신장 질환 치료, 상피 세포 증식 촉진, 암 치료, 항암요법 부작용 방지, 폐장해 치료, 위?십이지장 손상 치료, 뇌신경 장해 치료, 면역 억제 부작용 방지, 콜라겐 분해 촉진, 연골 장해 치료, 동맥 질환 치료, 폐섬유증 치료, 간 질환 치료, 혈액 응고 이상 치료, 혈장 저단백 치료, 창상 치료, 신경장해 개선, 조혈간세포 증가 또는 육모 촉진용 의약 제제.
청구항 제8항에 기재된 DNA를 포함하는, 간경변 치료, 신장 질환 치료, 상피 세포 증식 촉진, 암 치료, 항암요법 부작용 방지, 폐장해 치료, 위?십이지장 손상 치료, 뇌신경 장해 치료, 면역 억제 부작용 방지, 콜라겐 분해 촉진, 연골 장해 치료, 동맥 질환 치료, 폐섬유증 치료, 간 질환 치료, 혈액 응고 이상 치료, 혈장 저단백 치료, 창상 치료, 신경장해 개선, 조혈간세포 증가 또는 육모 촉진용 유전자 치료약.