JP2022514728A - 修飾ヒトエリスロポエチン(modified human erythropoietin) - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献5は、グリコペジレート化された(glycopegylated)EPOペプチドを記載する。変異したEPOペプチドの1つは、アミノ酸配列(配列番号73)を有し、以下の組から選択された少なくとも1つの突然変異(mutation)を有する。
Arg<139>からAla<139>、
Arg<143>からAla<143>、
Lys<154>からAla<154>
特許文献7は、オリゴ糖を組み込んだ修飾EPOを記載する。修飾EPOは、赤血球生成の活性を増加させ、細胞保護活性を維持する。
Asn<30>Thr<32> EPO;
Asn<51>Thr<53> EPO;
Asn<57>Thr<59> EPO;
Asn<69>EPO;
Asn<69>Thr<71> EPO;
Ser<68>Asn<69>Thr<71> EPO;
Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Gly<89>Thr<90> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90>Thr<92> EPO;
Ser<87>Asn<88>Thr<90>Ala<l 62> EPO;
Asn<69>Thr<72>Ser<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Asn<30>Thr<32>Val<87>Asn<88>Thr<90> EPO;
Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO;
Ser<87>Asn<89>Ile<90>Thr<91> EPO;
Asn<136>Thr<138> EPO;
Asn<138>Thr<140> EPO;
Thr<125> EPO;
Pro<124>Thr<125> EpO .
VLQRY(天然hEPOのアミノ酸11-15:配列番号1)、
TKVNFYAW(天然hEPOのアミノ酸44-51:配列番号2)、
SGLRSLTTL(天然hEPOのアミノ酸100-108:配列番号3)、
SNFLRG(天然hEPOのアミノ酸146-151:配列番号4)。
他の突然変異は、配列番号10のアミノ酸7,20,21,29,33,38,42,59,63,67,70,83,96,126,142,143,152,153,155,156,161で与えられる。
Tyr15AsnとLeul7Thrの突然変異を有し、配列番号(SEQ ID)2を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Lys45AsnとAsn47Thrの突然変異を有し、配列番号4を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Glu62AsnとTrp64Thrの突然変異を有し、配列番号8を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Gln65AsnとLeu67Thrの突然変異を有し、配列番号10を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Glu72AsnとVal74Thrの突然変異を有し、配列番号12を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Arg76AsnとGln78Thrの突然変異を有し、配列番号14を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Ala98AsnとSer100Thrの突然変異を有し、配列番号16を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Serl04Asnの突然変異を有し、配列番号18を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Thrl06AsnとLeu108Thrの突然変異を有し、配列番号20を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Leul49Thrの突然変異を有し、配列番号22を含む。
本発明の一実施例によれば、修飾ヒトエリスロポエチンは、
Glyl51AsnとLeul53Thrの突然変異を有し、配列番号24を含む。
配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23。
本発明のmhEPOを製造する方法は、以下のステップ(A)~(H)を有する。
(A)前記mhEPOをコードする核酸配列を提供するステップと、
(B)パッケージング細胞のコトランスフェクション・ベクターを構築するステップと、
(C)前記パッケージング細胞をコトランスフェクトするステップと、
これにより、前記mhEPOをコードする核酸配列を含むレンチウイルス粒子(以下「lvp」と称する)を生成し、
(D)前記ステップ(C)のパッケージング細胞により生成された前記lvpを収穫するステップと、
(E)前記mhEPOを発現する細胞を、前記ステップ(D)からの前記lvpで、形質導入するステップと、
(F)前記mhEPOをコードする核酸配列を含む前記ステップ(E)の細胞を選択するステップと、
(G)前記ステップ(F)で選択された細胞を培養するステップと、
その結果それらは前記mhEPOを発現させ、
(H)前記mhEPOを単離し精製するステップと
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23。
(1)前記転移ベクターの核外輸送を誘導するベクター、
(2)前記lvpが細胞内へ侵入するのを許すベクター、
(3)マトリックスタンパク質、キャプシド、プロテーゼ、逆転写酵素とインテグラ-ゼをコードするベクター、
(4)前記mhEPO配列を含む転移ベクター、
前記ステップ(E)において、前記細胞は、以下の(1)~(5)からなる組から選択される。
(1)CHO.K1,(2)HEK293,(3)NSO,(4)BHK-21,(5)HeLa。
更に、前記溶離剤は、グリシン、酢酸-NaClを含む組から選択される。
前記溶離剤は、以下を含む組から選択される。0.1Mグリシン(pH=2)、0.15Mグリシン(pH=2。5)と、0.2M酢酸、0.15MNaCl(pH=3)。
*神経保護に関連する治療を必要とする患者に対しhEPOの赤血球生成の機能の停止/阻害。この治療では、EPOは有害な影響を及ぼす。
*hEPOの半減期の延長。これにより、in vivo 生物学的活性を改善し、投与回数の減少をもたらす。
神経変性病(1)の一例には、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)がある。運動神経疾患(2)の一例には、ハンチントン病、脊髄小脳萎縮症、クロイツ-ヤコブ病がある。能力傷害の(3)一例には、うつ病、精神分裂症がある。発達障害(4)の一例には、ダウン症がある。神経障害(5)の一例には、脳欠陥事故、頭蓋脳外傷がある。
(i)分子コンフォメーション(立体配座)用に或いは神経保護/神経形成の活性の発達の為に必須のサイトを構成するアミノ酸残基の保存。
(ii)赤血球生成の活性の無効又は停止で提案されたアミノ酸の修飾。
(iii)N-グリコシル形成用のコンセンサス・サイトの生成。
26個のオリゴヌクレオチド(origonucleotide)を設計した。その内2個は、新たな完全なEPO配列を増幅し、残りの24個(順方向と逆方向のオリゴヌクレオチド)は、12個のポイント突然変異を導入する。
突然変異1: (Lys45 -^Asn45) + (Asn47 -^Thr47)
サイト特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)によるhEPOムテインの生成の方法の概要を、図1に示す。
IEDBデータベース(Immune Epitope Database and Analysis Resources)を用いて、シリコ分析(silico analysis)を実行し、hEPOムテインの潜在的な抗原性と不修飾分子のそれとを比較した。それら全てについて、Tエピトープの予測を、Class II Major Histocompatibility Complex (MHCII)で認識されたものだが、世界で最も代表的な8個の対立遺伝子(allele)(下に示す)を分析することにより、実行した。
(HUMAN, HLA-DR: DRB1*01.01, DRB1*03.01, DRB1*04.01, DRB1*07.01, DRB1*08.01, DRB1*11.01 , DRB1*13.01, DRB1*15.01).
抗原性スコアが、各hEPO変異種に対し得られ、それぞれがhEPOに対し得られたスコアと比較された。それらの潜在的な抗原性の程度を図3に示す。hEPOと同レベルの2つのムテイン(Mut98 100と、Mut151 153)が観測された。より大きな潜在的な抗原性を持つ2つのムテイン(Mut72 74と、Mut62 64)が観測された。最後に、より小さな潜在的な抗原性を持つ8つのムテイン(Mut45 47と、Mut49と、Mut15 17と、Mut65 67と、Mut49と、Mut76 78と、Mut104と、Mut106 108)が観測された。これら最後の2つは、抗原性が低いものである。
レンチウイルス粒子を組み立てて、その後CHO.K1細胞を形質導入(transduce)した。このため、HEK293 T/17細胞(パッケージング細胞)を4つのベクターでコトランスフェクト(co-transfect)し、12個のムテインの各々に対し、対応するレンチウイルス粒子を生成した。これらの4つのベクターは、(1)pREV,(2)pVSVG、(3)pMDL,(4)転移ベクター(transfer vector)pLV-PLK-MutXである。
(1)pREVは、転移ベクターの核外輸送とそのパッケージングを誘導する。
(2)pVSVGは、VSVエンベロープGタンパク質(ウイルス粒子の細胞内への移送に必要なもの)をコードする。このGタンパク質は広い親和性(tropism)を有する。
(3)pMDLは、以下のいずれかをコードする。発現ベクターをパッケージ化できるマトリックスとキャプシドタンパク質(capside protein)、プロテーゼ、逆転写酵素(reverse transcriptase)、組み込み酵素(integrase)(構造要素の分解の為と細胞ゲノム内に組み込む為に必要な酵素)
(4)転移ベクターpLV-PKL-MutX内では全てのウイルス遺伝子は除去され、本発明のhEPOムテインに対応する目的の遺伝子で置換される。
HEK293T/17細胞のトランスフェクション後の2日目に、mutXレンチウイルス粒子を含む各細胞の上清を収穫した。これは、CHO.K1細胞を形質導入するのに使用された。かくして、12個のCHO.K1mutXhEPOラインが得られた。72時間後、この上清を収穫し、保存し、後で特徴付けをした。同様に、安定した組換え細胞ラインを生成するために、それらは、ピューロマイシン抗生物質(puromycin antibiotic)を増量して圧縮し、導入遺伝子(transgene)を組み込む細胞を選択した。圧縮された細胞ラインは、増殖され、極低温混合物(90%(v/v)FBS,10%(v/v)DMSO)内に凍結保存され、液体窒素タンク内に保存された。
NDA:活性は検出不可能;
rhEPO:組換えヒトEPO;
Mut:ムテイン;
表I:hEPOムテインの特徴、サンドイッチELISAによる培養上清内の濃度の定量化、等電気収束法で測定されたアイソフォームの数の評価、不修飾分子と比較した割合(%)で表されたin vitro 生物学的活性の決定
本発明のムテインの精製プロセスを次に示す。このプロセスを理解しやすくする為に、次のムテイン(Mut45 47,Mut104,Mut151 153)を実施例として示す。このプロセスは、免疫親和性(IA)精製のスキームによる。最初に、IAマトリックスで行われたプロセスと等価なプロセスを模擬した(プロトコルA)。この目的は、本出願人の研究所で開発された抗rhEPOモノクロナール抗体で捕獲された高グリコシル化されたEPOムテインの各々を溶離する最も好ましい条件を確立することである。上記に基づいて、サンドイッチELISAアッセイが実施され、hEPO誘導体の比率を定量化した。このhEPO誘導体とは、抗原-抗体複合体(antigen-antibody complex)を各溶離条件(elution condition)に曝した後でもmAb2B2に結合を維持しているものである。同様に、IAマトリックスの将来の再使用の手順の観点から、溶離溶液の抗体に対する影響/効果を評価した(プロトコルB)。これは、溶離溶液がhEPOムテインへの結合能力に影響するかを決定するためにである。
以下の溶液1~22の溶離用量を評価した。
1.グリシン0.1M pH2,
2.グリシン0.15M pH2.5,
3.酢酸0.2M、NaCl0.15M pH2.5,
4.グリシン0.15M pH3,
5.クエン酸0.1M pH3,
6.酢酸0.2M、NaCl0.15M pH3,
7.グリシン0.15M pH3.5,
8.酢酸ナトリウム0.1M pH4,
9.酢酸ナトリウム0.1M/ジオキサン10%(v/v)pH4,
10.酢酸ナトリウム0.1M pH5,
11.リン酸ナトリウム0.1M pH6,
12.リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7中のイソプロピルアルコール40%(v/v)
13.PBSpH7,
14.PBSpH7中のエタノール40%(v/v)、
15.PBSpH7中のジオキサン10%(v/v)、
16.PBSpH7中のエチレングリコール40%(v/v)、
17.トリス/HCl0.1M pH8,
18.グリシン0.1M pH9,
19.グリシン0.1M pH10,
20.グリシン0.1M pH11,
21.リン酸ナトリウム0.1M pH11,
22.リン酸ナトリウム0.1M pH11.7
表II:選択された溶離剤溶液を考慮したhEPOムテインの溶出
(1)グリシン0.15M pH2.5
(6)酢酸0.2M、NaCl0.15M pH3
SolI:酢酸0.2M、NaCl0.15M pH3:溶液6
SolII:グリシン0.15M pH2.5:溶液2
表III:hEPOムテインのIACを介した精製パラメーター
表IV:各IACから得られた溶離剤の純度
Ph^sicochemica^_characterizatioi^_o^j2EPO_jivuteins
図9は、IACで精製したムテインのWestern Blot を示す。これを用いて、既知の分子量マーカーを用いて、このムテインの分子量を計算した。
hEPOの高グリコシル化されたムテインの見かけの分子量の決定は、各マーカーが移動する距離の変動曲線上の各変異種に応じたバンドの前フロントと後フロントの移動距離を、分子量の対数に応じて、補間することにより、実行した。
各変異種に対し計算された見かけ上の分子量は以下である。
*Mut45_47:34-66kDa
*Mut104:29-66kDa
*Mut151_153:35-45kDa
*rhEPO:31_43kDa
この決定は、追加的なN-グリコシル化サイトをhEPO分子に組み込むことに成功したことを確認するものである。その理由は、ムテインは、平均で、不修飾のhEPOの分子量より大きい分離量を表すからである。
グリコシル化によるhEPOの不均一性特にシアル酸残基の量を評価する為に、サンプルはIEFにより評価され、hEPOの高グリコシル化された変異種を作り出す様々なPIを有するアイソフォームを決定した。
精製され設計されたhEPOムテインの生物学的特徴付けが実施された。この為に、in vitro 増殖アッセイが、UT-7細胞ライン培養を用いて、行われ、本発明の実施例を示す例として採用されたムテインの赤血球生成の生物学的活性の評価(A-F)を実施した。その理由は、これらの細胞系列の生存と繁殖が、成長媒体(growth medium)中のhEPOの存在に依存しているからである。TF-1細胞ラインを使用するアッセイとは異なり、UT-7細胞ラインを使用するアッセイは、高い感受性応答で特徴付けられ、そのため、工程のこの段階用に選択された。
5.5.1 神経発達(分化)と構造的形成
構造的神経形成性は、神経発達又は分化を刺激するか促すプロセスを含む。この意味において、以下の機能を促進する化学剤又は化合物は、神経親和性化合物(neurotorophic compound)と見なされる。以下の機能の一例は、神経細胞突起の形成又は軸索成長、線維性/樹状脊椎の発達、シナプス数の増加である。神経と神経細胞ラインの一次培養は、このようなプロセスのin vitro 研究で広く用いられている。
この研究の一部は、神経の様々な発達段階における、本発明の様々なhEPO高グリコシル化されたムテインの神経親和性活動を評価した。
本発明のムテインが、神経原生効果(neuritogenic effect)を奏する(ニューロン当たりの神経細胞突起の長さと数が増加する)か否かを決定するために、N2a神経細胞ライン(神経芽のマウス)を用いた。細胞(50000個)が、培養プレート(24ウエル)のガラス上に接種され、DMEM完全媒体内に維持され、神経分化を阻止する20%のウシ胎児漿液(FBS:fetal bovine serum)と、抗生物質としてのゲンタマイシン(gentamicin)を補充した。次いで、培養媒体を、FBSを含まない媒体で置き換え、異なる濃度(50と300ng/ml)のrhEPO又はムテインで3時間補充し、神経細胞突起形成を誘発した(非特許文献32)。この後、細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA:paraformaldehyde)で、またリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でスクロース(sucrose)4%で、4℃で10分間固定し、PBS中の0.1%(v/v)のトリトン(Triton)X-100で2分間透過処理した。この固定された細胞は、その後、PBS中の3%(w/v)のウシ漿液アルブミン(BSA:bovine serum albumin)で1-2時間、ブロックされた。これには、1%(w/v)BSA内でマウス・アンティ-アルファ-ツブリン(mouse anti-alpha-tubulin)IgGモノクロナール抗体(1:1000,シグマ)を用いて、4℃で16時間神経細胞突起を標識した。翌日、PBSで3回の洗浄後、それを、アクチンフィラメント(actin filament)(1:1000,インビトロゲン(invitrogen))を標識するローダミン-共役されたファロイディン(rhodamine conjugated phalloidin)と、Alex488(1:1000,インビトロゲン)に共役されたヒツジ抗マウス抗体(goat anti-mouse antibody)で、室温で1時間インキュベート(培養)した。冷たいPBSで5分間3回洗浄した後、ガラスは蛍光保存(Fluorsave)(Calbiochem)装置に搭載された。
糸状足(線維芽)と樹状突起脊椎は、アクチン・フィラメントでエンリッチした膜突起である。この膜突起では、神経細胞突起/樹状突起から出現し、ポスト-シナプス区画(post -synaptic compartment )として作用する。このポスト-シナプス区画は、中枢神経の興奮シナプス(excitatoril synapses)内に豊富に存在する。この脊椎の形態は,可変であり、その差分構造(differential structure)に応じて分類される。樹状突起脊椎は、神経形成に好ましい神経発達の間、その形状/構造を変えることがある(非特許文献33)。この意味において、ある神経変性疾患は、樹状突起脊椎の形状と数量の変化(増加と減少の両方)に関連している。例えば、ダウン症においては、脊椎の量は著しく減少していると決定されている(非特許文献34)。これに対し、自閉症スペクトラム傷害では、より多い量の脊椎が、見つかっている(非特許文献35)。
シナプスは、2つのニューロンの間の膜の特殊な隣接関係(specialized contiguity relation)(ユニオン)として定義される。このユニオンは、シナプス・クレフト(synaptic cleft)として知られているが、電気インパルスの伝導と、あるシナプス(プレ-シナプス)から別のシナプス(ポスト-シナプス)への物質の通過を容易にする。様々な技術が開発され、シナプスの数を定量化している。シナプスの現在受け入れられている定義は、プレ-シナプス区画からの排他的なタンパク質クラスターと、ポスト-シナプス区画からの排他的なタンパク質クラスターが、同時に発生することである。
この為、免疫検出アッセイを、15日(15DIV)の一次ニューロン培養で実行した。この一次ニューロン培養においては、シナプス形成は、プレ-シナプスとポスト-シナプスのマーカーを重ね合わせることにより、検出された。
海馬ニューロンの一次培養に対するhEPOムテインの抗アポトーシスの効果の評価は、これらの化合物が、細胞(その代謝が、確立した細胞ライン内のようには変わらない)内に有する効果を研究することである。それは、興味深いモデルを構成する。その理由は、それは、脳内でin vivoで起こることにより現実的に似ているからである。
プライマーは以下であった。:
Mut15_17F : GTGCTGGAAAGAAACCTGACGGAAGCCAAA
MUT15_17R : TTTGGCTTCCGTCAGGTTTCTTTCCAGCAC
MUTEIN 15-17 (SEQ ID No. 1)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
AAACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 15-17 (SEQ ID No . 2)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERNLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 45-47(Lys45->Thr45)+(Asn47->Thr47)
プライマーは以下であった。:
Mut45_47F : CCCGACACCAACGTGACCTTCTACGCC
Mut45_47R: GGCGTGAAGGTCACGTTGGTGTCGGG
MUTEIN 45-47 (SEQ ID No. 3)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAACGTGACCTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 45-47 (SEQ ID No. 4)のヌクレオチド配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTNVTFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 49(Tyr49->Thr49)
プライマーは以下であった。:
Mut49F: AAAGTGAACTTCACCGCCTGGAAGCGG
Mut49R : CCGCTTCCAGGCGGTGAAGTTCACTTT
MUTEIN 49 (SEQ ID No. 5)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCACCGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 49 (SEQ ID No. 6)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFTAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 62-64(Glu62->Asn62)+(Trp64->Thr64)
プライマーは以下であった。:
Mut62_64F : CAGGCTGTGAACGTGACGCAGGGACTG
MUT62_64R : CAGTCCCTGCGTCACGTTCACAGCCTG
MUTEIN 62-64 (SEQ ID No. 7)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGAACGTGACGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 62-64 (SEQ ID No. 8)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS
LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVNVTQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 65-67(Gln65->Asn65)+(Leu67->Thr67)
プライマーは以下であった。:
Mut65_67F : GAAGTGTGGAACGGAACGGCTCTGCTG
MUT65_67R : CAGCAGAGCCGTTCCGTTCCACACTTC
MUTEIN 65-67 (SEQ ID No. 9)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGAACGGAACGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 65-67 (SEQ ID No. 10)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWNGTALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 72-74(Glu72->Asn72)+(Val74->Thr74)
プライマーは以下であった。:
Mut72_74F : CTGCTGAGCAACGCTACGCTGAGAGGA
MUT72_74R : TCCTCTCAGCGTAGCGTTGCTCAGCAG
MUTEIN 72-74 (SEQ ID No. 11)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCAACGCTACGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 72-74 (SEQ ID No. 12)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSNATLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 76-78(Arg76->Asn76)+(Gln78->Thr78)
プライマーは以下であった。:
Mut76_78F : GCTGTGCTGAACGGAACGGCCCTGCTC
MUT76 78R : GAGCAGGGCCGTTCCGTTCAGCACAGC
MUTEIN 76-78 (SEQ ID No. 13)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAACGGAACGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 76-78 (SEQ ID No. 14)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLNGTALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 98-100(Ala98->Asn98)+(Ser100->Thr100)
プライマーは以下であった。:
Mut98_100F : GTGGACAAGAATGTGACCGGCCTGAGATCC
MUT98_100R: GGATCTCAGGCCGGTCACATTCTTGTCCAC
MUTEIN 98-100 (SEQ ID No. 15)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG GACAAGAATGTGACCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 98-100 (SEQ ID No. 16)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS
LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV
DKNVTGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY
TGEACRTGDR
MUTEIN 104 (Ser104 -^Asn104)
プライマーは以下であった。:
Mut104F : TCCGGCCTGAGAAACCTGACCACCCTG
MUT104R: CAGGGTGGTCAGGTTTCTCAGGCCGGA
MUTEIN 104 (SEQ ID No. 17)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGAAACCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 104 (SEQ ID No. 18)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRNLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 106-108 (Thr106 ->Asn106)+(Leu108->Thr108)?
プライマーは以下であった。:
Mut106 108F : AGATCCCTGAACACCACGCTGAGAGCA
MUT106 108R : TGCTCTCAGCGTGGTGTTCAGGGATCT
MUTEIN 106-108 (SEQ ID No. 19)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGAACACCACGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 106-108 (SEQ ID No. 20)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLNTTLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 149 (Leu149 -^Thr149)
プライマーは以下であった。:
Mut149F: TACTCCAACTTCACGCGGGGCAAGCTG
MUT149R: CAGCTTGCCCCGCGTGAAGTTGGAGTA
MUTEIN 149 (SEQ ID No. 21)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCACGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 149 (SEQ ID No. 22)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFTRGKLKLY TGEACRTGDR
MUTEIN 151-153 (Gly151 - Asn151) + (Leu153 -^Thr153)
プライマーは以下であった。:
Mut151_153F : AACTTCCTGCGGAACAAGACGAAGCTGTAC
MUT151_153R : GTACAGCTTCGTCTTGTTCCGCAGGAAGTT
MUTEIN 151-153 (SEQ ID No. 23)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGAACAAGACGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
MUTEIN 151-153 (SEQ ID No. 24)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRNKTKLY
TGEACRTGDR
HUMAN EPO SEQUENCE
HUMAN EPO (SEQ ID No. 25)のヌクレオチド配列
ATGGGCGTGCACGAATGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGTCCCTGCTGTCTCTGCCTC
TGGGACTGCCTGTGCTGGGCGCTCCTCCTAGACTGATCTGCGACTCCCGGGTGCTGGAAAG
ATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCTCC
CTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGG
AAGTGGGCCAGCAGGCTGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCTCTGCTGAGCGAGGCTGTGCT
GAGAGGACAGGCCCTGCTCGTGAACTCCTCCCAGCCTTGGGAACCCCTGCAGCTGCACGTG
GACAAGGCTGTGTCCGGCCTGAGATCCCTGACCACCCTGCTGAGAGCACTGGGAGCCCAGA
AAGAGGCCATCTCTCCACCTGACGCCGCCTCTGCTGCTCCTCTGAGAACCATCACCGCCGA
CACCTTCAGAAAGCTGTTCCGGGTGTACTCCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTAC
ACCGGCGAGGCTTGCCGGACCGGCGACAGA
hEPO(配列番号26)のアミノ酸配列
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCS LNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHV DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLY TGEACRTGDR
Claims (26)
- 修飾ヒトエリスロポエチン(以下「mhEPO」と称する)において、
その赤血球生成促進の活性が、ヒトエリスロポエチン(以下「hEPO」と称する)のそれに比較して0.5%未満であり、グリコシル化用のコンセンサス・サイトの追加により、ホモ二量体又はヘテロ二量体の受容体への結合サイトの突然変異を含み、神経保護又は神経形成の能力を維持する
ことを特徴とする修飾ヒトエリスロポエチン。 - 前記受容体への結合サイトは以下のいずれかのポジションに含まれるアミノ酸の組から選択される
45-47、15-17,104,98-100,106-108,149,151-153,76-78,72-74,62-64,65-67又はこれらの組み合わせ
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 前記突然変異は、以下(a)~(k)を含む組から選択される
(a.) Lys45Asn と Asn47Thr;(b) Tyr15Asn と Leu17Thr;(c). Ser104Asn;(d) Ala98Asn と Ser100Thr;(e) Thr106Asn と Leu108Thr;(f) Leu149Thr;(g) Gly151Asn と Leu153Thr;(h) Arg76Asn と Gln78Thr;(i) Glu72Asn と Val74Thr;(j)・ Glu62Asn と Trp64Thr; (k). Gln65Asn と Leu67Thr.
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 前記mhEPOの赤血球生成促進の活性は、前記hEPOのそれに比較して、最大0.2%である
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 前記mhEPOの赤血球生成促進の活性は、存在しない
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたヌクレオチド配列を含むDNA配列によりコードされている
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたアミノ酸配列を含むDNA配列によりコードされている
配列番号2,配列番号4,配列番号8,配列番号10,配列番号12,配列番号14,配列番号16,配列番号18,配列番号20,配列番号22,配列番号24
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたヌクレオチド配列を含む
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする核酸。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたヌクレオチド配列を含む
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする形質変換ベクター。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたヌクレオチド配列を含む
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする発現ベクター。 - 以下の配列番号を含む組から選択されたヌクレオチド配列を含む
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とするレンチウイルス・ベクター。 - 以下の配列番号を含む組から選択された核酸分子を含む
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする遺伝子修飾細胞。 - 動物細胞ライン、植物細胞ライン、N-グリカンの添加を可能にする細胞宿主の内のいずれかを含む
ことを特徴とする請求項12記載の遺伝子修飾細胞。 - 動物細胞ラインを含む
ことを特徴とする請求項12記載の遺伝子修飾細胞。 - 以下の(1)~(5)を含む組のいずれかから選択される
(1)CHO.K1,(2)HEK293,(3)NSO,(4)BHK-21,(5)HeLa
ことを特徴とする請求項12記載の遺伝子修飾細胞。 - 請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチンを、治療的に有効な量含む
ことを特徴とする医薬組成物。 - 請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチンを治療的に有効な量含み、以下から選択される病状の治療に使われる
アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、運動神経病、ハンチントン病、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、うつ病と統合失調病を含む障害性疾患、ダウン症を含む発達性障害障害、脳血管障害による神経組織障害、頭蓋脳外傷
ことを特徴とする医薬組成物。 - 請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチンを、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、運動神経病、ハンチントン病、脊髄小脳萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病、うつ病と統合失調病を含む障害性疾患、ダウン症を含む発達性障害障害、脳血管障害による神経組織障害、頭蓋脳外傷から選択される病状の治療に使う
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチンの使用。 - 請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチン(以下「mhEPO」と称する)を製造する方法において、
(A)前記mhEPOをコードする核酸配列を提供するステップと、
(B)パッケージング細胞のコトランスフェクション・ベクターを構築するステップと、
(C)前記パッケージング細胞をコトランスフェクトするステップと、
これにより、前記mhEPOをコードする核酸配列を含むレンチウイルス粒子(以下「lvp」と称する)を生成し、
(D)前記ステップ(C)のパッケージング細胞により生成された前記lvpを収穫するステップと、
(E)前記mhEPOを発現する細胞を、前記ステップ(D)からの前記lvpで、形質導入するステップと、
(F)前記mhEPOをコードする核酸配列を含む前記ステップ(E)の細胞を選択するステップと、
(G)前記ステップ(F)で選択された細胞を培養するステップと、
その結果それらは前記mhEPOを発現させ、
(H)前記mhEPOを単離し精製するステップと
を有する
ことを特徴とする請求項1記載の修飾ヒトエリスロポエチンを製造する方法。 - 前記ステップ(A)において、前記核酸配列は、以下を含む組から選択される
配列番号1,配列番号3,配列番号7,配列番号9,配列番号11,配列番号13,配列番号15,配列番号17,配列番号19,配列番号21,配列番号23
ことを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記ステップ(B)のコトランスフェクション・ベクターは、以下のベクター(1)~(4)のいずれかを含む
(1)前記転移ベクターの核外輸送を誘導するベクター、
(2)前記lvpが細胞内へ侵入するのを許すベクター、
(3)マトリックスタンパク質、キャプシド、プロテーゼ、逆転写酵素とインテグラ-ゼをコードするベクター、
(4)前記mhEPO配列を含む転移ベクター、
ことを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記ステップ(E)において、前記細胞は、以下の(1)~(5)の組から選択される
(1)CHO.K1,(2)HEK293,(3)NSO,(4)BHK-21,(5)HeLa
ことを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記ステップ(H)は、アンチ-rhEPO抗体と溶離剤を含む免疫親和性による精製である
ことを特徴とする請求項19記載の方法。 - 前記溶離剤は、以下を含む組から選択される
グリシン、酢酸-NaCl、酢酸塩、クエン酸、リン酸塩、エタノール、イソプロピルアルコール、ジオキサン、エチレンプリコール、Tris-HCl、それらの混合物、
ことを特徴とする請求項23記載の方法。 - 前記溶離剤は、グリシン、酢酸-NaClを含む組から選択される
ことを特徴とする請求項23記載の方法。 - 前記溶離剤は、以下(1)~(4)を含む組から選択される
(1)0.1Mグリシン(pH=2)、
(2)0.15Mグリシン(pH=2.5)、
(3)0.2M酢酸、0.5MNaCl(pH=3)
ことを特徴とする請求項23記載の方法。
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JPH08506023A (ja) * | 1993-08-17 | 1996-07-02 | アムジエン・インコーポレーテツド | エリトロポエチン類似体 |
JP2008539745A (ja) * | 2005-05-13 | 2008-11-20 | シャリテー ウニベルジテーツメディツィーン−ベルリン | エリスロポエチン変異体 |
JP2009510008A (ja) * | 2005-09-28 | 2009-03-12 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 神経変性障害の処置 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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AU6709794A (en) * | 1993-04-21 | 1994-11-08 | Brigham And Women's Hospital | Erythropoietin muteins with enhanced activity |
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AU2003251770B9 (en) * | 2002-07-01 | 2009-06-04 | H. Lundbeck A/S | Recombinant tissue protective cytokines and encoding nucleic acids thereof for protection, restoration, and enhancement of responsive cells, tissues, and organs |
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JP2008539745A (ja) * | 2005-05-13 | 2008-11-20 | シャリテー ウニベルジテーツメディツィーン−ベルリン | エリスロポエチン変異体 |
JP2009510008A (ja) * | 2005-09-28 | 2009-03-12 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 神経変性障害の処置 |
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