CZ291515B6

CZ291515B6 - Izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, způsob její přípravy a farmaceutická kompozice na její bázi

Info

Publication number: CZ291515B6
Application number: CZ19904972A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Wayne Strickland; Thomas Edward Byrne; Steven George Elliott
Original assignee: Kirin-Amgen, Inc.
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1990-10-12
Publication date: 2003-03-12
Also published as: JP2983629B2; LV12575A; DE69029370T2; HK1006718A1; DK0668351T3; DE69033301D1; KR920701255A; CZ291472B6; JPH04502331A; JP3073905B2; IL125175A0; GR3032089T3; DE69033301T2; WO1991005867A1; CZ497290A3; DE69029370D1; KR100263845B1; DK0428267T4; CZ291471B6; CA2165694C

Abstract

Izolovan biologicky aktivn erytropoietinov izoforma, vykazuj c jedin² izoelektrick² bod a maj c specifick² po et sialov²ch kyselin na molekulu erytropoietinu, kde uveden² po et je vybr n ze skupiny, zahrnuj c 1 a 14. Zp sob p° pravy t to erytropoietinov izoformy, kter² zahrnuje stupn preparativn izoelektrick fokusace iÜt n ho erytropoietinu a eluce jedin izoformy z gelu. Farmaceutick kompozice, obsahuj c terapeuticky · inn mno stv t to erytropoietinov izoformy a farmaceuticky p°ijateln °edidlo, p° sadu nebo nosi .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká izolované biologicky aktivní erytropoietinové izoformy, způsobu její přípravy a farmaceutické kompozice na její bázi

Dosavadní stav techniky

Erytropoietin je glykoproteinový hormon zjištěný při zrání erytropoidních progenitorových buněk na erytrocyty. Má podstatný význam při regulaci hladin červených krvinek v oběhu. Přirozeně se vyskytující erytropoietin je produkován játry' během fetálního života a ledvinami u dospělých a cirkuluje v krvi a stimuluje produkci červených krvinek v kostní dřeni. Anémie je téměř vždy důsledkem renálního poškození, působící snížení produkce erytropoietinu v ledvinách. O rekombinantním erytropoietinu, produkovaném technikami genového inženýrství, zahrnujícími expresi proteinového produktu hostitelskými buňkami transformovanými genem kódujícím erytropoietin bylo zjištěno, že je účinný, jestliže se použije při léčení anémie vzniklé z chronického renálního poškození.

Dosud byla dostupnost erytropoietinu velmi omezená. I když je protein přítomen v lidské moči, vylučovaná množství jsou příliš nízká pro praktický zdroj erytropoietinu pro terapeutické využití. Pacienti postižení aplastickou anémií vykazují zvýšení hladiny urinámího erytropoietinu ve srovnání se zdravými individui, ale omezené množství takové moče rovněž činí tento zdroj nepraktickým. Purifikace lidského urinámího erytropoietinu podle Miyakeho a spol., J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), používá jako vý chozí materiál moč od osob s aplastickou anémií.

Identifikace, klonování a exprese genů, kódujících erytropoietin, je popsána v US patentu č. 4 703 008 Linnem. Popis purifikace rekombinantního erytropoietinu z buněčného média, podporujícího růst savčích buněk, obsahujících rekombinantní erytropoietinové plazmidy, je např. zahrnuta v US patentu č. 4 667 016 Laie a spol.. Exprese a získání biologicky aktivního rekombinantního erytropoietinu za savčích hostitelských buněk, obsahujících erytropoietinový gen v rekombinantním plazmidu, poskytuje v první řadě dostatečné množství erytropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Dále znalost genové sekvence a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu umožňuje lepší pochopené působení tohoto proteinu.

Biologická aktivita proteinu je závislá na jeho struktuře. Zejména primární struktura proteinu (tj. jeho aminokyselinová sekvence) poskytuje informaci, která umožňuje formaci sekundární (např. α-helix nebo β—list) a terciární (trojrozměrné přehyby) struktury polypeptidu během a po jeho syntéze. Přerušení vlastních sekundárních a terciárních struktur zavedením mutací nebo chemickým nebo enzymatickým zpracováním může vést ke snížení biologické aktivity.

V prokaryotních organismech jsou biologické aktivity proteinů z velké části ovládány výše uvedenými strukturami. Na rozdíl od proteinů z prokaryotních buněk je mnoho buněčných povrchů a sekretovaných proteinů produkovaných v eukaryotních buňkách modifikováno jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace označovaná jako glykosylace může výrazně ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může také být důležitá pro stabilitu proteinu, sekreci a subcelulámí lokalizaci. Vlastní glykosylace může mít základní význam pro biologickou aktivitu. Některé geny z eukaryotních organismů, když jsou exprimovány v bakteriích (např. E. coli), které poskytují proteiny, které mají malou nebo žádnou aktivitu díky nedostatku glykosylace.

Glykosylace se uskutečňuje při specifických místech podél polypeptidového hlavního řetězce a je obvykle dvou typů: O-vázané oligosacharidy jsou spojené se sarinovými nebo threoninovými zbytky, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, jestliže jsou tyto části sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků nalezené v každém typu, jsou rozdílné. Jeden typ cukru je obvykle nalezen na obou, je jím Nacetylneuraminová kyselina (dále nazývaná jako sialová kyselina). Sialová kyselina je obvykle terminální zbytek obou N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji uděluje glykoproteinu kyselý charakter.

Jak lidský z moče získaný erytropoietin, tak i rekombinantní erytropoietin (exprimovaný v savčích buňkách), mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 lidského erytropoietinu, obsahují tři N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, kde tvto řetězce tvoří asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázaná glykosylace probíhá na asparaginových zbytcích, umístěných v polohách 24, 38 a 83, zatímco O-vázané glykosylace probíhá na serinovém zbytku umístěném v poloze 126 (Lai a spol., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy a spol. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Oligosacharidové řetězce mohou být modifikovány terminálními zbjtky sialové kyseliny. Enzymatické zpracování glykosylovaného erytropoietinu pro odstranění zbvtků sialové kyseliny vede ke ztrátě in vivo aktivity, ale nepůsobí ztrátu aktivity in vitro (Lowy a spol., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser a spol., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Toto chování může být využito při rychlém odstranění asialoerytropoietinu z oběhu po interakci shepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein (Morrell a spol. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs a spol. Am. J. Phisio. 227, 1385 (1974); Ashwell a spol., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Erytropoietin tak vykazuje in vivo biologickou účinnost pouze, když je sialylován, a je tak zabráněno jeho vazbě hepatickým vázacím proteinem.

Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích není definována dostatečně. Bylo zjištěno, že neglykosylovaný erytropoietin má velmi sníženou in vivo aktivitu ve srovnání s glykosylovanou formou, ale udržuje si aktivitu in vitro (Dordal a spol. Endocrinology 116, 2293 (1985); Linův patent výše)). V další studii nicméně odstranění N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharidových řetězců jednotlivě nebo společně mutagenezí asparaginových nebo serinových zbytků, které jsou glykosylačními místy, výrazně snižuje in vitro aktivitu přeměněného erytropoietinu, který je produkován v savčích buňkách (Dube a spol. J. Biol. Chem. 263, 17516(1988)).

Glykoproteiny jako je erytropoietin mohou být separovány na různě nabité formy za použití technik jako je izoelektrická fokusace (IEF). Jsou uváděny IEF studie surového a částečně purinovaných erytropoietinových přípravků (Lukowsky a spol., J. Biochem. 50, 909 (1972); Shelton a spol. Biochem. med. 12, 45 (1975); Fuhr a spol. Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930 (1981)). Nanejvýš tři nebo čtyři frakce mající erytropoietinovou aktivitu byly rozlišeny IEF v těchto studiích a žádná nebyla charakterizována s ohledem na obsah cukrů. Dále nebyl stanoven žádný vztah mezi izoelektrickými body frakcí a jejich biologickou aktivitou.

V průběhu purifikace urinárního erytropoietinu z lidské moče, popisované v práci Miyakeho a spol. supra, byly zjištěny dvě erytropoietinové frakce z chromatografie na hydroxylapatitu označené jako II a IIIA, mající stejnou specifickou aktivitu. Následující analýza cukrů frakce II a IIIA prokázala, že frakce II má větší průměrný obsah sialové kyseliny než frakce IIIA (Dordal a spol. supra).

Podstatou předloženého vynálezu je poskytnout separované a izolované izoformy erytropoietinu, mající definovaný obsah sialových kyselin a biologickou aktivitu. Farmaceutické přípravky, obsahující takové molekuly by mohly být terapeuticky prospěšné.

-2CZ 291515 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaná biologicky aktivní erytropoietinová izoforma, vykazující jediný izoelektrický bod a mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erytropoietinu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14.

Erytropoietinovou izoformou podle vynálezu je účelně rekombinantní izoforma, s výhodou pak rekombinantní izoforma, která je vyrobena expresí exogenní DNA sekvence v buňce CHO. Erytropoietinová izoforma podle vynálezu s výhodou obsahuje erytropoietin, mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 nebo 1-166 lidského erytropoietinu. V přednostních provedeních vynálezu tato erytropoietinová izoforma obsahuje 14, 13 nebo 10 sialových kyselin na molekulu erytropoietinu.

Předmětem vy nálezu je dále také způsob přípravy erytropoietinové izoformy definované výše, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje stupně preparativní izoelektrické fokusace čištěného erytropoietinu a eluce jediné izoformy z gelu.

Konečně je předmětem vynálezu také farmaceutická kompozice obsahující terapeuticky účinné množství erytropoietinové izoformy definované výše a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.

Přehled obrázků na vý kresech

Obr. 1 představuje analytický izoelektrickofokusační gel z dělení rekombinantních erytropoietinových izoforem. Gelové dráhy 1-11 představují izoformy v rozmezí od méně kyselých (vyšší pí) ve dráze I ke kyselejším (nižší pí) ve dráze 11. Čištěný rekombinantní erytropoietin obsahující směs izoforem 9-14 je také uveden v poslední levé a pravé dráze gelu.

Obr. 2 představuje vztah mezi počtem sialových kyselin na erytropoietinovou izoformu a specifickou aktivitou in vivo každé izoformy, vyjádřenou jako jednotky na mg erytropoietinového polypeptidů. Na obr. 2A byla koncentrace každé erytropoietinové izoformy stanovena Bradfordovou proteinovou zkouškou, na obr. 2B byla koncentrace stanovena absorbancí při 280 nm, na obr. 2C byla koncentrace stanovena pomocí RIA.

Obr. 3 představuje analytický izoelektrickofokusační gel definovaných směsí rekombinantních erytropoietinových izoforem připravených aniontovýměnnou chromatografií za různých podmínek. Gelové dráhy 1-6 představují erytropoietinové izoformy eluované při vysocesolném promývání po promývání Q-Sepharosové kolony 150 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 150 mM kyselinou octovou (nepufrovaná), 200 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 250 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 300 mM kyselinou octovou, pH 4,7 nebo 300 mM kyselinou octovou (nepufrovanou). Čištěný rekombinantní erytropoietin, obsahující směs izoforem, získaný za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, s tím rozdílem, že DEAEagarózová chromatografíe je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, je znázorněn ve dráze zcela vlevo na gelu.

Obr. 4 představuje separaci erytropoietinových izoforem 8 až 12 získaných zpracováním média buněk na sloupci Q-Sepharosy gradientem klesajícího pH a zvyšující se iontové síly. Podíly z frakcí označených 2 až 40 byly podrobeny analytické izoelektrické fokusaci. Čištěný rekombinantní erytropoietin, obsahující směs izoforem, získaných za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, s tím rozdílem, že DEAE-agarózová chromatografíe byla nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, je uveden v poslední levé dráze tohoto gelu.

- J CZ 291515 B6

Obr. 5 představuje aminokyselinovou sekvenci lidského erytropoietinu. Čtverečky označují asparaginové zbytky, ke kterým jsou připojeny karbonydrátové řetězce a hvězdičky označují threoninové a serinové zbytky modifikované karbohydrátem. Další glykosylační místa poskytnutá v analozích z příkladu 6 jsou indikována mutacemi asparaginu, šeřinu a threoninu.

Obr. 6A, 6B a 6C představují série stupňů klonování při enerování plazmidů pro konstrukci a analýzu analogů lidského erytropoietinu. Tyto analogy mají aminokyseliny změněné jak je uvedeno na obr. 5, které poskytují další glykosylační místa.

Obr. 7 představuje analýzy Western blot COS buněčných supematantů sekvencí lidského erytropoietinu a indikovaných erytropoietinových analogů. Analogy /Asn⁹, Ser¹'/EPO, /Asn⁶⁹/EPO, /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO a /Pro¹²⁴, Thr ²⁵/EPO jsou konstruovány jak je popsáno v příkladu 6, Analogy /Pro¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO, /Asn¹²⁶, Ser¹²⁸/EPO a /Thr¹²⁵. Ser¹² EPO, které neobsahují další karbohydrátové řetězce, jsou zde uvedeny pro srovnání.

Obr. 8 představuje Western blot analýzu COS buněčných supematantů sekvencí lidského erytropoietinu a indikovaných erytropoietinových analogů pro zpracování s N-glykanázou. Analogy /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴. Thr¹²⁵/ERPO jsou konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /Val¹²⁶/EPO, /Pro¹²⁴/EPO, /Pro¹²⁵/EPO, /Thr¹²⁷/EPO, /Pro¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO a /Thr¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO jsou uvedeny pro srovnání.

Obr. 9 představuje izoelektrofokusační gel poolů 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Qsepharose a C4 reverzní fázi zpracováním buněčného média, které podporuje růst CHO buněk transfektovaných erytropoietinovou cDNA, obsahující /Thr^I2:7mutaci. Čištěný rekombinantní erytropoietin, obsahující směs izoforem, je získán za použiti postupů, popsaných v příkladu 2 práce Laia a spol., supra, s tím rozdílem, že DEAE-agarózová chromatografie je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, tyto erytropoietiny jsou uvedeny v levých a pravých drahách gelu.

Podle předloženého vynálezu jsou poskytovány izoformy erytropoietinu. Izolelektrická fokusace (IEF) dělí proteiny na základě náboje. Při umístění do gradientu pH a působením elektrického pole budou proteiny migrovat kbodu, ve kterém nemají náboj sítě a zůstávají na tomto místě. Toto je izoelektrický bod (pí) proteinu. Každý jednotlivý pruh pozorovaný při IEF představuje molekuly mající určitý pí a tím tedy obecně i stejný náboj ajsou nazvány jako izoformy. Použitý výraz „erytropoietinová izoforma“ označuje erytropoietinové přípravky, mající jediné pí a mající stejné aminokyselinové sekvence.

Ve výhodném provedení je erytropoietin produkt exprese exogenní DNA sekvence, která byla transfektována do jiných eukaryotních hostitelských buněk než lidských, tj., ve výhodném provedení je erytropoietin „rekombinantní erytropoietin“. Rekombinantní erytropoietin je výhodně produkován postupem popsaným Linem, US patent č. 4 703 008, uvedeným zde pro úplnost. Rekombinantní erytropoietin je výhodně čištěn podle obecných postupů popsaných v příkladu 2 v US patentu č. 4 667 016 Laie a spol., který je zde uveden jako odkaz nebo alternativně postupem popsaným v příkladu 2, kde chromatografie na DEAE agaróze je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose. V modifikaci se sloupcem Q-Sepharosa se 55 mM NaCl nahradí 25 mM NaCl v pufrovaném roztoku pro uvedení kolony na neutrální pH a 140 mM NaCl se nahradí 75 mM NaCl v pufrovaném roztoku pro eluci erytropoietinu z kolony. Tento materiál při analýze elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným migruje jako jediný druh (tj. pruh). Jestliže se čištěný erytropoietin podrobí IEF, jsou v gelu zřejmé násobné pruhy, které indikují, že jsou přítomny různě nabité formy glykoproteinů.

Bylo nalezeno, že jednotlivé izoformy rekombinantního erytropoietinu, mající aminokyselinovou sekvenci z moče získaného lidského erytropoietinu odpovídají erytropoietinovým molekulám, majícím od 1 do 14 sialových kyselin a každá izoforma přítomná v čištěném rekombinantním erytropoietinu má in vivo aktivitu, která má vztah k počtu sialových kyselin izoformy. Výraz

-4CZ 291515 B6

..erytropoietin“, jak je zde použit, zahrnuje přirozeně získaný erytropoietin, z moče získaný lidský erytropoietin jakož i nepřirozeně se vyskytující polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci dostatečně duplikativní s přirozeně se vyskytujícím erytropoietinem pro získání in vivo biologických vlastností takových, že buňky kostní dřeně zvyšují produkci retikulacytů a červených krvinek.

Surové přípravky erytropoietinu mají mnoho izoforem, ale materiál čištěný, například Laien a spol supra příklad 2, obsahuje převážně šest izoforem při analýze IEF. Dále byla detekována nejméně jedna další izoforma vy šší kyselosti při použití chromatografíckých postupů popsaných v příkladu 4. (Tato více kyselá forma, migrující při > 14 sialových kyselinách na IEF gelu může obsahovat negativní náboje nesialové ky seliny jak je zřejmé z odolnosti vůči štěpení sialidázou). Tyto izoformy se od sebe liší obsahem sialové kyseliny. Jak je uvedeno v příkladech, je toto doložení izolací 10 takových izoforem při preparativní IEF a stanovením obsahu sialové kyseliny u pěti z nich. Z izoforem zkoušených na obsah sialové kyseliny bylo zjištěno, že pět izoforem obsahuje buď 9, 10, 11, 12 nebo 13 zbytků sialové kyseliny.

Existuje vztah mezi relativní in vivo specifickou aktivitou erytropoietinu a počtem zbytků sialové kyseliny na molekulu erytropoietinu od izoformy 5 do 11 (každá izoforma je zde označena počtem sialových kyselina na molekulu erytropoietinu). Izoformy 11 až 14 mají přibližně stejnou in vivo specifickou aktivitu. Izoformy 5-14 byly studovány pokud jde o jejich in vivo aktivitu exhypoxickou polycytemickou biozkouškou na myších a množství každé přítomné izoformy je stanoveno Bradfordovou proteinovou zkouškou, absorbance při 280 nm nebo radioimunozkouškou (RIA) erytropoietinu. RIA stanovení (Egrie a spol. Immunobiology 172, 213 (1986)) vyjádřená jako jednotky /ml jsou rozdělena mezi 212 a 770 jednotkami/mg erytropoietinového polypeptidu, průměrná specifická aktivita čištěného erytropoietinu stanovené pomocí RIA udávají proteinové koncentrace izolovaných izoforem nebo směsí izoforem, vyjádřených jako mg erytropoietinového polypeptidu/mg. Jak je uvedeno v příkladech, relativní in vivo aktivita se postupně zvyšuje od izoformy 5 do izoformy 11 (viz tabulka 2).

In vivo specifické aktivity, které jsou zde uváděny, jsou měření relativních in vivo specifických aktivit a nejedná se o absolutní in vivo specifické aktivity. Pro účely této přihlášky jsou specifické aktivity použity pouze pro srovnání relativních aktivit izoforem, studiem za stejných podmínek ve stejných pokusech, zahrnujících stejné vnitřní standardy, stejný typ zvířat, mající stejné analytické údaje použité pro výpočet specifické aktivity, stejnou zkoušku pro stanovení obsahu proteinu. Není předpokládáno, že jakákoliv hodnota in vivo specifické aktivity uvedená pro jakoukoliv izoformu představuje základní nebo absolutní hodnotu pro tuto izoformu.

Předložený vynález poskytuje erytropoietinové izoformy. Specifické izoformy erytropoietinu, získané v souladu s předloženým vynálezem a jejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu. Například izoformy z moče získaného lidského erytropoietinu jsou odlišné od izoformy rekombinantního erytropoietinu. Ve výhodném provedení se vynález týká erytropoietinové izoformy mající specifický počet (např. pevný počet vyšší než O) sialových kyselin na molekulu erytropoietinu, uvedený počet je zvolen ze skupiny zahrnující 1 až 14. Výhodný je počet 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. V dalším provedení je počet vyšší než 14, výhodně 16 až 23.

Tento vynález také poskytuje přípravky, obsahující dvě nebo více erytropoietinových izoforem. V jednom provedení kompozice zahrnují směs izoforem, majících více než predeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu erytropoietinu, např. vyšší než 11 sialových kyselin na molekulu erytropoietinu nebo vyšší než 12 sialových kyselin na molekulu, např. směs izoforem 12, 13 a 14. V dalším provedení kompozice obsahují směsi izoforem, mající predeterminovaný počet sialových kyselin na erytropoietinovou molekulu, např. méně než 12, ale více než 8 sialových kyselin na molekulu, jako je např. směs izoforem 9, 10 a 11. Vynález také poskytuje přípravky obsahující erytropoietinové izoformy, kde jsou relativní množství izoforem stejná nebo

-5CZ 291515 B6 rozdílná. Například směsi izoforem 9. 10 a 11 by mohly mít izoformy v různých poměrech jako je 1:1:1,2:3:1 nebo 20:20:1.

Výhodně přípravky obsahují směsi méně než čtyř izoforem, například směs izoforem 11, 12 a 13, nebo směs 12 a 14, nebo směs 7 a 13.

Pro přípravu směsí erytropoietinových izoforem vynález také poskytuje způsoby současné izolace vybraných erytropoietinových izoforem. Tyto postupy zahrnují izolaci individuálních izoforem takovými technikami, jako je izoelektrická fokusace nebo příprava směsí izoforem, majících predeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu (například vyšší než 11) takovými technikami, jako je iontovýměnná chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na separaci proteinů podle náboje.

Obecně, iontovýměnná chromatografie a chromatofokusace zahrnují aplikaci buď surového lidského erytropoietinu (buněčné kondiciované médium) nebo čištěného materiálu na sloupec pryskyřice za podmínek, kdy dochází k vázání některých nebo všech erytropoietinových izoforem na pryskyřici. U surových erytropoietinových přípravků je výhodné aplikovat protein na sloupec při asi pH 7, zatímco pro čištěné přípravky může být protein aplikován na kolonu při pH 7 až asi pH 4. Po promytí sloupce pufrem při asi pH 4 se ty erytropoietinové izoformy, které zůstaly vázány na sloupci ionexu, eluují při zvyšujícím se pH a koncentraci soli pufru nebo aplikací gradientu snižujícího se pH a zvyšující se iontové síly při pH asi 4. Při chromatofokusaci jsou izoformy eluovány ze sloupce gradientem snižujícího se pH nebo promýváním sloupce vysokou koncentrací soli.

Jedno provedení vynálezu se týká savčích (např. z ovaria čínského křečka, CHO) hostitelských buněk, které přednostně syntetizují erytropoietinové izoformy, mající více než specifický počet, např. více než 10 sialových kyselin na molekulu. Erytropoietinové molekuly mají N-vázané nebo O-vázané oligosacharidové struktur}', které mohou limitovat obsah sialové kyseliny v molekule. Například, tetraantennární (čtyř-rozvětvené) N-vázané oligosacharidy nejobvykleji poskytují čtyři možná místa pro připojení sialové kyseliny, zatímco bi- a triantennámí oligosacharidové řetězce, které mohou nahradit tetraantennární formu na asparaginových připojovacích místech, mohou obvykle připojovat nejvýše dvě nebo tři sialové kyseliny. Ο-Vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení sialové kyseliny. Erytropoietinové molekuly tak mohou akomodovat celkem 14 zbytků sialové kyseliny stím, že všechny tři N-vázané oligosacharidy jsou tetraantennární. Kultury savčích buněk jsou prohledávány na ty buňky, které mají přednostně připojeny tetraantennární řetězce k rekombinantnímu erytropoietinu, a tedy maximalizovaný počet míst pro připojení sialové kyseliny.

Navázané oligosacharidy erytropoietinu z moče obsahují sialovou kyselinu na obou spojích a 2,3 a a 2,6 ke galaktóze (Takeuchi a spol., J. Biol. Chem. 263, 3657 (1988)). Typicky je sialová kyselina v a 2,3 spojení připojena ke galaktóze a 1,6 rozvětvením mannózy a sialová kyselina v a 2,6 spojení je připojena ke galaktóze a 1,3 rozvětvením mannózy. Enzymy, které připojují tyto sialové kyseliny (β-galaktosin a 2,3 sialyltransferáza a β-galaktosid a 2,6-sialyltransferáza) jsou nejúčinnější při připojování sialové kyseliny k mannóze a 1,6 a mannóze a 1,3 větvení.

Dihydrofolát reduktázu (DHFR) postrádající buňky ovaria čínského křečka (CHO) se obvykle používají jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních glykoproteinů včetně rekombinantního eiytropoietinu. Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a 2,6-sialyltransferázu, a proto nepřidávají sialovou kyselinu k a 2,6 spojení N-vázaného oligosacharidu glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách. (Mutsaers a spol. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi a spol. J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). Následkem toho rekombinantní erytropoietid produkovaný CHO buňkami postrádá sialovou kyselinu na spojeních 2,6 ke galaktóze (Sasaki a spol., (1987), supra; Takeuchi a spol., (1987), supra). V dalším provedení vynálezu je erytropoietin, použitý pro produkci izoforem, připravován v CHO buňkách, které jsou

-6CZ 291515 B6 transfektovány funkčním β-galaktosid a 2,6-sialyltransferázovým genem pro získání inkorporace sialové kyseliny do a 2,6 vazby ke galaktóze. Víz Lee a spol. J. Biol. Chem. 264,

13848 (1989), práce je zde uvedena jako odkaz pro popis technik pro získání modifikovaných

CHO buněk nebo jiných savčích hostitelských buněk.

Do \ynálezu jsou rovněž zahrnuty některé analogy lidského erytropoietinu. Použitý výraz „analog lidského erytropoietinu“ představuje erytropoietin sjedním nebo více náboji v aminokyselinové sekvenci lidského erytropoietinu, což vede ke zvýšení počtu míst pro připojení sialové kyseliny. Analogy jsou poskytovány místně řízenou mutagenezí, zahrnující adice, delece nebo substituce aminokyselinových zbytků, což přeměňuje místa tak, že jsou dostupná pro glykosylaci. Takové analogy mají větší počet karbohydrátových řetězců než lidský erytropoietin.

Jejich analogy mající zvýšenou biologickou aktivitu jsou kontruovány zvyšováním obsahu sialové kyseliny v molekule erytropoietinu. Analogy, mající obsah sialové kyseliny vyšší než bylo nalezeno u lidského erytropoietinu, jsou připravovány přidávání glykosylačních míst, která nebudou poškozovat sekundární nebo terciární konformaci, potřebnou pro biologickou aktivitu. Výhodně analog lidského erytropoietinu má 1,2 nebo 3 přídavná místa pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci. Například leucin v poloze 69 je nahrazen asparaginem za vzniku sekvence AsnLeu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvykle poskytnout až čtyři další sialové kyseliny na molekulu. Příklady dalších změn, které generují další N- nebo O-glykosylační míst,a jsou alaniny v polohách 125 a 127 na asparagin a serin, alanin v poloze 125 na threonin a alaniny v polohách 124 a 125 na prolin a threonin. Pro odborníky bude zřejmé, že předložený vynález zahrnuje mnohé další analogy lidského erytropoietinu, mající další místa pro glykosylaci.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky, obsahující terapeuticky účinné množství specifické izoformy nebo směs izoforem společně se vhodným ředidlem, přísadou a/nebo nosičem, vhodným při erytropoietinové terapii. Výraz „terapeuticky účinné množství“, který je zde použit, zahrnuje množství, které vyvolává terapeutické účinek při daných podmínkách a režimu podání. Podání erytropoietinových izoforem se výhodně provádí parenterálním způsobem. Specifický způsob bude záviset na podmínkách, které jsou ošetřovány. Podání erytropoietinových izoforem je výhodně provedeno v části přípravku, který obsahuje vhodný nosič, jako je lidský sérový albumin, vhodné ředidlo, jako je pufrovaný salinický roztok a/nebo vhodná přísada. Potřebná dávka bude taková, že její množství dostačuje ke zvýšení hematokritu pacientů a bude záviset na obtížnosti podmínek, které mají být ošetřovány, způsoby podání a podobně.

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu, ale nikterak jej neomezují. Erytropoietinový standard použitý v in vivo biostudiích v příkladech je rekombinantní erytropoietinový standard, který yl standardizován vůči částečně čištěnému erytropoietinovému standardu z moče. Takto jsou měřeny pouze relativní in vivo specifické aktivity. In vivo specifické aktivity jsou vyjádřeny v Jednotkách/ml“, ,jednotkách/mg“ a jednotkách/A_28O“ a nějako „IU/ml“, „IU/mg“ a IU/A₂₈o“, protože použitý erytropoietinový standard není přímo korelován k mezinárodnímu existujícímu standardu.

Příklady provedení

Příklad 1

Izolace izoforem rekombinantního erytropoietinu

-7CZ 291515 B6

Rekombinantní erytropoietin je produkován jak je popsáno Línem, supra. Rekombinantní erytropoietin, použitý jako výchozí materiál pro izolaci první a třetí izoformy, je čištěn podle postupu popsaného v příkladu 2 práce Laie a spol., supra. Výchozí materiál pro izolaci druhé a páté izoformy je čištěn podle Laie a spol, supra za použití modifikace Q-Sepharosové chromatografie. Tyto přípravky obsahují směs izoforem rekombinantního erytropoietinu, majících stejné aminokyselinové sekvence, jako lidský erytropoietin získaný z lidské moče a obsahují převážně izoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro přípravu čtvrté izoformy je materiál, který je eluován během 5 mM kyselina octová/1 mM glycin/6M močovinového promývání aniontovýměnné kolony v příkladu 2 práce Laie a spol. Tato frakce obsahuje izoformy s méně než nebo obsahují 9 sialových kyselin a byla dále čištěna gelovou filtrační chromatografii jak je popsáno v příkladu 2 práce Laie a spol. před použitím v preparativním izoelektrickém fokusačním postupu. Příprava šesté izoformy používá jako výchozí materiál čištěný přípravek rekombinantního erytropoietinu mající od 4 do 13 sialových zbytků. Tento materiál byl čištěn jak je popsáno v příkladu 2 Laie a spol. s výjimkou pro modifikaci iontovýměnné kolony (eluce rekombinantního erytropoietinu gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypuštění promývání kyselinou octovou/močovinou), která vede k retenci nejvíce izoforem, přítomných ve výchozím materiálu.

Šest různých přípravků individuálních izoforem bylo zpracováno preparativní izoelektrickou fokusací na granulovaném gelu (Ultradex, LKB) v podstatě jako LKB Application Notě 198. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyty (Pharmacia) jsou používány a gelové lože obsahuje 5 M močoviny.

V první přípravě se na gel aplikuje přibližně 20 mg rekombinantního erytropoietinu v 6,8 ml 20 mM citrátu sodného/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 a zpracovává fokusací při 8 W po přibližně 16 hodin. Po izoelektrické fokusací se proužky izoforem v gelu vizualizují přitisknutím papíru ke gelovému loži. Vyrobí se otisk a pak se fixuje namočením ve třech provedeních (přibližně 10 minut, teplota místnosti) do fixačního roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% sulfosalicylová kyselina), podrobí další změně (asi 10 minut) - 40% methanol/10% kyselina octová (30 až 60 °C), barví se 15 minut při 60 °C v 0,125% Coomasiie Blue R-250/40% methanol/10% kyselina octová a pak se odbarví v 7,5% methanolu/10% kyselině octové pro vizualizaci oddělených izoforem. Oblast granulovaného gelového lože, obsahující izoformy (~ 50 % pryskyřice) se odebere, přidá se voda (v 16 ml) a kaše se nalije na misku 14 x 62 cm a odpaří na asi 40 g čisté hmotnosti. Tento přípravek se zpracuje fokusací podruhé a otisk gelového lože se připraví jak bylo výše uvedeno. Část gelu, obsahující každou ze šesti rozlišitelných izoforem, se odebere z gelového lože.

Za účelem eluce izoforem z gelu se přidá ke každé izoformě roztok, obsahující 10 mM Tris-HCI, pH 7,0/5 mM Chaps pro přípravu kaše. Kaše se umístí do malých kolon a promyjí Tris-Chaps pufrem. Výtok kolonou byl odebrán a aplikován odděleně na malé kolony (otevřené uspořádání kolony) obsahující Vydac C4 pryskyřici s reverzní fází ekvilibrovanou ve 20% ethylenu/10 mM Tris-HCI, pH 7,0. Kolony se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/10 mM Tris-HCI, pH 7,0, 35% ethanolem/10 mM Tris-HCI, pH 7,0 a 65% ethanolem/10 mM tris-HCI, pH 7,0. Frakce eluované 65% ethanolem/10 mM Tris se zředí 1:110 mM Tris-HCI, pH 7,0 a zahustí a pak se pufr nahradí 10 mM Tris-HCI, pH 7,0 za použití Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátoru. Analytická izoelektrická fokusace tohoto přípravku se provede v podstatě jak je popsáno v LKB technická poznámka 250 za použití Servalyte 3-5 amfolinů (Serva) v polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 5 M močoviny.

Ve druhé přípravě se na gel aplikuje asi 26 mg rekombinantního erytropoietinu v 6,5 ml deionizované vody a fokusuje se při 2,5 W po 35 minut a 10 W asi 17 hodin. Proužky fokusovaného proteinu, které jsou viditelné v gelovém loži, se odeberou jako 11 různých skupin. Každá skupina se převede do asi 7,5 ml deionizované vody a 20 ml každého z výsledných supematantů z těchto skupin se podrobí analytické izoelektrické fokusací, jak je popsáno výše. Ke každé ze skupin se přidá 5 ml 1,5 M Tris-HCI, pH 8,8 a kaše se umístí každá do malé kolony

-8CZ 291515 B6 a ponechá se vytéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně třemi objemy 0,5 M Tris-HCl. pH 7 a promývací roztok se spojí sproteklou kapalinou. Eluované roztoky se zahustí a pufr se vymění za 20 mM citrátu sodného/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 za použití Amicon ultrafilračního zařízení, majícího vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000. Koncentrované roztoky (asi 0,5 ml) pak procházejí 0,22 mikrometrovým filtrem z acetátu celulózy. Vzhledem k analytické izoelektrické fokusaci bylo nalezeno pět skupin, obsahujících převážně jednotlivé izoformy 10, 11,12, 13 a 14.

Ve třetí přípravě se na gel aplikuje asi 30 mg rekombinantního erytropoietinu ve 21,8 ml destilované vody a fokusuje se při 2 W po 25 minut, při 10 W po 20 hodin a 15 W 15 minut. Proužky proteinu, odpovídající individuálním izoformám, jsou pozorovány vizuálně a odebrány z gelového lože. K izoformám izolovaným z gelu se přidá destilovaná voda, připraví se kaše a vzniklé supematanty se analyzují analytickou izoelektrickou fokusaci. Ke každé kaši se přidá stejný objem 1 M Tris-HCl, pH 7,2, suspenze se umístí do oddělených malých kolon a kapalná fáze se nechá vytéci z kolony pro eluci idoforem. Každý výtok se zahustí a pufr se vymění za 20 mM sodný citrát/lOOmM chlorid sodný, pH 7,0, za použití Amicon zařízení pro ultrafiltraci s vylučovací mezi molekulové hmotnosti 10 000. Analytický izoelektrofokusační gel izoformuje o tom, že byly získány skupiny, obsahující zejména jednotlivé izoformy 9, 10,11, 12, 13 a 14.

Čtvrtá příprava izoformy používá jako výchozí materiál erytropoietin, obsahující izoformy 3-9 (připravené výše). Před preparativní izoelektrickou fokusaci provedenou v podstatě jak bylo popsáno výše pro přípravu 1 až 3, byly amfolyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionovány v Rotofor (BioRad, Richmond, CA) buňce pro izoelektrickou fokusaci s kapalnou fází, pro získání amfolytů vhodnějších pro nižší izoelektrické body výchozího materiálu. Prefrakcionace se provádí smísením 6,7 ml Pharmalytu 2,5-5 s 15 g močoviny a přidáním vody na objem 50 ml. Směs se frakcionuje v Rotoforu při 10 W 1 °C po 5 1/2 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné a 0,1 M hydroxidu sodného jako anolytu a katolytu. Amfolytové frakce, mající zjištěné pH mezi 4,5 a asi 6 byly použity pro izoelektrickou fokusaci plochého lože.

Amfolyty byly získány z izoforem za použití Centrieluteru (Amicon, Danvers, MA) a 10000 MW Centriconu (Amicon) za použití následujících parametrů: 0,18 Tris pufr 8,8, 100 Volt, 25-30 mA, po 3 hodiny. Izoformy byly pak pufrem převedeny do 0,1 M chloridu sodného gelovou filtrací za použití Sephadexu G-25 (Pharmacia). Analytická izoelektrická fokusace pěti výsledných poolů prokázala, že obsahují izoformy 4, 5, 6, 7 a 8. Izoforma 4 vykazuje několik proužků což indikuje, že prošla určitou degradací.

Příprava páté izoformy byla modifikována přídavkem prefokusačního stupně k postupu izoelektrické fokusace na plochém loži. V této modifikaci nebyl přidán protein ke směsi amfolyt/močovina/gel před elektroforézou, ale byl přidán do izoelektrického fokusačního zařízení s následujícím vývojem gradientu pH v gelovém loži. Pro prefokusaci po 75 minut (1500 volt/h) byly sekce gelového lože ve vzdálenosti 2,25 - 4,25 cm od katody odebrány, smíseny s roztokem erytropoietinu a přidány zpět ke gelovému loži. Po izoelektrické fokusaci byly izoformy 10, 11, 12, 13 a 14 eluovány z gelového lože a odděleny od amfolytů ultrafiltraci za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).

Prefokusační modifikace byly uskutečněny proto, aby charakteristiky ultrafialové absorbance přípravků, obsahujících izoformy, byly podobnější těmto charakteristikám výchozího rekombinantního erytropoietinu. Zlepšení ve spektrálních charakteristikách může být zřejmé z poměru absorbance při 280 a 260 nm u izolovaných izoforem. Průměrný poměru absorbance při 280 nm k absorbanci při 260 nm (A280/A260) pro izoformy z přípravků 2 a 3 (neprefokusované) je 1,36 ± 0,11, zatímco průměrný poměr A280/A260 pro přípravky 5 a 6 (prefokusované je l,68±0,20. Jestliže je izoforma č. 14 vyloučena z propočtů, průměrné A280/A260 poměry jsou 1,39 ± 0,11 a 1,74 ± 0,09 pro přípravky 2 a 3 a 5 a 6. (Izoforma 14 může mít nejatypičtější spektrum, protože je přítomna v nejmenších množstvích a je tak více náchylná k interferencím stopovou kontaminací amfolytovými komponentami, nebo protože je nejbližší

-9CZ 291515 B6 elektrodě během provádění izoelektrické fokusace na plochém loži.). Průměrný A280/A260 poměr pro rekombinantní erytropoietin připraveny podle příkladu 2 Laie a spol. (modifikovaný jak bylo popsáno použitím Q-Sepharosy jako aniontovýměnné pry skyřice) je 1,91 ± 0,04.

Jak je popsáno výše, výchozí materiál pro přípravu izoformy č. 6 byl rekombinantní erytropoietinový přípravek obsahující izoformy 4-13. Amfolyty byly pre-fokusovány v zařízení Rotofor jako ve čtvrté přípravě. Pro izoelektrickou fokusaci na plochém loži byly použity amfolytové frakce, mající pH mezi 3,7 a 4,8. Ploché lože bylo prefokusováno postupem jako v přípravě č. 5 a izoformy 9, 10, 11, 12 a 13 byly získány po ultrafiltraci (Centricon-10) pro odstranění amfolytů.

Příklad 2

Obsah sialové kyseliny v izoformách rekombinantního erytropoietinu

Izoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 a erytropoietin čištěný postupy popsanými Laiem a spol., spra (směs izoforem 9 až 14) jsou pufrem převedeny do 0,10 - 0,15 M chloridu sodného a analyzovány na obsah sialové kyseliny modifikací postupu podle Jourdiana a spol, J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky sialové kyseliny jsou odštěpeny od glykoproteinů hydrolýzou 0,35 M kyselinou sírovou při 80 °C po 30 minut a roztoky jsou neutralizovány hydroxidem sodným před analýzou. Za účelem vyhodnocení množství přítomného erytropoietinového proteinu se provede stanovení proteinu podle Bradforda (Bradford Anal. Biochem 72, 248 (1976)) za použití rekombinantního erytropoietinu, majícího aminokyselinovou sekvenci lidského erytropoietinu jako standard za použití zkušebních reagencií a mikrozpůsobu podle BioRad. Výsledky, vyjádřené jako moly sialové kyseliny na mol erytropoietinu, jsou uvedeny v tabulce 1. Izoformy jsou značeny podle počtu sialových kyselin na molekulu a rozsahu od málo kyselých (izoforem 9) do nejkyselejších (izoforma 13). Izoformy 9—13 jsou uvedeny v gelových drahách 6-10 obr. 1. Množství izoformy 14 jsou nedostatečná k přesnému měření obsahu sialové kyseliny. Obsah sialové kyseliny v této izoformě je odhadnut z její migrace na IEF gelech vzhledem k dalším izoformám. Obsah sialové kyseliny izoforem 5-8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, aleje pravděpodobně odhadnut z jejich migrací na IEF gelech.

Tabulka 1

Izoforma erytropoietinu	mol sialové kysel iny/mol erytropoietinu
izoforma 13	12,9 ±0,5
izoforma 12	11,8 ±0,2
izoforma 11	11,0 ±0,2
izoforma 10	9,8 ± 0,3
izoforma 9	8,8 ± 0,6
směs izoforem (9-14)	11,3 ±0,2

Příklad 3

Aktivita izoforem rekombinantního erytropoietinu

Izoforma izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 byly hodnoceny podle absorbance při 280 nm, Bradfordovou proteinovou zkouškou a pomocí RIA pro erytropoietin pro stanovení množství přítomného rekombinantního erytropoietinu. Exhypoxická polycytemická biostudie na myších (Cotes a spol., Nátuře 1991, 1065 (1961) se použije pro stanovení in vivo biologické aktivity. Kvantifikace množství erytropoietinového proteinu přítomného podle radioimunozkoušky pro

-10CZ 291515 B6 erytropoietin poskytuje výsledky mající vyšší relativní in vivo specifickou aktivitu pro některé izoformy, protože zjevně snížená imunoreaktivita izoforem, obsahujících velké množství sialové kyseliny vede k podhodnocení koncentrace erytropoietinu a tak k nadhodnocení in vivo specifické aktivity pro nejvíce negativních izoforem. Stanovení z biostudie na myších, vyjádřená 5 jako jednotky/ml, jsou dělena koncentracemi odpovídajících proteinů pro získání in vivo specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erytropoietinového polypeptidu. Tyto specifické aktivity jsou uvedeny v tabulce 2.

V tabulce 2, je ,,n“ počet nezávislých přípravků izoforem, které spolupůsobí hodnotu specifické io aktivity. V nejvíce případech byly provedeny in vivo studie pro každý přípravek izoformy.

Některé in vivo údaje pomáhají při výpočtech specifické aktivity ve všech třech sloupcích. Jednotky/mg erytropoietinového póly peptidu byly stanoveny z absorbance při 280 nm, z hodnot radioimunozkoušky nebo z výsledků Bradfordovy proteinové zkoušky. Čištěný rekombinantní erytropoietin, obsahujících izoformy 9-14, byl použit jako standard vBradfordově proteinové 15 zkoušce, „n“ může být menší pro výpočty provedené za použití Bradfordovy proteinové zkoušky, protože některé přípravky nebyly v době provádění Bradfordovy zkoušky dostupné.

Eiytropoietin čištěný podle postupů popsaných Laiem a spol., supra a obsahující směs izoforem 9 až 14 byl použit jako standard ve zkouškách RIA a in vivo.

Relativní specifické aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erytropoietinového polypeptidu mohou být převedeny na jednotky/A₂₈₀ násobením 0,807 mg erytropoietinového polypeptidu/A₂₈₀. Přepočítávám' faktor je získán násobením extinkčního koeficientu erytropoietinu (1,345 mg/A₂₈o) obsahem proteinu v erytropoietinu (1,345 mg/A₂₈o) obsahem proteinu v erytropoietinovém 25 glykoproteinů (asi 60% hmotnostních, Davis a spol., Biochemistry 26, 2633 (1987)) pro vyjádření mg erytropoietinového pólypeptidu/A₂₈o (tj. 1,345 mg erytropoietinu/A₂₈o x 0,60 mg polypeptidu/mg erytropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A₂₈o). Dále specifické aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erytropoietinového polypeptidu mohou být násobeny faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erytropoietinového glykoproteinů pro získání specifických aktivit vyjádřených 30 jako jednotky/mg erytropoietinového glykoproteinů.

Tabulka 2

Izoforma	U/mg polypeptidu (Bradfordova proteinová zkouška)	n	U/mg polypeptidu (z A280)	n	U/mg polypeptidu (z RIA)	n
14	289,400 ±3,100	2	205,800 ± 37,700	2	366,700 ± 55,900	2
13	307,600 + 30,600	4	258,700 ± 59,500	5	337,200 ± 40,200	5
12	275,200 ± 55,600	4	258,400 ±41,700	5	287,700 ± 42,600	5
11	282,700 ±41,100	3	255,800 ± 67,300	4	251,400 ±62,700	4
10	188,000 ± 1,900	1	170,300 ±34,500	3	171,900 ±31,600	3
9			96,600 ± 46,700	2	113,600 ±39,600	2
8	65,200 ± 3,800	1	70,600 ±4,100	1	61,000 ±3,500	1
7	46,200 ± 5,800	1	50,300 ± 6,300	1	42,800 ± 5,400	1
5	16,600 ± 1,700	1	18,300 ± 1,900	1	15,500 ± 1,600	1

Údaje z tabulky 2 jsou také znázorněny na obr. 2A, 2B a 2C. Tyto údaje ukazují, že relativní in vivo aktivita erytropoietinu se zvyšuje jako funkce obsahu sialové kyseliny až do izoformy č. 11. Izoformy č. 11-14 mají v podstatě stejnou relativní in vivo bioaktivitu. (Toto je nejzjevnější, jestliže je koncentrace izoformy 14 vyjádřena použitím hodnoty z Bradfordovy zkoušky. 40 Bradfordova hodnota může být pro izoformu 14 přesnější, protože jsou obecně získány nižší hodnoty a to vede k obtížím při stanovení pomocí A₂₈₀ a nejzřejmějšímu snížení reaktivity v RIA pro velmi negativní formy, jak bylo uvedeno dříve). Vyšší in vivo specifická aktivita

-11CZ 291515 B6 erytropoietinových izoforem, majících více sialových kyselin, je nej pravděpodobněji způsobena delším průběhem poločasu životnosti těchto forem. Izoformy 9 a 13 jsou značeny radioaktivním jodem (^l_3I) a byla stanovena rychlost jejich štěpení u krys. Poločas životnosti v oběhu byl výrazně delší pro izoformu 13 než pro izoformu 9.

Příklad 4

Dělení směsí izoforem rekombinantního erytropoietinu chromatografií na Q-Sepharose

Buněčná kondiciovaná média z produkce rekombinantního erytropoietinu podle postupů popsaných Linem, supra, se koncentrují a diafiltrují proti 10 mM Tris, pH 7,2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovou mikroproteinovou zkouškou za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. 19,6 ml roztoku, obsahujícího 40 mg celkového proteinu, se připraví ve 20 μΜ CuSO₄, filtruje přes 0,45 mikrometrový filtr a vloží na 4ml kolonu (1,05 cm výška x 2,2 cm průměr) plněnou náplní Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia), která byla ekvilibrována 10 mM Tris, pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po aplikaci vzorku se kolona promyje dvěma objemy kolony pufru. Průtok kolonou je asi 1 ml/min. Pro dělení směsí izoforem erytropoietinu se použije šest oddělených kolon.

Kolony se promyjí 6 až 9 objemy pufru o nízké pH: kolona č. 1, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 2, 200 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20μΜ CuSO₄, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 3, 250 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 4, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 pomocí NaOH, kolona č. 5, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina, kolona č. 6, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina. pH kolon se zvyšuje na asi pH 7 promýváním každé kolony 8 až 11 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 μΜ CuSO₄, pH 7. Definované erytropoietinové izoformové směsi jsou z kolon eluovány promýváním 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuSO₄. pH 7,0.

Eluované izoformové pooly z každé kolony se zahustí a rozpouštědlo se vymění vodou za použití Amico Centricon-10 mikrokoncentrátoru. Výsledky analytické izoelektrické fokusace těchto koncentrovaných poolů jsou uvedeny na obr. 3. Gelové dráhy 1-6 představují definované směsi erytropoietinových izoforem eluovaných z kolon 1-6. „Izoformová směs“ uvedená v poslední pravé dráze gelu na obr. 3 představuje buněčné médium, které je aplikováno na kolonu QSepharosy jak je popsáno výše, kolona se promyje 5 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ CuSO₄, 6M močoviny a směs izoforem erytropoietinu se eluuje z kolony za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs izoforem se dále čistí podle postupů popsaných v práci Laie a spol., supra, před analytickou izoelektrickou fokusací.

Příklad 5

Frakcionace izoforem rekombinantního erytropoietinu za použití nízkého pH gradientu na QSepharose

V dalším postupu jsou izoformy erytropoietinu separovány za použití gradientu se snižováním pH a zvyšováním iontové síly. Koncentrované diafiltrované, erytropoietin obsahující médium se vnese na kolonu Q-Sepharosy v poměru asi 40 mg celkového proteinu/ml gelu. Kolona se pak promyje asi dvěma objemy kolony 10 mM Tris HC1, pH 7,0 a pak asi 10 objemy kolony 2 mM kyseliny octové/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO₄/6 M močoviny (pH přibližně 4,8) pro odstranění kontaminujících proteinů a erytropoietinových izoforem, obsahujících méně než asi 7 zbytků

-12CZ 291515 B6 sialové kyseliny. Izoformy, obsahující od přibližně 8 do přibližně 12 sialových kyselin jsou z kolony eluovány za použití gradientu od počátku 2 mM kyseliny octové v 6 M močoviny/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO₄ a do až 40 mM kyseliny octové/6 M močoviny/ 1 mM glycinu/20 μΜ CuSo₄ (pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 40 objemů kolony a frakce přibližně jednoho objemu kolony se odebírají do nádob, obsahujících objem Tris pufru dostačující k uvedení pH do rozmezí 6 - 8,5 proto, aby se zabránilo dlouhodobému vystavení odebraných frakcí nízkému pH. Podíly frakcí se podrobí analytické izoelektrické fokusaci pro sledování separace. Obr. 4 ukazuje separaci izoforem 8-11, které může být dosaženo tímto postupem. Izoformy 12-14, které zůstávají vázány na koloně při konci gradientu, jsou eluovány promýváním pufrem, obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuSO₄ (pH 7,0). Izoformy (separované působením gradientu nebo eluované roztoky chloridu sodného) jsou prosté kontaminujících proteinů při chromatografií na reverzní fázi, následované filtrační gelovou chromatografií, jak je popsáno v příkladu 2 v práci Laie a spol..

Příklad 6

Analogy lidského erytropoietinu, mající další glykosylační místa

A. Konstrukce analogů lidského erytropoietinu

Umístění existujících a navržených míst pro připojení karbohydrátu v erytropoietinové aminokyselinové sekvenci jsou uvedena na obr. 5 a postup přípravy těchto dalších glykosylačních míst je shrnut na obrázcích 6A-C a je popsán dále.

Za použití in vitro mutagenze byly sy ntetizovány následující oligonukleotidové primery: /Asn⁴, Ser⁶/EPO: 5'CGCCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3' /Asn⁹, Ser¹'/EPO: 5'ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' /Asn⁶⁹/EPO: 5'GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3' /Asn¹²⁴/EPO: 5'TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3' /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/ EPO: 5'CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3' /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/EPO: 5'AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTTG 3' /Thr¹²⁵/EPO: 5'TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3' /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO: 5'CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3'

Podtržené kodony představují oblasti chybného párování, kde aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují divoký typ aminokyselin.

/Asn⁴, Ser⁶/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa u Asn 4. /Asn⁹, Ser¹'/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa kAsn 9. /Asn⁶⁹/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69. /Asn¹²⁵, Ser'²⁷/EPO byl konstruován přidáním Nglykosylačního místa kAsn 125. /Thr'²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO byly konstruovány přidáním O-glykosylačního místa u Thr 125.

Následující oligonukleotidové primery jsou syntetizovány za použití in vitro mutageneze:

/Asn⁶⁹, Thr⁷'/EPO: 5’GGGCCTGGCAAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷'/EPO: 5'CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Asn¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO: 5'CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' /Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹/ EPO: 5'ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO: 5'CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3' /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO: 5'CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3' /Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/EPO: 5'CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3' /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹/EPO:

-13CZ 291515 B6

Oligonukleotidový primer 5'AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' je použit pro přípravu /Pro¹²⁴. Thr¹²’. Thr¹²⁶/EPO za použití /Pro¹²⁴, Thr¹²7EPO cDNA jako výchozí látky. Oligonukleotidový primer 5'TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' je pak použit pro přípravu /Pro¹²⁴, Thr^:°, Thr¹²⁶, Thr¹³¹/EPO.

/Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO a /Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69 a zvýšením N-glykosylace na tomto místě. /Asn^{1 5}, Thr¹²⁷/EPO, /Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹/EPO, /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser ⁷/EPO a /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO jsou konstruovány přidáním 10 N-glykosylačního místa a Asn 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě. /Thr¹²’, Thr¹²⁶/EPO a /Pro¹’⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹/EPO jsou konstruovány přidáním O-glykosylačního místa ke Thr 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě.

Zdrojem erytropoietinové DNA pro in vitro mutagenezi byl plazmid Hul3, klon cDNA lidského 15 erytropoietinu v pUC 8 (Law a spol. Proč Nati. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plazmidová DNA odvozená od Hul3 byla štěpena BstEII a Bglll restrikčními enzymy, výsledné fragmenty DNA byly podrobeny elektroforéze na agarózovém gelu a z gelu byl izolován 810 bp fragment erytropoietinové DNA za použití GeneClean™ kitu a postupy doporučenými výrobcem (BIO 101, lne.). Plazmid pBRgHuEPO obsahuje erytropoietinový genomový gen jako BamHI 20 fragment inzertovaný do derivátu pBR322, jak je popsáno ve zveřejněném patentu Lina, Supra.

pBRgHuEPO byl také štěpen pomocí BstEII a Bglll a byl získán vektorový fragment 6517 bp. Ligace těchto dvou fragmentů vede klGTl. Pro konstrukci pEC-1, byl pDSVL (popsaný ve zveřejněném patentu Lina, supra) štěpen BamHI a kněmu byl ligován izolovaný BamHI fragment velikosti 2,8 kilobází (kb) z IGT1, obsahující erytropoietinovou cDNA.

Za účelem přípravy jednořetězcové DNA pro mutagenezi in vitro byl pEC-1 štěpen BAMHI a Bglll a byl izolován fragmentem 820 bp erytropoietinové cDNA. Byl ligován k BamHI místu ml3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA byla získána ze supematantů E. coli kmen RZI032, infikovaného ml3-EC-l jak popsal Kunkel a spol. Methods in Enzymol. 154, 367 30 (1987) a Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983). Pro mutagenezi in vitro bylo smíseno přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše se 6 ml pufru (250 mM Tris pH 7,8, 50 mM mgCl₂ a 50 ml dithiothreitolu). Při připojení primeru ktemplátu byl objem reakční směsi upraven na 10 μΐ vodou, směs byla zahřívána na 65 °C po dobu 5 minut a pak nechána zchladnout na teplotu místnosti. Pro prodlužovací reakci bylo 35 přidáno 2,5 ml dTTP, dATP, dGTP a ATP (všechny s 10 μΜ), dále 1 μΐ (1 jednotka) E. coli DNA polymerázy (Klenowůw fragment) a 1 μΐ (1 jednotka) T4 DNA ligázy. Směs pak byla inkubována přes noc při 14 °C a použita pro transformování E. coli JM 109 (Yanisch-Perron a spol., Gene 33, 103 (1985)) jak je popsáno (Massing, supra).

Pro identifikaci mutantních klonů rozlišovací hybridizaci byly plaky na nutričním agaru přeneseny na Gene Screen filtry (New England Nuclear). Filtry byly sušeny pod tepelnou lampou a pak inkubovány po dobu jedné hodiny v 6x SSC, obsahujícím 1 % SDS při 60 °C. Pro hybridizaci byly oligonukleotidové primery uvedené výše (8 pmol) koncově označeny T4 polynukleotidovou kinázou a γ ³²P-označeným ATP a inkubovány s filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a 45 1 00 mg/ml DNA lososího sperma při 37 °C pro /Asn¹²⁴/mutaci, 55 °C pro /Asn⁴, Ser⁶/ mutaci, °C pro /Thr¹²⁵/ a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ mutace a 70 °C pro /Asn⁹, Ser¹¹/ a /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/ mutace. Příští den byly filtry třikrát promyty 6x SSC při teplotě místnosti a podrobeny autoradiografii. V případě nutnosti byly pak filtry promyty 6x SSC při zvýšených teplotách, dokud nebyla detekována malá nebo žádná hybridizace u plaků, majících erytropoietinovou cDNA sekvenci 50 divokého typu. Klony, které za těchto podmínek dávají pozitivní hybridizační signály, byly identifikovány a retransfektovány do JMI09 k izolování čistého klonu. Dideoxy řetězcová terminační sekvenční analýza dokládá, že jsou přítomny mutace u asparaginového, serinového, threoninového a prolinového zbytku.

-14CZ 291515 B6

Dvojřetězcové ml3 EC-1 DNA nesoucí /Asn⁴, Ser⁶/, /Asn⁹, Ser¹¹/, /Asn⁶⁹/, /Asn¹²⁴/, /Asn¹²⁵/, /Ser¹² /, /Asn¹⁶³, Ser¹⁶’/ /Thr¹²’/ a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ změny byly získány z JM109 transfektovaných buněk vaznou metodou (Holmes a spol., Anal. Biochem 117, 193 (1981)). DNA byly štěpeny pomocí BstEII a XhoII a byl izolovány 810 bp fragmenty erytropoietinové DNA. pEC-1 byly štěpeny BstEII s následujícím parciálním štěpením BglII a 5'konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosfatázou v 10 mM Tris, pH 8 při 60 °C po 60 minut. Byl izolován 7 kb vektorový fragment postrádající 810 bp BstEII—BglII a ligován k erytropoietinovým fragmentům uvedeným výše. Výsledné plazmidy (označené pEC-X, kde X znamená parciální mutaci) obsahující lidský’ erytropoietin se změněnými aminokyselinovými zbytky v označených pozicích.

erytropoietinových cDNA klonů byly transfektovány do COS-1 buněk (ATCC č. CRL-1650) elektrokorporací. COS-1 buňky byly z polotekutých disků odebrány, promyty médiem (modifikované Dulbecco základní médium, obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % Lglutaminu/penicilinu/ streptomycinu (Irvice Scientific)) a resuspendovány na 4 x 10⁶ buněk/ml. Jeden mililitr buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad) a elektroporuje Bio-Rad Gene Pulserem™ při 25 pF a 1600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosiče DNA a 2 až 20 pg plazmidové DNA kódující erytropoietinový analog. Elektroporované buňky se umístí v koncentraci 2 x 10⁶ buněk na 60 mm misku pro tkáňovou kulturu v 5 ml média. Po dvou až čtyřech hodinách po umístění se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Kondiciované médium se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporaci.

A. Zkouška aktivity erytropoietinového analogu

RIA byly provedeny podle Egrie a spol., supra. In vivo biologická aktivita erytropoietinových analogů byla stanovena exhypoxickou polycytemickou biostudií na myších (Cotes a spol., supra).

In vitro erytropoietinová aktivita byla stanovena zkouškou tvorby erytroidních kolonií jak je popsáno Iscovem a spol., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) s modifikacemi. Jednojademé buňky z buněk lidské kostní dřeně byly částečně čištěny na „ficol-pague“ vložce a promyty Iscovým médiem před umístěním na plotnu pro odstranění adherentních buněk. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulózy a neobsahuje jakýkoliv hovězí sérový albumin. Erytroidní kolonie byly spočteny po 8 až 10 dnech kultivace.

Erytropoietinové analogy transfektované a exprimované v COS buňkách jak je popsáno v sekci A, byly analyzovány v surových supematantech COS buněk pomocí RIA a zkouškou tvorby erytroidních kolonií. Lidská erytropoietinová sekvence má in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou stanovenou ve výše uvedeném pokusu. Analogy /Asn⁶⁹/EPO, /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO, /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO vykazují in vitro aktivitu srovnatelnou sRIA aktivitou a poskytují důkaz o dalších karbohydrátových řetězcích (jak je stanoveno v sekci C). Tyto analogy jsou dále analyzovány transfekcí cDNA klonem kódujícím erytropoietinový analog do CHO buněk, čištěním eiytropoietinového analogu a měřením in vivo biologické aktivity čištěného analogu.

C. Analýza Western Blot

Objem supernatantů, obsahující 5-20 jednotek z COS buněk transfektovaných cDNA erytropoietinových analogů, jak je popsáno v sekci A, byl imunoprecipitován přes noc při teplotě místnosti s králičí antierytropoietinovou polyklonální protilátkou. K imunoprecipitátu bylo přidáno 20 až 80 pl 1:1 proteinu A-Sepharosy v salinickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a ponecháno inkubovat jednu hodinu při teplotě místnosti. Vzorky byly odstředěny, promyty PBS a kde je to indikováno, byla peleta zpracována s N-glykanýzou pro odstranění N-vázaného karbohydrátového řetězce. Vzorky byly analyzovány elektroforézou na 150 SDS-polyakryl-15CZ 291515 B6 amidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a podrobeny Westernově analýze, jak je popsáno (Bumette a spol., Anal. Biochem 112, 195-203 (1981); Elliot a spol. Gene 79, 167-180 (1989)) za použití směsi myších antierytropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána Elliotem a spol. (1989) Blood 74, Suppl. 1, A. 1228.

Analýza supematantů COS buněk transfektovaných /Asn⁶⁹/EPO a /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO cDNA dokládá zvýšení erytropoietinu. Zvýšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího N-vázaného karbohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supematantů z COS buněk transfektovaných /Thr¹²7EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO cDNA s N-glykanázou dokládá zvětšenou velikost protienu ve srovnání se sekvencí lidského erytropoietinu. Tato zvětšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího O-vázaného karbohyrátového řetězce (obr. 8).

D. Izolace izofenorem erytropoietinových analogů

Erytropoietinový analog /Thr¹²⁵/EPO byl konstruován jak je popsáno v sekci A. 810 bp fragment erytropoietinové cDNA, nesoucí /Thr^12:7mutaci, byl izolován štěpením plazmidu pEC obsahujícího /Thr¹²⁵/ mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací fragmentu k pDECA, derivátu pDS α

2. pDS α 2 je obecně popsán v US patentové přihlášce č. 501 904, která je zde uvedena pro úplnost. pDEC Δ byl připraven s pDS α 2 následujícími kroky:

1) Hindlll místo pDS a2 bylo deletováno štěpením pDSa2 DNA pomocí Hindlll, zpracováním Hindlll kohezivních konců s E. coli DNA polymerázou (Klenow Fragment) a dNTP, a religací tupě zakončeného vektoru. Výsledný plazmid je pDS α 2 Δ H.

2) pDS α 2 Δ H byl štěpen pomocí Sáli a syntetický oligonukleotid mající SV40 „splice“ signál se Sáli linkerem připojeným ke 3' konci „splice“ signálu byl k němu ligován. Syntetický oligonukleotid měl následující sekvenci:

5'TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT _{CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA}AAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTATCTTCTAGGCCTGTACGG AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3'

Výsledný plazmid byl pDS α 2 Δ H spoje.

3) pDS α 2 Δ H spoj byl štěpen Sáli a konce zpracovány na tupo zpracováním s kohezivními konci s T4 DNA polymerázou a dNTP. 820 bp fragment BamHI-BglII lidské erytropoietinové cDNA byl na koncích natupo zpracován stejným postupem a ligován k plazmidu. Výsledný plazmid byl pDEC.

4) pDEC byl štěpen s KpnI a Pvull a na koncích zpracován na tupo zpracováním s kohezivními konci „mung beán“ nukleázo. Plazmid byl religován k deletovanému exizovanému Kpnl-PvuII fragmentu za vzniku plazmidu pDEC Δ.

Plazmid pDECA, obsahující /Thr¹²⁵/ erytropoietinovou cDNA, byl transfektován do -deficietních CHO buněk. 770 ml kondiciovaného média CHO buněk bylo zakoncentrováno za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 a diafiltrováno proti 10 mM TrisHCl, pH 8,6 na celkový objem 34 ml. 17ml podíl koncentrátu byl nanesen na Q-Sepharosovou kolonu s rychlým průtokem (5 ml objem náplně) ekvilibrovanou stejným pufrem a eluován lineárním gradientem 0-250 mM NaCl v 10 mM Tris-HCl, pH 8,6. Podíly frakcí z kolony, buď nezpracované nebo štěpené N-glykanázou, byly analyzovány SDS-PAGE nebo IEF a pooly (označené 2,3 a 4) byly připraveny na bázi izoformy a/nebo karbohydrátového složení frakcí. Každý pool byl nanesen na Vydac C4 kolonu (214TPB 2030, 1 cm průměr, 1,8-2,5 ml objem náplně, 0,34 ml/min) a promyt dvěma objemy kolony 20% ethanolu v 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony byly eluovány lineárními gradienty 20-94% ethanolu, 10 mM Tris, pH 7,0. Pooly byly připraveny, naředěny do 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a naneseny na Q-Sepharosové kolony s rychlým průtokem. Následujícím promýváním 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, byly vzorky eluovány

-16CZ 291515 B6 mM citrátem sodným, 250 mM NaCl, pH 7,0. Čištěné /Thr¹²⁵/ pooly byly analyzovány IEF a jsou uvedeny na obr. 9. EPO analog je analyzován na in vivo biologickou aktivitu jak je popsáno výše (Cotes a spol., supra).

Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však nijak vynález neomezují, naopak, jsou v něm zahrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nejširším rozsahu ta, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však nijak vynález neomezují, naopak, jsou v něm zahrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nejširším rozsahu ta, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná biologicky aktivní eiytropoietinová izoforma, vykazující jediný izoelektrický bod a mající specifický počet sialových kyselin na molekulu erytropoietinu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14.
2. Erytropoietinová izoforma podle nároku 1, kterou je rekombinantní izoforma.
3. Erytropoietinová izoforma podle nároku 1, kde uvedená izoforma obsahuje erytropoietin, mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 nebo 1-166 lidského erytropoietinu.
4. Erytropoietinová izoforma podle nároku 1, mající 14 sialových kyselin na molekulu erytropoietinu.
5. Erytropoietinová izoforma podle nároku 1, mající 13 sialových kyselin na molekulu erytropoietinu.
6. Erytropoietinová izoforma podle nároku 1, mající 10 sialových kyselin na molekulu erytropoietinu.
7. Erytropoietinová izoforma podle nároku 2, kde rekombinantní izoforma je vyrobena expresí exogenní DNA sekvence v buňce CHO.
8. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství erytropoietinové izoformy podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.
9. Způsob přípravy erytropoietinové izoformy podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně preparativní izoelektrické fokusace čištěného erytropoietinu a eluce jediné izoformy z gelu.