JP3073905B2

JP3073905B2 - ヒトエリスロポエチン類似体

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Publication number: JP3073905B2
Application number: JP07057432A
Authority: JP
Inventors: トーマス・ウエイン・ストリツクランド; トーマス・エドワード・バーン; ステイーブン・ジヨージ・エリオツト
Original assignee: キリン−アムジエン・インコーポレイテツド
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 1995-03-16
Publication date: 2000-08-07
Anticipated expiration: 2015-08-07
Also published as: AU646822B2; ES2139764T3; CN1063796C; CZ291515B6; GR3032089T3; DE69033301D1; IL95971A0; PT95586A; NO912281D0; NZ235676A; JPH04502331A; CN1051936A; CZ291488B6; EP0668351A1; IL125175A; EP0428267A3; SK497290A3; JP2983629B2; ZA908166B; NO912281L

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトエリスロポエチン
類似体、それをコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列
でトランスフェクトされた真核宿主細胞、及びそのよう
な類似体を含む医薬用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】エリ
スロポエチンは、赤血球前駆細胞から赤血球への成熟過
程に係わる糖蛋白ホルモンである。これは、循環赤血球
のレベルの調節に必須である。自然界に存在するエリス
ロポエチンは胎児期の肝臓及び成人の腎臓により生産さ
れ、血液中を循環して骨髄に於る赤血球生産を刺激す
る。腎不全の結果、腎臓のエリスロポエチン生産の減少
によりほとんど常に貧血になる。エリスロポエチンをコ
ードした遺伝子で形質転換した宿主細胞の蛋白質生成物
の発現を含む遺伝子工学技術により生産された組み換え
エリスロポエチンは、慢性腎不全の結果起こる貧血の治
療に用いる場合効果的であることが見いだされている。

【０００３】近年までエリスロポエチンの入手は非常に
限定されていた。この蛋白質は、ヒトの尿に存在する
が、排出量が非常に少ないことからこれを実際的な治療
用エリスロポエチン源とすることはできない。再生不良
性貧血患者は、健常人と比較して高水準の尿中エリスロ
ポエチン量を示すが、この尿の供給が限定されているこ
とから、やはり実質的にかかる源とすることはできな
い。J. Biol. Chem.,252,5558(1977年）に於て、Miyake
等によりヒト尿性エリスロポエチンの精製が、再生不良
性貧血患者由来の尿を出発物質として用いて行われた。

【０００４】エリスロポエチンをコードした遺伝子の同
定、クローニング及び発現は、米国特許第4,703,008 号
(Lin) に記載されている。例えば、組み換えエリスロポ
エチンプラスミドを含む哺乳動物細胞の成長を支持した
細胞培地からの組み換えエリスロポエチンの分離精製に
ついての記載は、米国特許第4,667,016 号(Lai等) に含
まれる。組み換えプラスミド上にエリスロポエチン遺伝
子を含む哺乳動物宿主細胞に於る、生物学的に活性な組
み換えエリスロポエチンの発現及び回収は、初めて治療
に十分な量のエリスロポエチンを使用可能にした。更
に、遺伝子配列の知識及び、より大量の精製された蛋白
質の使用可能性は、この蛋白質の作用様式についての理
解を深めた。

【０００５】蛋白質の生物学的活性は、その構造によ
る。詳しくは、蛋白質の一次構造（即ち、そのアミノ酸
配列）は、合成中及び合成後のポリペプチドによる二次
（例えばアルファヘリックス又はベータシート）及び三
次（三次折りたたみ構造全体）構造形成の情報を提供す
る。突然変異の誘導又は化学もしくは酵素処理による適
切な二次及び三次構造の破壊は、生物学的活性の減少を
もたらす。

【０００６】原核生物に於て、蛋白質の生物学的活性
は、前述の構造により大きく支配される。原核細胞から
の蛋白質と異なって、真核細胞により生成される多数の
細胞表面及び分泌蛋白質は、一又はそれ以上のオリゴサ
ッカリド残基によって修飾されている。この修飾は、グ
リコシレーションと称し、蛋白質の物理特性に劇的に影
響し、蛋白質の安定性、分泌及び細胞下局在性に於ても
重要である。適切なグリコシレーションは、生物学的活
性に必須である。事実、真核生物由来の遺伝子が、細胞
内蛋白質グリコシレーションプロセスを欠いたバクテリ
ア（例えば大腸菌）に於て発現した場合、グリコシレー
ションの欠乏により活性がないか又はほとんどない蛋白
質を生じる。

【０００７】グリコシレーションは、ポリペプチド骨格
の特定の位置で起き、通常二つの型、即ち、O-結合オリ
ゴサッカリドがセリン又はスレオニン残基と結合する型
とN-結合オリゴサッカリドが、配列Asn-X-Ser/Thr （こ
こでX はプロリンを除くアミノ酸を表す）の一部である
アスパラギン残基と結合する型がある。各型に於て見い
だされたN-結合及びO-結合オリゴサッカリドの構造及び
糖残基は、異なっている。通常両者に見いだされる糖の
一種は、N-アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と称
する）である。シアル酸は、通常N-結合及びO-結合オリ
ゴサッカリド両者の末端残基であり、その負の電荷によ
り糖蛋白質に酸の特性を与えることができる。

【０００８】ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列1-16
5 を有する組み換えエリスロポエチン（哺乳動物細胞内
で発現）及びヒト尿由来のエリスロポエチンの両者は、
糖蛋白質の全分子量の約40％から成る三ケ所のN-結合及
び一ケ所のO-結合オリゴサッカリド鎖を含む。N-結合グ
リコシレーションは24、 38及び83の位置に存在するアス
パラギン残基で起こり、一方O-結合グリコシレーション
は 126の位置に存在するセリン残基で起こる（Lai 等
J. Biol.Chem.261,3116 (1986年）； Broudy 等Arch. B
iochem. Biophys. 265,329（1988年））。オリゴサッカ
リド鎖は、末端シアル酸残基で修飾されていることが示
されている。全シアル酸残基を除去するためのグリコシ
ル化エリスロポエチンの酵素処理は、インビボ活性の損
失を結果として生じさせるが、インビトロ活性には影響
しない（Lowy等Nature 185, 102(1960年）；Goldwasser
等 J. Biol. Chem. 249, 4202 （1974年））。この性質
は、肝アシアログリコプロテイン結合蛋白質との相互作
用により循環系からアシアロエリスロポエチンが速やか
に除去されることにより説明される（Morrell 等 J. Bi
ol. Chem. 243, 155（1968年）；Briggs等，Am. J. Phy
siol. 227,1385（1974年）；Ashwell 等 Methods Enzym
ol. 50, 287 （1978年））。このように、エリスロポエ
チンはシアル化され、肝結合蛋白質による結合を避けた
場合のみインビボ生物学的活性を有する。エリスロポ
エチンのオリゴサッカリド鎖に於る他の成分の役割は明
らかではない。非グリコシル化エリスロポエチンは、グ
リコシル化型に比較してインビボ活性が非常に減少する
が、インビトロ活性は保持することが示されてきた（Do
rdal等 Endocrinology 116, 2293（1985年）；前記Lin
特許）。だが、他方の研究によると、グリコシレーショ
ン部位に存在するアスパラギン又はセリン残基の突然変
異によるN-結合又はO-結合オリゴサッカリド鎖の単一又
は同時除去は、哺乳動物細胞に於て生産される変化した
エリスロポエチンのインビトロ活性を著しく減少させる
（Dube等 J. Biol. Chem. 263, 17516（1988年））。

【０００９】エリスロポエチンの如き糖蛋白質は、等電
点電気泳動（IEF)の如き技術を用いて異なった荷電体に
分離させることができる。多数の研究者達が、未精製及
び部分精製したエリスロポエチン調製物のIEF 研究につ
いて報告している（Lukowsky等；J. Biochem 50, 909
（1972年）；Shelton 等 Biochem. Med. 12, 45 （1975
年）;Fuhr 等 Biochem. Biophys. Res. Comm. 98, 930
（1981年））。エリスロポエチン活性を有する多くて３
又は４個のフラクションがこれらの研究のIEF により分
類されたが、いずれも炭水化物含有量に関しては特徴づ
けられていない。さらに、フラクションの等電点とその
生物学的活性との間には何ら関連付けがなされなかっ
た。

【００１０】前述のMiyake等により研究されたヒト尿由
来の尿性エリスロポエチンの精製中、II及びIIIAと命名
されたヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの二
個のエリスロポエチンフラクションは、同じ比活性を有
することが報告された。後のフラクションII及びIIIAの
炭水化物分析は、フラクションIIが、フラクションIIIA
より平均シアル酸含有量が多いことを示した（前述のDo
rdal等）。

【００１１】

【課題を解決するための手段】発明の概要本発明は、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列中に、
グリコシル化部位の数の増加を生起させる１つ以上の変
更をもつヒトエリスロポエチン類似体を提供する。

【００１２】このグリコシル化部位は、N-結合炭水化物
鎖結合部位であってもよく、またO-結合炭水化物鎖結合
部位であってもよい。また、このような変更は、例えば
アミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって行い得る。
本発明の実施態様により、前記グリコシル化部位は、好
適には、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列の位置69
又は位置125 で置換されたものである。

【００１３】本発明はまた、ヒトエリスロポエチンより
も炭水化物鎖の数が多いヒトエリスロポエチン類似体を
提供する。

【００１４】炭水化物鎖は、シアル酸結合部位を提供す
るものであり得る。また、これはN-結合炭水化物鎖又は
O-結合炭水化物鎖であってもよい。

【００１５】具体的には、ヒトエリスロポエチン類似体
として、[Asn⁶⁹]EPO、[Asn¹²⁵,Ser¹²⁷]EPO、[Asn⁶⁹,T
hr⁷¹]EPO、[Ser⁶⁸,Asn⁶⁹,Thr⁷¹]EPO、[Thr¹²⁵]EPO、及
び[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPOが例として挙げられる。

【００１６】本発明はさらに、上記定義の治療上有効量
のヒトエリスロポエチン類似体と、医薬上許容可能な希
釈剤、アジュバント及び／又は担体とを含有してなる医
薬組成物も提供する。

【００１７】ヒトエリスロポエチン類似体は、網状赤血
球、赤血球の産生を増加させる薬理効果を有する。

【００１８】本発明はまた、上述したヒトエリスロポエ
チン類似体をコードするＤＮＡ配列をも提供する。さら
に、本発明は、宿主細胞がヒトエリスロポエチン類似体
の発現を可能にするように前記ＤＮＡ配列でトランスフ
ェクトされた真核宿主細胞も提供する。

【００１９】詳細な説明本発明によれば、エリスロポエチンイソフォームが提供
される。等電点電気泳動(IEF) は、電荷に基づいて蛋白
質を分離する。pH勾配及び電場に供した場合、蛋白質は
実効電荷を持たない位置に移動しそこにとどまる。これ
が、蛋白質の等電点(pI)である。IEF 上に観察されるそ
れぞれ明確なバンドは、特定のpI、従って同じ全電荷を
有する分子を表し、これをイソフォームと称する。ここ
で使用する用語「エリスロポエチンイソフォーム」と
は、単一のpI及び同じアミノ酸配列を有するエリスロポ
エチン調製物を指す。

【００２０】好ましい態様に於るエリスロポエチンは、
非ヒト真核性宿主細胞の中にトランスフェクトされた外
来性DNA 配列の発現の生成物である。即ち、好ましい態
様に於るエリスロポエチンは、組み換えエリスロポエチ
ンである。組み換えエリスロポエチンは、参照により本
明細書に含めた共通所有のLin 米国特許第4,703,008号
に記載の手法により有利に生産される。組み換えエリス
ロポエチンは、参照により本明細書に含めた共通所有の
Lai 等の米国特許第4,667,016 号の実施例2 に記載の通
常の手法、又は DEAE-アガロースクロマトグラフィーを
Q-セファロースクロマトグラフィーに代えることを除い
ては実施例2 に記載の手法により有利に精製される。Q-
セファロースカラム変法に於て、カラムを中性のpHにす
るために用いる緩衝液において25mM NaCl から55mM NaC
l に代え、カラムからエリスロポエチンを溶出させるた
めに用いる緩衝液において75mM NaCl から140 mM NaCl
に代える。この物質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析すると、単一種
（即ち、バンド）として移動する。精製エリスロポエチ
ンをIEF に供すると、糖蛋白質の異なる電荷型が存在す
ることを示す複数のバンドが現れる。

【００２１】尿由来のヒトエリスロポエチンのアミノ酸
配列を有する組み換えエリスロポエチンの別々のイソフ
ォームは、１から14のシアル酸を有するエリスロポエチ
ン分子に対応し、精製した組み換えエリスロポエチンに
存在する各イソフォームは、イソフォームが所有するシ
アル酸の数に従ったインビボ活性を有することを見いだ
した。ここで使用した用語「エリスロポエチン」とは、
天然に存在するエリスロポエチン、即ち尿由来のヒトエ
リスロポエチン、及び骨髄細胞に網状赤血球及び赤血球
の生産を増加させるインビボの生物学的特質を有するの
に十分に、天然に存在するエリスロポエチンのアミノ酸
配列及びグリコシレーションに類似する天然に存在しな
いポリペプチドを含むものとする。

【００２２】エリスロポエチンの粗調製物は、多数のイ
ソフォームを有するが、例えば前述のLai 等の特許の実
施例２のように精製した物質は、IEF により分析した場
合主に６個のイソフォームを含む。さらに、実施例４に
記載のクロマトグラフィーの手法を用いて、少なくとも
１個の他の高酸度イソフォームが検出されている。（IE
F ゲル上でシアル酸14個以上の位置に移動するこの高酸
性型は、シアリダーゼ消化に対する電荷の抵抗性により
示されるようにシアル酸の他の負の電荷を含むことがで
きる）。これらのイソフォームは、シアル酸含有量によ
り相互に異なる。実施例に示すように、これは、調製用
IEF によりイソフォームの10個を分離し、そのうち５個
についてシアル酸含有量を決定することにより証明され
る。シアル酸含有量を分析したイソフォームについて、
５個のイソフォームは9,10,11,12又は13個のシアル酸残
基のいずれかを含むことを見いだした。

【００２３】イソフォーム５から11（ここで、各イソフ
ォームはエリスロポエチン分子当りのシアル酸の数によ
り命名した）のエリスロポエチン分子当りのシアル酸残
基の数と、エリスロポエチンの相対インビボ比活性の間
には相関関係がある。イソフォーム11から14は、ほぼ同
じ相対インビボ比活性を有する。イソフォーム５から14
は、低酸素赤血球増加症マウスバイオアッセイ法により
インビボ活性を分析し、存在する各イソフォームの量
は、ブラッドフォード蛋白質分析、280nm に於る吸収又
はエリスロポエチンに対するラジオイムノアッセイ(RI
A) により決定した。U/mlとして表されるRIA 測定値（E
grie 等 Immunobiology 172，213, (1986年）は、 212,
770 U／mgエリスロポエチンポリペプチド（RIA により
決定された精製エリスロポエチンの平均比活性）で除す
ることによってmgエリスロポエチンポリペプチド／mlと
して表される単離したイソフォーム又はイソフォーム混
合物の蛋白質濃度を与える。実施例に示すように、相対
インビボ比活性はイソフォーム５からイソフォーム11ま
で段階的に増加している（表２参照）。

【００２４】ここで言うインビボ比活性とは、相対イン
ビボ比活性の測定値をいい、絶対インビボ比活性の測定
値ではない。この出願の目的として、比活性は、同じ分
析法、同じ内部標準を含む同じ条件、同じ型の動物、比
活性を計算するために使用する同じ分析データ、蛋白質
含有量を決定するための同じ分析法を用いて分析したイ
ソフォームの相対活性を比較するためにのみ使用する。
イソフォームについて報告されるインビボ比活性はどれ
も、そのイソフォームの個有値又は絶対値を表すもので
はない。

【００２５】本発明は、エリスロポエチンイソフォーム
を提供する。本発明により得られるエリスロポエチンの
特定のイソフォーム及びその性質は、出発物質の源によ
り変化する。例えば、尿由来のヒトエリスロポエチンの
イソフォームは、組み換えエリスロポエチンのイソフォ
ームと異なる。本発明は、好ましい態様に於て、エリス
ロポエチン分子当り特定の数（即ち、０より大きい一定
の数）のシアル酸（当該数は１−14から成る群から選択
される）を有するエリスロポエチンイソフォームに関す
る。有利な当該数は、9,10,11,12,13 又は14である。他
の態様に於て、当該数は14を超え、有利には16-23 であ
る。

【００２６】本発明は、２種又はそれ以上のエリスロポ
エチンイソフォームを含む組成物を提供する。一つの態
様に於て、この組成物は、エリスロポエチン分子当り所
定数以上のシアル酸、例えばエリスロポエチン分子当り
11個を超えるシアル酸又は分子当り12個を超えるシアル
酸を有するイソフォームの混合物、例えばイソフォーム
12,13 及び14の混合物を含む。他の態様に於て、この組
成物は、エリスロポエチン分子当り所定の数のシアル
酸、例えば分子当り12個未満であるが 8個を超えるシア
ル酸を有するイソフォームの混合物、例えばイソフォー
ム9,10及び11の混合物を含む。本発明はまたイソフォー
ムの相対量が同じ又は異なるエリスロポエチンイソフォ
ームの組成物を提供する。例えば、イソフォーム9,10及
び11の混合物は、1:1:1, 2:3:1又は20:20:1 のように割
合を変えることができる。

【００２７】この組成物は、４種未満のイソフォームの
混合物、例えばイソフォーム11,12及び13の混合物又は1
2及び14の混合物又は７及び13の混合物を含むことが有
利である。

【００２８】エリスロポエチンイソフォームの混合物を
製造するために、本発明は、選択するエリスロポエチン
イソフォームを同時に単離する方法も提供する。これら
の方法は、調製用等電点電気泳動のような技法による個
々のイソフォームの単離、又はイオン交換クロマトグラ
フィー又は等電点クロマトグラフィーのような技法によ
る分子当り所定数のシアル酸（例えば11超）を有するイ
ソフォーム混合物の調製を含む。これらの全ての技法
は、その基本として電荷による蛋白質の分離を有する。

【００２９】通常、イオン交換クロマトグラフィー及び
等電点クロマトグラフィーは、一部又は全部のエリスロ
ポエチンイソフォームの樹脂への結合を可能にする条件
下で、粗ヒトエリスロポエチン（細胞ならし培地）又は
精製した物質のいずれかを樹脂のカラムにかけることを
含む。粗エリスロポエチン調製物については、約pH７で
この蛋白質をカラムに供することが好ましく、精製した
調製物については、pH７から約pH４でこの蛋白質をカラ
ムに供することができる。約pH４の緩衝液でカラムを洗
浄した後、イオン交換カラムに結合しとどまったこれら
のエリスロポエチンイソフォームを、緩衝液の塩濃度及
びpHを増加させることにより又は約pH４でイオン強度増
加及びpH減少勾配に供することにより溶出させる。等電
点クロマトグラフィーではpH減少勾配又は高塩濃度でカ
ラムを洗浄することによりカラムからイソフォームを溶
出させる。

【００３０】本発明の一つの態様は、分子当り所定数以
上、例えば10超のシアル酸を有するエリスロポエチンイ
ソフォームを選択的に合成する哺乳動物（例えばチャイ
ニーズハムスター卵巣卵、CHO ）宿主細胞に関する。エ
リスロポエチン分子は、分子のシアル酸含有量を制限す
ることのできるN-結合又はO-結合オリゴサッカリド構造
を有する。例えばテトラアンテナ（四分枝）N-結合オリ
ゴサッカリドは、最も普通に４ケ所のシアル酸結合可能
部位を提供し、一方、アスパラギン結合部位に於てテト
ラアンテナ型と置換することができる二分枝及び三分枝
オリゴサッカリド鎖は、通常、多くて２又は３ケ所のシ
アル酸結合部位を有する。O-結合オリゴサッカリドは、
通常２ケ所のシアル酸結合部位を提供する。このよう
に、エリスロポエチン分子は、３個のN-結合オリゴサッ
カリドが全てテトラアンテナである場合、シアル酸残基
計14個を有することができる。組み換えエリスロポエチ
ンにテトラアンテナ鎖を選択的に付加することができ、
それによってシアル酸結合部位の数を最大限にすること
ができる細胞を得るために哺乳動物培養細胞を選抜す
る。

【００３１】尿性エリスロポエチンのN-結合オリゴサッ
カリドは、ガラクトースにα2,3 及びα2,6 結合両者の
シアル酸を含む（Takeuchi等 J. Biol. Chem. 263, 365
7(1988年))。典型的には、α2,3 結合のシアル酸はマン
ノースα1,6 分枝上のガラクトースに付加し、α2,6 結
合のシアル酸はマンノースα1,3 分枝上のガラクトース
に付加する。これらのシアル酸を付加する酵素（β- ガ
ラクトシドα2,3 シアリルトランスフェラーゼ及びβ-
ガラクトシドα2,6 シアリルトランスフェラーゼ）は、
それぞれマンノースα1,6 及びマンノースα1,3 分枝に
シアル酸を付加させるのに最も効果的である。

【００３２】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR) 欠損チ
ャイニーズハムスター卵巣卵（CHO)細胞は、組み換えエ
リスロポエチンを含む組み換え糖蛋白質の生産に通常宿
主細胞として用いられる。これらの細胞は、酵素β- ガ
ラクトシドα2,6 シアリルトランスフェラーゼを発現し
ないことから、これらの細胞内で生産される糖蛋白質の
N-結合オリゴサッカリドにα2,6 結合のシアル酸を付加
しない。（Mutsaers等Eur. J. Biochem. 156, 651（198
6年）；Takeuchi等 J. Chromatogr. 400, 207(1987
年))。従ってCHO 細胞で生産される組み換えエリスロポ
エチンには、ガラクトースに2,6 結合したシアル酸が欠
けている（前述のSasaki等（1987年）；前述のTakeuchi
等 (1987年))。本発明の他の態様に於て、イソフォーム
を生産するために用いられるエリスロポエチンは、機能
的β- ガラクトシドα2,6 シアリルトランスフェラーゼ
遺伝子で形質転換（トランスフェクション）し、ガラク
トースにα2,6 結合したシアル酸を組み込むCHO 細胞内
で生成する。改変したCHO 細胞又は他の哺乳動物宿主細
胞を作成する技法の開示については、参照により本明細
書に含めるLee 等 J. Biol. Chem. 264, 13848（1989
年）を参照。

【００３３】ヒトエリスロポエチンの類似体も又本発明
に含まれる。ここで使用した「ヒトエリスロポエチンの
類似体」とは、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列が
1 個以上変化しグリコシル化部位（例えばシアル酸結合
部位）の数が増加したエリスロポエチンを称する。類似
体は、グリコシレーションに有用である部位に変える、
アミノ酸残基の付加、欠失又は置換を含む部位特異的突
然変異により生じる。このような類似体は、ヒトエリス
ロポエチンよりも多数の炭水化物鎖を有する。

【００３４】生物学的活性が増加した類似体は、エリス
ロポエチン分子のシアル酸含有量を増加させることによ
り構築される。ヒトエリスロポエチンで見いだされたシ
アル酸よりも多くのシアル酸を有する類似体は、生物学
的活性に必要な二次又は三次構造を乱さないグリコシレ
ーション部位を付加することにより生じる。有利には、
ヒトエリスロポエチンの類似体は、N-グリコシレーショ
ン又はO-グリコシレーションのための 1,2又は３個の追
加部位を有する。例えば、69の位置のロイシンを、アス
パラギンに置換しN-グリコシレーションのための四番目
の部位として供する配列 Asn-Leu-Serを生じさせる。こ
のような変化は、通常、分子当り４個までの追加シアル
酸を提供することができる。追加N-又は0-グリコシレー
ション部位を生じさせる他の変化の例としては、 125及
び127 の位置のアラニンをそれぞれアスパラギン及びセ
リンに、125 の位置のアラニンをスレオニンに、124 及
び125 の位置のアラニンをそれぞれプロリン及びスレオ
ニンに変える例が挙げられる。本発明が、グリコシレー
ションのための追加部位を有するヒトエリスロポエチン
の他の多くの類似体を含むことは当業者に明白である。

【００３５】治療学上効果的な量の特定のイソフォーム
もしくはイソフォームの混合物又はエリスロポエチン類
似体、及びエリスロポエチン治療に於て有用な希釈剤、
アジュバント及び／又は担体を含む医薬用組成物も本発
明に含まれる。ここで使用した「治療学上効果的な量」
とは、所定の条件及び投与計画で治療の効果を提供する
量をいう。エリスロポエチンイソフォーム又はエリスロ
ポエチン類似体の投与は、非経口的経路によるのが好ま
しい。特定の経路の選択は、治療する状態による。エリ
スロポエチンイソフォーム又はエリスロポエチン類似体
の投与は、好ましくはヒト血清アルブミンのような適切
な担体、緩衝塩溶液のような適切な希釈液及び／又は適
切なアジュバントを含む剤形として行う。必要用量は、
患者のヘマトクリットを上昇させるのに十分な量であ
り、それは治療を受ける患者の重症度、用いる投与法等
により変わる。

【００３６】

【実施例】本発明の実施例を以下により具体的に示す
が、これらの実施例に限定されるものではない。実施例
のインビボバイオアッセイに於て用いたエリスロポエチ
ン標準は、部分的に精製した尿性エリスロポエチン標準
に対して標準化した組み換えエリスロポエチン標準であ
る。このように、相対インビボ比活性のみを測定する。
又、用いたエリスロポエチン標準が存在する国際規格と
直接相関しないことから、インビボ比活性は、“U/m
l”，U/mg”，及び“ U/A₂₈₀”で表し、“IU／ml”，
“IU／mg”及び“IU/A₂₈₀”とはしない。

【００３７】実施例１：組み換えエリスロポエチンイソ
フォームの単離組み換えエリスロポエチンは前述のLin に記載された通
りに製造する。一回目及び三回目のイソフォーム単離の
出発物質として用いた組み換えエリスロポエチンは、前
述のLai 等の実施例２に記載の手順により精製した。二
回目及び五回目のイソフォーム単離の出発物質は、前述
のLai 等の、Q-セファロースクロマトグラフィーの変法
により精製した。これらの調製物は、尿由来のヒトエリ
スロポエチンと同じアミノ酸配列を有する組み換えエリ
スロポエチンのイソフォーム混合物を含み、主にイソフ
ォーム9-14を含む。四回目のイソフォーム調製の出発物
質は、Lai 等の実施例２に於て陰イオン交換カラムの洗
液、５mM酢酸／１mMグリシン／6M尿素により溶出した物
質である。このフラクション（画分）は、９個以下のシ
アル酸を有するイソフォームを含み、Lai 等の実施例２
に記載されている通りに調製用等電点電気泳動の使用に
先立ちゲル濾過クロマトグラフィーによりさらに精製し
た。六回目のイソフォーム調製に於て、４から13個のシ
アル酸残基を有する組み換えエリスロポエチンの精製し
た調製物を出発物質として用いた。この物質は、出発物
質に存在するほとんどのイソフォームを保持できるイオ
ン交換カラム（pH 8.4の塩化ナトリウム勾配での組み換
えエリスロポエチンの溶出、及び酢酸／尿素洗浄の省
略）への改変を除いてはLai 等の実施例２に従って精製
した。

【００３８】個々のイソフォーム６種類の調製を、実質
的にエルケービー社の指示書番号198 に従って、顆粒化
ゲルベッド（ウルトロデックス（Ultrodex）、エルケー
ビー社）に於る調製用等電点電気泳動により行った。フ
ァルマライト(Pharmalyte)（ファルマシア社）2.5-5 ア
ンフォライト（ファルマシア社）を用い、ゲルベッドは
5Mの尿素を含む。

【００３９】一回目の調製に於て、6.8ml の 20mM クエ
ン酸ナトリウム／100mM 塩化ナトリウム pH 7.0 に溶解
させた約20mgの組み換えエリスロポエチンをゲルに供
し、8ワットで約16時間フォーカスした。等電点電気泳
動後、ゲル中のイソフォームバンドをゲルベッドの紙接
触プリントにより可視化した。プリントした後、固定液
（40％メタノール／10％酢酸／10％ TCA／3.5 ％スルホ
サルチル酸）に３回（室温でそれぞれ約10分）浸漬する
ことにより固定し、40％メタノール／10％酢酸（30−60
℃）に一回（約10分）供し、分離したイソフォームを可
視化するために、60℃の 0.125％クマシーブルー R-250
／40％メタノール／10％酢酸中で15分間染色した後、7.
5%メタノール／10％酢酸中で脱色した。イソフォームを
含む顆粒化ゲルベッド部分（樹脂の約50％）を取り出
し、水を加え（約16ml）、スラリーを5.5×24.5インチ
のトレイに注ぎ、全重量が約40g になるまで蒸発濃縮し
た。この調製物を再度フォーカスし、ゲルベッドの接触
プリントを前述の通りに作製した。６個の識別可能なイ
ソフォームのそれぞれを含むゲル部分をゲルベッドから
取り出した。

【００４０】ゲルからイソフォームを溶出させるため
に、10mMトリス-HClpH 7.0／5mM Chaps を含む溶液を各
イソフォームに加え、スラリー状にした。このスラリー
を小カラムに移し、トリス-Chaps緩衝液で洗浄した。こ
の通過液を集め、20％エタノール／10mMトリス-HCl pH
7.0で平衡化したVydac C4逆相樹脂を充填した小カラム
（開口型）にそれぞれ供した。このカラムは、20％エタ
ノール／10mMトリス-HCl,pH 7.0 、35％エタノール／10
mMトリス-HCl, pH 7.0及び65％エタノール／10mMトリス
-HCl, pH 7.0を用いて段階的に展開した。65％エタノー
ル／10mMトリスで溶出したフラクションを、10mMトリス
-HCl,pH 7.0 を用いて1:1 に希釈し、濃縮に供した後、
セントリコン(Centricon)-10（アミコン社）微量濃縮器
を用いて10mMトリス-HCl,pH 7.0 にバッファー交換し
た。この調製物の分析用等電点電気泳動を、 5M の尿素
を含むポリアクリルアミドゲル中で、セルバライト(Ser
valyte)-5 アンホリン（セルバ社）を用いて、本質的
に、エルケイビー社の指示書番号250 に記載されている
通りに行った。

【００４１】二回目の調製に於て、6.5ml の脱イオン水
に溶解させた約26mgの組み換えエリスロポエチンをゲル
に供し、 2.5ワットで35分及び10ワットで約17時間フォ
ーカスした。ゲルベッド中に観察することができるフォ
ーカスした蛋白質のバンドを11の異なったプールとして
取り出した。各プールを脱イオン水で約7.5 mlにし、そ
の結果できた各プールの上澄液20mlを前述の通りに分析
用等電点電気泳動に供した。各プールに５mlの1.5Mトリ
ス-HCl,pH 8.8 を加え、スラリーをそれぞれ小カラムに
移し、液相を通過させた。樹脂を約3 倍容量の0.5Mトリ
ス-HCl, pH７で洗浄し、洗液を通過液と合わせた。この
溶出液を濃縮し、１万ダルトン分子量濾別用アミコン使
い捨て限外濾過装置を用いて20mMクエン酸ナトリウム／
100mM 塩化ナトリウムpH7.0 にバッファー交換した。し
かる後、この濃縮液（約 0.5ml）を0.22ミクロンカット
オフの酢酸セルロースフィルターを通過させた。分析用
等電点電気泳動に基づいて、５個のプールが単一のイソ
フォーム 10,11,12,13及び14を主に含むことが判明し
た。

【００４２】３回目の調製に於て、21.8mlの蒸留水に溶
解させた約30mgの組み換えエリスロポエチンをゲルに供
し、２ワットで25分間、10ワットで20時間及び15ワット
で15分間フォーカスした。個々のイソフォームに対応す
る蛋白質のバンドを肉眼的に観察し、ゲルベッドから取
り出した。ゲルから分離したイソフォームに蒸留水を加
えてスラリーを生じさせ、その結果できた上澄液を分析
用等電点電気泳動により分析した。各スラリーに等容量
の1Mトリス-HCl, pH 7.2を加え、懸濁液をそれぞれ小カ
ラムに移し、このカラムに液相を通過させてイソフォー
ムを溶出させた。各通過液を濃縮し、１万ダルトン分子
量カットオフのアミコン使い捨て限外濾過装置を用いて
20mMクエン酸ナトリウム／100mM 塩化ナトリウムpH7.0
にバッファー交換した。分析用等電点電気泳動ゲルによ
り、単一のイソフォーム 9,10,11,12,13及び14を主に含
むプールが得られたことが示された。

【００４３】四回目のイソフォーム調製に於て、イソフ
ォーム3-9 を含むエリスロポエチン（前述の通りに調
製）を出発物質として用いた。調製用等電点電気泳動を
本質的に前述の調製1-3 の通りに行うに先だって、等電
点の低い出発物質のためにより適切なアンホライトレン
ジを得るためにロトフォー（Rotofor 、バイオラッド
社、リッチモンド、カルフォルニア）液相等電点電気泳
動セル中でアンホライト（ファルマライト2.5-5 ）を前
分画した。前分画は、6.7ml のファルマライト2.5-5 を
15g の尿素と混合し、精製した水を加えて50ml容量にす
ることにより行った。この混合液は、ロトフォー中で10
ワット、１℃で５時間半、陽極液及び陰極液としてそれ
ぞれ0.1M燐酸及び0.1M水酸化ナトリウムを用いて分画し
た。 4.5から約６の測定pHを有するアンホライトフラク
ションをフラットベッド等電点電気泳動に用いた。

【００４４】セントリエリューター（Centrieluter、ア
ミコン社、デンバー、マサチューセッツ）及び10,000 M
W カットオフのセントリコン（アミコン社）を用い、以
下のパラメーター、即ち、0.18トリス緩衝液pH8.8, 100
ボルト，25-30 mA，３時間で、イソフォームからアンホ
ライトを取り除いた。しかる後、セファデックスG-25
（ファルマシア）を用いてゲル濾過によりイソフォーム
を0.1M塩化ナトリウムにバッファー交換した。この結果
できた５個のプールの分析用等電点電気泳動は、イソフ
ォーム4,5,6,7 及び８を含むことを示した。イソフォー
ム４はいくつかのバンドに分かれたが、これは分解を受
けたことを示唆している。

【００４５】五回目のイソフォーム調製は、フラットベ
ッド等電点電気泳動の手法にプレフォーカシングステッ
プを加えることにより改変した。この改変に於ては、電
気泳動前にアンホライト／尿素／ゲルの混合物に蛋白質
を加えず、ゲルベッドのpH勾配の形成の後に等電点電気
泳動装置に加える。75分間のプレフォーカシング（1500
ボルト−時間）後、カソード側から 2.25-4.25cmのゲル
ベッド部分を取り出し、エリスロポエチン溶液と混合
し、ゲルベッドにもどした。等電点電気泳動後、イソフ
ォーム 10,11,12,13及び14をゲルベッドから溶出させ、
セントリコーン−10（アミコン社）を用いて限外瀘過に
よりアンホライトから分離した。

【００４６】プレフォーカシング改変は、イソフォーム
調製物の紫外線吸収特性を出発組み換えエリスロポエチ
ンのそれに、より類似させようとして考案した。スペク
トル特性に於るこの改良は、単離したイソフォームの 2
80及び260 nmに於る吸収の比率に見いだすことができ
る。調製物２及び３（プレフォーカスなし）のイソフォ
ームの260 nmの吸収に対する280 nmの吸収の平均比率(A
₂₈₀/A₂₆₀) は、1.36±0.11 であり、一方、調製物５
及び６（プレフォーカスあり）の A₂₈₀/A₂₆₀の平均比
率は1.68±0.20である。イソフォーム#14 を計算から除
外した場合、調製物2&3 及び5&6 の平均 A₂₈₀/A₂₆₀比
率は、それぞれ1.39±0.11及び1.74±0.09である。（イ
ソフォーム14は、その存在が最も少量であり、そのため
アンホライト成分による痕跡量のコンタミネーションに
よって干渉されやすいこと、又はフラットベッド等電点
電気泳動操作に於て電極に最も近接していることから最
も不規則なスペクトルを有する。） Lai等の実施例２
（前述したように陰イオン交換樹脂としてQ-セファロー
スを用いることにより改変）に従って調製した組み換え
エリスロポエチンの平均 A₂₈₀/A₂₆₀比率は1.91±0.04
である。

【００４７】前述したように、イソフォーム調製物#6の
出発物質は、イソフォーム4-13を含む組み換えエリスロ
ポエチン調製物であった。アンホライトは四回目の調製
と同様にロトフォー装置内でプレフォーカスした。 3.7
から4.8 の測定pHを有するアンホライト分画をフラット
ベッド等電点電気泳動に用いた。フラットベッドは#5と
同様にプレフォーカスし、限外濾過（セントリコーン−
10）して担体としてのアンホライトを取り除いた後、イ
ソフォーム9,10,11,12及び13を得た。

【００４８】実施例２：組み換えエリスロポエチンイソ
フォームのシアル酸含有量実施例１に記載した通りに単離したイソフォーム及び前
述のLai 等の手法に従って精製したエリスロポエチン
（イソフォーム９から14の混合物）は、0.10-0.15 M の
塩化ナトリウムにバッファー交換し、Jourdian等，J. B
iol. Chem. 246,430(1971年) の方法を改変してシアル
酸含有量を分析した。シアル酸残基は、0.35 Mの硫酸を
用い80℃で30分間の加水分解により糖蛋白質から切断
し、分析に先立ち、水酸化ナトリウムでこの溶液を中和
した。存在するエリスロポエチン蛋白質の量を算定する
ために、標準としてヒトエリスロポエチンのアミノ酸配
列を有する組み換えエリスロポエチンを用いて、ブラッ
ドフォード蛋白質アッセイ（Bradford Anal. Biochem.
72, 248 （1976年）を、バイオラッド社の分析試薬を用
い、同社の微量分析法に従って行った。エリスロポエチ
ンのモル当りのシアル酸のモルとして表した結果を表１
に示す。イソフォームは、分子当りのシアル酸の数に従
って命名し、低酸性（イソフォーム９）から高酸性（イ
ソフォーム13）までの範囲であった。イソフォーム９-1
3 は図１のゲルレーン6-10に示される。イソフォーム14
の量は、正確にシアル酸含有量を測定するのに不十分で
ある。このイソフォームのシアル酸含有量は、他のイソ
フォームとの相対的なIEF ゲル上の移動により推定し
た。イソフォーム 5-8（調製物#4）のシアル酸含有量
は、測定しなかったが、同様にIEF ゲル上の移動により
推定した。

【００４９】

【表１】

【００５０】実施例３：組み換えエリスロポエチンイソ
フォームの活性実施例１に記載した通りに単離したイソフォームは、28
0nm に於る吸収、ブラッドフォード蛋白質アッセイ及び
エリスロポエチンのRIA により分析し、存在する組み換
えエリスロポエチンの量を決定した。低酸素赤血球増加
症マウスバイオアッセイ（Cotes 等 Nature 191, 1065
(1961年) ）を用いて、相対インビボ生物学的活性を決
定した。エリスロポエチンのラジオイミュノアッセイを
用いたエリスロポエチン蛋白質の定量は、一部のイソフ
ォームが高い相対インビボ比活性を有するという結果を
生じた。なぜならば、多数のシアル酸を含むイソフォー
ムの見かけの減少した免疫反応性は、エリスロポエチン
濃度の過小評価をもたらし、従って最も負に荷電したイ
ソフォームの相対インビボ比活性の過大評価をもたらし
たからである。U/mgで表したマウスバイオアッセイの測
定値を対応する蛋白質濃度で除して、U/mgエリスロポエ
チンペプチドで表したインビボ比活性をだした。これら
の比活性を表２に示す。

【００５１】表２に於て、“ｎ”は比活性値に寄与する
独立したイソフォーム調製物の数を表す。ほとんどの場
合、各イソフォーム調製物に於て数回のインビボ分析を
おこなった。同じインビボデータが３個のカラム全ての
比活性計算に寄与し、U/mgエリスロポエチンポリペプチ
ドは、280nm の吸収、ラジオイムノアッセイ又はブラッ
ドフォード蛋白質アッセイの結果により決定した。イソ
フォーム9-14を含む精製した組み換えエリスロポエチン
をブラッドフォード蛋白質アッセイの標準として用い
た。“ｎ”はブラッドフォード蛋白質アッセイによる計
算では、ブラッドフォードアッセイを行った時点でいく
つかの調製物は利用不能になったので、少なくなってい
る。

【００５２】前述のLai 等の手法により精製した、イソ
フォーム９から14の混合物を含むエリスロポエチンを、
RIA 及びインビボ分析の標準として用いた。

【００５３】U/mgエリスロポエチンポリペプチドとして
表される相対比活性は、0.807mg エリスロポエチンポリ
ペプチド/A₂₈₀を掛けることにより U/A₂₈₀に変換する
ことができる。変換係数は、エリスロポエチンの吸光定
数（1.345 mg/A₂₈₀）にエリスロポエチン糖蛋白質の蛋
白質含有量（約60重量％、Davis 等 Biochemistry 26,
2633 (1987年））を掛けることにより求める。こうして
求め、mgエリスロポエチンポリペプチド／Ａ₂₈₀（すな
わち、1.345 mgエリスロポエチン/A₂₈₀×0.60mgポリペ
プチド／mgエリスロポエチン＝0.807 mgポリペプチド/A
₂₈₀）を得る。さらに、U/mgエリスロポエチンポリペプ
チドとして表される比活性に、ファクター、 0.60 mgポ
リペプチド／mgエリスロポエチン糖蛋白質を掛けて、U/
mgエリスロポエチン糖蛋白質として表される比活性をだ
すことができる。

【００５４】

【表２】

【００５５】表２のデータはまた、図2A,2B 及び2Cに図
式的に示す。これらのデータは、エリスロポエチンの相
対インビボ活性がイソフォーム#11 までシアル酸含有量
の関数として増加することを示す。イソフォーム11-14
は、本質的に同じ相対的インビボ生物活性を有する。
（これは、イソフォーム14の濃度をブラッドフォードア
ッセイ値を用いて表した場合最も明らかである。ブラッ
ドフォード値はイソフォーム14にとってより正確であ
る。なぜなら、得られる量が通常少なく A₂₈₀による決
定が困難であり、既に述べた非常に負荷電型のRIA に於
て最も見かけの反応性が減少したからである。）より多
くのシアル酸を有するエリスロポエチンイソフォームの
相対インビボ比活性が高いのは、これらのイソフォーム
の循環半減期がより長いということが考えられる。イソ
フォーム９及び13を放射性ヨウ素（¹²⁵Ｉ）で標識し、
そのラットに於るクリアランス率を決定した。循環半減
期は、イソフォーム９よりイソフォーム13の方がかなり
長かった。

【００５６】実施例４：Q-セファロースクロマトグラフ
ィーによる組み換えエリスロポエチンイソフォーム混合
物の選出前述のLin の手法による組み換えエリスロポエチンの生
産から得た細胞ならし培地を濃縮し、10mMトリス,pH7.2
で透析濾過した。蛋白質濃度は、標準としてウシ血清ア
ルブミンを用いてブラッドフォード微量蛋白質アッセイ
により決定した。40mgの全蛋白質を含んだ19.6 ml の溶
液に20μM になるようにCuSO₄を加え、0.45ミクロンカ
ットオフのフィルターで濾過し、前もって 10mM トリ
ス，pH 6.8から7.0 を用いて４℃で平衡化したQ-セファ
ロースファーストフロー（ファルマシア社）を充填した
ベッドボリューム 4ml（高さ1.05cm，直径 2.2cm）のカ
ラムに供した。試料供試後、カラム容量の２倍容量の同
じ緩衝液でカラムを洗浄した。カラムの流速は約１ml／
分である。この手法を用いて６個のカラムを別々に準備
し、限定したエリスロポエチンイソフォーム混合物を選
出した。

【００５７】カラムは、カラム容量の６から９倍の以下
の成分からなる低pH緩衝液、即ち、カラム#1は、150mM
酢酸，1mM グリシン，20μM CuSO₄，6M尿素,NaOH でpH
4.7に調整；カラム#2は、 200 mM 酢酸，1mM グリシ
ン，20μM CuSO₄， 6M 尿素，NaOHでpH4.7 に調整；カ
ラム#3は、250mM 酢酸，1mM グリシン，20μM CuSO₄，
6M 尿素,NaOH でpH4.7 に調整；カラム#4は、300mM 酢
酸，1mM グリシン,20 μM CuSO₄， 6M 尿素，NaOHでpH
4.7に調整；カラム #5 は、150mM 酢酸，1mM グリシ
ン，20μM CuSO₄， 6M 尿素；カラム#6は、 300mM酢
酸，1mM グリシン，20μM CuSO₄， 6M 尿素で洗浄し
た。カラムのpHは、各カラムをカラム容量の 8から11倍
の10mMトリス-HCl，55mM NaCl ，20μM CuSO₄, pH 7の
緩衝液で洗浄することにより約pH 7に増加させた。限定
したエリスロポエチンイソフォーム混合物は、10mMトリ
ス-HCl,140mM NaCl,20μM CuSO₄, pH 7.0で洗浄するこ
とによりカラムから溶出させた。

【００５８】各カラムから溶出させたイソフォームのプ
ールを濃縮しアミコンセントリコーン-10 微量濃縮装置
を用いて溶媒を水で置換した。これらの濃縮プールの分
析用等電点電気泳動の結果を図３に示す。ゲルレーン1-
6 は、それぞれカラム1-6 から溶出させた限定したエリ
スロポエチンイソフォーム混合物を表す。図３の右端の
ゲルレーンに示される“イソフォーム混合物”は、前述
した通りにQ-セファロースカラムに供した細胞培地を表
す。このカラムを5mM 酢酸，1mM グリシン，20μM CuSO
₄及び6M尿素を含む溶液で洗浄し、エリスロポエチンイ
ソフォーム混合物を、前述の手法を用いてカラムから溶
出させた。分析用等電点電気泳動に先立ち、この溶出し
たイソフォーム混合物をさらに前述のLai 等の手法によ
り精製した。

【００５９】実施例５：Q-セファロースの低pH勾配を用
いた組み換えエリスロポエチンイソフォームの分画他の手法に於ては、エリスロポエチンイソフォームはpH
が減少しイオン強度が増加する勾配を用いて分離する。
濃縮した透析濾過エリスロポエチン含有培地を、約40mg
の全蛋白質／mlゲルの割合でQ-セファロースカラムに供
した。しかる後、カラムを、カラム容量の約２倍の10mM
トリス-HCl, pH 7.0で、次にカラム容量の約10倍の2mM
酢酸／1mM グリシン／20μM CuSO₄／6M尿素 (pH約4.8)
で洗浄し、混入蛋白質及び約７未満のシアル酸残基を有
するエリスロポエチンイソフォームを取り除いた。約8
個から約12個のシアル酸を含むイソフォームを、約2mM
酢酸／6M尿素／1mM グリシン／20μM CuSO₄から始まっ
て40mM酢酸／6M尿素／1 mMク゛リシン/20μM CuSO₄(pH 約4)
までの勾配を用いてカラムから溶出させた。勾配の全容
量はカラム容量の約40倍であり、カラム容量とほぼ同量
の各フラクション（分画）を、集めたフラクションを長
時間低pHにさらすのを避けるためpHを6-8.5 の範囲にす
るのに十分な量のトリス緩衝液を含む容器に集めた。フ
ラクションの一部を分析用等電点電気泳動に供し分離を
モニターした。図4 は、この手法により達成することが
できるイソフォーム8-11の分離を示す。勾配を終えた時
点でカラムに結合したままのイソフォーム12-14 を 10m
M トリス-HCl,140mM NaCl,20μM CuSO₄(pH 7.0)から成
る緩衝液で洗浄することにより溶出した。Lai 等の実施
例２に記載したように、逆相クロマトグラフィー、続い
てゲル濾過クロマトグラフィーにより、混入蛋白質をイ
ソフォーム（勾配中に分離又は塩化ナトリウム溶液によ
り溶出）から除去した。

【００６０】実施例６：追加グリコシレーション部位を
有するヒトエリスロポエチンの類似体 A.ヒトエリスロポエチン類似体の構築エリスロポエチンのアミノ酸配列の既存及び計画の炭水
化物結合部位を図5 に示し、これらの追加グリコシレー
ション部位作出の手法を、図6A-C及び以下に示した。

【００６１】以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、
インビトロ突然変異用に合成した。

【００６２】

【表３】

【００６３】下線を引いたコドンは、かっこで示したア
ミノ酸が野生型のアミノ酸と置き変わった不適正部分を
示す。

【００６４】[Asn⁴,Ser⁶]EPOは、Asn 4 にN-グリコシ
レーション部位を付加させるために構築した。[Asn⁹,S
er¹¹]EPOは、Asn ９にN-グリコシレーション部位を付加
させるために構築した。[Asn⁶⁹]EPOは、Asn 69にN-グリ
コシレーション部位を付加させるために構築した。[Asn
¹²⁵,Ser¹²⁷]EPOは、Asn 125 にN-グリコシレーション
部位を付加させるために構築した。[Thr¹²⁵]EPO及び[P
ro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPOは、Thr 125 にO-グリコシレーショ
ン部位を付加させるために構築した。

【００６５】以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、
インビトロ突然変異用に合成した。

【００６６】

【表４】

【００６７】[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Thr¹³¹]EPO：
[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPO cDNA から開始して、オリゴヌク
レオチドプライマー５′AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC ３′
を用いて[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶]EPOを作出した。し
かる後、オリゴヌクレオチドプライマー５′TGCTCCACTC
ACAACAATCACTG３′を用いて[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,
Thr¹³¹]EPOを作出した。

【００６８】[Asn⁶⁹,Thr⁷¹]EPO及び[Ser⁶⁸,Asn⁶⁹,Th
r⁷¹]EPOは Asn 69 にN-グリコシレーション部位を付加
させ、この部位のN-グリコシレーションを促進するため
に構築した。[Asn¹²⁵,Thr¹²⁷]EPO，[Asn¹²⁵,Th
r¹²⁷,Thr¹³¹]EPO, [Pro¹²⁴,Asn¹²⁵,Ser¹²⁷] EPO 及
び[Pro¹²⁴,Asn¹²⁵,Thr¹²⁷]EPOはAsn 125 にN-グリコ
シレーション部位を付加させ、この部位のN-グリコシレ
ーションを増加させるために構築した。[Thr¹²⁵,Thr
¹²⁶]EPO, 及び[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵,Thr¹²⁶,Ser¹³¹]EPO
はThr 125 にO-グリコシレーション部位を付加させ、こ
の部位のグリコシレーションを増加させるために構築し
た。

【００６９】インビトロ突然変異用エリスロポエチンDN
A の材料は、pUC ８中のヒトエリスロポエチンcDNAクロ
ーン、プラスミド Hu13 （Law 等Proc Natl. Acad. Sc
i. 83, 6920（1986年））である。Hu13から誘導された
プラスミドDNA は、BstEII及びBglII 制限酵素で切断
し、その結果できたDNA フラグメントをアガロースゲル
電気泳動に供し、ジェネクリーン（GeneClean 、TM）キ
ット及び製造元（BIO 101社）から供された手法を用い
て810 塩基対(bp)エリスロポエチンDNA フラグメントを
ゲルから分離した。プラスミド pBRgHuEPOは前述のLin
特許に記載があるよう導体に挿入したBamHI フラグメン
トのようなエリスロポイエチンゲノム遺伝子を含む。pB
RgHuEPO は又BstEII及びBglII で消化し、6517 bp ベク
ターフラグメントを回収した。この２個のフラグメント
の連結によってIGT1を得た。pEC-1 を構築するために、
pDSVL(Lin特許に記載があり、又図5Bに示す）をBamHI
で切断し、エリスロポエチンcDNAを含むIGT1から単離し
た2.8 キロベース(kb) BamHIフラグメントをこれに連結
した。

【００７０】インビトロ突然変異用一本鎖DNA を作出す
るために、pEC-1 をBamHI 及びBglII で切断し、820 bp
エリスロポエチン cDNA フラグメントを単離した。これ
をm13mp18 のBamHI サイトに連結しm13-EC-1を作出し
た。Kunkel等 Methods in Enzymol. 154，367 （1987
年）及び Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 （19
83年）により記載されている通りに、m13-EC-1に感染さ
せた大腸菌RZ1032株の上澄液から一本鎖DNA を回収し
た。インビトロ突然変異のために、約１μg の一本鎖DN
A 及び0.2 pmole の前述の合成プライマーの１種を６ml
の緩衝液（250 mMトリスpH7.8, 50mM MgCl₂及び50mMジ
チオスレイトール）と混合した。鋳型にプライマーをア
ニーリングをするために、反応容量を水で10μl に調整
し、この混合液を65℃で５分間加熱した後室温まで冷却
した。鎖延長反応のために、dTTP,dATP,dGTP,dCTP 及び
ATP （全て10μM ）の各2.5ml を加え、引き続き１μl
（１ユニット）大腸菌DNA ポリメラーゼ（クレノウフラ
グメント）及び１μl （１ユニット）のT4 DNAリガーゼ
を加えた。しかる後、この混合液を14℃で一晩保温し、
前述のMessing のように大腸菌JM 109 (Yanisch-Perron
等 Gene 33, 103 (1985 年））を形質転換するために用
いた。

【００７１】ディファレンシャル（differenfial）ハイ
ブリダイゼーション法による突然変異クローンを同定す
るために、普通寒天培地上のプラークをジーンスクリー
ンフィルター（ニューイングランドヌクレアー社）に移
した。このフィルターを加熱灯で乾燥させた後、1%SDS
を含む60℃の６×SSC 中で1 時間保温した。ハイブリダ
イゼーションのために、前記のオリゴヌクレオチドプラ
イマー（８pmoles）にT4ポリヌクレオチドキナーゼ及び
γ³²P 標識ATP で末端標識し、フィルターと共に、[Asn
¹²⁴] 突然変異については37℃で、[Asn⁴,Ser⁶] 突然
変異については55℃で、[Thr¹²⁵] 及び[Pro¹²⁴,Thr
¹²⁵] 突然変異については65℃で、及び[Asn⁹,Ser¹¹]
及び[Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵] 突然変異については70℃で 6×
SSC 、0.5%SDS及び100mg/mlサケ精子DNA 中で一晩保温
した。翌日、フィルターを室温にて６×SSC を用いて3
回洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。必要に応
じて、この後、本来のエリスロポエチンcDNA配列を有す
るプラークにハイブリダイセーションがほとんど又は全
く検出されなくなるまで、温度を上げてフィルターを6
×SSC で洗浄した。これらの条件下で陽性のハイブリダ
イセーションシグナルを示すクローンを同定し、JM 109
に再感染させて純粋なクローンを単離した。ジデオキシ
チェインターミネーション配列分析は、アスパラギン、
セリン、スレオニン及びプロリン残基への突然変異が存
在することを示した。[Asn⁴,Ser⁶],[Asn⁹,Ser¹¹],[A
sn⁶⁹],[Asn¹²⁴],[Asn¹²⁵],[Ser¹²⁷],[Asn¹⁶³,Ser
¹⁶⁵],[Thr¹²⁵] 及び[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵] の変化を担持
する二重鎖m13 EC-1 DNAは、煮沸法（Holmes等Anal.Bio
chem 117，193 (1981 年）により JM 109 形質転換細胞
から回収した。このDNA をBstEII及びXhoII で切断し、
810 bpエリスロポイエチンDNA フラグメントを単離し
た。pEC-1 は、BstII で切断し次にBglII で部分切断
し、その結果できたフラグメントの５′末端を、細菌ア
ルカリホスファターゼを用いて10 mM トリス、pH 8中で
60℃で60分間脱リン酸した。 810 bp BstEII-BglIIフラ
グメントを欠いた７kbベクターフラグメントを分離し、
上記のエリスロポエチンフラグメントに連結した。この
結果できたプラスミド（pEC-X と命名、ここでX は個々
の突然変異を表す）は、示した位置で変更したアミノ酸
残基を有するヒトエリスロポエチンを含む。

【００７２】ヒトエリスロポエチン配列及び[Asn⁴,Ser
⁶],[Asn⁹,Ser¹¹],[Asn⁶⁹],[Asn¹²⁴],[Asn¹²⁵,Ser
¹²⁷],[Asn¹⁶³,Ser¹⁶⁵],[Thr¹²⁵] 及び[Pro¹²⁴,Thr
¹²⁵]エリスロポエチンcDNAクローンに対応する類似体
のcDNAクローンは、エレクトロポレーションによりCOS-
1 細胞（ATCC No. CRL-1650)にトランスフェクトした。
COS-1 細胞は、半集密的皿から回収し、培地（5%牛胎児
血清及び 1% L-グルタミン／ペニシリン／ストレプトマ
イシン（アービンサイエンティフィク社）を含むダルベ
ッコ(Dulbecoo)の改変必須培地）で洗浄し、４×10⁶ce
lls/mlの密度で再懸濁させた。1ml の細胞を、エレクト
ロポレーションキュベット（バイオラッド社）に移し、
100 から200 μg の担体DNA 及びエリスロポエチン類似
体をコードした2 から20μg のプラスミドDNA の存在
下、バイオラッドジーンパルサー（Bio-Rad Gene Pulse
r 、TM）を用いて、25マイクロファラッド及び1600ボル
トでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーシ
ョンした細胞を、組織培養皿（直径60mm）当り２×10⁶
個で5 mlの培地中に接種した。接種の 2から4 時間後、
5ml の新鮮な培地で置き換えた。エレクトロポレーショ
ンの3 から5 日後、ならし（conditioned ）培地を集め
た。

【００７３】B.エリスロポエチン類似体の活性分析前述のEgrie 等の手法に従ってRIA を行った。エリスロ
ポエチン類似体のインビボ生物学的活性は、低酸素赤血
球増加症マウスバイオアッセイ（Cotes 等、前述）によ
り測定した。

【００７４】インビトロエリスロポエチン活性は、Isco
ve等J.Cell Physiol. 83, 309-320（1974年）により記
載されている赤芽球コロニー形成分析法を改変して測定
した。ヒト骨髄細胞由来の単核化細胞を、フィコール／
パクークッション（ficoll-paque cushion）上で部分精
製した後、プレーティングに先立ち吸着性細胞を除くた
めにIscoveの培地中で洗浄した。培養培地は、0.9%メチ
ルセルロースを含むが、牛血清アルブミンは含まなかっ
た。培養の８から10日後、赤芽球コロニーを計数した。

【００７５】セクションA に記載したように、COS 細胞
にトランスフェクトし発現したエリスロポエチン類似体
は、RIA 及び赤芽球コロニー形アッセイにより、未精製
のCOS 細胞上澄液中で分析した。ヒト由来配列のエリス
ロポエチンは、前記の分析により決定したRIA 活性に比
するインビトロ活性を有した。類似体の[Asn⁶⁹]EPO,[As
n¹²⁵,Ser¹²⁷]EPO, [Thr¹²⁵]EPO, 及び[Pro¹²⁴,Thr
¹²⁵]EPOは、RIA 活性に比するインビトロ活性を示し、
（セクションC で決定するように）追加炭水化物鎖を有
することを証明した。これらの類似体は、エリスロポエ
チン類似体をコードしているcDNAクローンをCHO 細胞に
トランスフェクトし、エリスロポエチン類似体を精製
し、精製類似体のインビボ生物学的活性を測定すること
により更に分析した。

【００７６】C.ウエスタンブロット分析セクションA に記載した通りにエリスロポエチン類似体
cDNAでトランスフェクトしたCOS 細胞から得た5-20 Uを
含む一定量の上澄液を、ウサギ抗エリスロポエチンポリ
クローナル抗体を用いて室温で一晩免疫沈降させた。リ
ン酸緩衝食塩水(PBS) に溶解させたプロテインＡ−セフ
ァロース1:1 の 20-80μl を免疫沈降物に加え、室温で
1 時間保温した。この試料を遠心し、PBS で洗浄し、特
に指示する場合は、ペレットをN-グリカナーゼで処理し
N-結合炭水化物鎖を除去した。この試料を15％SDS-ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により分析し、ニトロセル
ロースに移して、マウス抗エリスロポエチンモノクロー
ナル抗体の混合物を用いて、Burnette等 Anal. Bioche
m. 112, 195-203（1981年）及びElliot等 Gene 79,167-
180 （1989年）に記載されている通りにウエスタン分析
に供した。このような抗体の一つとして9G8AがElliot等
（1989年）Blood 74,Supp. 1, A.1228に記載されてい
る。

【００７７】[Asn⁶⁹]EPO及び[Asn¹²⁵,Ser¹²⁷]EPO cDN
A でトランスフェクトしたCOS 細胞上澄液の分析は、ヒ
ト由来配列のエリスロポエチンと比較して蛋白質のサイ
ズが増加していることを示した。このサイズの増加は、
追加N-結合炭水化物鎖を示唆している（図7 ）。[Thr
¹²⁵]EPO, 及び[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPO cDNA でトランス
フェクトしたCOS 細胞から得た上澄液のN-グリカナーゼ
を用いた処理は、ヒト由来配列のエリスロポエチンと比
較して蛋白質のサイズが増加していることを示した。こ
のサイズの増加は、追加O-結合炭水化物鎖を示唆してい
る（図8 ）。

【００７８】D.エリスロポエチン類似体イソフォームの
単離エリスロポエチン類似体[Thr¹²⁵]EPOは、セクションA
の記載通りに構築した。[Thr¹²⁵] 突然変異を担持する
810 bpのエリスロポエチンcDNAフラグメントは、[Thr
¹²⁵] 突然変異を含むプラスミドpEC をBstEII及びBglI
I で切断することにより単離し、pDS α２の誘導体であ
るpDECΔにこのフラグメントを連結した。pDS α２は、
参照により本明細書に含めた共通所有の米国特許出願番
号 501,904に記載されている。 pDEC Δは、以下の段階
によりpDS α２から誘導した: (1) pDS α２のHindIII 部位は、HindIII でpDS α2 DN
A を切断し、大腸菌DNA ポリメラーゼ（クレノウフラグ
メント）及びdNTPs でHindIII 付着末端を処理し、ブラ
ントエンド化したベクターに再連結することによって欠
落させた。この結果できたプラスミドがpDS α２ΔH で
ある。

【００７９】(2) pDS α２ΔH をSalIで切断し、これ
を、スプライスシグナルの３´末端に付加したSalIリン
カーを含むSV40スプライスシグナルを有する合成オリゴ
ヌクレオチドに連結した。合成オリゴヌクレオチドは、
以下の配列を有した。

【００８０】

【表５】

【００８１】この結果できたプラスミドがpDS α２ΔH
スプライスである。(3)pDSα2 ΔH スプライスは、SalI
で切断し、T4 DNAポリメラーゼ及びdNTPs で付着末端を
処理することによりブラントエンド化した。820 bp. Ba
mHI-BglII ヒトエリスロポエチンcDNAフラグメントは、
同じ方法によりブラントエンド化し、プラスミドに連結
した。この結果できたプラスミドがpDECである。

【００８２】(4)pDEC は、KpnI及びPvuII で切断し、リ
ョクトウ（mung bean ）ヌクレアーゼで付着末端を処理
することによりブラントエンド化した。切り出したKpnI
-PvuIIフラグメントを欠落させるために再連結し、この
結果できたプラスミドがpDECΔである。 [Thr¹²⁵] エ
リスロポエチンcDNAを含むプラスミドpDECΔをDHFR-欠
損CHO 細胞にトランスフェクトした。CHO 細胞でならし
た培地770 mlを１万ダルトン分子量カットオフのメンブ
レンを用いて濃縮し、10 mM トリス-HCl ,pH 8.6で最終
容量34 ml になるまで透析濾過した。濃縮液の一部(17
ml) を、同じ緩衝液で平衡化したQ-セファロースファー
ストフローカラム(5mlベッドボリューム）に供し、10 m
M トリス-HCl ,pH 8.6中の0-250 mM NaCl の直線勾配に
よって溶出させた。カラムフラクションの一部を、未処
理で又はN-グリカナーゼで切断して、SDS-PAGE又はIEF
で分析し、プール（2,3 及び４と命名）をフラクション
の炭水化物及び／又はイソフォームの組成に基づいて集
めた。各プールをビダク（Vydac) C4 カラム（214TPB20
30；直径１cm；1.8-2.5 mlベッドボリューム；0.34ml/
分）に供し、10 mM トリス-HCl, pH 7.0に溶解させた20
％エタノールのカラム容量の2 倍量で洗浄した。このカ
ラムを 20-94％エタノールの10 mM トリス-HCl, pH 7.0
の直線勾配で溶出した。プールを集め、10mMトリス-HC
l, pH 7.0で希釈し、Q-セファロースファーストフロー
カラムに供した。10 mM トリス-HCl，pH7.0 で洗浄した
後、試料を20 mM クエン酸ナトリウム、250 mMNaCl, pH
7.0で溶出させた。精製した[Thr¹²⁵] プールをIEF に
より分析し、図9 に示した。EPO類似体は、前述（Cotes
等、前述）したようにインビボ生物学的活性を分析し
た。

【００８３】以上に、本発明をその好ましい実施態様を
用いて説明したが、これらの態様に限定されるものでは
ない。特許請求の範囲に記載の思想及び範囲に包含され
る変形物及び等価物は本発明に含まれるものであり、本
発明はこのような変形物の及び等価物を全て含むように
最も広い解釈によるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】この図は、分離した組み換えエリスロポエチン
イソフォームの分析用等電点電気泳動写真である。ゲル
レーン1-11は、レーン１のより非酸性（高pI）からレー
ン11に於るより酸性（低pI）までのイソフォームを示
す。イソフォーム9-14の混合物を含む精製した組み換え
エリスロポエチンも、ゲルの左右両端のレーンに示され
る。

【図２Ａ】この図は、エリスロポエチンポリペプチドの
mg当りのユニットとして表される各イソフォームのイン
ビボ比活性と、エリスロポエチンイソフォーム当りのシ
アル酸の数の相関関係を示す。各エリスロポエチンイソ
フォーム濃度は、ブラッドフォード蛋白質アッセイによ
り決定した。

【図２Ｂ】この図は、エリスロポエチンポリペプチドの
mg当りのユニットとして表される各イソフォームのイン
ビボ比活性と、エリスロポエチンイソフォーム当りのシ
アル酸の数の相関関係を示す。各エリスロポエチンイソ
フォーム濃度は、280mm の吸収により決定した。

【図２Ｃ】この図は、エリスロポエチンポリペプチドの
mg当りのユニットとして表される各イソフォームのイン
ビボ比活性と、エリスロポエチンイソフォーム当りのシ
アル酸の数の相関関係を示す。各エリスロポエチンイソ
フォーム濃度はRIA により決定した。

【図３】この図は、条件の異なる陰イオン交換クロマト
グラフィーにより調製した組み換えエリスロポエチンイ
ソフォームの限定した混合物の分析用等電点電気泳動写
真である。1-6 のゲルレーンは、それぞれ、150mM 酢酸
pH 4.7, 150mM酢酸（非緩衝），200mM 酢酸 pH 4.7 ，
250mM 酢酸pH 4.7，300mM 酢酸 pH 4.7 又は300mM 酢酸
（非緩衝）でＱ−セファロース高速フローカラムを洗浄
した後高塩濃度溶出液で溶出したエリスロポエチンイソ
フォームを表す。 DEAE-アガロースクロマトグラフィー
をQ-セファロースクロマトグラフィーに代えることを除
いては前述のLai 等の実施例２に記載された手法を用い
て得たイソフォームの混合物を含む精製した組み換えエ
リスロポエチンも、ゲルの左端レーンに示される。

【図４】この図は、Q-セファロースカラムにかけた細胞
ならし培地をpH減少及びイオン強度増加勾配に供するこ
とにより達成した８ないし12個のエリスロポエチンイソ
フォームの分離を示す等電点電気泳動写真である。フラ
クション２からフラクション40までの偶数番号のフラク
ションを分析用等電点電気泳動に供した。DEAE-アガロ
ースクロマトグラフィーをQ-セファロースクロマトグラ
フィーに代えることを除いては前述のLai 等の実施例２
に記載された手法を用いて得たイソフォームの混合物を
含む精製した組み換えエリスロポエチンも、ゲルの左端
レーンに示される。

【図５】この図は、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配
列を示す。四角は、炭水化物鎖が結合するアスパラギン
残基を示し、星印は、炭水化物で修飾されるスレオニン
及びセリン残基を示す。実施例６の類似体に於て提供さ
れた追加グリコシレーション部位は、アスパラギン、セ
リン及びスレオニンへの突然変異により示される。

【図６Ａ】この図は、ヒトエリスロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミド生成に用いた一連のクローニ
ングステップを示す。この類似体は、図５に示すように
追加グリコシレーション部位を提供する変化したアミノ
酸を有する。

【図６Ｂ】この図は、ヒトエリスロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミド生成に用いた一連のクローニ
ングステップを示す。この類似体は、図５に示すように
追加グリコシレーション部位を提供する変化したアミノ
酸を有する。

【図６Ｃ】この図は、ヒトエリスロポエチン類似体の構
築及び分析用のプラスミド生成に用いた一連のクローニ
ングステップを示す。この類似体は、図５に示すように
追加グリコシレーション部位を提供する変化したアミノ
酸を有する。

【図７】この図は、ヒト配列エリスロポエチン及びエリ
スロポエチン類似体のCOS 細胞上澄液のウェスタンブロ
ット分析を示す。類似体の[Asn⁹,Ser¹¹], EPO，[As
n⁶⁹]EPO, [Asn¹²⁵,Ser¹²⁷]EPO，及び[Pro¹²⁴,Thr
¹²⁵]EPOは、実施例6 に記載した通りに構築される。追
加炭水化物鎖を含まない類似体の[Pro¹²⁵,Thr¹²⁷]EP
O，[Asn¹²⁶,Ser¹²⁸]EPO及び[Thr¹²⁵,Ser¹²⁷]EPOを
比較のために示す。

【図８】この図は、ヒト配列エリスロポエチン及びエリ
スロポエチン類似体のCOS 細胞上澄液のN-グリカナーゼ
処理後のウェスタンブロット分析を示す。類似体の[Thr
¹²⁵]EPO及び[Pro¹²⁴,Thr¹²⁵]EPOは、実施例6 に記載
した通りに構築した。類似体の[Val¹²⁶]EPO, [Pr
o¹²⁴]EPO, [Pro¹²⁵]EPO, [Thr¹²⁷]EPO, [Pro¹²⁵,Se
r¹²⁷]EPO及び[Thr¹²⁵,Ser¹²⁷]EPOを比較のために示
す。

【図９】この図は、[Thr¹²⁵] 突然変異を含むエリスロ
ポエチンcDNAでトランスフェクトしたCHO 細胞の成長を
支持した細胞培地をQ-セファロース及びC4逆相クロマト
グラフィーにかけることにより得たプール2,3 及び4 の
等電点電気泳動写真である。イソフォームの混合物を含
む精製した組み換えエリスロポエチンは、DEAE-アガロ
ースクロマトグラフィーをQ-セファロースクロマトグラ
フィーに代えたことを除いては前述のLai 等の実施例２
に記載した手法により得られ、これも、やはりゲルの左
右のレーンに示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者トーマス・エドワード・バーンアメリカ合衆国、メリーランド・20817、ベセダ、サバンナ・ドライブ・7718 (72)発明者ステイーブン・ジヨージ・エリオツトアメリカ合衆国、カリフオルニア・ 91320、サウザンド・オークス、ゴールデン・クレスト・アベニユー・1040 (56)参考文献特表昭61−501627（ＪＰ，Ａ) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．249（13）ｐ．4202−4206（1974) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．263（33）ｐ．17516−17521（1988) ＣｏｌｄＳｐｒ．Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 51，ｐ685−692（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳＷＰＩＣＡＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトエリスロポエチンよりも炭水化物鎖の
数が多く、かつ、エリスロポエチン活性を有するヒトエ
リスロポエチン類似体の製造方法であって、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列中にグリコシル化
部位の数の増加を生起させる１つ以上の変更をもつヒト
エリスロポエチン類似体をコードするＤＮＡを作製する
工程、ヒトエリスロポエチン類似体の発現を可能にするように
該ＤＮＡでトランスフェクトされた真核宿主細胞を生成
する工程、および該細胞を培地中に培養し、生成したヒ
トエリスロポエチン類似体を回収する工程、該回収されたヒトエリスロポエチン類似体から、1分子
あたりのシアル酸数が１０以上のイソフォーム混合物か
らなるヒトエリスロポエチン類似体を分離する工程を含
む方法。
【請求項２】真核宿主細胞がチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞であることを特徴とする請求項１に記
載の方法。