KR20080095868A - 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

간편성과 저비용성이 우수한 시알산의 제거 방법, 및 그것을 이용한 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법의 제공을 목적으로 한다. 본 발명의 시알산의 제거 방법은, 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 산성으로 하고, 또한 가열함으로써 에리스로포이에틴 분자에 결합되는 시알산을 제거하는 산성 가열 처리 공정을 포함한다. 또, 본 발명의 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법은, 본 발명의 시알산의 제거 방법에 의해, 에리스로포이에틴 분자에 결합되는 시알산을 제거하는 시알산 제거 공정을 포함하는 제조 방법이다.

Description

시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법{METHOD OF REMOVING SIALIC ACID AND PROCESS FOR PRODUCING ASIALOERYTHROPOIETIN}

본 발명은, 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법에 관한 것이다.

에리스로포이에틴(이하, EPO라고도 한다)은, 적혈구계 전구 세포의 분화, 증식을 촉진하는 기능을 갖고, 주로 신장에서부터 생성되는 산성 당단백질 호르몬이다. 혈액 중에 가장 풍부하게 존재하는 적혈구는, 일정 기간 기능한 후에 비장 등에서 파괴된다. 예를 들면, 인간에서는, 적혈구의 평균 수명은 약 120일이다. 한편, 적혈구는 골수로부터 끊임없이 공급되고, 말초의 전체 적혈구 수는, 정상적인 상태에서는 항상 일정하게 유지되고 있다. 에리스로포이에틴은, 이러한 생체 적혈구의 항상성 유지에 있어서 중심적인 역할을 담당하고 있다. 임상적으로는, 에리스로포이에틴은, 빈혈의 치료나 수술 전후의 관리에 이용되고 있다.

최근, 천연의 당쇄(糖鎖)를 갖는 에리스로포이에틴 대신에, 에리스로포이에틴에 결합된 시알산을 제거한 아시알로에리스로포이에틴을 임상적으로 이용하는 것이 검토되고 있다(예를 들면, 특허 문헌 1(WO2002/053580에 대응) 참조). 이 아시알로에리스로포이에틴은, 통상, 시알리다제 등의 효소에 의해 에리스로포이에틴을 처리하여 제조되는 것 외에, 시알릴트랜스퍼라제 결손 세포를 숙주 세포로서 이용함으로써 제조할 수 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조). 아시알로화된 에리스로포이에틴은, 간장에 존재하는 아시알로 당단백질 리셉터를 통해 신속하게 대사된다. 따라서, 투여 부위로부터 혈액 중으로 빠져나온 경우에도 적혈구 조혈을 일으키지 않고, 다혈(polycythemia)이나 혈압 상승이 장해가 되는 질환에 있어서도 임상 응용이 가능하다.

특허 문헌 1 : 일본국 특허공표 2005-502584호 공보

[발명이 해결하고자 하는 과제]

그러나, 상기 종래의 효소를 이용하는 시알산의 제거 방법은, 작업이 번잡하고 비용이 비싸진다는 문제가 있다. 또, 특수한 숙주 세포를 사용하는 방법도 마찬가지로 작업이 번잡해진다는 문제나, 비용이 비싸진다는 문제가 있다.

그래서, 본 발명은, 간편성과 저비용성이 우수한 시알산의 제거 방법, 및 그것을 이용한 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법의 제공을 목적으로 한다.

[과제를 해결하기 위한 수단]

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 시알산의 제거 방법은, 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산의 제거 방법으로서, 상기 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 산성으로 하고, 또한 가열하는 산성 가열 처리 공정을 포함하는 시알산의 제거 방법이다. 또는, 상기 산성 가열 처리 공정 후의 상기 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 중화하고, 또한 냉각하는 중화 냉각 처리 공정을 더 포함하는 시알산의 제거 방법이다.

또, 본 발명의 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법은, 본 발명의 시알산의 제거 방법에 의해, 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산을 제거하는 시알산 제거 공정을 포함하는 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법이다.

[발명의 효과]

본 발명자는, 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산을 제거하는 방법에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 에리스로포이에틴을 산성으로 하고, 또한 가열하는 것만으로 시알산을 제거할 수 있고, 또한, 그 생물학적 활성이 손상되지 않는 것을 발견하여, 본 발명에 도달하였다.

본 발명의 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법은, 간편성 및 저비용에 우수하기 때문에, 아시알로에리스로포이에틴을 간편하게 염가로 제조할 수 있다. 또, 본 발명의 제조 방법으로 제조되는 아시알로에리스로포이에틴은, 에리스로포이에틴에 비해 손색이 없는 세포 증식 자극 등의 생물학적 기능을 달성하기 때문에, 예를 들면, 치료나 의약 조성물의 제조 등의 의료 분야에서 널리 이용할 수 있다.

도 1은, 아시알로 EPO 및 천연형 EPO에 대해 SDS-PAGE를 행한 겔의 사진이다(실시예 1).

도 2는, 아시알로 EPO 및 천연형 EPO에 대해 IEF를 행한 겔의 사진이다(실시예 1).

도 3은, 천연형 EPO와 아시알로 EPO의 세포 증식 자극 기능을 비교한 그래프이다(실시예 1).

본 발명의 시알산의 제거 방법에 있어서, 상기 산성은 pH4.0 이하인 것이 바람직하고, 또, 상기 가열은, 상기 용액의 온도를 60℃ 이상으로 하는 가열인 것이 바람직하다.

본 발명의 시알산의 제거 방법에 있어서, 상기 산성 가열 처리 공정의 처리 시간은, 15분 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 시알산의 제거 방법은, 상기 산성 가열 처리 공정 후, 상기 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 중화하고, 또한 냉각하는 중화 냉각 처리 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 중화는, 상기 용액의 pH를 pH5.0∼pH10.0의 범위로 하는 중화인 것이 바람직하다. 또, 상기 냉각은, 상기 용액의 온도를 0℃∼50℃의 범위로 하는 냉각인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 「아시알로에리스로포이에틴(이하, 아시알로 EPO라고도 한다)」이란, 에리스로포이에틴(이하, EPO라고도 한다) 분자에 결합되어 있는 시알산이 제거된 EPO를 말한다.

통상, 재조합 동물 세포에 의해 생산되는 EPO 및 뇨 유래의 EPO 중 어느 것에 있어서나, EPO는 당쇄 구조가 다른 다양한 EPO를 포함하는 EPO 조성물로서 얻어진다. 시알산에 대해서도 동일하고, 상기 EPO 조성물 중의 EPO 분자에 부가되어 있는 시알산의 수는, 각각의 EPO 분자에 따라 다르지만, 통상, 1개의 EPO 분자에 11개∼15개의 시알산이 부가되어 있다. 본 발명에 있어서, 아시알로 EPO란, 이들 시알산을 적어도 1개 제거한 것이다. 상기 시알산의 제거에 의해 EPO로부터 제거되는 시알산의 수는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 모든 시알산을 제거해도 되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 시알산을 제거해도 된다. 본 발명에 있어서의 아시알로 EPO로서는, EPO 분자에 결합되는 시알산의 수가 10개 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5개 이하이며, 특히 바람직하게는 2개 이하이다.

또한, EPO 및 아시알로 EPO에 결합되는 시알산의 수는, EPO 조성물에 포함되는 EPO 1분자당의 평균수로 나타낼 수 있고, 그 1분자당의 시알산의 평균수는, 당업자에게 있어서 종래 공지의 방법으로 측정할 수 있다(예를 들면, 일본국 특허공개 평8-151398호, EP0428267호 공보). 예를 들면, EPO를 0.35M의 황산을 이용해 80℃, 30분간의 가수분해를 행하여 시알산을 모두 EPO로부터 절단하고, EPO의 단백질 및 시알산을 각각 정량하여, EPO의 1몰당의 시알산의 몰수를 산출하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 이용하는 EPO는, 어떠한 EPO라도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 고도로 정제된 EPO이다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 포유류 EPO, 특히 인간 EPO와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이 바람직하다.

상기 EPO의 제조 방법으로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 인간 유래의 추출물을 정제하여 천연의 인간 EPO를 얻는 방법(예를 들면, 일본국 특허공고 평1-38800호 공보(WO86/04068에 대응) 참조)이나, 혹은, 유전자 재조합법을 포함하는 유전자 공학적 수법에 의해 대장균, 이스트균, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), C127 세포, COS 세포, 골수종 세포, BHK 세포, 곤충 세포 등의 세포 내에 발현시켜, 여러 가지의 방법으로 추출해 분리 정제한 인간 EPO 등을 이용하는 방법을 들 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명에 있어서 사용하는 EPO는, 유전자 공학적 수법에 의해 제조된 EPO가 바람직하고, 포유 동물 세포, 특히 CHO 세포를 이용하여 제조된 EPO가 바람직하다(예를 들면, 일본국 특허공고 평1-44317호 공보(WO86/03520에 대응), Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810(1985) 참조).

상기 유전자 공학적 수법에 의해 제조된 EPO는, 천연 유래의 EPO와 아미노산 배열이 동일한 것, 혹은 상기 아미노산 배열 중의 1 또는 복수개의 아미노산을 결실(缺失), 치환, 부가 등을 한 것으로서, 천연 유래의 EPO와 동일한 생물학적 활성을 갖는 것을 포함한다. 아미노산의 결실, 치환, 부가 등은, 당업자이면 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 부위 특이적 변이 유발법(Gotoh, T. et al. (1995)Gene 152, 271-275;Zoller, M.J. and Smith, M. (1983)Methods Enzymol. 100, 468-500;Kramer, W. et al. (1984)Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456;Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987)Methods Enzymol. 154, 350-367;Kunkel, T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492;Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 이용하여, EPO의 아미노산 배열에 적절히 변이를 도입함으로써, EPO와 기능적으로 동일한 폴리펩티드를 조제할 수 있다. 또, 아미노산의 변이 는 자연계에 있어서도 발생할 수 있다. 일반적으로, 치환되는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄(側鎖)의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V ; 이상은 아미노산의 한 글자 표기이며, 이하 동일하다), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 유황 원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르본산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W) 등을 들 수 있다. 어떤 아미노산 배열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 등에 의해 수식된 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지할 수 있는 것은 이미 공지이다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1984)81, 5662-5666; Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research(1982)10, 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1982)79, 6409-6413).

본 발명에 있어서 사용하는 EPO는, EPO와 다른 단백질의 융합 단백질이어도 된다. 융합 폴리펩티드를 제작하기 위해서는, 예를 들면, EPO를 코드하는 DNA와, 다른 단백질을 코드하는 DNA를, 프레임이 일치되도록 연결하고, 이것을 발현 벡터에 도입하여, 숙주에서 발현시키면 된다. 상기 다른 단백질로서는, 특별히 제한되지 않는다. 또, 본 발명에 있어서 사용하는 EPO로서, 화학 수식한 EPO나 당쇄를 수식, 개변한 EPO 등을 사용해도 된다. 화학 수식한 EPO로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 비타민 B12 등의 무기 혹은 유기 화합물을 결합시킨 EPO 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 EPO로서, 분자 중의 아미노산이 수식된 EPO 등을 이용하는 것도 가능하다. EPO 분자 중의 아미노산의 수식으로서는, 예를 들면, 카르바밀화, 비오틴화, 아미딘화, 아세틸화, 구아니딘화 등을 들 수 있다.

다음에, 본 발명의 시알산의 제거 방법에 대해 설명한다.

본 발명의 시알산의 제거 방법은, EPO를 포함하는 용액을, 산성 또한 가열 조건 하에서 처리함으로써, EPO 분자에 결합되어 있는 시알산을 제거하는 산성 가열 처리 공정을 포함하는 방법이다.

상기 EPO를 포함하는 용액의 EPO의 농도로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.01mg/L∼100.0mg/L이고, 바람직하게는 0.05mg/L∼50.0mg/L이며, 보다 바람직하게는 1.0mg/L∼10.0mg/L이다.

상기 산성은, 예를 들면, pH4.0 이하이고, 바람직하게는 pH0.1∼pH4.0의 범위이며, 보다 바람직하게는 pH0.5∼pH3.0의 범위이고, 보다 더욱 바람직하게는 pH1.0∼pH2.5의 범위이다.

상기 EPO를 포함하는 용액을 상기 범위의 산성으로 하는 방법은, 특별히 제한되지 않고, 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있으며, 예를 들면, 염산 용액, 인산 용액, 아세트산 용액 등의 산성 용액을 상기 EPO를 포함하는 용액에 첨가하는 등으로 해서 행할 수 있다.

상기 가열은, 시알산을 제거하기 위해 상기 EPO를 포함하는 용액을 처리하기 위한 가열로서, 그 온도는, 예를 들면, 60℃ 이상이고, 바람직하게는 60℃∼100℃이며, 보다 바람직하게는 70℃∼90℃이고, 보다 더욱 바람직하게는 75℃∼85℃이다.

상기 산성 가열 처리 공정에 있어서, 상기 EPO를 포함하는 용액을 산성으로 하는 공정과 가열하는 공정의 순서는 특별히 제한되지 않고, 상기 EPO를 포함하는 용액을 산성으로 한 후 가열해도 되고, 상기 EPO를 포함하는 용액을 가열한 후 산성으로 해도 되며, 또는, 산성으로 하는 공정과 가열하는 공정을 동시에 행해도 된다. 이들 중에서도, 본 발명에 있어서는, 상기 EPO를 포함하는 용액을 산성으로 하는 공정 뒤에 가열하는 공정을 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 시알산의 제거 방법에 있어서, EPO 분자에 결합된 시알산을 제거하기 위한 상기 산성 가열 처리 공정의 처리 시간은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 15분 이상이고, 바람직하게는 30분 이상이며, 보다 바람직하게는 45분 이상, 보다 더욱 바람직하게는 60분 이상이다. 상기 처리 시간의 상한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 24시간이고, 바람직하게는 360분이며, 더욱 바람직하게는 120분이다.

본 발명의 시알산의 제거 방법은, 상기의 산성 가열 처리 공정 후, 상기 EPO를 포함하는 용액을 중화하고, 냉각하는 중화 냉각 처리 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 중화는, 상기 용액의 pH를, 예를 들면, pH5.0∼pH10.0의 범위로 하는 중화로서, 상기 중화의 pH는, 바람직하게는 pH6.0∼pH9.0이고, 보다 바람직하게는 pH6.5∼pH7.5이다.

상기 EPO를 포함하는 용액을 중화하는 방법은, 특별히 제한되지 않고, 당업자에게 공지된 방법으로 행할 수 있으며, 예를 들면, 수산화나트륨 용액 등의 알칼리성 용액을 상기 시알산 제거 공정 후의 용액에 첨가하는 등으로 해서 행할 수 있다.

상기 냉각은, 상기 용액의 온도를, 예를 들면, 0℃∼50℃의 범위로 하는 냉각으로서, 바람직하게는 0℃∼40℃이고, 더욱 바람직하게는 0℃∼30℃이다.

상기 중화 냉각 처리 공정에 있어서, 상기 EPO를 포함하는 용액을 중화하는 공정과 냉각하는 공정의 순서는 특별히 제한되지 않고, 상기 EPO를 포함하는 용액을 중화한 후 냉각해도 되고, 냉각한 후 중화해도 되며, 또는, 중화하는 공정과 냉각하는 공정을 동시에 행해도 된다. 이들 중에서도, 본 발명에 있어서는, 중화하는 공정 뒤에 냉각하는 공정을 하는 것이 바람직하다.

다음에, 본 발명의 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법에 대해 설명한다.

본 발명의 아시알로 EPO의 제조 방법은, 본 발명의 시알산의 제거 방법에 의해, 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산을 제거하는 시알산 제거 공정을 포함하는 제조 방법이다.

상기 시알산 제거 공정에 있어서의, EPO를 포함하는 용액을 산성으로 하고, 또한 가열하는 처리 조건, 그 방법 및 그 순서, 및 처리 시간은, 전술한 바와 같다.

동일하게, 상기 시알산 제거 공정에 있어서의, EPO를 포함하는 용액을 중화 하고, 또한 냉각하는 처리 조건, 그 방법 및 그 순서는, 전술한 바와 같다.

상기 시알산 제거 공정에 의해 얻어진 아시알로 EPO 함유 용액 중의 아시알로 EPO는, 예를 들면, 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절히 정제할 수 있고, 고순도의 아시알로 EPO를 얻을 수 있다.

본 발명의 아시알로 EPO의 제조 방법에 의해 제조되는 아시알로 EPO는, EPO와 동등하게 생물학적 활성을 갖기 때문에, 예를 들면, 의약 조성물이나 시약 등에 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서, EPO와 동등한 생물학적 활성이란, EPO가 갖는 활성으로서, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 세포 증식 자극 활성, 세포·조직의 재생 촉진, 세포·조직의 보호 활성 등을 들 수 있다.

아시알로 EPO를 의약 조성물로 하는 경우, 필요에 따라, 현탁화제, 용해 보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 유황 함유 환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가해도 된다.

상기 현탁화제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 메틸셀룰로오스, 폴리소르베이트 80, 히드록시에틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스분말, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등을 들 수 있다.

상기 용해 보조제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리소르베이트 80, 니코틴산아미드, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 마크로골(macrogol), 피마자유 지방산 에틸에스테르 등을 들 수 있 다.

상기 안정화제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 덱스트란 40, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 아황산나트륨, 메타아황산나트륨 등을 들 수 있다. 또, 상기 안정화제로서, 어떤 종류의 아미노산을 첨가할 수도 있다(예를 들면, 일본국 특허공개 평10-182481호 공보 참조). 안정화제로서 첨가되는 아미노산에는, 예를 들면, 유리(遊離)의 아미노산, 그 나트륨염, 칼륨염, 염산염 등의 염 등이 포함된다. 상기 아미노산은, 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있고, 그 종류는 특별히 제한되지 않지만, 바람직한 아미노산으로서는, 류신, 트립토판, 세린, 글루타민산, 아르기닌, 히스티딘, 리신을 들 수 있다.

상기 등장화제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, D-만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다.

상기 보존제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 파라옥시 안식향산 메틸, 파라옥시 안식향산 에틸, 소르빈산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.

상기 흡착방지제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌옥사이드·프로필렌옥사이드 공중합체, 히드록시프로필셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다.

상기 계면활성제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 전형적으로는, 비이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 천연계의 계면활성제 등을 들 수 있다. 상기 비이 온 계면활성제로서는, 예를 들면, 소르비탄모노카프릴레이트, 소르비탄모노라우레이트, 소르비탄모노팔미테이트 등의 소르비탄지방산에스테르 ; 글리세린모노카프릴레이트, 글리세린모노미리스테이트, 글리세린모노스테아레이트 등의 글리세린지방산에스테르 ; 데카글리세르모노스테아레이트, 데카글리세르디스테아레이트, 데카글리세릴모노리놀레이트 등의 폴리글리세린지방산에스테르 ; 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄 트리올레이트, 폴리옥시에틸렌소르비탄트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르 ; 폴리옥시에틸렌소르비톨테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌소르비톨테트라올레이트 등의 폴리옥시에틸렌소르비톨지방산에스테르 ; 폴리옥시에틸렌글리세린모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌글리세린지방산에스테르 ; 폴리에틸렌글리콜디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜지방산에스테르 ; 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 등의 폴리옥시에틸렌알킬에테르 ; 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌프로필에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르 ; 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 ; 폴리옥시에틸렌피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 ; 폴리옥시에틸렌소르비톨밀랍 등의 폴리옥시에틸렌밀랍 유도체 ; 폴리옥시에틸렌라놀린 등의 폴리옥시에틸렌라놀린 유도체 ; 폴리옥시에틸렌스테아린산아미드 등의 폴리옥시에틸렌지방산아미드 등의 HLB6∼18을 갖는 것 등을 들 수 있다. 상기 음이온 계면활성제로서는, 예를 들면, 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등의 탄소 원자수 10∼18의 알킬기를 갖는 알킬황산염 ; 폴리옥시에틸렌라우릴황산나트륨 등의 에틸렌옥시드의 평균 부가 몰수가 2∼4이고 알킬기의 탄소 원자수가 10∼18인 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염 ; 라우릴술포숙신산에스테르나트륨 등의 알킬기의 탄소 원자수가 8∼18인 알킬술포숙신산에스테르염 등을 들 수 있다. 상기 천연계의 계면활성제로서는, 예를 들면, 레시틴, 글리세로인지질 ; 스핑고미엘린 등의 스핑고인지질 ; 탄소 원자수 12∼18의 지방산의 자당지방산에스테르 등을 들 수 있다. 이들 계면활성제는, 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가해도 된다. 이들 중에서도 바람직한 계면활성제로서는, 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르로서, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록 상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌글리콜도 바람직하다.

상기 유황 함유 환원제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 탄소 원자수 1∼7의 티오알칸산 등의 술프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.

상기 산화방지제로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산토코페롤, L-아스코르빈산 및 그 염, L-아스코르빈산팔미테이트, L-아스코르빈산스테아레이트, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 갈산트리아밀(triamyl gallate), 갈산프로 필(propyl gallate), 혹은, 에틸렌디아민4아세트산2나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제 등을 들 수 있다.

또한, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 탄산수소나트륨 등의 무기염이나, 구연산나트륨, 구연산칼륨, 아세트산나트륨 등의 유기산 등의 통상 첨가되는 성분을 첨가해도 된다.

상기 아시알로 EPO를 포함하는 의약 조성물을 투여하는 경우, 그 투여량은, 예를 들면, 아시알로 EPO가, 0.001μg/kg/일∼1000μg/kg/일이고, 바람직하게는 0.01μg/kg/일∼100μg/kg/일이며, 더욱 바람직하게는 0.1μg/kg/일∼30μg/kg/일이다. 단, 투여량은 이것에 한정되지 않고, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상, 투여 경로 등을 고려하여 의사에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 그 밖의 양태로서, 본 발명의 아시알로 EPO의 제조 방법에 의해 아시알로 EPO를 제조하는 공정을 포함하는 아시알로 EPO 함유 의약 조성물의 제조 방법, 그것에 의해 제조된 상기 의약 조성물, 및 상기 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법, 예를 들면, 빈혈의 치료나 수술 전후의 관리의 방법을 포함할 수 있다.

이하에, 실시예에 의해 본 발명을 더 설명한다.

실시예 1

(아시알로 EPO의 제조)

190μL의 천연형의 EPO를 포함하는 용액(1300μg/mL)을 준비하고, 상기 용액에, 1.0N의 HCl를 10μL 첨가한 후, 80℃로 가열하여 60분간 인큐베이트함으로써 상기 EPO에 결합되는 시알산을 제거하였다. 그 후, 5.0N의 NaOH을 2.0μL 첨가하 여 중화함과 더불어, 실온까지 냉각하여, 아시알로 EPO를 포함하는 용액을 얻었다. 상기 HCl 첨가 후의 용액의 pH는 1.0이고, 상기 NaOH 첨가 후의 용액의 pH는 7.0이었다. 또한, 상기 천연형 EPO는, EPO 유전자가 도입된 CHO 세포를 배양하여 얻어진 것이다.

천연형 EPO와 시알산의 제거 후의 아시알로 EPO의 분자량 및 등전점을, 각각, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동(SDS-PAGE) 및 등전점 전기 영동(IEF)을 이용하여 확인하였다. 그 결과를, 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1은, SDS-PAGE 후에 단백질의 염색을 행한 겔의 사진이지만, 이 도면에 나타낸 바와 같이, 아시알로 EPO의 분자량은, 시알산의 제거 처리 전의 천연형 EPO보다 감소하였다. 또, 도 2는, IEF 후에 단백질의 염색을 행한 겔의 사진이지만, 이 도면에 나타낸 바와 같이, 시알산의 제거 처리 전의 천연형 EPO의 등전점이 4.55 미만이었던 것에 반해, 시알산의 제거 처리 후의 아시알로 EPO의 등전점은 7.35 이상이었다. 이들 변화는, EPO 분자로부터 시알산이 제거된 것과 일치한다. 또, 제조된 상기 아시알로 EPO의 1분자당의 시알산의 평균수는 0이었다.

이와 같이 제조된 아시알로 EPO의 생물학적 활성을, 상기 천연형 EPO의 생물학적 활성과 비교하기 위해, EPO 의존성 세포주의 증식 자극 활성을 지표로 하여 검토하였다. 또한, 본 시험에 이용한 AS-E2 세포는, 인간 백혈병 환자의 골수 세포로부터 수립된 EPO 수용체 발현 세포주이고, EPO 비존재 하에서는 생존할 수 없는 특징을 갖고 있다. 상기 아시알로 EPO와 상기 천연형 EPO를 각각 첨가하여, 세포 증식에 주는 영향을 WST-1 분석에 의해 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸 다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, 세포 증식 자극 기능에 대해, 양자 모두 동일한 기능을 갖고 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 시알산의 제거 방법 및 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법은, 간편하고 저비용으로 행할 수 있기 때문에, 예를 들면, 의약 조성물의 제조에 이용할 수 있고, 널리 의료 분야에 유용하다.

Claims (8)

1. 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산의 제거 방법으로서, 상기 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 산성으로 하고, 또한 가열하는 산성 가열 처리 공정을 포함하는 시알산의 제거 방법.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 산성 가열 처리 공정 후의 상기 에리스로포이에틴을 포함하는 용액을 중화하고, 또한 냉각하는 중화 냉각 처리 공정을 더 포함하는 시알산의 제거 방법.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,

   상기 산성이 pH4.0 이하인 시알산의 제거 방법.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 가열이, 상기 용액의 온도를 60℃ 이상으로 하는 가열인 시알산의 제거 방법.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 산성 가열 처리 공정의 처리 시간이 15분 이상인 시알산의 제거 방법.
6. 청구항 2 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 중화가, 상기 용액의 pH를 pH5.0∼10.0의 범위로 하는 중화인 시알산의 제거 방법.
7. 청구항 2 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 냉각이, 상기 용액의 온도를 0∼50℃의 범위로 하는 냉각인 시알산의 제거 방법.
8. 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 시알산의 제거 방법에 의해, 에리스로포이에틴에 결합되어 있는 시알산을 제거하는 시알산 제거 공정을 포함하는 아시알로에리스로포이에틴의 제조 방법.

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