CN101365719A - 唾液酸的去除方法及去唾液酸促红细胞生成素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简易性和低成本性优异的唾液酸的去除方法、及用该方法制备去唾液酸促红细胞生成素的方法。本发明的唾液酸去除方法包括使含促红细胞生成素的溶液呈酸性，并且进行加热，从而去除结合在促红细胞生成素分子上的唾液酸的酸性加热处理工序。另外，本发明的去唾液酸促红细胞生成素的制备方法包括通过本发明的唾液酸的去除方法，将结合在促红细胞生成素分子上的唾液酸去除的唾液酸去除工序。

Description

唾液酸的去除方法及去唾液酸促红细胞生成素的制备方法

技术领域

本发明涉及唾液酸的去除方法及去唾液酸促红细胞生成素的制备方法。

背景技术

促红细胞生成素(以下也称为“EPO”)具有促进红细胞系前体细胞的分化、增殖的功能，是主要从肾脏产生的酸性糖蛋白激素。血液中存在最为丰富的红细胞在发挥一定时期功能后在脾脏等被破坏。例如，在人体中，红细胞的平均寿命是大约120天。另一方面，红细胞从骨髓源源不断地提供出来，末梢的总红细胞数目在正常状态下常常保持一定。促红细胞生成素在维持这样的生物体的红细胞的永久性中担任重要的作用。在临床上，促红细胞生成素被用于贫血的治疗以及术前术后的管理。

近年来，将去除了结合在促红细胞生成素上的唾液酸的去唾液酸促红细胞生成素代替天然的具有糖链的促红细胞生成素，并用于临床的相关问题正处于研究中(例如，参见专利文献1(对应于WO2002/053580))。该去唾液酸促红细胞生成素通常除了通过用唾液酸酶等酶处理促红细胞生成素来制备外，也可用唾液酸转移酶缺损细胞作为宿主细胞来制备(例如，参见专利文献1)。经去唾液酸化的促红细胞生成素由存在于肝脏的去唾液酸糖蛋白受体介导，快速被代谢掉。因此，即使在从给药部位向血液中漏出的情况下，也不会引起红细胞造血，在即使是以多血及血压升高为障碍的疾病中进行临床应用也是可能的。

专利文献1：特表2005-502584号公报。

但是，上述现有的使用酶的唾液酸的去除方法存在操作复杂、成本高的问题。而且，使用特殊宿主细胞的方法也同样地存在操作复杂、成本高的问题。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种简易性、低成本性优良的唾液酸的去除方法，及用该方法制备去唾液酸促红细胞生成素的方法。

为了实现上述目的，本发明的唾液酸的去除方法是结合在促红细胞生成素上的唾液酸的去除方法，其包括使含上述促红细胞生成素的溶液呈酸性、并且进行加热的酸性加热处理工序。而且，还进一步包括在上述酸性加热处理工序后中和上述含促红细胞生成素的溶液、并且进行冷却的中和冷却处理工序。

并且，本发明的去唾液酸促红细胞生成素的制备方法是包括通过本发明的唾液酸的去除方法来去除结合在促红细胞生成素上的唾液酸的唾液酸去除工序的去唾液酸促红细胞生成素的制备方法。

本发明人就去除结合在促红细胞生成素上的唾液酸的方法进行了反复的锐意研究，结果发现，使促红细胞生成素呈酸性、并且仅加热即可去除唾液酸，更进一步发现其生物学活性并没有失去，从而达成了本发明。

本发明的唾液酸的去除方法及去唾液酸促红细胞生成素的制备方法，由于简易性和低成本性优异，因此能够简易、廉价地制备去唾液酸促红细胞生成素。而且，用本发明的制备方法制备的去唾液酸促红细胞生成素，因为能够实现与促红细胞生成素相比毫不逊色的细胞增殖刺激等生物学功能，因此，能够广泛地用于例如治疗及医药组合物的制备等医疗领域中。

附图说明

图1是去唾液酸EPO及天然型EPO进行了SDS-PAGE的凝胶的照片(实施例1)。

图2是去唾液酸EPO及天然型EPO进行了IEF的凝胶的照片(实施例1)。

图3是比较天然型EPO和去唾液酸EPO的细胞增殖刺激功能的曲线图(实施例1)。

具体实施方式

在本发明的唾液酸的去除方法中，上述酸性优选是pH4.0以下，而且，上述加热优选是将上述溶液的温度加热到60℃以上。

在本发明的唾液酸的去除方法中，上述酸性加热处理工序的处理时间优选是15分钟以上。

本发明的唾液酸的去除方法优选在上述酸性加热处理工序后进一步包括中和上述含促红细胞生成素的溶液、并且进行冷却的中和冷却处理工序。

上述中和优选将上述溶液的pH中和至pH5.0～10.0的范围内。而且，上述冷却优选将上述溶液的温度冷却至0℃～50℃的范围内。

在本发明中，“去唾液酸促红细胞生成素(以下也称为去唾液酸EPO)”是指去除了结合在促红细胞生成素(以下也称为EPO)分子上的唾液酸的EPO。

通常，在从重组动物细胞生产的EPO和从尿中获得的EPO中的任意一个，EPO均作为含有不同糖链结构的多种EPO的EPO组合物而获得。对于唾液酸也是同样，虽然加成在上述EPO组合物中的EPO分子上的唾液酸的数目根据各个EPO分子的不同而不同，但通常1个EPO分子上加成有11个～15个唾液酸。在本发明中，去唾液酸EPO是指这些唾液酸中至少去除了一个的物质。通过上述唾液酸的去除从EPO去除的唾液酸的数目没有特别的限制，例如可以去除全部的唾液酸，也可以除去1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个唾液酸。作为本发明的去唾液酸EPO，优选结合在EPO分子上的唾液酸的数目是10个以下，更优选是5个以下，特别优选是2个以下。

再者，结合在EPO及去唾液酸EPO上的唾液酸的数目可以用EPO组合物中含有的每1分子EPO的平均数来表示，其每1分子的唾液酸的平均数对于本领域技术人员来说，用现有公知的方法能够测定(例如，特开平8-151398号、EP0428267号公报)。例如，可以列举出下述方法等：将EPO用0.35M的硫酸在80℃进行30分钟的水解，将唾液酸全部从EPO切下，分别定量EPO的蛋白质及唾液酸，计算每1摩尔EPO的唾液酸的摩尔数。

本发明中使用的EPO虽然无论什么样的EPO均可使用，但是优选是高度精制了的EPO。更具体地，例如优选是哺乳类EPO、特别优选人EPO和实质上具有相同生物学活性的物质。

作为上述EPO的制备方法，没有特别的限制，例如可以列举出将来自人的提取物精制而获得天然的人EPO的方法(例如、参见特公平1-38800号公报(对应于WO86/04068))，或者使用通过包括基因重组法的基因工程方法使之在大肠杆菌、酵母菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等细胞内表达，并采用各种方法提取、分离精制而得到的人EPO等的方法。这些方法当中，在本发明使用的EPO，优选为通过基因工程的方法制备的EPO、优选为使用哺乳动物细胞、尤其优选使用CHO细胞制备的EPO(例如，参见特公平1-44317号公报(对应于WO86/03520))，Kenneth Jacobs et al.，Nature，313，806-810(1985))。

通过上述基因工程的方法制备的EPO包括和天然来源的EPO的氨基酸序列相同的物质、或者是上述氨基酸序列中的1个或多个氨基酸发生了缺失、置换、增加等、且具有与天然来源的EPO相同的生物学活性的物质。氨基酸的缺失、置换、增加等是本领域技术人员可以通过公知的方法进行的。例如、用部位特异性突变诱发法(Gotoh，T.et al.(1995)Gene152，271-275；Zoller，M.J.and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.and Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等、通过向EPO的氨基酸序列中导入适当的突变、能够制备与EPO功能相同的多肽。而且，氨基酸的突变在自然界也可发生。一般地，被置换的氨基酸残基优选置换为保持氨基酸侧链性质的其它的氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以列举出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V；以上是用一个字母来表示氨基酸，下文相同)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含有硫原子的侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱侧链的氨基酸(R、K、H)、具有芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)等。具有通过对某个氨基酸序列上的1个或多个氨基酸残基的缺失、增加、置换等而经修饰的氨基酸序列的多肽能够保持其生物学活性已是公知的(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.& Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。

本发明中使用的EPO也可以是EPO与其它蛋白质的融合蛋白质。制备融合多肽时，例如将编码EPO的DNA和编码其它蛋白质的DNA按照框架(日文原文为：フレ—ム)一致的方式进行连接，导入表达这些DNA的载体中，在宿主中使之表达即可。作为上述其它的蛋白质，没有特别的限制。而且，作为本发明中使用的EPO，也可以使用经化学修饰的EPO及糖链经修饰、改变的EPO等。作为经化学修饰的EPO，例如可以列举出结合了聚乙二醇、维生素B12等有机或无机化合物的EPO等。另外，作为本发明中使用的EPO，还可以使用分子中的氨基酸经修饰的EPO等。作为EPO分子中的氨基酸的修饰，例如可以列举出氨基甲酰化、生物素化、脒化、乙酰化、胍化等。

下面，就本发明的唾液酸的去除方法进行说明。

本发明的唾液酸的去除方法包括将含EPO的溶液在酸性且加热条件下进行处理、从而去除结合在EPO分子上的唾液酸的酸性加热处理工序。

上述含EPO溶液的EPO浓度没有特别的限制，例如是0.01mg/L～100.0mg/L，优选是0.05mg/L～50.0mg/L，更优选是1.0mg/L～10.0mg/L。

上述酸性例如是pH4.0以下，优选是pH0.1～pH4.0的范围，更优选是pH0.5～pH3.0的范围，更进一步优选是pH1.0～pH2.5的范围。

将上述含EPO的溶液调至上述酸性范围的方法没有特别的限制，可以采用本领域技术人员公知的方法进行，例如可以将盐酸溶液、磷酸溶液、醋酸溶液等酸性溶液添加到上述含EPO的溶液中等来进行。

上述加热是为了去除唾液酸而处理上述含EPO的溶液的加热，其温度例如是60℃以上，优选是60℃～100℃，更优选是70℃～90℃，更进一步优选是75℃～85℃。

在上述酸性加热处理工序中，将上述含EPO的溶液调成酸性的工序和加热工序的顺序没有特别的限制，可以将上述含EPO的溶液调成酸性后加热，也可在将上述含EPO的溶液加热后调成酸性，或者，调成酸性的工序和加热工序也可同时进行。其中，在本发明中，优选在将上述含EPO的溶液调成酸性的工序后进行加热的工序。

在本发明的唾液酸的去除方法中，为了去除结合在EPO分子上的唾液酸的上述酸性加热处理工序的处理时间没有特别的限制，例如是15分钟以上，优选是30分钟以上，更优选是45分钟以上，更进一步地优选是60分钟以上。上述处理时间的上限没有特别的限制，例如是24小时，优选是360分钟，更优选是120分钟。

在本发明的唾液酸的去除方法中，优选上述酸性加热处理工序后进一步包括中和上述含EPO的溶液、并且进行冷却的中和冷却处理工序。

上述中和是将上述溶液的pH例如调至pH5.0～pH10.0的范围的中和，上述中和的pH优选是pH6.0～pH9.0，更优选是pH6.5～pH7.5。

中和上述含EPO的溶液的方法没有特别的限制，可以采用本领域技术人员公知的方法进行，例如，可以将氢氧化钠溶液等碱性溶液加到上述唾液酸去除工序后的溶液中等来进行。

上述冷却是将上述溶液的温度例如调至0℃～50℃的冷却，优选是0℃～40℃，更优选是0℃～30℃。

在上述中和冷却处理工序中，中和上述含EPO的溶液的工序和冷却工序的顺序没有特别的限制，可以在中和上述含EPO的溶液后冷却，也可以在冷却后中和，或者，中和工序和冷却工序也可同时进行。其中，本发明中，优选中和工序后进行冷却的工序。

下面，就本发明的去唾液酸促红细胞生成素的制备方法进行说明。

本发明的去唾液酸EPO的制备方法包括通过本发明的唾液酸的去除方法来去除结合在促红细胞生成素上的唾液酸的唾液酸去除工序。

上述唾液酸去除工序中，使含EPO的溶液呈酸性、并且加热的处理条件，其方法及它们的顺序以及处理时间，如前所述。

同样，上述唾液酸去除工序中，中和含EPO的溶液、并且冷却的处理条件，其方法及它们的顺序，如前所述。

通过上述唾液酸去除工序得到的含去唾液酸EPO的溶液中的去唾液酸EPO例如可以通过本领域技术人员公知的方法适当精制，从而得到高纯度的去唾液酸EPO。

通过本发明的去唾液酸EPO的制备方法制备的去唾液酸EPO，因为具有与EPO相同的生物学活性，例如可以用于医药组合物或试剂等中。本发明中，与EPO具有相同的生物学活性是指EPO具有的活性，没有特别的限制，例如可以列举出细胞增殖刺激活性，促进细胞、组织的再生，细胞、组织的保护活性等。

将去唾液酸EPO制成医药组合物时，必要时，可以适当地加入混悬剂、助溶剂、稳定剂、等渗剂、保存剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调节剂、止痛剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。

上述混悬剂没有特别的限制，例如可以列举出甲基纤维素、聚山梨酸酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯等。

上述助溶剂没有特别的限制，例如可以列举出聚氧乙烯固化蓖麻油、聚山梨酸酯80、烟酰胺、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。

上述稳定剂没有特别的限制，例如可以列举出葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等。而且，作为上述稳定剂，也可加入某种氨基酸(例如，参见特开平10-182481号公报)。作为稳定剂添加的氨基酸包括例如游离的氨基酸、其钠盐、钾盐、盐酸盐等盐等。上述氨基酸可以添加1种或2种以上的组合，对于其种类没有特别的限制，作为优选的氨基酸，可以列举出亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸。

上述等渗剂没有特别的限制，例如可以列举出D-甘露醇、山梨糖醇等。

上述保存剂没有特别的限制，例如可以列举出对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。

上述防吸附剂没有特别的限制，例如可以列举出人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷-环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚乙二醇等。

上述表面活性剂没有特别的限制，典型地可以列举出非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂，天然系表面活性剂等。上述非离子表面活性剂例如可以列举出具有HLB6-18的物质等，如脱水山梨糖醇单辛酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯等脱水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十聚甘油单硬脂酸酯、十聚甘油二硬脂酸酯、十聚甘油单亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯固化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯固化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等。上述阴离子表面活性剂例如可以列举出十六烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等氧乙烯的平均加成摩尔数为2-4、烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基丁二酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基磺基丁二酸酸酯盐等。上述天然系的表面活性剂例如可以列举出卵磷脂、甘油磷脂、神经鞘髓磷脂等鞘磷脂；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。这些表面活性剂也可一种或2种以上组合添加。其中优选的表面活性剂是聚山梨酸酯20、40、60或80等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、特别优选聚山梨酸酯20和80。另外，也优选以泊洛沙姆(Pluronic F-68(注册商标)等)为代表的聚氧乙烯聚丙二醇。

上述含硫还原剂没有特别的限制，例如可以列举出N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数为1～7的硫代烷酸等含有巯基的物质等。

上述抗氧化剂没有特别的限制，例如可以列举出异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基联茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯、或者乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂等。

另外，还可加入常用的添加成分如氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐以及柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机酸等。

将含有上述去唾液酸EPO的医药组合物给药时，其给药量，例如去唾液酸EPO是0.001μg/kg/日～1000μg/kg/日，优选是0.01μg/kg/日～100μg/kg/日，更优选是0.1μg/kg/日～30μg/kg/日。但是，给药量并不限于这些，可以由医生根据患者的年龄、体重、性别、症状以及给药途径等考虑决定。因此，本发明的其它实施方式还可以包括：包括通过本发明的去唾液酸EPO的制备工艺来制备去唾液酸EPO的工序的含去唾液酸EPO医药组合物的制造方法、通过该方法制备的上述医药组合物、以及包括投予上述医药组合物的治疗方法，例如贫血的治疗和术前术后的管理方法。

下面，通过实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

(去唾液酸EPO的制备)

准备190μL含有天然型的EPO的溶液(1300μg/mL)，在上述溶液中加入1.0N的HCl 10μL，然后加热至80℃，并孵育60分钟，从而去除结合在上述EPO上的唾液酸。之后，加入2.0μL 5.0N的NaOH进行中和，同时冷却至室温，得到含有去唾液酸EPO的溶液。上述HCl加入后的溶液的pH是1.0，上述NaOH加入后的溶液的pH是7.0。此外，上述天然型EPO是通过培养导入了EPO基因的CHO细胞而获得的。

天然型EPO和唾液酸去除后的去唾液酸EPO的分子量及等电点可以分别用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)及等电点电泳(IEF)进行确认。其测定结果分别见图1和图2。图1是SDS-PAGE后进行了蛋白质染色的凝胶的照片，如图1所示，去唾液酸EPO的分子量与唾液酸去除处理前的天然型EPO相比减少了。图2是IEF后进行了蛋白质染色的凝胶的照片，如图2所示，唾液酸去除处理前的天然型EPO的等电点不足4.55，与此相对，唾液酸去除处理后的去唾液酸EPO的等电点在7.35以上。这些变化与从EPO分子中唾液酸的去除相一致。另外，制备后的上述去唾液酸EPO的每1分子的唾液酸的平均数目是0。

为了将如此制备的去唾液酸EPO的生物活性与上述天然型EPO的生物学活性进行比较，以EPO依赖性细胞株的增殖刺激活性作为指标进行了研究。本试验中使用的AS-E2细胞是从人白血病患者的骨髓细胞中建立的EPO受体表达细胞株，其具有在EPO非存在下不能生存的特点。分别加入上述去唾液酸EPO和上述天然型EPO，通过WST-1分析来测定它们对细胞增殖的影响。其结果见图3。按照该图3所示，就细胞增殖刺激功能而言，两者具有相同的功能。

按照以上所述，本发明的唾液酸的去除方法及去唾液酸促红细胞生成素的制备方法因为简易并且成本低，例如可用于制备医药组合物、可用于广泛的医疗领域。

Claims (8)

1.一种结合在促红细胞生成素上的唾液酸的去除方法，其包括使含所述促红细胞生成素的溶液呈酸性、并进行加热的酸性加热处理工序。

2.权利要求1所述的唾液酸的去除方法，其进一步包括在所述酸性加热处理工序后中和所述含促红细胞生成素的溶液、并进行冷却的中和冷却处理工序。

3.权利要求1或2所述的唾液酸的去除方法，其中，所述酸性是pH4.0以下。

4.权利要求1至3中任意一项所述的唾液酸的去除方法，其中，所述加热是将所述溶液的温度加热到60℃以上。

5.权利要求1至4中任意一项所述的唾液酸的去除方法，其中，所述酸性加热处理工序的处理时间是15分钟以上。

6.权利要求2至5中任意一项所述的唾液酸的去除方法，其中，所述中和是将所述溶液的pH中和至pH5.0～10.0的范围内。

7.权利要求2至6中任意一项所述的唾液酸的去除方法，其中，所述冷却是将所述溶液的温度冷却至0～50℃的范围内。

8.一种去唾液酸促红细胞生成素的制备方法，其包括通过权利要求1至7中任意一项所述的唾液酸的去除方法来去除结合在促红细胞生成素上的唾液酸的唾液酸去除工序。

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