EA041947B1

EA041947B1 - Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток

Info

Publication number: EA041947B1
Application number: EA202090220
Authority: EA
Inventors: Леопольд Грилльбергер; Манфред Райтер; Вольфганг Мундт
Original assignee: Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2022-12-16

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США, №

61/362635, поданной 8 июля 2010 г., описание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Область техники

Рекомбинантная экспрессия терапевтических белков в культуре клеток (в частности, крупномасштабных культурах клеток), включая культуры эукариотических клеток, и, конкретнее, культуры клеток млекопитающих, требует применения специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества для эффективного роста клеток. В составы сред для клеточных культур часто входят различные добавки, включая эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), животные белки и/или гидролизаты белков крупного рогатого скота, а также белковые гидролизаты, полученные из растений или дрожжей. Одна из проблем, связанных с такими культурами, состоит в том, что количество получаемого белка, а также общая и удельная активность указанного белка, часто варьируют в разных культурах клеток, даже в случае, когда состав среды для культуры клеток неизменен. Эта вариабельность особенно очевидна в случае крупномасштабных производственных процессов с применением объемов клеточных культур от 10 л до более чем 20000 л. Вариабельность для разных культур клеток особенно часто наблюдают для сред для клеточных культур, содержащих гидролизаты, что приводит к уменьшению продукции общего продуцируемого количества белка, а также уменьшению общей и удельной активности.

Одной из возможных причин вариабельности, наблюдаемой в разных культурах клеток, является то, что загрязняющие примеси в добавках, таких как гидролизаты, варьируют от партии к партии. Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин, трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и получаемые из них биологические продукты. Кроме того, получаемые из сыворотки крови человека добавки должны быть проверены на все известные вирусы, включая вирусы гепатита и ВИЧ, которые могут передаваться через сыворотку крови. Более того, бычья сыворотка и получаемые из нее продукты несут риск заражения КГЭ. Помимо этого, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При применении для культуры клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или животных, возникают многочисленные проблемы (например, варьирующие качество и свойства составов из разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или КГЭ), в частности, если указанные клетки применяют для производства лекарственных средств или вакцин для введения человеку. Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективной системы хозяина и условий культивирования, для которых не требуется сыворотка или другие белковые вещества животного происхождения.

Такие бессывороточные среды разрабатывались на основе белковых экстрактов, получаемых из растений или дрожжей. Например, известно, что гидролизаты сои подходят для процессов ферментации и могут усиливать рост многих микроорганизмов со сложными питательными потребностями, дрожжей и грибов. В WO 96/26266 указано, что папаиновые гидролизаты соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие ее компоненты могут применяться для тканевых культур. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) описывают эффекты стимуляции роста и продуктивности определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы.

В WO 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной питательной среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных животных и процесса воспроизводства вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культур клеток, содержащей пептид риса, экстракт дрожжей и их ферментативный гидролизат, и/или растительные липиды для роста животных клеток, описан в WO 98/15614. Содержащая очищенный соевый гидролизат среда для культивирования рекомбинантных клеток описана в WO 01/23527. В WO 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует и присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста.

В ЕР-А-0481791 описана культуральная среда с заданным биохимическим составом для культивирования сконструированных клеток СНО, не содержащая белков, липидов и углеводов, выделенных из животных источников, содержащая также рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, 1% к 0,025% (масса/объем) пептона расщепленной папаином сои, и путресцин. В WO 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В этом контексте следует отметить, что, как известно, путресцин входит также в стандартные среды, например, в среду DMEM/Хэма F12 в концентрации 0,08 мг/л.

Растительные и/или дрожжевые гидролизаты, однако, представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и загрязнителей. При этом свойства коммерчески доступных партий гидролизатов существенно варьируют. В результате выход рекомбинантных белков или вирусных продуктов значительно различается (разница составляет до троекратной) в зависимости от партии используемого гидролизата (разброс от партии к партии). Этот недостаток влияет на пролиферацию клеток, а также экспрессию белков в каждой клетке. В US 2007/0212770 описаны различные не

- 1 041947 содержащие животных белков и олигопептидов, культуральные среды с заданным химическим составом, подходящие для крупномасштабного производства рекомбинантных белковых биофармацевтических средств.

Гемостаз включает взаимодействие различных путей гемостатических реакций, в итоге приводящих к образованию тромба. Тромбы представляют собой отложения компонентов крови на поверхности стенок сосудов, состоящие в основном из агрегированных тромбоцитов крови и нерастворимого перекрестно-сшитого фибрина. Образование фибрина происходит в результате сдерживания протеолиза фибриногена под действием тромбина, фермента свертывания. Тромбин представляет собой конечный продукт каскада свертывания, последовательной активации зимогена на поверхности активированных тромбоцитов и лейкоцитов, и различных клеток сосудов (для ознакомления см. K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, pp. 1-16).

Важной функцией каскада свертывания является активация фактора X комплексом активированного фактора IX (Фактора IXa) и активированного фактора VIII (Фактора VIIIa). Дефицит или дисфункция компонентов этого комплекса связаны с заболеванием крови, известным как гемофилия (J. E. Sadler & Е. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia В, and von Willebrand's Disease (Гемофилия А, гемофилия В и болезнь Виллебранда), в G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases (Молекулярные основы заболеваний крови). W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). Гемофилия А связана с дефицитом активности фактора VIII, в то время как гемофилия В связана с дефицитом фактора IX. Современное лечение представляет собой заместительную терапию с применением фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания. Из указанных тромбопатий гемофилия А встречается чаще, поражая примерно одного человека из 10000. Заместительная терапия у пациентов с гемофилией А включает повторяющееся введение препаратов, содержащих нормальный фактор VIII, путем внутривенной инфузии. Интервал между инфузиями представляет собой функцию от снижения активности фактора VIII в кровотоке. Полупериод активности фактора VIII после инфузии различен у разных индивидуумов, варьируя от 10 до 30 ч. Таким образом, профилактическая терапия требует инфузии каждые 2-3 дня. Это является тяжелым бременем для пациентов с гемофилией, в частности, в случаях, когда венозный доступ затруднен в результате местной карбонизации после частых проколов иглой для внутривенных инфузии.

Снижение частоты инфузии за счет применения фактора VIII с продленным периодом полужизни было бы очень благоприятно. В данной области техники хорошо известно, что время полураспада неактивированного гетеродимера фактора VIII сильно зависит от присутствия фактора фон Виллебранда, проявляющего высокое сродство к фактору VIII (но не к фактору VIIIa) и служащего белкомпереносчиком (J. E. Sadler and E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia В and von Willebrand's disease, в G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). Известно, что пациенты, страдающие от болезни Виллебранда типа 3, не имеющие детектируемого уровня фактора фон Виллебранда в кровотоке, страдают также от вторичного дефицита фактора VIII. Кроме того, период полураспада введенного внутривенно фактора VIII у таких пациентов составляет от 2 до 4 ч, что заметно меньше 10-30 ч, наблюдаемых у пациентов с гемофилией А. Из полученных результатов следует, что фактору VIII свойственна тенденция к быстрому выведению из кровотока, и что этот процесс до некоторой степени подавляется комплексообразованием с его естественным переносчиком - фактором фон Виллебранда.

Фактор фон Виллебранда (vWF) представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде ряда мультимеров, размер которых варьирует, как правило, от приблизительно 500 до 20000 кДа (или 240 димеров vWF). Димерные и мультимерные формы vWF составлены 250 кДа полипептидными субъединицами, связанными друг с другом дисульфидными связями. vWF опосредует первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда; только мультимеры большего размера проявляют также гемостатическую активность. Мультимеризованный VWF связывается с поверхностным гликопротеином тромбоцитов Gp1ba посредством взаимодействия в домене A1 VWF, содействуя адгезии тромбоцитов. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы vWF, а те формы vWF, которые имеют низкие молекулярные массы (низкомолекулярный vWF), возникают за счет протеолитического расщепления. Мультимеры с большими молекулярными массами накапливаются в тельцах Вейбеля-Палада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции.

Снижение связывающей активности FVIII благодаря сниженным уровням белка vWF или уменьшению связывающей способности FVIII приводит к одному из трех типов болезни Виллебранда. Дополнительно или альтернативно, определенные типы болезни Виллебранда характеризуются повышением или снижением уровня Gp1bα-опосредованного связывания тромбоцитов, а именно типы 2А, 2В и 2М (обобщенные данные см. у Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1):94-108 (2003)). Соответственно, модулирование взаимодействия vWF как с FVIII, так и с Gp1ba представляет собой целесообразную стратегию для лечения как гемофилии, так и болезни Виллебранда.

Учитывая биологическую важность vWF, существует постоянная необходимость в совершенствовании техники способов получения vWF для терапевтического применения. Общеизвестно, что vWF мо- 2 041947 жет быть выделен из эндогенных источников, таких как плазма крови человека. Выделенный vWF обладает таким преимуществом, как высокая удельная активность в отношении выполнения его биологической функции и может, таким образом, эффективно применяться в качестве терапевтического белка для лечения соответствующих заболеваний, таких как болезнь Виллебранда. Как правило, vWF плазмы обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей приблизительно 100 мЕ/мкг, однако выделение из плазмы крови человека имеет недостатки, так как, например, такая плазма может содержать различные вирусы, такие как ВИЧ и/или вирусы гепатита, которые могут переноситься пациенту. Кроме того, плазма представляет собой ограниченный ресурс и, таким образом, дефицит плазмы может приводить к проблематичности получения достаточного количества vWF для лечения. Соответственно, рекомбинантные способы получения vWF обладают преимуществами, разрешая некоторые проблемы, связанные с зависимостью от плазмы в качестве источника vWF. Для рекомбинантного получения была клонирована полноразмерная кДНК vWF; указанный прополипептид соответствует аминокислотным остаткам 23-764 полноразмерного препро-vWF (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90).

К сожалению, vWF представляет собой молекулу, подвергающуюся сложным посттрансляционным модификациям. Кроме того, мультимеризация димеров vWF в большие и ультрабольшие мультимеры в аппарате Гольджи представляет собой сложную задачу при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, экспрессия высокомолекулярного vWF в культуре клеток, например, эндотелиальных клетках человека (первичных), зависит от специфического накопления ультрабольших молекул vWF в тельцах ВейбеляПалада. Такие культуры клеток не подходят для получения терапевтических белков. Описаны и другие способы культивирования клеток; известно, что условия культивирования клеток могут влиять на продуцирование vWF различным образом. Например, показано, что высокие концентрации аммония (NH₄ ⁺) нарушают посттрансляционную модификацию. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23): 13497-13503, 1989) показали, что уровень аммония 25 мМ приводили к снижению мультимеризации vWF в эндотелиальных клетках, что также негативно влияет на удельную ристоцетиновую активность рекомбинантного vWF.

Снижение мультимеризации, как правило, связано со снижением активности, в частности, удельной ристоцетиновой активности, рекомбинантного vWF.

До сих пор трудно предсказать, какие параметры могут положительно или отрицательно влиять на продуцирование того или иного белка, в особенности - сложных гликопротеинов, таких как фактор VIII и vWF. Например, показано, что определенные компоненты среды для клеточной культуры влияют на продуцирование фактора VIII. Согласно описанию в патенте США №5804420 добавление полиола, меди и других следовых металлов может положительно влиять на выход фактора VIII. Также, согласно описанию в WO 2009/086309, показано, что применение меди в процессе культивирования клеток повышает выработку фактора VIII. У Mignot et al. (1989) описано также осуществление экспрессии vWF в рекомбинантных клетках СНО. Однако ни в одном из указанных примеров не содержится информации относительно удельной активности vWF или уровня его мультимеризации.

Белки ADAMTS (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина I типа) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих ряд консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, цистеин-богатый домен, дезинтегрин-подобный домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев множество повторов тромбоспондина типа I (для ознакомления см. Nicholson et al., ВМС Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Указанные белки, эволюционно родственные семействам металлопротеиназ ADAM и ММР (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, для которых установлена связь с рядом заболеваний и состояний, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), соединительнотканные расстройства, раковые заболевания, воспаление (Nicholson et al.) и тяжелую плазмодийную тропическую малярию (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349). Из-за этих связей ферменты ADAMTS были признаны потенциальными мишенями для терапии ряда патологий (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31). Соответственно, существует потребность в способах получения больших количеств белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, не содержащих загрязнителей, таких как вирусы, КГЭ и патогены типа бактерий Mycoplasma.

Один из представителей семейства ADAMTS, ADAMTS13, расщепляет фактор фон Виллебранда (vWF) между остатками Tyr 1605 и Met 1606; эта функция отвечает за разложение больших мультимеров vWF in vivo. Установлена связь потери активности ADAMTS 13 с некоторыми состояниями, такими как ТТП (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41(1):4-14), острое и хроническое воспаление (Chauhan et al, J Exp Med. 2008 Sep 1;205(9):2065-74), и, совсем недавно, с тяжелой плазмодийной тропической малярией (Larkin et al, PLoS Pathog. 2009 Mar;5(3):e1000349).

Протеаза ADAMTS 13 представляет собой гликозилированный белок массой 190 кДа, синтезируемый преимущественно в печени (Levy et al, Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al, Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al, J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; и Gerritsen et al, Blood. 2001; 98:1654-1661). В значительной степени кА и в случае с мультимерами rVWF высшего порядка, рекомбинантная экспрессия больших ADAMTS 13 в культурах клеток млекопитающих сопряжена с множеством трудностей.

Таким образом, существует необходимость в условиях культивирования клеток, в частности, усло

- 3 041947 виях культивирования при крупномасштабном производстве, обеспечивающих стабильный общий выход белка и/или стабильную общую и удельную активность продуцируемых белков в различных культурах клеток. Стабильность в культурах при крупномасштабных производственных процессах важна для производства терапевтических белков. Существует также необходимость в условиях культивирования клеток для крупномасштабного производства rVWF с уровнями мультимеризации и удельной ристоцетиновой активностью, сравнимыми или превышающими таковые VWF, присутствующего в нормальной плазме человека. Сходным образом, так как белки ADAMTS вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области техники существует потребность в способах крупномасштабного производства рекомбинантных белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для получения фармацевтических средств и для фармацевтического введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанные и другие потребности данной области техники в получении рекомбинантного фактора фон Виллебранда и рекомбинантного ADAMTS 13.

Краткое описание изобретения

Согласно определенным аспектам настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что введение добавок в среды для клеточных культур, применяемые для экспрессии рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF) и рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), приводит к значительному повышению экспрессии белков и ферментативной активности.

Согласносвоему первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап добавления в указанную основную среду для клеточных культур гидролизата перед культивированием указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный гидролизат представляет собой растительный гидролизат. Согласно конкретному варианту реализации указанный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основная среда для клеточных культур представляют собой не содержащую животных белков культуральную среду.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанные основные среды для клеточных культур представляет собой культуральные среды с заданным химическим составом.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет от 2,4 до 20 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинации.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки СНО.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.

- 4 041947

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5х10⁶ клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х10⁶ клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х10⁶ клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из части культурального супернатанта.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг rVWF. Согласно конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг rVWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов по меньшей мере 10% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры VWF из 14-22 димеров.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 10 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4+ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов rVWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации указанный способ дополнительно включает этап очистки rVWF от по меньшей мере 50% rFVIII, присутствующего в отделенном супернатанте. Согласно одному из вариантов реализации отношение rVWF к rFVIII после этапа очистки составляет по меньшей мере 10:1.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rVWF.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает композицию рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF), полученную описанным в настоящем изобретении способом.

Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанная композиция также содержит рекомбинантный фактор VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации отношение rVWF к rFVIII составляет по меньшей мере 10:1.

Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящем изобретении способом.

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), при этом по меньшей мере 10% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF в указанном супернатан- 5 041947 те присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов указанный супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.

Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,4 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,5 ME ристоцетинкофакторной активности на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,6 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,7 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (А13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие животных белков культуральные среды.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой культуральные среды с заданным химическим составом.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 1 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 2 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 1 мкг/л до 6 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 2 мкг/л до 4 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинаций. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 4,0x106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под- 6 041947 держивают на уровне менее чем 3,5х10⁶ клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 3,0х10⁶ клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из указанной части культурального супернатанта.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.

Согласно предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1200 мЕ/мкг.

Согласно более предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-VWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH₄ ⁺ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 10 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH₄ ⁺ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 5 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH₄ ⁺ в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rA13.

Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящем изобретении способом.

Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 5 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETSVWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 7 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 9 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-VWF73 на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящем изобретении способу.

Согласно девятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), при этом указанный супернатант содержит по меньшей мере 2 мкг rA13 на мл. Согласно конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13 на мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13 на мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в на- 7 041947 стоящем изобретении способу.

Согласно десятому аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), полученная согласно любому из вышеописанных способов.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. (1А) Электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1 %) rVWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди, согласно описанию в примере 2. Отметим, что день культивирования 3 эквивалентен дню периодической культуры 1 из табл.7 и табл.8. (1В) Относительное содержание мультимеров VWF, содержащих от 1 до 10 димеров (зона № 1) и более чем 10 димеров (зона № 2) согласно оценке зон, приведенных на фиг. 1 А, количественно определяли денситометрическим анализом.

Фиг. 2. (2А) Интервальный график средней удельной активности rVWF в супернатантах клеточных культур rVWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди. (2В) Интервальный график средней концентрации NH₄ ⁺, обнаруживаемой в супернатантах клеточных культур rVWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди.

Фиг. 3. Супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантный ADAMTS13 в присутствии возрастающих уровней меди, исследовали с применением анализа ДСН-ПААГ. После ДСН-ПААГ rA13 визуализировали с помощью (3А) окрашивания серебром и (3В) анти-А13 вестерн-блоттинга.

Фиг. 4. График зависимости объемной продуктивности (Р Frets) от концентрации меди, показывающий экстраполированный (сплошная линия) эффект оптимальной концентрации меди на выработку rA13.

Фиг. 5А-К. Ступенчатые диаграммы при непрерывном суспензионном (хемостатическом) культивировании клеток, экспрессирующих rA13 на протяжении времени культивирования 8 недель, сравнивающие эффекты основных уровней меди (0,66 мкг/л) с таковыми в культурах, дополненных до конечной концентрации меди 2 мкг/л. Каждый столбец представляет среднее значение за неделю хемостатической культуры. Легенда относится к конкретным неделям, для которых представлены данные.

Фиг. 6. (6А) Электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) rVWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди при высокой и низкой плотности клеток согласно описанию в примере 3. Следует отметить, что дни культивирования 8 и 17 (CST8 и CST17) эквивалентны дню 8 и дню 17 в табл. 10-13. (6В) Относительное содержание мультимеров VWF, содержащих от 1 до 10 димеров и более чем 10 димеров согласно оценке зон, приведенных на фиг. 6А, количественно определяли денситометрическим анализом.

Подробное описание изобретения

I. Введение.

Рекомбинантный vWF (rVWF) и рекомбинантный ADAMTS13 (rA13) могут быть получены посредством экспрессии в крупномасштабных культурах клеток млекопитающих. Однако активность указанных белков при получении с применением стандартных условий культивирования клеток часто варьирует от культуры к культуре клеток, даже в тех случаях, когда общий состав сред неизменен; удельная активность рекомбинантных белков часто отличается от таковой vWF и rA13, полученных из плазмы крови. Кроме того, rVWF, экспрессируемый в культурах клеток млекопитающих, склонен образовывать белковые составы с низким (менее 10%) процентным содержанием мультимеров высшего порядка (мультимеры высшего порядка включают молекулы, содержащие более чем 10 димеров VWF). Эти недостатки стандартных способов получения rVWF и rA13 представляют особенные сложности при создании культур для крупномасштабного производства (т.е. от 10 до более чем 20000-литровых культур).

Одним из потенциальных источников вариабельности, часто наблюдаемой в разных партиях клеточной культур, является присутствие загрязнителей в компонентах сред для клеточных культур. Указанные загрязнители могут присутствовать в различном количестве в разных партиях, что приводит к варьирующим результатам при получении rVWF и rA13. После изучения различных загрязнителей, обнаруживаемых в различных добавках для клеточных культуральных сред, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие гидролизатов приводит к варьированию концентраций меди в таких культуральных средах. Дальнейшие исследования дали неожиданный результат: добавление меди в культуральные среды до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л, стабильно увеличивало общую и удельную активность rVWF и rA13 и/или также могло приводить к увеличению общего выхода белка. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы и композиции для высокопродуктивного получения rVWF и белков rA13 с высокой удельной активностью.

Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток и композиции для получения больших количеств rVWF и rA13, обладающих активностью, сравнимой или превышающей активность, проявляемую происходящим из плазмы vWF

- 8 041947 (pdVWF) или происходящим из плазмы ADAMTS13 (pdA13). Согласно дальнейшим аспектам белки rVWF и rA13, получаемые согласно настоящему изобретению, демонстрируют стабильно более высокую активность по сравнению с белками, получаемыми с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении. Удачным образом, согласно определенным вариантам реализации описанных в настоящем изобретении способов и композиций, белки rVWF и rA13, полученные согласно настоящему изобретению, проявляют стабильно более высокую удельную активность (т.е. Е/мг белка) по сравнению с белками, полученными с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении. Сходным образом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы получения rVWF и rA13 дают больший выход активности на объем культуры (т.е. Е/л/день), по сравнению со стандартными способами культивирования клеток с применением сред без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящем изобретении.

Согласно еще одному аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации общая концентрация меди составляет приблизительно 1,5-4,5 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь до получения приблизительно 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8; 4; 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20 мкг/л меди или более. Основные среды для клеточных культур как правило, содержат следовые концентрации меди менее 1 мкг/л.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л меди для продуцирования rVWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,5-15; 2,0-10; 2,58; 3,0-6; 4,0-5,0 мкг/л меди для продуцирования rVWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат.

Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,5 до приблизительно 4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,6-3,8; 1,7-3,6; 1,8-3,4; 1,9-3,2; 2,0-3,0; 2,1-2,8; 2,2-2,6; 2,3-2,4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры включает, помимо меди и/или одного или более гидролизата, от приблизительно 1,0 до приблизительно 30 мкМ цинка. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры также содержит, помимо меди и/или одного или более гидролизата и/или цинка, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5,0 мМ кальция.

Согласно дальнейшему аспекту и в соответствии со всеми вышеизложенными, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым уровни аммония в растворе культуры клеток являются низкими (менее 10 мМ). Согласно определенным вариантам реализации в способах культивирования клеток согласно настоящему изобретению применяют среды для клеточных культур, содержащие более 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/л меди в комбинации с низкими уровнями аммония.

Одним из преимуществ способов и композиций согласно настоящему изобретению является то, что они подходят для крупномасштабного культивирования клеток. Объем указанных крупномасштабных культур клеток составляет по меньшей мере 10 л, 50 л, 100 л, 150 л, 200 л, 250 л, 500 л, 750 л, 1000 л, 1500 л, 2000 л, 5000 л, 10000 л или 20000 л.

Согласно определенным аспектам способы согласно настоящему изобретению не обязательно приводят к получению большего суммарного количества рекомбинантного белка, однако получаемый рекомбинантный белок (rVWF или rA13) демонстрирует более высокую общую и удельную активность, чем обнаруживаемая у белков, полученных с применением стандартных клеточных культур, в частности, по сравнению с белками, полученными в таких культурах клеток, где среда для клеточной культуры не содержит дополнительных добавок меди. Согласно дальнейшим аспектам белки rVWF и rA13, полученные из клеток, культивируемых в средах с добавлением меди, демонстрируют стабильно повышенную активность на литр культуры клеток по сравнению с клетками, культивируемыми в основных средах для клеточных культур без добавления меди. Согласно дальнейшим аспектам добавление в среды меди со- 9 041947 гласно настоящему изобретению приводит к повышению выхода белка, увеличению числа клеток в культуре и/или повышению общей активности на литр культуры по сравнению со средами без добавления меди.

Дальнейшие преимущества способов и композиций согласно настоящему изобретению заключаются в получении популяции белков с высоким процентным содержанием (более 10%) высокомультимеризованного rVWF.

Хотя значительная часть обсуждения белков ADAMTS в настоящем изобретении относится к ADAMTS 13 (А13), необходимо понимать, что, так как все белки ADAMTS имеют общую структуру центрального домена и общие структурно-функциональные связи, способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, применимы для получения любых белков ADAMTS, не ограничиваясь rA13.

Определения

Используемый в настоящем изобретении термин рекомбинантный vWF включает vWF полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК. Согласно определенным вариантам реализации белки vWF согласно настоящему изобретению могут содержать конструкцию, полученную, например, согласно WO 1986/06096, опубликованной 23 окт. 1986 г., и заявке на патент США сер. № 07/559509, поданной 23 июля 1990г. от имени Ginsburg et al., включенных в настоящее изобретение посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного vWF. vWF согласно настоящему изобретению может включать все потенциальные формы, в том числе мономерные и мультимерные формы. Необходимо также понимать, что настоящее изобретение охватывает применение комбинаций разных формы vWF. Например, vWF согласно настоящему изобретению может включать разные мультимеры, разные производные; как активные биологически производные, так и не активные биологические производные.

Термин рекомбинантный при использовании, например, в отношении клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы введением гетерологичной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, либо изменением нативной (нативного) нуклеиновой кислоты или белка, или что указанная клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не обнаруживаемые в нативных (нерекомбинантных) формах указанных клеток или экспрессируют нативные гены, которые в противном случае экспрессируются аномально, экспрессируются недостаточно или не экспрессируются вообще.

В контексте настоящего изобретения рекомбинантный vWF охватывает любые члены семейства vWF, например, от млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи; и их биологически активные производные. Согласно предпочтительному варианту реализации рекомбинантный VWF представляет собой VWF человека. Мутантные и вариантные белки vWF, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков vWF. Кроме того, vWF согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. vWF, описанные в настоящем изобретении, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.

Термины высокомультимерный vWF, высокомолекулярный vWF и HMW VWF могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к ковалентно связанным мультимерам vWF, содержащим более чем 10 димеров VWF. Согласно определенным вариантам реализации HMW VWF содержит по меньшей мере 11 димеров VWF, или по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или более димеров VWF.

Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS относится к полипептиду - дезинтегрину и металлопротеиназе из семейства металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина I типа. Члены указанного семейства включают белки человека ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (Nm_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (Nm_030955),

ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155;

NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (Nm_139057),

ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) и ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Белки ADAMTS включают и полноразмерные белки, и неполные полипептиды, которые проявляют по меньшей мере частичную биологическую активность, например, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более, от активности, демонстрируемой полноразмерным белком, в частности, протеазной активности, демонстрируемой полноразмерным белком. В определенных случаях белок ADAMTS подвергается посттрансляционной модификации in vivo или in vitro, например, ферментативным или химическим путем. Понятно, что белки ADAMTS согласно настоящему изобретению включают изоформы альтернативного сплайсинга, консервативно модифицированные белки, идентичные по существу белки, гомологи и т.п.

В контексте настоящего изобретения термин белок ADAMTS охватывает любые члены семейства

- 10 041947

ADAMTS, происходящие, например, из млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи, и их биологически активные производные. Мутантные и вариантные белки ADAMTS, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков ADAMTS. Кроме того, белки ADAMTS согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. Белки ADAMTS, описанные в настоящем изобретении, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.

Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS 13 относится к любому белку или полипептиду, обладающему активностью ADAMTS 13, в частности, способностью расщеплять пептидную связь между остатками Tyr-842 и Met-843 в VWF. Согласно типовому варианту реализации белок ADAMTS 13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75- 1427 NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно другому варианту реализации белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620596 (изоформа 2 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1371 NP_620594 (изоформа 2 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно еще одному из вариантов реализации ADAMTS13 белки включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620595 (изоформа 3 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1340 NP_620595 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Используемый в настоящем изобретении термин белок ADAMTS13 включает природные варианты, обладающие vWF-расщепляющей активностью, и искусственные конструкции, обладающие vWF-расщепляющей активностью. Согласно применению в настоящем описании ADAMTS13 охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, сохраняющие некоторую степень основной активности. Примеры мутаций ADAMTS13, обнаруживаемые в популяциях человека, включают без ограничений R7W, V88m, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, Р618А, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, А1033Т, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, для многих из которых показана связь с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП). Белки ADAMTS13 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, показано, что ADAMTS13 модифицируется N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) по остаткам 614, 667 и 1354, и предсказано, что остатки 142, 146, 552, 579, 707, 828 и 1235 могут также модифицироваться таким образом.

Протеолитически активный рекомбинантный ADAMTS13 может быть получен посредством осуществления экспрессии в культурах клеток млекопитающих, согласно описанию у Plaimauer et al., (2002, Blood. 15;100(10):3626-32) и в US 2005/0266528, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Способы экспрессии рекомбинантного ADAMTS13 в культуре клеток описаны у Plaimauer В, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):2433 и в US 2011/0086413, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемый в настоящем изобретении термин биологически активное производное при использовании в контексте белка ADAMTS охватывает также полипептиды, полученные с применением технологии рекомбинантной ДНК, что может включать любые известные в данной области техники способы (i) получения рекомбинантной ДНК посредством методов генной инженерии, например, посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, т.е. электропорацией или микроинъекцией, (iii) культивирования указанных трансформированных клеток, например, в непрерывном или периодическом режиме, (iv) экспрессии белка ADAMTS, например, конститутивного или индуцируемого, и (v) выделения указанного белка ADAMTS, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток, (vi) получения существенно очищенного рекомбинантного белка ADAMTS, например, с помощью ионообменной хроматографии-, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и т.п. Термин биологически активное производное включает также гибридные молекулы, такие как, например, белок ADAMTS или его функциональный фрагмент, скомбинированный с вторым полипептидом, например, доменом Fc иммуноглобулина или альбуминовым доменом, для улучшения биологических/фармакологических параметров, таких как, например, период полужизни белка ADAMTS в кровотоке млекопитающего, в частности, человека.

Термины выделенный, очищенный или биологически чистый относятся к веществу, практически или по существу не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в естественном состоянии. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с применением техник аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Согласно одному из вариантов реализации rVWF представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Согласно другому варианту реализации rA13 представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Термин очищенный согласно некоторым ва

- 11 041947 риантам реализации означает, что нуклеиновая кислота или белок дают по существу одну полосу в электрофоретическом геле. Согласно другим вариантам реализации это означает, что чистота указанной(ого) нуклеиновой кислоты или белка составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно - по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Чистота или очистка согласно другим вариантам реализации означает удаление по меньшей мере одного загрязнителя из подвергаемой очищению композиции. В этом смысле очистка не подразумевает, что очищенное соединение будет гомогенным, например, чистым на 100%.

Биологическая активность vWF может быть измерена посредством известных методов анализа in vitro. Например, ристоцетин-кофакторный анализ основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии vWF. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации vWF и может быть измерена турбодиметрическим методом, например, с применением агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). В настоящем изобретении удельную ристоцетинкофакторную активность vWF согласно настоящему изобретению выражают в мЕ/мкг vWF согласно оценке с применением методов анализа in vitro.

Используемый в настоящем изобретении термин одна единица активности ADAMTS означает уровень активности в 1 мл смешанной нормальной плазмы человека, независимо от того, какой метод анализа применяют. Например, в том случае, если белок ADAMTS представляет собой ADAMTS 13, одна единица активности ADAMTS 13 FRETS-VWF73 представляет собой уровень активности, необходимый для расщепления такого же количества субстрата FRETS-VWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100), которое расщепляется одним мл смешанной нормальной плазмы человека. Удобно, что активность ADAMTS 13 может быть определена методами функционального анализа, такими как функциональный анализ с применением модифицированных пептидов фактора фон Виллебранда в качестве субстрата ADAMTS 13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep;6(9): 1534-41). Предпочтительный способ определения активности рекомбинантного ADAMTS13 человека описан у Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) (Анализ протеазы, расщепляющей фактор фон Виллебранда (vWF), основанный на понижении коллаген-связывающей способности деградированного vWF: инструмент для диагностики тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП)). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). Согласно одному из вариантов реализации, чтобы считаться белком ADAMTS13 согласно приведенному выше определению, полипептид или белок должен обладать по меньшей мере 1% vWF-расщепляющей активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 10% активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% активности нативного ADAMTS13. Количество белка ADAMTS13 также может быть определено измерением антигена ADAMTS13, например, с применением метода ИФА (ELISA), описанного у Rieger et al, (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212- 20). В данной области техники общепризнано, что 1 мл смешанной нормальной плазмы человека содержит 1 мкг ADAMTS13. Таким образом, согласно общепринятому в данной области техники правилу 1 мкг полученного из плазмы ADAMTS13 обладает одной единицей активности ADAMTS13.

Термины раствор культуры клеток, среда или среды для клеточной культуры и супернатант культуры клеток относятся к аспектам процессов культивирования клеток, как правило, общеизвестным в данной области техники. В контексте настоящего изобретения раствор культуры клеток может включать среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток. Указанные среды для клеточных культур вводят в раствор культуры клеток извне, необязательно вместе с добавками, для обеспечения питательных веществ и других компонентов для культивирования клеток, экспрессирующих rVWF или rA13. Термин супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для клеточной культуры, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или экскретируемые клетками во время культивирования, но не сами клетки. Таким образом, согласно одному контексту супернатант культуры клеток может относиться к жидкой фазе раствора культуры клеток (т.е. к раствору культуры клеток, исключая клетки). Например, концентрация аммония культурального супернатанта, как правило, относится к концентрации аммония в растворе культуры клеток. Согласно другим контекстам супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, из которого указанные клетки были извлечены (т.е. отделенному супернатанту культуры клеток).

Используемые в настоящем изобретении термины витамин В3, никотинамид, ниацинамид, ниацин и никотиновая кислота могут использоваться взаимозаменяемо, относясь к любому члену семейства витаминов В3. Соответственно, любой член указанного семейства может быть использован для добавления в среду, применяемую в способах согласно настоящему изобретению.

Используемый в настоящем изобретении термин среда с заданным химическим составом или среды с заданным химическим составом относится к синтетической ростовой среде, все компоненты которой идентифицированы и их концентрации известны. Среды с заданным химическим составом не

- 12 041947 содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут включать или не включать отдельные компоненты растительного или животного происхождения (например, белки, полипептиды, и т.п.). Неограничивающие примеры коммерчески доступных сред с заданным химическим составом включают различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), питательную смесь Хэма (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), их комбинации, и т.п. Способы получения культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например, в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемый в настоящем изобретении термин не содержащая олигопептидов культуральная среда или не содержащие олигопептидов культуральные среды относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептиды, такие как, например, олигопептиды, полученные из белкового гидролизата. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда не содержит олигопептиды, состоящие из двадцати или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пятнадцати или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие десять или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие семь или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пять или более аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие три или более аминокислоты. Согласно дальнейшему варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие две или более аминокислоты. Способы получения не содержащих олигопептидов культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США №6171825 и № 6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемый в настоящем изобретении термин бессывороточная культуральная среда или бессывороточная культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки. Несмотря на то, что зачастую бессывороточные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или белковые фракции. Способы получения бессывороточных культуральных сред известны в данной области техники, например, в патентах США №6171825 и № 6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемый в настоящем изобретении термин не содержащая животных белков культуральная среда или не содержащие животных белков культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки, белка или фракции белка. Хотя зачастую не содержащие животных белков культуральные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, не содержащие животных белков культуральные среды могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения не содержащих животных белков культуральных сред известны в данной области техники, например, в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №2008/0009040 и №2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Используемый в настоящем изобретении термины основная (базовая)среда для клеточной культуры или основные (базовые) среды для клеточных культур относятся к культуральной среде с заданным химическим составом, не содержащей олигопептидов культуральной среде, бессывороточной культуральной среде или не содержащей животных белков культуральной среде, в которую не был добавлен гидролизат, например, растительный или дрожжевой гидролизат. Основные среды общеизвестны в данной области техники, например, DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Указанная основная среда может включать ряд ингредиентов, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, обеспечивающем культивирование клетки; такие количества общеизвестны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например, бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому напряжению или ингибиторы протеазы. При необходимости, могут быть добавлены неионогенные ПАВ, такие как сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.

II. Среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rVWF и/или rA13, обладающих повышенной активностью по сравнению с rVWF и rA13, полученных с применением основных сред для клеточных культур. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rVWF и/или rA13, в которых в основные среды для клеточных культур добавляют одно или более дополнительное вещество. Согласно

- 13 041947 конкретным вариантам реализации и приведенному ниже более подробному описанию условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению включают основные среды для клеточных культур, в которые добавлена медь до концентрации по меньшей мере 1,0 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации применяемые среды для клеточных культур и супернатанты, полученные с помощью процессов согласно настоящему изобретению, также содержат низкие уровни (менее 10 мМ) аммония. Согласно конкретному варианту реализации условиями культивирования клеток, применяемыми для экспрессии rVWF и/или rA13, управляют таким образом, чтобы поддерживать в супернатанте культуры клеток низкий уровень аммония, т.е. менее чем 10 мМ и, предпочтительно, менее чем 5 мМ.

Культуральная среда согласно настоящему изобретению могут быть основаны на подходящих основных средах, общеизвестных в данной области техники, таких как DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Основная среда может включать ряд ингредиентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, содействующем культивированию клетки; такие количества, как правило, известны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например, бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому стрессу, или ингибиторы протеазы. При необходимости может быть добавлено неионогенное ПАВ, например, сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.

Как правило, основные среды содержат менее чем 1 мкг/л меди - например, среда DMEM/Хэма F12 содержит медь в концентрации приблизительно 0,3 мкг/л. Такие концентрации меди не обеспечивают достаточного количества ионов меди для поддержания продуцирования белков rVWF и rA13 согласно настоящему изобретению, которые проявляют высокую удельную активность.

Медь может быть введена в среды для клеточных культур согласно настоящему изобретению с помощью различных способов, например, введением добавки в среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка в культуральную среду может содержать гидролизат, который можно применять для повышения концентрации меди в указанной среде. Гидролизаты могут включать любой гидролизат из общеизвестных в данной области техники, таких как растительные гидролизаты, соевые гидролизаты и гидролизат пшеничной клейковины. Согласно определенным вариантам реализации добавление гидролизата может способствовать повышенной концентрации меди, от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 мкг/л Cu²⁺. Согласно некоторым вариантам реализации количество меди, обеспеченное гидролизатом, может зависеть от количества меди в указанном гидролизате, а также количества добавленного гидролизата. Содержание меди в гидролизате может быть определено элементным анализом, например, адсорбционной атомной спектроскопией (GFAA: атомной абсорбцией в графитовой печи), или масс-спектрометрическими методами (например, ИСП-МС).

Согласно определенным вариантам реализации медь может вводиться в культуральные среды, сама по себе или вместе с гидролизатом, путем введения средовой добавки, включая подходящую соль меди или хелат меди. Подходящая медь соли может включать, не ограничиваясь перечисленными, сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди и оксид меди. Подходящие хелаторы меди могут включать, не ограничиваясь перечисленными, альбумин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), полиаминовые хелатирующие агенты, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин, триэтилендиамин, тетраэтиленпентамин, аминоэтилэтаноламин, аминоэтилпиперазин, пентаэтиленгексамин, триэтилентетрамин-гидрохлорид, тетраэтиленпентамин-гидрохлорид, пентаэтиленгексамин-гидрохлорид, тетраэтилпентамин, каптоприл, пеницилламин, ^^-бис(3-аминопропил)-1,3пропандиамин, N,N,6uc (2 аминоэтил) 1,3 пропандиамин, 1,7-диокса-4,10-диазациклододекан, 1,4,8,11тетраазациклотетрадекан-5,7-дион, 1,4,7-триазациклононана тригидрохлорид, 1-окса-4,7,10триазациклододекан, 1,4,8,12-тетраазациклопентадекан и 1,4,7,10-тетраазациклододекан.

Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно конкретному варианту реализации в основные клеточные среды добавляют медь до конечной концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения конечной концентрации приблизительно 1,0-5,0; 1,2-4,0; 1,3-3,0; 1,4-2,9; 1,5-2,8; 1,6-2,7; 1,7-2,6; 1,8-2,5; 1,9-2,4; 2,0-2,3; 2,1-2,2 мкг/л меди. Согласно дальнейшим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1,2-9,5; 1,4-9; 1,6-8,5; 1,8-8; 2,0-7,5; 2,2-7; 2,4-6,5; 2,6-6,0; 2,8-5,5; 3,0-5,0; 3,2-4,5; 3,4-4; и 2-4 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 16, 2-5, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2 мкг/л. Согласно еще одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей кон

- 14 041947 центрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л, или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л меди или более. Согласно определенным вариантам реализации и более подробному описанию ниже в настоящем изобретении культуры для получения rA13 могут содержать приблизительно 2-4 мкг/л меди, тогда как культуры для получения rVWF могут содержать по меньшей мере 2 мкг/л меди.

Вышеуказанные концентрации представляют собой относительные концентрации чистой меди в форме двухвалентного иона меди (Cu²⁺). Если используется производное меди, например, гидратированная соль, или соединение, содержащее медь, например, хелатор меди, указанное количество производного или хелатора добавляют таким образом, что конечная концентрация меди попадает в указанные в настоящем изобретении диапазоны. Например, 2 мкг/л CuSO4-5H2O эквивалентны концентрации меди, составляющей приблизительно 0,51 мкг/л (без сульфата и 5Н2О).

Удачным образом, было обнаружено, что применение в процессе культивирования клеток среды для клеточной культуры, обеспечивающей низкие концентрации (NH4+) в растворе культуры клеток (т.е. в культуральном супернатанте), приводит к экспрессии рекомбинантного VWF и/или rA13 с более высокой удельной активностью. Соответственно, согласно определенным вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 5 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 4 мМ. Согласно другим вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ, 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее.

Соответственно, согласно определенным вариантам реализации способы и композиции, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, основаны на применении основных сред для клеточных культур с добавлением меди (например, до конечной концентрации, составляющей меньшей мере 2 мкг/л) для применения в процессе, который приводит к концентрации NH4+ в супернатанте, составляющей не более 10 мМ. Согласно другим вариантам реализации основную среду для клеточной культуры дополняют для получения конечных концентраций меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1.

Таблица 1

Типовые варианты концентраций меди и аммония в культуральных средах и супернатанте, подходящих для экспрессии рекомбинантных белков согласно настоящему описанию

Концентрация аммония

но.

НБЧ 10мМ

НБЧ 9мМ

НБЧ 8мМ

НБЧ 7мМ

НБЧ 6мМ

НБЧ 5мМ

НБЧ 4мМ

НБЧ ЗмМ

НБЧ 2мМ

НБЧ 1мМ

Концентрация меди

пмм 1 мкг/л

Вар. 1

Вар. 41

Вар. 81

Вар. 121

Вар. 161

Вар. 201

Вар. 241

Вар. 281

Вар. 321

Вар. 361

Вар. 401

ПММ 2 мкг/л

Вар. 2

Вар. 42

Вар. 82

Вар. 122

Вар. 162

Вар. 202

Вар. 242

Вар. 282

Вар. 322

Вар. 362

Вар. 402

ПММ 3 мкг/л

Вар. 3

Вар. 43

Вар. 83

Вар. 123

Вар. 163

Вар. 203

Вар. 243

Вар. 283

Вар. 323

Вар. 363

Вар. 403

ПММ 4 мкг/л

Вар. 4

Вар. 44

Вар. 84

Вар. 124

Вар. 164

Вар. 204

Вар. 244

Вар. 284

Вар. 324

Вар. 364

Вар. 404

ПММ 5 мкг/л

Вар. 5

Вар. 45

Вар. 85

Вар. 125

Вар. 165

Вар. 205

Вар. 245

Вар. 285

Вар. 325

Вар. 365

Вар. 405

ПММ 6 мкг/л

Вар. 6

Вар. 46

Вар. 86

Вар. 126

Вар. 166

Вар. 206

Вар. 246

Вар. 286

Вар. 326

Вар. 366

Вар. 406

ПММ 7 мкг/л

Вар. 7

Вар. 47

Вар. 87

Вар. 127

Вар. 167

Вар. 207

Вар. 247

Вар. 287

Вар. 327

Вар. 367

Вар. 407

ПММ 8 мкг/л

Вар. 8

Вар. 48

Вар. 88

Вар. 128

Вар. 168

Вар. 208

Вар. 248

Вар. 288

Вар. 328

Вар. 368

Вар. 408

- 15 041947

пмм 9 мкг/л

Вар. 9

Вар. 49

Вар. 89

Вар. 129

Вар. 169

Вар. 209

Вар. 249

Вар. 289

Вар. 329

Вар. 369

Вар. 409

ПММ 10 мкг/л

Вар. 10

Вар. 50

Вар. 90

Вар. 130

Вар. 170

Вар. 210

Вар. 250

Вар. 290

Вар. 330

Вар. 370

Вар. 410

Приблизительно 1 мкг/л

Вар. 11

Вар. 51

Вар. 91

Вар. 131

Вар. 171

Вар. 211

Вар. 251

Вар. 291

Вар. 331

Вар. 371

Вар. 411

Приблизительно 1,5 мкг/л

Вар. 12

Вар. 52

Вар. 92

Вар. 132

Вар. 172

Вар. 212

Вар. 252

Вар. 292

Вар. 332

Вар. 372

Вар. 412

Приблизительно 2 мкг/л

Вар. 13

Вар. 53

Вар. 93

Вар. 133

Вар. 173

Вар. 213

Вар. 253

Вар. 293

Вар. 333

Вар. 373

Вар. 413

Приблизительно 2,5 мкг/л

Вар. 14

Вар. 54

Вар. 94

Вар. 134

Вар. 174

Вар. 214

Вар. 254

Вар. 294

Вар. 334

Вар. 374

Вар. 414

Приблизительно 3 мкг/л

Вар. 15

Вар. 55

Вар. 95

Вар. 135

Вар. 175

Вар. 215

Вар. 255

Вар. 295

Вар. 335

Вар. 375

Вар. 415

Приблизительно 3,5 мкг/л

Вар. 16

Вар. 56

Вар. 96

Вар. 136

Вар. 176

Вар. 216

Вар. 256

Вар. 296

Вар. 336

Вар. 376

Вар. 416

Приблизительно 4 мкг/л

Вар. 17

Вар. 57

Вар. 97

Вар. 137

Вар. 177

Вар. 217

Вар. 257

Вар. 297

Вар. 337

Вар. 377

Вар. 417

Приблизительно 4,5 мкг/л

Вар. 18

Вар. 58

Вар. 98

Вар. 138

Вар. 178

Вар. 218

Вар. 258

Вар. 298

Вар. 338

Вар. 378

Вар. 418

Приблизительно 5 мкг/л

Вар. 19

Вар. 59

Вар. 99

Вар. 139

Вар. 179

Вар. 219

Вар. 259

Вар. 299

Вар. 339

Вар. 379

Вар. 419

Приблизительно 5,5 мкг/л

Вар. 20

Вар. 60

Вар. 100

Вар. 140

Вар. 180

Вар. 220

Вар. 260

Вар. 300

Вар. 340

Вар. 380

Вар. 420

Приблизительно 6 мкг/л

Вар. 21

Вар. 61

Вар. 101

Вар. 141

Вар. 181

Вар. 221

Вар. 261

Вар. 301

Вар. 341

Вар. 381

Вар. 421

Приблизительно 7 мкг/л

Вар. 22

Вар. 62

Вар. 102

Вар. 142

Вар. 182

Вар. 222

Вар. 262

Вар. 302

Вар. 342

Вар. 382

Вар. 422

Приблизительно 8 мкг/л

Вар. 23

Вар. 63

Вар. 103

Вар. 143

Вар. 183

Вар. 223

Вар. 263

Вар. 303

Вар. 343

Вар. 383

Вар. 423

Приблизительно 9 мкг/л

Вар. 24

Вар. 64

Вар. 104

Вар. 144

Вар. 184

Вар. 224

Вар. 264

Вар. 304

Вар. 344

Вар. 384

Вар. 424

Приблизительно 10 мкг/л

Вар. 25

Вар. 65

Вар. 105

Вар. 145

Вар. 185

Вар. 225

Вар. 265

Вар. 305

Вар. 345

Вар. 385

Вар. 425

1-20 мкг/л

Вар. 26

Вар. 66

Вар. 106

Вар. 146

Вар. 186

Вар. 226

Вар. 266

Вар. 306

Вар. 346

Вар. 386

Вар. 426

2-20 мкг/л

Вар. 27

Вар. 67

Вар. 107

Вар. 147

Вар. 187

Вар. 227

Вар. 267

Вар. 307

Вар. 347

Вар. 387

Вар. 427

1-10 мкг/л

Вар. 28

Вар. 68

Вар. 108

Вар. 148

Вар. 188

Вар. 228

Вар. 268

Вар. 308

Вар. 348

Вар. 388

Вар. 428

2-10 мкг/л

Вар. 29

Вар. 69

Вар. 109

Вар. 149

Вар. 189

Вар. 229

Вар. 269

Вар. 309

Вар. 349

Вар. 389

Вар. 429

1-6 мкг/л

Вар. 30

Вар. 70

Вар. ПО

Вар. 150

Вар. 190

Вар. 230

Вар. 270

Вар. 310

Вар. 350

Вар. 390

Вар. 430

2-6 мкг/л

Вар. 31

Вар. 71

Вар. 111

Вар. 151

Вар. 191

Вар. 231

Вар. 271

Вар. 311

Вар. 351

Вар. 391

Вар. 431

3-6 мкг/л

Вар. 32

Вар. 72

Вар. 112

Вар. 152

Вар. 192

Вар. 232

Вар. 272

Вар. 312

Вар. 352

Вар. 392

Вар. 432

4-6 мкг/л

Вар. 33

Вар. 73

Вар. 113

Вар. 153

Вар. 193

Вар. 233

Вар. 273

Вар. 313

Вар. 353

Вар. 393

Вар. 433

1-5 мкг/л

Вар. 34

Вар. 74

Вар. 114

Вар. 154

Вар. 194

Вар. 234

Вар. 274

Вар. 314

Вар. 354

Вар. 394

Вар. 434

2-5 мкг/л

Вар. 35

Вар. 75

Вар. 115

Вар. 155

Вар. 195

Вар. 235

Вар. 275

Вар. 315

Вар. 355

Вар. 395

Вар. 435

3-5 мкг/л

Вар. 36

Вар. 76

Вар. 116

Вар. 156

Вар. 196

Вар. 236

Вар. 276

Вар. 316

Вар. 356

Вар. 396

Вар. 436

4-5 мкг/л

Вар. 37

Вар. 77

Вар. 117

Вар. 157

Вар. 197

Вар. 237

Вар. 277

Вар. 317

Вар. 357

Вар. 397

Вар. 437

1-4 мкг/л

Вар. 38

Вар. 78

Вар. 118

Вар. 158

Вар. 198

Вар. 238

Вар. 278

Вар. 318

Вар. 358

Вар. 398

Вар. 438

2-4 мкг/л

Вар. 39

Вар. 79

Вар. 119

Вар. 159

Вар. 199

Вар. 239

Вар. 279

Вар. 319

Вар. 359

Вар. 399

Вар. 439

3-4 мкг/л

Вар. 40

Вар. 80

Вар. 120

Вар. 160

Вар. 200

Вар. 240

Вар. 280

Вар. 320

Вар. 360

Вар. 400

Вар. 440

*Н.О. = не определено *НБЧ= не более чем *ПММ = по меньшей мере

- 16 041947

Согласно некоторым вариантам реализации добавление в среды меди согласно настоящему изобретению производится путем дополнения основных сред, не содержащих животных белков и/или сред с заданным химическим составом. Способы получения не содержащих животных белков и культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и в опубликованных заявках на патент США №№2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Согласно одному из вариантов реализации основная культуральная среда, применяемая в способах, описанных в настоящем изобретении, представляет собой не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду. Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда может быть средой с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанные культуральные среды могут содержать по меньшей мере один полиамин в концентрации от приблизительно 0,5 мг/л до приблизительно 10 мг/л.

Согласно дальнейшим вариантам реализации и в дополнение к любым описанным выше согласно настоящему изобретению предложены культуральные среды, для получения которых в основную среду добавляют медь и по меньшей мере что-либо одно из кальция, цинка и/или витамина В3. Согласно определенным вариантам реализации указанная среда может не содержать животных белков, не содержать олигопептидов или представлять собой среду с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанная не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду получают согласно описанию в патентах США № 6171825 и №6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США №№2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей; оба источника включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей; и добавлением дополнительной меди и необязательно одного или более из кальция, цинка и витамина В3. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда с заданным химическим составом может быть сходной со смесью (1:1) модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма F12 (DMEM/Хэма F12), куда добавлена дополнительная медь и необязательно кальций, цинк и/или витамин В3 для увеличения удельной активности rVWF или rA13, экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной среде. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда не содержит животных компонентов. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит белок, например, животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. Согласно другому варианту реализации указанная культура содержит добавленные экзогенные рекомбинантные белки. Согласно другому варианту реализации указанные белки получены от сертифицированного свободного от патогенов животного.

Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин принадлежит группе из орнитина, путресцина, спермина или спермидина или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина.

Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 мг/л до 10 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 мг/л до 8 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин входит в группу из орнитина, путресцина, спермина или спермидина, или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.

Согласно дальнейшим аспектам помимо меди применяемые согласно настоящему изобретению среды для клеточных культур также могут содержат что-либо одно или более из: дополнительного кальция, цинка, одного или более витамина, и любых их комбинаций.

Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль кальция; неограничивающие примеры приемлемых солей включают CaCl₂, CaFPO₃2Н₂О, CaI₂,

- 17 041947

CaBr2, (C₂H₃O₂)₂Ca, (CHO2)2Ca, (C₆H₇O₆)₂Ca, (С₆Н₅О₇)₂Са3-2Н2О и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль кальция.

Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль цинка; неограничивающие примеры приемлемых солей включают ZnSO₄-7H₂O, ZnSO₃-2H2O, (С6Н₅О7^п₃-2ЩО, ZnBr2, ZnBr₂-2H₂O, ZnCh, Zn ЩОз)₂-6Н₂О, ZnfHPO^W, (C^O^Zn^O и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль цинка. Согласно другим вариантам реализации цинк-содержащий пептидный или белковый препарат, например, инсулин, может применяться для добавления в описываемую в настоящем изобретении культуру.

Согласно дальнейшим аспектам основные клеточные среды с добавлением меди и одного или более из описанных выше дополнительных веществ можно также применять в культурах с низкими уровнями аммония в супернатанте. Согласно определенным вариантам реализации дополненные среды для клеточных культур для применения согласно настоящему изобретения дают уровни аммония в растворе культуры клеток менее 10 мМ. Согласно дальнейшим вариантам реализации дополненную среду для клеточных культур согласно настоящему изобретению применяют при уровнях аммония в культуре клеток, составляющих приблизительно 0,5-9,5; 1,0-9,0; 1,5-8,5; 2,0-8,0; 2,5-7,5; 3,0-7,0; 3,5-6,5; 4,0-6,0; 4,5-5,5 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации указанные концентрации меди и аммония в среде для клеточных культур и супернатанте культуры клеток поддерживают на протяжении длительного периода времени в течение процесса производства. Согласно конкретному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония в культуре клеток поддерживают на протяжении процесса производства, т.е. в течение времени, пока rVWF или rA13 экспрессируют и выделяют из крупномасштабной культуры клеток. Согласно определенным вариантам реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в культуральном растворе на уровне согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в течение всего периода такого производственного процесса.

Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть представлена жидкой, сухой или порошковой формой. Указанная среда может быть предварительно разделена на аликвоты, содержащие количества, подходящие для однократного применения, либо большие количества, подходящие для более чем одной клеточной культуры. Как правило, среда согласно настоящему изобретению представлена в стерильном виде.

Ниже обсуждаются характерные особенности сред для клеточных культур, подходящих для получения rVWF или rA13. Несмотря на то, что они описаны применительно либо к rVWF, либо к RA13, необходимо понимать, что любые приведенные ниже описания, относящиеся к rVWF, подходят и для RA13, и наоборот.

А. Среды для клеточных культур для получения рекомбинантного VWF.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к раствору культуры клеток для получения рекомбинантных vWF, более конкретно - высокомолекулярных vWF, обладающих высокой удельной активностью, которые описаны ниже в настоящем изобретении. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение предлагает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащий среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающие удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.

Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно описанию выше. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере

- 18 041947 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения среды для клеточных культур могут содержать медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, согласно другому варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 3 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 15 мкг/л, и согласно дальнейшему варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 20 мкг/л.

Согласно другим вариантам реализации концентрация меди в среде для клеточных культур согласно настоящему изобретению может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг г/л, согласно другому варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 15 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 10 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг г/л до приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 6 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 15 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 8 мкг/л, и согласно дальнейшему варианту реализации - от приблизительно 4 мкг/л до приблизительно 6 мкг г/л.

Согласно настоящему изобретению также предложены наборы для экспрессии или получения rVWF; указанные наборы содержат культуральную среду, подходящую для экспрессии rVWF, обладающего высокой удельной активностью.

В. Среды для клеточных культур для получения ADAMTS13 (А13).

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает культуральные среды, подходящие для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью. Удачным образом, было обнаружено, что добавление в культуральную среду меди значительно повышает активность рекомбинантных ферментов ADAMTS (например, rADAMTS13), экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной дополненной среде, в то время как указанные ферменты экспрессируются на уровнях, равных или превышающих таковые для клеток, культивируемых в среде без добавок.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает среды для клеточных культур с добавлением меди для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS 13 с высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди, составляющей от приблизительно 2 до приблизительно 4 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди приблизительно 1-3, 2-3, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды содержат медь в концентрации по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит от 2 мкг/л до 20 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 1 мкг/л до 6 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 2 мкг/л до 5 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 3 мкг/л до 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди, или по меньшей мере 2 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 11 мкг/л, 12 мкг/л, 13 мкг/л, 14 мкг/л, 15 мкг/л, 16 мкг/л, 17 мкг/л, 18 мкг/л, 19 мкг/л, 20 мкг/л, либо более высокие концентрации меди.

Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно приведенному выше описанию. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней, или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно

- 19 041947 конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).

Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2.

Таблица 2

Типовые варианты реализации концентраций меди и цинка в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13

Концентрация цинка

пмм 2 мкМ

ПММ 3 мкМ

ПММ 4 мкМ

ПММ 5 мкМ

ПММ 6 мкМ

ПММ 7 мкМ

ПММ 8 мкМ

ПММ 9 мкМ

ПММ 10 мкМ

2-12 мкМ

5-12 мкМ

Концентрация меди

пмм 1 мкг/л

Вар. 441

Вар. 481

Вар. 521

Вар. 561

Вар. 601

Вар. 641

Вар. 681

Вар. 721

Вар. 761

Вар. 801

Вар. 841

ПММ 2 мкг/л

Вар. 442

Вар. 482

Вар. 522

Вар. 562

Вар. 602

Вар. 642

Вар. 682

Вар. 722

Вар. 762

Вар. 802

Вар. 842

ПММ 3 мкг/л

Вар. 443

Вар. 483

Вар. 523

Вар. 563

Вар. 603

Вар. 643

Вар. 683

Вар. 723

Вар. 763

Вар. 803

Вар. 843

ПММ 4 мкг/л

Вар. 444

Вар. 484

Вар. 524

Вар. 564

Вар. 604

Вар. 644

Вар. 684

Вар. 724

Вар. 764

Вар. 804

Вар. 844

ПММ 5 мкг/л

Вар. 445

Вар. 485

Вар. 525

Вар. 565

Вар. 605

Вар. 645

Вар. 685

Вар. 725

Вар. 765

Вар. 805

Вар. 845

ПММ 6 мкг/л

Вар. 446

Вар. 486

Вар. 526

Вар. 566

Вар. 606

Вар. 646

Вар. 686

Вар. 726

Вар. 766

Вар. 806

Вар. 846

ПММ 7 мкг/л

Вар. 447

Вар. 487

Вар. 527

Вар. 567

Вар. 607

Вар. 647

Вар. 687

Вар. 727

Вар. 767

Вар. 807

Вар. 847

ПММ 8 мкг/л

Вар. 448

Вар. 488

Вар. 528

Вар. 568

Вар. 608

Вар. 648

Вар. 688

Вар. 728

Вар. 768

Вар. 808

Вар. 848

ПММ 9 мкг/л

Вар. 449

Вар. 489

Вар. 529

Вар. 569

Вар. 609

Вар. 649

Вар. 689

Вар. 729

Вар. 769

Вар. 809

Вар. 849

ПММ 10 мкг/л

Вар. 450

Вар. 490

Вар. 530

Вар. 570

Вар. 610

Вар. 650

Вар. 690

Вар. 730

Вар. 770

Вар. 810

Вар. 850

Приблизительно 1 мкг/л

Вар. 451

Вар. 491

Вар. 531

Вар. 571

Вар. 611

Вар. 651

Вар. 691

Вар. 731

Вар. 771

Вар. 811

Вар. 851

Приблизительно 1.5 мкг/л

Вар. 452

Вар. 492

Вар. 532

Вар. 572

Вар. 612

Вар. 652

Вар. 692

Вар. 732

Вар. 772

Вар. 812

Вар. 852

Приблизительно

Вар.

- 20 041947

2 мкг/л

453

493

533

573

613

653

693

733

773

813

853

Приблизительно 2.5 мкг/л

Вар. 454

Вар. 494

Вар. 534

Вар. 574

Вар. 614

Вар. 654

Вар. 694

Вар. 734

Вар. 774

Вар. 814

Вар. 854

Приблизительно 3 мкг/л

Вар. 455

Вар. 495

Вар. 535

Вар. 575

Вар. 615

Вар. 655

Вар. 695

Вар. 735

Вар. 775

Вар. 815

Вар. 855

Приблизительно 3,5 мкг/л

Вар. 456

Вар. 496

Вар. 536

Вар. 576

Вар. 616

Вар. 656

Вар. 696

Вар. 736

Вар. 776

Вар. 816

Вар. 856

Приблизительно 4 мкг/л

Вар. 457

Вар. 497

Вар. 537

Вар. 577

Вар. 617

Вар. 657

Вар. 697

Вар. 737

Вар. 777

Вар. 817

Вар. 857

Приблизительно 4.5 мкг/л

Вар. 458

Вар. 498

Вар. 538

Вар. 578

Вар. 618

Вар. 658

Вар. 698

Вар. 738

Вар. 778

Вар. 818

Вар. 858

Приблизительно 5 мкг/л

Вар. 459

Вар. 499

Вар. 539

Вар. 579

Вар. 619

Вар. 659

Вар. 699

Вар. 739

Вар. 779

Вар. 819

Вар. 859

Приблизительно 5.5 мкг/л

Вар. 460

Вар. 500

Вар. 540

Вар. 580

Вар. 620

Вар. 660

Вар. 700

Вар. 740

Вар. 780

Вар. 820

Вар. 860

Приблизительно 6 мкг/л

Вар. 461

Вар. 501

Вар. 541

Вар. 581

Вар. 621

Вар. 661

Вар. 701

Вар. 741

Вар. 781

Вар. 821

Вар. 861

Приблизительно 7 мкг/л

Вар. 462

Вар. 502

Вар. 542

Вар. 582

Вар. 622

Вар. 662

Вар. 702

Вар. 742

Вар. 782

Вар. 822

Вар. 862

Приблизительно 8 мкг/л

Вар. 463

Вар. 503

Вар. 543

Вар. 583

Вар. 623

Вар. 663

Вар. 703

Вар. 743

Вар. 783

Вар. 823

Вар. 863

Приблизительно 9 мкг/л

Вар. 464

Вар. 504

Вар. 544

Вар. 584

Вар. 624

Вар. 664

Вар. 704

Вар. 744

Вар. 784

Вар. 824

Вар. 864

Приблизительно 10 мкг/л

Вар. 465

Вар. 505

Вар. 545

Вар. 585

Вар. 625

Вар. 665

Вар. 705

Вар. 745

Вар. 785

Вар. 825

Вар. 865

1-20 мкг/л

Вар. 466

Вар. 506

Вар. 546

Вар. 586

Вар. 626

Вар. 666

Вар. 706

Вар. 746

Вар. 786

Вар. 826

Вар. 866

2-20 мкг/л

Вар. 467

Вар. 507

Вар. 547

Вар. 587

Вар. 627

Вар. 667

Вар. 707

Вар. 747

Вар. 787

Вар. 827

Вар. 867

1-10 мкг/л

Вар. 468

Вар. 508

Вар. 548

Вар. 588

Вар. 628

Вар. 668

Вар. 708

Вар. 748

Вар. 788

Вар. 828

Вар. 868

2-10 мкг/л

Вар. 469

Вар. 509

Вар. 549

Вар. 589

Вар. 629

Вар. 669

Вар. 709

Вар. 749

Вар. 789

Вар. 829

Вар. 869

1-6 мкг/л

Вар. 470

Вар. 510

Вар. 550

Вар. 590

Вар. 630

Вар. 670

Вар. 710

Вар. 750

Вар. 790

Вар. 830

Вар. 870

2-6 мкг/л

Вар. 471

Вар. 511

Вар. 551

Вар. 591

Вар. 631

Вар. 671

Вар. 711

Вар. 751

Вар. 791

Вар. 831

Вар. 871

3-6 мкг/л

Вар. 472

Вар. 512

Вар. 552

Вар. 592

Вар. 632

Вар. 672

Вар. 712

Вар. 752

Вар. 792

Вар. 832

Вар. 872

4-6 мкг/л

Вар. 473

Вар. 513

Вар. 553

Вар. 593

Вар. 633

Вар. 673

Вар. 713

Вар. 753

Вар. 793

Вар. 833

Вар. 873

1-5 мкг/л

Вар. 474

Вар. 514

Вар. 554

Вар. 594

Вар. 634

Вар. 674

Вар. 714

Вар. 754

Вар. 794

Вар. 834

Вар. 874

2-5 мкг/л

Вар. 475

Вар. 515

Вар. 555

Вар. 595

Вар. 635

Вар. 675

Вар. 715

Вар. 755

Вар. 795

Вар. 835

Вар. 875

3-5 мкг/л

Вар. 476

Вар. 516

Вар. 556

Вар. 596

Вар. 636

Вар. 676

Вар. 716

Вар. 756

Вар. 796

Вар. 836

Вар. 876

4-5 мкг/л

Вар. 477

Вар. 517

Вар. 557

Вар. 597

Вар. 637

Вар. 677

Вар. 717

Вар. 757

Вар. 797

Вар. 837

Вар. 877

1-4 мкг/л

Вар. 478

Вар. 518

Вар. 558

Вар. 598

Вар. 638

Вар. 678

Вар. 718

Вар. 758

Вар. 798

Вар. 838

Вар. 878

2-4 мкг/л

Вар. 479

Вар. 519

Вар. 559

Вар. 599

Вар. 639

Вар. 679

Вар. 719

Вар. 759

Вар. 799

Вар. 839

Вар. 879

3-4 мкг/л

Вар. 480

Вар. 520

Вар. 560

Вар. 600

Вар. 640

Вар. 680

Вар. 720

Вар. 760

Вар. 800

Вар. 840

Вар. 880

*ПММ = по меньшей мере

Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации

- 21 041947 концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).

Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ, или более, кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3.

Таблица 3

Типовые варианты реализации концентраций меди и кальция в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13

Концентрация кальция

пмм 0,5 мМ

ПММ 0,75 мМ

ПММ 1,0 мМ

ПММ 1,25 мМ

ПММ 1,5 мМ

ПММ 2,0 мМ

ПММ 2,5 мМ

ПММ 3,0 мМ

ПММ 4 мМ

ПММ 5 мМ

0,51,5 мМ

Концентрация меди

пмм 1 мкг/л

Вар. 881

Вар. 921

Вар. 961

Вар. 1001

Вар. 1041

Вар. 1081

Вар. 1121

Вар. 1161

Вар. 1201

Вар. 1241

Вар. 1281

ПММ 2 мкг/л

Вар. 882

Вар. 922

Вар. 962

Вар. 1002

Вар. 1042

Вар. 1082

Вар. 1122

Вар. 1162

Вар. 1202

Вар. 1242

Вар. 1282

ПММ 3 мкг/л

Вар. 883

Вар. 923

Вар. 963

Вар. 1003

Вар. 1043

Вар. 1083

Вар. 1123

Вар. 1163

Вар. 1203

Вар. 1243

Вар. 1283

ПММ 4 мкг/л

Вар. 884

Вар. 924

Вар. 964

Вар. 1004

Вар. 1044

Вар. 1084

Вар. 1124

Вар. 1164

Вар. 1204

Вар. 1244

Вар. 1284

ПММ 5 мкг/л

Вар. 885

Вар. 925

Вар. 965

Вар. 1005

Вар. 1045

Вар. 1085

Вар. 1125

Вар. 1165

Вар. 1205

Вар. 1245

Вар. 1285

ПММ 6 мкг/л

Вар. 886

Вар. 926

Вар. 966

Вар. 1006

Вар. 1046

Вар. 1086

Вар. 1126

Вар. 1166

Вар. 1206

Вар. 1246

Вар. 1286

ПММ 7 мкг/л

Вар. 887

Вар. 927

Вар. 967

Вар. 1007

Вар. 1047

Вар. 1087

Вар. 1127

Вар. 1167

Вар. 1207

Вар. 1247

Вар. 1287

ПММ 8 мкг/л

Вар. 888

Вар. 928

Вар. 968

Вар. 1008

Вар. 1048

Вар. 1088

Вар. 1128

Вар. 1168

Вар. 1208

Вар. 1248

Вар. 1288

ПММ 9 мкг/л

Вар. 889

Вар. 929

Вар. 969

Вар. 1009

Вар. 1049

Вар. 1089

Вар. 1129

Вар. 1169

Вар. 1209

Вар. 1249

Вар. 1289

ПММ 10 мкг/л

Вар. 890

Вар. 930

Вар. 970

Вар. 1010

Вар. 1050

Вар. 1090

Вар. ИЗО

Вар. 1170

Вар. 1210

Вар. 1250

Вар. 1290

Приблизительно 1 мкг/л

Вар. 891

Вар. 931

Вар. 971

Вар. 1011

Вар. 1051

Вар. 1091

Вар. 1131

Вар. 1171

Вар. 1211

Вар. 1251

Вар. 1291

Приблизительно 1,5 мкг/л

Вар. 892

Вар. 932

Вар. 972

Вар. 1012

Вар. 1052

Вар. 1092

Вар. 1132

Вар. 1172

Вар. 1212

Вар. 1252

Вар. 1292

Приблизительно 2 мкг/л

Вар. 893

Вар. 933

Вар. 973

Вар. 1013

Вар. 1053

Вар. 1093

Вар. 1133

Вар. 1173

Вар. 1213

Вар. 1253

Вар. 1293

- 22 041947

Приблизительно 2,5 мкг/л

Вар. 894

Вар. 934

Вар. 974

Вар. 1014

Вар. 1054

Вар. 1094

Вар. 1134

Вар. 1174

Вар. 1214

Вар. 1254

Вар. 1294

Приблизительно 3 мкг/л

Вар. 895

Вар. 935

Вар. 975

Вар. 1015

Вар. 1055

Вар. 1095

Вар. 1135

Вар. 1175

Вар. 1215

Вар. 1255

Вар. 1295

Приблизительно 3,5 мкг/л

Вар. 896

Вар. 936

Вар. 976

Вар. 1016

Вар. 1056

Вар. 1096

Вар. 1136

Вар. 1176

Вар. 1216

Вар. 1256

Вар. 1296

Приблизительно 4 мкг/л

Вар. 897

Вар. 937

Вар. 977

Вар. 1017

Вар. 1057

Вар. 1097

Вар. 1137

Вар. 1177

Вар. 1217

Вар. 1257

Вар. 1297

Приблизительно 4,5 мкг/л

Вар. 898

Вар. 938

Вар. 978

Вар. 1018

Вар. 1058

Вар. 1098

Вар. 1138

Вар. 1178

Вар. 1218

Вар. 1258

Вар. 1298

Приблизительно 5 мкг/л

Вар. 899

Вар. 939

Вар. 979

Вар. 1019

Вар. 1059

Вар. 1099

Вар. 1139

Вар. 1179

Вар. 1219

Вар. 1259

Вар. 1299

Приблизительно 5,5 мкг/л

Вар. 900

Вар. 940

Вар. 980

Вар. 1020

Вар. 1060

Вар. 1100

Вар. 1140

Вар. 1180

Вар. 1220

Вар. 1260

Вар. 1300

Приблизительно 6 мкг/л

Вар. 901

Вар. 941

Вар. 981

Вар. 1021

Вар. 1061

Вар. 1101

Вар. 1141

Вар. 1181

Вар. 1221

Вар. 1261

Вар. 1301

Приблизительно 7 мкг/л

Вар. 902

Вар. 942

Вар. 982

Вар. 1022

Вар. 1062

Вар. 1102

Вар. 1142

Вар. 1182

Вар. 1222

Вар. 1262

Вар. 1302

Приблизительно 8 мкг/л

Вар. 903

Вар. 943

Вар. 983

Вар. 1023

Вар. 1063

Вар. 1103

Вар. 1143

Вар. 1183

Вар. 1223

Вар. 1263

Вар. 1303

Приблизительно 9 мкг/л

Вар. 904

Вар. 944

Вар. 984

Вар. 1024

Вар. 1064

Вар. 1104

Вар. 1144

Вар. 1184

Вар. 1224

Вар. 1264

Вар. 1304

Приблизительно 10 мкг/л

Вар. 905

Вар. 945

Вар. 985

Вар. 1025

Вар. 1065

Вар. 1105

Вар. 1145

Вар. 1185

Вар. 1225

Вар. 1265

Вар. 1305

1-20 мкг/л

Вар. 906

Вар. 946

Вар. 986

Вар. 1026

Вар. 1066

Вар. 1106

Вар. 1146

Вар. 1186

Вар. 1226

Вар. 1266

Вар. 1306

2-20 мкг/л

Вар. 907

Вар. 947

Вар. 987

Вар. 1027

Вар. 1067

Вар. 1107

Вар. 1147

Вар. 1187

Вар. 1227

Вар. 1267

Вар. 1307

1-10 мкг/л

Вар. 908

Вар. 948

Вар. 988

Вар. 1028

Вар. 1068

Вар. 1108

Вар. 1148

Вар. 1188

Вар. 1228

Вар. 1268

Вар. 1308

2-10 мкг/л

Вар. 909

Вар. 949

Вар. 989

Вар. 1029

Вар. 1069

Вар. 1109

Вар. 1149

Вар. 1189

Вар. 1229

Вар. 1269

Вар. 1309

1-6 мкг/л

Вар. 910

Вар. 950

Вар. 990

Вар. 1030

Вар. 1070

Вар. 1110

Вар. 1150

Вар. 1190

Вар. 1230

Вар. 1270

Вар. 1310

2-6 мкг/л

Вар. 911

Вар. 951

Вар. 991

Вар. 1031

Вар. 1071

Вар. 1111

Вар. 1151

Вар. 1191

Вар. 1231

Вар. 1271

Вар. 1311

3-6 мкг/л

Вар. 912

Вар. 952

Вар. 992

Вар. 1032

Вар. 1072

Вар. 1112

Вар. 1152

Вар. 1192

Вар. 1232

Вар. 1272

Вар. 1312

4-6 мкг/л

Вар. 913

Вар. 953

Вар. 993

Вар. 1033

Вар. 1073

Вар. 1113

Вар. 1153

Вар. 1193

Вар. 1233

Вар. 1273

Вар. 1313

1-5 мкг/л

Вар. 914

Вар. 954

Вар. 994

Вар. 1034

Вар. 1074

Вар. 1114

Вар. 1154

Вар. 1194

Вар. 1234

Вар. 1274

Вар. 1314

2-5 мкг/л

Вар. 915

Вар. 955

Вар. 995

Вар. 1035

Вар. 1075

Вар. 1115

Вар. 1155

Вар. 1195

Вар. 1235

Вар. 1275

Вар. 1315

3-5 мкг/л

Вар. 916

Вар. 956

Вар. 996

Вар. 1036

Вар. 1076

Вар. 1116

Вар. 1156

Вар. 1196

Вар. 1236

Вар. 1276

Вар. 1316

4-5 мкг/л

Вар. 917

Вар. 957

Вар. 997

Вар. 1037

Вар. 1077

Вар. 1117

Вар. 1157

Вар. 1197

Вар. 1237

Вар. 1277

Вар. 1317

1-4 мкг/л

Вар. 918

Вар. 958

Вар. 998

Вар. 1038

Вар. 1078

Вар. 1118

Вар. 1158

Вар. 1198

Вар. 1238

Вар. 1278

Вар. 1318

2-4 мкг/л

Вар. 919

Вар. 959

Вар. 999

Вар. 1039

Вар. 1079

Вар. 1119

Вар. 1159

Вар. 1199

Вар. 1239

Вар. 1279

Вар. 1319

3-4 мкг/л

Вар. 920

Вар. 960

Вар. 1000

Вар. 1040

Вар. 1080

Вар. 1120

Вар. 1160

Вар. 1200

Вар. 1240

Вар. 1280

Вар. 1320

*ПММ = по меньшей мере

Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне, не превышающем 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 8811320, приведенных в табл.3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному вариан

- 23 041947 ту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).

Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и кальций. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 мМ и 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.

Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамин В3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 мг/л до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4.

- 24 041947

Таблица 4

Типовые варианты реализации концентраций меди и никотинамида в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13

Концентрация кальция

пмм 2 мг/мл

ПММ 3 мг/мл

ПММ 4 мг/мл

ПММ 5 мг/мл

ПММ 6 мг/мл

ПММ 7 мг/мл

ПММ 8 мг/мл

ПММ 9 мг/мл

ПММ 10 мг/мл

ПММ 15 мг/мл

2-10 мг/мл

Концентрация меди

пмм 1 мкг/л

Вар. 1321

Вар. 1361

Вар. 1401

Вар. 1441

Вар. 1481

Вар. 1521

Вар. 1561

Вар. 1601

Вар. 1641

Вар. 1681

Вар. 1721

ПММ 2 мкг/л

Вар. 1322

Вар. 1362

Вар. 1402

Вар. 1442

Вар. 1482

Вар. 1522

Вар. 1562

Вар. 1602

Вар. 1642

Вар. 1682

Вар. 1722

ПММ 3 мкг/л

Вар. 1323

Вар. 1363

Вар. 1403

Вар. 1443

Вар. 1483

Вар. 1523

Вар. 1563

Вар. 1603

Вар. 1643

Вар. 1683

Вар. 1723

ПММ 4 мкг/л

Вар. 1324

Вар. 1364

Вар. 1404

Вар. 1444

Вар. 1484

Вар. 1524

Вар. 1564

Вар. 1604

Вар. 1644

Вар. 1684

Вар. 1724

ПММ 5 мкг/л

Вар. 1325

Вар. 1365

Вар. 1405

Вар. 1445

Вар. 1485

Вар. 1525

Вар. 1565

Вар. 1605

Вар. 1645

Вар. 1685

Вар. 1725

ПММ 6 мкг/л

Вар. 1326

Вар. 1366

Вар. 1406

Вар. 1446

Вар. 1486

Вар. 1526

Вар. 1566

Вар. 1606

Вар. 1646

Вар. 1686

Вар. 1726

ПММ 7 мкг/л

Вар. 1327

Вар. 1367

Вар. 1407

Вар. 1447

Вар. 1487

Вар. 1527

Вар. 1567

Вар. 1607

Вар. 1647

Вар. 1687

Вар. 1727

ПММ 8 мкг/л

Вар. 1328

Вар. 1368

Вар. 1408

Вар. 1448

Вар. 1488

Вар. 1528

Вар. 1568

Вар. 1608

Вар. 1648

Вар. 1688

Вар. 1728

ПММ 9 мкг/л

Вар. 1329

Вар. 1369

Вар. 1409

Вар. 1449

Вар. 1489

Вар. 1529

Вар. 1569

Вар. 1609

Вар. 1649

Вар. 1689

Вар. 1729

ПММ 10 мкг/л

Вар. 1330

Вар. 1370

Вар. 1410

Вар. 1450

Вар. 1490

Вар. 1530

Вар. 1570

Вар. 1610

Вар. 1650

Вар. 1690

Вар. 1730

Приблизительно 1 мкг/л

Вар. 1331

Вар. 1371

Вар. 1411

Вар. 1451

Вар. 1491

Вар. 1531

Вар. 1571

Вар. 1611

Вар. 1651

Вар. 1691

Вар. 1731

Приблизительно 1,5 мкг/л

Вар. 1332

Вар. 1372

Вар. 1412

Вар. 1452

Вар. 1492

Вар. 1532

Вар. 1572

Вар. 1612

Вар. 1652

Вар. 1692

Вар. 1732

Приблизительно 2 мкг/л

Вар. 1333

Вар. 1373

Вар. 1413

Вар. 1453

Вар. 1493

Вар. 1533

Вар. 1573

Вар. 1613

Вар. 1653

Вар. 1693

Вар. 1733

Приблизительно 2,5 мкг/л

Вар. 1334

Вар. 1374

Вар. 1414

Вар. 1454

Вар. 1494

Вар. 1534

Вар. 1574

Вар. 1614

Вар. 1654

Вар. 1694

Вар. 1734

Приблизительно 3 мкг/л

Вар. 1335

Вар. 1375

Вар. 1415

Вар. 1455

Вар. 1495

Вар. 1535

Вар. 1575

Вар. 1615

Вар. 1655

Вар. 1695

Вар. 1735

Приблизительно 3,5 мкг/л

Вар. 1336

Вар. 1376

Вар. 1416

Вар. 1456

Вар. 1496

Вар. 1536

Вар. 1576

Вар. 1616

Вар. 1656

Вар. 1696

Вар. 1736

Приблизительно 4 мкг/л

Вар. 1337

Вар. 1377

Вар. 1417

Вар. 1457

Вар. 1497

Вар. 1537

Вар. 1577

Вар. 1617

Вар. 1657

Вар. 1697

Вар. 1737

Приблизительно 4,5 мкг/л

Вар. 1338

Вар. 1378

Вар. 1418

Вар. 1458

Вар. 1498

Вар. 1538

Вар. 1578

Вар. 1618

Вар. 1658

Вар. 1698

Вар. 1738

Приблизительно 5 мкг/л

Вар. 1339

Вар. 1379

Вар. 1419

Вар. 1459

Вар. 1499

Вар. 1539

Вар. 1579

Вар. 1619

Вар. 1659

Вар. 1699

Вар. 1739

Приблизительно 5,5 мкг/л

Вар. 1340

Вар. 1380

Вар. 1420

Вар. 1460

Вар. 1500

Вар. 1540

Вар. 1580

Вар. 1620

Вар. 1660

Вар. 1700

Вар. 1740

Приблизительно 6 мкг/л

Вар. 1341

Вар. 1381

Вар. 1421

Вар. 1461

Вар. 1501

Вар. 1541

Вар. 1581

Вар. 1621

Вар. 1661

Вар. 1701

Вар. 1741

Приблизительно 7 мкг/л

Вар. 1342

Вар. 1382

Вар. 1422

Вар. 1462

Вар. 1502

Вар. 1542

Вар. 1582

Вар. 1622

Вар. 1662

Вар. 1702

Вар. 1742

Приблизительно 8 мкг/л

Вар. 1343

Вар. 1383

Вар. 1423

Вар. 1463

Вар. 1503

Вар. 1543

Вар. 1583

Вар. 1623

Вар. 1663

Вар. 1703

Вар. 1743

Приблизительно 9 мкг/л

Вар. 1344

Вар. 1384

Вар. 1424

Вар. 1464

Вар. 1504

Вар. 1544

Вар. 1584

Вар. 1624

Вар. 1664

Вар. 1704

Вар. 1744

Приблизительно 10 мкг/л

Вар. 1345

Вар. 1385

Вар. 1425

Вар. 1465

Вар. 1505

Вар. 1545

Вар. 1585

Вар. 1625

Вар. 1665

Вар. 1705

Вар. 1745

1-20 мкг/л

Вар. 1346

Вар. 1386

Вар. 1426

Вар. 1466

Вар. 1506

Вар. 1546

Вар. 1586

Вар. 1626

Вар. 1666

Вар. 1706

Вар. 1746

2-20 мкг/л

Вар. 1347

Вар. 1387

Вар. 1427

Вар. 1467

Вар. 1507

Вар. 1547

Вар. 1587

Вар. 1627

Вар. 1667

Вар. 1707

Вар. 1747

- 25 041947

1-10 мкг/л

Вар. 1348

Вар. 1388

Вар. 1428

Вар. 1468

Вар. 1508

Вар. 1548

Вар. 1588

Вар. 1628

Вар. 1668

Вар. 1708

Вар. 1748

2-10 мкг/л

Вар. 1349

Вар. 1389

Вар. 1429

Вар. 1469

Вар. 1509

Вар. 1549

Вар. 1589

Вар. 1629

Вар. 1669

Вар. 1709

Вар. 1749

1-6 мкг/л

Вар. 1350

Вар. 1390

Вар. 1430

Вар. 1470

Вар. 1510

Вар. 1550

Вар. 1590

Вар. 1630

Вар. 1670

Вар. 1710

Вар. 1750

2-6 мкг/л

Вар. 1351

Вар. 1391

Вар. 1431

Вар. 1471

Вар. 1511

Вар. 1551

Вар. 1591

Вар. 1631

Вар. 1671

Вар. 1711

Вар. 1751

3-6 мкг/л

Вар. 1352

Вар. 1392

Вар. 1432

Вар. 1472

Вар. 1512

Вар. 1552

Вар. 1592

Вар. 1632

Вар. 1672

Вар. 1712

Вар. 1752

4-6 мкг/л

Вар. 1353

Вар. 1393

Вар. 1433

Вар. 1473

Вар. 1513

Вар. 1553

Вар. 1593

Вар. 1633

Вар. 1673

Вар. 1713

Вар. 1753

1-5 мкг/л

Вар. 1354

Вар. 1394

Вар. 1434

Вар. 1474

Вар. 1514

Вар. 1554

Вар. 1594

Вар. 1634

Вар. 1674

Вар. 1714

Вар. 1754

2-5 мкг/л

Вар. 1355

Вар. 1395

Вар. 1435

Вар. 1475

Вар. 1515

Вар. 1555

Вар. 1595

Вар. 1635

Вар. 1675

Вар. 1715

Вар. 1755

3-5 мкг/л

Вар. 1356

Вар. 1396

Вар. 1436

Вар. 1476

Вар. 1516

Вар. 1556

Вар. 1596

Вар. 1636

Вар. 1676

Вар. 1716

Вар. 1756

4-5 мкг/л

Вар. 1357

Вар. 1397

Вар. 1437

Вар. 1477

Вар. 1517

Вар. 1557

Вар. 1597

Вар. 1637

Вар. 1677

Вар. 1717

Вар. 1757

1-4 мкг/л

Вар. 1358

Вар. 1398

Вар. 1438

Вар. 1478

Вар. 1518

Вар. 1558

Вар. 1598

Вар. 1638

Вар. 1678

Вар. 1718

Вар. 1758

2-4 мкг/л

Вар. 1359

Вар. 1399

Вар. 1439

Вар. 1479

Вар. 1519

Вар. 1559

Вар. 1599

Вар. 1639

Вар. 1679

Вар. 1719

Вар. 1759

3-4 мкг/л

Вар. 1360

Вар. 1400

Вар. 1440

Вар. 1480

Вар. 1520

Вар. 1560

Вар. 1600

Вар. 1640

Вар. 1680

Вар. 1720

Вар. 1760

*ПММ = по меньшей мере

Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее, и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).

Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441- 880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2.

Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, кальций и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никоти

- 26 041947 намид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл до 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3.

III. Способы получения факторов крови с высокой удельной активностью А. Способы культивирования клеток.

Настоящее изобретение обеспечивает способы крупномасштабного производства рекомбинантных белков (таких как rVWF и rA13). Согласно определенным вариантам реализации в таких способах крупномасштабного производства применяют реакторы с мешалкой/перемешиванием для получения указанных терапевтических рекомбинантных белков.

Согласно определенным вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению могут включать применение систем культивирования клеток в периодическом или непрерывном режиме. Например, в случае использования периодических культур клеток к ним может применяться режим однократного периодического культивирования, подпитываемого культивирования или повторного периодического культивирования. Сходным образом, к непрерывным культурам клеток может применяться, например, перфузионный, турбидостатический или хемостатический режим. Периодическое и непрерывное культивирование клеток может проводиться в условиях суспензионной или адгезионной культуры. В условиях суспензионного культивирования клетки свободно суспендированы и распределены в культуральной среде. Альтернативно, в условиях адгезионного культивирования, клетки связаны с твердой фазой, например, микроносителем, пористым микроносителем, дисковым носителем, керамическим картриджем, полым волокном, плоской пластиной, гель-матрицей и т.п.

Периодическая культура представляет собой, как правило, крупномасштабную культуру клеток, в которой клеточный инокулят культивируют до максимальной плотности в реакторе или ферментере, и собирают и обрабатывают, как при однократном периодическом культивировании. Подпитываемая культура представляет собой, как правило, периодическую культуру, получающую либо свежие питательные вещества (например, ограничивающие рост субстраты), либо добавки (например, предшественники продуктов). Питательный раствор, как правило, является высококонцентрированным, чтобы избежать разбавления в биореакторе. В повторно-периодической культуре клетки помещают в культуральную среду и выращивают до требуемой плотности клеток. Затем, чтобы избежать наступления фазы спада и гибели клеток, культуру разбавляют полной ростовой средой до того, как клетки достигают максимальной концентрации. Количество и частота разведений широко варьирует и зависит от характеристик роста клеточной линии и удобства процесса культивирования. Указанный процесс может повторяться столько раз, сколько потребуется и, если клетки и среда не отбрасываются при пересеве, объем культуры будет увеличиваться ступенчато, по мере каждого следующего разведения. Вопрос увеличивающегося объема может быть решен использованием реактора, имеющего достаточный размер для разбавлений внутри указанного сосуда, либо распределением разбавленной культуры по нескольким сосудам. Принцип указанного типа культивирования состоит в поддержании клеток в экспоненциальной фазе роста. Серийно пересеваемая культура характеризуется тем, что объем указанной культуры всегда постепенно возрастает, может быть несколько сборов, клетки продолжают расти и указанный процесс может продолжаться так долго, как это необходимо. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный белок ADAMTS (например, rADAMTS13) может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный VWF может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры.

Непрерывная культура может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, где, как правило, поддерживается постоянный объем культуры за счет сопутствующего удаления отработанной среды. Согласно хемостатическому и турбидостатическому методам извлеченная среда содержит клетки. Таким образом, клетки, остающиеся в сосуде для культивирования клеток, должны расти для поддержания стационарного состояния. Согласно хемостатическому способу скоростью роста, как правило, управляют посредством контроля степени разбавления, т.е. скорости добавления свежей среды. Скорость роста клеток в культуре может поддерживаться, например, на субмаксимальном уровне, изменением степени разбавления. Напротив, при турбидостатическом способе степень разбавления устанавливают таким образом, чтобы обеспечить максимальную скорость роста, которой могут достигнуть клетки при заданных технологических условиях, таких как рН и температура. Согласно определенным вариантам реализации rVWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта непрерывной культуры. Типовой способ непрерывного культивирования клеток описан в WO/2011/012725 (Grillberger et al.), содержание которой включено в настоящее изобретение

- 27 041947 посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

При перфузионном культивировании извлеченная среда бедна клетками, которые остаются в культуральном сосуде, например, за счет применения способов фильтрации или центрифугирования, приводящих к повторному внесению клеток в культуру. Однако, как правило, используемые для фильтрации задерживают не 100% клеток, и таким образом часть их удаляется при извлечении среды. Очень высокие скорости роста для культивирования в режиме перфузии не критичны, так как большая часть клеток остается в культуральном сосуде. Согласно определенным вариантам реализации rVWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта перфузионной культуры.

Реакционная система с баком-мешалкой может применяться для периодического и непрерывного культивирования клеток в суспензионном или адгезионном режимах. Как правило, указанная реакционная система с баком-мешалкой может эксплуатироваться так, как любой стандартный реактор с мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, Rushton, гидравлический, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.

Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высоких удельных значений площадей поверхности относительно объема культуры для достижения высоких плотностей клеток и экспрессии белка. Один из способов обеспечения таких условий роста заключается в применении микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Принцип роста клеток на микроносителях впервые был описан у van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)); он обеспечивает прикрепление клеток к поверхности небольших твердых частиц, взвешенных в ростовой среде. Указанные способы обеспечивают высокое соотношение поверхность-объем и таким образом обеспечивают эффективную утилизацию питательных веществ. Кроме того, при экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях повышение соотношения поверхность-объем обеспечивает более высокие уровни секреции и таким образом более высокий выход белка в супернатанте культуры. Наконец, указанные способы позволяют легко увеличивать масштаб эукариотических экспрессионных культур.

Клетки, экспрессирующие vWF и/или rA13, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Указанный микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранный из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина, целлюлозы и других, согласно описанию у Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно доращивать клетки до некоторой биомассы на сферических микроносителях, и пересевать указанные клетки при достижении ими конечной для ферментера биомассы, перед получением экспрессированного белка, на пористый микроноситель, или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, и Cytodex™ 3 (GE Healthcare) и крупнопористые микроносители такие как Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

Согласно приведенному выше описанию настоящее изобретение включает среды для клеточных культур, содержащие повышенную концентрацию меди. Понятно, что все варианты реализации изобретения и концентрации, описанные выше в разделе Среды для клеточных культур, применимы к способам согласно настоящему изобретению, описываемых в настоящем изобретении.

Согласно определенным вариантам реализации указанная культура может поддерживаться в течение по меньшей мере приблизительно 7 дней, или по меньшей мере приблизительно 14 дней, 21 дня, 28 дней, или по меньшей мере приблизительно 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, или по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев, или дольше. Плотность клеток, которая поддерживается в культуре клеток для получения рекомбинантного белка vWF или рекомбинантного белка rA13, зависит от условий культивирования и среды, применяемых для экспрессии белка. Специалист в данной области техники легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культивирования клеток с получением rVWF или rA13. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток в указанной культуре поддерживают на уровне от приблизительно 0,5x106 до 4х10⁷ клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 1,0x107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток может поддерживаться на уровне концентрации от приблизительно 2,0x106 до приблизительно 4,0x106 клеток/мл, или от приблизительно 1,0x106 до приблизительно 2,5x106 клеток/мл, или от приблизительно 1,5x106 до приблизительно 3,5x106 клеток/мл, или в любом сходном диапазоне, в течение длительного периода времени.

- 28 041947

Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящем изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной согласно настоящему изобретению, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концен

- 29 041947 трации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Согласно другому варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток

- 30 041947 непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель.

Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х10⁶ клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.

Ниже приведены характерные детали способов получения rVWF и rA13. Следует понимать, что, хотя условия представлены конкретно для rVWF или rA13, указанные условия для rVWF могут применяться для получения rA13 и наоборот.

В. Способы получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения vWF в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония. Используемый в настоящем изобретении термины культура клеток (клеточная культура) и раствор культуры клеток применяют взаимозаменяемо.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий: а) обеспечение культуры клеток; b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительною мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно дальнейшим вариантам реализации мультимерные rVWF, получаемый с применением способов согласно настоящему изобретению, содержат приблизительно 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 димеров. Согласно дальнейшим вариантам реализации rVWF, получаемый согласно настоящему изобретению, обладает удельной активностью по меньшей мере приблизительно 20; 22,5; 25; 27,5; 30; 32,5; 35; 37,5; 40; 42,5; 45; 47,5; 50; 52,5; 55; 57,5; 60; 62,5; 65; 67,5; 70; 72,5; 75; 77,5; 80 или более мЕ/мкг. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для получения rVWF поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х10⁶ клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 2,0х10⁶ клеток/мл, 1,5х10⁶ клеток/мл, 1,0х10⁶ клеток/мл, 0,5х10⁶ клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают в диапазоне от 1,5х10⁶ клеток/мл и

2,5х10⁶ клеток/мл.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения

- 31 041947 композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрация аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 5 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 4 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реали

- 32 041947 зации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации среды для клеточных культур содержат аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей приблизительно 4,3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 2 мкг/л до 20 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще

- 33 041947 одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 3 мкг/л до 10 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 4 мкг/л до 7,5 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rVWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем концентрацию NH₄ ⁺ в указанном супернатанте поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 7 дней, и при этом указанный отделенный супернатант также обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

- 34 041947

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH₄ ⁺ в культуре клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл.1, в течение по меньшей мере 9 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rVWF ; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким обра

- 35 041947 зом, что происходит экспрессия и экскреция rVWF из клеток в культуральный супернатант; (е) мониторинга концентрации аммония в указанном культуральном супернатанте; и (f) отделения по меньшей мере части культурального супернатанта, причем указанный культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 10 мМ, не используют для получения композиции rVWF, и при этом указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 3-8 мкг/л или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 6 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 5 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 4 мМ, не используют для получения композиции rVWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л, 7 мкг/л, 8 мкг/л, 9 мкг/л, 10 мкг/л, 15 мкг/л, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20 мкг/л, 2-10 мкг/л, 38 мкг/л, или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.

Рекомбинантный vWF может быть получен посредством осуществления экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых, например, клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки, например, клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вариантов реализации можно осуществлять экспрессию указанного vWF в дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, BHK или HEK. Как правило, для экспрессии vWF согласно настоящему изобретению применяют клетки млекопитающих, например, клетки СНО из непрерывной клеточной линии.

Согласно определенным вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую vWF, может представлять собой вектор. Указанный вектор может доставляться вирусом или может представлять собой плазмиду. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, может представлять собой конкретный ген или его биологически функциональную часть. Согласно одному из вариантов реализации указанный белок представляет

- 36 041947 собой по меньшей мере биологически активную часть vWF.

Для экспрессии указанного vWF могут применяться разнообразные векторы; они могут быть выбраны из эукариотических экспрессионных векторов. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, рМЕТ, с применением таких промоторов, как АОХ1, GAP, GAL1, AUG1, и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, рВАС и т.п, с применением таких промоторов, как РН, р10, МТ, Ас5, OpIE2, gp64, polh и т.п, и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п, и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п, с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин. Типовой вектор для экспрессии rVWF описан у Kaufman et al. (Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3): 1233-42); содержание указанного источника включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанная последовательность нуклеиновой кислоты также содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как промоторные последовательности, энхансеры, ТАТА-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-А-последовательности, последовательности процессинга белков, маркеры отбора и т.п., которые общеизвестны специалистам в данной области техники.

Помимо сред для клеточных культур, содержащих повышенную концентрацию меди, условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ на протяжении всего подготовительного процесса (upstream-процесса) в системах культивирования. Согласно одному из вариантов реализации условия культивирования клеток включают концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ, согласно другому варианту реализации менее чем приблизительно 20 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 15 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 10 мМ, и согласно дальнейшему варианту реализации менее чем приблизительно 5 мМ.

Согласно некоторым вариантам реализации концентрации аммония согласно настоящему изобретению поддерживают на постоянном уровне на протяжении всего подготовительного процесса в системе культивирования клеток. Клетки, применяемые согласно настоящему изобретению, могут культивироваться, например, способами, модифицированными относительно стандартных периодического культивирования и непрерывного культивирования, общеизвестных в данной области техники. При этом такие стандартные техники могут приводить к образованию высоких концентраций аммония в конце культивирования. В способах согласно настоящему изобретению эта проблема преодолена за счет применения систем производства, которые могут обеспечить постоянное поступление культуральной среды с помощью таких техник, как, например, перфузионное или хемостатическое культивирование. После культивирования клеток-хозяев vWF может быть выделен из отработанной среды с применением стандартных методик, таких как ультрафильтрация или центрифугирование. При необходимости vWF может быть очищен, например, ионообменной и/или эксклюзионной хроматографией и т.п.

Непрерывная культура (например, перфузионная или хемостатическая культура) может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, при этом объем культуры, как правило, неизменен. Сходным образом, непрерывная ферментация может подразумевать процесс, при котором клетки или микроорганизмы в культуре поддерживают в экспоненциальной фазе роста за счет постоянного добавления свежей среды, точно компенсируемом удалением суспензии клеток из биореактора. Кроме того, реакционная система с баком-мешалкой может применяться для суспензионного, перфузионного, хемостатического культивирования и/или культивирования на микроносителях. Как правило, в качестве указанной реакционной системы с бакоммешалкой может работать любой стандартный реактор с баком-мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, типа Rushton, гидравлическим, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.

С. Способы получения рекомбинантного ADAMTS13 (А13).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения rA13 в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1,0 мкг/л; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основ

- 37 041947 ных сред для клеточных культур в день (т.е. 1500 единиц FRETS-VWF73 активности в день на литр культуры клеток; Р FRETS). Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2 мкг/л, 3 мкг/л, 4 мкг/л, 5 мкг/л, 6 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 1-6 мкг/л, 2-5 мкг/л, 2-4 мкг/л или 3-4 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение объемной продуктивности FRETS-VWF73 (Р FRETS). Например, согласно определенным вариантам реализации выделяют по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для продуцирования rA13 поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0x106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 3,5x106 клеток/мл, 3,0x106 клеток/мл, 2,5x106 клеток/мл, 2,0x106 клеток/мл, 1,5x106 клеток/мл, 1,0x106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают на уровне от 3,0x106 клеток/мл до 4,0x106 клеток/мл.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта (FRETS). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-VWF73 на мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение продуктивности FRETS. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 8 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 10 единицами активности FRETS-VWF73 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-VWF73 активности на 10⁶ клеток культуры в день (т.е. q Frets). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 Е FRETS-VWF73 активности на 10⁶ клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е FRETS-VWF73 активности на 10⁶ клеток культуры в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е FRETS-VWF73 активности на 10⁶ клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение удельной продуктивности FRETS-VWF73 на клетку (q Frets). Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-VWF73 активности на 10⁶ клеток культуры ежедневно в течение по

- 38 041947 меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 Е FRETS-VWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день (Р ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13, согласно ИФА-анализу, на литр культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры в день (т.е. q ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки согласно q ELISA. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на 10⁶ клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13, согласно ИФА-анализу, на мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 3 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 5 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 мкг rA13 на мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней, или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.

Согласно одному варианту реализации описанных выше способов раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по

- 39 041947 меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ, или не выше 9 мМ, 8 мМ, 7 мМ, 6 мМ, 5 мМ, 4 мМ, 3 мМ, 2 мМ, 1 мМ, или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т. е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13). Согласно конкретному варианту реализации культуральный раствор содержит медь и аммоний в концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и цинка; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинк. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно одному варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 мкМ до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ или более, цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 мМ до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, при

- 40 041947 веденных в табл.3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и кальция; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 мМ и 1,5 мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6 мМ; 0,7 мМ; 0,8 мМ; 0,9 мМ; 1,0 мМ; 1,1 мМ; 1,2 мМ; 1,3 мМ; 1,4 мМ; 1,5 мМ; 1,6 мМ; 1,7 мМ; 1,8 мМ; 1,9 мМ; 2,0 мМ; 2,25 мМ; 2,5 мМ; 2,75 мМ; 3,0 мМ; 3,5 мМ; 4,0 мМ; 4,5 мМ; 5,0 мМ или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 мг/л до 10 мг/л никотинамида (витамина В3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мг/л, 3 мг/л, 4 мг/л, 5 мг/л, 6 мг/л, 7 мг/л, 8 мг/л, 9 мг/л, 10 мг/л, 15 мг/л, 20 мг/л, или более высокие концентрации никотинамида (витамина В3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл.4. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

- 41 041947

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл.2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (а) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, кальция и никотинамида; (с) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (е) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 мг/мл и 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл или более, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл.3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-VWF73 на литр дополненных основных сред для клеточных культур в день.

Рекомбинантные белки ADAMTS могут быть получены посредством осуществления экспрессии в любой подходящей прокариотической или эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, COS, HEK 293, BHK, SKHep, и HepG2; клетки насекомых, например SF9 клетки, SF21 клетки, S2 клетки, и High Five клетки; и дрожжевые клетки, например, клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вариантов реализации указанные белки ADAMTS можно экспрессировать в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реа

- 42 041947 лизации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО, BHK или HEK. Согласно предпочтительному варианту реализации клеточная линия представляет собой клеточную линию СНО. Согласно конкретному варианту реализации клоны СНО, способные к стабильной экспрессии rA13, получают ко-трансфекцией клетки СНО кодирующими последовательностями rA13 и дигидрофолатредуктазы (например, мышиного гена dhfr) и отбором при росте в присутствии возрастающих уровней метотрексата.

Согласно одному из вариантов реализации указанные клетки могут представлять собой любые клетки млекопитающих, пригодные для культивирования, предпочтительно в ходе производственного процесса (т.е. по меньшей мере в 10 л, предпочтительно по меньшей мере в 100 л), для получения требуемого белка ADAMTS, такого как ADAMTS13. Примеры включают линию клеток почки обезьяны CV1 трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); линию эмбриональных клеток почек человека (клетки 293 или 293 субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al, J. Gen Virol, 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR, такие как субклон DUKX-B11 (СНО, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс Буффало (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562, ATCC CCL51 ); клетки TRI (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2). Предпочтительно, клеточная линия представляет собой линию клеток грызунов, в частности, линию клеток хомяка, такую как СНО или BHK.

Значительное число векторов может применяться для экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS 13) и может быть выбрано из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Согласно определенным вариантам реализации плазмидный вектор предназначен для применения в экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS 13). Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и управляющие последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в соединении с указанными хозяевами. Указанный вектор может нести сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором.

Предпочтительный способ получения стабильных клонов клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный белок ADAMTS, следующий. Дефицитную по DHFR клеточную линию СНО DUKX-B11 трансфицируют DHFR-экспрессионным вектором, чтобы обеспечить экспрессию соответствующего рекомбинантного белка. Типовой способ описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12), содержание которого включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Отбор проводят культивированием в не содержащих гипоксантин/тимидин (НТ) средах; амплификации соответствующей области, кодирующей экспрессию рекомбинантного белка ADAMTS и DHFR гена, достигают размножением клеток в возрастающих концентрациях метотрексата. При необходимости клеточные линии СНО могут быть адаптированы для роста в не содержащей сыворотки и/или белков среде, по существу согласно описанию в US 6100061 (Reiter et al., lmmuno Aktiengesellschaft).

Согласно другому предпочтительному варианту реализации стабильные HEK293 клетки получают, трансфицируя их конструкцией, содержащей селектируемый маркер устойчивости к гигромицину, и отбирая трансформанты по устойчивости к антибиотику.

Способность определенных вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза, встраиваться в геном клетки-хозяина и стабильно и эффективно экспрессировать вирусные гены, делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, клетки млекопитающих). Соответственно, согласно определенным вариантам реализации вирусный вектор применяют для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13) в клетку-хозяина для экспрессии. Указанный вирусный вектор должен содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором. Как вариант, указанный вирусный вектор может не содержать контрольную последовательность, вместо этого используя контрольную последовательность клеткихозяина для управления экспрессией белка ADAMTS. Неограничивающие примеры вирусных векторов, которые могут применяться для доставки нуклеиновой кислоты, включают аденовирусные векторы, AAV-векторы и ретровирусные векторы.

Согласно одному из вариантов реализации аденовирусный экспрессионный вектор включают конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для осуществления упаковки указанной конструкции и гарантированной экспрессии клонированной в нее конструкции ADAMTS.

- 43 041947

Аденовирусные векторы позволяют вводить чужеродные последовательности размером до 7 т.п.н.

(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 53 5-546, 1992)).

Согласно другому варианту реализации аденоассоциированный вирус (AAV) может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), в клетку-хозяина для экспрессии. AAV-системы описывались ранее и, как правило, общеизвестны в данной области техники (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Natlmmun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr TopMicrobiol Immunol, 158:97-129, 1992). Детали получения и применения rAAV-векторов описаны, например, в патентах США №5139941 и №4797368, включенных в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте и для любых целей.

Согласно одному из вариантов реализации ретровирусный экспрессионный вектор может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS 13), в клетку-хозяина для экспрессии. Указанные системы были описаны ранее и в целом общеизвестны в данной области техники (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, в: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, в: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). Согласно конкретному варианту реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., например, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al, NatBiotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer etal, J Virol, 71(9):6641-6649, 1997; патенты США №6013516 и №5994136).

Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как pRSET, pET, pBAD и т.п, при этом промоторы, применяемые в прокариотических экспрессионных векторах, включают lac, trc, trp, recA, araBAD и т.п. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с применением таких промоторов, как AOX1, GAP, GAL1, AUG1, и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, рВАС и т.п, с применением таких промоторов, как РН, p10, MT, Ас5, OpIE2, gp64, polh и т.п, и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п, и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п, с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актина. Типовой вектор для экспрессии rA13 описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15;100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12); содержание указанного источника включено в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Настоящее изобретение обеспечивает, наряду с прочими аспектами, способы крупномасштабной экспрессии белка ADAMTS. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высокого отношения поверхности к объему в культуре для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является применение микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Согласно другому варианту реализации указанные ростовые потребности удовлетворяются посредством применения суспензионной культуры клеток.

IV. Конкретные варианты реализациию.

А. Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF).

Рекомбинантный vWF можно экспрессировать в клетках млекопитающих, но удельная активность vWF может широко варьировать в зависимости от условий культивирования клеток; не было показано, что она сравнима или равна таковой vWF, выделенного из плазмы крови. Настоящее изобретение основано частично на неожиданном открытии, что среды для клеточных культур, содержащие по меньшей мере 2,4 мкг/л меди, обеспечивают благоприятный эффект, способствую экспрессии высокомолекулярного vWF, имеющего высокую удельную активность. В частности, высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомультимерную форму, содержащую от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающую удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Процессы культивирования клеток согласно настоящему изобретению также позволяют поддерживать низкие уровни NH₄ ⁺ (например, менее чем 10 мМ) во время подготовительного процесса в системах культивирования клеток, уменьшая таким образом пагубные эффекты на посттрансляционные модификации. Предполагается, что согласно настоящему изобретению впервые предложены условия клеточных культур, включающие среду с подходящей концентрацией меди в комбинации с подходящими уровнями аммония в супернатанте, для экспрессии высокомультимерных vWF с высокой удельной активностью.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для кле- 44 041947 точной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH₄ ⁺). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный раствор культуры клеток содержит: среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток раствор культуры клеток содержит средовую добавку, содержащую медь.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит гидролизат, необязательно соевый гидролизат.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит соль меди, хелат меди или их комбинации.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный способ включает этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и имеет удельную ристоцетиновую активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки взяты из непрерывной клеточной линии.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки СНО.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет от приблизительно от 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, получаемый при помощи процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; и b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.

- 45 041947

Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rVWF рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно от 14 до приблизительно 22 димеров.

Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF, при этом указанный раствор культуры клеток включает среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладает удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF, находящегося в высокомультимерной форме с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH₄ ⁺). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.

Согласно одному аспекту настоящее изобретение включает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащего среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров, и обладающие удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному из вариантов реализации описанных выше растворов культур клеток по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного VWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или а соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно определенным вариантам реализации клетки могут быть взяты из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетинкофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение включает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий а) обеспечение культуры клеток; b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и, d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительной до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации супернатанта культуры клеток, описанной выше, по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по

- 46 041947 меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки, которые могут быть взяты из непрерывной клеточной линии, могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди.

Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение охватывает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации описанного выше супернатанта культуры клеток по меньшей мере 10% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут быть из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки СНО. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо указанная удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), обладающий удельной ристоцетинкофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг. согласно еще более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций по меньшей мере 10% rVWF в указанной композиции присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров. Со- 47 041947 гласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rVWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера VWF из более чем 10 димеров.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rVWF экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 2,4 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2,4 мкг/л до 20 мкг/л меди. Согласно одному из вариантов реализации медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4+ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,5х10⁶ клеток/мл.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х10⁶ клеток/мл.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную культуру поддерживают на уровне менее чем 1,5х10⁶ клеток/мл.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rVWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации большую часть коэкспрессируемого rFVIII удаляют. Согласно более конкретному варианту реализации отношение rVWF к rFVIII в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение включает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: а) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; с) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Очевидно, что здесь могут применяться все варианты реализации и концентрации, описанные в разделах Среды для клеточных культур и Способы получения рекомбинантного vWF выше.

Рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, обладающий высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации vWF согласно настоящему изобретению представляет собой высокомультимерную форму vWF. Согласно некоторым вариантам реализации указанная высокомультимерная форма vWF содержит по меньшей мере до приблизительно 14 димеров, а согласно другим вариантам реализации - по меньшей мере до приблизительно 22 димера. Согласно другим вариантам реализации высокомультимерная форма vWF может варьировать от приблизительно 10 до приблизительно 20 димеров, или от приблизительно 15 до приблизительно 25 димеров, или от приблизительно 20 до приблизительно 40 димеров. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный vWF сопоставим с vWF плазмы.

Согласно приведенному в настоящем изобретении описанию в соответствии с настоящим изобретением получен неожиданный результат, состоящий в том, что повышенная концентрация меди в культуре клеток среды позволяет получать высокомолекулярный vWF с высокой удельной активностью. Среды для клеточных культур, содержащие медь в концентрации, например, выше, чем приблизительно

- 48 041947

2,4 мкг/л, могут повышать выход рекомбинантного мультимерного vWF по сравнению с не содержащими медь средами. Согласно определенным вариантам реализации процент мультимерного vWF (т.е. rVWF, содержащего по меньшей мере 2 димера) может быть выше, чем приблизительно 50%, или выше, чем приблизительно 75%, или выше, чем приблизительно 90%. Уровень мультимеризации vWF может быть проанализирован с применением стандартных техник, таких как, например, in электрофорез в агарозе в невосстанавливающих условиях.

Согласно настоящему изобретению рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать высокой удельной активностью, например, высокой удельной ристоцетин-кофакторной активностью. Согласно одному из вариантов реализации рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг, а согласно другому варианту реализации - по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно другим вариантам реализации удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг или от приблизительно 50 мЕ/мкг до приблизительно 100 мЕ/мкг.

В. Рекомбинантный ADAMTS13 (rA13).

Белки ADAMTS (т.е. ADAMTS-1-ADAMTS-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, имеющих общую модулярную доменную организацию (для ознакомления см. Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:544-69). Все белки ADAMTS имеют общее строение центрального домена, состоящего из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинк-зависимый металлопротеиназный каталитический домен, дезинтегрин-подобный домен, повтор тромбоспондина типа I, цистеин-богатый домен и спейсерный домен (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):314937). Помимо этого, все они, кроме ADAMTS-4, содержат по меньшей мере еще один домен повтора тромбоспондина типа I, и многие из белков ADAMTS содержат один или более дополнительный вспомогательный домен. В частности, сообщалось, что все белки ADAMTS, по всей видимости, содержат по меньшей мере один кальций-связывающий сайт и по меньшей мере один цинк-связывающий сайт, расположенные внутри металлопротеиназного каталитического домена (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).

Описана биологическая роль белков ADAMTS при различных заболеваниях и состояниях, включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, перестройку костной ткани, фолликулогенез в яичниках, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост/ремоделирование опухолей (ADAMTS-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7С и бычий дерматоспараксис (ADAMTS-2); артрит, атеросклероз и тендинопатия (ADAMTS-4); артрит и глиобластома (ADAMTS-5); артрит (ADAMTS-7); антиангиогенез, злокачественные новообразования мозга, артрит и атеросклероз (ADAMTS-8); артрит (ADAMTS-9, -12); тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ADAMTS-13); и антитромбоз/инсульт (ADAMTS 18) (для ознакомления см. Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).

Рекомбинантный ADAMTS 13 (A13) экспрессировали в клетках млекопитающих и прежде, однако удельная активность широко варьирует в зависимости от условий культивирования клеток. Было обнаружено, что многие коммерчески доступные культуральные среды непригодны для экспрессии rA13 с высокой удельной активностью, выражаемой как отношение активности, измеренной посредством анализа FRETS-VWF73, к содержанию антигена, согласно оценке с применением ELISA. Согласно одному аспекту способы, предложенные согласно настоящему изобретению, основаны на нескольких полезных открытиях, позволяющих осуществлять экспрессию в культуре клеток белка rA13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности.

Соответственно, благодаря общим структурно-функциональным связям семейства ADAMTS секретируемых металлопротеиназ, предлагаемые согласно настоящему изобретению способы позволяют экспрессировать в культуре клеток и выделять из клеточной среды все белки ADAMTS.

Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный ADAMTS 13 (rA13), обладающий удельной FRETS-VWF активностью, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанный rA13 обладает удельной FRETS-VWF активностью, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно конкретному варианту реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток СНО.

Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанный rA13 экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 1 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2 до 20 мкг/л меди.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль

- 49 041947 меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрата меди и оксида меди.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH₄ ⁺ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 5 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH₄ ⁺ в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.

Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 4,0х10⁶ клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 3,0х10⁶ клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х10⁶ клеток/мл. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 1,5х10⁶ клеток/мл.

V. Составы.

Согласно одному аспекту составы, содержащие рекомбинантные терапевтические белки rVWF или rA13 согласно настоящему изобретению, лиофилизируют перед введением. Лиофилизация проводится с применением общеизвестных в данной области техники методик и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:2439 (1996)].

Способы получения фармацевтических составов может включать один или более следующий этап: добавление стабилизирующего агента согласно описанию в настоящем изобретении к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из объемообразующего агента, регулирующего осмолярность агента и ПАВ, каждый из которых соответствует приведенному в настоящем изобретении описанию, к указанной смеси перед лиофилизацией. Лиофилизированный состав состоит, согласно одному аспекту, по меньшей мере из чего-либо одного или более из: буфера, объемообразующего агента и стабилизатора. Согласно этому аспекту оценивают полезность поверхностноактивного вещества и используют его в случаях, когда слипание на этапе процесса лиофилизации или восстановления представляет собой проблему. Для поддержания стабильности рН состава во время лиофилизации вводят подходящий буферизирующий агент.

Стандартный способ восстановления лиофилизированного материала заключается в повторном добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (WFI) (как правило, эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя при получении фармацевтиков для парентерального введения иногда применяют разбавленные растворы антибактериальных агентов [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Соответственно, предложены способы получения восстановленных композиций рекомбинантного VWF, включающие этап добавления разбавителя к лиофилизированной композиции рекомбинантного VWF согласно настоящему изобретению.

Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Различные водные носители, например, стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многодозового применения или вода с подходящим количеством поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий). Согласно различным аспектам такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие агенты, например, и без ограничения, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой встречающиеся в природе фосфатиды, например, и без ограничения, лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, и без ограничения, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, и без ограничения, гептадекаэтил-еноксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такими как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, и без ограничения, такими как полиэтиленсорбитанмоноолеат. Согласно различным

- 50 041947 аспектам указанные водные суспензии также содержат один или более консервант, например, и без ограничения, этил, или н-пропил, п-гидроксибензоат.

Для введения композиций человеку или экспериментальным животным, согласно одному аспекту, указанные композиции содержат один или более фармацевтически приемлемый носитель. Выражения фармацевтически или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые стабильны, подавляют разложение белков, например, агрегацию и продукты расщепления, и, кроме того, не вызывают аллергических или другие нежелательных реакций при введении с применением путей, общеизвестных в данной области техники, согласно приведенному ниже описанию. Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все из клинически полезных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.п, включая агенты, описанные выше.

Указанные фармацевтические составы вводят внутривенно, перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляции, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Используемый в настоящем изобретении термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузионные техники. Также включено введение путем внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретный участок. Как правило, композиции по существу не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.

Однократное или многократное введение указанных композиций выполняют с применением дозировок и схем, выбранных лечащим врачом. Подходящая для предотвращения или лечения заболевания дозировка зависит от типа заболевания, лечение которого проводят, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарственное средство с профилактической или терапевтической целью, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на лекарственное средство, и на основании выбора лечащего врача.

Согласно одному аспекту составы согласно настоящему изобретению вводят сначала в виде болюса, а затем следует непрерывная инфузия для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В другом примере соединение согласно настоящему изобретению вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники смогут легко оптимизировать эффективные дозировки и схемы введения в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяет специалист в данной области техники в зависимости от пути введения и требуемой дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), стр. 1435-1712, включенные в настоящее изобретение посредством ссылки. Такие составы влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo введенных агентов. В зависимости от путь введения подходящую дозу вычисляют в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размером органа. Подходящие дозировки могут быть уточнены посредством стандартных способов определения уровней дозы в крови в сочетании с подходящими данными о зависимости доза-эффект. Окончательный режим дозирования определяет лечащий врач с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, например, удельной активности лекарственного средства, тяжести поражения и отклика пациента, возраста, состояния, массы тела, пола и рациона питания пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и других клинических факторов. Например, типичная доза рекомбинантного vWF согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 50 Е/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований появляется дополнительная информация относительно подходящих уровней дозировок и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.

VI. Способы лечения.

Настоящее изобретение также охватывает способы лечения пациента, нуждающегося в rVWF или rA13, полученных согласно способам, описанным в настоящем изобретении. Такие способы лечения могут включать введение фармацевтических составов, содержащих рекомбинантный rA13 или высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способы терапевтического или профилактического лечения, включающие введение композиции rVWF или rA13, предложенной в настоящем изобретении. Как правило, для терапевтического применения составы вводят пациенту с заболеванием или состоянием, связанным с дисфункцией ADAMTS13 или VWF, или нуждающемуся в этом по иной причинам, в терапевтически эффективной дозе. Составы и количества, эффективные для указанного применения, зависят от тяжести указанного заболевания или состояния, и от общего состояния здоровья пациента. В зависимости от дозировки и частоты, требуемых и переносимых пациентом, может осуществляться однократное или многократное введение указанных составов.

Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с дисфункцией ADAMTS13 или VWF. Согласно дальнейшему варианту реализации фармацевтические составы, содер

- 51 041947 жащие рекомбинантный vWF, могут вводиться для лечения заболеваний, связанных с vWF, таких как болезнь Виллебранда или гемофилия. Согласно другому варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, включающие введение композиции rA13, предложенной в настоящем изобретении. Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способы разрушения одного или более тромба у нуждающегося в этом пациента. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения инфаркта у нуждающегося в этом пациента. Как правило, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы включают введение композиции rADAMTS13 согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом пациенту.

Неограничивающими примерами расстройств, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, являются наследственная тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), приобретенная ТТП, артериальный тромбоз, острый инфаркт миокарда (ОИМ), инсульт, сепсис и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС).

Неограничивающие примеры расстройств, связанных с инфарктом, включают без ограничения инфаркт миокарда (сердечный приступ), эмболию легких, цереброваскулярные нарушения, такие как инсульт, окклюзионная болезнь периферических артерий (например, гангрена), антифосфолипидный синдром, сепсис, гигантоклеточный артериит (ГКА), грыжа и заворот кишок.

VII. Примеры.

Настоящее изобретение будет также проиллюстрировано следующими примерами, не ограничиваясь ими.

Пример 1.

Эксперименты с непрерывной культурой клеток проводили с применением культуры рекомбинантной клеточной линии СНО, экспрессирующей vWF. Основная среда представляла собой DMEM/F12, содержащую приблизительно 0,3 мкг/л Cu²⁺. В указанную среду был добавлен соевый гидролизат и сульфат меди (CuSO₄-5H₂O) с получением конечной концентрации меди в среде выше, чем по меньшей мере 2,4 мкг/л.

Рекомбинантные клетки СНО, экспрессирующие vWF, культивировали в непрерывной клеточной культуре таким образом, что уровни аммония (NH₄ ⁺) находились на уровне концентрации менее чем приблизительно 10 мМ. Было обнаружено, что системы производства, обеспечивающие непрерывное поступление среды (например, перфузионные или хемостатические культуры) предпочтительны, так как стандартные техники периодических или подпитываемых культур приводят к высоким концентрациям NH₄ ⁺ в конце культивирования. В конце культивирования выделяли высокомультимерный vWF и измеряли удельную ристоцетин-кофакторную активность vWF.

Пример 2.

Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rVWF) коэкспрессировали в периодических культурах клеток GD8/6 для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность VWF. Вкратце, клетки GD8/6 культивировали в непрерывном режиме в среде BAV-SP, состоящей из порошка модифицированной основной среды DMEM/F12 (табл. 5) и дополнительных добавок, также содержащих 4 г/л соевого гидролизата, см. табл. 6, с добавлением или без добавления дополнительной меди. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rVWF использовали основные BAV-SP среды. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что добавляло еще 0,7 мкг/л меди, как было установлено экспериментально, с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в среды BAV-SP, используемые для периодических культур, также добавляли дополнительно 3,3 мкг/л Cu²⁺, что давало конечную концентрацию меди 4,3 мкг/л, для определения действия высоких концентраций меди на экспрессию и активность VWF.

- 52 041947

Таблица 5

Состав культуральных сред BAV-SP

Среда BAV-SP
Компоненты	мг/л
Аминокислоты
L-Аланин	4,45
L-Аргинин НО	147,50
Г-Аспарагин-Н₂О	30,21
L-Аспарагиновая кислота	6,65
L-Цистеин HCI-H2O	32,55
L-Цистин 2НС1	57,35
L-Глутаминовая кислота	7,35
Г лицин	18,75
Г-Гистидин-Н₂О НС1	31,48
Г идрокси-Г-Пролин
L-Изолейцин	54,47
L-Лейцин	59,05
L-Лизин НС1	91,25
L-Метионин	17,24
L -Фенилаланин	35,48
L-Пролин	52,24
L-Серин	26,25
L-Треонин	53,45
L-Триптофан	29,01
L-Тирозин 2Na 2Н2О	55,79
L-В алии	52,85
Витамин
Аскорбиновая кислота	3,499
Биотин	0,0035
Холинхлорид	8,980
D-Са-Пантотенат	2,240
Фолиевая кислота	2,650
1-Инозитол	12,600
Никотинамид	2,020
Пиридоксин НС1	2,031
Рибофлавин	0,219
Тиамин НС1	2,170
Витамин В12	0,680
Неорганические соли
Кальция хлорид (СаС12)	116,600
Сульфат меди (CuSO4-5H₂O)	0,0013
Нитрат железа (Fe(NO₂)3-9H₂O)	0,050
Сульфат железа (FeSO4-7H₂O)	0,417
Хлорид магния (MgC12)	28,640
Сульфат магния (MgSO4)	48,840
Хлорид калия (КС1)	311,800
Хлорид натрия (NaCl)	6995,500
Фосфат натрия (Na2HPO4)	71,020
Фосфат натрия (NaH2PO4)	62,500
Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO4-7H2O)	0,432
Селенит натрия	0,0131
Другие
D-Глюкоза	3151
Линолевая кислота	0,042
Липоевая кислота	0,105
Путресцин 2НС1	0,081
Тимидин	0,365
Гипоксантин Na	2,390
Пируват натрия	55,000

- 53 041947

Таблица 6

Состав добавки для BAV-SP

Компоненты конечного состава
L-Глутамин	600,00
Этаноламин	1,530
Synperonic F68	250,000
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	2000,000
Соевый пептон	4000,00

Общий состав	18596,8

Клетки GD8/6, экспрессирующие rVWF, культивировали либо в среде с низким содержанием меди (табл. 7), либо в среде с высоким содержанием меди (табл. 8) в течение 7 дней. Через 2 дня культуры пересевали для проведения периодического культивирования на протяжении 5 дней. Образцы указанного культур ального супернатанта ежедневно исследовали на содержание rVWF (vWF ELISA), общую (ристоцетин) и удельную (удельную активность) с применением ристоцетин-кофакторного анализа. Различные параметры культивирования, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрация аммония также отслеживали ежедневно (кроме дней периодического культивирования 3 и 4).

Неожиданно было обнаружено, что культуры клеток, росшие при высоких концентрациях меди, давали супернатанты, имеющие значительно более высокую общую и удельную rVWF-активность (ср. результаты в табл.7 и табл. 8). Например, на 4 день периодического культивирования культура клеток, росшая при высоких концентрациях меди, имела 1,52 ME rVWF активности/мл, по сравнению с 0,2 ME rVWF активности/мл для культуры с низким содержанием меди, несмотря на тот факт, что культура с низким содержанием меди клеток давала почти в два раза большее количество rVWF по сравнению с культурой клеток с высоким содержанием меди. Кроме того, удельная активность супернатанта, полученного из культуры с высоким содержанием меди, была более чем в 13 раз выше, чем у супернатанта культуры с низким содержанием меди (831 мЕ/10 мкг rVWF к 62 мЕ/10 мкг rVWF).

Как видно из табл. 7 и 8, общая и удельная ристоцетин-кофакторная активность культуры с высоким содержанием меди была в два раза выше таковой культуры с низким содержанием меди, на 1 день периодического культивирования. Кроме того, в отличие от последующего увеличения активности, наблюдаемого в культуре с высоким содержанием меди, в культуре клеток с низким содержанием меди не было отмечено увеличения ристоцетин-кофакторной активности после 1 дня периодического культивирования. В соответствии с этим результатом анализ мультимерного статуса rVWF электрофорезом в агарозном геле показал, что в супернатанте культуры клеток с низким содержанием меди в 1-й день периодического культивирования присутствовала низкая относительно концентрации низкомолекулярных видов rVWF концентрация высокомолекулярного rVWF, и также что указанная относительная концентрация снижалась с течением времени (фиг. 1А и 1В). Напротив, добавление в культуральную среду Cu²⁺стабильно приводило к образованию антигена с ристоцетин-кофакторной (RiCoF) активностью на протяжении четвертого дня. В соответствии с этим, уменьшения количества стабильных высокомолекулярных мультимеров rVWF в течение дня 4 периодической культуры не происходило (фиг. 1А и 1В). Результаты денситометрии агарозного электрофоретического геля, приведенные на фиг. 1В, показали, что при условии низкого уровня меди культура способна продуцировать только популяцию rVWF, более чем 10% rVWF которой (т.е. 16,3%) представлено молекулами из более чем 10 димеров, в течение одного дня периодического культивирования (т.е. образец дня 3 в 2 полосе агарозного геля на фиг. 1 А); примечательно, что эта популяция опускалась до всего лишь 4% на день 5 периодического культивирования (образец дня 7 в полосе 6). Напротив, в условиях высокого содержания меди относительное количество мультимеров VWF, состоящих из более чем 10 димеров, стабильно составляет около 30% на протяжении дня 4 в периодической культуре (день 3-день 6 в полосах 7-10; 28-31,4%).

Примечательно, что начиная с 5-го дня периодического культивирования культуры с высоким содержанием меди, когда уровни NH4⁺ превышали 100 мг/л (выше, чем приблизительно 5,0 мМ), экспрессия дополнительного антигена (18,3-35,4 мкг/л; ср. дни периодического культивирования 4 и 5 в табл.8) не приводила к сопутствующему увеличению RiCoF-активности в супернатанте. В соответствии с этим результатом уровень высокомолекулярных мультимеров rVWF на 5 день периодического культивирования (7 день культивирования) снижался относительно концентрации низкомолекулярных мультимеров rVWF. Также только на 5 день периодического культивирования (образец дня 7 культуры в полосе 11) относительное количество vWF, состоящего из более чем 10 димеров, снижается до 21,4%.

В совокупности приведенные выше данные показывают, что дополнительная концентрация меди в культурах клеток, экспрессирующих rVWF, существенно увеличивает общую и удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, а также стабильную выработку высокомолекулярных мультимеров rVWF. Кроме того, эти данные выявляют корреляцию между высокими концентрациями NH4⁺ в культуре клеток и снижением ристоцетин-кофакторной активности rVWF и выработки высокомолекулярного мультимерного rVWF.

- 54 041947

Таблица 7

Экспрессия rVWF в культурах клеток млекопитающих при периодическом режиме культивирования с применением сред BAV-SP с низкой концентрацией меди (1,0 мкг/л)

день периодического культивирования	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	nh₄ ⁺ [мг/л]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	Удельная активность мЕ/10мкг
0	0,42	21	98,8	н.о.	н.о.	н.о.
1	0,78	43	н.о.	6,3	0,23	365
2	1,24	64	99,1	12,8	0,23	180
3	1,86	н.о.	н.о.	22,7	0,21	93
4	2,49	но.	но.	32,2	0,20	62
5	з,и	106	98,3	44,4	0,20	45

Таблица 8

Экспрессия rVWF в культурах клеток млекопитающих, культивируемых в периодическом режиме с применением BAV-SP сред с высокой концентрацией меди (4,3 мкг/л)

день периодического культивирования	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	nh₄ ⁺ [мг/л]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	Удельная активность мЕ/10мкг
0	0,40	21	99,3	н.о.	н.о.	н.о.
1	0,71	42	н.о.	4,8	0,40	833
2	1,23	63	99,5	8,7	0,62	713
3	1,85	н.о.	н.о.	15,0	1,07	713
4	2,54	н.о.	н.о.	18,3	1,52	831
5	3,32	109	98,9	35,4	1,55	438

Пример 3.

Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rVWF) коэкспрессировали в непрерывных культурах клеток GD8/6, эксплуатируемых в хемостатических условиях, для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность VWF. Вкратце, клетки GD8/6 культивировали в среде BAV-SP, содержащей 4 г/л соевого гидролизата с добавлением и без добавления меди согласно описанию в примере 2. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rVWF применяли основные среды BAV-SP. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что давало дополнительные 0,7 мкг/л меди с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в периодических культурах применяли среды BAV-SP также с добавлением дополнительных 3,3 мкг/л Cu²⁺, с получением конечной концентрации меди 4,3 мкг/л, для определения эффекта высоких концентраций меди на экспрессию и активность VWF. Культуры, растущие в присутствии высоких и низких концентраций меди, культивировали как при высокой (2,8х10⁶ клеток/мл), так и при низкой (прибл. 1,4х10Е06 клеток/мл) плотности клеток.

Как и ранее, образцы указанного культурального супернатанта исследовали на rVWF содержание (vWF ELISA), общую (ристоцетиновую) и удельную (удельную активность) активность посредством ристоцетин-кофакторного анализа. Также отслеживали различные параметры культуры, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония. Данные получали на основании фазы стационарного состояния недель 2 и 3 хемостатической культуры (табл. 9-13).

Таблица 9

Средние данные по экспрессии rVWF в хемостатической культуре клеток на протяжении недель 2 и 3

Количество клеток	Концентрация меди	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	NH4+ [мМ]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	удельная активност [мЕ/10мкг
большое	низкая	2,88	3,88	97,74	44,56	0,10	21,62
большое	высокая	2,79	4,04	98,25	38,38	0,19	53,11
маленькое	низкая	1,55	3,33	98,63	18,96	0,10	50,16
маленькое	высокая	1,43	3,17	98,59	11,76	0,70	598,76

- 55 041947

Таблица 10

Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3

День	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	NH4+ [мМ]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	удельная активность [мЕ/10мкг]
8	2,54	3,7	98,20	39,8	0,095	23,86934673
9	3,02	4,2	97,40
10	2,97	3,9	97,90	41,3	0,095	23,00242131
11	2,78
13	2,91	3,8	97,60	41,7	0,095	22,78177458
14	2,90	3,8	97,40
15	3,05	3,9	97,70	44,7	0,095	21,25279642
16	2,99	3,8	98,30
17	2,76	3,9	97,40	55,3	0,095	17,17902351
	2,88	3,88	97,74	44,56	0,10	21,62

Таблица 11

Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и высоких уровней меди на протяжении недель 2 и 3

День	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	NH4+ [мМ]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	удельная активность [мЕ/10мкг]
8	2,52	3,9	98,30	31,8	0,35	110,0628931
9	2,92	4,3	98,50
10	2,80	4,2	98,60	37,4	0,32	85,56149733
11	2,57
13	2,81	3,9	98,50	37,6	0,095	25,26595745
14	2,92	3,9	97,80
15	2,77	3,9	97,80	43,0	0,095	22,09302326
16	2,72	4,0	98,30
17	3,04	4,1	98,20	42,1	0,095	22,56532067
	2,79	4,04	98,25	38,38	0,19	53,11

Таблица 12

Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3

День	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	ML [мМ]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	удельная активность [мЕ/10мкг]
8	1,61	3,3	99,10	19,3	0,095	49,22279793
9	1,65	3,3	98,00
10	1,49	3,3	98,90	18,6	0,095	51,07526882
11	1,58
13	1,58	3,4	98,10	18,1	0,095	52,48618785
14	1,56	3,3	99,30
15	1,52	3,3	98,50	18,9	0,095	50,26455026
16	1,50	3,3	98,40
17	1,50	3,4	98,70	19,9	0,095	47,73869347
	1,55	3,33	98,63	18,96	0,10	50,16

- 56 041947

Таблица 13

Экспрессия rVWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, высокого уровня меди на протяжении недель 2 и 3

День	Количество клеток [10Е6 клеток/мл]	NH4+ [мМ]	Жизнеспособность [%]	vWF ELISA [мкг/мл]	Ристоцетин [МЕ/мл]	удельная активность [мЕ/10мкг]
8	1,46	3,2	98,80	11,6	0,73	629,3103448
9	1,45	3,2	98,20
10	1,37	3,1	98,90	11,0	0,7	636,3636364
11	1,43
13	1,33	3,2	98,10	И,1	0,68	612,6126126
14	1,39	3,2	97,20
15	1,51	3,2	99,70	12,4	0,69	556,4516129
16	1,49	3,2	98,60
17	1,43	3,2	99,20	12,7	0,71	559,0551181
	1,43	3,17	98,59	11,76	0,70	598,76

Как показано на фиг. 2А, супернатант, собранный из непрерывной rVWF-культуры клеток, выращенной при низкой плотности клеток и высоких концентрациях меди, имел высокую удельную активность (в среднем 600 мЕ/10 мкг), в то время как супернатанты, собранные из rVWF-культур клеток, выращенных при высокой плотности клеток в присутствии высоких или низких концентраций меди, и rVWF-культур клеток, выращенных при низкой плотности клеток в присутствии низкой концентрации меди, имели низкие удельные активности (менее чем 100 мЕ/10 мкг). В соответствии с результатами, полученными для периодических культур, как видно из фиг. 2В, непрерывные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующие rVWF с высокой удельной активностью, содержат более низкие NH4+ концентрации, чем культуры, продуцирующие rVWF с низкой удельной активностью. Эти данные также подтверждают корреляцию между концентрацией NH4+ в культуре клеток и удельной активностью rVWF, продуцируемого указанной культурой. Примечательно, что комбинация высокой концентрации меди и низкой концентрации аммония в культуре клеток позволяла добиться значительного повышения активности rVWF.

В соответствии с этим результатом, анализ мультимерного статуса rVWF в хемостатических культурах с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 6) показал, что только супернатанты культур, эксплуатируемых при высоком содержании меди и низкой плотности клеток и, таким образом, низком содержании аммония, обеспечивали устойчивую экспрессию высокомультимерного vWF (приблизительно 23%-27% в дни CST 8, 17 и 24, полосы 4, 8, и 12, соответственно). Все прочие условия не обеспечивали устойчивого достижения большого количества - более чем 10% vWF, содержащего более чем 10 димеров, на протяжении длительного периода культивирования.

Пример 4.

Для определения эффекта концентрации меди в культуральной среде на экспрессию и удельную активность rA13 культуры клеток млекопитающих для экспрессии rA13 культивировали в течение 4 недель в условиях хемостатической непрерывной культуры в среде ADAMTS13, включающей модифицированные основные среды DMEM/F12 BESP845 и дополнительные добавки (табл. 14), содержащие медь в диапазоне концентраций от 0,66 мкг/л (без дополнительного добавления меди) и с дополнительным добавлением меди до 4 мкг/л. Как видно из табл. 15, возрастающая концентрация меди в среде для клеточных культур приводила к значительному увеличению объемной (Р) и удельной (q) продуктивности, выражаемой в виде общей активности rA13, полученного на литр культуры в день, и общей активности полученного rA13 на клетку в день, соответственно.

- 57 041947

Таблица 14

Состав среды для получения ADAMTS13

DMEM/F12 BESP845
Аминокислоты	мг/л
L-Аланин	13,3500
L-Аргинин НС1	147,5000
Е-Аспарагин-НгО	45,1600
L-Аспарагиновая кислота	19,9500
L-Цистеин HCI-H2O	32,5500
L-Цистин 2НС1	102,3500
L-Γ лутаминовая кислота	22,0500
Глицин	26,2500
Е-Гистидин-НгО НС1	51,4800
L-Изо лейцин	74,4700
L-Лейцин	119,0500
L-Лизин НС1	146,2500
L-Метионин	100,0000
L-Фенилаланин	60,4800
L-Пролин	63,7400
L-Серин	36,7500
L-Треонин	53,4500
L-Триптофан	29,0100
L-Тирозин 2Na 2Н2О	75,7900
L-Валин	82,8500

- 58 041947

соли	мг/л
Кальция хлорид (СаС12)	116,6000
Сульфат меди (CuSO4-5H₂O)	0,0026
Нитрат железа (Fc(NOi)3-9H₂O)	0,0500
Сульфат железа (FeSO4-7H₂O)	1,0170
Хлорид магния (MgC12)	28,6400
Сульфат магния (MgSO4)	48,8400
Хлорид калия (КО)	311,8000
Хлорид натрия (NaCl)	5495,5000
Na2HPO4 Безводный	213,0200
NaH2PO4 Безводный	54,3500
Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO4-27H2O)	0,4320
Селенит натрия, безводный	0,0087
Витамин	мг/л
Аскорбиновая кислота	3,4990
Биотин	0,2035
Холинхлорид	26,9800
D-Са-Пантотенат	6,2400
Фолиевая кислота	6,6500
1-Инозитол	36,6000
Никотинамид	7,0200
Пиридоксин HC1	6,0310
Рибофлавин	0,6590
Тиамин НО	6,5100
Витамин В12	2,6800
другое	мг/л
D-Г люкоза	5000,0000
Линолевая кислота	0,0420
Липоевая кислота	1,0050
Путресцин 2НС1	3,6810
Тимидин	0,3650
Гипо ксантин Na	2,3900
Пируват натрия	55,0000
DMEM/F12 BESP845: всего	12738,3

ADAMTS-13 Средовые добавки	мг/л
L-Γ лутамин	1300,0000
Pluronic F68	1000,0000
Этаноламин	1,5300
ZnSo4*7Н2О	1,0000
Na-Γ идрокарбонат	1500,0000
Всего добавок	3802,5
Общее количество ингредиентов	16540,8

Чтобы определить, влияют ли повышенные концентрации меди на сохранность экспрессируемого rA13, супернатант, собранный от гА13-культур клеток, выращенных в среде, содержащей 0,66 мкг/л, 1 мкг/л и 4 мкг/л меди, исследовали с помощью анализа ДСН-ПААГ. Как видно из фиг. 3А (окрашивание серебром) и фиг. 3В (анти-А13 вестерн-блоттинг), очевидных изменений в качестве продукта при гельэлектрофорезе не наблюдается. Так, экспрессия гА13 в присутствии повышенных концентраций меди не приводит к повышению уровня усеченного 170 кДа или других низкомолекулярных вариантов гА13, и к появлению дополнительных или увеличению полос, соответствующих НСР(белкам клеток-хозяев).

При расчете оптимальной концентрации меди для активности гА13 экстраполирование данных из табл. 15 о зависимости Р Frets от концентрации меди (фиг. 4) показывает, что оптимальный эффект, очевидно, достигается при приблизительно 2 мкг/л, с негативным влиянием по консервативной оценке при более чем приблизительно 4 мкг/л.

-

Claims

Таблица 15

Экспрессия rA13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды содержащей различные конпентрации меди

Объем 10 л R&D (НИР) эксперимент Среднее за 4 недели CST ZZ-NC Р Frets q Frets Уд. активность

[10Е6 клеток/мл] [Е/(л*д)] [Е/(10Е9 клетки* д)1 Е/мг

0,66 мкг/л Си²⁺ 1,35 1322 1028 1759

1 мкг/л Си²⁺ 1,64 1962 1247 1690

4 мкг/л Си²⁺ 2,26 2960 1338 1768

На основании полученных результатов, описанных выше, был проведен дополнительный эксперимент для сравнения экспрессии rA13 в среде для клеточных культур, содержащей 0,66 мкг/л меди и содержащих 2,0 мкг/л меди. Как видно из табл. 16, добавление в основные клеточные среды меди до конечной концентрации 2,0 мкг/л меди приводило к значительному повышению объемной (Р) и удельной (q) продуктивности, выраженной в виде общей активности rA13, полученного на литр культуры в день и общей активности rA13, полученного на клетку в день, соответственно, на протяжении 8 недель. Конкретные данные для каждой недели выработки rA13 в двух указанных культурах приведены на фиг. 5. Из этих данных очевидно следует, что добавление меди оказывает измеряемый благоприятный эффект на метаболизм клеток, удельную скорость роста и выработку rA13.

Таблица 16

Экспрессия rA13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды, содержащей различные концентрации меди

Объем 10 л ZZ-NC Р Frets q Frets Уд. активность

Среднее за 8 недель CST [10Е6 кл./мл] [Е/(л*д)] [Е/(10Е9 кл.*д)] Е/мг

0,66 мкг/л Сп²⁺ 1,29 1049 821 1862

2 мкг/л Сн²⁺ 2,17 2470 1146 1749

Понятно, что примеры и варианты реализации, описанные в настоящем изобретении, приведены исключительно для наглядности, и что различные модификации или изменения с учетом таковых будут понятны специалистам в данной области техники, подлежат включению в суть и объем настоящего изобретения и подпадают под действие прилагаемой формулы изобретения. Все упоминаемые в настоящем изобретении публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящее изобретение посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция на основе рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rVWF), содержащая rVWF, где композиция обладает по меньшей мере 0,5 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл, где композиция получена способом, содержащим стадии:

(a) обеспечение основной среды для культивирования клеток;

(b) добавление в основную среду для культивирования клеток меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л;

(c) обеспечение одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую rVWF белок;

(d) культивирование одной или более клеток в культуральной среде, дополненной медью, в результате чего происходит экспрессия и секретирование rVWF клетками в культуральный супернатант, причем концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 10 мМ; и (e) отделение по меньшей мере части культурального супернатанта, где по меньшей мере 20%

- 60 041947 rVWF в композиции представлено высокомолекулярными мультимерами VWF, состоящими более чем из

10 димеров.
2. rVWF композиция по п.1, где способ дополнительно содержит стадию дополнения в основную среду для культивирования клеток гидролизата до культивирования одной или более клеток.
3. rVWF композиция по п.2, где гидролизат представляет собой растительный гидролизат.
4. rVWF композиция по п.3, где гидролизат представляет собой соевый гидролизат.
5. rVWF композиция по п.1, где основная среда для культивирования клеток представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду.
6. rVWF композиция по п.1, где основная среда для культивирования клеток представляет собой не содержащую белков культуральную среду.
7. rVWF композиция по п.1, где основная среда для культивирования клеток представляет собой культуральную среду с заданным химическим составом.
8. rVWF композиция по п.1, где конечная концентрация меди в основной среде для культивирования клеток, дополненной медью, составляет по меньшей мере 4 мкг/л.
9. rVWF композиция по п.1, где конечная концентрация меди в основной среде для культивирования клеток, дополненной медью, составляет от 2,4 до 20 мкг/л.
10. rVWF композиция по п.1, где основная среда для культивирования клеток, дополненная медью, представлена в форме соли меди, хелата меди или их комбинации.
11. rVWF композиция по п.10, где соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
12. rVWF композиция по п.1, где одна или более клеток являются клетками млекопитающего.
13. rVWF композиция по п.12, где клетками млекопитающего являются клетки СНО.
14. rVWF композиция по п.1, где культивирование одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.
15. rVWF композиция по п.1, где культивирование одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток.
16. rVWF композиция по п.15, где непрерывное культивирование клеток осуществляют в хемостатическом режиме.
17. rVWF композиция по п.15, где непрерывное культивирование клеток осуществляют в режиме перфузии.
18. rVWF композиция по п.1, где одну или более клеток культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.
19. rVWF композиция по п.1, где плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5x106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования одной или более клеток.
20. rVWF композиция по п.19, где плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0x106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования одной или более клеток.
21. rVWF композиция по п.19, где плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5x106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования одной или более клеток.
22. rVWF композиция по п.1, где этап отделения по меньшей мере части культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из части культурального супернатанта.
23. rVWF композиция по п.1, где по меньшей мере 30% rVWF в супернатанте представлено высокомолекулярными мультимерами VWF, состоящими более чем из 10 димеров.
24. rVWF композиция по п.1, где супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры VWF, состоящие из от 14 до 22 димеров.
25. rVWF композиция по п.1, где rVWF коэкспрессируют с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII).
26. rVWF композиция по п.25, где способ дополнительно включает этап очистки rVWF по меньшей мере от 50% rFVIII, присутствующего в отделенном супернатанте.
27. rVWF композиция по п.26, где отношение rVWF к rFVIII после очистки составляет по меньшей мере 10:1.
28. rVWF композиция по п.1, где способ дополнительно включает этап обогащения rVWF.
29. rVWF композиция по п.1, где композицию получают в форме для фармацевтического введения.
30. rVWF композиция по п.1, где указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
31. rVWF композиция, содержащая rVWF, имеющая удельную ристоцетин-кофакторную активность по меньшей мере 40 мЕ/мкг, где композиция получена способом, содержащим стадии:

(a) обеспечение основной среды для культивирования клеток;

(b) добавление в основную среду для культивирования клеток меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л;

(c) обеспечение одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую rVWF белок;

- 61 041947 (d) культивирование одной или более клеток в культуральной среде, дополненной медью, в результате чего происходит экспрессия и секретирование rVWF клетками в культуральный супернатант, причем концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 10 мМ; и (e) отделение по меньшей мере части культурального супернатанта, где по меньшей мере 20% rVWF в композиции представлено высокомолекулярными мультимерами VWF, состоящими более чем из 10 димеров.
32. Супернатант клеточной культуры, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), где по меньшей мере 20% rVWF представлено высокомолекулярными мультимерами VWF, состоящими более чем из 10 димеров, где в супернатант клеточной культуры вводят медь для достижения конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л и где концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 10 мМ.
33. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант обладает по меньшей мере 0,5 ME ристоцетин-кофакторной активности на мл.
34. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF.
35. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 40 мЕ/мкг rVWF.
36. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF.
37. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 60 мЕ/мкг rVWF.
38. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.
39. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант имеет удельную ристоцетинкофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 80 мЕ/мкг rVWF.
40. Супернатант клеточной культуры по п.32, где по меньшей мере 30% rVWF в супернатанте представлено высокомолекулярными мультимерами VWF, состоящими более чем из 10 димеров.
41. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры VWF, состоящие из от 14 до 22 димеров.
42. Супернатант клеточной культуры по п.32, где супернатант дополнительно содержит рекомбинантный фактор VIII (rFVIII).
43. Супернатант клеточной культуры по п.42, где отношение rVWF к rFVIII составляет по меньшей мере 10:1.
44. rVWF композиция по п.1, где концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 4 мМ.
45. rVWF композиция по п.31, где концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 4 мМ.
46. Супернатант клеточной культуры по п.32, где концентрацию NH⁴⁺ в супернатанте клеточной культуры поддерживают на уровне ниже 4 мМ.

-